Faculteit Bio-ingenieurswetenschappen
Academiejaar 2013– 2014
Saccharificatiepotentieel van wild type populier versus een
genetisch gemodificeerd lijn
Mathijs Heynderickx
Promotor: dr. Ingeborg Stals
Tutor: Jeroen De Mey
Masterproef voorgedragen tot het behalen van de graad van
Master of Science in de industriële wetenschappen: biochemie
2
Faculteit Bio-ingenieurswetenschappen
Academiejaar 2013– 2014
Saccharificatiepotentieel van wild type populier versus een
genetisch gemodificeerd lijn
Mathijs Heynderickx
Promotor: dr. Ingeborg Stals
Tutor: Jeroen De Mey
Masterproef voorgedragen tot het behalen van de graad van
Master of Science in de industriële wetenschappen: biochemie
3
Auteursrecht
“De auteur en de promotoren geven de toelating deze masterproef voor consultatie
beschikbaar te stellen en delen ervan te kopiëren voor persoonlijk gebruik. Elk ander gebruik
valt onder de beperkingen van het auteursrecht, in het bijzonder met betrekking tot de
verplichting uitdrukkelijk de bron te vermelden bij het aanhalen van resultaten uit deze
masterproef.”
“The author and the promoters give the permission to use this thesis for consultation and to
copy parts of it for personal use. Every other use is subject to the copyright laws, more
specifically the source must be specified extensively when using results from this thesis.”
De promotor
De auteur
Ingeborg Stals
Mathijs Heynderickx
4
Woord vooraf
Ik heb voor dit onderwerp gekozen vanuit mijn interesse voor energieproblematiek. Ik ben ervan
overtuigd dat we moeten investeren in verschillende vormen van biobrandstoffen zoals biodiesel en
bio-ethanol. Daarom koos ik voor het thema “verbetering van het saccharificatiepotentieel van
genetisch gewijzigde populieren”. Tijdens het literatuuronderzoek is mijn interesse voor bio-ethanol
productie sterk gegroeid.
Allereerst wil ik mijn promotor Dr. Ingeborg Stals bedanken voor het mogelijk maken van deze thesis.
Daarnaast bedank ik ook Ing. Jeroen De Mey, hij was direct aanspreekbaar voor al mijn vragen en hij
heeft heel wat bijgedragen aan de praktische uitvoering van de verschillende experimenten.
Daarnaast bedank ik hem ook voor het doorploegen van mijn schrijfsels. Samen met Ing. Pieter
Verhaegen zorgde dit duo voor de komische noot in het labo zodat af en toe eens gelachen kon
worden. Daarnaast bedank ik al mijn medestudenten voor de kameraadschap van de afgelopen vier
jaar. Ik bedankt vooral Ilse en Anke voor de steun en gesprekken van het afgelopen jaar, vooral
wanneer de frustraties door mislukte experimenten hoog opliepen. Tot slot bedank ik mijn broer
omdat die mij als geen ander begrijpt in vele opzichten. Ik wens hem de komende jaren nog veel
succes hier in Gent. Ook bedank ik mijn ouders, ze steunen mij op alle vlakken en gaven mij de kans
om te studeren en op kot te gaan in Gent.
Mathijs Heynderickx
5
Abstract
In het kader van bio-ethanolproductie zijn goedkope lignocellulosesubtraten nodig die zonder veel
voorbehandelingen hoge saccharificatierendementen halen. Daarom wordt onderzocht in hoever het
gebruik van transgene populieren kan leiden tot hogere opbrengsten op macroschaal. De populieren,
die in deze thesis gebruikt worden, waren verlaagd in transcriptie van het CCR-gen. Dit is een gen uit
de ligninesynthese. Volgens sommige auteurs is lignine de belangrijkste hinderpaal om tot een
efficiënte hydrolyse van biomassa te komen. In deze masterproef werden twee proefopstellingen
gebruikt om een verschil aan te tonen. In de eerste proefopzet wordt door opschalen van een highthroughput methode geprobeerd om de verbetering van het sacharificatiepotentieel te meten. Met
deze high-throughput methode was in de literatuur reeds aangetoond dat er een verschil was tussen
de wilde en transgene lijnen. De gemeten verschillen waren bij onze proefopzet niet overtuigend
genoeg om te besluiten dat de transgene lijn meer glucose oplevert. Bij een tweede proefopzet
werden voorbehandelingen gebruikt die industrieel toepasbaar zijn. Algemeen werd bij deze
proefopzet ook geen verschil gemeten tussen de lijnen. De Ca(OH)2 voorbehandeling was de enige
voorbehandeling waarbij de transgene lijn siginificant meer glucose had vrijgesteld.
With the view to produce bio-ethanol, there is the need of cheap lignocellulose substrates that yield
a lot of carbohydrates without much pretreatment. Therefore, it is investigated to what extent the
use of transgenic poplars may lead to higher yields on the macro scale. The poplars used in this thesis
were decreased in transcription of CCR gene. This is a gene that intervenes in the synthesis of lignin.
By some authors lignin is mentioned as the factor that contributes most to the recalcitrance of
lignocellulose biomass. In these thesis two test setups where used. In the first setup a highthroughput method was up-scaled to measure the improvement in saccharification yield. This
method was already known to be sufficient to measure a difference between wild-type and
transgenic-type. The measured differences in the first setup where not convincing enough to
conclude that the transgenic line yields more glucose than the wild-type. In a second experiment an
industrially applicable pretreatment was used. Here, no difference was measured between the lines.
The Ca (OH)2 pretreatment was the only pre-treatment where the transgenic-type significantly
released more glucose.
6
Inhoudstafel
Woord vooraf .......................................................................................................................................... 5
Abstract ................................................................................................................................................... 6
Inhoudstafel ............................................................................................................................................ 7
Lijst met tabellen, grafieken, vergelijkingen en afbeeldingen ................................................................ 9
Tabellen ............................................................................................................................................... 9
Grafieken ............................................................................................................................................. 9
Afbeeldingen ..................................................................................................................................... 10
Lijst met afkortingen ............................................................................................................................. 11
Inleiding ................................................................................................................................................. 12
1
Samenstelling biomassa ................................................................................................................ 14
1.1
Cellulose ................................................................................................................................ 14
1.2
Hemicellulose ........................................................................................................................ 15
1.3
Lignine ................................................................................................................................... 17
1.3.1
Biochemische synthese van monolignolen ................................................................... 17
1.3.2
Lignificatie...................................................................................................................... 20
1.4
2
3
Opbouw van lignocellulose biomassa .................................................................................. 21
Factoren die de enzymatische hydrolyse beïnvloeden ................................................................. 23
2.1
Kristalliniteit .......................................................................................................................... 23
2.2
Specifiek oppervlak ............................................................................................................... 24
2.3
Lignine ................................................................................................................................... 24
2.4
Hemicellulose ........................................................................................................................ 24
2.5
Besluit over parameters die hydrolyse beïnvloeden ............................................................. 25
Voorbehandelingen ....................................................................................................................... 26
3.1
Alkalische voorbehandelingen .............................................................................................. 26
3.2
SPORL..................................................................................................................................... 27
4
Enzymatische hydrolyse ................................................................................................................ 30
5
Genetische modificatie van populieren en effect op saccharificatie ............................................ 32
5.1
Downregulatie van 4CL en Cald5H gen volgens Min et al. (2012) ........................................ 32
5.2
Downregulatie van 4CL en CCoAOMT gen volgens Wang et al. (2012a) .............................. 32
5.3
4CL downregulatie door Voelker et al.(2010) ....................................................................... 33
5.4
CCR downregulatie door Van Acker et al. (2014) .................................................................. 33
7
6
Materialen en methoden .............................................................................................................. 36
6.1
6.1.1
Voorbereidende stappen(Hames et al., 2008) .............................................................. 36
6.1.2
Bepaling van extracten in de biomassa ......................................................................... 38
6.1.3
Bepaling van structurele koolhydraten en ligine........................................................... 39
6.2
7
Compositionele analyse ........................................................................................................ 36
Enzymatische hydrolyse ........................................................................................................ 40
6.2.1
Hydrolyse uitgevoerd door opschalen van de high-troughput experimenten.............. 40
6.2.2
Hydrolyse uitgevoerd op macro-schaal voorbehandelde substraten ........................... 42
Resultaten en bespreking .............................................................................................................. 45
7.1
Compositionele analyse ........................................................................................................ 45
7.2
Enzymatische hydrolyse ........................................................................................................ 48
7.2.1
Hydrolyse uitgevoerd door opschalen van de high-throughput experimenten ........... 48
7.2.2
Hydrolyse uitgevoerd volgens de meer klassieke eigen opzet...................................... 55
7.2.3
Belsuit hydrolyse experimenten .................................................................................... 60
8
Algemeen besluit ........................................................................................................................... 61
9
Referentielijst ................................................................................................................................ 62
10
Bijlagen ...................................................................................................................................... 68
10.1
Inleiding ................................................................................................................................. 68
10.2
Statistische verwerking van gegevens .................................................................................. 69
10.3
Statistische data .................................................................................................................... 70
10.3.1
Hydrolyse uitgevoerd door opschalen van de high-troughput experimenten.............. 70
10.3.2
Hydrolyse uitgevoerd volgens de meer klassieke eigen opzet...................................... 72
10.3.3
Sacharificatie Belgische lijnenen ................................................................................... 74
8
Lijst met tabellen, grafieken, vergelijkingen en
afbeeldingen
Tabellen
Tabel 1 Verschillende polysacchariden behorende tot hemicellulose.................................................. 16
Tabel 2 meest voorkomende verbindingen in lignine en relatieve hoeveelheid .................................. 20
Tabel 3 Voorbeelden NaOH voorbehandeling op loofhout. ................................................................. 26
Tabel 4 Sulfiet voorbehandeling ........................................................................................................... 27
Tabel 5 Vergelijking tussen high throughput methode en zelf uitgevoerde experimenten. ................ 41
Tabel 6 Compositionele analyse van de verschillende stalen. .............................................................. 45
Tabel 7 Vergelijking high-throughput met opschalin ............................................................................ 55
Tabel 8 opbrengstcoëfficiënt voorbehandelingen ................................................................................ 56
Tabel 9 Statistische verwerking experiment 1 sacharificatie Franse lijnen .......................................... 70
Tabel 10 Statistische verwerking experiment 2 sacharificatie Franse lijnen ....................................... 70
Tabel 11 Statistische verwerking experiment 1 glucaan opbrengst Franse lijnen ................................ 70
Tabel 12 Statistische verwerking experiment 2 glucaan opbrengst Franse lijnen ................................ 70
Tabel 13 Statistische verwerking sacharificatie Belgische lijnen........................................................... 71
Tabel 14 Statistische verwerking glucaan opbrengst Belgische lijnen .................................................. 71
Tabel 15 Statistische verwerking saccharificatieopbrengst Franse stalen met klassieke opzet ........... 72
Tabel 16 Statistische verwerking van glucaanopbrengst Franse stalen met klassieke opzet ............... 73
Tabel 17 Statistische verwerking saccharificatieopbrengst Belgische stalen met klassieke opzet ....... 74
Tabel 18 Statistische verwerking glucaanopbrengst Belgische stalen met klassieke opzet ................. 75
Grafieken
Grafiek 1 Compositionele analyse van FS40-Be lijn. ............................................................................. 46
Grafiek 2 Compositionele analyse van WT-Be lijn................................................................................. 46
Grafiek 3 Compositionele analyse van Fas13-Fr lijn.............................................................................. 47
Grafiek 4 Compositionele analyse van WT-Fr lijn. S. ............................................................................. 47
Grafiek 5 Saccharificatie opbrengst na 24h van FAS13-Fr & WT-Fr ...................................................... 49
Grafiek 6 Saccharificatie opbrengst na 72h van FAS13-Fr & WT-Fr ...................................................... 49
Grafiek 7 Glucaan opbrengst na 24h van FAS13-Fr & WT-Fr ................................................................ 50
Grafiek 8 Glucaan opbrengst na 72h van FAS13-Fr & WT-Fr ................................................................ 50
Grafiek 9 Verdeling deeltjes profiel van Fas13-Fr en WT-Fr ................................................................. 52
Grafiek 10 Saccharificatie opbrengst na 24h van FAS40-Be & WT-Be .................................................. 53
Grafiek 11 Saccharificatie opbrengst na 72h van FAS40-Be & WT-Be .................................................. 53
Grafiek 12 Glucaan opbrengst na 24h van FAS40-Be & WT-Be ............................................................ 54
Grafiek 13 Glucaan opbrengst na 72h van FAS40-Be & WT-Be ............................................................ 54
Grafiek 14 Opbrengst verschillende voorbehandelingen...................................................................... 56
Grafiek 15 Saccharificatie opbrengst na 72h met Ca(OH)2 voorbehandeling ....................................... 57
Grafiek 16 Saccharificatie opbrengst na 72h met NaOH voorbehandeling .......................................... 57
Grafiek 17 Saccharificatie opbrengst na 72h met H2S04 voorbehandeling ........................................... 58
Grafiek 18 Saccharificatie opbrengst na 72h met SPORL voorbehandeling.......................................... 58
9
Afbeeldingen
Figuur 1 Een stuk uit een cellulose keten .............................................................................................. 14
Figuur 2 Verschil tussen cellulose (a) en amylose (b)............................................................................ 15
Figuur 3 De primaire structuur van glucoronoxylaan............................................................................ 15
Figuur 4 Lignine eenheden : p-hydroxyphenyl- (H), guaiacyl- (G) en syringyl- (S) ................................ 17
Figuur 5 Biosynthese uit fenylalanine tot p-coumarylalcohol, coniferylalcohol, 5hydroxyconiferylalcohol en sinapylalchohol ......................................................................................... 19
Figuur 6 Radicalisatie van coniferylalcohol naar een eigen bewerking van een figuur naar ................ 20
Figuur 7 Overzicht van de meest voorkomende verbindingen in een lignine netwerk ....................... 21
Figuur 8 opbouw van levende celwand met middenlamel, primaire en secundaire celwand ............ 22
Figuur 9 Opbouw van hout ML=Midden Lamel, P =primaire cel wand, S1;S2;S3 = secundaire celwand
............................................................................................................................................................... 22
Figuur 10 Verzeping met hydroxide ion van esterbinding tussen lignine en koolhydraat.................... 27
Figuur 11 Vorming van benzylium cation als belangrijk reactief intermediair in zuur sulfiet koken ... 29
Figuur 12 Reacties van β-O-4 structuren tijdens zure sulfiet voorbehandeling ................................... 29
Figuur 13 Reacties van β-O-4 structuren tijdens neutrale sulfiet voorbehandeling ............................ 29
Figuur 14 Fritz Pulverisette 15............................................................................................................... 37
Figuur 15 Soxhlet apparaat .................................................................................................................. 38
Figuur 16 Praktische uitvoering van enzymatische hydrolyses ............................................................. 42
10
Lijst met afkortingen
PAL
C4H
4CL
CCR
CAD
C3H
HTC
CCoAMT
COMT
F5H
ATP
Ca(OH)2
NaOH
SPORL
Pathway
Downgeguleerd
end-over-end mixer
Ball milling
FPU
DS
NMR
Downstream processing
phenylalanine ammonia-lyase
cinnamate 4-hydroxylyase
4-coumarate: CoA ligase
cinnamoyl-CoA reductase
cinnamyl alcohol dehydrogenase
p-coumarate 3-hyrdoxylyase
hydroxycinnamoyl-CoA:shikimate/quinate of
hydroxycimnamoyltranferase
caffeoyl-CoA O-methyltransferase
caffeïnezuur O-methyltransferase
ferulate 5-hydroxylase
adenosinetrifosftaat
calciumhydroxide
natriumhydroxide
sulfite pretreatment to overcome recalcitrance of lignocellulose
reactieweg
verlaagd (met betrekking tot genexpressie)
rondraaiende incubator
kogel malen
filter paper units
droge stof gehalte
Nuclear magnetic resonance
opzuivering en verwerking van chemicaliën
11
Inleiding
In deze thesis wordt gekeken wat het effect is van genetische wijzigingen in het genoom van Populus
Trichocarpa op het saccharificatiepotentieel. De stalen die geanalyseerd werden in deze thesis zijn
allemaal afkomstig van veldproeven met populieren die verminderd zijn in de expressie van het CCRgen. Deze realisatie kan gezien worden als een voorbeeld van de integratie van groene en witte
biotechnologie (Vanholme et al., 2013). De laatste jaren is vooral door de verdienste van de witte
biotechnologie enorme vooruitgang geboekt in de productie van o.a. bio-ethanol op basis van
lignocellulose. Hieronder wordt kort het productieproces uitgelegd van bio-ethanol en hoe verlaging
van het CCR-gen kan bijdragen tot een hogere opbrengst. Om ethanol en andere biochemische
metabolieten te produceren met micro-organismen wordt meestal uitgegaan van glucose als
grondstof (Lehmann, 2007). Voor productie van bulkchemicalïen zoals bio-ethanol kan gebruik
gemaakt worden van goedkope grondstoffen (zoals melasse) (Carvajal et al., 2010). Omdat de deze
nevenstroom van de suikerindustrie eerder beperkt is, wordt ook gezocht naar andere goedkope
grondstoffen die ons koolhydraten kunnen leveren voor het uitvoeren van deze fermentaties. Een
mogelijke suikerbron is lignocellulose. Technisch gezien is hier reeds een hele weg afgelegd. Het is
reeds mogelijk op industriële schaal bio-ethanol te produceren op basis van voedselgewassen als
suikerriet, mais en tarwe. Deze bio-ethanol wordt bio-ethanol van de eerste generatie genoemd.
Omdat deze omdat deze echter concurreert met de voedselproductie (An et al., 2011) wordt
uitgekeken naar alternatieven zoals lignocellulose biomassa. Op laboschaal is dit reeds mogelijk
maar er zijn nog een aantal technische problemen, die een economische en rendabele productie op
grote schaal verhinderen. Als je de productie van bio-ethanol uit lignocellulose biomassa bekijkt, kan
je ruwweg vier stappen onderscheiden: voorbehandeling, saccharificatie, vergisting en opzuivering
(down stream processing) (Vanholme et al., 2013). Eerst wordt lignocellulose biomassa - dit is
verzamelnaam voor verschillende soorten plantenmateriaal (hout, bladeren, wortels en stengels
maar ook papier en karton) - onderworpen aan een voorbehandelingstap. Hierdoor wordt het
rendement van de volgende stap (saccharificatie) verbeterd. De biomassa wordt hierbij chemisch en
fysisch behandeld waardoor de biomassa poreuzer wordt en een deel van de lignine verwijderd
wordt. Bij te strenge voorbehandelingscondities worden echter ook inhibitoren geproduceerd
(Vanholme et al., 2013). Na deze stap worden cellulasen toegevoegd voor de saccharificatie, dit zijn
enzymen afkomstig van micro-organismen, meestal schimmels, die in de natuur kunnen groeien op
lignocellulose biomassa. Deze enzymen breken de grote moleculaire structuren in de plant af tot
kleinere koolhydraten (Vanholme et al., 2013).
Naast de kost van de enzymen (Vanholme et al., 2013) is vooral de voorbehandeling duur omdat dit
een zeer energie-intensieve stap is. Daarom wordt de voorbehandeling dan ook beschouwd als één
van de grote bottlenecks. De experimenten uit mijn thesis zijn gebaseerd op de hypothese dat
transgene populieren meer fermenteerbare suikers kunnen opleveren met mildere
voorbehandelingscondities. Getransformeerde populier lijnen die geselecteerd waren op basis van
geschikte fenotypische kenmerken, werden buiten een serre gekweekt. Na de groei werden de
bomen geoogst en verdeeld in verschillende fracties. De fracties die de beste fenotytpsiche
kenmerken hadden werden geanalyseerd. Naast een compositionele analyse gebeurde ook een
enzymatische high-throughput saccharificatie. Uit resultaten van deze geautomatiseerde
saccharificatie kon duidelijk worden afgeleid dat de transgene lijnen beduidend meer glucose en
xylose opleverden bij de zelfde voorbehandeling. Deze high-throughput saccharificatieproef werd als
12
vertrekpunt gekozen om te schalen. Daarnaast werden ook voorbehandelingen uitgevoerd die
industriële voorbehandelingsmethoden meer benaderen.
In de literatuurstudie wordt eerst de samenstelling van lignocellulose biomassa beschreven. Daarna
wordt de ligninesynthese uitgelegd door de biochemische pathways te beschrijven. In het volgende
hoofdstuk wordt uitgelegd wat de oorzaken zijn van het recalcitrante gedrag van lignocellulose
biomassa. Er wordt kort besproken wat de effecten zijn van de voorbehandelingen die toegepast
werden in deze thesis. Vervolgens wordt ingegaan op de werking van de enzymen. In het laatste
hoofdstuk van de literatuurstudie worden voorbeelden uit de literatuur gegeven van genetisch
gemodificeerde populieren en het effect hiervan op het saccharificatiepotentieel. De vergisting van
de suikers tot bio-ethanol wordt in deze thesis niet behandeld.
In hoofdfstuk “Materiaal en methoden” wordt beschreven hoe de compositionele analyse werd
uitgevoerd. Hierin wordt ook uitgelegd op welke manier de voorbehandelingen en hydrolyses
werden uitgevoerd. In het hoofdstuk “Resultaten” wordt weergeven hoe de resultaten berekend
werden en of dat er significante verschillen waarneembaar zijn. Ten slotte volgt nog een hoofdstuk
met de bespreking van de resultaten en een algemeen besluit.
13
1 Samenstelling biomassa
Planten blijken bestand te zijn tegen regen en wind. Ze kunnen met hun wortels harde bodems
doordringen. Wanneer we bedenken dat een plant voor 70 % uit water bestaat, is dit op zijn minst
merkwaardig te noemen. Het is de plantencelwand die aan de basis ligt van deze eigenschappen. De
componenten in de celwand kunnen we indelen in drie groepen: cellulose, hemicellulose en lignine.
Deze structuren geven stevigheid aan alle planten. In het plantenrijk bestaat er een rijke variatie qua
samenstelling van de celwand (Gibson, 2012; Lee et al., 2011)
Lignocellulose biomassa is in hoofdzaak uit drie componenten opgebouwd: cellulose, hemicellulose
en lignine. Pectine is ook een bestanddeel maar, de primaire celwand en middenlammel buiten
beschouwing gelaten, komt nagenoeg niet voor in populier, het onderwerp van deze masterproef. De
secundaire celwand bestaat voornamelijk uit cellulose, hemicellulose en lignine.
1.1 Cellulose
Cellulose is de belangrijkste vezel in het plantenrijk. Het is een lange polysaccharideketen die bestaat
uit 7000 tot 15000 β-D-glucose monomeren die via β-(1,4)-glycosidische bindingen aan elkaar
geschakeld zijn.
Figuur 1 Een stuk uit een cellulose keten
Cellulose heeft zijn typische structuur te danken aan de β-oriëntering op de koolstof 1 (C1) van
glucose. Door de β-oriëntering zijn de glucose monomeren 180° gedraaid ten opzichte van elkaar.
Hierdoor vormen de ketens een macromoleculaire structuur van β-(1,4)-gelinkte β-D-glucose
eenheden samengepakt in microfibrillen, waarbij kristallijne en niet-kristallijne regio’s elkaar
afwisselen. De kristallijne structuren zijn groter en hebben een lengte van 20nm (Gibson, 2012). De
kristallijne structuur ontstaat doordat er aan elke kant van de keten evenveel waterstofbruggen
gevormd kunnen worden door de draaiing van 180° tussen naburige glucose eenheden (Gibeaut and
Carpita, 1994). Dit is in tegenstelling tot amylose en amylopectine, waar de C1 van glucose een αoriëntering heeft waardoor alle glucose eenheden op dezelfde manier georiënteerd zijn. Hier wordt
door waterstofbrugvorming tussen twee hydroxylgroepen op C2 en C6 van naast elkaar liggende
glucose eenheden, de helixstructuur van zetmeel gevormd (BeMiller and Whistler, 2009; Humpula et
al., 2011) en geen intermoleculaire waterstofbruggen, zoals bij het stevigere cellulose.
14
Figuur 2 Verschil tussen cellulose (a) en amylose (b)(Brandt et al., 2013)
1.2 Hemicellulose
In tegenstelling tot cellulose is hemicellulose korter (500 tot 3000 monomeren per keten) en
complexer van structuur. Vaak bestaat het uit een ruggengraat van xylose (xylaan) of mannose
(mannaan) waarop nog zijketens staan bestaande uit verschillende andere koolhydraatmonomeren
(Tabel 1). Ook zure groepen als α-D-glucuron-, α-D-4-O-methylgalacturon- en α-D-galacturonzuur
komen voor. De meest voorkomende pentosen in hemicellulose zijn β-D-xylose en α-L-arabinose.
Vaak voorkomende hexosen zijn β-D-mannose, β-D-glucose en α-D-galactose. Hemicellulose heeft
in tegenstelling tot cellulose geen kristallijne structuur.
Figuur 3 De primaire structuur van glucoronoxylaan (Ebringerova et al., 2005).
15
De hemicellulose van populieren bestaat zoals de meeste andere loofbomen voornamelijk uit
glucuronoxylaan (Figuur 3) In glucuronoxylaan is de verhouding tussen de xylose eenheden over de
4-O-methyl-α-D-glucuronzuur groepen ongeveer 10:1. Hemicellulose, geïsoleerd uit populieren door
middel van enkelvoudige alkalische extractie, bevatte volgens Jiang et al. tussen 90% en 79% xylose.
De belangrijkste soort hemicellulose was in dit geval glucoronoxylaan met een lage subsitutiegraad.
Daarnaast werden ook minieme hoeveelheden glucomannaan en sporen van de andere sacchariden
gevonden (Jiang et al., 2014).
Polysaccharide
Arabinogalactaan
Oorsprong biomassa
Naaldhout
Ruggengraat
β-D-Galactose
zijketens
β-D-Galactose
α-L-Arabinose
Xyloglucaan
Loofhout, grassen
β-D-Glucose
β-D-Xylose
β-D-Xylose
β-D-Galactose
α-L-Arabinose
α-L-Fucose
Acetyl
Galactoglucomannaan
Naaldhout
β-D-Mannose
β-D-Glucose
β-D-Galactose
Acetyl
Glucomannaan
Naaldhout en loofhout
β-D-Mannose
β-D-Glucose
Glucoronoxylaan
Loofhout
β-D-Xylose
Arabinoglucoronoxylaan
Grassen en granen, en naaldhout
β-D-Xylose
4-O-Methyl-α-DGlucuronzuur
Acetyl
4-O-Methyl-α-DGlucuronzuur
α-L-Arabinose
Arabinoxylaan
Granen
β-D-Xylose
α-L-Arabinose
Glucuronoarbinoxylaan
Grassen en granen
β-D-Xylose
α-L-Arabinose
4-O-Methyl-α-DGlucuronzuur
Acetyl
Homoxylaan
Algen
β-D-Xylose
Tabel 1 Verschillende polysacchariden behorende tot hemicellulose naar een tabel van (Girio et al., 2010) oorspronkelijke
bronnen (Carpita and Gibeaut, 1993; de Vries and Visser, 2001; Ebringerova et al., 2005)
16
1.3 Lignine
Lignine is een aromatisch polymeer dat deels verantwoordelijk is voor de stijfheid en sterkte van de
celwand, daarnaast maakt het de celwand water ondoorlatend. Tijdens de evolutie hebben planten
de mogelijkheid om lignine te synthetiseren ontwikkeld toen de eerste landplanten zich
ontwikkelden uit de waterplanten. Daarnaast speelt het ook een rol in de bescherming tegen
pathogenen (Ferrer et al., 2008; Vanholme et al., 2010). Het kan beschouwd worden als de lijm die
cellulose- en hemicellulosefibrillen aan elkaar bindt. Deze hydrofobe structuur bemoeilijkt de
enzymatische afbraak van lignocellulose (Boerjan et al., 2003). In planten bevat de secundaire
celwand vooral veel lignine (Vanholme et al., 2008). Lignine is een polymeer dat hoofdzakelijk is
opgebouwd is uit p-hydroxyphenyl- (H), guaiacyl- (G) en syringyl- (S) eenheden (Figuur 4). Deze zijn
afgeleid van precursor monolignolen (p-coumarylalcohol, coniferylalcohol en sinapylalcohol).
Populier bevat net als alle hardhout planten vooral G- en S-units. Zachthout of loofhout bestaat
voornamelijk uit G-units met een kleine fractie H-units (Hu and Ragauskas, 2012).
Figuur 4 Lignine eenheden : p-hydroxyphenyl- (H), guaiacyl- (G) en syringyl- (S) (SIXTA, 2006)
In de ligninesynthese zijn twee stadia te onderscheiden: enerzijds is er de enzymatisch/biochemische
omzetting van fenylalanine tot monolignolen waavan de bekenste p-coumarylalcohol,
coniferylalcohol en sinapylalcohol zijn. Anderzijds is er de radicalaire koppeling van deze precursoren
tot een ‘willekeurig’ lignine netwerk.
1.3.1 Biochemische synthese van monolignolen
De biochemische pathway voor de lignine precursoren begint uit het aminozuur fenylalanine. Dit
aminozuur is afkomstig uit de shikimate-pathway, waaruit ook de andere aromatische aminozuren
gevormd worden. Door een pathway waarin verschillende genen betrokken zijn, worden
fenylpropanoïdes uit fenylalanine gesynthetiseerd. De fenylpropanoïdes zijn een verzamelnaam voor
stoffen met een aromatisch gedeelte en een geconjugeerde staart met drie koolstofatomen. Deze
pathway wordt enkel teruggevonden in planten, fungi en bacteriën. In Figuur 5 wordt Fenylalanine
eerst gedeamideerd tot kaneelzuur door phenylalanine ammonia-lyase (PAL). Vervolgens wordt een
OH-groep geïntroduceerd op de para-plaats van de aromatische ring van kaneelzuur door cinnamate
4-hydroxylyase (C4H) met vorming van para-coumarinezuur. Daarna wordt door het enzym 4coumarate: CoA ligase (4CL) een Co-enzym A thio-ester bekomen van coumarinezuur namelijk pcoumaroyl-CoA. Dit is een voorbeeld van een fenylpropanoïde thio-ester dat kan deel nemen aan
monolignol- maar ook flavenoïde- en benzenoïdebiosysnthese (Boerjan et al., 2003; Ferrer et al.,
2008; Vanholme et al., 2012).
17
Er zijn echter ook nog twee andere intermediairen die gevormd kunnen worden uit deze pathway
met twee bijkomende enzymen. Het tweede intermediair is cafeïnezuur dat gevormd wordt door
middel van cinnamate 4-hydroxylyase (C4H) uit p-coumarinezuur. Na activatie met 4CL krijgen we de
geactiveerde vorm van cafeïnezuur: caffeyol-CoA. Het derde intermediair ferulazuur wordt gevormd
uit cafeïnezuur door een methylatie van de zuurstof op de metaplaats van cafeïnezuur. Het enzym
dat betrokken is bij deze stap is cafeïnezuur O-methyltransferase (COMT). Ook hier kan een activatie
gebeuren met 4CL zodat opnieuw een CoA-thio eters gevormd wordt (Boerjan et al., 2003; Ferrer et
al., 2008; Vanholme et al., 2012) .
In de Figuur 5 staan ook vier indermediairen weergegeven tussen grote haken. Deze pathway is een
van recenste ontdekkingen in de synthese. Er gebeurt een omzetting via het ester van p-coumaroylCoA met shikiminezuur of quininezuur via hydroxycinnamoyltranferase (HCT). Vervolgens wordt door
het enzym C3H p-coumaroyl- shikiminezuur/quininezuur omgevormd tot cafeoylshikiminezuur/quininezuur. Om cafeoyl-CoA te bekomen wordt opnieuw HCT gebruikt, ditmaal om
de transesterificatie in de tegengestelde richting uit te voeren.
De feitelijke monolignolsynthese gebeurt met drie extra enzymen cinnamoyl-CoA reductase (CCR),
ferulate-5-hydroxylase (F5H) en cinnamyl alcohol dehydrogenase (CAD) (Vanholme et al., 2012).
Deze enzymen vormen in loofhout – dus ook in populier - vooral coniferylalcohol en sinapylalcohol.
Eerst gebeurt een reductie door het CCR enzym. Het is logisch wanneer dat dit gen verminderd
wordt in expressie – zoals de bomen die gebruikt werden in deze thesis - dat er verminderde
synthese plaatsvindt van coniferylalcohol en sinapylalcohol. Tegelijkertijd vindt in deze bomen
stroomopwaarts de opstapeling plaats van ferulazuur (Leple et al., 2007). Na de tussenkomst van CCR
enzym wordt coniferaldehyde gehydroxyleerd op de 5-positie van aromatische ring tot 5hydroxyconiferaldehyde door ferulate-5-hydroxylase (F5H). Het pas gevormde alcohol op 5hydroxyconiferaldehyde wordt dan omgezet tot het methylether door COMT tot sinapaldehyde. De
gevormde aldehydes (coniferaldehyde en sinapaldehyde) worden in de laatste stap omgezet tot
coniferylalcohol en sinapylalcol door hetzelfde enzym CAD (Boerjan et al., 2003; Vanholme et al.,
2012). Er is ook nog vorming mogelijk van p-coumarylalcohol maar omdat het hardhout betreft is dit
van minder belang.
Door bovenstaande netwerk van reacties te begrijpen krijgen we een idee van de verschillende
genen die in aanmerking komen voor het genetisch wijzigen van lignine-inhoud en -samenstelling.
Men probeert door alternatieve monomeren in te bouwen, lignine te bekomen die een minder
inhiberende werking heeft op de saccharificatie van de cellulose en hemicellulose. Men wil daarom
(1) monomeren met een direct splitsbare groep, (2) een hydrofiel karakter (oplosbaar in water), (3)
een lage polymerisatiegraad en (4) minder verbindingen met hemicellulose (Vanholme et al., 2012).
Na biosynthese van de verschillende lignine eenheden worden ze verplaatst naar de apoplast van de
cel via een mechanisme waarbij ATP met een transporteiwit (ATP-binding casette) zorgt voor
verplaatsing (actief transport). Het exacte mechanisme hiervan is nog niet helemaal opgehelderd.
Men weet wel dat geglycosyleerde lignine monomeren preferentieel opgeslagen worden in polaire,
beter oplosbare vormen in de vacuolen van de plantencellen. De niet-geglycosyleerde monomeren
worden direct getransporteerd tot buiten de celwand waar vervolgens de lignificatie plaatsvindt.
(Miao and Liu, 2010)
18
Figuur 5 Biosynthese uit fenylalanine tot p-coumarylalcohol, coniferylalcohol, 5-hydroxyconiferylalcohol en
sinapylalchohol. Figuur werd bewerkt (Vanholme et al., 2012) door middel van ACD/ChemSketch (Freeware) ACDlabs
19
1.3.2 Lignificatie
Op het moment dat de lignine monomeren de celwandmatrix binnenkomen worden ze door
peroxidasen en/of laccasen geradicaliseerd. De initiatie van de radicalisatie verloopt wel nog
enzymatisch. De lignineradicalen zijn resonantie-gestabiliseerde-radicalen (Figuur 6). De radicale
koppeling is echter een puur chemisch proces dat onafhankelijk is van enzymen. Elke fenolische
molecule die de juiste chemische (kinetische en thermodynamische) radicaal genererende
eigenschappen heeft, kan deelnemen aan het polymerisatieproces.
Figuur 6 Radicalisatie van coniferylalcohol naar een eigen bewerking van een figuur naar (Vanholme et al., 2012) door
middel van ACD/ChemSketch (Freeware) ACDlabs
Ligninificatie (of cross-coupling) is een proces waarbij ligninemonomeren meestal op hun β-positie
ingebouwd worden in het groeiende polymeer (Boerjan et al., 2003). De β-positie is het meest
reactief door de resonantiestabilisatie (Figuur 6). Deze koppeling kan leiden tot verschillende soorten
bindingen zoals weergegeven in Tabel 2. Zo is ongeveer 60% van de verbindingen tussen de
verschillende eenheden een β-O-4 of β-arylbinding (Figuur 7). Deze binding wordt gevormd tussen
het β koolstof van het betreffende monolignol en de zuurstof op plaats vier van de aromatische ring
van het groeiende oligomeer. De andere bindingen tussen de verschillende eenheden zijn
voornamelijk β-5- en β-β-bindingen. Deze koolstof-koolstof- of gecondenseerde bindingen zijn veel
sterker dan de β-O-4-binding (Vanholme et al., 2012). Wanneer lignocellulose biomassa
voorbehandeld wordt om cellulose en hemicellulose vrij te stellen, tracht men vooral de β-O-4binding te breken door een zure of basische voorbehandeling. De gecondenseerde bindingen zijn
enkel te breken onder omstandigheden waarbij alle suikers volledig gehydrolyseerd worden.
Type verbinding in hardhout
Dimeer structuur
Percentage
β‐O‐4
Fenylpropaan‐ β‐aryl ether
60,00
α‐O‐4
Fenylpropaan- α aryl ether
7,00
β ‐5
Fenylcoumaraan
6,00
5‐5
BiFenyl
5,00
4‐O‐5
Diaryl ether
7,00
β ‐1
1,2‐Diaryl propaan
7,00
β‐β
β-β-gelinkte structuur
3,00
Tabel 2 meest voorkomende verbindingen in lignine en relatieve hoeveelheid (Fengel and Wegener, 1989)
20
Figuur 7 Overzicht van de meest voorkomende verbindingen in een lignine netwerk (SIXTA, 2006)
1.4 Opbouw van lignocellulose biomassa
Cellulose, hemicellulose en lignine zijn de bouwstenen van de biomassa. Deze bouwstenen zijn
echter ook onderling met elkaar verbonden via verschillende intermoleculaire verbindingen.
Het is al lang aangetoond dat er waterstofbindingen tussen de drie componenten gevormd
worden. Daarnaast is er ook bewijs van esterverbindingen tussen hemicellulose en lignine
(Tarkow and Feist, 1969). Er zijn ook etherverbindingen tussen lignine en koolhydraten. Het is
echter niet bekend of deze etherbindingen ook tussen cellulose of hemicellulose gevormd
worden (Harmsen, 2010).
21
Figuur 8 opbouw van levende celwand met middenlamel, primaire en secundaire celwand (Brandt et al., 2013)
Hout is opgebouwd uit langgerekte dode cellen die watertransport toelaten. Deze structuur wordt
initieel gevormd door levende protoplasten. In houtvormend weefsel (vasculair cambium) ontstaat
secundair xyleem en secundair floëem weefsel (Mellerowicz et al., 2001). De cellen in dit weefsel
bestaan uit verschillende lagen. De middenlamel is de buitenste laag die ontstaat tijdens de celdeling,
deze laag bevat vooral veel pectine. Daarna wordt de primaire celwand gevormd (SIXTA, 2006). De
primaire celwand bestaat ongeveer voor de helft uit pectine met daarnaast nog cellulose en xylaan
(Mellerowicz et al., 2001). Deze celwand laat nog celstrekking toe. Wanneer de secundaire celwand
ontstaat, wordt de celwand vooral veel dikker. De secundaire celwand draagt het meeste bij tot de
biomassa omdat deze het dikste is (SIXTA, 2006). De lignificatie van de celwand is de laatste stap die
plaatsvindt. Na de lignificatie ondergaat de protoplast geprogrammeerde celdood om nu als dood
xyleemweefsel te functioneren.
Figuur 9 Opbouw van hout ML=Midden Lamel, P =primaire cel wand, S1;S2;S3 = secundaire celwand (SIXTA, 2006).
22
2 Factoren die de enzymatische hydrolyse
beïnvloeden
2.1 Kristalliniteit
Ruwweg kan gezegd worden dat 2/3 van alle cellulose kristallijn is en dat 1/3 amorf is. Volgens
theoriën uit de jaren ’80 zijn amorfe regio’s gemakkelijker hydrolyseerbaar door de verschillende
cellulasen. Om de hoeveelheid amorfe regios te kunnen vergelijken werd het begrip kristalliniteit
geïntroduceerd. Dit is een index tussen nul en één die berekend wordt via de verhouding van
piekkarakteristieken uit het X-straal difrractie patroon of NMR spectrum van biomassa (Park et al.,
2010).
Dat amorfe regio’s makkelijker hydrolyseerbaar zijn, strookt met het feit dat een vermindering van
de kristalliniteit een verhoging geeft van het saccharificatiepotentieel (Eschenburg et al., 2002; Fan et
al., 1980; Fan et al., 1981; Hall et al., 2010; Park et al., 2010; Sasaki et al., 1979).
Er zijn echter ook studies uitgevoerd waarbij hiervoor geen bewijs werd gevonden (Chen et al., 2007;
Grethlein, 1985; Mansfield et al., 1999; Puri, 1984; Ramos et al., 1993; Thompson et al., 1992; Zhang
and Lynd, 2004).Volgens Grethlein (1985) heeft de mate van kristalliniteit nauwelijks effect maar is
poriegrootte en porievolume veel belangrijker. Thompson (1992) concludeerde dan weer dan vooral
de verhouding tussen de grootte van enzymen en de grootte (diameter) van de poriën van belang is
(Thompson et al., 1992).
Een mogelijke verklaring voor deze tegenstrijdige studies wordt geleverd door Mansfield (1999). De
studies die een positieve correlatie vonden tussen de hydrolyseerbaarheid en de kristalliniteit
gebruikten als substraat relatief zuiver cellulose die mechanisch behandeld werd, waardoor de
kristaliniteit veranderde. Het zou kunnen dat bij deze voorbehandelingstechniek het specifiek
oppervlak groter wordt waardoor de hydrolyse sneller verloopt (Converse et al., 1990).
In de literatuur worden de verschillende vormen van cellulose uitgebreid beschreven. Hieronder
wordt een kort overzicht van de verschillende vormen gegeven. Deze verschillende basis vormen
word en elk gekarakteriseerd door een eigen specifiek X-straal diffractiepatroon.
Cellulose Iα en Iβ zijn de vormen die doorgaans voorkomen in de natuur. Bij hogere planten wordt
meer cellulose Iβ aangetroffen. De andere soort wordt meer geassocieerd met algen en bacteriën. Er
is geweten dat ze dezelfde cellulose ruggengraatstructuur hebben, enkel de manier waarop de
waterstofbruggen georiënteerd zijn, verschilt (Atalla and VanderHart, 1999). Het minder stabiele
cellulose Iα kan omgezet worden tot Iβ door verhitting (Wang et al., 2013).
Cellulose II heeft een lagere kristalliniteit en specifiek oppervlak. Het neemt ook sneller water op dan
dan cellulose I. Het bevat in tegenstelling tot cellulose I ook antiparallelle ketens. Uit testen blijkt dat
cellulose II beter enzymatisch hydrolyseerbaar is dan cellulose I(Kobayashi et al., 2012; Wada et al.,
2010).
Cellulose II wordt bekomen uit cellulose I door middel van regeneratie waarbij cellulose I wordt
behandeld met een solvent en vervolgens verdund met water waardoor het terug neerslaat als
cellulose II. Ook kan het bekomen worden uit cellulose I door middel van mercerisatie waarbij
23
cellulose I wordt behandeld met geconcentreerd NaOH (Osullivan, 1997). Deze twee verschillende
manieren resulteren toch in gelijkaardige kristalstructuren (Langan et al., 2001).
Wanneer cellulose I of II behandeld wordt met vloeibare ammoniak, wordt na verdamping cellulose
III gevormd (Osullivan, 1997; Zugenmaier, 2001). Cellulose IV wordt bekomen door verhitting in
glycerol tot 206°C (Osullivan, 1997). Wegens de weinige studies moeten uitspraken over
hydrolyseerbaarheid met nodige voorzichtigheid behandeld worden en zijn daarom ook niet meer
relevant in deze thesis.
2.2 Specifiek oppervlak
Omdat het begin van de enzymatische hydrolyse een heterokatalytische stap is, is het oppervlak
waar enzymen op kunnen binden zeer belangrijk. Volgens veel wetenschappers is een verhoging van
het specifiek oppervlak geen echte factor die bijdraagt tot een verhoging van de hydrolyse maar
eerder een gevolg van voorbehandelingen waar lignine en hemicellulose verwijderd wordt
(Taherzadeh and Karimi, 2008; Wyman, 1996).
Anderzijds kunnen we het oppervlak van lignocellulose verdelen in een intern en extern oppervlak.
Het extern oppervlak kan gerelateerd worden aan de grootte en vorm van de partikels terwijl het
intern oppervlak afhangt van de capillaire structuur. Meestal zal de voorbehandeling het intern
oppervlak vergroten door opname van water of andere solventen. Drogen zal meestal zorgen voor
het onomkeerbaar sluiten van de poriën. Hierdoor wordt het saccharificatiepotentieel verminderd
(Fan et al., 1980; Taherzadeh and Karimi, 2008).
2.3 Lignine
Cellulose en hemicellulose zijn aan elkaar bevestigd door middel van lignine. Het hydrofobe lignine
beschermt cellulosefibrillen als fysieke barrière waardoor het specifiek oppervlak kleiner is en minder
zwelling plaatsvindt (Grethlein et al., 1984; Mansfield et al., 1999; Stone et al., 1969; Taherzadeh and
Karimi, 2008). Hoe meer water de biomassa bevat, hoe groter de poriën en hoe beter de
saccharificatie (enzymatische afbraak) gebeurt. Lignine verhindert niet enkel de hydrolyse op een
fysische manier als barrière maar ook op diverse andere manieren (Ucar and Fengel, 1988). Zo kan
aan lignine een deel van de enzymen geadsorbeerd worden. Eens geadsorbeerd, kunnen ze geen
celluloseketens afbreken (Agbor et al., 2011; Clesceri et al., 1985; Converse et al., 1990; Lee et al.,
1994). Tenslotte kan ook opgelost lignine ten gevolge van een voorbehandeling, inhiberend werken
op de verschillende cellulasen en hemicellulasen (Berlin et al., 2006). Een van de belangrijkste doelen
van de voorbehandeling is dus het verwijderen van de lignine.
Bij biomassa met gelijke lignine inhoud kan soms de verhouding van S/G units informatie geven over
de recalcitrantie van de biomassa. Guaicylgroepen leiden tot meer gecrosslinkt lignine waardoor
meer bifenyleenheden en ander koolstof-koolstof bindingen gevormd worden. Syringyl eenheden
vormen meestal meer labiele etherbindingen via de 4-hydroxyfunctie. De S/G verhouding is best zo
hoog mogelijk zodat de kans op gecondenseerde bindingen lager wordt (Dixon et al., 1996; Ferrer et
al., 2008; Li et al., 2000).
2.4 Hemicellulose
Hemicellulose schermt net als lignine de cellulose microfibrillen af tegen enzymatische afbraak.
Meestal wordt door de voorbehandeling een deel van de hemicellulose verwijderd. Door recenter
gebruik van hemicellulases in industriële enzym-cocktails, verkrijgt men een synergetisch effect
24
tussen de cellulasen en de hemicellulasen omdat ze samen de matrix efficiënter ontsluiten. De
hemicellulosefractie is tevens een interessante fractie voor valorisatie. Daarom is het minder
belangrijk om het hemicellulose te verwijderen bij de voorbehandeling.
2.5 Besluit over parameters die hydrolyse beïnvloeden
Het mag duidelijk zijn dat het moeilijk is om het belangrijkste effect van een voorbehandeling naar
voor te schuiven. De effecten van voorbehandeling moeten synergetisch bekeken worden omdat er
meestal meerdere aanwijsbare effecten zijn die zorgen voor de verbeterde hydrolyse van
lignocellulose.
25
3 Voorbehandelingen
Omdat er veel verschillende voorbehandelingstechnieken bestaan, worden hier enkel de
voorbehandelingen toegelicht die getest zijn op de populierstalen tijdens de masterproef. De
efficiëntie van een voorbehandeling wordt meestal beïnvloed door de gebruikte reactietemperatuur,
voorbehandelingstijd en de concentratie van de gebruikte chemicaliën.
3.1 Alkalische voorbehandelingen
Een alkalische voorbehandeling is één van de vele methoden die aangewend kunnen worden in de
behandeling van biomassa. De alkalische voorbehandelingen kunnen onderverdeeld worden in twee
groepen: (a) voorbehandelingen met NH3 en (b) voorbehandelingen met NaOH en Ca(OH)2
(Carvalheiro et al., 2008). Alle drie kunnen ze gebruikt worden door betreffende stof in oplossing te
brengen. Met ammoniak is echter ook Ammonia Fiber Explosion (AFEX) mogelijk. Dit is vergelijkbaar
met stoomexplosie. Hier wordt echter onder hoge druk vloeibaar ammoniakgas gebruikt. Na
drukdaling vind een expansie plaats waarbij de poriën openbarsten. Hierbij is het mechanisch effect
veel belangrijker dan bij een gewone voorbehandeling. Daarnaast wordt soms ook oxidatieve kalk
toegepast. Hierbij wordt biomassa in waterig milieu onder zuurstofdruk geplaatst waarbij ondermeer
het lignine verwijderd wordt. Hier spelen echter ook nog oxidatieve processen mee die niet
voorkomen bij een gewone Ca(OH)2 voorbehandeling.
Het belangrijkste effect dat optreedt tijdens de alkalische voorbehandeling is de verwijdering van
lignine (Silverstein et al., 2007; Zheng et al., 2009). Daarnaast wordt in mindere mate ook
hemicellulose verwijderd. Voordelen van basische voorbehandeling zijn lagere
voorbehandelingstemperaturen en lagere drukken in vergelijking met verdund zure
voorbehandelingen. Onder andere hierdoor worden tijdens basische voorbehandelingen veel minder
degradatieproducten als furfural en hydroxymethylfurfyral (HMF) gevormd (Pavlostathis and Gossett,
1985; Zheng et al., 2009).
Er zijn verschillende studies uitgevoerd over NaOH voorbehandelingen waarbij de
hydrolyseerbaarheid duidelijk verbetert (Chang et al., 1997; Kassim and Elshahed, 1986; Wan et al.,
2011; Wu et al., 2011). De effectiviteit werd reeds voor verschillende soorten biomassa bewezen
(Tabel 3 ).
Substraat
Populier
Cryptomeria
japonica
Voorbehandeling condities
Saccharificatie
Enzyme dossage
referentie
1 g biomassa 25 mL 5 N NaOH
150 °C gedurende 1 h.
77%
(Oka et al., 2013)
Eucalyptus
camaldulensis
1 g biomassa in 25 mL 5 N NaOH
150 °C gedurende 1 h.
70%
cellulase van Trichoderma reesei (15
FPU/g susbtraat),
Celluclast 1.5 L, Novozymes
b-glucosidase Aspergillus niger (80
CBU/g substraat), Novozyme 188,
Novozymes) in 10 mL
cellulase van Trichoderma reesei (15
FPU/g susbtraat),
Celluclast 1.5 L, Novozymes
b-glucosidase Aspergillus niger (80
CBU/g substraat), Novozyme 188,
cellulase (15 FPU/g substraat) van
Bacillus amyloliquifaciens ARC3
(Rawat et al., 2013)
Populus
deltoides
2.8% NaOH in vast vloeistof
verhouding 1:8 bij 94 ◦C voor 1 h
41.5%
(Oka et al., 2013)
Tabel 3 Voorbeelden NaOH voorbehandeling op loofhout.
26
Figuur 10 Verzeping met hydroxide ion van esterbinding tussen lignine en koolhydraat
Een belangrijk mechanisme in de basische voorbehandeling is de verzeping (Figuur 10) van de
esterbindingen tussen lignine en koolhydraten (Sun and Cheng, 2002; Zheng et al., 2009). Ook door
verzepingreacties worden acyl- en uronzuur groepen verwijderd van de hemicellulose (Wan et al.,
2011). Naast verzepingreacties is vergroting van het intern oppervlak een belangrijk effect van een
basische voorbehandeling. Daarnaast werd aangetoond door middel van pieken in het infrarood
spectrum van cellulose dat de waterstofbruggen en β-1,4-glycosidische bindingen in cellulose
verbroken werden. Zoals reeds vermeld zijn de effecten van de NaOH op de kristalliniteit van
cellulose en biomassa in het algemeen niet ontegensprekelijk aangetoond (He et al., 2008; Kumar et
al., 2009; Wu et al., 2011).
3.2 SPORL
Het SPORL proces staat voor “Sulphite pretreatment to overcome recalcitrance of lignocellulose” en
werd recent ontwikkeld door de U.S. Forest Service, Forest Product Laboratory en de universiteit van
Wisconsin-Madison. Het is eigenlijk een voorbehandelingsproces dat afkomstig is uit de
papierindustrie. Het oorspronkelijke proces uit de papierindustrie wordt toegeschreven aan
Benjamin Chew Tilghman een Amerikaans chemicus die de U.S. patent 70,485 (November 1867)
getiteld ‘Treating Vegetable Substances for Making Paper Pulp’ op zijn naam zette. Hij behandelde
hout met Ca(HSO3) en SO2 in drukreactoren. In 1874 werd de eerste sulfietmolen voor
papierproductie in Europa geopend waarbij de Mg(HSO3) de actieve component was.
Naam
Zuur Bisulfiet
Bisulfiet
Neutraal Sulfiet
Alkalisch Sulfiet
pH
1-2
3-5
6-9
10-13,5
Tegenion
Ca2+, Mg2+, Na+, NH4+
Mg2+, Na+, NH4+
Na+, NH4+
Na+
Actieve component
H+, HSO3(H+), HSO3SO32OH-, SO32-
Tabel 4 Sulfiet voorbehandeling (SIXTA, 2006)
Naast calcium en magnesium als tegenion van het sulfietion zijn ook Na+ en NH4+ mogelijk als
tegenionen. Beiden hebben het voordeel dat ze bruikbaar zijn in basische omstandigheden daar
27
Ca(HSO3)2 en Mg(HSO3)2 1enkel toepasbaar zijn in zure omgeving (Tabel 1). De actieve zwavel (IV)
verbindingen in de reacties zijn SO2 en HSO3-. De verhouding wordt bepaald door de pH en
temperatuur van de oplossing volgens onderstaande vergelijking:
⇔
⇔
SPORL processen kunnen onderverdeeld worden in zure, neutrale en basische reacties.
Omdat de literatuur over de theoretische achtergrond van SPORL eerder beperkt is zijn de volgende
paragrafen een samenvatting van de belangrijkste reacties in verband met sulfiet koken in papier
industrie. Men kan er echter van uit gaan dat wegens de gelijkaardige omstandigheden deze reacties
ook plaatsvinden bij zure hydrolyse. Het doel in de papierindustrie is vooral belangrijk voor het
oplossen van lignine en zo zuivere cellulose vezel te bekomen die zeer geschikt is voord de papier
industrie (Wang et al., 2009).
Bij sulfiet voorbehandeling spelen sulfonatie, hydrolyse, condensatie en redox reacties een
belangrijke rol. Sulfonatie gebeurt voornamelijk met lignine en in mindere mate ook met
koolhydraten. Condensatie wordt vooral waargenomen tussen lignine eenheden. De koolhydraten
zijn het meest onderhevig aan hydrolyse, maar het is vooral hydrolytische splitsing van de ligninekoolhydraat binding die belangrijk is.
Bij de reactie met het waterstofsulfide en zwaveldioxide is het vooral de pH die op twee manieren
de reactiviteit van het medium beïnvloedt. Enerzijds via het zuurbase evenwicht zoals afgebeeld in
Fout! Verwijzingsbron niet gevonden.. Anderzijds via de vorming van reactieve intermediëren in
o.a. lignine structuur.
Het belangrijkste reactiemechanisme onder zure condities is sulfonatie, zoals weergeven in Figuur
11. De alfa-ether wordt geprotoneerd waardoor een alcohol of water wordt afgesplitst. Hierdoor
onstaat een benzylium kation dat resonantie gestabiliseerd is. Deze resonantie structuur kan enkel
ontstaan indien het α-proton en α-substituent in het vlak van de aromatische vlak liggen. Dit vraagt
dus meestal bond-rotatie en dus extra energie voor de reactie. Door een nucleofiele aanval van
waterstofsulfiet vindt de sulfonatie plaats. Het is echter ook mogelijk dat er een nucleofiele aanval
plaats vindt met een andere ligninemolecule waardoor een condensatie plaatsvindt. Lignine verliest
zijn apolair karakter door sulfonatie waardoor het oplost in water (SIXTA, 2006).
Naast delignificatie, wat het enige doel is bij papierproductie om een zuivere cellulose vezel over te
houden wordt bij SPORL hemicellulose verwijderd en cellulose gedepolymeriseert . Ook kan soms pH
controle condensatie van lignine verhinderen (Wang et al., 2009). SPORL wordt meestal uitgevoerd
1
Calciumwaterstofsulfiet en magnesiumwaterstofsulfiet
28
bij een temperatuur rond de 180°C gedurende 30 minuten. Hierbij wordt het hout gemengd met 4
gram sulfiet en 2 gram zwavelzuur Bij deze omstandige heden worden 20 FPU per gram cellulose een
cellulose conversie van 95% bereikt binnen de 24h (Wang et al., 2009).
Figuur 11 Vorming van benzylium cation als belangrijk reactief intermediair in zuur sulfiet koken (SIXTA, 2006)
Figuur 12 Reacties van β-O-4 structuren tijdens zure sulfiet voorbehandeling (SIXTA, 2006)
Figuur 13 Reacties van β-O-4 structuren tijdens neutrale sulfiet voorbehandeling (SIXTA, 2006)
29
4 Enzymatische hydrolyse
Na de voorbehandeling volgt de enzymatische hydrolyse. Hierbij worden enzymen gebruikt die
dienen om de ether verbindingen (o.a. β-(1,4)-glycosidische binding in cellulose) te verbreken.
De meeste van deze enzymen behoren tot de klasse van de hydrolasen. Deze enzymen worden
extracellulair geproduceerd door zowel eukaryote als prokaryote micro-organismen(Hilden and
Johansson, 2004).
De enzymatische hydrolyse van oligo- en polysacchariden in glucose en andere suikers is de
meest efficiënte manier om suikermonomeren vrij te stellen (El-Zawawy et al., 2011; Sukumaran
et al., 2005; Wilson, 2009). Dit proces kan ook volledig chemisch verlopen. Hierbij wordt echter
gebruik gemaakt van verhoogde temperaturen en een sterk mineraal zuur (Hamelinck et al.,
2005; Xiang et al., 2003). Om de reactie bij een vergelijkbare snelheid te laten verlopen is echter
veel zuur of een hoge temperatuur (200°C tot 240°C) nodig (El-Zawawy et al., 2011). Na de
hydrolyse worden de gevormde monomeren door een reeks nevenreacties gedegradeerd. Deze
gevormde componenten zoals furanen en organische zuren werken inhiberend op de
daaropvolgende fermentatie (El-Zawawy et al., 2011). Er zijn zelf processen bekend waarbij de
theoretische reactiesnelheidconstante van de degradatie groter is dan die van de zure hydrolyse.
Hierdoor was de opbrengst van glucose in de grootte orde van slechts 10% (Sun et al., 2009).
Deze enzymen kunnen ingedeeld worden op basis van hun substraten.
Enerzijds zijn er de cellulasen die cellulose hydrolyseren, anderzijds zijn er de hemicellulasen.
Hemicellulasen kunnen nog verder onderverdeeld worden in xylanasen en manasen (Girio et al.,
2010). De cellulasen kunnen ook onderverdeeld worden op basis van de manier waarop ze de
celluloseketens hydrolyseren. Endoglucanases splitsen de celluloseketens in het midden, terwijl
exoglucanases aan het uiteinde van de ketens cellobiose moleculen afsplitsen (International
Union of Biochemistry and Molecular Biology. and Webb, 1992).
Cellobiose wordt dan gehydrolyseerd door beta-glycosidase tot twee glucose monomeren.
Algemeen bestaat een endo en exo glucosylhydrolases uit twee delen : een koolhydraat bindinde
module en een katalytisch deel die met elkaar gelinkt zijn via een linker peptide.Meestal kunnen
de katalystische gedeeltes van glycosyl-hydrolases in drie vormen onderverdeeld worden (1) een
tunnel geschikt voor enzymen die progressieve exo-aanval activiteit hebben of (2) een spleet
voor endo-aanval activiteit. Daarnaast bestaat er ook nog (3) krater/zakje die geschikt is voor
degradatie via einstandige aanval. Het is vooral de sterke actie van cellobiohydrolases of
exoglucanases te wijten aan het gebonden blijven aan het substraat door de tunnel structuur
van het actief centrum die zorgt voor de sterke actie van de enzymen. Volgens sommige auteurs
moet de sterke scheiding tussen exo- en endoglucanasen sterk genuanceerd worden omdat
sommige endoglucanasen ook een exo-aanval activiteit beschikken (Gilad et al., 2003; Hakamada
et al., 2002; Kim and Kim, 1995). Daarnaast zijn er exocellulasen die hun katalytische actieve
tunnel kunnen openen naar een spleet vorm waardoor endoglucanase activiteit mogelijk wordt
30
(Munoz et al., 2003). Hierdoor wordt een meer continu spectrum van eigenschappen die
variëren van strikt endo- tot strikt exoglucanase activiteit (Hilden and Johansson, 2004).
Hierboven worden de belangrijkste cellulasen beschreven, het is echter belangrijk om te
beseffen dat ze allemaal samenwerken om de volledige degradatie van het substraat te
bewerkstelligen(Hilden and Johansson, 2004; Verardi et al., 2012).
Naast de enzymen die verantwoordelijk zijn voor de hydrolyse voor de degradatie van
koolhydraten zijn er ook enzymen die hoog-reactieve en niet specifieke radicalen generen die
depolymerisatie van lignine tewerkstellen. Dit enzymatisch mechanisme van lingnolyse wordt
beschreven als enzymatische verbranding omdat verschillende willekeurige
oxidatiemechanismen plaatsvinden. Het mag niet verwonderlijk zijn dat de oxidatie niet enkel bij
lignine zou voorkomen. De recente herklasificering van GH612 sluit hiermee aan: vroeger werd
deze enzymen zoals de andere cellulasen en tot de klasse van de hydrolasen gerekend. Nu wordt
het gerekend tot de lytic polysaccharide monooxygenases (LPMO). Deze enzymen splitsen
cellulose oxidatief door middel van reducerende agentia (Levasseur et al., 2013).
Door middel van submerse fermenaties van gemodificeerde stammen van onderandere
Trichoderma Reesi (Mansfield et al., 1999) en Aspergillus worden de meeste enzym cocktails
geproduceerd (Mansfield et al., 1999). De laatste jaren is de kost van cellulasen met meer dan
20-voud gedaald. Dit is vooral te danken aan bedrijven als Novozymes en Dupont Industrial
Biosciences (vroeger Genencor) en US Department of Energy (Merino and Cherry, 2007).
2
GH61 was een vroeger klasse van cellulasen met zeer zwakke endoglucanase activiteit (Harris, P.,
2014, Auxiliary Activity Family 9.)
31
5 Genetische modificatie van populieren en
effect op saccharificatie
5.1 Downregulatie van 4CL en Cald5H gen volgens Min et al. (2012)
Min et al. (2012) verlaagden de lignine inhoud in Populus trichocarpa door downregulatie van 4CL
gen (Min et al., 2012). Daarnaast werd ook een lijn (CH 8-1-4) gemodificeerd waarin Cald5H3 in
overexpressie werd gebracht. De bomen werden in serres gekweekt. Het ontschorste hout werd
vermalen en hierop werden vier voorbehandelingstechnieken toegepast.
Uit de compositieanalyse blijkt dat alle mutante lijnen een lager ligninegehalte hebben dan de wild
type variant. De glucaangehaltes zijn hoger in de gewijzigde populieren in vergelijking tot de wilde
variant. In de laatste stap wordt de enzymatische Saccharificatie uitgevoerd met 5 FPU / g substraat.
Het transgene hout gaf een hogere suikeropbrengst, zowel bij onvoorbehandelde als
voorbehandelde stalen. De totale suikeropbrengst volgde systematisch 4CL 1-1 > 4CL 1-4 > CH 8-1-4 >
WT. De suikeropbrengst was omgekeerd evenredig met de lignine inhoud.
Uit deze paper blijkt dat het mogelijk is om een verbetering in saccharificatiepotentieel aan te tonen
voor genetisch gewijzigde populieren in het 4CL gen. Dit gen verlaagt de lignine inhoud, waardoor
een betere saccharificatie optreedt die zowel meetbaar is voor behandeld als onbehandeld hout
(Choi and Mathews, 1996). Technische gegevens van de artikels waar uitgelegd wordt hoe deze
transgene lijnen tot stand komen ontbreken echter.
5.2 Downregulatie van 4CL en CCoAOMT gen volgens Wang et al. (2012a)
In een artikel wordt het effect van het effect van downregulatie van 4CL en CCoAOMT4. In een
veldproef werden vier lijnen samen met wild type populier (Poplar Tomentosa) gedurende van 2004
tot 2009 gekweekt in een serre. Van deze vier lijnen werden er twee verlaagd in 4CL( B4CL28 &
B4CL86) en twee in CCoAOMT (BCOA264 BCOAA133). Na vijf jaar werden de bomen geoogst
ontschorst, verhakseld en ondergingen ze een methanol extractie.
Van de geëxtraheerde stalen werd het Klason lignine gehalte bepaald. De verschillende stalen
werden aan 1% en 3% voorbehandeling met NaOH onderworpen.
De wilde bomen bevatten ongeveer 21% lignine terwijl de transgene lijnen 19% lignine bevatten. Bij
de 4-CL lijnen werd enkel vermindering vastgesteld bij de zuur onoplosbare lignine. Bij de CCoAOMT
lijn werd ook een vermindering vastgesteld bij de zuuroplosbare lignine. Volgens de auteurs zou dit
kunnen wijzen dat CCoAOMT gen betrokken is bij vorming van zuur oplosbare lignine. Alle lijnen
hadden een verhoogde cellulose inhoud wat in overeenstemming is met de theorie dat cellulose
ontstaat uit de overschot van de synthese van andere koolstof metabolieten (Hu et al., 1999).
glucaan. Enkel de CCoAOMT lijnen vertoonden betere saccharificatie kenmerken bij voorbehandelig
met 1% NaOH. Bij de 3% NaOH voorbehandeling werd enkel nog een significante verbetering
vastgesteld voor BCOA133 lijn. De 4-CL lijnen toonden geen significant verschil. Bij een
voorbehandeling met 3% NaOH werd meer glucose en minder xylose vrijgesteld dan bij de 1% NaOH
voorbehandeling.
3
4
Cald5H is het zelfde enzym als F5H (Vanholme et al., 2012)
4CL en CCoAOMT zijn genen betroken in monolignolen synthese voor verdere informatie zie 1.3
32
Volgende besluiten werden uit de paper getrokken:
1. Vermindering van 4CL en CCoAOMT zorgde voor een verlaging van de lignine inhoud tussen
de 6 en 10%.
2. Omdat de zuur oplosbare lignine inhoud sterk verlaagd was in de CCoAOMT-down
gereguleerde lijnen werd een significante verhoging van glucose opbrengst vastgesteld
3. Strengere voorbehandelingscondities zorgen dat de positieve effecten van verlaagde lignine
inhoud vervagen.
De paper toont aan dat het mogelijk is om het saccharificatie potentieel van biomassa te verbeteren
doormiddel van transgene Populus tomentosa.
5.3 4CL downregulatie door Voelker et al.(2010)
Voelker et Al. Voerde high-throughput saccharificatie experimenten op verschillende 4CL downregulated lijnen. Bij de warmwater voorbehandeling die toegepast werd, kon geen statistisch
significant verschil in saccharificatiepotentieel aangetoond worden tussen de 4CL lijn en de wild type.
Hier werd high-throughput saccharificatie uitgevoerd op verschillende lijnen die down-gereguleerd
werden in 4CL gen. De warmwater voorbehandeling in de microtiterplaten en saccharificatie kon niet
aantonen dat er een statistisch significant verschil was in saccharificatiepotentieel tussen de controle
en gewijzigde lijnen (Voelker et al., 2010).
5.4 CCR downregulatie door Van Acker et al. (2014)
In deze thesis wordt onderzocht wat het verschil in saccharificatie potentieel is tussen twee populier
lijnen: enerzijds wild-type (WT) populier en anderzijds een transgene lijn. Beide lijnen werden
gekweekt onder dezelfde omstandigheden. Deze testen gebeuren op materiaal afkomstig van twee
veldproeven, uitgevoerd door bioenergy group, Department of Plant Systems Biology, VIB Vlaams
Instituut voor Biotechnologie (VIB) (goedkeuring B/BE/07/V2) en door Institut national de la
recherche agronomique (INRA) in Orleans (goedkeuring B/FR/07/06/01) (Van Acker et al., 2014).
Hieronder wordt de ontwikkeling van deze lijnen besproken.
In Leple et al. (2007) werd de ontwikkeling van downgereguleerde CCR lijnen beschreven. CCR is het
enzym dat één van de voorlaatste omzetting katalyseert in de monolignolen synthese (1.3.1
Biochemische synthese van monolignolen). Het zet onder andere feruloyl-CoA om in conferaldehyde.
Het onderzoek naar deze transgene lijnen begon met het klonen CCR-cDNA van xyleemweefsel van
Populus trichocarpa. Later bleek dat er nog andere homologe genen CCR gevonden werden in
Populus trichocarpa (Li et al., 2005). Het gekloonde gen bleek als enige actief te zijn bij ontwikkeling
van het xyleem. Doormiddel van de veelgebruikte 35S promotor van het bloemkool mozaïekvirus
werden sense en anti sense constructs ontworpen.
De transformatie werd uitgevoerd met Agrobacterium tumefaciens zoals beschreven door Leplé et al
(Leple et al., 1992). Van de verschillende lijnen werden na groei van de transgene populieren in de
serre vijf lijnen geselecteerd die duidelijke xyleem verkleuring hadden. FAS13 en FAS18 zijn twee
lijnen gemaakt met de anti-sense construct en FS3, FS30 en FS40 die gemaakt werden met de sense
construct.
De kleur van in de serre gegroeide bomen varieerde van oranje naar wijnrood.
Per boom was soms ook variatie in kleur op te merken. De verkleuring was te wijten aan ferulazuur,
33
dat ingebouwd werd in de lignine. De verkleuring werd geassocieerd met een duidelijke verlaging in
Klason zuur-onoplosbarele lignine ten opzichte van niet verkleurde delen.
Thioacidolyse5 - waarbij selectief de ether bindingen gesplitst worden en vervolgens G en S eenheden
gekwantificeerd worden - toonde aan dat de vrijgestelde G en S units in CCR deficiënte lijnen
duidelijk lager waren wat wijst op meer gecondenseerde lignine bindingen. De S/G verhouding,
gebaseerd op thioacidolyse toonde geen significant verschil met wild-type. Daarnaast werd bij
thioacidolyse ook een structuur gemeten die er specifiek op wees dat ferulazuur wordt ingebouwd in
het netwerk als monolignol. NMR toonde aan dat bij meting van alle S en G units (gecondenseerde
en niet-gecondenseerde bindingen) de S/G verhouding van de transgene lijnen significant lager was
dan die van de wildtype.
In de CCR down-gereguleerde lijnen werd een verhoogde in transcriptie van het PAL-gen vastgesteld,
dat de ingangsstap katalyseert uit fenylalanine. Mogelijks zorgt de verlaagde concentratie aan
intermediaren in pathway of lagere lignine hoeveelheid in de celwand voor een verhoogde
transcriptie van dit gen.
Belangrijk in verband met deze thesis zijn de verbeterde pulpkarakteristieken. Na kraftpulping6 van
de verschillende lijnen werd duidelijk dat bij lagere baseconcentratie delignificatie beter optreedt, in
het bijzonder bij de FS3 en FS30 lijn. Nadelig aan de fenotypisch sterk gewijzigd lijnen was de
verminderde biomassa opbrengst.
De Belgische bomen werden geoogst 10 maand na planten. Na de ontschorsing werd elke boom
onderverdeeld in zes categoriën, in functie van de rode xyleemverkleuring. Dit verschil in xyleem
verkleuring werd reeds opgemerkt in het serrre gekweekte materiaal. Het was duidelijk dat het CCRgen minder onderdrukt was in FS3 dan in FS40. Er waren onder ander meer ongekleurde bomen in de
FS3 lijn. De drie klassen met de sterkste verkleuring werden vervolgens gebruikt om de highthroughput saccharificatie, zoals beschreven in Santoro et al. uit te voeren (Santoro et al., 2010).
Verder in deze thesis wordt nog meer ingegaan op de gebruikte methode. Uit de resultaten van de
saccharificatie bleek dat het rood xyleem van de transgene lijnen duidelijk meer glucose vrijstelden.
Naarmate de concentratie NaOH toenam, werd de toename in saccharificatierendement voor zowel
FS3 als FS40 veel kleiner. De SSF experimenten gaven een verhoging van 48% en 87% tegenover dat
van het wildtype. Daarnaast hadden de bomen uit klasse 5 minder biomassa opbrengst. Wanneer de
verminderde biomassa opbrengst in rekening wordt gebracht, leveren de FS40 en FS3 evenveel
ethanol per hectare op als de WT. Van deze veldproef FS40 en WT populierin deze thesis
gesacharificeerd. Dit waren ontschorste stalen die nog verhakseld moesten worden.
De veldproef in Frankrijk gebeurde analoog aan de Belgische. De oogst gebeurde hier 20 maand na
planten. Opnieuw werden de jonge bomen in klassen onderverdeeld op basis van xyleemverkleuring.
Bij uitvoering van de SSF experimenten op het volledig rode hout werd enkel een verhoging van 36%
en 161% voor FS3 en FAS13 gemeten in ethanol opbrengst. De vermindering in biomassa was 16% en
24% voor de FS3 en FAS13 lijn in vergelijking met het wildtype. Bij berekening van de ethanol
5
Thioacidolyse is manier om niet gecondenseerde lignine eenheden te meten doormiddel van is een
reacties die enkel ether verbindingen in de lignine aanvallen.
6
Kraftpulping is een papier productieproces dat lignine verwijderd met Na2S en NaOH.
34
opbrengst per boom werd voor FS3-lijn minder ethanol gemeten. De FAS13 lijn vertoonde toch een
57% verbetering in vergelijking met wild-type. Van deze veldproef werden twee stalen aangeleverd
FAS-13 en WT, deze bevatten echter nog schors.
De cellulose-inhoud van de verschillende bomen vertoonde geen significante verschillen voor alle
lijnen. De cellulose van de transgene bomen werd dus efficiënter versuikerd.
35
6 Materialen en methoden
Naast een compositionele analyse waarbij de hoeveelheid lignin, extract, glucaan, xylaan en andere
suikers gequantificeerd worden bestaat het grootste deel van thesis uit het uitvoeren van
enzymatische hydrolyse. Eerst werd er geprobeerd om een experiment na te bootsen door een high
trouput methode opteschalen. Met deze high-trouput methode werd aangetoond dat ze geschikt
was om verbeteringen in sacharificatie te meten. Tenslotte werden een ‘marco’ voorbehandelingen
gedaan waarmee getracht werd een verbetering vast te stellen.
6.1 Compositionele analyse
Voor de compositionele analyse werd een procedure uitgevoerd gebaseerd op de LAP’s van NREL.
Hieronder wordt gedeeltelijk de procedure van NREL overlopen (Sluiter and Sluiter, 2010). Bij elke
stap wordt vermeld of wij hem al dan niet uitvoeren en waarom dit al dan niet gerechtvaardigd is.
Om de uiteindelijke samenstelling te bepalen werd een lang parcours afgelegd. Vooral de Klason
lignine bepaling was problematisch. De herhaalbaarheid liet te wensen over: de spreiding op de
verschillende stalen was te groot.
6.1.1 Voorbereidende stappen(Hames et al., 2008)
Indien de biomassa meer dan 10% vocht bevat, moet het vochtgehalte tot minder 10% gebracht
worden om microbiële groei tegen te gaan. De populierstalen die wij gebruiken hebben een
drogestof gehalte van 95-96% waardoor vooraf drogen niet verreist is.
Wanneer de biomassa deeltjes groter dan 2mm bevat, moeten ze gemalen worden omdat alle
onderstaande methoden enkel geschikt zijn voor deeltjes kleiner dan 2 mm. Belangrijk is dat de
molen hierbij niet te heet wordt omdat materiaal dat normaal verwijderd wordt via extractie kan
achter blijven op het verhitte metaal van de molen. Wij malen de stalen eerst met Fritz Pulverisette
15 snijmolen (Figuur 14 Fritz Pulverisette 15) en een elektrische koffiemolen (Krups). Bij de eerste
stalen werd een donkere verkleuring van de stalen opgemerkt na malen met deze elektrische molen.
Dit was wellicht te wijten aan te warm worden van de biomassa in deze molen. Deze elektrische
koffiemolen werd dan ook niet meer gebruikt en vervangen door een handmatige koffiemolen die
minder warm wordt.
36
Figuur 14 Fritz Pulverisette 15
Na het malen dient zich normaal een zeefstap aan. Dit werd eerst niet uitgevoerd omdat er geen
zeven beschikbaar waren in het labo, bovendien kan ongewenste fractionnatie optreden. Door de
tegenvallende resultaten werden experimenten met zeven uitgevoerd. Wanneer er toch gezeefd
werd, werd gebruik gemaakt van de -20/+80 mesh fractie. Men gebruiken van een ander soort zeven
(800µm en 150µm). Deze zeven zijn het meest gelijkaardig dan de 20/80 mesh zeven. Grotere
deeltjes zullen namelijk bij de zure hydrolyse het onvolledig oplossen van koolhydraten veroorzaken.
Bij te kleine deeltjes grootte kunnen meer afbraakproducten gevormd worden. Ook kan de gebruikte
fractie gevolgen hebben voor het as percentage van het staal. Dit is echter in het kader van deze
thesis bij het gebruik van houtachtige stalen minder van toepassing.
Omdat biomassa een wisselend vochtpercentage kan hebben wordt de samenstelling van de
biomassa steeds uitgedrukt op basis van een volledig droog monster. Na analyse kan, indien
gewenst, met het vochtgehalte in het sample de volledige oorspronkelijke samenstelling van de
biomassa berekend worden. Het drogestof gehalte wordt berekend door van het oorspronkelijke
staal een deel af te wegen in een getarreerd aluminium schaaltje, 12 uur te drogen bij 105°C en te
tarreren. De massa van de biomassa voor en na drogen worden opgenomen. Hieruit wordt dan het
drogestof gehalte berekend.
37
De asfractie bij houtachtig materiaal is steeds laag. Volledig sluiten van de massabalans werd niet
beoogd dus werd een asbepaling niet uitgevoerd.
6.1.2 Bepaling van extracten in de biomassa
Naast de structurele componenten in biomassa als cellulose, hemicellulose en lignine zijn er ook niet
structurele materialen aanwezig in biomassa die kunnen interfereren met de structurele
componenten. Daarom is het noodzakelijk deze niet-structurele componenten eerst te verwijderen
doormiddel van extracties met water en/of ethanol (Sluiter et al., 2005).
Een extractie met ethanol is voor alle soorten biomassa vereist omdat biomassa ook niet structurele
harsen bevat die ook kunnen precipiteren tijdens de filtratie van lignine in de volgende stap. Bij
kruidachtige biomassa is voorafgaand een waterextractie aangeraden omdat hier bij een diverse niet
structurele materialen aanwezig zijn als eiwitten en sucrose (Sluiter et al., 2005).
Omdat de populierstalen houtachtige stalen zijn, werd de waterextractie niet uitgevoerd. De ethanol
extractie werd wel uitgevoerd door middel van Soxhlet extractie. Dit houdt in dat de biomassa in een
gedroogde cellulose huls wordt gebracht. De massa wordt genoteerd en vervolgens wordt de huls in
het Soxhlet apparaat geplaatst. Het Soxhlet apparaat wordt dan op een verwarmde kolf met daarin
ongeveer 200 ml ethanol gemonteerd. Op het Soxhlet apparaat plaatst men vervolgens een koeler.
De ethanol verdampt en beweegt zich via B door buis C naar de koeler waar het condenseert. De
druppels ethanol lopen in recipiënt A, waar de extractie plaatsvindt. Als het solvent in recipiënt A de
hoogte h van de overloop bereikt, loopt de oplossing
met extracten terug in de kolf via buisje D. Dit proces
dient zich verscheidene malen te herhalen tot de
oplossing in A geen extract meer bevat. Nadat de
oplossing in recipiënt A helder en kleurloos is
geworden, is alles geëxtraheerd. De bepaling van de
extracten van kan op twee manieren gebeuren: men
kan enerzijds de biomassa droog wegen in een droge
getarreerde cellulose huls. Na extractie laat men de
ethanol uit de huls verdampen en droogt men verder in
de droogstoof. Vervolgens bepaalt men opnieuw de
massa van de droge huls. Anderzijds kan men
doormiddel een Rotavapor de ethanol uit de
getarreerde kolf verdampen totdat de kolf enkel nog
extract bevat. Na droogdampen kan uit het gewicht
van kolven opnieuw het percentage extract berekend
worden. In principe wordt volgens de NREL procedure
enkel de methode met de droogdampen van de kolf
gebruikt. Bij wegen van brosse cellulose hulzen is het
maar de vraag of er geen massaverlies optreedt door de
extractie.
Figuur 15 Soxhlet apparaat (Jensen, 2007)
38
6.1.3 Bepaling van structurele koolhydraten en ligine
Deze bepaling van lignine en koolhydraten gebeurt doormiddel van een LAP die beschikbaar in
Biomassa labo. Deze LAP (Laboratory Analytical Procedure) is echter gebasseerd op de LAP van NREL”
(Sluiter et al., 2012; Sluiter et al., 2008). Samengevat gebeurt hier een tweefasige hydrolyse. De
eerste gebeurt koud met geconcentreerd zuur (72% H2SO4) en de tweede gebeurt warm met
verdund zuur(ongeveer 2% H2SO4). Alle koolhydraatpolymeren worden hierbij gehydrolyseerd.
Echter bij de warme hydrolyse kan ook degradatie van de gevormde monomeren optreden. Deze
laatste reactie kan leiden tot een onderschatting van de totale hoeveelheid polysacchariden . Door
gebruik te maken van een sugar recovery standard (SRS) wordt een correctiefactor berekend die aan
dit probleem tegemoet komt. De vloeistof die de gehydrolysserde polysacchariden bevat, wordt
vervolgens gemeten op een HPLC kolom. Het grootste deel van de lignine wordt niet gehydrolyseerd
en kan dan afgefilterd worden en gravimetrisch bepaald worden. Het kleine deel dat toch oplost kan
dan gekarakteriseerd worden door spectrofotometrische analyse via een extinctie coëfficiënt
behorende bij een bepaalde golflengte. Het nadeel hiervan is dat dit slechts een schatting is van de
hoeveelheid opgeloste lignine. Er kan niet worden uitgegaan van een ijklijn wegens het gebrek aan
referentie materiaal. Aan de hand van biomassa specifieke extinctie golflengtes in het het UV-gebied
kan dan geschat worden wat de hoeveelheid biomassa is. Deze hoeveelheid lignine wordt meestal
niet bepaald omdat ze dermate laag is ( < 1 % ) in vergelijking met Klason zuur onoplosbare lignine.
Van het hydrolysaat wordt ook de suikersamenstelling met HPLC gemeten gemeten. Hieronder wordt
deze procedure meer in detail uitgelegd.
Eerst wordt 300 mg van biomassa in drievoud afgewogen in pressure tubes. Hierbij wordt 4,42ml
zwavelzuur (72 %) toegevoegd. Deze tubes worden voorzien van een glasstaaf en in een
warmwaterbad van 37°C geplaatst gedurende 1 uur. Gedurende dit uur wordt de biomassa
regelmatig geroerd (elke 5 min). Ondertussen wordt een SRS ontdooid. Na één uur wordt dan 75 ml
AD analytisch bijgevoegd (volumetrische pipet) . Bij de ontdooide SRS van 10 ml wordt 4,42 ml
zwavelzuur (72 %) gevoegd met 65 ml AD. Daarna worden de pressure tubes gesloten met een teflon
schroefdop. Vervolgens worden deze buizen in de autoclaaf geplaatst en verhit tot 121°C (1 bar)
gedurende één uur. Na afkoelen wordt van het hydrolysaat in de tubes ongeveer 2,5 ml afgenomen
voor monosacchariden bepaling met HPLC. Nu werd de zuur onoplosbare Klason lignine afgefilterd
op porseleinen kroezen. Na drogen in de droog stoof op 105°C kan de lignine gravimetrisch worden
bepaalt.
De monosacchariden kunnen bepaald worden met anion uitwisselings chromatografie systheem
gebasseerd op HPAEC-PAD (High Performance/ High pH Anion Exchange Chromatography with
pulsed Amperometric Detection). De stalen die geladen zullen worden op de CarboPAC bevatten best
geen bivalente ionen omdat deze zeer sterk binden aan de kolom en vervolgens interfereren met de
scheiding. Daarom wordt 1 ml van de stalen ,afkomstig uit de verschillende buizen van zure
hydrolyse, gepipetteerd in een maatkolf van 25 ml. Na toevoegen van een druppel fenolftaleine
worden de stalen getitreerd met een verzadigde oplossing van BaOH tot kleuromslag bij een pH van .
Door toevoeging van BaOH worden alle sulfaat ionen verwijderd doordat een BaSO4 neerslaat. Na
titratie worden de kolfjes aangelengd tot 25ml. Dan wordt met filtratie (45 µm) de onzuiverheden
verwijderd en worden de stalen nog 10 keer verdund alvorens ze in de autosampler van de Dionex
ICS300 gebracht worden. Nu worden de stalen één voor één op de kolom (Carbopac 20) gebracht .
Deze kolom is specifiek geschikt voor monosacchariden en disacchariden. Net zoals in Hardy et al.
wordt de kolom geëlueerd met een speciaal bereide NaOH oplossing die geen carbonaat ionen bevat
39
en pH heeft hoger dan 12 (Hardy et al., 1988; Weitzhandler et al., 2004). De scheiding berust op het
zwak zuur karakter van suikermoleculen (pKa van 12 tot 14) (Kerherve et al., 1995). Door de sterk
basische omgeving worden sommige alchohol groepen gedeprotoneerd en zullen ze verschillend
gebonden zijn aan de positieve hars van de kolom. Na de scheiding op de kolom worden de suikers
gemeten de PAD detector. Deze detector bestaat uit een de goud electrode die onder zeer snel
wisselende spanningen staat. Bij de detectie wordt een snel wisselende potentiaal gebruikt waarbij
een bepaalde potentaal oxidatie van het analyt optreedt aan de goudelektrode. De stroom die
hierdoor onstaat wordt gemeten en geintegreerd. Door de afwisseling van positieve en negatieve
potentiaalpulsen wordt vervuiling van de elektrode voorkomen. Na verwerking van signaal,
registratie van de retentietijden en vergelijking met een reeks standaarden, worden de
suikergehaltes bepaald.
Via deze methode kan men niet rechstreeks de hoeveelheid cellulose en hemicellulose berekenen.
Wel kan de hoeveelheid glucaan,xylaan, galactaan, arbinaan en manaan bepaalt worden. Deze
begrippen staan voor hoeveelheden waarbij een bepaalde suiker voorkomt in de polysaccharide
vorm. Er zijn namelijk ook glucose monomeren ingebouwd in hemicellulose die niet onderscheiden
worden van de glucosemonomeren afkomstig van de cellulose fractie.
6.2 Enzymatische hydrolyse
6.2.1 Hydrolyse uitgevoerd door opschalen van de high-troughput experimenten
Om het saccharificatie potentieel van verschillende populier lijnen met CCR deficiëntie te meten,
wordt in het artikel van Van Acker et al. (2014) gebruik gemaakt van de i-Wall CUSTOM-designes
robot die beschreven wordt in het artikel van Santoro et al. (2010). Deze robot kan high-troughput
analysen uitvoeren: in een week kunnen 972 monsters voorbehandeld, gesaccharificeerd en
geanalyseerd worden op glucose en xylose. Met deze robot zijn enkele eenvoudige
voorbehandelingen mogelijk: voorbehandelingsvloeistof wordt gedurende een bepaalde tijd in het
recipient bij de biomassa te gebracht. Na de voorbehandeling vindt in dezelfde vial de saccharificatie
plaats, nadat het zuur of base geneutraliseerd werd door buffer.
Eerst wordt gebruik gemaakt van een microtube waarin 20 tot 40 mg biomassa samen met drie
roestvrij stalen parels per sample wordt gebracht. Door een pneumatische schudder wordt de
biomassa verpulverd met een frequentie van 5000 bewegingen per minuut met een amplitude van
25mm. Dan wordt een gaatje in de microtube geboord. Vervolgens wordt op een analytische balans
een tweede vial geplaatst en wordt 1,5 mg biomassa per vial afgewogen met een tolerantie van
0,2mg. Alle samples werden in triplicaat geanalyseerd.
De voorbehandeling vindt plaats door 750µl voorbehandelingsvloeistof in de vials te brengen. Als
voorbehandeling vloeistof wordt gebruik gemaakt van 0,025% (6,25mM) NaOH, 0,25% (62,5mM)
NaOH en 2% H2S04. Vervolgens werden de stalen geïncubeerd op 90°C gedurende 3 uur.
Na de voorbehandeling werden afhankelijk van de voorbehandelingsvloeistof andere neutralisatie
oplossingen gebruikt. Bij voorbehandelingen met 6,25 mM NaOH werd geneutraliseerd met 50 µl
36% HCl. De hydrolyse gebeurde met 25 µl Accelerase 1000 in 30m M citraat buffer (pH 4,5) met
0,01% Natriumazide tegen groei van micro organismen. Bij voorbehandeling met 62,5 mM en
625mM wordt eerst 5 en 50µl HCl van 36% toegevoegd (niet vermeld in artikel maar via berekening).
40
Bij voorbehandeling met 2 % H2S04 werd gebruik gemaakt van 50 µl 5M NaOH. Het totale drogestof
gehalte in het vial was 0,19 % op een volume van 800 µL.
Na toevoeging van de enzymen (Accelerase 1500) word alles gedurende 20 uur geïncubeerd mij 50°C
door middel van end-over-end rotation. Op het einde werd alles bij 1500 xg voor 3 min
gecentrifugeerd. Vervolgens wordt het supernatans in een andere 96-well plaat overgebracht.
Daarna worden alle monsters in duplicaat in twee 384-platen geplaatst om het glucose en xylose
gehalte enzymatisch te meten.
Als vertrekpunt van de deze thesis werd getracht de high throughput methode op te schalen en
hiermee allereerst een verschil te kunnen aantonen om dan meer ‘macro’ voorbehandelingen te
doen die dichter bij industriële condities liggen. Uiteindelijk werd een voorbehandeling voorgesteld
waar de dimensie van de high througput meting met een factor 100 werd vermenigvuldigd om
relatieve weegfouten te verkleinen.
Massa biomassa
Pretreatment solution
Enzym
Temperatuur
Neutralizing solution/buffer
high throughput
1,5 mg
750 µL
0,25 µL
90 °C
50 µL
zelf uitgevoerde experimeten
150 mg
75 ml
25 µL
90 °C
4 ml
Tabel 5 Vergelijking tussen high throughput methode en zelf uitgevoerde experimenten.
In het biomassa labo wordt de biomassa niet via ball milling verkleind maar zoals beschreven bij de
compositionele analyse, met de Fritz Pulverisette 15 en handmatig bediende koffiemolen. In deze
thesis werd enkele voorbehandeling met 62,5 mM NaOH gebruikt.
Om de voorbehandelingsvloeistof te bereiden werd in een maatkolf van 500ml, 1,25 g NaOH
afgewogen (voorbehandelingsvloeistof 0,25% NaOH of 62,5mM). Dan wordt er per Duran fles 75 ml
0,25% oplossing toegevoegd samen met 150 mg biomassa. Dit werd gedurende 3 uur in een warm
waterbad op 90°C voorbehandeld. Na afkoelen werd ongeveer 0,3 ml (afhankelijk van pH)
geconcentreerd zoutzuur (36%) toegevoegd tot een pH van 4,8. Hierna werd 4 ml een
geconcentreerde citraatbuffer van 800mM toegevoegd zodat na verdunning in de 75 ml een
buffersterkte van 40 mM bekomen werd. De pH lag steeds tussen de 4,70 en 4,90.
Het enzym dat in deze thesis gebruikt werd was Accelerase trio van de firma Dupont, geproduceerd
met gemodifceerde Trichoderma reesei. De activiteit van dit enzym mengsel was 42FPU/ml.
De activiteit werd bepaald met de NREL methode zoals beschreven door Adney (1996). In het artikel
staat niet expliciet vermeld hoeveel FPU er gebruikt wordt voor de hydrolyse van de stalen. Maar
men weet wel dat 0,25µl Accelerase 1000 gebruikt wordt per 1,5 mg biomassa. In onze experimenten
hebben we evenveel volume Accelerase Trio gebruikt per biomassa waardoor de experimenten
bij 7 FPU / g droge stof uitgevoerd werden.
41
Na toevoegen van 25µl enzym per duran fles werd alles geïncubeerd bij 50°C in een schudincubator
bij 200 toeren per minuut (Figuur 16). Er werd een staal genomen na 24 uur en na 72 uur. Van beide
stalen werd enkel de glucoseconcentratie gemeten met de GOD-POD methode.
Figuur 16 Praktische uitvoering van enzymatische hydrolyses
6.2.2 Hydrolyse uitgevoerd op macro-schaal voorbehandelde substraten
Naast de opschaling van High-troughput experimenten werd ook een voorbehandeling uitgevoerd in
meer realistische omstandigheden door bij hogere drogestof percentages te werken. De high
troughput methode werkt bij een droge stof percentage van 0,2% wat zeer ver van industriële
voorbehandelingen staat.
Enerzijds werd op alle vier stalen een voorbehandeling uitgevoerd met Ca(OH)2, NaOH en H2SO4 in
vrij milde omstandigheden. De omstandigheden werden mild gekozen omdat gevreesd werd dat bij
te strenge condities geen verschil waarneembaar zou zijn tussen de stalen. Daarnaast werd ook een
strengere sulfiet voorbehandeling gebruikt. Deze voorbehandelingsmethode werd gekozen omdat ze
industrieel direct toepasbaar is: de kennis om dergelijke installaties te bouwen is in principe
voorhanden omdat het proces reeds onder gewijzigde vorm ingang heeft in de papierindustrie. Ook
is het een uitermate geschikte voorbehandeling om recalcitrantie van hardhout te verminderen.
Concreet werd gebruik gemaakt van een voorbehandeling waarbij 10 g verhakselde populier wordt
gesuspendeerd in 90 ml voorbehandelingsvloeistof. Met deze proefopzet werden drie verschillende
voorbehandelingen getest: Er werden twee basische (Ca(OH)2 en NaOH) en één zure (H2SO4)
42
voorbehandeling getest. Bij de voorbehandeling met NaOH en H2SO4 werd eerst een stock oplossing
bereid waarbij 2,22 g NaOH of 1,25 ml H2S04 (96 % en d = 1,84) werd gemengd in een maatkolf van
200ml met gedestileerd water (AD). Op deze manier kan men zeker dat omstandigheden gelijk zijn
voor beide stalen (wild en transgene lijn). Omdat Ca(OH)2 slecht oplosbaar is en dit precipiteert op de
bodem van de maatkolf wordt dit rechtstreeks toegevoegd. Per recipiënt is dus 10 g biomassa
aanwezig met 90 ml vloeistof waarin steeds 1% van een chemisch reagens is opgelost of
gesuspendeerd. Nadat alle Duran flessen zijn afgesloten worden ze geschud en in de autoclaaf gezet
die reeds kokend water bevat. Na sluiten van deksel en ventiel wordt gewacht totdat de temperatuur
en druk van de autoclaaf gestegen is tot 121°C en 1 bar. De verdere opwarmtijd tijd van 100 °C tot
121 °C bedraagt ongeveer 12 minuten. Hierna wordt de autoclaaf gedurende 30 minuten op 121 °C
gehouden. Vervolgens wordt autclaaf uitgeschakeld en het ventiel zachtjes opengezet. Na ongeveer
20 minuten is het mogelijk om de autoclaaf te openen en stalen worden verder afgekoeld in water bij
kampertemperatuur.
Na de voorbehandeling worden de stalen afgefilterd en gewassen met 200 ml AD in porseleinen
filters waarin een zeer fijn draadnet ligt. De deeltjes die fijn genoeg zijn vallen door dit net, maar de
afgefilterde vloeistof wordt meermaals over de voorbehandelde biomassa gebracht tot de deeltjes
weerhouden worden door de filterkoek. Omdat de filterkoek te klein was om volledig zuigend
oppervlak te bedekken werd de filterkoek slecht ontwaterd. Omdat het zeer weinig biomassa betreft
werd het fijn draadnet manueel uitgeperst om overtollig water te verwijderen. Hierna werd de massa
van de natte biomassa bepaald door de massa van draadnet en biomassa te verminderen met dat
van het draadnet. Op deze manier werd alle natte biomassa gekwantificeerd. Dan wordt van de
verschillende stalen het droge stof gehalte bepaald. Uit de natte biomassa, het droge stof gehalte en
het gegeven dat 10 g droge biomassa behandeld werd kan de voorbehandelings opbrengstcoëfficiënt
bepaald worden.
Naast de voorbehandeling in de Duran flessen werd ook een zure SPORL voorbehandeling uitgevoerd
in de Parr reactor. Bij deze voorbehandeling werd 50g populier vermengd met 150g vloeistof met
daarin 1g NaHSO3 en 0,3 ml H2S04 96%. Deze voorbehandeling werd ook gebruikt in een artikel van
Wang et al. (2012b). Deze voorbehandeling kon het verschil in fenotype tussen verschillende
kruisingen, na voorbehandeling met deze condities nog steeds aantonen. Er is één essentieel verschil
tussen de voorbehandeling die uitgevoerd werd in de paper en de eigen uitgevoerde
voorbehandeling. Na de sulfiet voorbehandeling werd geen extra maling meer uitgevoerd. Een van
de voordelen van een sulfiet voorbehandeling is het feit dat grote partikels nog steeds efficient
voorbehandeld kunnen worden en na voorbehandeling gemakkelijker vermalen.
Ook hier werd de filtratie op de zelfde manier uitgevoerd zoals beschreven in het voorgaande
experiment. Om de biomassa volledig te recupereren uit de reactor werd deze nagespoeld met veel
water (3x 100 ml), waarna dit waswater afgefilterd werd.
Na droge stof bepaling volgt nog de enzymatische hydrolyse. Elk punt wordt in drievoud gemeten om
statistisch onderzoek te kunnen doen op de sampels. Die wordt uitgevoerd in vial’s van 10 ml bij een
droge stof percentage van 3%. Dit komt overeen met 300 mg biomassa per vial. De enzymen werden
zo gedoseerd zodat elke experiment uitgevoerd werd 7, 14 en 28 FPU / g droge voor behandelde
biomassa (FPU / g DS). Eerst werd nodige biomassa afgewogen in vials. Dan werd een hoeveelheid
buffer toegevoegd. Na toevoeging van de benodigde hoeveelheid enzym wordt een totaal volume
43
van 10 ml bekomen. Daarna wordt alles geïncubeert gedurende 72 uur op 50°C. Na 72 uur werden de
stalen dan ingevroren om te bewaren en microbiële degradatie van de suikers te voorkomen. Op de
dag van de meting werden de stalen terug ontdooit. Daarna werden verdund tot de concentratie
aan glucose lager dan 100µM was. De meting verliep via een GOD-POD (Glucose oxidase/peroxidase)
meting. Glucose oxidase/peroxidase zet glucose om in gluconzuur en waterstofperoxide. In de
tweede stap wordt waterstofperoxide gebruikt om ABTS te oxideren waarbij een sterk groene kleur
ontstaat. De detectie gebeurt door absorptie te meten bij 420 nm. In de oorsronkelijk proceduren
van wordt O-dianisidine gebruikt van Bergmeyer (1974).
44
7 Resultaten en bespreking
De stalen van de Franse veldproef worden aangeduid met WT-Fr (wild-type populier) en FAS13-Fr
(transgene variant). De stalen van de Belgische veldproef worden aangeduid als WT-Be (wild-type
populier) en FS40-Be (transgene variant). De vier stalen waren afkomstig van veldproeven van het
VIB en INRA (5.4 CCR downregulatie door Van Acker et al. (2014)). De Belgische stalen waren stalen
zonder schors. De Franse stalen bevatten wel nog schors.
7.1 Compositionele analyse
De resultaten van de compostionele analyse zijn weergegeven in tabel 7. Hieruit is duidelijk af te
leiden dat de Belgische stalen meer glucaan bevatten dan de Franse (45,9% versus 34,6%). Dit komt
omdat de Belgische stalen ontschorst waren. De sacharidensamenstellingen van de stalen afkomstig
van dezelfde velfproef zijn gelijkaardig. De glucaan inhoud van onze stalen (47,74 % voor FS40-Fr en
45,9 % voor WT ) komt overeen met deze uit het artikel van Van Acker et al. (respectievelijk 516,9 ±
60,3 µg/mg (51,6 %) en 509 ± 48,3 µg/mg (50,9 %) voor de FS40-Be en WT-Be lijn). Net zoals in de
compositionele analyse van het artikel van Van Acker et al. (2014)werd in de CCR lijn iets meer
glucaan gemeten.
FAS13-Fr
WT-Fr
FS40-Be
WT-Be
Lignine
26,47 ± 4,66 %
28,10 ± 7,00 %
23,42 ± 2,66 %
28,66 ± 4,3 %
Arabaan
2,04 ± 0,08 %
1,77 ± 0,1 %
0,34 ± 0,12 %
0,33 ± 0,02 %
Galactaan
1,57 ± 0,04 %
1,50 ± 0,08 %
0,99 ± 0,06 %
1,14 ± 0,08 %
Glucaan
33,45 ± 0,86 %
34,6 ± 0,76 %
47,74 ± 0,43 %
45,9 ± 0,68 %
Xylaan
11,04 ± 0,32 %
11,56 ± 3,25 %
16,89 ± 0,12 %
16,81 ± 0,46 %
Manaan
1,25 ± 22,38 %
1,25 ± 10,62 %
N.d.
N.d.
Extract
9,20%
8,38%
3,20%
4,40%
Tabel 6 Compositionele analyse van de verschillende stalen.
Wanneer we naar de lignineinhoud kijken, zien we inderdaad dat het WT gemiddeld meer lignine
(28,66 % versus 23,43 % en 28,10 % versus 26,47 %) bevat dan de CCR downgereguleerde lijnen.
Echter door te grote spreiding op deze resultaten kunnen geen sluitende conclusies getrokken
worden. Zowel de glucaan- als de lignine-inhoud is een gemiddelde van 5 metingen, waarop ook de
standaarddeviatie berekend wordt. Omdat een ligninemeting steeds gepaard gaat met een
monosaccharidemeting is het dus opmerkelijk dat de laatste veel minder spreiding vertoont. Dit
wordt verduidelijkt in Grafiek 1 Compositionele analyse van FS40-Be lijn:De glucaanmetingen 2-3-4-5
liggen zeer dicht bij elkaar terwijl de ligninemetingen een veel grotere variatie vertonen. Dit werd
voor alle stalen geobserveerd, zie Grafiek 2, Grafiek 3 en Grafiek 4. Dit was eigenllijk ook al waar te
nemen tijdens de filtratiestap, stalen 1 tot 5 (afkomstig van de zelfde boom) hadden een andere
kleur. Dit is een aanwijzing dat mogelijks verschillende reacties plaatsvinden die ook een invloed
hebben op het zuuronoplosbare lignine.
45
Compositionele analyse FS40-Be
60,00%
50,00%
42,45%
49,09%
48,87%
49,39%
49,90%
(m/m)
40,00%
27,78%
30,00%
25,43%
20,00%
23,26%
20,34%
24,15%
Lignine
Glucaan
10,00%
0,00%
1
2
3
4
5
Staal nummer
Grafiek 1 Compositionele analyse van FS40-Be lijn. Staal nummer één werd niet meegenomen in berekening van
gemiddelde glucaanhoeveelheid in Tabel 6 Compositionele analyse van de verschillende stalen.
Compositionele analyse Wi-Be
60,00%
50,00%
48,42% 47,65%
48,78%
47,21%
45,03%
(m/m)
40,00%
30,00%
20,00%
24,52%
30,61%
31,35%
36,33%
27,10%
Lignine
Glucaan
10,00%
0,00%
1
2
3
4
5
Staal nummer
Grafiek 2 Compositionele analyse van WT-Be lijn Staal nummer vijf werd niet meegenomen in berekening van
gemiddelde glucaanhoeveelheid in Tabel 6 Compositionele analyse van de verschillende stalen.
Verklaringen voor deze spreiding zijn in de literatuur niet te vinden. Wel zijn er reden te vinden
waarom de ligninehoeveelheid overschat zou kunnen worden. Er zijn onderzoeken die de acidinsoluble lignin beschouwen als de “vuilnisbak” van de analyse omdat elk niet-gehydrolyseerd deeltje
hierbij gerekend wordt (Sluiter et al., 2010). In de literatuur zijn wel voorbeelden te vinden waarbij
lignine inhoud door een dilute acid voorbehandeling stijgt ten opzichte van de niet voorbehandelde
stalen. Mogelijks worden er componenten gevormd tijdens de zure voorbehandeling die
condenseren met de zuur onoplosbare lignine onder zure condities. Afbraakproducten als furfural en
5-hydroxymethylfufural worden genoemd als mogelijke kandidaten (Katahira et al., 2013). Het lijkt
echter logischer dat dergelijke producten eerder bias zouden veroorzaken dan spreiding op de
46
resultaten. Moest inderdaad de verhoging te wijten zijn aan deze degradatieproducten zou in de
stalen met een hoger lignine gehalte een lagere hoeveelheid glucaan en andere suikers verwacht
worden. Uitgaande van de resultaten (geen spreiding op monosacchariden en veel spreiding op
lignine inhoud) lijken de monosachariden niet te interferen met de lignine meting.
Compositionele analyse FAS13-Fr
40,00%
32,96%
33,14%
34,37% 35,65%
35,00%
(m/m)
30,00%
29,32%
32,47%
25,00%
34,35%
32,46%
23,19%
25,10%
20,00%
Lignine
15,00%
Glucaan
10,00%
5,00%
0,00%
1
2
3
4
5
Staal nummer
Grafiek 3 Compositionele analyse van Fas13-Fr lijn
(m/m)
Compositionele analyse WT-Fr
45,00%
40,00%
35,00%
30,00%
25,00%
20,00%
15,00%
10,00%
5,00%
0,00%
35,44%
36,69%
33,98%
24,73% 17,93%
26,78%
35,17%
40,94%
34,00%
24,20%
Lignine
Glucaan
1
2
3
4
5
Staal nummer
Grafiek 4 Compositionele analyse van WT-Fr lijn. Staal nummer drie werd niet meegenomen in berekening van
gemiddelde glucaan hoeveelheid in Tabel 6 Compositionele analyse van de verschillende stalen.
Ook eiwitten zijn een te onderzoeken piste. Normaal worden eiwitten verwijderd tijdens de
extractie. Mogelijks zijn niet alle eiwitten verwijderd en zorgt dit voor de interferentie (Sluiter et al.,
2010). De spreiding op de metingen wordt enkel verklaard indien de eiwitten niet homogeen
verdeeld zitten in het staal. Bij een homogene verdeling van de eiwitten is te verwachten dat enkel
bias zou optreden.
Er zijn wel artikels die een verklaring geven voor spreidingen binnen de gemeten monosacchariden
(Templeton et al., 2010) maar niet voor spreiding van het ligninegehalte.
47
7.2 Enzymatische hydrolyse
7.2.1 Hydrolyse uitgevoerd door opschalen van de high-throughput experimenten
In deze paragraaf worden de resultaten gegeven en besproken van het opgeschaalde highthroughput experiment.
Massa biomassa
Pretreatment solution
Enzym
Temperatuur
Neutralizing solution/buffer
high throughput
1,5 mg
750 µL
0,25 µL
90 °C
50 µL
zelf uitgevoerde experimeten
150 mg
75 ml
25 µL
90 °C
4 ml
Om over de begrippen saccharificatie- en glucaanopbrengst eenduidig te kunnen spreken worden ze
hieronder beiden gedefinieerd. Saccharificatie werd in deze thesis gedefinieerd als de hoeveelheid
vrijgestelde glucose per hoeveelheid onbehandelde biomassa. De glucaanopbrengst is gedefinieerd
als de hoeveelheid glucaan die vrijgesteld werd op de hoeveelheid glucaan in de afgewogen
hoeveelheid biomassa. Men kan niet gebruik maken van het begrip cellulose opbrengst omdat de
hoeveelheid cellulose niet gekwantificeerd werd. In de plaats wordt dus de hoeveelheid glucaan
gebruikt. Omdat 1,00 gram glucaan of cellullose 1,11 gram glucose vrijstelt na hydrolyse (opname
van water) wordt de hoeveelheid glucaan berekend door de hoeveelheid vrijgestelde glucose te
vermenigvuldigen met 0,9.
7.2.1.1 Franse lijnen (FAS13-Fr & WT-Fr)
Wanneer de sacharificatie opbrengst en glucaanopbrengst van de Franse lijnen vergeleken worden
met de high-troughput experimenten uit de literatuur kan men concluderen dat de opgeschaalde
versies slechter presteren. De Franse lijnen worden voor 24,9 en 28,6% gesaccharificeerd terwijl bij
de eigen experimenten maximaal 11,21% gehaald wordt. Het experiment werd volledig herhaald op
exact de zelfde manier: dit gaf met in acht name van de spreiding hetzelfde resultaat.
48
Saccharificatie opbrengst na 24h
12,00%
10,00%
(m/m)
8,00%
6,00%
4,00%
2,00%
0,00%
EXP 1
WT-Fr 24h
EXP 2
FAS13-Fr 24h
Grafiek 5 Saccharificatie opbrengst na 24h van FAS13-Fr & WT-Fr
Saccharificatie opbrengst na 72h
12,00%
10,00%
(m/m)
8,00%
6,00%
4,00%
2,00%
0,00%
EXP 1
WT-Fr 72h
EXP 2
FAS13-Fr 72h
Grafiek 6 Saccharificatie opbrengst na 72h van FAS13-Fr & WT-Fr
49
Glucaan opbrengst 24h
35,00%
30,00%
(m/m)l
25,00%
20,00%
15,00%
10,00%
5,00%
0,00%
EXP 1
WT-Fr 72h
EXP 2
FAS13-Fr 72h
Grafiek 7 Glucaan opbrengst na 24h van FAS13-Fr & WT-Fr
Glucaanopbrengst 24h
35,00%
30,00%
(m/m)
25,00%
20,00%
15,00%
10,00%
5,00%
0,00%
EXP 1
WT-Fr 24h
EXP 2
FAS13-Fr 24h
Grafiek 8 Glucaan opbrengst na 72h van FAS13-Fr & WT-Fr
Vermoedelijk is deze proefopzet niet geschikt om dergelijke voorbehandelingen bij dergelijk laag
drogestof gehalte te doen. Het is geweten dat bij hoge substraatconcentratie productinhibitie een
probleem wordt (Kristensen et al., 2009). Daarom mag men bij dergelijke lage substraat
concentraties nagenoeg volledige conversie verwachten. Mogelijks zijn de stappen waar de hydrolyse
niet exact gekopieerd kon worden verantwoordelijk voor de verschillen. Bij de high-troughput
50
methode worden de platen gemengd via end-over-end mixing. Mogelijks is de schudsnelheid van
onze incubator te laag om alle deeltjes gesuspendeerd te houden en treedt er dus sedimentatie op.
Ook is ball milling een voorbehandelingstap die wel in de high-throughput methode en niet in de
eigen uitgevoerde experimenten uitgevoerd werd. Er wordt aanvaard dat ball-milling een effect heeft
op de kristaliniteit van het substraat en dus op de digesteerbaarheid (Schwanninger et al., 2004).
Daarnaast waren de geteste stalen in het artikel ontschorst. De geteste Franse stalen in deze thesis
bevatten wel nog schors.
Onafhankelijk van het feit dat de rendementen te laag zijn kon ook worden vastgesteld dat de wild
type lijn steeds beter scoort in beide experimenten. Na 72 uur was het sacharificatiepotentieel van
wild type significant hoger in experiment 2. Omdat er dus een significant verschil werd vastgesteld
dat tegen tegengesteld was aan de verwachtingen werd een verklaring gezocht. Mogelijks speelt
deeltjesgrootte een rol. Met de zeven die we ter beschikking hadden in het labo werd een
deeltjesprofiel opgesteld van beide stalen.
51
Verdeling deeltjes profiel
80,00%
70,00%
massa fractie
60,00%
50,00%
40,00%
Wt-Fr
30,00%
FAS13-Fr
20,00%
10,00%
0,00%
… > 1 mm 1 mm > … > 800 µm > … 500 µm > …
800 µm
> 500 µm
Grafiek 9 Verdeling deeltjes profiel van Fas13-Fr en WT-Fr
Uit Grafiek 9 kan men afleiden datGrafiek 9 Verdeling deeltjes profiel van Fas13-Fr en WT-Fr het
wildtype meer fijne deeltjes bevat dan de transgene lijn. Er wordt algemeen aanvaard dat kleine
deeltjes beter versuikeren (Vidal et al., 2011).
Uit het eerste experiment met schorsbevattende stalen van de Franse veldproef kunnen we niet
besluiten dat er een significante verbetering is van het saccharifcatie potentieel van de CCR lijn. Bij
de volgende proef met de nieuwe ontschorste stalen van de Belgische veldproef, werd na
deeltjesverkleining een extra zeefstap ingevoerd om het effect van deeltjesgrootte te kunnen
uitsluiten.
7.2.1.2 Belgische lijnen
Ook in deze stalen was het sacharificatie potentieel aan de lage kant (<11%; Grafiek 10 en Grafiek 11)
Om deeltjesgrootte effecten te kunnen uitsluiten werd de verhakselde biomassa gefractioneerd door
te zeven. Voor dit experiment werd de fractie tussen 500µm en 800µm gebruikt. De
saccarificatieopbrengst en glucaanopbrengst van FS40-Be lijn is hoger dan die van het wild type,
maar dit is geen significante verhoging. Doordat bij deze proef de saccharificaties slechts in tweevoud
uitgevoerd werden, kon geen significant verschil gemeten worden.
52
Saccharficatieopbrengst na 24h
12,00%
10,00%
(g/g)
8,00%
6,00%
4,00%
2,00%
0,00%
WT-Be 24h
FS40-Be 24h
Grafiek 10 Saccharificatieopbrengst na 24h van FAS40-Be & WT-Be
Saccharificatieopbrengst na 72h
12,00%
10,00%
(g/g)
8,00%
6,00%
4,00%
2,00%
0,00%
WT-Be 72h
FS40-Be 72h
Grafiek 11 Saccharificatieopbrengst na 72h van FAS40-Be & WT-Be
53
Glucaanopbrengst na 24h
0,2
(g/g)
0,15
0,1
0,05
0
1
WT-Be 24h
FS40-Be 24h
Grafiek 12 Glucaanopbrengst na 24h van FAS40-Be & WT-Be
Glucaanopbrengst na 24h
0,2
(g/g)
0,15
0,1
0,05
0
1
WT-Be 72h
FS40-Be 72h
Grafiek 13 Glucaanopbrengst na 72h van FAS40-Be & WT-Be
54
7.2.1.3 Besluit
Er kan worden besloten worden dat dit high-throughput experimenten niet opgeschaald konden
worden omdat de omzettingen veel te laag waren. De saccharificatieopbrengst bedraagt tussen 8,00
en 11,13 % voor de opgeschaalde experimenten terwijl de geautomatiseerde hydrolyses
rendementen haalden tussen de 24,9 en 39,3 %. De glucaanconversie van de opgeschaalde
experimenten bedroeg tussen de 15,68 en 28,9 % versus 53,4 en 79, 7 % voor de kleinschalige
hydrolyses (Tabel 7). Een aantal stappen als ball-milling en end-over-end mixing zijn moeilijk toe te
passen in de realiteit. Hierdoor liggen de rendementen een stuk lager.
Sacharificatieopbrengst
High-throughput Opschaling
FS40-Be 39,3 ± 4,8 %
10,75 ± 0,73 %
WT-Be
35,3 ± 2,6 %
8,00 ± 0,97 %
Cellulose-/Glucaanomzetting
High-throughput Opschaling
79,7, ± 9,3 %
20,26 ± 1,38 %
68,9, ± 4,0 %
15,68 ± 1,92 %
FAS13-Fr 36,2 ± 2,1 %
WT-Fr
24,9 ± 2,3 %
65,2 ± 5,4 %
53,4 ± 12,0 %
10,29 ± 0,35 %
11,13 ± 0,84 %
27,69 ± 1,19 %
28,9 ± 2,28 %
Tabel 7 Vergelijking high-throughput met opschalin
Omdat twee verschillende substraten gebruikt zijn, moet een controle gebeuren op deeltjesgrootte.
Dit in tegenstelling tot andere experimenten, waar bijvoorbeeld verschillende voorbehandelingen
getest worden op hetzefde substraat. Daarnaast is deze methode veel minder nauwkeurig doordat
de operator veel tussenkomt in de analyse. Bij high-throughput analyse uitgevoerd door Santoro
werden alle handelingen uitgevoerd door een robot (Santoro et al., 2010). Ook moet een oplossing
voor de bezinkende biomassa (end-over-end mixing) gevonden worden, indien nog bij zeer lage
droge stof gehaltes gewerkt wordt.
7.2.2 Hydrolyse uitgevoerd volgens de meer klassieke eigen opzet
Hieronder wordt een definitie gegeven van de begrippen saccharificatie-, glucaanopbrengst en
opbrengstcoëfficient. Omdat de voorbehandeling en hydrolyse hier niet in hetzelfde recipient
plaatsvinden moet bij berekening van saccharificatie-, glucaanopbrengst ook nog rekening gehouden
worden met de opbrengstcoëfficent van de biomassa. Deze coefficiënt drukt uit wat de biomassa
opbrengst is van de voorbehandeling.
55
7.2.2.1
Bespreking Voorbehandelingen
De opbrengstcoëfficenten van de voorbehandelingen liggen tussen de 67,28 en 107,27%. De
opbrengstcoëfficent van de SPROL en NaOH voorbehandeling zijn het laagste (< 65% voor Franse
stalen en minder dan 94,5% voor de Belgische ontschorste stalen) zie Tabel 8. De zwavelzuur
voorbehandeling hebben een iets hogere opbrengstcoëfficient (>65% voor Franse stalen en meer dan
94,5% voor Belgische ontschorste stalen).
Bij een basische of sulfiet voorbehandeling is het massaverlies te wijten aan lignine die opgelost in de
vloeibare fase, terwijl bij een zure voorbehandeling vooral hemicellulose gedepolymeriseerd wordt
en verdwijnt in het filtraat. Bij de populieren, afkomstig van de franse veldproef zijn de
opbrengstcoefficiënten voor alle voorbehandelingen lager. De Franse stalen hadden
opbrengstcoëfficienten van 61,92% tot 80,27% terwijl de Belgische stalen opbrengstcoëfficenten
hadden van 90,19% tot 107,27% (Tabel 8en Grafiek 14). Dit is te verklaren omdat de franse biomassa
nog schors bevatte, die meer lignine en hemicellulose bevat, waardoor relatief meer biomassa
opgelost wordt. De opbrengstcoëfficiënten van Ca(OH)2 voorbehandeling van de belgische
populierstalen zijn groter dan 100%. Mogelijk is dit te wijten aan Ca(OH)2 dat neerslaat in de poriën
van de biomassa. Statistisch gezien heeft het geen zin om uitspraken te doen bij welke populier (wild
type versus transgene lijn) meer of minder biomassa verwijderd wordt.
Ca(OH)2
Na(OH)
H2SO4
Sporl
FAS13-Fr WT-Fr
FS40-Be WT-Be
80,27% 76,99% 102,28% 107,27%
61,92% 64,13% 90,19% 94,05%
67,28% 65,91% 95,49% 94,53%
68,32% 68,70%
Tabel 8 opbrengstcoëfficiënt voorbehandelingen
1,2
1
0,8
WT-Fr
0,6
FAS13-Fr
WT-Be
0,4
FS40-Be
WT-Be
FAS13-Fr
WT-Fr
0,2
0
Ca(OH)2 Na(OH)
H2SO4
FS40-Be
Sporl
Grafiek 14 Opbrengst verschillende voorbehandelingen
56
(m/m)
Saccharificatie opbrengst na 72h
Ca(OH)2 voorbehandeling
40,00%
35,00%
30,00%
25,00%
20,00%
15,00%
10,00%
5,00%
0,00%
WT-Fr
FAS13-Fr
WT-Be
FS40-Be
0
10
20
30
40
FPU / g DS
Grafiek 15 Saccharificatieopbrengst na 72h met Ca(OH)2 voorbehandeling
Saccharificatie opbrengst na 72h
NaOH voorbehandeling
50,00%
(m/m)
40,00%
30,00%
WT-Fr
20,00%
FAS13-Fr
WT-Be
10,00%
FS40-Be
0,00%
0
5
10
15
20
25
30
FPU / g DS
Grafiek 16 Saccharificatieopbrengst na 72h met NaOH voorbehandeling
57
Saccharificatie opbrengst na 72h
H2S04
30,00%
(m/m)
25,00%
20,00%
WT-Fr
15,00%
FAS13-Fr
10,00%
WT-Be
5,00%
FS40-Be
0,00%
0
5
10
15
20
25
30
FPU / g DS
Grafiek 17 Saccharificatieopbrengst na 72h met H2S04 voorbehandeling
Saccharificatie opbrengst na 72h
SPORL
30,00%
(m/m)
25,00%
20,00%
15,00%
WT-Fr
10,00%
FAS13-Fr
5,00%
0,00%
0
5
10
15
20
25
30
FPU / g DS
Grafiek 18 Saccharificatieopbrengst na 72h met SPORL voorbehandeling
7.2.2.2
Bespreking saccharificatie Franse lijnen
Bij de Ca(OH)2 voorbehandeling scoort de transgene lijn significant beter dan de wilde lijn bij 7 FPU /
g DS (8,66 % saccharificatie versus 7,79 % ; Grafiek 15 ; Tabel 15 ). Bij de NaOH voorbehandeling
werden geen significante verschillen gemeten, dit is duidelijk zichtbaar in Grafiek 16 ( Tabel 15 ). De
zwavelzuur voorbehandeling geeft bij 28 FPU / g DS een significant betere opbrengst dan de
transgene lijn (7,73 % versus 6,80 %; Grafiek 17 ; Tabel 15). Bij SPORL zien we bij 28 FPU / g DS echter
het omgkeerde: de transgene lijn scoort significant slechter 21,29% versus 23,67% (Grafiek 18 ; Tabel
15). Voor tabel met alle resultaten en statistische verwerking van glucaanopbrengst wordt verwezen
naar Tabel 16 in bijlage. Uit deze tabel met glucaan opbrengst kan het zelfde afgeleid worden dan uit
de tabel met de saccharificatie opbrengsten.
Wanneer alle saccharificatieopbrengsten van mutante en wildtype populieren vergeleken worden,
zien we dat op enkele uitzonderingen na, geen significante verschillen (95% betrouwbaarheids
58
interval, tweezijdig) gemeten worden tussen de verschillende lijnen.
Bij de saccharificatierendementen van de franse stalen wordt enkel een significant verschil
opgemeten voor: de Ca(OH)2 VB bij 7 FPU / g DS; de H2SO4 VB bij 28 FPU / g DS en SPORL bij 28
FPU/g DS. Van de twaalf uitgevoerde experimenten (4 voorbehandelingen bij 3 enzym dossages) zijn
er slechts 3 waarbij een significant verschil gemeten wordt (1/4). Normaal is de kans op een vals
positief (lees hier als een effectief verschil) 1 op 20 bij een 95% betrouwbaarheids interval. Daarom
wordt vermoed dat de statistische verschillen te wijten zijn aan toeval omdat ze niet consequent zijn.
Vermoedelijk liggen menselijk fouten aan de basis van deze metingen. Daarnaast kan ook de
deeltjesgrootte een rol spelen binnen deze experimenten. Binnen deze proef kan op geen enkele
manier besloten worden dat de FAS13-Fr significant beter scoort dan Wi-Fr.
7.2.2.3 Bespreking saccharificatie Belgische lijnen
Bij deze proef werd na het verkleinen en zeven, de fractie tussen de 2 en 1,4 mm gebruikt om alle
voorbehandelingen te doen. Variatie ten gevolge van deeltjesgrootte werd hier uitgesloten.
Uit de hydrolyses en voorbehandelingen, uitgevoerd op belgische ontschorste stalen blijkt dat de
transgene lijn FS40 bij een de Ca(OH)2 voorbehandeling weldegelijk een beter rendement behaalt bij
7 en 28 FPU / g DS (27,33 % versus 19,15 % en 35,74 % versus 30,12 % ; Tabel 17) . Uit statistische
analyse blijkt dat voor deze punten een significant verschil gemeten wordt. Bij 14 FPU / g droge stof
is het verschil even groot (31,74 % versus 25,76 %), maar niet statistisch significant voor dit
experiment (Tabel 17). Bij de NaOH voorbehandeling scoort de transgene lijn overal beter (26,78 %
versus 26,64 % ; 33,43 % versus 32,26 % en 38,46 % versus 34,81 %) dan wild type populier maar dit
is statistisch niet significant. Uit de zwavelzuur voorbehandeling kunnen opnieuw geen statistisch
significante verschillen worden afgeleid.
Opnieuw moeten we besluiten dat behalve de Ca(OH)2 voorbehandeling geen verschil gemeten
wordt.
7.2.2.4 Besluit
De transgene lijnen en wild type lijnen vertonen geen spectaculaire verschillen. Enkel bij de Ca(OH)2
voorbehandeling vertonen de mutante lijnen een verbetering ten opzichte van de wild type.
Enerzijds is het mogelijk dat het hout, gebruikt in deze thesis veel minder fenotypische kenmerken en
dus verlaagde lignineinhoud vertoont in vergelijking met de geanalyseerde stalen in het artikel van
Van Acker et al. (2014). Daarin staat beschreven dat het saccharificatiepotentieel bepaald werd op de
drie klassen van bomen met sterkste verkleuring. Uit de supplementaire data blijkt ook dat de
transgene bomen die behoorden tot klasse 3 niet significant beter schoorden dan wilde lijnen. Bij de
belgische stalen scoort de transgene FS40 lijn steeds beter.
Anderzijds zou, wanneer er toch een fenotypsich verschil zou zijn tussen deze stalen, deze methode
niet geschikt bevonden zijn om een verschil in saccharificeerbaarheid aan te tonen. Mogelijks moet
deze methode aangepast worden waarbij meer herhalingen gedaan worden op hetzelfde materiaal.
Ook zou het beter zijn om na elke voorbehandeling een nieuwe compositionele analyse te uit te
voeren om te weten hoeveel lignine en glucaan in de voorbehandelde stalen zit. Het is duidelijk dat
de reeds bewezen verbetering in saccharificatie potenieel doormiddel van SSF experimenten en hightroughput analyse niet kan aangetoond worden in deze ‘klassieke’ proefopzet
59
Naast het feit dat geen verschillen werden opgemerkt werden wel goeie rendementen gemeten. De
NaOH voorbehandeling gafbij 28 FPU /g DS een glucaanconversie van 68% voor de Belgische
ontschorste stalen en meer dan 51% voor de Franse stalen met schors (Tabel 16 en Tabel 18).
Bij de zure sporl voorbehandeling werd een glucaan conversie bekomen van meer dan 57% (Tabel
16).
7.2.3 Belsuit hydrolyse experimenten
Het is niet gelukt een statistisch significante verbetering in sacharificatiepotentieel of
glucaanomzetting aan te tonen voor een van de transgene lijnen. Het feit dat er geen significant
verschil is bekent echter niet dat er geen verschil is. Het betekent enkel dat er geen verschil
meetbaar is binnen deze proegopzet.
Voor toekomstige experimenten is het aan te raden om geen hydrolyse experimenten bij
verschillende enzym dosages uit te voeren, maar meer herhalingen te doen bij dezelfde hoeveelheid
enzym. Ook voorbehandelingen kunnen meer herhaald worden. Bij de klassieke opzet worden in
tegenstelling met de opschaling van de high-throuhgput methode laat toe wel goeie rendementen
gehaalt.
60
8 Algemeen besluit
Het is niet mogelijk om een high-throughput eenvoudigweg te kopiëren door een schaalvergroting
toe te passen. De gehaalde rendementen zijn laag in vergelijking met eerdere resultaten uit de
literatuur. Er zijn een aantal verbeteringen mogelijk in de proefopzet.
Daarnaast is het duidelijk dat de verbeteringen van het saccharificatiepotentieel die werden gemeten
in het artikel van Van Acker et al. (2014) niet overtuigend werden vastgesteld in deze thesis. De
uitkomsten die wel wijzen op een verbetering zijn niet overtuigend genoeg.
De experimenten die uitgevoerd werden volgens de klassieke methode7 hebben wel een hoge
opbrengst in tegenstelling tot de opschaalde high-throughput experimenten. In industriële
toepasbare omstandigheden werden behalve voor Ca(OH)2 voorbehandeling geen verbeteringen
gemeten van transgene lijnen.
Daarnaast is de ligninebepaling een probleem in onze analyse. Een alternatieve methode kan een
elementanalyse zijn om de verhoudingen tussen de verschillende componenten (C/H/N8) te
vergelijken.
Ten slotte rijst de vraag of dat een verhoging van het sacharificatiepotentieel, aangetoond met een
high-trouput methode wel relevant is op macroschaal? Algemeen is het geweten dat omzetting van
biomassa in koolhydraten een zeer lage opbrengst geeft. Meestal zijn zeer agressieve condities nodig
om hoge rendementen te halen bij saccharificatie van loofhout. Is een verlaging van lignine gehalte
of aanpassing van structuur dan nog wel industrieel relevant? Ook is de verminderde
biomassaopbrengst per hectare nadelig voor de transgene lijnen.
7
8
Klassieke methode : voorbehandeling en sacharificatie in een appart recipiënt (6.2.2)
C/H/N : koolstof / waterstof / stiktof
61
9 Referentielijst
Adney, B., 1996, Measurement of cellulase activities laboratory analytical procedure (LAP), in J.
Baker, and L. National Renewable Energy, eds., NREL/TP ;, National Renewable Energy
Laboratory.
Agbor, V. B., N. Cicek, R. Sparling, A. Berlin, and D. B. Levin, 2011, Biomass pretreatment:
Fundamentals toward application: Biotechnology Advances, v. 29, p. 675-685.
An, H. J., W. E. Wilhelm, and S. W. Searcy, 2011, Biofuel and petroleum-based fuel supply chain
research: A literature review: Biomass & Bioenergy, v. 35, p. 3763-3774.
Atalla, R. H., and D. L. VanderHart, 1999, The role of solid state C-13 NMR spectroscopy in studies of
the nature of native celluloses: Solid State Nuclear Magnetic Resonance, v. 15, p. 1-19.
BeMiller, J. N., and R. L. Whistler, 2009, Starch: Chemistry and Technology, Elsevier Science.
Bergmeyer, 1974, Determination with glucose oxidase and peroxidase., Methods of enzymatic
analysis, New York, Academic Press.
Berlin, A., M. Balakshin, N. Gilkes, J. Kadla, V. Maximenko, S. Kubo, and J. Saddler, 2006, Inhibition of
cellulase, xylanase and beta-glucosidase activities by softwood lignin preparations: Journal of
Biotechnology, v. 125, p. 198-209.
Boerjan, W., J. Ralph, and M. Baucher, 2003, Lignin biosynthesis: Annual Review of Plant Biology, v.
54, p. 519-546.
Brandt, A., J. Grasvik, J. P. Hallett, and T. Welton, 2013, Deconstruction of lignocellulosic biomass
with ionic liquids: Green Chemistry, v. 15, p. 550-583.
Carpita, N. C., and D. M. Gibeaut, 1993, STRUCTURAL MODELS OF PRIMARY-CELL WALLS IN
FLOWERING PLANTS - CONSISTENCY OF MOLECULAR-STRUCTURE WITH THE PHYSICALPROPERTIES OF THE WALLS DURING GROWTH: Plant Journal, v. 3, p. 1-30.
Carvajal, Y. A., H. Verelst, E. G. Suarez, and J. Pedraza, 2010, Simulation of the Batch Fermentation
Stage in the Process to obtain Ethanol from Final Molasse: Pres 2010: 13th International
Conference on Process Integration, Modelling and Optimisation for Energy Saving and
Pollution Reduction, v. 21, p. 931-936.
Carvalheiro, F., L. C. Duarte, and F. M. Girio, 2008, Hemicellulose biorefineries: a review on biomass
pretreatments: Journal of Scientific & Industrial Research, v. 67, p. 849-864.
Chang, V. S., B. Burr, and M. T. Holtzapple, 1997, Lime pretreatment of switchgrass: Applied
Biochemistry and Biotechnology, v. 63-5, p. 3-19.
Chen, Y., A. J. Stipanovic, W. T. Winter, D. B. Wilson, and Y.-J. Kim, 2007, Effect of digestion by pure
cellulases on crystallinity and average chain length for bacterial and microcrystalline
celluloses: Cellulose, v. 14, p. 283-293.
Choi, C. H., and A. P. Mathews, 1996, Two-step acid hydrolysis process kinetics in the saccharification
of low-grade biomass .1. Experimental studies on the formation and degradation of sugars:
Bioresource Technology, v. 58, p. 101-106.
Clesceri, L. S., A. P. Sinitsyn, A. M. Saunders, and H. R. Bungay, 1985, RECYCLE OF THE CELLULASEENZYME COMPLEX AFTER HYDROLYSIS OF STEAM-EXPLODED WOOD: Applied Biochemistry
and Biotechnology, v. 11, p. 433-443.
Converse, A. O., H. Ooshima, and D. S. Burns, 1990, KINETICS OF ENZYMATIC-HYDROLYSIS OF
LIGNOCELLULOSIC MATERIALS BASED ON SURFACE-AREA OF CELLULOSE ACCESSIBLE TO
ENZYME AND ENZYME ADSORPTION ON LIGNIN AND CELLULOSE: Applied Biochemistry and
Biotechnology, v. 24-5, p. 67-73.
de Vries, R. P., and J. Visser, 2001, Aspergillus enzymes involved in degradation of plant cell wall
polysaccharides: Microbiology and Molecular Biology Reviews, v. 65, p. 497-+.
Dixon, R. A., C. J. Lamb, S. Masoud, V. J. H. Sewalt, and N. L. Paiva, 1996, Metabolic engineering:
Prospects for crop improvement through the genetic manipulation of phenylpropanoid
biosynthesis and defense responses - A review: Gene, v. 179, p. 61-71.
62
Ebringerova, A., Z. Hromadkova, and T. Heinze, 2005, Hemicellulose: Polysaccharides 1: Structure,
Characterization and Use, v. 186, p. 1-67.
El-Zawawy, W. K., M. M. Ibrahim, Y. R. Abdel-Fattah, N. A. Soliman, and M. M. Mahmoud, 2011, Acid
and enzyme hydrolysis to convert pretreated lignocellulosic materials into glucose for
ethanol production: Carbohydrate Polymers, v. 84, p. 865-871.
Eschenburg, S., M. L. Healy, M. A. Priestman, G. H. Lushington, and E. Schonbrunn, 2002, How the
mutation glycine96 to alanine confers glyphosate insensitivity to 5-enolpyruvyl shikimate-3phosphate synthase from Escherichia coli: Planta, v. 216, p. 129-135.
Fan, L. T., Y. H. Lee, and D. H. Beardmore, 1980, MECHANISM OF THE ENZYMATIC-HYDROLYSIS OF
CELLULOSE - EFFECTS OF MAJOR STRUCTURAL FEATURES OF CELLULOSE ON ENZYMATICHYDROLYSIS: Biotechnology and Bioengineering, v. 22, p. 177-199.
Fan, L. T., Y. H. Lee, and D. R. Beardmore, 1981, THE INFLUENCE OF MAJOR STRUCTURAL FEATURES
OF CELLULOSE ON RATE OF ENZYMATIC-HYDROLYSIS: Biotechnology and Bioengineering, v.
23, p. 419-424.
Fengel, D., and G. Wegener, 1989, Wood: Chemistry, Ultrastructure, Reactions, Walter De Gruyter
Incorporated.
Ferrer, J. L., M. B. Austin, C. Stewart, and J. P. Noe, 2008, Structure and function of enzymes involved
in the biosynthesis of phenylpropanoids: Plant Physiology and Biochemistry, v. 46, p. 356370.
Gibeaut, D. M., and N. C. Carpita, 1994, BIOSYNTHESIS OF PLANT-CELL WALL POLYSACCHARIDES:
Faseb Journal, v. 8, p. 904-915.
Gibson, L. J., 2012, The hierarchical structure and mechanics of plant materials: Journal of the Royal
Society Interface, v. 9, p. 2749-2766.
Gilad, R., L. Rabinovich, S. Yaron, E. A. Bayer, R. Lamed, H. J. Gilbert, and Y. Shoham, 2003, Ce1I, a
noncellulosomal family 9 enzyme from Clostridium thermocellum, is a processive
endoglucanase that degrades crystalline cellulose: Journal of Bacteriology, v. 185, p. 391-398.
Girio, F. M., C. Fonseca, F. Carvalheiro, L. C. Duarte, S. Marques, and R. Bogel-Lukasik, 2010,
Hemicelluloses for fuel ethanol: A review: Bioresource Technology, v. 101, p. 4775-4800.
Grethlein, H. E., 1985, THE EFFECT OF PORE-SIZE DISTRIBUTION ON THE RATE OF ENZYMATICHYDROLYSIS OF CELLULOSIC SUBSTRATES: Bio-Technology, v. 3, p. 155-160.
Grethlein, H. E., D. C. Allen, and A. O. Converse, 1984, A COMPARATIVE-STUDY OF THE ENZYMATICHYDROLYSIS OF ACID-PRETREATED WHITE-PINE AND MIXED HARDWOOD: Biotechnology and
Bioengineering, v. 26, p. 1498-1505.
Hakamada, Y., K. Endo, S. Takizawa, T. Kobayashi, T. Shirai, T. Yamane, and S. Ito, 2002, Enzymatic
properties, crystallization, and deduced amino acid sequence of an alkaline endoglucanase
from Bacillus circulans: Biochimica Et Biophysica Acta-General Subjects, v. 1570, p. 174-180.
Hall, M., P. Bansal, J. H. Lee, M. J. Realff, and A. S. Bommarius, 2010, Cellulose crystallinity - a key
predictor of the enzymatic hydrolysis rate: Febs Journal, v. 277, p. 1571-1582.
Hamelinck, C. N., G. van Hooijdonk, and A. P. C. Faaij, 2005, Ethanol from lignocellulosic biomass:
techno-economic performance in short-, middle- and long-term: Biomass & Bioenergy, v. 28,
p. 384-410.
Hames, B., R. Ruiz, C. Scarlata, A. Sluiter, J. Sluiter, and D. Templeton, 2008, Preparation of samples
for compositional analysis: Laboratory Analytical Procedure (LAP), v. 1617.
Hardy, M. R., R. R. Townsend, and Y. C. Lee, 1988, MONOSACCHARIDE ANALYSIS OF
GLYCOCONJUGATES BY ANION-EXCHANGE CHROMATOGRAPHY WITH PULSED
AMPEROMETRIC DETECTION: Analytical Biochemistry, v. 170, p. 54-62.
Harmsen, P., 2010, Literature Review of Physical and Chemical Pretreatment Processes for
Lignocellulosic Biomass, Wageningen UR, Food & Biobased Research.
Harris, P., 2014, Auxiliary Activity Family 9.
He, Y., Y. Pang, Y. Liu, X. Li, and K. Wang, 2008, Physicochemical characterization of rice straw
pretreated with sodium hydroxide in the solid state for enhancing biogas production: Energy
& Fuels, v. 22, p. 2775-2781.
63
Hilden, L., and G. Johansson, 2004, Recent developments on cellulases and carbohydrate-binding
modules with cellulose affinity: Biotechnology Letters, v. 26, p. 1683-1693.
Hu, F., and A. Ragauskas, 2012, Pretreatment and Lignocellulosic Chemistry: Bioenergy Research, v. 5,
p. 1043-1066.
Hu, W. J., S. A. Harding, J. Lung, J. L. Popko, J. Ralph, D. D. Stokke, C. J. Tsai, and V. L. Chiang, 1999,
Repression of lignin biosynthesis promotes cellulose accumulation and growth in transgenic
trees: Nature Biotechnology, v. 17, p. 808-812.
Humpula, J. F., S. P. S. Chundawat, R. Vismeh, A. D. Jones, V. Balan, and B. E. Dale, 2011, Rapid
quantification of major reaction products formed during thermochemical pretreatment of
lignocellulosic biomass using GC-MS: Journal of Chromatography B-Analytical Technologies in
the Biomedical and Life Sciences, v. 879, p. 1018-1022.
International Union of Biochemistry and Molecular Biology. and Webb, E. C., 1992, Enzyme
nomenclature 1992 : recommendations of the Nomenclature Committee of the International
Union of Biochemistry and Molecular Biology on the nomenclature and classification of
enzymes prepared for NC-IUBMB by Edwin C. Webb, p. xiii, 862.
Jensen, W. B., 2007, The origin of the soxhlet extractor: Journal of Chemical Education, v. 84, p. 19131914.
Jiang, H., Q. Q. Chen, J. H. Ge, and Y. Zhang, 2014, Efficient extraction and characterization of
polymeric hemicelluloses from hybrid poplar: Carbohydrate Polymers, v. 101, p. 1005-1012.
Kanji, G. K., 2006, 100 Statistical Tests, SAGE Publications.
Kassim, E. A., and A. S. Elshahed, 1986, ENZYMATIC AND CHEMICAL HYDROLYSIS OF CERTAIN
CELLULOSIC MATERIALS: Agricultural Wastes, v. 17, p. 229-233.
Katahira, R., J. B. Sluiter, D. J. Schell, and M. F. Davis, 2013, Degradation of Carbohydrates during
Dilute Sulfuric Acid Pretreatment Can Interfere with Lignin Measurements in Solid Residues:
Journal of Agricultural and Food Chemistry, v. 61, p. 3286-3292.
Kerherve, P., B. Charriere, and F. Gadel, 1995, Determination of marine monosaccharides by high-pH
anion-exchange chromatography with pulsed amperometric detection: Journal of
Chromatography A, v. 718, p. 283-289.
Kim, C. H., and D. S. Kim, 1995, PURIFICATION AND SPECIFICITY OF A SPECIFIC ENDO-BETA-1,4-DGLUCANASE (AVICELASE-II) RESEMBLING EXO-CELLOBIOHYDROLASE FROM BACILLUSCIRCULANS: Enzyme and Microbial Technology, v. 17, p. 248-254.
Kobayashi, K., S. Kimura, U. J. Kim, K. Tokuyasu, and M. Wada, 2012, Enzymatic hydrolysis of cellulose
hydrates: Cellulose, v. 19, p. 967-974.
Kristensen, J. B., C. Felby, and H. Jorgensen, 2009, Yield-determining factors in high-solids enzymatic
hydrolysis of lignocellulose: Biotechnology for Biofuels, v. 2.
Kumar, P., D. M. Barrett, M. J. Delwiche, and P. Stroeve, 2009, Methods for Pretreatment of
Lignocellulosic Biomass for Efficient Hydrolysis and Biofuel Production: Industrial &
Engineering Chemistry Research, v. 48, p. 3713-3729.
Langan, P., Y. Nishiyama, and H. Chanzy, 2001, X-ray structure of mercerized cellulose II at 1
angstrom resolution: Biomacromolecules, v. 2, p. 410-416.
Lee, D., A. H. C. Yu, K. K. Y. Wong, and J. N. Saddler, 1994, EVALUATION OF THE ENZYMATIC
SUSCEPTIBILITY OF CELLULOSIC SUBSTRATES USING SPECIFIC HYDROLYSIS RATES AND
ENZYME ADSORPTION: Applied Biochemistry and Biotechnology, v. 45-6, p. 407-415.
Lee, K. J. D., S. E. Marcus, and J. P. Knox, 2011, Cell Wall Biology: Perspectives from Cell Wall Imaging:
Molecular Plant, v. 4, p. 212-219.
Lehmann, J., 2007, Bio-energy in the black: Frontiers in Ecology and the Environment, v. 5, p. 381387.
Leple, J. C., A. C. M. Brasileiro, M. F. Michel, F. Delmotte, and L. Jouanin, 1992, TRANSGENIC POPLARS
- EXPRESSION OF CHIMERIC GENES USING 4 DIFFERENT CONSTRUCTS: Plant Cell Reports, v.
11, p. 137-141.
Leple, J. C., R. Dauwe, K. Morreel, V. Storme, C. Lapierre, B. Pollet, A. Naumann, K. Y. Kang, H. Kim, K.
Ruel, A. Lefebvre, J. P. Joseleau, J. Grima-Pettenati, R. De Rycke, S. Andersson-Gunneras, A.
64
Erban, I. Fehrle, M. Petit-Conil, J. Kopka, A. Polle, E. Messens, B. Sundberg, S. D. Mansfield, J.
Ralph, G. Pilate, and W. Boerjan, 2007, Downregulation of cinnamoyl-coenzyme a reductase
in poplar: Multiple-level phenotyping reveals effects on cell wall polymer metabolism and
structure: Plant Cell, v. 19, p. 3669-3691.
Levasseur, A., E. Drula, V. Lombard, P. M. Coutinho, and B. Henrissat, 2013, Expansion of the
enzymatic repertoire of the CAZy database to integrate auxiliary redox enzymes:
Biotechnology for Biofuels, v. 6, p. 14.
Li, L. G., X. F. Cheng, S. F. Lu, T. Nakatsubo, T. Umezawa, and V. L. Chiang, 2005, Clarification of
cinnamoyl co-enzyme a reductase catalysis in monolignol biosynthesis of aspen: Plant and
Cell Physiology, v. 46, p. 1073-1082.
Li, L. G., J. L. Popko, T. Umezawa, and V. L. Chiang, 2000, 5-Hydroxyconiferyl aldehyde modulates
enzymatic methylation for syringyl monolignol formation, a new view of monolignol
biosynthesis in angiosperms: Journal of Biological Chemistry, v. 275, p. 6537-6545.
Mansfield, S. D., C. Mooney, and J. N. Saddler, 1999, Substrate and enzyme characteristics that limit
cellulose hydrolysis: Biotechnology Progress, v. 15, p. 804-816.
Mellerowicz, E. J., M. Baucher, B. Sundberg, and W. Boerjan, 2001, Unravelling cell wall formation in
the woody dicot stem: Plant Molecular Biology, v. 47, p. 239-274.
Merino, S. T., and J. Cherry, 2007, Progress and challenges in enzyme development for Biomass
utilization: Biofuels, v. 108, p. 95-120.
Miao, Y.-C., and C.-J. Liu, 2010, ATP-binding cassette-like transporters are involved in the transport of
lignin precursors across plasma and vacuolar membranes: Proceedings of the National
Academy of Sciences.
Min, D. Y., Q. Z. Li, H. Jameel, V. Chiang, and H. M. Chang, 2012, The Cellulase-Mediated
Saccharification on Wood Derived from Transgenic Low-Lignin Lines of Black Cottonwood
(Populus trichocarpa): Applied Biochemistry and Biotechnology, v. 168, p. 947-955.
Munoz, I. G., S. L. Mowbray, and J. Stahlberg, 2003, The catalytic module of Cel7D from
Phanerochaete chrysosporium as a chiral selector: structural studies of its complex with the
beta blocker (R)-propranolol: Acta Crystallographica Section D-Biological Crystallography, v.
59, p. 637-643.
Oka, D., K. Kobayashi, N. Isobe, Y. Ogawa, T. Yokoyama, S. Kimura, U.-J. Kim, K. Tokuyasu, and M.
Wada, 2013, Enzymatic hydrolysis of wood with alkaline treatment: Journal of Wood Science,
v. 59, p. 484-488.
Osullivan, A. C., 1997, Cellulose: the structure slowly unravels: Cellulose, v. 4, p. 173-207.
Park, S., J. O. Baker, M. E. Himmel, P. A. Parilla, and D. K. Johnson, 2010, Cellulose crystallinity index:
measurement techniques and their impact on interpreting cellulase performance:
Biotechnology for Biofuels, v. 3.
Pavlostathis, S. G., and J. M. Gossett, 1985, ALKALINE TREATMENT OF WHEAT STRAW FOR
INCREASING ANAEROBIC BIODEGRADABILITY: Biotechnology and Bioengineering, v. 27, p.
334-344.
Puri, V. P., 1984, EFFECT OF CRYSTALLINITY AND DEGREE OF POLYMERIZATION OF CELLULOSE ON
ENZYMATIC SACCHARIFICATION: Biotechnology and Bioengineering, v. 26, p. 1219-1222.
Ramos, L. P., M. M. Nazhad, and J. N. Saddler, 1993, EFFECT OF ENZYMATIC-HYDROLYSIS ON THE
MORPHOLOGY AND FINE-STRUCTURE OF PRETREATED CELLULOSIC RESIDUES: Enzyme and
Microbial Technology, v. 15, p. 821-831.
Rawat, R., B. K. Kumbhar, and L. Tewari, 2013, Optimization of alkali pretreatment for bioconversion
of poplar (Populus deltoides) biomass into fermentable sugars using response surface
methodology: Industrial Crops and Products, v. 44, p. 220-226.
Santoro, N., S. L. Cantu, C. E. Tornqvist, T. G. Falbel, J. L. Bolivar, S. E. Patterson, M. Pauly, and J. D.
Walton, 2010, A High-Throughput Platform for Screening Milligram Quantities of Plant
Biomass for Lignocellulose Digestibility: Bioenergy Research, v. 3, p. 93-102.
Sasaki, T., T. Tanaka, N. Nanbu, Y. Sato, and K. Kainuma, 1979, CORRELATION BETWEEN X-RAYDIFFRACTION MEASUREMENTS OF CELLULOSE CRYSTALLINE-STRUCTURE AND THE
65
SUSCEPTIBILITY TO MICROBIAL CELLULASE: Biotechnology and Bioengineering, v. 21, p. 10311042.
Schwanninger, M., J. C. Rodrigues, H. Pereira, and B. Hinterstoisser, 2004, Effects of short-time
vibratory ball milling on the shape of FT-IR spectra of wood and cellulose: Vibrational
Spectroscopy, v. 36, p. 23-40.
Silverstein, R. A., Y. Chen, R. R. Sharma-Shivappa, M. D. Boyette, and J. Osborne, 2007, A comparison
of chemical pretreatment methods for improving saccharification of cotton stalks:
Bioresource Technology, v. 98, p. 3000-3011.
SIXTA, H., HANDBOOK OF PULP, 2 VOLUMES, JOHN WILEY PROFESSIO.
SIXTA, H., 2006, HANDBOOK OF PULP, 2 VOLUMES, JOHN WILEY PROFESSIO.
Sluiter, A., B. Hames, R. Ruiz, C. Scarlata, and J. Sluiter, 2012, Determination of structural
carbohydrates and lignin in biomass. Laboratory Analytical Procedures (LAP), National
Renewable Energy Laboratory (NREL), Golden, CO. Revised version Jul 2011.
Sluiter, A., B. Hames, R. Ruiz, C. Scarlata, J. Sluiter, D. Templeton, and D. Crocker, 2008,
Determination of structural carbohydrates and lignin in biomass: Laboratory analytical
procedure.
Sluiter, A., R. Ruiz, C. Scarlata, J. Sluiter, and D. Templeton, 2005, Determination of extractives in
biomass: Laboratory Analytical Procedure (LAP), v. 1617.
Sluiter, J., and A. Sluiter, 2010, Summative mass closure: NREL, NREL/TP-510-48087, p. 1-10.
Sluiter, J. B., R. O. Ruiz, C. J. Scarlata, A. D. Sluiter, and D. W. Templeton, 2010, Compositional analysis
of lignocellulosic feedstocks. 1. Review and description of methods: Journal of agricultural
and food chemistry, v. 58, p. 9043-9053.
Stone, J. E., A. M. Scallan, E. Donefer, and E. Ahlgren, 1969, DIGESTIBILITY AS A SIMPLE FUNCTION OF
A MOLECULE OF SIMILAR SIZE TO A CELLULASE ENZYME: Advances in Chemistry Series, p.
219-&.
Sukumaran, R. K., R. R. Singhania, and A. Pandey, 2005, Microbial cellulases - Production, applications
and challenges: Journal of Scientific & Industrial Research, v. 64, p. 832-844.
Sun, Y., and J. Y. Cheng, 2002, Hydrolysis of lignocellulosic materials for ethanol production: a review:
Bioresource Technology, v. 83, p. 1-11.
Sun, Y., J. Zhuang, L. Lin, and P. Ouyang, 2009, Clean conversion of cellulose into fermentable
glucose: Biotechnology Advances, v. 27, p. 625-632.
Taherzadeh, M. J., and K. Karimi, 2008, Pretreatment of lignocellulosic wastes to improve ethanol
and biogas production: A review: International Journal of Molecular Sciences, v. 9, p. 16211651.
Tarkow, H., and W. C. Feist, 1969, A MECHANISM FOR IMPROVING DIGESTIBILITY OF
LIGNOCELLULOSIC MATERIALS WITH DILUTE ALKALI AND LIQUID AMMONIA: Advances in
Chemistry Series, p. 197-&.
Templeton, D. W., C. J. Scarlata, J. B. Sluiter, and E. J. Wolfrum, 2010, Compositional analysis of
lignocellulosic feedstocks. 2. Method uncertainties: Journal of agricultural and food
chemistry, v. 58, p. 9054-9062.
Thompson, D. N., H. C. Chen, and H. E. Grethlein, 1992, COMPARISON OF PRETREATMENT METHODS
ON THE BASIS OF AVAILABLE SURFACE-AREA: Bioresource Technology, v. 39, p. 155-163.
Ucar, G., and D. Fengel, 1988, CHARACTERIZATION OF THE ACID PRETREATMENT FOR THE
ENZYMATIC-HYDROLYSIS OF WOOD: Holzforschung, v. 42, p. 141-148.
Van Acker, R., J.-C. Leple, D. Aerts, V. Storme, G. Goeminne, B. Ivens, F. Legee, C. Lapierre, K. Piens,
M. C. E. Van Montagu, N. Santoro, C. E. Foster, J. Ralph, W. Soetaert, G. Pilate, and W.
Boerjan, 2014, Improved saccharification and ethanol yield from field-grown transgenic
poplar deficient in cinnamoyl-CoA reductase: Proceedings of the National Academy of
Sciences of the United States of America, v. 111, p. 845-850.
Vanholme, B., T. Desmet, F. Ronsse, K. Rabaey, F. Van Breusegem, M. De Mey, W. Soetaert, and W.
Boerjan, 2013, Towards a carbon-negative sustainable bio-based economy: Frontiers in Plant
Science, v. 4.
66
Vanholme, R., B. Demedts, K. Morreel, J. Ralph, and W. Boerjan, 2010, Lignin Biosynthesis and
Structure: Plant Physiology, v. 153, p. 895-905.
Vanholme, R., K. Morreel, C. Darrah, P. Oyarce, J. H. Grabber, J. Ralph, and W. Boerjan, 2012,
Metabolic engineering of novel lignin in biomass crops: New Phytologist, v. 196, p. 978-1000.
Vanholme, R., K. Morreel, J. Ralph, and W. Boerjan, 2008, Lignin engineering: Current Opinion in
Plant Biology, v. 11, p. 278-285.
Verardi, A., I. De Bari, E. Ricca, and V. Calabrò, 2012, Hydrolysis of Lignocellulosic Biomass: Current
Status of Processes and Technologies and Future Perspectives, in P. M. A. P. L. (Ed.), ed.
Vidal, B. C., B. S. Dien, K. C. Ting, and V. Singh, 2011, Influence of Feedstock Particle Size on
Lignocellulose Conversion-A Review: Applied Biochemistry and Biotechnology, v. 164, p.
1405-1421.
Voelker, S. L., B. Lachenbruch, F. C. Meinzer, M. Jourdes, C. Ki, A. M. Patten, L. B. Davin, N. G. Lewis,
G. A. Tuskan, L. Gunter, S. R. Decker, M. J. Selig, R. Sykes, M. E. Himmel, P. Kitin, O.
Shevchenko, and S. H. Strauss, 2010, Antisense Down-Regulation of 4CL Expression Alters
Lignification, Tree Growth, and Saccharification Potential of Field-Grown Poplar: Plant
Physiology, v. 154, p. 874-886.
Wada, M., M. Ike, and K. Tokuyasu, 2010, Enzymatic hydrolysis of cellulose I is greatly accelerated via
its conversion to the cellulose II hydrate form: Polymer Degradation and Stability, v. 95, p.
543-548.
Wan, C., Y. Zhou, and Y. Li, 2011, Liquid hot water and alkaline pretreatment of soybean straw for
improving cellulose digestibility: Bioresource Technology, v. 102, p. 6254-6259.
Wang, G. S., X. J. Pan, J. Y. Zhu, R. Gleisner, and D. Rockwood, 2009, Sulfite Pretreatment to
Overcome Recalcitrance of Lignocellulose (SPORL) for Robust Enzymatic Saccharification of
Hardwoods: Biotechnology Progress, v. 25, p. 1086-1093.
Wang, H. Z., Y. X. Xue, Y. J. Chen, R. F. Li, and J. H. Wei, 2012a, Lignin modification improves the
biofuel production potential in transgenic Populus tomentosa: Industrial Crops and Products,
v. 37, p. 170-177.
Wang, M. Y., K. Liu, L. Dai, J. Zhang, and X. Fang, 2013, The structural and biochemical basis for
cellulose biodegradation: Journal of Chemical Technology and Biotechnology, v. 88, p. 491500.
Wang, Z. J., J. Y. Zhu, R. S. Zalesny, Jr., and K. F. Chen, 2012b, Ethanol production from poplar wood
through enzymatic saccharification and fermentation by dilute acid and SPORL
pretreatments: Fuel, v. 95, p. 606-614.
Weitzhandler, M., V. Barreto, C. Pohl, P. Jandik, J. Cheng, and N. Avdalovic, 2004, CarboPac (TM)
PA20: a new monosaccharide separator column with electrochemical detection with
disposable gold electrodes: Journal of Biochemical and Biophysical Methods, v. 60, p. 309317.
Wilson, D. B., 2009, Cellulases and biofuels: Current Opinion in Biotechnology, v. 20, p. 295-299.
Wu, L., M. Arakane, M. Ike, M. Wada, T. Takai, M. Gau, and K. Tokuyasu, 2011, Low temperature
alkali pretreatment for improving enzymatic digestibility of sweet sorghum bagasse for
ethanol production: Bioresource Technology, v. 102, p. 4793-4799.
Wyman, C., 1996, Handbook on Bioethanol: Production and Utilization, Taylor & Francis.
Xiang, Q., Y. Y. Lee, P. O. Pettersson, and R. Torget, 2003, Heterogeneous aspects of acid hydrolysis of
alpha-cellulose: Applied Biochemistry and Biotechnology, v. 105, p. 505-514.
Zhang, Y. H. P., and L. R. Lynd, 2004, Toward an aggregated understanding of enzymatic hydrolysis of
cellulose: Noncomplexed cellulase systems: Biotechnology and Bioengineering, v. 88, p. 797824.
Zheng, Y., Z. Pan, and R. Zhang, 2009, Overview of biomass pretreatment for cellulosic ethanol
production: Int J Agric & Biol Eng 2(3): 51, v. 2.
Zugenmaier, P., 2001, Conformation and packing of various crystalline cellulose fibers: Progress in
Polymer Science, v. 26, p. 1341-1417.
67
10 . Bijlagen
10.1 Inleiding
Omdat de gemeten waarden steeds gebaseerd zijn op een steekproef van het geteste materiaal is
het gemeten gemiddelde van de steekproef niet gelijk aan het gemiddelde van de populatie. Er is
steeds een afwijking tussen het steekproef gemiddelde en populatie gemiddelde. Zonder statistiek is
er geen manier om te besluiten of één type behandeling beter is dan een andere groep.
Om te kijken of dat het saccharificatie potentieel en glucaanconversie hoger zijn gebruikt men in het
artikel van Van Acker et al. (2014) een tweezijdige Dunnett’s test waarbij p-waarden kleiner dan 0,05
als significant beschouwd worden. De Dunnett’s test is een test geschikt om K behandeling (2
transgene lijnen) te vergelijken met één controle lijn (wild type gegroeid in de zelfde
omstandigheden) (Kanji, 2006). Deze test is vergelijkbaar met de Student t-test, maar is een meer
algemene versie om meerdere behandelingen te vergelijken met één controle groep. Bij een
ongepaarde Student test wordt data van twee onafhankelijke groepen met elkaar vergeleken. In
deze thesis werd gebruik gemaakt van een Student-t test omdat bij de proef opzet slecht werd
uitgegaan van 2 lijnen: wilde lijn (controle) en transgene lijn. Bij elke test horen twee hypotheses:
Nulhypothese hypothese H0 : “Het sacharificatie potentieel van de wilde lijn is gelijk aan dat van de
transgene lijn”
Alternatieve hypothese H1 : “Het sacharificatie potentieel van de wilde lijn is verschillend met dat
van de transgene lijn”
In principe zou de alternatieve hypothese ook kunnen zijn: “Het sacharificatie potentieel van de
wilde lijn is lager dan dat van de transgene lijn”. Uit de data blijkt echter dat er ook experimenten zijn
waarbij de transgene lijn slechter scoort dan de wilde lijn.
In het artikel van Van Acker et al. (2014) werd gebruik gemaakt van een tweezijdige Dunnett’s test
waarbij p-waarden kleiner dan 0,05 als significant beschouwd werden. De Student t-test werd
uitgevoerd door tweezijdige te testen met een betrouwbaarheid van 0,95. De kans op een type 1
fout (onterecht verwerpen van H0 hypothese) is 0,05 procent.
Verder in deze bijlage worden de formules uitgelegd hoe het sacharificatiepotentieel en glucaan
omzetting bepaald werden. Daarnaast wordt ook uitgelegd hoe de t-test toegepast werd op deze
gegevens. Ten slotte worden verschillende tabellen gegeven waarin t-waardes berekend worden en
waar dus uit kan afgeleid worden ofdat er significante verschillen zijn tussen wild type en transgene
lijn.
68
10.2 Statistische verwerking van gegevens
EXP1
Sacharificatie
Mean St.Dev Var
n Pooled Var t Cal
WT-Fr 24h
7,23% 0,34% 0,0012% 3
FAS13-Fr 24h 6,26% 0,35% 0,0012% 3
0,000012 3,43
Hieronder wordt de variatie berekend.
Uit de varianties van de twee verschillende groepen kan dan een gepoolde variantie bepaald worden.
Hier mee wordt dan een t-waarde berekend die als dan niet kleinder is dat de kritische t-waarde. De
kritische t waarde is 2,776 voor vier vrijheid graden bij een twee zijdige onbetrouwbaarheid van 0,05
(Kanji, 2006).
|
|
√
√
|
√
|
√
Wanneer de kritische t-waarde kleiner is dan de berekende
dan wordt de H0 hypothese
verworpen. Wanneeer de kritische t-waarde groter is dan de berekende t waarde (
wordt de H0
hypothese aanvaard. Uit dit experiment blijkt dat de H0 hypothese wordt verworpen. Omdat de
gemiddelde sacharificatieopbrengst van de wilde lijn dus hoger is dan de transgene lijn wordt direct
het nut van tweezijdig testen duidelijk. Afwijking die op basis van de verwachting onlogisch lijken
(men verwacht dat wildtype slechter zou scoren) worden hiermee ook duidelijk.
In alle verdere experimenten wordt op de zelfde manier berekent of dat er een significant verschil is
tussen de twee waarden. In de volgende tabellezn zijn onderstreepte waarden zijn significant
verschillend.
69
10.3 Statistische data
10.3.1 Hydrolyse uitgevoerd door opschalen van de high-troughput experimenten
10.3.1.1 Franse lijnen
Saccharificatie
EXP1
Wi-Fr 24h
FAS13-Fr 24h
Saccharificatie
Mean St.Dev Var
n Pooled Var t Cal
7,23% 0,34% 0,0012% 3
6,26% 0,35% 0,0012% 3
0,000012 3,43
Wi-Fr 72h
11,13% 0,84% 0,0071% 3
FAS13-Fr 72h 10,29% 0,35% 0,0012% 3
0,000042 1,58
Tabel 9 Statistische verwerking experiment 1 sacharificatie Franse lijnen
EXP2
WT-Fr 24h
FAS13-Fr 24h
Saccharificatie
Mean St.Dev Var
n Pooled Var t Cal
9,37% 0,93% 0,0087% 3
8,50% 0,58% 0,0034% 3
0,000061 1,37
WT-Fr 72h
11,21% 0,64% 0,0041% 3
FAS13-Fr 72h 9,86% 0,53% 0,0028% 3
0,000034 2,81
Tabel 10 Statistische verwerking experiment 2 sacharificatie Franse lijnen
Glucaan omzetting
EXP1
Glucaan opbrengst
Mean St.Dev Var
n Pooled Var t Cal
WT-Fr 24h
18,78% 0,98% 0,010% 3
FAS13-Fr 24h 16,85% 1,03% 0,011% 3
0,00010 2,35
WT-Fr 72h
28,90% 2,28% 0,052% 3
FAS13-Fr 72h 27,69% 1,19% 0,014% 3
0,00033 0,81
Tabel 11 Statistische verwerking experiment 1 glucaan opbrengst Franse lijnen
EXP2
Glucaan opbrengst
Mean St.Dev Var
n Pooled Var t Cal
WT-Fr 24h
24,35% 2,49% 0,062% 3
FAS13-Fr 24h 22,87% 1,68% 0,028% 3
0,00045 0,85
WT-Fr 72h
29,11% 1,78% 0,032% 3
FAS13-Fr 72h 26,54% 1,57% 0,025% 3
0,00028 1,87
Tabel 12 Statistische verwerking experiment 2 glucaan opbrengst Franse lijnen
70
10.3.1.2 Belgische lijnen
Saccharificatie
Saccharificatie
Mean St.Dev Var
WT-Fr 24h
FAS13-Fr 24h
n Pooled Var t Cal
5,95% 1,38% 0,0190% 2
7,41% 0,97% 0,0095% 2
0,000142 1,22
WT-Fr 72h
8,00% 0,97% 0,0095% 2
FAS13-Fr 72h 10,75% 0,73% 0,0053% 2
0,000074 3,20
Tabel 13 Statistische verwerking sacharificatie Belgische lijnen
Glucaan opbrengst
Glucaan opbrengst (%)
Mean St.Dev Var
n Pooled Var t Cal
WT-Be 24h 11,67% 2,71% 0,073% 2
FS40-Be 24h 13,97% 1,84% 0,034% 2
0,00054 0,99
WT-Be 72h 15,68% 1,92% 0,037% 2
FS40-Be 72h 20,26% 1,38% 0,019% 2
0,00028 2,74
Tabel 14 Statistische verwerking glucaan opbrengst Belgische lijnen
Om een statistisch significant verschil te meten bij deze proef moet de berekende t-waarde groter
zijn dan 4,303. Bij deze proef was het aantal vrijheidsgraden gelijk aan 2 en niet 4 zoals bij alle
andere proeven (zie 10.2 voor berekening vrijheidsgraden). Hierdoor wordt bij dit experiment een
andere kritische t waarde gebruikt.
71
10.3.2 Hydrolyse uitgevoerd volgens de meer klassieke eigen opzet
10.3.2.1 Franse lijnen
Saccharificatie
FAS13-Fr
Saccharificatie
Mean
St.Dev Var
VB
EXP
FPU/g droge stof
Ca(OH)2
1
7
2
14
3
28
Na(OH)
4
7
5
14
6
28
H2SO4
7
7
8
14
9
28
Sporl
10
7
11
14
12
28
8,66%
10,14%
13,79%
10,62%
16,32%
19,00%
5,50%
6,28%
7,73%
12,17%
17,42%
21,29%
0,30%
0,24%
0,36%
0,75%
1,20%
1,01%
0,43%
0,40%
0,36%
0,50%
0,49%
0,62%
0,0009%
0,0006%
0,0013%
0,0057%
0,0144%
0,0102%
0,0019%
0,0016%
0,0013%
0,0025%
0,0024%
0,0039%
WT-Fr
Saccharificatie
Mean St.Dev Var
n
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
7,79%
11,43%
15,87%
11,01%
17,23%
19,70%
5,02%
5,95%
6,80%
12,02%
17,86%
23,67%
0,21%
1,06%
1,44%
0,27%
1,08%
0,67%
0,46%
0,23%
0,35%
0,98%
0,84%
0,84%
0,0004%
0,0112%
0,0207%
0,0007%
0,0116%
0,0045%
0,0022%
0,0005%
0,0012%
0,0097%
0,0071%
0,0071%
n
Pooled Var
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
0,0007%
0,0059%
0,0110%
0,0032%
0,0130%
0,0073%
0,0020%
0,0011%
0,0013%
0,0061%
0,0047%
0,0055%
t Cal
4,1496
2,07361
2,428197
0,860204
0,980797
1,007614
1,32046
1,216208
3,198374
0,235498
0,783225
3,92524
df
4
4
4
4
4
4
4
4
4
4
4
4
Tabel 15 Statistische verwerking saccharificatieopbrengst Franse stalen met klassieke opzet
72
10.3.2.2 Glucaanopbrengst
FAS13-Fr
glucaan opbrengst
Mean
St.Dev
VB
Ca(OH)2
Na(OH)
H2SO4
Sporl
EXP FPU/gDROGE STOF
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
7
14
28
7
14
28
7
14
28
7
14
28
23,31%
27,27%
37,09%
28,56%
43,90%
51,11%
14,80%
16,88%
20,79%
32,75%
46,88%
57,29%
1,01%
0,95%
1,37%
2,16%
3,42%
3,02%
1,22%
1,16%
1,12%
1,59%
1,78%
2,24%
Var
0,0102%
0,0091%
0,0187%
0,0466%
0,1168%
0,0909%
0,0150%
0,0136%
0,0125%
0,0254%
0,0317%
0,0500%
WT-Fr
glucaan opbrengst
n Mean
St.Dev
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
20,23%
29,70%
41,21%
28,60%
44,75%
51,17%
13,03%
15,46%
17,66%
31,22%
46,40%
61,48%
0,69%
2,82%
3,84%
0,93%
2,96%
2,07%
1,24%
0,68%
0,98%
2,64%
2,41%
2,57%
Var
0,0048%
0,0797%
0,1477%
0,0087%
0,0877%
0,0427%
0,0154%
0,0046%
0,0096%
0,0699%
0,0580%
0,0660%
m Pool.Var
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
0,0075%
0,0444%
0,0832%
0,0277%
0,1023%
0,0668%
0,0152%
0,0091%
0,0110%
0,0476%
0,0448%
0,0580%
t Cal
4,35
1,41
1,75
0,03
0,33
0,03
1,76
1,83
3,65
0,86
0,28
2,13
df
4
4
4
4
4
4
4
4
4
4
4
4
Tabel 16 Statistische verwerking van glucaanopbrengst Franse stalen met klassieke opzet
73
10.3.3 Sacharificatie Belgische lijnenen
10.3.3.1 Saccharificatie
FS40-Be
Saccharificatie
Mean
St.Dev
VB
Ca(OH)2
Na(OH)
H2SO4
EXP FPU/gDROGE STOF
1
7
2
14
3
28
4
7
5
14
6
28
7
7
8
14
9
28
27,33%
31,74%
35,74%
26,78%
33,43%
38,46%
13,04%
22,27%
18,83%
1,47%
4,21%
0,68%
1,91%
1,15%
2,07%
1,83%
3,76%
0,91%
Var
0,0215%
0,1772%
0,0046%
0,0363%
0,0133%
0,0428%
0,0334%
0,1413%
0,0083%
WT-Be
Saccharificatie
n Mean
St.Dev
3
3
3
3
3
3
3
3
3
19,15%
25,76%
30,12%
26,64%
32,26%
34,81%
14,49%
16,13%
18,87%
0,95%
1,16%
1,37%
2,40%
2,91%
2,45%
2,83%
1,05%
1,65%
Var
0,0091%
0,0134%
0,0188%
0,0578%
0,0849%
0,0603%
0,0800%
0,0111%
0,0272%
n Pooled Var
3
3
3
3
3
3
3
3
3
0,0153%
0,0953%
0,0117%
0,0470%
0,0491%
0,0515%
0,0567%
0,0762%
0,0178%
t Cal
8,089442
2,371811
6,37026
0,077268
0,645734
1,969977
0,745157
2,720609
0,041112
df
4
4
4
4
4
4
4
4
4
Tabel 17 Statistische verwerking saccharificatieopbrengst Belgische stalen met klassieke opzet
74
10.3.3.2 Glucaan omzetting
FS40-Be
glucaan opbrengst
Mean
St.Dev
VB
Ca(OH)2
Na(OH)
H2SO4
EXP
WT-Be
Var
n Mean
St.Dev
Var
m Pool.Var
t Cal
df
FPU/g DROGE STOF
1
2
3
4
5
6
7
8
9
7
14
28
7
14
28
7
14
28
51,52%
59,84%
67,38%
50,48%
63,03%
72,50%
24,58%
41,98%
35,49%
2,81%
7,95%
1,41%
3,62%
2,25%
3,95%
3,45%
7,10%
1,75%
0,0787%
0,6328%
0,0200%
0,1312%
0,0505%
0,1563%
0,1193%
0,5036%
0,0306%
3
3
3
3
3
3
3
3
3
37,56%
50,52%
59,05%
52,23%
63,26%
68,25%
28,40%
31,63%
37,00%
1,95%
2,39%
2,83%
4,78%
5,79%
4,92%
5,56%
2,12%
3,28%
0,0380%
0,0572%
0,0799%
0,2281%
0,3350%
0,2419%
0,3093%
0,0450%
0,1076%
3
3
3
3
3
3
3
3
3
0,0583%
0,3450%
0,0500%
0,1796%
0,1928%
0,1991%
0,2143%
0,2743%
0,0691%
7,08
1,94
4,56
0,51
0,07
1,17
1,01
2,42
0,70
4
4
4
4
4
4
4
4
4
Tabel 18 Statistische verwerking glucaanopbrengst Belgische stalen met klassieke opzet
75
76

EPSON STYLUS DX5000/CX4900

Alex van der Zwart, Hogeschool Inhollland Delft, Centre of Expertise

Uniek Proces zet Biomassa om in BioFuel

GA NAAR PAROOL.NL/WINEENFIETS

Klimatologische invloeden op diverse poederlaksystemen

het conserveringstraject

Two Team Project in FD

Shape - Beyuna

de potentie voor duurzame energie

Grote kadavers in het bos. Han ten Seldam.