PowerPoint プレゼンテーション

関節リウマチ関連遺伝子 PADI4 と
シトルリン・抗シトルリン化ペプチド抗体
~最近の話題~
平成18年3月23日
東京女子医科大学附属
膠原病リウマチ痛風センター
京都大学大学院医学研究科附属ゲノム医学センター
理化学研究所遺伝子多型研究センター 関節リウマチ関連遺伝子研究チーム
山田 亮
項目
1. シトルリン・PADI・抗シトルリン化ペプチド抗体
に関する基礎事項
2. 遺伝子
1. アレル差解析(関連解析)
3. PADI・シトルリン・シトルリン化
1.
2.
3.
4.
発現解析
酵素特性解析
基質解析
シトルリン化タンパク質解析
4. PADI・シトルリン化タンパクの病理
1. 関節リウマチ
2. その他の疾患
5. 動物モデル
?
遺伝子アレル差解析
?
発現解析
?
酵素特性解析
?
基質解析
?
シトルリン化タンパク質解析
?
シトルリン化タンパク質と
自己免疫反応関係の解析
?
抗シトルリン化ペプチド抗体解析
?
抗シトルリン化ペプチド抗体と関節炎・関
節リウマチとの因果関係
?
動物モデル解析
?
項目
1. シトルリン・PADI・抗シトルリン化ペプチド抗体
に関する基礎事項オーバービュー
2. 遺伝子
1. アレル差解析(関連解析)
3. PADI・シトルリン・シトルリン化
1.
2.
3.
4.
発現解析
酵素特性解析
基質解析
シトルリン化タンパク質解析
4. PADI・シトルリン化タンパクの病理
1. 関節リウマチ
2. その他の疾患
5. 動物モデルの視点からのサマリー
フリーアミノ酸としての
出納と代謝
アルギニン
シトルリン
アミノ酸代謝
NOS、NO産生
尿素サイクル
コーディングアミノ酸 : 20種
必須アミノ酸 :
ヒト9種 (+準必須アミノ酸 3 種(Arg,His,Tyr))
ラット10種(ヒト+アルギニン)
シトルリン
対応tRNAなし
非コーディングアミノ酸
ペプチジルシトルリン化
とその代謝サイクル
遊離アミノ酸
抗原提示
ペプチド化
分解と抗原処理
?
PADI基質
シトルリン化タンパク
?
アミノ酸の翻訳後修飾としてのシトルリン化
• リン酸化
• メチル化
• 水酸化
• アセチル化
• カルボキシル化
• シトルリン化
• グリコシル化
分子内反応関連
周辺残基影響
残基特異性
翻訳後修飾間相互作用
メチル化・アセチル化・シトルリン化
翻訳後修飾間関連
メチル
メチル化・シトル
リン化相互作用
メチルメチル
項目
1. シトルリン・PADI・抗シトルリン化ペプチド抗体
に関する基礎事項オーバービュー
2. 遺伝子
1. アレル差解析(関連解析)
3. PADI・シトルリン・シトルリン化
1.
2.
3.
4.
発現解析
酵素特性解析
基質解析
シトルリン化タンパク質解析
4. PADI・シトルリン化タンパクの病理
1. 関節リウマチ
2. その他の疾患
5. 動物モデルの視点からのサマリー
遺伝子アレル差解析
?
Korean
PADI4 gene structure and association-positive SNPs
EXONs
exons
1
2
3
4
5
6
78
9
10
11 1213 1415
SNPs
SNPs
Caucasians
Japanese
16
K562細胞におけるmRNA安定性解析
Vector : pcDNA-DEST40
CMV promoter
PADI4 (susceptible and non susceptible type cDNA)
5’UTR 25bp
3’ UTR 218bp
Ratio of gradiation (%)
実験方法
K562細胞にTransfectionし、48時間培養後、 5ug/ml actinomycin D処理 し、RNAを回収、
TaqMan assayによりPADI4 RNA量を測定する。18S rRNA (細胞数), Neomycin遺伝子
(transfection効率)を用いて補正を行った。
S: susceptible type
N: non-susceptible type
100
*
50
* p<0.05 (t-test)
S
N
0h
S
N
2h
S
N
4h
PADI4におけるRA関連ハプロタイプと非関連ハプロタイプ
のアレル別発現量比較
Standard curve
-2.00
-1.50
-1.00
0.00
-0.50 -0.50 0.00
0.50
1.00
1.50
2.00
2.50
-1.50
-2.00
-2.50
-3.00
-3.50
-4.00
y = 0.7775x - 3.1847
R2 = 0.9894
-4.50
サンプルDNA, cDNA:
PADI4遺伝子上padi4_89 (A/G)をヘテロ接合体でもつ健常人4
人の末梢血リンパ球から精製したgenomic DNAとRNA
Probe:
Padi4_89 (A/G) genotyping用TaqMan probe
-5.00
Log2G/A
1.6
1.4
1.2
Ratio of G: A alleles
Log2VIC/FAM
-1.00
1
cDNA
genomic DNA
0.8
0.6
0.4
0.2
0
Normal 1
Normal 2
Normal 3
Normal 4
Ave. genomic DNA: 0.99
Ave. cDNA (4samples): 1.26
RA関連ハプロタイプは非関連ハプロタイプと比較して、ゲノムの場合は1なのに対し
て、cDNAでは平均1.3となっている。
アレル差解析 まとめ
• PADI4多型とRA発病リスクは
– アジアン>コーカシアン
• 発病リスク多型は
– コーディングSNPs / イントロンSNPs
項目
1. シトルリン・PADI・抗シトルリン化ペプチド抗体
に関する基礎事項オーバービュー
2. 遺伝子
1. アレル差解析(関連解析)
3. PADI・シトルリン・シトルリン化
1.
2.
3.
4.
発現解析
酵素特性解析
基質解析
シトルリン化タンパク質解析
4. PADI・シトルリン化タンパクの病理
1. 関節リウマチ
2. その他の疾患
5. 動物モデルの視点からのサマリー
PADI酵素反応
• 発現・局在レベルの特異性
– 発現している臓器・組織・細胞内外・細胞内部
位による特異性
•
•
•
•
反応環境による特異性(Ca2+など)
基質特異性
残基特異性
残基修飾状態特異性
PADIアイソザイム
種間保存
?生理的役割分担?
発現特異性
PADIアイソザイムの臓器・組織・細胞分布
脳 肝 腎 肺
PADI1 ●
●
PADI2 ●
●
PADI3
PADI4 ●
●
PADI6
脳 肝 腎 肺
虚血性脳変性
多発性硬化症
Apoptosis
->MBP
cit-MBP:
チャージの喪
失=タンパク分
解を受けやす
くなる
消化管
●
●
消化管
脾 胸腺 骨髄 血球 心
●
●
●
●
●
●
●
●
●
脾 胸腺 骨髄 血球 心
骨格筋
●
●
●
骨格筋
皮膚 毛嚢 子宮 卵巣 胎盤 胎児 滑膜
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
皮膚 毛嚢 子宮 卵巣 胎盤 胎児 滑膜
表皮形成時
(アポトーシス)
KeratinFillaghrinとそ
の重合
in Vitro
マクロファージ
Caionophoreinduced アポ
トーシス
Vimentin
炎症滑膜
Fibrin
PADI1
PADI2
PADI3
PADI4
PADI6
核内発現
Histones
Sm
いずれも、核
内メチル化基
質
[Ca 2+]~10-3M
反応環境特異性
[Ca 2+]~10-7M
[Ca 2+]による
PADI活性制御
細胞外・細胞内
核外・核内
Nakayama HM, Suzuki A, Yamamoto K et
al. BBRC 327; 192-200:2005
発現・活性化調節
monocytes and macrophages
Macrophage
Monocyte
Transcriptional
regulation
DNA
RNA
PADI4
Enzyme
DNA
RNA
Enzyme
Enzymeactivational
regulation
Translational
regulation
PADI2
ER Vossenaar WJ vanVenrooij LAB
Joosten et al. Arthritis & Rheum 2004
基質特異性
Nakayama HM, Suzuki A, Yamamoto K et al.
BBRC 327; 192-200:2005
残基特異性
Nakayama HM, Suzuki A, Yamamoto K et al.
BBRC 327; 192-200:2005
Nature Structural & Molecular Biology 11, 777 - 783
(2004)
Published online: 11 July 2004; |
doi:10.1038/nsmb799
残基修飾状態特異性
メチル
a-ジメチルArg
メチル
メチル
メチル
メチル
モノメチルArg
s-ジメチルArg
メチル
メチル
メチル
メチル
メチルメチル
メチル
メチル
?PADIの生理機能?
翻訳後修飾
リン酸化、グリコシル化、アセチル化、ヒドロキル化、シトルリン化
両方向性反応・逆方向酵素ペア
修飾のON・OFF機能
リン酸化
アセチル化
メチル化
キナーゼ⇔フォスファターゼ
アセチラーゼ⇔デアセチラーゼ
PRMT⇔?デイミナーゼ?
ヒストンのメチル化・シトルリン化の場合
Arg と メチルArg はシトルリン化される
ジメチルArg はシトルリン化されない
翻訳後修飾間関連
メチル
メチル化・シトルリ
ン化相互作用
メチル メチル
少なくとも単純なON-OFF機構ではない
?シトルリン→アルギニン酵素の存在の有無?
シトルリン化ヒストンのサルベージ(仮説)
メチル化とシトルリン化が知られる基質
Histone
Sm (Small nuclear ribonucleoproteins)
Autoantigen
その他基質
• Fibrinogenと重合性
• ATIIIとその活性
• Myelin Basic Protein(MBP)と脱髄
ATIII was inactivated by
citrullination and
citrullinated fraction of
ATIII was higher in RA
plasma.
Chang X, Yamada R, Yamamot K et al.
Rheumatology 44:238-9;2005
Fibrinogen citrullination
inhibits thrombincatalyzed fibrin
polymerization.
Nakayama HM, Suzuki A, Yamamoto K
et al.
MBPシトルリン化、シトルリン化残基
特性についても知見あり(1970年代
より2005年まで)
遊離アミノ酸・ペプチド・PADI酵素の細胞・細胞内器官別分布の解析
生理的処理
アポトーシスを含めて?
抗原提示細胞によ
る処理を経て自己
免疫反応成立の可
能性?
存在・局在確認のためのシトルリン・PADIの解析抗体など
抗シトルリン
抗体
基質
遊離シトルリン
抗MC抗体
(Senshu)
RA3抗体
RA患者自
己抗体
比色法
抗PADI4抗
体
vitro,組 免染、ウェス
織
タン
人工基質シトルリン化物
vitro
OD測定
ペプチジルシトルリン
組織
免染
ELISA, 免染,
ウェスタン
ELISA
OD測定
シトルリン含有タンパク
組織
免染
ELISA, 免染, 免染、ウェ
ウェスタン
スタン
ELISA
OD測定
PADI4
組織
RA3抗体はRA患者のB細胞を取ってきて、scFv(抗
体の可変領域)をファージベクターに組み込みます。
ファージの表面に発現したscFvは抗体の種類だけ存
在していることになり、RA患者由来のライブラリでは
自己抗体もクローニングされます。ただし、その抗体
の抗原が特定のタンパクのみを認識しているかどう
かは不明であり、そのほかの様々なタンパクとクロス
リアクションしている可能性が実験的にも示唆されて
います。
免染、ウェ
スタン
項目
1. シトルリン・PADI・抗シトルリン化ペプチド抗体
に関する基礎事項オーバービュー
2. 遺伝子
1. アレル差解析(関連解析)
3. PADI・シトルリン・シトルリン化
1.
2.
3.
4.
発現解析
酵素特性解析
基質解析
シトルリン化タンパク質解析
4. PADI・シトルリン化タンパクの病理
1. 関節リウマチ
2. その他の疾患
5. 動物モデルの視点からのサマリー
RA滑膜シトルリン化蛋白の存在
抗CCP抗体の局所産生
抗CCP抗体の特異性
破壊性亜型との関連
抗CCP抗体の発病前出現
~9年
発病予測性
非RA(OA・Reactive arthritis)での
シトルリン化蛋白の存在
抗CCP抗体産生B細胞の局所存在
HLA・TCR
と
シトルリン化ペプチドの関係
Augmentation of T-cell response
by citrullinated peptides
J.Hill E Cairns et al.
J Immunol 2003
Shared epitope
塩基性アミノ酸による
ペプチド認識フロア形成
HLA-SE
aCCP(+)
?
Multi-hit model
CCP(+)-RA
CCP(-)-RA
シトルリン化エピトープ探索
3. What are Substrates of PADI4 and Epitopes of anti-CCP Ab?
Immunoscreening of citrullinated epitopes of RA autoantibodies
Yamanaka OM, Suzuki A, Yamamoto K et al. 2005
Identification of citrullinated
eukaryotic translation initiation factor
4G1 as novel autoantigen in
rheumatoid arthritis
Okazaki Y, Suzuki A, Yamamoto K et al. BBRC 341;94-100 (2006)
Anti-citrullinated collagen
type I antibody is a target of
autoimmunity in rheumatoid
arthritis
Suzuki A, Yamada R, Yamamoto K et al. BBRC 341;94-100 (2006)
シトルリン化自己抗原
シトルリン化寛容抗原
• cit’d Fib
• cit’d Fillagrin
• cit'd Fib
• cit'd Fillagrin
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
anti-Sa
anti-perinuclear
cit'ed CI
cit'ed CII
Eukaryotic elongation Factor
cit’d alpha Enolase
anti-Sa ?
anti-perinuclear ?
cit'ed CI ?
cit'ed CII ?
Eukaryotic elongation Factor ?
cit’d alpha Enolase ?
Hisrone ?
Sm ?
MBP ?
項目
1. シトルリン・PADI・抗シトルリン化ペプチド抗体
に関する基礎事項オーバービュー
2. 遺伝子
1. アレル差解析(関連解析)
3. PADI・シトルリン・シトルリン化
1.
2.
3.
4.
発現解析
酵素特性解析
基質解析
シトルリン化タンパク質解析
4. PADI・シトルリン化タンパクの病理
1. 関節リウマチ
2. その他の疾患
5. 動物モデルの視点からのサマリー
CIAでシトルリン化蛋白
細胞核内・核外
~PADI2・4分布と相関?
Streptococcal cell wall-inducedで
シトルリン化蛋白
シトルリン化Fibrin
その他
抗シトルリン化ペプチド抗体が
産生されがたい・・・?
シトルリン化抗原による感作増強?
CIAラット
Center for Genomic Medicine, Kyoto University,
Kyoto, Japan
– Fumihiko Matsuda
– Shohei Chida
– Alexandre Vasilescu
– Hitomi Hiratani
– Sachiko Toyoda
– Justine Yovo-Vasilescu
– Chanavee Ratanajaraya
– Miki Kokubo
– Kenei Ohigashi
– Victor Renault
– Masao Yamaguchi
– Katsura Hirosawa
•
SNP Research Center, RIKEN,
Yokohama, Japan
– Lab. for Rheumatic DIseases
• Kazuhiko Yamamoto
• Akari Suzuki
• Yuta Kochi
• Mikako Mori
• Kyoko Kobayashi
• Miyako Yamanaka
• Emi Kanno
• Keiko Myouzen
– Akihiro Sekine
– Tatsuhiko Tsunoda
– Yusuke Nakamura
•
Clinical Institutes of Collaboration
–
University of Tokyo Hospitals
•
–
Tetsuji Sawada
National Sagamihara Hospital
•
•
Shigeto Tohma
Toshihiro Matsui