天然物質の取扱い 天然物の単離 天然材料・・・植物，微生物，海洋生物 抽出・・・溶媒抽出，樹脂吸着，イオン交換 精製・・・クロマトグラフィー，結晶化 構造決定・・・NMR，MS，X線 天然成分の抽出 溶媒抽出 有機化合物が親和性の高い溶媒に溶解するという性質を利用し， 試料に溶媒を添加し，目的成分が溶解した溶液を分離する方法 培養液 水不混和性有機溶媒により抽出 使用する有機溶媒と水との分配係数にしたがって分配 クロロホルム，酢酸エチル，ジエチルエーテル，ブタノールなど 生体・・・多量の水を含む 水混和性溶媒または水により抽出 アセトン，エタノール，メタノール，水（熱水），アルカリ水など 生体乾燥物 目的成分を溶解する溶媒により抽出 あらゆる種類の溶媒が使用可能 吸着と溶離（溶出） 水溶液中の有機化合物・・・疎水性相互作用 ポリスチレン系樹脂（HP-20など）・・・再使用可能 吸着力弱，芳香族化合物を吸着しやすい 溶出溶媒・・・メタノール水，メタノール，アセトン水，アルカリーアセトン オクタデシルシリカ（ODS）・・・再使用可能 吸着力弱 溶出溶媒・・・メタノール水，メタノール 活性炭 吸着力強，芳香族化合物を吸着しやすい 溶出溶媒・・・アセトン水，アルカリーアセトン 非極性有機溶媒中の化合物・・・親水性相互作用 シリカゲル，（アルミナ） ヘキサン，クロロホルム，酢酸エチル，アセトン，メタノール（混合溶媒） イオン交換 強酸性陽イオン交換樹脂・・・塩基性物質，両性物質 交換基：スルホン酸（Dowex 50など）・・・酸により活性化（H+型） 溶出液・・・アンモニア水 弱酸性陽イオン交換樹脂・・・強塩基性物質 交換基：カルボン酸・・・解離平衡があるのでNa+型でも使用可 溶出液・・・アンモニア水，塩酸水 強塩基性陰イオン交換樹脂・・・酸性物質，両性物質 交換基：４級アンモニウム（Dowex 1など）・・・塩基により活性化（OH-型） 溶出液・・・塩酸水 弱塩基性陰イオン交換樹脂・・・強酸性物質 交換基：３級アミン・・・解離平衡があるのでCl-型でも使用可 溶出液・・・塩酸水，アンモニア水 天然物の精製 分配 不混和性の２種の溶媒中では，溶質は上層と下層に分配される。 十分に低濃度の領域では，両溶媒層における溶質の濃度比は 一定温度において一定である（分配律） 分配係数 P = 有機溶媒層の溶質濃度 / 水層の溶質濃度 天然抽出物 酢酸エチル－水で分配 酢酸エチル層 水層 ブタノール－水で分配 ブタノール層 水層 ヘキサン / 90%メタノール 水/ クロロホルム・メタノール（10：1） 分配クロマトグラフィー 吸着剤に固定相（水など）を吸着させ，これと展開溶媒との間の分配を 連続的に行わせることにより，溶質を分離するクロマトグラフィー 順相系 固定相保持担体（吸着剤）：シリカゲル，セルロース，デキストラン 展開溶媒： ブタノール／酢酸／水 ブタノール／メタノール／水 ブタノール／メタノール／緩衝液 酢酸エチル／水 逆相系 固定相保持担体（吸着剤）：ODS，ポリスチレン系樹脂 展開溶媒： アセトニトリル or メタノール／水 アセトニトリル or メタノール／トリフルオロ酢酸／水 アセトニトリル or メタノール／緩衝液 ・吸着クロマトグラフィーと比較して，多量の試料処理は困難である 遠心分配クロマトグラフィー（CPC） 遠心機ローターのセル中に固定相（上層または下層）を遠心力によって 保持し，移動相（下層または上層）を液滴としてセル内を通過させることに により分配を行うクロマトグラフィー 遠心力 液滴 （上層） 遠心分配クロマトグラフィー（CPC） 遠心機ローターのセル中に固定相（上層または下層）を遠心力によって 保持し，移動相（下層または上層）を液滴としてセル内を通過させることに により分配を行うクロマトグラフィー 遠心力 液滴 （下層） 吸着クロマトグラフィー 吸着剤と展開溶媒との間の吸着・溶離平衡を利用し，化合物を分離する クロマトグラフィー 極性吸着剤・・・シリカゲル，（アルミナ） 展開溶媒： ヘキサン／酢酸エチル クロロホルム／メタノール 非極性吸着剤・・・活性炭 展開溶媒： アセトン／水 アセトン／アンモニア水 アセトン／緩衝液 ・分配クロマトグラフィーとの明確な区別は困難であることが多い ・非可逆的吸着による分離障害がおこりうる 薄層クロマトグラフィー（TLC） 毛細管現象により浸透・上昇する溶媒を利用し，分配または吸着・溶離 平衡により試料を分離するクロマトグラフィー 順相系・・・シリカゲル，（アルミナ） 展開溶媒： ヘキサン／酢酸エチル クロロホルム／メタノール ブタノール／酢酸／水 逆相系・・・ODS 展開溶媒： メタノール／水 メタノール／トリフルオロ酢酸／水 メタノール／緩衝液 ・カラムクロマトグラフィーより分離が優れている ・精製に用いる場合は担体をかきとり，目的物を抽出する ・カラムクロマトグラフィーと比較して，多量の試料処理は困難である 高速液体クロマトグラフィー（HPLC） 高密度の担体を充填した金属カラムを用い，高圧で展開溶媒を流すこと により，高い分離能を実現したクロマトグラフィー クロマトグラフィーの障害・・・担体間の空隙における試料の拡散 細粒化した球状の担体を高密度で充填 空隙体積の減少 → 試料拡散の減少，流速の減少 逆相系・・・ODS 展開溶媒： アセトニトリル or メタノール／水 アセトニトリル or メタノール／トリフルオロ酢酸／水 アセトニトリル or メタノール／緩衝液 順相系・・・シリカゲル 展開溶媒： ヘキサン／2-プロパノール ・ODSカラムは繰り返し使用可能である ・シリカゲルカラムは劣化しやすい 天然物精製における化合物の検出 非破壊的な方法で検出する必要がある カラムクロマトグラフィー（フラクションコレクター利用） UV（254 nm）・・・UV吸収のない化合物は検出できない 一部とって，発色法で検出（TLC上の硫酸発色など） TLC UV（254 nm）・・・UV吸収のない化合物は検出できない 疎水性化合物は水発色 細長い短冊状に切り取り，発色剤により発色 HPLC・・・検出装置を連結 UV（254 nm）・・・UV吸収のない化合物は検出できない UV（220 nm）・・・アミド結合のUV吸収を検出できる 使用溶媒限定 UV（195 nm）・・・ほぼすべての有機化合物を検出できる 示差屈折計（RI）・・・ほぼすべての有機化合物を検出できる，やや低感度 ツルアリインゲン完熟種子粉砕物（100 kg） メタノール抽出，濃縮 酢酸エチル抽出（pH 7） 酢酸エチル層 酢酸エチル層 水層 酢酸エチル抽出（pH 2.5） 水層 シリカゲルクロマトグラフィー ベンゼン／酢酸エチル（55：45～60：40） O 活性炭クロマトグラフィー H アセトン／水（1：1） CO Sephadex G-50分配クロマトグラフィー HO H 1 M リン酸緩衝液（pH 5.4） CH3 COOH ベンゼン／ブタノール（95：5～93：7） シリカゲルTLC クロロホルム／酢酸エチル／酢酸（8：20：1） ジベレリンA1（10 mg） OH Streptomyces ribosidicus培養濾液 pH 7に調整 弱酸性陽イオン交換樹脂（NH4+型） 0.5 M アンモニア水 濃縮，pH 7に調整 弱酸性陽イオン交換樹脂（NH4+型） 0.2 M アンモニア水 濃縮 OH H2N H2N HO HO NH2 O O O 強塩基性陰イオン交換樹脂（OH-型） 水 凍結乾燥 メタノールから再結晶 リボスタマイシン結晶 OH OH OH O NH2 Coleophoma empetri培養物（20 L） アセトン添加，濾過，濃縮 酢酸エチル抽出 酢酸エチル層 ブタノール層 水層 ブタノール抽出 水層 OH O HO OH H H N H2N H N O H3C シリカゲルクロマトグラフィー ジクロロメタン／メタノール（3：1～1：1） ODS逆相クロマトグラフィー 50%メタノール洗浄 80%メタノール溶出 遠心分配クロマトグラフィー ブタノール／メタノール／水（4：1：5） シリカゲルクロマトグラフィー ブタノール／酢酸／水（6：1：1） WF11899A（11 mg） O O HO H NH O O O HN HO O CH3 HO H OH N H NH OH H NH O OH CH3 SO3Na 天然物の構造決定 1805年 1925年 1928年 1945年 モルヒネの発見 モルヒネの構造決定 ペニシリンの発見 ペニシリンの構造決定 120年 17年 機器分析による構造決定 NMR (nuclear magnetic resonance) 原子核（特に水素と炭素）の近傍の構造，原子のつながり方 MS (mass spectrometry) 分子およびフラグメントイオンの質量（分子量） IR (infrared) 官能基の確認 UV (ultraviolet) 二重結合の共役状態，化合物の同定 X線 (X-ray) 結晶解析 立体構造決定 バイオ医薬 バイオテクノロジーによる医薬品の開発 インスリン・・・糖尿病治療薬 ～1980年代 ブタインスリンを利用 高価 B鎖C末端 ヒト Thr30 → Ala30 ブタ 197９年 ヒトインスリン遺伝子の解明 1980年 Herbert Boyer （Genentech社創設） 組換え大腸菌によるヒトインスリンの生産 1987年 組換え酵母によるヒトインスリンの生産 遺伝子組換え技術によるヒトインスリンの生産 １．A鎖遺伝子組換え大腸菌，B鎖遺伝子組換え大腸菌 両鎖を別々に生産，可溶化 → ジスルフィド結合形成 ２．プロインスリン（B鎖-C鎖-A鎖）遺伝子組換え大腸菌 生産，可溶化 → ジスルフィド結合形成 → トリプシン＋カルボキシペプチダーゼBによる切断 ３．B鎖・A鎖の融合タンパク遺伝子組換え酵母 ジスルフィド体の分泌生産 → トリプシンによる切断 組換え技術により生産されるペプチドホルモン医薬 ペプチドホルモン 対象疾患 製造法 インスリン 糖尿病 大腸菌・酵母 成長ホルモン 小人症 大腸菌 心房性ナトリウム利尿ペプチド 急性心不全 大腸菌 グルカゴン 低血糖症 酵母 組換え技術により生産される酵素医薬 酵素 適用 製造法 t-PA 血栓溶解 動物細胞 血液凝固第Ⅶ因子 血友病 動物細胞 血液凝固第Ⅷ因子 血友病 動物細胞 組換え医薬生産に用いられる宿主 宿主 分泌生産 糖鎖 大腸菌 困難 なし 枯草菌 可能 なし パン酵母 可能 酵母型 CHO細胞 可能 ヒト型 組換え医薬生産に用いられるベクター ベクター・・・目的遺伝子の運び手 ・宿主細胞内で安定に複製する ・適当な制限酵素切断点を有する ・薬剤耐性などのマーカーを有する 大腸菌 pBR322系プラスミド 酵母 シャトルベクター（pBR322−酵母ars1） 動物細胞 レトロウイルス（pBR322−MMLV） 組換え技術により生産されるワクチン B型肝炎ウイルス粒子 HBsAg（表面抗原）・・・感染防御抗原 HBcAg（コア抗原） DNAポリメラーゼ DNA結合タンパク質 Xタンパク質 組換えHBsAgを酵母で生産（糖鎖なし） B型肝炎ウイルスワクチン 組換え技術により生産されるワクチン ヒトパピローマウイルス（16，18型） L1タンパク質（カプソメア形成）・・・感染防御抗原 組換えイラクサギンウワバ（昆虫）細胞により製造 ヒトパピローマウイルス（16，18，6，11型） L1タンパク質（カプソメア形成）・・・感染防御抗原 組換え酵母により製造 組換え技術により生産されるサイトカイン類 医薬 サイトカイン インターフェロンα インターフェロンγ インターロイキン２ サイトカイン受容体 可溶性TNF受容体 （エタネルセプト） 増殖因子 エリスロポエチン G-CSF 対象疾患 製造法 B型肝炎，C型肝炎，がん がん がん 大腸菌 大腸菌 大腸菌 関節リウマチ 動物細胞 貧血 白血球減少 動物細胞 大腸菌 組換え技術により生産される抗体医薬 医薬 抗体 対象疾患 製造法 トラスツズマブ（ハーセプチン） 抗HER2抗体 乳がん，胃がん 動物細胞 リツキシマブ（リツキサン） 抗CD20抗体 悪性リンパ腫 動物細胞 ベバシズマブ（アバスチン） 抗VEGF抗体 結腸・直腸がん 動物細胞 セツキシマブ 抗EGF受容体抗体 結腸・直腸がん 動物細胞 パニツムマブ 抗EGF受容体抗体 結腸・直腸がん 動物細胞 バシリキシマブ 抗CD25抗体 腎移植 動物細胞 インフリキシマブ 抗TNF-α抗体 関節リウマチ 動物細胞 アダリムマブ 抗TNF-α抗体 関節リウマチ 動物細胞 ゴリムマブ 抗TNF-α抗体 関節リウマチ 動物細胞 パリビズマブ 抗RSウイルス抗体 RSV気道感染症 動物細胞 トシリズマブ 抗IL6受容体抗体 関節リウマチ 動物細胞 バイオ医薬の売上げ（2008年度，億円） エポエチン ベータ 腎性貧血治療薬 増殖因子 450 エポエチン アルファ 腎性貧血治療薬 増殖因子 440 インフリキシマブ 抗リウマチ薬 抗体 370 エタネルセプト 抗リウマチ薬 サイトカイン受容体 260 トラスツズマブ 抗悪性腫瘍薬 抗体 240 リツキシマブ 抗悪性腫瘍薬 抗体 210 ベバシズマブ 抗悪性腫瘍薬 抗体 200 インスリン 糖尿病治療薬 ペプチドホルモン 150 レノグラスチム 好中球減少症治療薬 増殖因子 120 バイオ医薬品の国内市場規模 （富士経済，2009年以降は予測） 億円 7000 6000 5000 4000 3000 2000 1000 0 2007 08 09 10 11 12 13 14 15 16 17 年
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