Instructivo para el procesamiento de muestras del área de Microbiología
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Código: I-FQUI-LAC-07
Revisión: 11
Fecha de emisión: 5/Enero/2009
Fecha de modificación:25/03/2015
1.-OBJETIVO
Analizar muestras biológicas para análisis microbiológicos en las condiciones adecuadas para su
procesamiento analítico.
2.- ALCANCE
Aplica a todas las muestras biológicas para análisis microbiológicos, según la orden médica de los
usuarios que acuden al Laboratorio de Análisis Clínicos de la Facultad de Química, San José Tecoh,
Coordinación General de Salud y módulo Fénix.
3.- DESCRIPCIÓN DE LA OPERACIÓN
Es importante el uso de guantes, bata, cubrebocas y lentes de seguridad en el momento de la toma y
procesamiento de las muestras. Se realizarán la toma según el instructivo para la toma de muestras
biológicas en el laboratorio de análisis clínicos con código I-FQUI-LAC-01.
Se realizará un cuestionario de toma de muestra para cultivos con códigoF-FQUI-LAC-87, además se
mantendrá al día la bitácora de lector automático cristal con código F-FQUI-LAC-83, la bitácora de
mantenimiento y uso diario del lector automático bbl cristal con código FQUI-LAC-94, la bitácora de
Microbiología con código F-FQUI-LAC-49, se transcribirán los resultados al formato de cultivos con
código FQUI-LAC-11 y luego se entregará a recepción la bitácora de relación de los estudios
entregados por el área de microbiología con código F-FQUI-LAC-82, se llevará la hoja estadística de
estudios con código F-FQUI-LAC-48, la bitácora de uso de autoclave con código F-FQUI-LAC-61 y el
formato para el registro de temperatura de las estufas con código F-FQUI-LAC-19.
Las muestras son aceptadas si cumplen las condiciones que se describen en cada estudio y las
tomadas con hisopos estériles deben estar en medio de transporte. Si las muestras no cumplieran con
las condiciones deben ser rechazadas.
Una vez sembradas las muestras que están en medios de transporte serán guardadas en el
refrigerador hasta que los resultados sean reportados.
Las muestras de heces fecales y orina serán desechadas el mismo día que se siembren.
Mensualmente se correrá un control externo de PACAL para el área de Bacteriología.
Se llena el formato F-FQUI-LAC-52 control y preservación de Reactivos y cada día 15 se envía al
responsable de su seguimiento.
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EXUDADO FARINGEO
Se utiliza para el diagnóstico de faringitis
MATERIAL NECESARIO
- Abatelenguas
- Hisopo estéril
- Medio de transporte
- Medios de cultivo
- Asas bacteriológicas
CONDICIONES PREVIAS
El usuario deberá acudir en ayunas y sin aseo bucal. No deberá ingerir antibióticos y/o antifúngicos de
3 a 5 días antes de la toma de muestra.
TÉCNICA
1.-Se realizará un cuestionario de toma de muestra para cultivos con código F-FQUI-LAC-87.
2.-Realizar la toma del exudado faríngeo, según el instructivo para la toma de muestra biológica en el
laboratorio de análisis clínicos con código I-FQUI-LAC-01.
3.-Una vez hecha la toma se realiza la siembra en los medios de cultivo: Agar Sangre, Agar Mac
Conkey, Agar de Sal y Manitol.
4.-Incubar los medios a 37ºC y observar el crecimiento a las 24 horas.
5.-Realizar la identificación de manera manual y si hubiera alguna duda se realizaría la identificación
con el sistema de identificación bacteriológica en miniatura BD BBL TM Crystal TM.
6.-Luego de haber transcurrido las 24hrs se procede a identificar los microorganismos presentes en la
muestra según los esquemas de identificación. Una vez realizada las pruebas correspondientes, se
incuban a 37 ºC por 24 hrs.
7.-Se leen las pruebas realizadas y se identifica a las bacterias.
8.-Reportar los resultados en la bitácora (F-FQUI-LAC-49) y transcribirlos en el formato CULTIVOS (FFQUI-LAC-11).
OBSERVACIONES
Se investigará rutinariamente la presencia de Streptococcus beta-hemolítico del grupo A (S.pyogenes),
Staphylococcus aureus, Streptococcus beta hemolítico no del grupo A y no del grupo B,
microorganismos gramnegativos, entre otros.
EXUDADO NASAL
Esta muestra se utiliza para buscar portadores de S.aureus entre otros.
MATERIAL NECESARIO
- Hisopo estéril
- Medios de cultivo
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- Medio de transporte
- Asas bacteriológicas
CONDICIONES PREVIAS
El usuario deberá acudir al laboratorio, sin haber ingerido antibióticos y/o antifúngicos de 3 a 5 días
antes de la toma y no haberse colocado gotas o espray en las fosas nasales.
TÉCNICA.
1.-Se realizará un cuestionario de toma de muestra para cultivos con código F-FQUI-LAC-87.
2.-Realizar la toma del exudado nasal, según el instructivo para la toma de muestra biológica en el
laboratorio de análisis clínicos con código I-FQUI-LAC-01.
3.-Una vez hecha la toma se realiza la siembra en los medios de cultivo: Agar Sangre, Agar Mac
Conkey, Agar Thayer Martin, Agar de Sal y Manitol.
4.-Incubar los medios a 37ºC y observar el crecimiento a las 24 horas.
5.-Realizar la identificación de manera manual y si hubiera alguna duda se realizaría la identificación
con el sistema de identificación bacteriológica en miniatura BD BBL TM Crystal TM.
6.-Luego de haber transcurrido las 24hrs se procede a identificar los microorganismos presentes en la
muestra según los esquemas de identificación. Una vez realizada las pruebas correspondientes, se
incuban a 37 ºC por 24 hrs.
7.-Se leen las pruebas realizadas y se identifica a las bacterias.
8.-Reportar los resultados en la bitácora (F-FQUI-LAC-49) y transcribirlos en el formato CULTIVOS (FFQUI-LAC-11).
EXUDADO VAGINAL
Esta muestra se utiliza para conocer la etiología en casos de vaginosis bacteriana, candidiasis vaginal,
Trichomonas vaginales entre otros. Puede utilizarse para búsqueda de portadoras de Streptococcus
del grupo B en embarazadas.
MATERIAL NECESARIO
- Camilla ginecológica
- Espéculo estéril.
- Hisopos estériles.
- Medio de transporte
- Tubo con 4 mL de solución salina.
- Tubos estériles.
- Portaobjetos.
- Medios de cultivo
- Asas bacteriológicas
CONDICIONES PREVIAS
El usuario no debe tener aseo genital, no haber ingerido antibióticos y/o antifúngicos de 3 a 5 días
antes de la toma de muestra, no haber tenido relaciones 3 días antes, no haberse colocado ninguna
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crema u óvulos y no estar menstruando. En usuarios que nunca han tenido relaciones sexuales o en
niñas la toma sólo se realiza en el exterior de los genitales.
TÉCNICA
1.-Se realizará un cuestionario de toma de muestra para cultivos con código F-FQUI-LAC-87.
2.-Realizar la toma del exudado vaginal, según el instructivo para la toma de muestra biológica en el
laboratorio de análisis clínicos con código I-FQUI-LAC-01.
3.-El examen en fresco se realiza con el tubo con solución salina, se le quita el hisopo y se centrifuga
a 1,650 r.p.m., luego se elimina el sobrenadante para colocar el sedimento en un portaobjetos y
observar al microscopio con el objetivo de 40X. Se observa varios campos para buscar Trichomonas
vaginalis, si no se encuentra se reporta como: no se observaron parásitos.
4.-Al frotis se le realiza la tinción de Gram y una vez seca la muestra, se coloca una gota de inmersión
y se observa al microscopio con el objetivo de 100X para buscar células claves.
5.-Sembrar en medios de cultivo: Agar Sangre, Agar Mac Conkey, Agar Chocolate, Agar Thayer
Martin, Agar Dextrosa de Sabouraud, Agar de Sal y Manitol.
6.- Incubar los medios a 37ºC y observar el crecimiento a las 24 horas.
7.-Realizar la identificación de manera manual y si hubiera alguna duda se realizaría la identificación
con el sistema de identificación bacteriológica en miniatura BD BBL TM Crystal TM.
8.-Luego de haber transcurrido las 24hrs se procede a identificar los microorganismos presentes en la
muestra según los esquemas de identificación. Una vez realizada las pruebas correspondientes, se
incuban a 37 ºC por 24 hrs.
9.-Se leen las pruebas realizadas y se identifica a las bacterias.
10.-Reportar los resultados en la bitácora (F-FQUI-LAC-49) y transcribirlos en el formato de
CULTIVOS (F-FQUI-LAC-11).
EXUDADO URETRAL
Se utiliza para el diagnóstico etiológico de uretritis y La principal bacteria a investigar es N.
gonorrhoeae.
MATERIAL NECESARIO
- Hisopos uretrales de alginato cálcico o dracón.
- Hisopos estériles.
- Medio de transporte.
- Tubo con 5 mL de solución fisiológica.
- Portaobjetos.
- Medios de cultivo.
- Asas bacteriológicas.
CONDICIONES PREVIAS
El usuario no debe tener aseo genital, no haber ingerido antibióticos y/o antifúngicos de 3 a 5 días
antes de la toma de muestra, no haber tenido relaciones 3 días antes y no haberse colocado ninguna
crema.
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TÉCNICA
1.-Se realizará un cuestionario de toma de muestra para cultivos con código F-FQUI-LAC-87.
2.-Realizar la toma del exudado uretral, según el instructivo para la toma de muestra biológica en el
laboratorio de análisis clínicos con código I-FQUI-LAC-01.
3.-El examen en fresco se realiza con el tubo con solución salina, se le quita el hisopo y se centrifuga
a 2500 r.p.m., luego se elimina el sobrenadante para colocar el sedimento en un portaobjetos y
observar al microscopio con el objetivo de 40X. Se observa varios campos para buscar Trichomonas
vaginalis, si no se encuentra se reporta como: no se observaron parásitos.
4.-Al frotis se le realiza la tinción de Gram y una vez seca la muestra, se coloca una gota de inmersión
y se observa al microscopio con el objetivo de 100X para buscar polimorfonucleares con bacterias
diplococos gramnegativos.
5.-Sembrar en medios de cultivo: Agar Sangre, Agar Mac Conkey, Agar Chocolate, Agar Thayer
Martin, Agar Dextrosa de Sabouraud, Agar de Sal y Manitol.
6.-Incubar los medios a 37ºC y observar el crecimiento a las 24 horas.
7.- Realizar la identificación de manera manual y si hubiera alguna duda se realizaría la identificación
con el sistema de identificación bacteriológica en miniatura BD BBL TM Crystal TM.
8.-Luego de haber transcurrido las 24hrs se procede a identificar los microorganismos presentes en la
muestra según los esquemas de identificación. Una vez realizada las pruebas correspondientes, se
incuban a 37 ºC por 24 hrs.
9.-Se leen las pruebas realizadas y se identifica a las bacterias.
10.-Reportar los resultados en la bitácora (F-FQUI-LAC-49) y transcribirlos en el formato de
CULTIVOS (F-FQUI-LAC-11).
UROCULTIVO
(Orina obtenida por “Chorro medio”)
La prueba se realiza para determina si existe una infección en las vías urinarias. Se investiga la
presencia de bacterias u hongos. La muestra idónea es la primera micción de la mañana, ya que
permite la multiplicación de bacterias durante la noche.
CONDICIONES PREVIAS
Se requiere que el usuario no esté tomando antibióticos y/o antifúngicos de 3 a 5 días antes de la
toma, la primera orina de la mañana, aseo de genitales y recolectar en un recipiente o bolsa estéril el
chorro medio de la orina.
MATERIAL NECESARIO
- Medios de cultivo
- Recipiente de boca ancha con tapa de rosca hermética y estéril.
- Asa calibrada de platino color negro de 0.001mL o asa calibrada de platino color rojo de 0.01mL (
Anexo 1).
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OBTENCIÓN DE LA MUESTRA
Los pacientes recolectarán la muestra por la técnica del chorro medio.
TÉCNICA
1.-La muestra debe ser sembrada máximo 2 horas después de su recolección.
2.-Utilizar asa calibrada de platino color negra de 0.01mL (1 colonia = 100 UFC/mL) o asa calibrada de
platino color rojo 0.001mL (1 colonia = 1,000 UFC/mL).
3.-Homogenizar bien la orina.
4.-Sembrar las muestras en Agar Sangre y un medio de baja selectividad (CHROMagar Orientador o
Agar Mac Conkey).
5.-Esterilizar el asa de platino y enfriarla. Para enfriar el asa se sumerge verticalmente y se retira
asegurándose llevar una gota de orina para luego desecharla, esto se realiza 3 veces y la cuarta se
utiliza para sembrar en los medios de cultivo.
6.-Extender la orina contenida en el asa a lo largo de un diámetro de la placa. Extender el inóculo con
la misma asa en estrías muy apretadas perpendicularmente a la primera estría y luego
perpendicularmente a la segunda con múltiples pasadas del asa, que se superpongan, hasta cubrir
toda la placa.
7.-Incubar las placas en posición invertida 24 hrs a 37 °C, si no hay crecimiento a las 24hrs dejar
incubar 24 hrs más.
8.- Realizar la identificación de manera manual y si hubiera alguna duda se realizaría la identificación
con el sistema de identificación bacteriológica en miniatura BD BBL TM Crystal TM.
9.-Luego de haber transcurrido las 24hrs se procede a identificar los microorganismos presentes en la
muestra según los esquemas de identificación. Una vez realizada las pruebas correspondientes, se
incuban a 37 ºC por 24 hrs.
10.-Se leen las pruebas realizadas y se identifica a las bacterias.
11.-Estimar el número de colonias y multiplicarlo por el factor de dilución según el asa utilizada, para
obtener el número de bacterias por ml de orina.
12.-Reportar los resultados en la bitácora (F-FQUI-LAC-49) y transcribirlos en el formato de
CULTIVOS (F-FQUI-LAC-11).
OBSERVACIONES
Un recuento de más de 100,000 UFC/mL es indicativo de infección (el número no se correlaciona con
la gravedad de la misma).
Un recuento de menos de 10,000 UFC/mL hace sospechar una contaminación de la muestra,
especialmente si hay varios tipos distintos de colonias, pues las infecciones urinarias son casi siempre
debidas a un sólo microorganismo. Las cifras intermedias son dudosas, y requieren la consulta al
médico y la repetición del análisis. Hay que tener presente que las muestras obtenidas por punción
suprapúbica o cateterismo aséptico no llevan contaminación, y debe considerarse positivo cualquier
recuento.
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COPROCULTIVO
La familia Enterobacteriaceae está formada por bacilos gramnegativos aerobios y anaeróbios
facultativos que fermentan la glucosa, son oxidasa negativa y crecen en medios usuales. Habitan
como comensales en el tubo digestivo del hombre y de otros animales de sangre caliente. En algunos
géneros como Salmonella, Shigella y Yersinia hay especies o bioserotipos patógenos, y otros como
Escherichia (excepto 4 subespecies), Citrobacter, Klebsiella y Proteus forman parte de la biota normal
del tubo digestivo y pueden actuar como oportunistas.
MATERIAL NECESARIO
-Medios de cultivo
-Caldo de tetrationato
-Asas bacteriológicas
-Recipiente de boca ancha con tapa de rosca hermética y estéril.
CONDICIONES PREVIAS
Se requiere que el usuario no esté tomando antibióticos y/o antifúngicos de 3 a 5 días antes de
recolectar su muestra, colocarla en un recipiente estéril, se recomienda que las heces fecales sean del
día y remitirlas al laboratorio a la mayor brevedad.
TÉCNICA
1.-Se realiza una siembra directa de la muestra fecal en Agar Salmonella- Shigella, Agar Mac Conkey
y en caldo de Tetrationato. Se incuban los medios durante 24 horas a 37°C. Nota: el caldo tetrationato
sele agrega 200µL de yodo para activarlo.
2.-Realizar Bioquímicas de las colonias que crecieron en los Agares e incubar durante 24 horas a
37°C.
3.-Resembrar la muestra del caldo de tetrationato en Agar Salmonella-Shigella, Agar Mac Conkey y
dejar incubar durante 24 horas a 37°C.
4.- Realizar la identificación de manera manual y si hubiera alguna duda se realizaría la identificación
con el sistema de identificación bacteriológica en miniatura BD BBL TM Crystal TM.
5.-Realizar Bioquímicas de las colonias que crecieron de la resiembra e incubar durante 24 horas a
37°C.
6.-Identificar las bioquímicas según las tablas de identificación.
7.-Reportar los resultados en la bitácora (F-FQUI-LAC-49) y transcribirlos en el formato de CULTIVOS
(F-FQUI-LAC-11).
LESION (HERIDA)
MATERIAL NECESARIO
-Portaobjetos
-Hisopo estéril
-Medio de transporte
-Medios de cultivos
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-Asas bacteriológicas
CONDICIONES PREVIAS
El usuario no debe asearse el área de lesión y no haber ingerido antibióticos y/o antifúngicos de 3 a 5
días antes de la toma de muestra.
TÉCNICA
1.-Se realizará un cuestionario de toma de muestra para cultivos con código F-FQUI-LAC-87.
2.-Realizar la toma de lesión, según el instructivo para la toma de muestra biológica en el laboratorio
de análisis clínicos con código I-FQUI-LAC-01.
3.-Sembrar en medios de cultivo: Agar Sangre, Agar Mac Conkey, Agar Chocolate, Agar Thayer
Martin, Agar Dextrosa de Sabouraud, Agar de Sal y Manitol.
4.-Incubar los medios a 37ºC y observar resultados en 24 horas.
5.-Realizar la identificación de manera manual y si hubiera alguna duda se realizaría la identificación
con el sistema de identificación bacteriológica en miniatura BD BBL TM Crystal TM.
6.-Luego de haber transcurrido las 24hrs se procede a identificar los microorganismos presentes en la
muestra según los esquemas de identificación. Una vez realizada las pruebas correspondientes, se
incuban a 37 ºC por 24 hrs.
7.-Se leen las pruebas realizadas y se identifica a las bacterias.
8.-Identificar los microorganismos presentes en la muestra según esquemas de identificación
9.-Reportar los resultados en la bitácora (F-FQUI-LAC-49) y transcribirlos en el formato de CULTIVOS
(F-FQUI-LAC-11).
HEMOCULTIVO
El hemocultivo es una prueba que se utiliza para diagnosticar bacteriemias y fungemias, que consiste
en el cultivo de una muestra de sangre en medios adecuados para recuperar las bacterias y los
hongos.
MATERIAL NECESARIO
-Jeringas desechables
-Yodo povidona
-Torundas del algodón con alcohol etílico al 70%
-Frascos de Hemocultivo
-Asas bacteriológicas
-Medios de cultivo
CONDICIONES PREVIAS
Se requiere que el usuario no esté tomando antibióticos y/o antifúngicos de 3 a 5 días antes de
recolectar la muestra y tener ayuno de 10 a 12hrs.
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Código: I-FQUI-LAC-07
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Fecha de emisión: 5/Enero/2009
Fecha de modificación:25/03/2015
TÉCNICA
1.-Se realizará un cuestionario de toma de muestra para cultivos con código F-FQUI-LAC-87.
2.-Realizar la toma del hemocultivo, según el instructivo para la toma de muestra biológica en el
laboratorio de análisis clínicos con código I-FQUI-LAC-01.
3.-Inyectar inmediatamente la sangre en el frasco de hemocultivo.
4.-Mezclar la sangre con el medio líquido para evitar la formación de coágulos.
5.-Incubar el frasco de cultivo a 37°C durante 8 días
6.-La sangre con el medio líquido deberá bañar 1 a 2 veces la superficie del medio de cultivo, está
maniobra se repite por lo menos cada 12 horas durante el tiempo de incubación.
7.-Hacer siembras directas a las 24, 48, 72 horas en medios de cultivo: Agar Sangre, Agar Mac
Conkey, Agar Chocolate, Agar Thayer Martin, Agar Dextrosa de Sabouraud, Agar de Sal y Manitol.
8.-Incubar los medios a 37°C hasta esperar los 8 días desde que se recepcionó la muestra.
9.-Si hay crecimiento en los agares se procede a identificar los microorganismos de manera manual y
si hubiera alguna duda se realizaría la identificación con el sistema de identificación bacteriológica en
miniatura BD BBL TM Crystal TM.
10.-En el momento que se observe crecimiento se procede a identificar los microorganismos presentes
en la muestra según los esquemas de identificación. Una vez realizada las pruebas correspondientes,
se incuban a 37 ºC por 24 hrs.
11.-Se leen las pruebas realizadas y se identifica a las bacterias.
12.-Reportar los resultados en la bitácora (F-FQUI-LAC-49) y transcribirlos en el formato de
CULTIVOS (F-FQUI-LAC-11).
CULTIVO DE ESPERMA
MATERIAL NECESARIO
-Medios de cultivos
-Asas bacteriológicas
CONDICIONES PREVIAS
El paciente puede recolectar su muestra en su casa o en el LACSC por la técnica de masturbación,
con previo aseo de genitales y manos, sin haber orinado, no haber ingerido antibióticos y/o
antifúngicos de 3 a 5 días antes de la recolección, con abstinencia sexual de 3 días y colocar la
muestra en un recipiente estéril.
TÉCNICA
1.- Sembrar en medios de cultivo: Agar Sangre, Agar Mac Conkey, Agar Chocolate, Agar Thayer
Martin, Agar Dextrosa de Sabouraud, Agar de Sal y Manitol.
2.-Incubar los medios a 37ºC y observar resultados en 24 horas.
3.-Realizar la identificación de manera manual y si hubiera alguna duda se realizaría la identificación
con el sistema de identificación bacteriológica en miniatura BD BBL TM Crystal TM.
4.-Luego de haber transcurrido las 24hrs se procede a identificar los microorganismos presentes en la
muestra según los esquemas de identificación. Una vez realizada las pruebas correspondientes, se
incuban a 37 ºC por 24 hrs.
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Instructivo para el procesamiento de muestras del área de Microbiología
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Código: I-FQUI-LAC-07
Revisión: 11
Fecha de emisión: 5/Enero/2009
Fecha de modificación:25/03/2015
5.-Se leen las pruebas realizadas y se identifica a las bacterias.
6.-Identificar los microorganismos presentes en la muestra según esquemas de identificación
7.-Reportar los resultados en la bitácora (F-FQUI-LAC-49) y transcribirlos en el formato de CULTIVOS
(F-FQUI-LAC-11).
CULTIVO DE EXPECTORACIÓN
MATERIAL NECESARIO
-Medios de cultivos
-Asas bacteriológicas
CONDICIONES PREVIAS
El usuario puede recolectar su esputo en su casa o en el LACSC por la técnica de expectoración y no
debe haber ingerido antibióticos y/o antifúngicos de 3 a 5 días antes de la recolección.
TÉCNICA
1.-Sembrar en medios de cultivo: Agar Sangre, Agar Mac Conkey, Agar Chocolate, Agar Thayer
Martin, Agar Dextrosa de Sabouraud, Agar de Sal y Manitol.
2.-Incubar los medios a 37ºC y observar resultados en 24 horas.
3.- Realizar la identificación de manera manual y si hubiera alguna duda se realizaría la identificación
con el sistema de identificación bacteriológica en miniatura BD BBL TM Crystal TM.
4.-Luego de haber transcurrido las 24hrs se procede a identificar los microorganismos presentes en la
muestra según los esquemas de identificación. Una vez realizada las pruebas correspondientes, se
incuban a 37 ºC por 24 hrs.
5.-Se leen las pruebas realizadas y se identifica a las bacterias.
6.-Identificar los microorganismos presentes en la muestra según esquemas de identificación
7.-Reportar los resultados en la bitácora (F-FQUI-LAC-49) y transcribirlos en el formato de CULTIVOS
(F-FQUI-LAC-11).
CULTIVO OFTÁLMICO(LAGRIMAL)
Los agentes infecciosos pueden atacar cualquier parte del ojo, tanto desde afuera como desde
adentro.
La conjuntivitis (inflamación) produce enrojecimiento (ojos rosados), picazón y secreción, que puede
ser mucosa o purulenta.Los patógenos bacterianos más comunes son Staphylococcus aureus,
Haemophilus influenza, Streptococcus pneumoniae y Pseudomonas aeruginosa. La conjuntivitis aguda
también puede ser causada por dos patógenos de transmisión sexual, Chlamydia trachomatis y
Neisseria gonorrhoeae.
MATERIAL NECESARIO
-Hisopo estéril
-Medio de transporte
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Código: I-FQUI-LAC-07
Revisión: 11
Fecha de emisión: 5/Enero/2009
Fecha de modificación:25/03/2015
-Medios de cultivos
-Asas bacteriológicas
CONDICIONES PREVIAS
Se requiere que el usuario no esté tomando antibióticos y/o antifúngicos de 3 a 5 días antes de
recolectar la muestra y no asearse el ojo.
TÉCNICA
1.-Se realizará un cuestionario de toma de muestra para cultivos con código F-FQUI-LAC-87.
2.-Realizar la toma del cultivo oftálmico, según el instructivo para la toma de muestra biológica en el
laboratorio de análisis clínicos con código I-FQUI-LAC-01.
3.- Sembrar en medios de cultivo: Agar Sangre, Agar Mac Conkey, Agar Chocolate, Agar Thayer
Martin, Agar Dextrosa de Sabouraud, Agar de Sal y Manitol.
4.-Incubar los medios a 37ºC y observar resultados en 24 horas.
5.- Realizar la identificación de manera manual y si hubiera alguna duda se realizaría la identificación
con el sistema de identificación bacteriológica en miniatura BD BBL TM Crystal TM.
6.-Luego de haber transcurrido las 24hrs se procede a identificar los microorganismos presentes en la
muestra según los esquemas de identificación. Una vez realizada las pruebas correspondientes, se
incuban a 37 ºC por 24 hrs.
7.-Se leen las pruebas realizadas y se identifica a las bacterias.
8.-Identificar los microorganismos presentes en la muestra según esquemas de identificación
9.-Reportar los resultados en la bitácora (F-FQUI-LAC-49) y transcribirlos en el formato de CULTIVOS
(F-FQUI-LAC-11).
CULTIVO OTICO
MATERIAL NECESARIO
-Hisopo estéril
-Medio de transporte
-Medios de cultivos
-Asas bacteriológicas
CONDICIONES PREVIAS
Se requiere que el usuario no esté tomando antibióticos y/o antifúngicos, ni haberse colocado gotas de
3 a 5 días antes de recolectar la muestra.
TÉCNICA
1.-Se realizará un cuestionario de toma de muestra para cultivos con código F-FQUI-LAC-87.
2.-Realizar la toma del cultivo otico, según el instructivo para la toma de muestra biológica en el
laboratorio de análisis clínicos con código I-FQUI-LAC-01.
3.- Sembrar en medios de cultivo: Agar Sangre, Agar Mac Conkey, Agar Chocolate, Agar Thayer
Martin, Agar Dextrosa de Sabouraud, Agar de Sal y Manitol.
4.-Incubar los medios a 37ºC y observar resultados en 24 horas.
F-DGPLANEI-CC/GA-39/REV:01
Instructivo para el procesamiento de muestras del área de Microbiología
Página: 12 de 58
Código: I-FQUI-LAC-07
Revisión: 11
Fecha de emisión: 5/Enero/2009
Fecha de modificación:25/03/2015
5.- Realizar la identificación de manera manual y si hubiera alguna duda se realizaría la identificación
con el sistema de identificación bacteriológica en miniatura BD BBL TM Crystal TM.
6.-Luego de haber transcurrido las 24hrs se procede a identificar los microorganismos presentes en la
muestra según los esquemas de identificación. Una vez realizada las pruebas correspondientes, se
incuban a 37 ºC por 24 hrs.
7.-Se leen las pruebas realizadas y se identifica a las bacterias.
8.-Identificar los microorganismos presentes en la muestra según esquemas de identificación
9.-Reportar los resultados en la bitácora (F-FQUI-LAC-49) y transcribirlos en el formato de CULTIVOS
(F-FQUI-LAC-11).
CULTIVOS MICOLÓGICOS
La micosis presente, así como el estudio micológico y la selección de la muestra a examinar, estará
guiada por la forma de presentación clínica.
Clásicamente según su localización anatómica, las micosis se pueden dividir en: superficiales,
dermohipodérmicas, profundas localizadas y sistémicas. Según el grado de patogenicidad del hongo
se pueden dividir en: micosis causadas por agentes oportunistas, por patógenos primarios con
comportamiento oportunista o por patógenos primarios.
Actualmente no debe olvidarse que hongos que no se consideraban patógenos o se encontraban
limitado a un solo órgano pueden causar enfermedad diseminada en el inmunodeprimnido. En este
contexto se debe tener en cuenta que el aislamiento de algunos hongos en piel, mucosas u otros
sectores, puede no significar una afección localizada, sino que por el contrario ser la manifestación de
una micosis sistémica diseminada.
CONCEPTOS GENERALES
El tipo de muestra recogida dependerá de la micosis sospechada y de su localización anatómica.
Los tubos, viales, frascos (vidrio o plástico) donde se recolecten las muestras deben ser estériles y con
tapón hermético y correctamente identificadas.
MUESTRAS PARA ESTUDIO DE MICOSIS SUPERFICIALES.
Este examen se solicita habitualmente para el diagnóstico de micosis superficiales tales como:
dermatofitosis, candidiasis, pitiriasis versicolor, dermatitis seborreica, entre otras.
Las dermatofitosis corresponden al parasitismo de la piel y sus anexos causada por un grupo de
hongos queratinofílicos y queratinolíticos denominados dermatofitos.
Las candidiasis superficiales corresponden a las afecciones de piel y mucosas causadas por especies
de levaduras del género Candida.
La pitiriasis versicolor es una afección de la piel causada por levaduras del género Malassezia
(clásicamentre Malassezia furfur), que se caracteriza por la aparición de máculas
hipohiperpigmentadascon descamación furfurácea en dicho sector.
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Instructivo para el procesamiento de muestras del área de Microbiología
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Código: I-FQUI-LAC-07
Revisión: 11
Fecha de emisión: 5/Enero/2009
Fecha de modificación:25/03/2015
PIEL
MATERIAL NECESARIO
-Caja de Petri estéril
-Hoja de bisturí
-Porta objetos
-Cinta adhesiva
CONDICIONES PREVIAS
El usuario no debe asearse el área un día antes, no haber ingerir antifúngicos de 3 a 5 días antes de la
toma y no colocarse ninguna crema.
TÉCNICA
1.-Se realizará un cuestionario de toma de muestra para cultivos con código F-FQUI-LAC-87.
2.-Realizar la toma del cultivo micológico de piel, según el instructivo para la toma de muestra biológica
en el laboratorio de análisis clínicos con código I-FQUI-LAC-01.
3.-La muestra que se coloca en el portaobjetos se clarifica con el KOH y buscar estructuras
microscópicas de hongos.
4.-Las escamas de piel recolectadas, se colocarán en Agar Dextrosa Sabouraud.
5.-Se deja incubar por 15 días a temperatura ambiente.
6.-Identificar el hongo según su morfología y tablas de identificación.
7.-Reportar los resultados en la bitácora (F-FQUI-LAC-49) y transcribirlos en el formato de CULTIVOS
(F-FQUI-LAC-11).
OBSERVACIONES
Se deberá tener en cuenta que la sensibilidad del estudio micológico está directamente relacionado
con la cantidad de material obtenido; por lo cual la muestra a estudiar debe ser abundante.
UÑAS
MATERIAL NECESARIO
-Cajas de Petri estéril
-Hoja de bisturí
CONDICIONES PREVIAS
El usuario no debe asearse el área un día antes, no haber ingerir antifungicos de 3 a 5 días antes de la
toma y no colocarse ninguna crema.
TECNICA
1.-Se realizará un cuestionario de toma de muestra para cultivos con código F-FQUI-LAC-87.
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2.-Realizar la toma del cultivo micológico de uña, según el instructivo para la toma de muestra
biológica en el laboratorio de análisis clínicos con código I-FQUI-LAC-01.
3.-Las escamas de la uña recolectadas, se colocarán en Agar Dextrosa Sabouraud.
4.-Se deja incubar por 15 días a temperatura ambiente.
5.-Identificar el hongo según su morfología y tablas de identificación.
6.-Reportar los resultados en la bitácora (F-FQUI-LAC-49) y transcribirlos en el formato de CULTIVOS
(F-FQUI-LAC-11).
OBSERVACIONES
Se deberá tener en cuenta que la sensibilidad del estudio micológico está directamente relacionado
con la cantidad de material obtenido; por lo cual la muestra a estudiar debe ser abundante.
CABELLO
MATERIAL NECESARIO
-Cajas de Petri estéril
-Pinzas
CONDICIONES PREVIAS
El usuario no debe lavarse la cabeza un día antes, no haber ingerir antifúngicos de 3 a 5 días antes de
la toma y no colocarse ninguna crema.
TÉCNICA
1.- Se realizará un cuestionario de toma de muestra para cultivos con código F-FQUI-LAC-87.
2.-Realizar la toma del cultivo micológico de cabello, según el instructivo para la toma de muestra
biológica en el laboratorio de análisis clínicos con código I-FQUI-LAC-01.
3.-El pelo se colocará en Agar Dextrosa Sabouraud.
4.-Se deja incubar por 15 días a temperatura ambiente.
5.-Identificar el hongo según su morfología y tablas de identificación.
6.-Reportar los resultados en la bitácora (F-FQUI-LAC-49) y transcribirlos en el formato de CULTIVOS
(F-FQUI-LAC-11).
LESION (HERIDA)
MATERIAL NECESARIO:
-Hisopo estéril
-Medio de transporte
CONDICIONES PREVIAS
El usuario no debe asearse el área de lesión y no haber ingerido antifúngicos de 3 a 5 días antes de la
toma de muestra.
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TÉCNICA
1.- Se realizará un cuestionario de toma de muestra para cultivos con código F-FQUI-LAC-87.
2.-Realizar la toma de lesión, según el instructivo para la toma de muestra biológica en el laboratorio
de análisis clínicos con código I-FQUI-LAC-01.
3.-El exudado se colocará en Agar Dextrosa Sabouraud.
4.-Se deja incubar por 15 días a temperatura ambiente.
5.-Identificar el hongo según su morfología y tablas de identificación.
6.-Reportar los resultados en la bitácora (F-FQUI-LAC-49) y transcribirlos en el formato de CULTIVOS
(F-FQUI-LAC-11).
BACTERIOSCOPIA
MATERIAL NECESARIO
-Hisopo estéril
-Portaobjeto
CONDICIONES PREVIAS
El usuario no debe asearse el área donde se va a realizar la toma un día antes y que no esté tomando
antibióticos y/o antifúngicos de 3 a 5 días antes de recolectar la muestra.
La bacterioscopía es una técnica fundamental para él análisis de la morfología y tinción de las
bacterias por Gram.
1.-Se realiza la toma con un hisopo estéril del área afectada.
2.-Se hace un extendido de la muestra sobre un portaobjetos.
3.-Se fija con la flama del mechero.
4.-Se realiza la tinción de Gram:
a)Se cubre la placa con cristal violeta durante un minuto y luego se lava.
b)Se cubre la placa con Lugol durante un minuto y luego se lava.
c)Se decolora la muestra con alcohol-cetona durante un minuto y luego se lava.
d)Se cubre la placa con safranina durante un minuto y luego se lava.
e)Se deja secar.
f)Una vez seca la muestra, se coloca una gota de inmersión y se observa al microscopio con el
objetivo de 100X.
5.-Reportar los resultados en la bitácora (F-FQUI-LAC-49) y transcribirlos en el formato de CULTIVOS
(F-FQUI-LAC-11).
BACILOSCOPIA
La baciloscopía, es la técnica fundamental en toda investigación bacteriológica de la tuberculosis, en la
detección de casos y control de tratamiento. Con un costo bajo y de rápida ejecución, la baciloscopía
es una técnica que permite identificar al 70-80% de los casos pulmonares positivos.
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MATERIAL NECESARIO
-Hisopo estéril
-Portaobjeto
CONDICIONES PREVIAS
El usuario puede recolectar su esputo en su casa o en el LACSC por la técnica de expectoración y no
debe haber ingerido antibióticos y/o antifúngicos de 3 a 5 días antes de la recolección.
TÉCNICA
1.-Con lápiz diamante se numera en uno de los extremos los portaobjetos nuevos.
2.-Con el mechero encendido se procede a destapar la muestra que se coloca junto al portaobjetos
que le corresponde. Una vez seleccionada la parte de la muestra, que en el caso de los diversos
líquidos obtenidos por punción es el sedimento obtenido por centrifugación por 15 minutos a 3 000
r.p.m., de aquí se toma para el frotis.
3.-Se coloca la muestra en el portaobjetos con la ayuda de pipetas Pasteur estériles y se procede a
extenderla con aplicadores de madera, con movimientos circulares y finalmente de vaivén hasta formar
una película lo más uniforme posible, se dejará secar a temperatura ambiente.
4.-La tinción se puede realizar por la técnica de Ziehl-Neelsen o Kinyou.
a) La tinción de Ziehl-Neelsen se realiza de la siguiente forma: se fija la baciloscopía con alcohol al
70% y se cubre con fucsina. Se calientan los frotis flameándolos con una pinza provista en un extremo
con torunda embebida en alcohol, hasta que empiece la emisión de vapores se deja de calentar y
repite la operación cuantas veces sea necesario en un lapso de 5 minutos. Se elimina el colorante con
agua. Se agrega alcohol-ácido hasta decolorar el frotis. Se enjuaga con agua y se aplica el colorante
de contraste que es el azul de metileno por espacio de 1.5 minutos. Se enjuaga con agua corriente y
se deja escurrir en forma vertical sobre papel absorbente hasta que se seque.
b) La tinción de Kinyou se realiza de la siguiente forma: se fija la baciloscopía con alcohol al 70% y se
cubre con fucsina durante 5 minutos. Se elimina el colorante con agua. Se agrega alcohol-ácido hasta
decolorar el frotis. Se enjuaga con agua y se aplica el colorante de contraste que es el azul de metileno
por espacio de 1.5 minutos. Se enjuaga con agua corriente y se deja escurrir en forma vertical sobre
papel absorbente hasta que se seque.
5.-La observación debe establecer en primer término si se encuentran BAAR en el extendido y si los
hay, el número aproximado de ellos por campo microscópico.
Los bacilos aparecen como bastoncillos delgados de color rojo y con gránulos en su interior, aislados,
en pares o agrupados sobre un fondo azul claro de la tinción de contraste. La contabilidad debe seguir
una pauta uniforme de observación leyendo de izquierda a derecha del extendido un mínimo de 100
campos útiles distribuidos en el total del extendido.
6.-El informe del resultado se realizará de la siguiente forma:
Negativo: no se observan BAAR.
Positivo +: se observan menos de un bacilo por campo en promedio en 100 campos observados.
Positivo ++: se observan de 1 a 10 bacilos por campo en promedio en 50 campos observados.
Positivo +++: Se observan más de 10 bacilos por campo en promedio en 20 campos observados.
7.-Reportar los resultados en la bitácora (F-FQUI-LAC-49) y transcribirlos en el formato de CULTIVOS
(F-FQUI-LAC-11).
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EXAMÉN MICROSCÓPICO PARA HONGOS
Está técnica se utiliza para ver las estructuras microscópicas de los hongos.
1.-Si la muestra es de piel se recolecta con una cinta adhesiva pegándola en la piel y luego se coloca
en un portaojetos. Si es cabello, se utiliza un pelo con la raíz y de lesiones se recolecta con un hisopo
estéril.
2.-Se coloca sobre la muestra 2 gotas de KOH al 10% y se deja 1min.
3.-Se observa al microscopio con el objetivo de 40X.
4.-Reportar los resultados en la bitácora (F-FQUI-LAC-49) y transcribirlos en el formato de CULTIVOS
(F-FQUI-LAC-11).
TINCIÓN DE GRAM
1.-.-Tomar una colonia bacteriana y disolverla con una gota de solución salina en un portaobjetos.
2.-Una vez seca la placa se fija con la flama del mechero.
4.-Se realiza la tinción de Gram:
a)Se cubre la placa con cristal violeta durante un minuto y luego se lava.
b)Se cubre la placa con Lugol durante un minuto y luego se lava.
c)Se decolora la muestra con alcohol-cetona durante un minuto y luego se lava.
d)Se cubre la placa con safranina durante un minuto y luego se lava.
e)Se deja secar.
f)Una vez seca la muestra, se coloca una gota de inmersión y se observa al microscopio con el
objetivo de 100X.
MEDIOS DE CULTIVO
Debido a que la mayoría de las muestras enviadas al laboratorio de microbiología contienen varias
especies de bacterias, mezcladas a menudo con otros microorganismos, se debe utilizar un medio
selectivo para aislar aquellas especies que pueden ser de importancia clínica. Es importante conocer
la composición de los medios y el propósito y concentración relativa de cada compuesto o reactivo
incluido. Las fórmulas son algo complejas e incluyen componentes que sólo inhiben el desarrollo de
ciertas especies bacterianas, sino que también detectan una variedad de características bioquímicas
de importancia en la identificación preliminar de los microorganismos seleccionados.
Tipos generales de sustancias y compuestos usados en los medios selectivos.
Hidrolizados de proteínas (peptona, infusión de carne, triptonas, caseína).
Hidratos de carbono.
Buffers.
Enriquecimientos.
Inhibidores.
Indicadores de pH
Otros indicadores.
Otros compuestos y sustancias.
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AGAR MAC CONKEY (MC)
Fórmula
Peptona
Polipeptona
Lactosa
Sales Biliares
Cloruro de sodio
Agar
Rojo neutro
Cristal violeta
Agua destilada csp.
pH final
17.0 g
3.0 g
10.0 g
1.5 g
5.0 g
13.5 g
0.3 g
0.001 g
1.0 L
7.1
PROPÓSITO Y COMPONENTES DIFERENCIALES.
Medio diferencial para la selección y recuperación de Enterobacterias y bacilos Gram negativos
entéricos relacionados.
Las sales biliares y el cristal violeta inhiben el desarrollo de bacterias Gram positivos y de algunas
Gram negativas exigentes.
La lactosa es el único hidrato de carbono. Las bacterias fermentadoras de lactosa forman colonias de
diferentes tonos de rojo debido al viraje del indicador rojo neutro (rojo a pH menor de 6,8) por la
producción de ácidos mixtos. Las colonias no fermentadoras de lactosa aparecen incoloras o
transparentes.
Método de preparación de Agar Mac Conkey marca Bioxon (Anexo II).
Disolver 50gr del medio en un litro de agua destilada o deionizada, hidratar entre 10 a 15 minutos y
calentar a ebullición agitando continuamente, hervir durante 1 minuto. Esterilizar en autoclave a 121°C
durante 15 minutos, enfriar a 45-50°C y vaciar en cajas Petri 20mL por placa.
Método de preparación de Agar Mac Conkey marca MCD (Anexo III).
Suspender 50 g del medio en 1 litro de agua purificada. Calentar con agitación suave hasta completa
disolución del polvo y hervir durante 1 minuto. Esterilizar en autoclave a 121°C (15 libras de presión)
durante 15 minutos. Enfriar a una temperatura entre 45-50°C y vaciar en placas de Petri estériles.
Una vez gelificado el Agar de Mac Conkey se meterá a prueba de esterilidad en la estufa
bacteriológica por 24 hrs a 37°C. Transcurridos las 24 hrs sacarlos de la estufa y revisar si no están
contaminados.
Las cajas se etiquetaran con la abreviatura del medio, número de lote, fecha de elaboración y fecha de
caducidad.
Se recomienda probar el desarrollo microbiológico con cepas control.
REACCIONES E INTERPRETACIÓN.
Los típicos fermentadores fuertes de lactosa, tales, como las especies de Escherichia, Klebsiella y
Enterobacter, forman colonias rojas rodeadas de una zona de bilis precipitada. Los fermentadores
débiles o lentos de lactosa, tales como Citrobacter, Providencia, Serratia y Hafnia, pueden formar
colonias incoloras en 24 h o ligeramente rosadas en 24 a 48h.
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Fecha de modificación:25/03/2015
Las colonias de Proteus, Edwardsiella, Salmonella y Shigella, con raras excepciones, son incoloras o
transparentes.
AGAR DE SAL Y MANITOL (MSA)
Fórmula
Digerido Péptico de Tejido
Animal
Cloruro de Sodio
Digerido Pancreático de
Caseína
D-Manitol
Extracto de Carne
Rojo de Fenol
Agar Bacteriológico
pH
5.0 g
75.0 g
5.0 g
10.0 g
1.0 g
0.025 g
15.0 g
7.4 ± 0.2
El Agar Sal y Manitol es utilizado para el aislamiento y diferenciación de estafilococos a partir de
muestras clínicas y diversos materiales.
PROPÓSITO Y COMPONENTES DIFERENCIALES
El Agar Sal y Manitol fue formulado por Chapman para obtener el aislamiento de estafilococos,
inhibiendo el crecimiento de otras bacterias al utilizar una alta concentración de sal. Al adicionar
cloruro de sodio al 7.5% al Agar Rojo de Fenol y Manitol, se obtiene un abundante crecimiento de
cepas patógenas de estafilococos (coagulasa positivos) que forman colonias y halos amarillos a
diferencia de las cepas no patógenas que dan colonias pequeñas de color rojo y sin cambio en el color
del medio. Asimismo, esta alta concentración de cloruro de sodio inhibe el crecimiento de flora
acompañante.
Las peptonas y el extracto de carne proporcionan la fuente de carbono, nitrógeno, vitaminas y
minerales. El D-manitol es el carbohidrato.
El rojo de fenol actúa como indicador de pH. El agar es adicionado como agente solidificante.
Método de preparación de Agar de Sal y Manitol marca Bioxon (Anexo IV).
Disolver 111 g del medio deshidratado en un litro de agua destilada y remojar unos 15 minutos.
Mezclar bien y calentar a ebullición durante 1 minuto, esterilizar en autoclave a 121°C durante 15
minutos.
Método de preparación de Agar de Sal y Manitol marca MCD (Anexo V).
Suspender 111 g del medio en 1 litro de agua purificada. Calentar con agitación suave hasta completa
disolución del polvo y hervir durante 1 minuto. Esterilizar en autoclave a 121°C (15 libras de presión)
durante 15 minutos. Enfriar a temperatura de 45-50°C y vaciar en placas de Petri estériles.
Una vez gelificado el Agar de Sal y Manitol se meterá a prueba de esterilidad en la estufa
bacteriológica por 24 hrs a 37°C. Transcurridos las 24 hrs sacarlos de la estufa y revisar si no están
contaminados.
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Fecha de emisión: 5/Enero/2009
Fecha de modificación:25/03/2015
Las cajas se etiquetaran con la abreviatura del medio, número de lote, fecha de elaboración y fecha de
caducidad.
Se recomienda probar el desarrollo microbiológico con cepas control.
REACCIONES E INTERPRETACIÓN
Colonias pequeñas a medianas con zonas amarillas alrededor; S. aureus.
Colonias grandes de color naranja a blanco; Micrococos.
Otros estafilococos colonias pequeñas de color rojo sin cambio en el color del medio.
Bacterias Gram negativas; inhibidas o muy poco desarrollo.
Estreptococos sin crecimiento.
AGAR MUELLER HINTON (MH)
FÓRMULA
Infusión de Carne
300.0
Almidón.
Peptona de Caseína H
Agar Bacteriológico
pH
1.5
17.5
17.0
7.4 ± 0.2
PROPÓSITO Y COMPONENTES DIFERENCIALES
El Agar Mueller Hinton es un medio utilizado para realizar las pruebas de susceptibilidad
antimicrobiana en microorganismos aeróbicos por el método de Kirby-Bauer. Este medio también es
conocido como Agar M-H. Bauer, Kirby, Sherris y Tuck recomendaron el Agar de Mueler Hinton para
llevar a cabo las pruebas de susceptibilidad a antibióticos, utilizando un solo disco impregnado con una
alta concentración de un antimicrobiano. El Agar Mueller Hinton cumple con los requerimientos de la
Organización Mundial de la Salud y está especificado en la FDA. Este medio es el seleccionado por la
NCCLS (National Commitee for Clinical Laboratory Standards) para realizar las pruebas de
susceptibilidad, por su alta reproducibilidad, su bajo contenido de substancias inhibidoras y el
crecimiento satisfactorio que presentan la mayoría de los patógenos no fastidiosos. Con este medio se
han llevado a cabo una gran cantidad de estudios sobre susceptibilidad antimicrobiana.
En este medio, la infusión de carne y la peptona de caseína proveen la fuente de nitrógeno, vitaminas,
carbón y aminoácidos. El almidón es agregado para absorber cualquier metabolito tóxico y el agar es
adicionado como agente solidificante.
Método de preparación de Agar Muller Hinton marca Bioxon (Anexo VIII).
Suspender 38 g del polvo en un litro de agua purificada. Mezclar perfectamente, calentar con agitación
frecuente y hervir durante un minuto hasta disolución completa. Esterilizar a 121°C durante 15 minutos.
Enfriar a 40-45°C y si se desea pueden prepararse placas o tubos de Agar Chocolate agregar sangre
estéril. La mezcla con Sangre debe achocolatarse calentándose a 80°C durante 10 minutos. No
sobrecalentar.
Método de preparación de Agar Muller Hinton marca MCD (Anexo IX).
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Fecha de modificación:25/03/2015
Suspender 38 g del medio en 1 litro de agua purificada. Calentar con agitación suave hasta completa
disolución del polvo y hervir durante 1 minuto. Esterilizar en autoclave a 121°C (15 libras de presión)
durante 15 minutos. Para obtener desarrollo de Neiserias enfriar a una temperatura entre 45-50°C y
agregar sangre debe achocolatarse calentando a 80°C durante 10 minutos. No sobrecalentar. Vaciar
en placas de Petri estériles.
Una vez gelificado el Agar Mueller Hinton se meterá a prueba de esterilidad en la estufa bacteriológica
por 24 hrs a 37°C. Transcurridos las 24 hrs sacarlos de la estufa y revisar si no están contaminados.
Las cajas se etiquetaran con la abreviatura del medio, número de lote, fecha de elaboración y fecha de
caducidad.
Se recomienda probar el desarrollo microbiológico con cepas control.
REACCIONES E INTERPRETACIÓN
Crecimiento de colonias pequeñas o grandes y se observa la pigmentación de bacterias de
Pseudomonas aeruginosa y Serratia marcences.
AGAR DEXTROSA SABOURAUD (ADexS)
Fórmula
Dextrosa
40.0 g
Peptona de Caseína
5.0 g
Digerido Pancreático de 5.0 g
Tejido Animal
Agar Bacteriológico
15.0 g
pH
5.6 ± 0.2
PROPÓSITOS Y COMPONENTES DIFERENCIALES
Este medio es utilizado para el cultivo de hongos patógenos, particularmente de aquellos asociados
con infecciones de piel. La alta concentración de dextrosa y la acidez del pH hacen a éste un medio
selectivo para hongos. Con la adición de cicloheximida, estreptomicina y penicilina, se obtiene un
excelente medio para el aislamiento primario de dermatofitos. En este medio las peptonas proveen la
fuente de carbono y nitrógeno para el crecimiento de los microorganismos, la dextrosa actúa como
fuente de energía y el agar es agregado como agente solidificante.
Preparar el medio según instrucciones del fabricante (Anexo VI y Anexo VII).
REACCIONES E INTERPRETACIÓN
En las muestras positivas se observa el crecimiento de hongos y levaduras con su morfología colonial
típica o confluencia de colonias.
Método de preparación de Agar Dextrosa Sabouraud marca Bioxon (Anexo VI).
Disolver 65 g del medio deshidratado en un litro de agua destilada, remojar de 10 a 15 minutos,
mezclar bien hasta que se obtenga una suspensión uniforme. Calentar agitando frecuentemente y
hervir durante 1 minuto. Distribuir y esterilizar a 118-121°C durante 15 minutos.
Método de preparación de Agar Dextrosa Sabouraud marca MCD (Anexo VII).
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Suspender 65 g del medio en 1 litro de agua purificada. Calentar con agitación suave hasta completa
disolución del polvo y hervir durante 1 minuto. Evitar el sobrecalentamiento. Esterilizar en autoclave a
121°C (15 libras de presión) durante 15 minutos. Enfriar a una temperatura entre 45-50°C y vaciar en
placas de Petri estériles.
Una vez gelificado el Agar Dextrosa Sabouraud se meterá a prueba de esterilidad en la estufa
bacteriológica por 24 hrs a 37°C. Transcurridos las 24 hrs sacarlos de la estufa y revisar si no están
contaminados.
Las cajas se etiquetaran con la abreviatura del medio, número de lote, fecha de elaboración y fecha de
caducidad.
Una vez gelificado el Agar de Sal y Manitol se meterá a prueba de esterilidad en la estufa
bacteriológica por 24 hrs a 35-38°C. Transcurridos las 24 hrs sacarlos de la estufa y revisar si no
están contaminados.
Las cajas se etiquetaran con la abreviatura del medio, número de lote, fecha de elaboración y fecha de
caducidad.
Se recomienda probar el desarrollo microbiológico con cepas control.
SISTEMA DE IDENTIFICACIÓN BACTERIOLÓGICA EN MINIATURA BD BBLTM CRYSTALTM
Purificar las cepa sospechosa de ser patógena según el tracto que sea analizado.- En el medio donde
este la cepa sospechosa de ser patógena, tocar con una asa recta una sola colonia y hacer un tapete,
luego incubar a 35-37°C durante 24hrs.
1.- Saque las tapas de la bolsa. Deseche el secante. Una vez sacadas de la bolsa, las tapas cubiertas
deben utilizarse en el plazo de 1 hora. No utilice el panel si no hay secante en la bolsa. Vea la Fig. A.
2.- Tome un tubo de inoculo y etiquételo con el número de muestra del paciente. Utilizando una técnica
aséptica, con la punta de una torunda estéril de algodón (no utilice una torunda de poliéster) o una
varilla con aplicador de madera o un asa de cultivo estéril de plástico.
Para los patógenos entéricos/no fermentadores suspender una colonia grande bien aislada (con un
diámetro de 2 a 3 mm o mayor) o de 4 a 5 colonias más pequeñas de la misma morfología de una
placa de sangre. El uso de una placa Agar Mac Conkey es también aceptable.
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Fecha de emisión: 5/Enero/2009
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Para los patógenos positivos suspender las colonias en un tubo BBL cristal RGP hasta tener una
turbidez de estándar No 2 de McFarland. Si se pasa la concentración del inoculo del No 2 de
McFarland se recomienda lo siguiente:
a.- Preparar una nueva suspensión del inoculo equivalente al estándar No 2 de MacFarland.
b.- Si se tiene colonias disponibles, diluir el inoculo con un volumen mínimo (no exceder a 1 mL) con
solución salina estéril al 8.5% hasta el estándar 2 de McFarland.
3.-Suspenda las colonias en un tubo de fluido de inóculo BBL Crystalpara organismos entéricos/heces.
4.- Vuelva a tapar el tubo y agítelo durante aproximadamente 10-15 s.
5.- Tome una base y marque el número de muestra del paciente en la pared lateral.
6.- Vierta todo el contenido del fluido de inoculo en el área objetivo de la base. Vea la Fig. B.
7.- Sostenga la base con ambas manos y mueva el inoculo suavemente de un lado para otro a lo largo
de las pistas hasta que se hayan llenado todos los pocillos. Haga retroceder cualquier líquido sobrante
del área objetivo. Vea la Fig. C.
8.- Alinee la tapa de forma que el extremo marcado de la tapa esté en la parte superior del área
objetivo de la base. Vea la Fig. D.
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9.- Apriete hasta que perciba una ligera resistencia. Coloque el pulgar en el borde de la tapa hacia la
parte media del panel en cada lado y apriete simultáneamente hasta que la tapa encaje en su lugar
(tiene que escuchar dos clics). Vea la Fig. E.
10.-Incubar el panel de 35 a 37°C en las muestras. Vea la Fig F.
Encender el interruptor
El interruptor está localizado en la parte posterior del lector.
I =Power ON
O =Power OFF
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Ciclo de calentamiento
Cuando este encendido el Autoreader BBL Crystal, el lector encenderá sus lámparas internas e iniciara
el ciclo de “calentamiento, durante10 minutos.
Si intenta abrir el cajón (la pantalla de introducción de datos) un mensaje de error aparecerá indicando
que el lector está calentando. El mensaje indicara el número de minutos y segundos que restan para
que el ciclo de calentamiento finalice. Si intenta explorar/leer el panel durante el proceso, un mensaje
de error aparecerá indicando que el lector se está calentando. El mensaje indicara el número de
minutos y segundos que faltan para completar el ciclo.
Después del ciclo de calentamiento, para abrir el programa se sigue la siguiente ruta:
Programas/BBL Crystal MIND, luego te va a pedir Nombre de usuario y contraseña.
Nombre de Usuario: BBLCrystal
Contraseña: BBL
Una vez que entramos al programa elegimos la pestaña panel de referencia para calibrar el
equipo.
Se proporciona un panel de referencia con el BBL Crystal Autoreader. El panel de referencia es
utilizado para verificar que el Autoreader este correctamente calibrado. Se recomienda que revise su
panel de referencia una vez por mes.
Control de calidad.
La prueba del control de calidad se recomienda para cada lote de paneles, en este caso se utiliza la
cepa Escherichia coli ATCC 25922 en paneles para patógenos entéricos/no fermentadores y para gran
positivos Staphylococcus aureus ATCC 29213.
Introducción de los paneles de los usuarios
Primero tenemos que elegir la pestaña introducción, luego nos saldrá una ventana para agregar
número de acceso (fecha que entro el estudio), ID del paciente (número de orden) y nombre del
paciente e inmediatamente se abrirá el Autoreader para colocar el panel, la tarjeta del panel debe
quedar enfrente de la tarjeta del Autoreader. Después le damos la opción de escaneo, añadir, ID y por
último revisión, buscamos el nombre del paciente y vemos la bacteria que identifico el equipo.
Nota: Si el equipo llegará a fallar se procesaría de forma manual. Para mayor información consultar el
manual sistema de identificación bacteriológica en miniatura BD BBLtm crystaltm.
También se llevará una bitácora de lector automático crystal F-FQUI-LAC-83, cada vez que se utilice el
equipo y la bitácora de mantenimiento y uso diario del lector automático bbl cristal con código F-QUILAC-94.
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PRUEBAS PARA IDENTIFICACION BACTERIANA DE FORMA MANUAL
BIOQUIMICAS PARA LA IDENTIFICACIÓN DE ENTEROBACTERIAS
Son bacilos Gram-negativos, anaerobios facultativos, oxidasa-negativa, catalasa-positiva, que
fermentan la glucosa y reducen los nitratos. Su identificación se basa en pruebas bioquímicas, que
pueden realizarse en una batería de tubos o utilizando un sistema comercial.
a) Prueba con agar hierro de kligler / agar de hierro triple azúcar (TSI): Mediante esta prueba
vamos a poder determinar:
- La capacidad de un microorganismo de fermentar un hidrato de carbono específico (en este caso
glucosa, lactosa y/o sacarosa) incorporado en un medio de crecimiento básico.
- Producción o no de gases: CO2 e H2 como productos finales del metabolismo de los hidratos de
carbono.
- Producción de ácido sulfhídrico (SH2).
El medio de Kligler contiene como hidratos de carbono la glucosa y la lactosa.
Existe otro medio, el TSI, que posee un tercer hidrato de carbono, la sacarosa; los fundamentos
bioquímicos de ambos son los mismos, por lo que nos vamos a referir solamente al medio de Kligler.
Técnica:La inoculación del medio se realiza en picadura hasta unos 0.6 cm del fondo.
Esta distancia se debe respetar a fin de evitar la entrada de aire en la parte profunda y una alteración
en el medio anaerobio. Se retira el hilo por el mismo camino de entrada y, sin volver a cargar el hilo, se
siembra en estrías la superficie del pico de flauta.
Se incuban los tubos inoculados a 35-37º C durante 18-24 h. Es importante respetar estos tiempos de
incubación, ya que lecturas de menor o mayor incubación pueden dar resultados falsamente positivos
o negativos.
Lectura e interpretación de los resultados:
1) Utilización de los hidratos de carbono:
 Fermentación de la glucosa y no de la lactosa: pico alcalino (rojo) y fondo ácido (amarillo), K/A.
Ejemplo de no fermentadores de lactosa y sí de glucosa: Shigella, Proteus, Salmonella.
 Fermentación tanto de la glucosa como de la lactosa: Pico ácido (amarillo), fondo ácido (amarillo).
A/A. Ejemplos de microorganismos fermentadores de lactosa y glucosa son Escherichia coli,
Klebsiella y Enterobacter.
 No hay fermentación ni de glucosa ni de lactosa: Pico alcalino (rojo) y fondo alcalino (rojo). K/K. En
ausencia de fermentación de hidratos de carbono no se forman ácidos, y la utilización de las
peptonas con la consiguiente producción de grupos básicos hace que todo el medio aparezca de
color rojo. Las bacterias que producen este tipo de fermentación son conocidas como "no
fermentadoras" y es una importante indicación de que el microorganismo no pertenece a las
Enterobacterias. Ej.: Pseudomonas aeruginosa (bacilo no Enterobacteriaceae Gram (-).
2) Producción de gas:
Los gases producidos son el CO2 y el H2, productos finales del metabolismo de la glucosa. Se pueden
apreciar por la aparición de burbujas en la parte inferior del medio, por la producción de grietas en su
interior o incluso por la elevación del medio, que se separa del fondo.
3) Producción de ácido sulfhídrico (SH2):
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El sulfhídrico es incoloro y su presencia se detecta a través de la formación de sulfuro ferroso, que es
negro. Debido a que se requiere un medio ácido para que un microorganismo produzca sulfhídrico, un
fondo negro debe leerse como ácido aún cuando el color amarillo esté oscurecido por el precipitado
negro.
b) Producción de indol: Se siembra en agua de peptona. Incubar a 37°C, 24-48 horas. Añadir unas
gotas de reactivo de Kovac resbalando por la pared del tubo. En caso positivo aparece un anillo rojo en
la interfase. Esto es debido a la reacción con el indol producido por la bacteria a partir del triptófano.
c) Movilidad: Sembrar por picadura con asa recta en el medio MIO. Incubar a 37°C, 48 horas.
Observar si el crecimiento está sólo en la picadura o se extiende a los lados de ella. La baja
concentración de agar de este medio (3 por mil) permite que las bacterias lo invadan si son móviles.
d) Crecimiento en citrato: Sembrar en la superficie inclinada del medio de agar Citrato de Simmons.
Cultivar a 37°C, 24 horas. En caso positivo el medio vira de verde a color azul. El medio contiene
citrato sódico como única fuente de carbono. Las bacterias capaces de utilizarlo alcalinizan el medio, y
hacen virar el indicador azul de bromotimol, a la vez que muestran crecimiento en superficie.
e) Producción de ureasa: Sembrar en estría en la superficie inclinada del agar urea de Christensen.
Incubar a 37° C, 24 horas. En caso positivo aparece color rojo cereza. Es debido a la alcalinización del
medio por producción de amonio a partir de la urea que contiene el medio, lo que hace virar el rojo de
fenol.
PRUEBA DE LA OXIDASA
FUNDAMENTO
Se investiga la presencia de la enzima citocromooxidasa en el microorganismo, la cual oxida al dimetilparafenilen-diamina (reactivo incoloro) dando un producto de color.
El sistema citocromooxidasa se encuentra, por lo general, en microorganismos aerobios.
REACTIVOS
Dimetil-p-fenilendiamina o tetrametil-p-fenilendiamina impregnado sobre tiras o discos de papel de
filtro.
TÉCNICA
1. Colocar una tira o disco impregnado de reactivo en un portaobjetos.
2. Tomar una colonia con el asa y depositarla sobre la tira o disco.
LECTURA E INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS
La aparición de un color azul oscuro indica la existencia del enzima citocromooxidasa (prueba
positiva).
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PRECAUCIONES
 Proteger el reactivo de la luz ya que se altera con ella.
 Guardar en frío.
 Los medios que contienen colorantes pueden interferir la reacción.
 Algunas asas de cultivo metálicas pueden interferir la reacción. Se ha comprobado que la
presencia de un simple vestigio de hierro puede por sí solo catalizar la oxidación del reactivo,
dando una falsa reacción positiva. Por ello deben utilizarse aplicadores de madera.
INTERÉS
Ayuda a la identificación de los géneros Pseudomonas (por lo general positivo) de las Enterobacterias
[-], entre otros.
PRUEBA DE LA CATALASA
FUNDAMENTO
Se investiga la presencia en el microorganismo de la enzima catalasa, capaz de descomponer el
peróxido de hidrógeno o agua oxigenada (H2O2) en H2O y O2, que se desprende en forma de burbujas
en el medio. El H2O2 se forma como un producto terminal oxidativo de la descomposición aeróbica de
los azúcares; si se acumulara sería tóxica para la bacteria.
REACTIVO
H2O2 de 100 volúmenes (30%).
TÉCNICA
Con un asa o hilo de inoculación, recoger el centro de una colonia pura de 18-24h, y colocarla sobre
un portaobjetos limpio. A continuación agregar una gota de agua oxigenada de 100 volúmenes sobre
el microorganismo del portaobjetos.
No invertir el orden del método pues pueden registrarse falsos positivos especialmente si se utilizan
hilos o asas que contengan hierro. Si se están utilizando asas o hilos de platino también se puede caer
en este error ya que el platino puede producir un resultado falsamente positivo. No es necesaria la
mezcla del cultivo y el agua oxigenada con la aguja o el asa de inoculación.
Si el microorganismo es catalasa [+] se observará de inmediato la aparición de burbujas (liberación de
gas).
PRECAUCIONES
 Se debe evitar la utilización de agar-sangre como medio de cultivo ya que los eritrocitos contienen
la enzima catalasa y podemos obtener falsos positivos.
 No se deben usar cultivos excesivamente viejos, ya que con el tiempo pueden perder la actividad
catalásica, pudiéndose obtener falsos resultados negativos.
 No utilizar asas o hilos de platino, ni que contengan vestigios de hierro.
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INTERÉS
Diferenciación de los géneros:
- Streptococcus [-] y Staphylococcus [+]
PRUEBA DE LA COAGULASA
Se pretende comprobar la facultad de un microorganismo de coagular el plasma por acción de la
enzima coagulasa. La coagulasa se puede encontrar en dos formas: libre y fija o ligada (unida a la
pared bacteriana).
La coagulasa es una enzima con actividad semejante a la protrombina, capaz de transformar el
fibrinógeno en fibrina, provocando la formación de un coágulo visible.
TÉCNICA
Se pueden seguir dos tipos de técnicas:
1.- Prueba del portaobjetos: pone de manifiesto la coagulasa ligada:
Colocar una gota de agua destilada o solución salina fisiológica estéril sobre un portaobjetos.
Emulsionar suavemente una gota de suspensión del microorganismo en estudio de 24 horas en un
caldo enriquecido (Ej.: BHI) en la gota de agua, utilizando un asa o una varilla. La prueba puede
hacerse también partiendo directamente de una colonia obtenida en una placa de aislamiento.
Añadir una gota del plasma y mezclar bien.
Inclinar el portaobjetos hacia uno y otro lado.
2.- Prueba en tubo: pone de manifiesto la coagulasa ligada y la libre:
Añadir asépticamente 0,5 ml de plasma a 0,5 ml de un cultivo puro de 18 a 24 h. en un caldo
enriquecido.
Mezclar por rotación suave del tubo, evitando agitar el contenido.
Incubar a 37º C, preferiblemente en un baño de agua, observando periódicamente el tubo.
LECTURA E INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS:
1.- Prueba en portaobjetos: una reacción positiva se detecta en 15 a 20 segundos por la formación
de grumos blancos. La prueba se considera negativa si no se observa aglutinación en 2 a 3 minutos.
Todos los resultados negativos deben verificarse mediante la prueba en tubos debido a que algunas
cepas de Staphylococcus aureus producen coagulasa libre que no reacciona en la prueba en
portaobjetos.
2.- Prueba en tubo: La reacción se considera positiva ante cualquier grado de coagulación visible
dentro del tubo. La reacción se observa mejor inclinando el tubo. Si es positiva, el coágulo permanece
en el fondo del tubo.
Reacción negativa: ausencia de coágulo tras 24-48 horas de incubación.
INTERÉS
Se utiliza de manera específica para diferenciar Staphylococcus aureus (coagulasa positivo) de otras
especies de Staphylococcus.
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SUSCEPTIBILIDAD A OPTOQUINA
Se determina la sensibilidad de un microorganismo a la optoquina.
Medio de cultivo: agar sangre
Reactivo: discos impregnados de optoquina.
TÉCNICA
Sembrar masivamente una colonia del microorganismo a investigar sobre una placa de agar sangre y
colocar en la superficie de la placa los discos de optoquina. Incubar a 37º durante 24 horas.
LECTURA E INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS
En caso de que el microorganismo sea sensible a la optoquina, se observa un halo de inhibición
alrededor del disco.
INTERÉS
Diferenciar Streptococcus pneumoniae (sensible) de otras especies de
Streptococcus alfahemolíticos (resistentes).
SUSCEPTIBILIDAD A BACITRACINA
Se determina la sensibilidad de un microorganismo a la bacitracina.
Medio de cultivo: placas con agar sangre.
Reactivo: discos impregnados con bacitracina.
TÉCNICA
Sembrar masivamente una colonia del microorganismo a investigar en una placa de agar sangre y
colocar sobre la placa los discos de bacitracina.
Incubar a 37º durante 24 horas.
LECTURA E INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS
Una zona de inhibición del crecimiento alrededor del disco, aunque sea pequeña, indicará la
sensibilidad.
INTERÉS
Diferenciar Streptococcus pyogenes (grupo A de Lancefield), sensible a la bacitracina, de otras
especies de Streptococcus beta-hemolíticos (grupos B,C, D, F, G) que son resistentes.
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SUSCEPTIBILIDAD A ANTIBIOTICOS
ANTIBIOGRAMA DE DIFUSIÓN SEGÚN KIRBY-BAUER
Se basa en la formación en el gel de agar de un gradiente de concentración de antibiótico a partir de
un disco impregnado con una determinada cantidad. Al crecer las bacterias inoculadas previamente
sobre la superficie de la placa se forman halos de inhibición alrededor de los discos, que define la zona
en la que la concentración de antibiótico es mayor que la CMI. Por lo tanto, su diámetro está
directamente relacionado con la CMI del antibiótico, y permite determinar la sensibilidad o resistencia
siempre que se respeten una serie de parámetros: espesor del medio en la placa, su composición,
inóculo bacteriano y tiempo de incubación, principalmente. No puede utilizarse para bacterias de
crecimiento lento (> 24 h), porque desaparece el gradiente de concentraciones
MATERIAL
Una placa con agar Mueller-Hinton.
Hisopo o pipeta Pasteur.
Pinzas.
Multidiscos grampositivo II BIO-RAD
CF
cefalotina
LEV
levofloxacina
E
eritromicina
AM
ampicilina
TE
tetracilina
SXT
trimetoprim-sulfametoxazol
CTX
cefotaxima
GE
gentamicina
CXM
cefuroxima
FEP
cefepime
DC
dicloxacilina
PE
penicilina
Antibióticos adicionales para bacterias grampositivas
NET
netilmicina
RA
rifampincina
AMC
amoxacilina con acido clavulánico
Multidiscos gramnegativos II BIO-RAD.
AK
amikacina
AM
ampicilina
LEV
levofloxacina
CF
cefalotina
CTX
cefotaxima
CRO
ceftriaxona
CL
cloranfenicol
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GE
NET
NF
FEP
SXT
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Código: I-FQUI-LAC-07
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Fecha de emisión: 5/Enero/2009
Fecha de modificación:25/03/2015
gentamicina
netilmicina
nitrofurantoína
cefepime
trimetoprim- sulfametoxazol
Antibiótico adicional para bacterias gramnegativas
AMC
amoxacilina con acido clavulánico
TÉCNICA
1.-Impregnar una torunda con la suspensión del inóculo; escurrirla contra la pared del tubo y sembrar
con ella toda la superficie de la placa, mediante estrías cruzadas en varias direcciones. Antes de 15
minutos deben colocarse los discos de antibióticos.
2.-Con pinzas flameadas y frías (o con un aplicador automático) se disponen los discos sobre las
placas, adherir cada disco al agar presionando ligeramente con las pinzas.
A los 15 minutos se llevan a incubar, invertidas, a 35-37º C.
LECTURA
1.-Se puede realizar la lectura dentro de las 16-24 horas.
2.-Medir los halos con calibrador o regla graduada, considerando la zona que está libre de crecimiento.
En caso de bacteriostáticos es aceptable un ligero velo dentro del halo. La presencia de colonias en el
interior del halo indica contaminación, cultivo mixto o aparición de resistencia.
3.-Si un antibiótico presenta una inhibición total de la bacteria y el antibiótico que se encuentra a su
lado también tiene inhibición, no permitiendo poder medir el halo de inhibición se puede reportar en la
bitácora (F-FQUI-LAC-49) con un signo (-) y en el formato de CULTIVOS (F-FQUI-LAC-11) se
reportaría como sensible.
4.-Reportar los resultados en la bitácora (F-FQUI-LAC-49) y transcribirlos en el formato de CULTIVOS
(F-FQUI-LAC-11).
F-DGPLANEI-CC/GA-39/REV:01
Instructivo para el procesamiento de muestras del área de Microbiología
Página: 33 de 58
Código: I-FQUI-LAC-07
Revisión: 11
Fecha de emisión: 5/Enero/2009
Fecha de modificación:25/03/2015
Esquemas de Identificación
Agar Sangre
α hemólisis
Catalasa –
Oxidasa Gram cocos +
β hemólisis
Catalasa –
Oxidasa Gram cocos +
Catalasa +
Oxidasa Gram cocos +
Catalasa +
Oxidasa Gram cocos +
Catalasa +
Oxidasa +
Gram cocos +
Catalasa +
Oxidasa +
Gram cocos -
γ hemólisis
Catalasa +
Oxidasa Gram bacilos -
F-DGPLANEI-CC/GA-39/REV:01
Instructivo para el procesamiento de muestras del área de Microbiología
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Código: I-FQUI-LAC-07
Revisión: 11
Fecha de emisión: 5/Enero/2009
Fecha de modificación:25/03/2015
Agar Sangre con α hemólisis
Catalasa Oxidasa Gram cocos +
Streptococcus α hemolítico
Para llegar a la especie
tabla 1
Agar Sangre con β hemólisis
Catalasa +
Oxidasa Gram cocos +
Staphylococcus spp.
Para llegar a la especie
tabla de identificación
correspondiente.
Agar Sangre con β hemólisis
Catalasa Oxidasa Gram cocos +
Streptococcus β hemolítico
Para llegar a la especie
tabla 1
Agar Sangre con γ hemólisis
Catalasa +
Oxidasa Gram cocos +
Staphylococcus spp.
Para llegar a la especie
tabla de identificación
correspondiente.
F-DGPLANEI-CC/GA-39/REV:01
Instructivo para el procesamiento de muestras del área de Microbiología
Página: 35 de 58
Código: I-FQUI-LAC-07
Revisión: 11
Fecha de emisión: 5/Enero/2009
Fecha de modificación:25/03/2015
Agar Sangre con γ hemólisis
Catalasa +
Oxidasa +
Gram cocos +
Agar Sangre con γ hemólisis
Catalasa +
Oxidasa +
Gram cocos -
Moraxella spp., Neisseria spp
Macrococcus spp., Micrococcus spp. y
algunas especies de Staphylococcus
spp., según la tabla 2
Para llegar a la especie
tabla de identificación
correspondiente.
Agar Sangre con γ hemólisis
Catalasa +
Oxidasa Gram bacilos -
Familia Enterobacteriaceae
Para llegar a la especie
tabla de identificación
correspondiente.
Agar Sangre con α hemólisis
Catalasa Oxidasa Gram bacilos +
Bacilos α hemolíticos
Para llegar a la especie
tabla de identificación
correspondiente.
F-DGPLANEI-CC/GA-39/REV:01
Instructivo para el procesamiento de muestras del área de Microbiología
Página: 36 de 58
Código: I-FQUI-LAC-07
Revisión: 11
Fecha de emisión: 5/Enero/2009
Fecha de modificación:25/03/2015
Agar Mac Conkey
Lactosa +
Lactosa -
Bioquímicas
Bioquímicas
Identificación con la
tabla de
Enterobacterias
Identificación con la
tabla de
Enterobacterias
Agar de Sal y Manitol
Fermentan el manitol
No fermentan el
manitol
Coagulasa +
Coagulasa -
Tabla de identificación de
Staphylococcus
Tabla de identificación de
Staphylococcus
F-DGPLANEI-CC/GA-39/REV:01
Instructivo para el procesamiento de muestras del área de Microbiología
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Código: I-FQUI-LAC-07
Revisión: 11
Fecha de emisión: 5/Enero/2009
Fecha de modificación:25/03/2015
Tabla 1 Criterios fenotípicos para la identificación presuntiva de Streptococcus y
Enterococcus de importancia clínica.
Microorganism
os Hem Ba
ólisis c Streptococcus β del grupoA Streptococcus Β,nin
del grupo B guna Streptococcus β de los grupos C, F y G. Enterococcus α,β,ni
del grupo D ngun
a Streptococcus α,nin
del grupo D no guna Enterococcus. Streptococcus α,nin
viridans guna Streptococcus α pneumoniae (Neumococos) S Prue
X
ba T de CA
MP Hidrólis
is de Hipurat
o LAP
PY
R Bilis Esculi
na Crecimient Opt Sol
o, en caldo oq ubil
con NaCl uin ida
al 6.5% a d de Bili
s _ R _ _ + + _ + + _ V R _ _ _ R _ S R R R _ + V S _ _ + _ _ R R _ V + + + + R _ R S _ _ + _ + _ R _ V S V + _ V _ R _ V S _ _ _ + _ ‐ _ S + Koneman 2008 pag (683)
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Instructivo para el procesamiento de muestras del área de Microbiología
Página: 38 de 58
Código: I-FQUI-LAC-07
Revisión: 11
Fecha de emisión: 5/Enero/2009
Fecha de modificación:25/03/2015
Tabla 2.-Características fenotípicas para la diferenciación de Micrococcus,
Macrococcus y Staphylococcus
Características Micrococcus y especies relacionadas Macrococcus Staphylococcus Tamaño de la colonia 1‐1.8µm 1.3‐2.5 µm 0.6‐1.5 µm Forma de la colonia Convexa Velocidad de crecimiento Muy lento Poco convexa, abovedada Lento Elevada, poco convexa Lento a rápido Producción de ácido a partir de glucosa en condiciones anaerobias ‐ ‐ + Lisostafina R S S Producción de ácido a partir de glicerol en aerobiosis en presencia de 0.4µg/mL de eritromicina. Sensibilidad a la furazolidona (disco de 100 µg/mL de furazolidona) Sensibilidad a la bacitracina (disco Taxo A de 0.04 unidades) Prueba de la oxidasa modificada ‐ ND + R S S S R R + + ‐b ND.- datos no disponibles, b todas las especies de de Staphylococcus son oxidasa modificada negativa
excepto las cepas de (S. sciuri, S. lentus y S. Kocuria).
Koneman 2008 pag (613)
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Fecha de modificación:25/03/2015
Tablas de identificación adicionales
Página
Referencia
Enterobacterias
Microorganismo
226
Koneman,2008
Especies de Shigella
242
Koneman,2008
Especies de Salmonella
244
Koneman,2008
Especies de Yersinia
259
Koneman,2008
Especies de Pseudomonas
303
Koneman,2008
Especies de Klebsiella
251
Koneman,2008
Especies de Proteus
256
Koneman,2008
Especies de
Staphylococcus
Especies de Streptococcus
beta hemolíticos.
Enterococcus faecalis.
619
Koneman,2008
687
Koneman,2008
699
Koneman,2008
Especies de Neisseria y
Moraxella
Especies de Haemophilus
572-573
Koneman,2008
424
Koneman,2008
Identificación de levaduras
1164
Koneman,2008
1119-1164
Koneman,2008
Identificación de la
morfología de los hongos
filamentosos
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Instructivo para el procesamiento de muestras del área de Microbiología
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Código: I-FQUI-LAC-07
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Fecha de emisión: 5/Enero/2009
Fecha de modificación:25/03/2015
Tabla 3 Diámetro de halo de inhibición en mm
Antibióticos
Microorganismos
Concentración
Amikacina
Ampicilina
Enterobacterias
Enterobacterias
Estafilococo spp.
Enterococcus spp.
Estreptococo spp.
Enterobacterias
Pseudomonas
aeruginosa
Enterobacterias
Enterobacterias
Enterobacterias
Enterobacterias
Enterobacterias
Enterobacterias
Enterobacterias
Estafilococo spp.
Enterobacterias
Estafilococo spp.
Enterobacterias
Enterobacterias
Enterobacterias
Enterobacterias
30µg
10µg
Carbenecilina
Cefalotina
Cefepime
Cefotaxima
Ceftazidima
Ceftriaxona
Cefuroxima
Cloranfenicol
Dicloxacilina
Enoxacina
Eritromicina
Gentamicina
Levofloxacina
Netilmicina
Nitrofurantoína
Pefloxacina
Penicilina
Ampicilina
Tetraciclina
TrimetoprimSultametoxazol
Estafilococo spp.
Enterococcus spp.
N. Gonorrhoea spp.
Streptococcus spp.
Enterobacterias
100 µg
30µg
30µg
30µg
30µg
30µg
30µg
30µg
1 µg
10µg
10µg
10µg
5µg
30µg
303 µg
5µg
10U
10 µg
30µg
25 µg
Resistente
(R)
≤14
≤13
≤28
≤16
≤19
≤13
Intermedio
( I)
15-16
14-16
20-22
14-16
Sensible
( S)
≥17
≥17
≥29
≥17
≥23
≥17
≤14
≤14
≤14
≤14
≤13
≤14
≤12
≤10
≤14
≤13
≤12
≤13
≤12
≤14
≤14
15-17
15-17
15-22
15-17
14-20
15-22
13-17
11-12
15-17
14-22
13-14
14-16
13-14
15-16
15-22
≥18
≥18
≥23
≥18
≥21
≥23
≥18
≥13
≥18
≥23
≥15
≥17
≥15
≥17
≥23
≤28
≤14
≤26
≤14
≤10
27-46
15-18
11-15
≥29
≥15
≥47
≥24
≥19
≥16
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Instructivo para el procesamiento de muestras del área de Microbiología
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Antibiótico
Microorganismo
Concentración
Rifampin
Estafilococo spp.
Estreptococo
pneumoniae
Enterococo spp.
Haemophilus spp.
Neisseria
meningitidis
Amoxicilinclavulanin
acid
Netilmicin
R= Resistente
Página: 41 de 58
Código: I-FQUI-LAC-07
5µg
5µg
Resistente
(R)
≤16
≤16
Intermedio
(I)
17-19
17-18
Sensible
(S)
≥20
≥19
5µg
5µg
5µg
≤16
≤16
≤19
17-19
17-19
20-24
≥20
≥20
≥25
Enterobacterias
20/10 µg
≤13
14-17
≥18
Estafilococo spp.
Haemophilus spp.
20/10 µg
20/10 µg
≤19
≤19
-
≥20
≥20
Enterobacterias
No
enterobacterias
Estafilococo spp.
30 µg
30 µg
≤12
≤12
13-14
13-14
≥15
≥15
30 µg
≤12
13-14
≥15
I= Intermedio
S= Sensible
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CEPAS DE REFERENCIA
Las cepas de referencia se sembraran una vez al mes para mantenerlas viables, se taparan y sellaran
los recipientes, estos estarán marcados con el nombre de la muestra, fecha de almacenaje y el
nombre quién lo almacena de acuerdo al reglamento de seguridad e higiene de los laboratorios de la
Facultad de Química de la UADY.
Cepas
Staphylococcus epidermidis
Escherichia coli.
Escherichia coli.
Streptococcus agalactiae
Streptococcus pyogenes
Streptococcus pneumoniae
Yersinia enterocolítica
Pseudomonas aeruginosa
Salmonella entérica subsp. Entérica
serovarTyphimurium
Shigella flexneri
Shigella sonnei
Shigella boydii
Staphylococcus aureus subsp aureus
Staphylococcus saprophyticus
Enterococcus faecalis
Neisseria gonorrhoeae
Candida albicans
Trichophytum mentagrophytes
Trichophytum tonsurans
Número de ATCC
12228
25922
11775
12386
12344
49619
23715
27853
14028
12022
25931
9207
29213
BAA-750
19433
19424
10231
9533
28942
Al finalizar el análisis de la muestra eliminar guantes, agujas, material biológico (cepas) en bolsas y
recipientes especiales según la Bitácora del almacén temporal residuos peligrosos biológicos infecciosos
(RPBI) con código I-FQUI-LAC-10 de acuerdo a la norma oficial mexicana NOM-087-SEMARNAT-SSA12002.
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ANEXO 1 Asa calibrada de platino color negro de 0.01mL o asa calibrada de platino color rojo de
0.001mL.
ANEXO II Instrucciones del fabricante para la preparación del Agar Mac Conkey de la marca Bioxon.
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Instructivo para el procesamiento de muestras del área de Microbiología
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ANEXO III Instrucciones del fabricante para la preparación del Agar Mac Conkey de la marca MCD.
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Instructivo para el procesamiento de muestras del área de Microbiología
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ANEXO IV Instrucciones del fabricante para la preparación del Agar de Sal y Manitol de la marca
Bioxon.
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ANEXO V Instrucciones del fabricante para la preparación del Agar de Sal y Manitol de la marca MCD.
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ANEXO VI Instrucciones del fabricante para la preparación del Agar Dextrosa Sabouraud de la marca
Bioxon.
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ANEXO VII Instrucciones del fabricante para la preparación del Agar Dextrosa Sabouraud de la marca
MCD.
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Instructivo para el procesamiento de muestras del área de Microbiología
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ANEXO VIII Instrucciones del fabricante para la preparación del Agar Mueller Hinton de la marca
Bioxon.
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ANEXO IX Instrucciones del fabricante para la preparación del Agar Mueller Hinton de la marca MCD.
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F-DGPLANEI-CC/GA-39/REV:01
Instructivo para el procesamiento de muestras del área de Microbiología
Página: 52 de 58
Código: I-FQUI-LAC-07
Revisión: 11
Fecha de emisión: 5/Enero/2009
Fecha de modificación:25/03/2015
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antimicrobial disk susceptibility test. Approved standard
M2-A5.National Commitee for Clinical Laboratory Standards.Villanova, PA.
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23. Muller, L., 1923. Un nouveau milieu d´enrichissement, pour la recherche du bacille typhique et des
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Salmonellabacillen. Z. Hyg. Infektionskr.117 :26
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Pathol. Bacteriol. 54: 469-483.
26. United States Pharmacopeial Convention. 1995. The United States pharmacopeia, 23rd. ed. The
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27. Isenberg, H.D. (ed.). 1992. Clinical microbiology procedureshandbook. Vol.1. American Society for
Microbiology, Washington, D.C.
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gonococci and trichomonas. Brit. Med. J. 2:421-424
29. Stuart, R.D., S.R. Toshach, and Patsula. 1954. The problem of transport of specimens for culture of
gonococci. Can. J. Public Health 45: 73-83.
30. Stuart, R.D. 1946. The diagnosis and control of gonorrhea by bacteriological cultures.Glasgow, M.J.
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31. Stuart, R.D. 1959. Transport medium for specimens in public health bacteriology. Public Health
Reports. 74: 431-438.
32. Manual sistema de identificación bacteriológica en miniatura BD BBLtm crystaltm.
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Instructivo para el procesamiento de muestras del área de Microbiología
Página: 53 de 58
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Fecha de modificación:25/03/2015
4.- DOCUMENTOS DE REFERENCIA
Código
Nombre del documento
Lugar de almacenamiento
I-FQUI-LAC-10
Instructivo para el manejo de residuos peligrosos
biológicos infecciosos (RPBI)
N/A
Sistemas de identificación bacteriológica en miniatura
BD BBL TM Crystal TM
N/A
Norma Mexicana protección ambiental-Residuos
peligrosos biológico- infecciosos-clasificación y
especificaciones de manejo (NOM-087-SEMARNATSSA1-2002)
I-FQUI-LAC-01
Instructivo para la toma de muestras biológicas en el
laboratorio de análisis clínicos.
LACSC
Área de trabajo
LACSC
LACSC
5.- CONTROL DE REGISTROS
Identificación
Nombre del
registro
Lugar de
almacenamiento
Responsable de
su protección
Tiempo de
retención
Disposición de
los registros
Cultivos
Área de trabajo
Responsable de
área
1 año
Archivo muerto
F-FQUI-LAC-19
Formato para el
registro de
temperatura de
la estufa
Área de trabajo
Responsable de
área
1 año
Archivo muerto
F-FQUI-LAC-24
Formato para el
registro diario de
temperatura del
refrigerador
Área de trabajo
Responsable de
área
1 año
Archivo muerto
F-FQUI-LAC-48
Hoja estadística
de estudios
Área de trabajo
Responsable de
área
1 año
Archivo muerto
F-FQUI-LAC-49
Bitácora de
Microbiología
Área de trabajo
Responsable de
área
1 año
Archivo muerto
F-FQUI-LAC-52
Control y
Área de trabajo
Responsable de
1 año
Archivo muerto
F-FQUI-LAC-11
F-DGPLANEI-CC/GA-39/REV:01
Instructivo para el procesamiento de muestras del área de Microbiología
Revisión: 11
Fecha de emisión: 5/Enero/2009
Fecha de modificación:25/03/2015
Preservación de
Reactivos
F-FQUI-LAC-61
F-FQUI-LAC-82
F-FQUI-LAC-83
F-FQUI-LAC-87
F-QUI-LAC-94
Página: 54 de 58
Código: I-FQUI-LAC-07
área
Bitácora de uso
de autoclave
Área de trabajo
Responsable de
área
1 año
Archivo muerto
Bitácora de
relación de los
estudios
entregados por el
área de
microbiología
Área de trabajo
Responsable de
área
1 año
Archivo muerto
Bitácora de lector
automático
cristal.
Área de trabajo
1 año
Archivo muerto
1 año
Archivo muerto
1 año
Archivo muerto
Cuestionario de
toma de
muestras para
cultivos.
Bitácora de
mantenimiento y
uso diario del
lector automático
bbl cristal.
Área de recepción
Responsable de
área
Responsable de
recepción
Responsable de
área
Área de trabajo
6.- GLOSARIO
6.1 .- SIGLAS
UADY.- Universidad Autónoma de Yucatán.
LACSC.- Laboratorio de análisis clínicos de servicio a la comunidad.
RPBI.- Residuos peligrosos biológicos infecciosos.
AS.- AGAR SANGRE.
MC.- AGAR MAC CONKEY.
MSA.- AGAR DE SAL Y MANITOL.
Achoc.- AGAR CHOCOLATE.
ATM.- AGAR THAYER MARTIN.
ADexS.- AGAR DEXTROSA SABOURAUD.
SS.- AGAR SALMONELLA-SHIGELLA.
CHROMagar O.- CHROMagar ORIENTADOR
CF.- Cefalotina.
LEV.- Levofloxacina.
E.- Eritromicina.
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Código: I-FQUI-LAC-07
Revisión: 11
Fecha de emisión: 5/Enero/2009
Fecha de modificación:25/03/2015
AM.- Ampicilina.
TE.- Tetracilina.
SXT.-Trimetoprim-sulfametoxazol.
CTX.- Cefotaxima.
GE.- Gentamicina.
CXM.- Cefuroxima.
FEP.- Cefepime.
DC.- Dicloxacilina.
PE.- Penicilina.
NET.- Netilmicina.
RA.- Rifampincina.
AMC.- Amoxacilina con acido clavulánico.
BAAR.-Bacilo ácido-alcohol resistente.
6.2 .- DEFINICIONES
Exudado faríngeo.- Cultivo de faringe.
Urocultivo.- Cultivo de orina
Coprocultivo.- Cultivo de heces fecales
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Instructivo para el procesamiento de muestras del área de Microbiología
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Revisión: 11
Fecha de emisión: 5/Enero/2009
Fecha de modificación:25/03/2015
7.- CONTROL DE REVISIONES
Nivel de
revisión
Sección y/o página
1
4,5,6,8,9,10,
11,12,13.
27
01
31
34
02
10, 14, 16.
3
5, 6, 16, 17, 18.
04
05
Descripción de la modificación y mejora
La redacción del alcance.
En estas páginas se modificaron las técnicas
de las pruebas, para hacerlas de una forma
más específica.
En la página 27 se agregaron esquemas de
identificación para explicar el mecanismo de
clasificación de las bacterias de una manera
más clara.
En esta página se agregaron tablas de
identificación.
En la página 34 se agregó unas tablas para
medir el halo de inhibición en mm de los
antibiogramas.
Se agregaron las pruebas de hemocultivo,
bacterioscopía y examen microscópico para
hongos.
Se eliminó el directorio y el prefacio del
Instructivo.
Se agrego el sistema syslabs en el diagrama
del procesamiento de muestras
microbiológicas.
Se eliminaron los formatos,F-FQUI-LAC-12,
F-FQUI-LAC-13, F-FQUI-LAC-16,F-FQUILAC-63, F-FQUI-LAC-39, F-FQUI-LAC-38.
Se eliminó el diagrama del procesamiento de
muestras microbiológicas, políticas, medidas
de seguridad en el laboratorio y se agrego el
sistema de identificación bacteriológica en
Todo el documento. miniatura BD BBLTm crystaltm, se agrego la
bitácora de relación de los estudios
entregados por el área de microbiología FFQUI-LAC-82.
Fecha de
modificación
18-Junio-2009
16-Octubre-2009
13-Mayo-2011
12-Noviembre-2012
F-DGPLANEI-CC/GA-39/REV:01
Instructivo para el procesamiento de muestras del área de Microbiología
06
07
Página: 57 de 58
Código: I-FQUI-LAC-07
Revisión: 11
Fecha de emisión: 5/Enero/2009
Fecha de modificación:25/03/2015
Se modificó el nombre del responsable
sanitario y se agrego la bitácora de lector
automático crystal F-FQUI-LAC-83.
9 de Julio-2013
Cambio de Director de la Facultad de
1,4 ,7, 8, 10, 12, 13, Química, se agrego el cuestionario de toma
40 y 42.
de muestra para cultivos F-FQUI-LAC-87.
21-Agosto-2013
21, 40 y 42.
42
08
Se modificó el nombre del Responsable
Sanitario.
09
Se modificó el alcance.
Se cambió la manera de procesamiento de
las muestras bacteriológicas, primero se
realizará de manera manual y si
hubiera
alguna duda se realizaría la identificación con
1,2,3,4,5,6,7,8,9,10. el sistema de identificación bacteriológica en
miniatura BD BBL TM Crystal TM.
37
Se específico la manera como se mantienen
viables las cepas de referencia.
22
Se implemento la bitácora de mantenimiento
y uso diario del lector automático bbl cristal
F-FQUI-LAC-94, el Control y Preservación de
Reactivos F-FQUI-LAC-52 y el registro diario
de temperatura del refrigerador F-FQUI-LAC24
10
En la prueba de urocultivo, se identificó las
asas de platino calibradas de acuerdo a su
tamaño y color, además en el anexo 1 se
muestra la manera como se etiquetaron las
asas.
En los medios de cultivo que se preparan en
el laboratorio, se agregaron las instrucciones
del fabricante para su elaboración.
También se específico como se debe
identificar los medios preparados con:
abreviatura del medio, número de lote, fecha
de elaboración y fecha de caducidad.
5
16-18
39-46
12-Noviembre-2013
22-Agosto-2014
5-Octubre-2014
F-DGPLANEI-CC/GA-39/REV:01
Instructivo para el procesamiento de muestras del área de Microbiología
11
3
Página: 58 de 58
Código: I-FQUI-LAC-07
Revisión: 11
Fecha de emisión: 5/Enero/2009
Fecha de modificación:25/03/2015
Se especifico donde se debe mantener el
medio de transporte y cuanto tiempo.
Las instrucciones del fabricante para el
método de preparación de los medios de
cultivo, que están como imágenes se
transcribieron en el texto.
También se especifico las condiciones de
aceptación y rechazo de las muestras.
Se actualizo el instructivo con el nuevo
formato.
25/03/2015
Nota: Ésta sección será utilizada a partir de la primera modificación a este documento. La revisión 00, se
mantendrá en blanco.
Elaboró
Revisó
Aprobó
M. en C. Claribel Huchin Chan
Responsable de Microbiología
M. en C. Gabriel Ángel Montero Lara
Responsable sanitario
Dra. Zulema Osiris Cantillo Ciau
Directora de la Facultad de Química
Las firmas avalan la responsabilidad de las personas que: elaboran el documento, revisan su
adecuación y aprueban para su implementación dentro del Sistema de Gestión de la Universidad
Autónoma de Yucatán.
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