UNIVERSIDAD MAYOR DE SAN SIMÓN
FACULTAD DE CIENCIAS FARMACÉUTICAS
Y BIOQUÍMICAS
DEPARTAMENTO DE POSTGRADO
COMPARACIÓN DE LA TÉCNICA PCR GP5+/GP6+bio – EIA CON LA TÉCNICA
INNO-LiPA GENOTYPING EXTRA PARA LA DETECCIÓN DE LOS VIRUS DEL
PAPILOMA HUMANO DE ALTO RIESGO EN CÉLULAS CERVICALES
TESIS PRESENTADA PARA OPTAR DEL GRADO ACADÉMICO
DE MAGISTER EN MICROBIOLOGÍA CLÍNICA
PRESENTADO POR: Lic. MARIA ISABEL GARCÍA SEJAS
TUTORES:
MSc. PATRICIA RODRIGUEZ HERBAS
PhD. ROSSE MARY YAÑEZ VILLANUEVA
Abril 2015
COCHABAMBA - BOLIVIA
DEDICATORIA
A DIOS quien me dio la fe, la
fortaleza, la salud y la esperanza
para terminar este trabajo, ya que
sin él nada podemos hacer.
“TODO LO PUEDO EN CRISTO
QUE ME FORTALECE”
FILIPENSES 4:13
i
AGRADECIMIENTOS
En primer lugar, quiero expresar mi más sincero agradecimiento al equipo de
profesionales del Proyecto de VPH de la Facultad de Medicina de la Universidad
Mayor de San Simón, a la cabeza de la Dra. Vèronique Fontaine, que me recibieron
con los brazos abiertos,
depositando su confianza en mí, al brindarme la gran
oportunidad de realizar el trabajo de investigación y el incalculable conocimiento que
me compartieron, espero haber respondido a sus expectativas y no haberlos
defraudado.
Hay tantas otras personas a las que tengo que agradecer por su apoyo incondicional
y espero no olvidarme de ninguna de ellas.
En primer lugar a mis tutores de tesis:

A la MSc. Patricia Rodríguez Herbas, por
trasmitirme día a día su
entusiasmo, su capacidad de trabajo y su saber, por que confió en mí, me
alentó en todo momento. Gracias por ofrecerme más de lo que pude haber
necesitado, por su colaboración, afecto y su inagotable paciencia que fueron
esenciales para batallar en la elaboración del trabajo y hacer posible la
culminación de este.

A la Dra. Rosse Mary Yañez Villanueva, agradecerle especialmente su gran
interés en apoyarme para lograr este paso en mi vida profesional aún pese a
las dificultades siempre supo cómo seguir adelante y al brindarme la
oportunidad de recurrir a su capacidad y experiencia ya que sus
observaciones y conocimientos que me ha compartido hicieron posible la
realización de este trabajo.
Al Dr. Jaime Barriga, tengo que agradecer por su gran colaboración y paciencia, en
la recolección de muestras para el desarrollo de este trabajo. Que durante este largo
camino apoyó desinteresadamente al Proyecto de VPH.
ii
A la Lic. Sandra Pacheco, por el inestimable asesoramiento en los análisis
estadísticos de los datos, por su ánimo constante, sus cálidos consejos y su infinita
paciencia con las interminables dudas que me bloqueaban de vez en cuando.
A mis tribunales: Dra. Zulema Bustamante, Dra. Marisol Córdova y Dra. Rosario
Manzur, estoy enormemente agradecida por su disposición en cuanto a tiempo y
consejos y en todo lo que he necesitado para corregir las sugerencias observadas.
A mi compañera Tania Vargas, por mantener la calma y la tranquilidad en momentos
difíciles durante este tiempo, por sus consejos en determinadas situaciones y por sus
ánimos en momentos de flaqueza y sobre todo por creer en mí.
A las personas que en el poco tiempo se convirtieron en amigas: Karina Ustariz, Yara
Rodríguez, que tanto me han ayudado en el conocimiento del VPH; a la Dra.
Benedicta Flores, Dra. Nair Montaño que nunca dejaron de motivarme moralmente.
A mi Madre y mi hermano por estar apoyándome siempre en todas las decisiones
que he tomado en mi vida. Una de ellas es este logro, pues sin saber muy bien que
era “eso”, que tanto hacia en mi cuarto, pero entendiendo lo importante que era para
mí, siempre han estado pendientes de mí.
A mis amigas Sorel, Sandra, Eli, Ros y Marcela que con sus merecidas palabras
diarias de: “¡¿Isa, ya está la tesis?!”, me dieron las fuerzas suficientes para poder
seguir adelante.
Y en última instancia, a todas las personas que han contribuido a que este trabajo
haya sido posible, quiero expresarles mi cariño y mi agradecimiento más sincero.
¡GRACIAS POR TODO!
iii
RESUMEN
La morbimortalidad por cáncer de cuello uterino (CACU) es elevada en muchos
países del mundo. Los principales agentes relacionados a esta enfermedad son una
gran variedad de genotipos del Virus del Papiloma Humano (VPH) de alto riesgo
(VPH-AR), siendo los más prevalentes en cáncer y en lesiones de alto grado los
VPH-AR 16 y 18. La identificación de la infección por VPH-AR es una herramienta útil
para el diagnóstico precoz de cáncer de cuello, y pueden complementarse con la
prueba de Papanicolaou (Pap), ya que ésta, aunque interpreta las diferentes lesiones
celulares del epitelio del cuello uterino, no puede detectar directamente el VPH.
Distintas técnicas de biología molecular son aplicadas para la detección del VPH,
para su aplicación en el tamizaje poblacional estas deben contrastarse y validarse.
Una de las técnicas ampliamente descrita y utilizada en diferentes países es la PCR
GP5+/GP6+bio -EIA. Con el objetivo de implementar este método para la detección de
los más importantes VPHs, nosotros la hemos comparado con la técnica de
hibridación reversa INNO-LiPA Genotyping Extra, una técnica muy reconocida que
permite la identificación de 28 genotipos de VPH.
La comparación de estas dos técnicas se realizó en muestras VPH positivas
procedentes de mujeres atendidas en el Hospital Materno Infantil Germán Urquidi
(HMIGU). La PCR GP5+/GP6+bio-EIA implementada en nuestro laboratorio se basa en
la detección de 15 diferentes genotipos, utilizando dos diferentes cocteles de
oligonucleótidos preparados en base a la prevalencia de los genotipos más
oncogénicos: VPH16/18 (cóctel1) y VPH31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68, 73
y 82 (cóctel 2). Estos dos cocteles
hibridan productos amplificados por PCR
GP5+/GP6+bio, que están fijados a pocillos de microplacas después de una
desnaturalización alcalina; estos híbridos formados son detectados luego por una
reacción enzimática.
Una primera comparación de los tres diferentes cebadores utilizados para detectar el
VPH amplificando la fracción L1 del ADN viral; PGMY09/11, SPF10 INNO-LiPA y
iv
PCR GP5+ /GP6+ bio, muestra que la PCR GP5+ /GP6+ bio presentó una proporción de
detección de ADN de VPH (positivos) más baja (85,7%) en comparación con los
cebadores SPF10 y PGMY09/11 (97,9% y 91,8% respectivamente), aunque estas
diferencias no fueron estadísticamente significativas (p = 0,67). La concordancia de
los resultados obtenidos por INNO-LiPA y la técnica de PCR GP5+/GP6+bio -EIA para
la detección de VPH-AR sin discriminar mono o múltiples infecciones fue “Regular”
(kappa = 0,3), esta concordancia mejoró cuando se trató de discriminar solo VPH
16/18 (kappa = 0,51). Interesantemente al realizar el mismo test para la detección de
los VPH 16/18 en muestras con mono-infecciones, el acuerdo es “Bueno” (kappa =
0,71).
Por tanto aunque la PCR GP5+/GP6+bio -EIA tiene algunos problemas para detectar
genotipos de VPH-AR sobre todo en multi-infecciones, esta técnica permite detectar
VPH-AR y sobre todo VPH 16 en muestras de mujeres con niveles de co-infección
bajos y con manifestación de lesiones de alto grado.
v
ABSTRACT
Morbidity and mortality from cervical cancer (CACU) is high in many countries. The
main agents related to this disease are a variety of genotypes of Human
Papillomavirus-High Risk (HPV-HR), the most prevalent cancer and high-grade
lesions are the HPV-HR 16 and 18. Identification of HPV-HR infection is a useful tool
for early diagnosis of cervical cancer, and can be complemented with the
Papanicolaou test (Pap test), although the Pap test can interpret the different
epithelial cell lesions of the cervix, it cannot directly detect the presence of HPV.
Different molecular biology techniques are applied for the detection of HPV, however
they need to be contrasted and validated for use in population screening. One of the
widely techniques described and used in different countries, is the PCR
GP5+/GP6+bio-EIA. In order to implement this method for the detection of the most
important HPVs, we have compared the reverse hybridization technique INNO-LiPA
Genotyping Extra, a well-known technique that allows the identification of 28 HPV
genotypes.
The comparison of these two techniques was performed in HPV positive samples
from women attending the “Hospital Materno Infantil German Urquidi” (HMIGU). The
PCR GP5+/GP6+bio-EIA implemented in our laboratory is based on the detection of 15
different genotypes, using two different cocktails of oligonucleotides prepared based
on the prevalence of oncogenic genotypes: HPV16 / 18 (cocktail 1) and HPV 31, 33,
35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68, 73 and 82 (cocktail 2). These two cocktails
hybridize products amplified by the PCR GP5+/GP6+bio, which are attached to multiwells microplate after alkaline denaturation; these hybrids formed are then detected
by an enzymatic reaction.
A first comparison of the three different primers used for amplifying fraction L1 of HPV
viral DNA; PGMY09/11, SPF10 INNO-LiPA and PCR GP5+/GP6+bio, shows that PCR
GP5+/GP6+bio presented a proportion of HPV DNA detection (positive) rate lower
(85,7%) compared with the SPF10 and PGMY09/11 primers (97,9% and 91,8%
vi
respectively), although these differences were not statistically significant (p = 0,67).
The concordance of the results obtained by INNO-LiPA and PCR GP5+/GP6+bio -EIA
for detection of HPV-HR without discriminating single or multiple infections was
"Regular" (kappa = 0,3), this agreement increased when it came to discriminate single
HPV 16/18 (kappa = 0,51). Interestingly when performing the same test for the
detection of HPV 16/18 in single infections, the agreement is "Good" (kappa = 0, 71).
Although the PCR GP5+/GP6+bio -EIA has some problems to detect genotypes of
HPV-HR especially in multi-infections, this technique can detect HPV-HR especially
HPV 16, in samples from women with low levels of co-infection and in high-grade
lesions.
vii
ÍNDICE GENERAL
DEDICATORIA ......................................................................................................... i
AGRADECIMIENTOS .............................................................................................. ii
RESUMEN .............................................................................................................. iv
ABSTRACT ............................................................................................................ vi
ÍNDICE GENERAL ............................................................................................... viii
ÍNDICE DE TABLAS ............................................................................................. xii
ÍNDICE DE FIGURAS ........................................................................................... xiii
ÍNDICE DE ANEXOS ............................................................................................ xvi
ABREVIACIONES ............................................................................................... xvii
I.
INTRODUCCIÓN ............................................................................................... 1
II. JUSTIFICACIÓN ............................................................................................... 3
III.
HIPOTESIS .................................................................................................... 3
IV.
OBJETIVOS ................................................................................................... 4
4.1.
Objetivo General ......................................................................................... 4
4.2.
Objetivos específicos .................................................................................. 4
V. MARCO TEÓRICO ............................................................................................ 5
5.1.
Generalidades cáncer de cuello uterino y el VPH ....................................... 5
5.2.
Características generales del virus del papiloma humano (VPH) ............... 7
5.3.
Tipos de VPH ............................................................................................ 10
5.4.
Ciclo viral del VPH .................................................................................... 10
5.5.
Transmisión de la infección del VPH ........................................................ 12
5.6.
Cofactores asociados a la infección por VPH ........................................... 12
5.6.1.
Cofactores exógenos.......................................................................... 13
5.6.2.
Cofactores virales ............................................................................... 14
5.6.3.
Cofactores del huésped...................................................................... 15
5.6.4.
Otros cofactores ................................................................................. 15
viii
5.7.
Patogénesis .............................................................................................. 15
5.8.
Oncogénesis por VPH............................................................................... 17
5.9.
Diagnóstico del cáncer y del virus del papiloma humano (VPH ................ 17
5.9.1. Clínica.................................................................................................... 17
5.9.2. Citología o Papanicolau .......................................................................... 18
5.9.3. Colposcopia ........................................................................................... 19
5.9.4. Inspección Visual con Ácido Acético (IVAA) .......................................... 20
5.9.5. Test de Schiller ...................................................................................... 21
5.9.6. Histopatológico ...................................................................................... 21
5.9.7. Métodos moleculares ............................................................................ 21
5.9.7.1. Métodos de detección del ADN - VPH ............................................ 22
5.9.8. Biomarcadores tumorales en el cáncer cervical .................................... 27
5.10. Tratamiento virus del papiloma humano ................................................... 29
5.10.1. Destructivos: ........................................................................................ 29
5.10.2. Escisionales ......................................................................................... 30
5.11. Prevención ................................................................................................ 32
5.11.1. Prevención primaria frente al cáncer de cuello de útero ...................... 32
5.11.2. Prevención secundaria del cáncer de cuello uterino ........................... 34
5.11.3. Prevención terciaria del cáncer de cuello uterino ................................ 34
VI.
MATERIALES Y MÈTODOS ....................................................................... 35
6.1.
ASPECTOS DEL ESTUDIO ..................................................................... 35
6.1.1. Tipo de estudio ...................................................................................... 35
6.1.2. Lugar de estudio .................................................................................... 35
6.1.3. Población de estudio ............................................................................. 35
6.1.4. Criterios de inclusión ............................................................................. 35
6.1.5. Criterios de exclusión ............................................................................ 35
6.1.6. Recolección de la muestra .................................................................. 36
6.1.7. Tipo de Muestreo ................................................................................... 36
6.2.
MATERIALES ........................................................................................... 36
6.3.
METODOLOGIA ....................................................................................... 37
ix
6.3.1. Extracción de ADN por el método de congelación-descongelación ..... 37
6.3.2. Amplificación de ADN por PCR ............................................................. 37
6.3.2.1. Verificación de la calidad del ADN extraído mediante la amplificación
del gen de la β-globina humana .................................................................. 37
6.3.2.2. Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) para la detección de
ADN del VPH por la PCR PGMY09/11........................................................ 38
6.3.2.3. Verificación y visualización del ADN en geles de agarosa por
electroforesis ................................................................................................ 39
6.3.3. Genotipificación de ADN........................................................................ 39
6.3.3.1. Genotipificación por INNO-LiPA Genotyping Extra ......................... 39
6.3.3.2. Genotipificación por PCR GP5+/GP6+bio- EIA (Reacción en Cadena
de la Polimerasa GP5+/GP6 +bio- Enzimo Inmuno ensayo)........................... 42
6.3.4. Método de análisis estadístico............................................................... 44
6.3.4.1. Prueba de proporciones de K muestras .......................................... 44
6.3.4.2. Índice de Kappa .............................................................................. 45
VII. RESULTADOS ................................................................................................ 47
7.1. Identificación de los diferentes genotipos de VPH-AR por el método de
Hibridación Reversa INNO-LiPA Genotyping Extra ............................................ 47
7.2. Determinación de los genotipos de VPH-AR más frecuentes en citologías
“sin lesiones intraepiteliales”, “LIE-B” y “LIE-A”, para la aplicación de los cocteles
de oligonucleótidos en la técnica PCR GP5+/GP6+bio –EIA. ................................ 50
7.3. Comparación de las técnicas de PCR PGMY09/11, SPF 10 INNO-LiPA y
PCR GP5+ /GP6+bio-EIA para la detección de ADN viral. .................................... 53
7.4. Evaluación de la capacidad de detección de genotipos de VPH-AR de la
técnica PCR GP5+/GP6+bio -EIA comparándola con la técnica de hibridación
reversa INNO-LiPA Genotyping Extra................................................................ 58
7.4.1. Concordancia entre INNO-LiPA vs PCR GP5+/GP6+bio- EIA en mono y
múltiples infecciones ....................................................................................... 59
VIII. DISCUSIÓN .................................................................................................... 62
8.1. Frecuencia de genotipos en la población de estudio ................................... 62
x
8.2. Análisis de la frecuencia de genotipos para la preparación de los cocteles 62
8.3. Capacidad de detección de ADN viral ......................................................... 64
8.4. Capacidad de detección de genotipos de VPH-AR de la técnica PCR
GP5+/GP6+bio - EIA. ............................................................................................. 65
IX. CONCLUSIONES ........................................................................................... 67
X. RECOMENDACIONES ................................................................................... 69
XI. BIBLIOGRAFÍA ............................................................................................... 70
XII. ANEXOS ......................................................................................................... 82
xi
ÍNDICE DE TABLAS
Tabla 1. Principales funciones de las proteínas de VPH………………………………...9
Tabla 2. Correlación entre tres clasificaciones diferentes de las lesiones del
cuello uterino……………………………………………………………………...19
Tabla 3. Recomendación sobre el acuerdo en base a los valores numéricos
de Kappa…………………………………………………………………………..46
Tabla 4. Tabla de Contingencia 2x2 de los resultados de detección del
VPH mediante la amplificación con cebadores: a) PGMY09/11 vs SPF10;
b) PGMY09/11 vs GP5+/GP6+bio-EIA, c) GP5+/GP6+ bio-EIA vs SPF10…….56
Tabla 5. Detección de ADN de VPH por PCR PGMY09/11, PCR GP5+ /GP6+bio
(PCR-EIA)……………………………………….…………………………………57
Tabla 6. Tabla de Contingencia 2x2 de los resultados de identificación de
VPH-AR obtenidos por INNO-LiPA vs PCR GP5+/GP6+bio – EIA………….58
Tabla 7. Tabla de Contingencia 2x2 de los resultados de identificación de
VPH 16/18 obtenidos por INNO-LiPA vs PCR GP5+/GP6+bio – EIA………..59
Tabla 8. Tabla de Contingencia 2x2 de los resultados de identificación de
VPH 16/18 obtenidos por INNO-LiPA vs PCR–EIA en mono-infecciones.60
Tabla 9. Tipos de VPH detectados por INNO-LiPA y PCR GP5+/GP6+bio-EIA
(Cóctel 1 y Cóctel 2)…………………….........................................................61
Tabla 10. Patrón para considerar como interpretables a las líneas
reactivas en la tira de INNO-LiPA……………….……………………………94
xii
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1. Los 10 tipos de VPH más frecuentes identificados en mujeres con
cáncer de cuello uterino en todo el mundo y en la región latinoamericana.6
Figura 2. Contribución relativa de los VPH s 16 y 18 al cáncer de cuello uterino
en los países latinoamericanos……………………………………………….7
Figura 3. Genoma del VPH lineado, Genes “E”, Genes “L” y LCR
“región de control larga”………………………………………………………..8
Figura 4. Proceso de infección del VPH………………………………………………..11
Figura 5. Cambios histológicos en las diferentes lesiones del cuello uterino,
Observado por colposcopia. ………………………………..………………..20
Figura 6. Localización de los diferentes sistemas de cebadores utilizados en la
detección por PCR del VPH……………………………………………….….23
Figura 7. a) Procedimiento de Vaporización con láser CO2 y b) Crioterapia……..30
Figura 8. a) Conización y b) Histerectomía…………………………………………….31
Figura 9. Protección mediana por Ac neutralizantes…………………………………33
Figura 10. Principio de INNO-LiPA Genotyping Extra, adaptado del folleto
de Innogenetics…….……….…………………………………………….…..41
Figura 11. Tiras de INNO-LiPA Genotyping Extra, después del proceso
de hibridación..………………………………………………………………..41
Figura 12. Principio de la técnica de EIA en placa Comercial (Streptavidin
coated microplates).….……………………………………………………….43
xiii
Figura 13. Placa Comercial (Streptavidin coated microplates) lista para leer
con el espectrofotómetro……………………………………………………..44
Figura 14. Frecuencia de genotipos de VPH en la población total estudiada……....48
Figura 15. Los diez tipos de VPH más frecuente entre las mujeres con y sin
lesiones cervicales en el mundo comparado con regiones no
desarrollados y desarrolladas.………………………………………….........49
Figura 16. a) Tipos de VPH más frecuentes en mujeres con resultado de citologías
sin lesiones intraepiteliales o citología normal (N=33) b) Representación
del rango de edades de las mujeres estudiadas…………………………..50
Figura 17. a) Tipos de VPH más frecuentes en mujeres con resultado de citologías
con lesiones de bajo grado (LIE- B; N=14) b) Representación del rango
de edades de las mujeres estudiadas………………………………..…….51
Figura 18. a) Tipos de VPH más frecuentes en mujeres con resultado de citologías
con lesiones de alto grado (LIE- A; N=12) b) Representación del rango
de edades de las mujeres estudiadas……………………………………...51
Figura 19. Electroforesis en gel de agarosa al 2% de los productos amplificados
por PCR de una fracción del gen de β-globina humana. Carriles 1y7,
Marcador de peso; carril 2, Control Positivo; Carriles 3, 4, 5, Muestras
y Carril 6 Control Negativo…………………………………………………..54
Figura 20. Electroforesis en gel de agarosa al 2% de los productos amplificados
por PCR con los cebadores PGMY09/11. Carril 1, Control Positivo;
Carriles 2, 3, 4, 5 Muestras; Carril 6, Control Negativo y Carril 7 Marcador
de peso…………………………………………………………………………54
Figura 21. Electroforesis en gel de agarosa al 2% de los productos amplificados
por PCR con los cebadores GP5+/GP6+bio. Carril 1 y 6, Controles
xiv
Positivos; Carriles 2, 3, 4, Muestras; Carril 5, Control Negativo y Carril 7,
Marcador de peso…………………………………………………………......55
Figura 22. A: Preparación del gel al 2%, B: Solución de Bromuro Etidio
BIO-RAD (10ng/ml), C: Cubeta de electroforesis horizontal
(Enduro GEL XL), D: Trans iluminador de luz UV………………………….87
Figura 23. A: Ubicación de las respectivas tiras, B: Aplicación de la solución de
hibridación, C: Incubación en el Baño María, D: Placa antes y después
del proceso de agitación, E: Proceso de stop F: Tiras después de todo
el proceso y listas para ser interpretadas……………………………………93
Figura 24. Gráfica para la Interpretación de los resultados suministrado por el kit
INNO-LiPA Genotyping Extra………………………………………………..95
Figura 25. A: Placa lista, B: Aplicación de SSC- Tween C: Numeración de muestras,
D: Adición de NaOH, E: Placa cubierta con parafilm, F: Adición del
cóctel 1………………………………………………………………………….99
Figura 26. A: Adición del cóctel 2, B: Adición del anticuerpo Monoclonal, C: Adición
del sustrato, D: Incubadora de 37°C, E: Proceso de incubación en cámara
húmeda, F: Espectrofotómetro……………………………………………..100
xv
ÍNDICE DE ANEXOS
ANEXO 1: Materiales……………………………………………………………………….82
ANEXO 2: Preparación de tampones………………………………………………….....85
ANEXO 3: Protocolo preparación de gel agarosa al 2%...........................................86
ANEXO 4: Protocolo preparación de bromuro de etidio…………………………….....87
ANEXO 5: Método extracción del ADN (congelación-descongelación)……….….….88
ANEXO 6: Cebadores para la amplificación de la PCR PGMY09/11………………...89
ANEXO 7: Procedimiento para INNO-LiPA Genotyping Extra.……..………………....90
ANEXO 8: Interpretación para la Técnica INNO-LiPA Genotyping Extra…………….94
ANEXO 9: Soluciones para la Técnica de EIA……………………………………….....96
ANEXO 10: Procedimiento para la Técnica de EIA…….………………………………97
ANEXO 11: Interpretación para la Técnica PCR GP5+/GP6+bio–EIA……...………...101
xvi
ABREVIACIONES
ADN: Ácido Desoxirribonucleico.
ARN: Ácido Ribonucleico.
ASC-US: Células Escamosas Atípicas de Significado Indeterminado.
ASC-H: Células Escamosas Atípicas, no puede excluirse una Lesión Intraepitelial
Escamosa de Alto Grado.
BCIP / NBT: Dimetilformamida, 4-nitroazul de Tetrazolio
CACU: Cáncer de Cuello Uterino.
CIN: Neoplasia Intraepitelial Cérvicouterina.
CIN 1: Neoplasia Intraepitelial Cérvicouterina Leve.
CIN 2: Neoplasia Intraepitelial Cérvicouterina Moderada.
CIN 3: Neoplasia Intraepitelial Cérvicouterina Severa.
E: Región temprana “Early”.
EDTA: Ácido etilen diamino tetra acético.
FDA: Administración de Alimentos y Drogas de los Estados Unidos.
H- SIL: Lesión epidermoide Intraepitelial de alto Grado.
HMIGU: Hospital Materno Infantil German Urquidi.
ICO: Information Centre on HPV and Cancer (HPV Information Centre)
L: Región tardía “Late”.
LIE – A: Lesiones Intraepiteliales de Alto Grado
xvii
LIE – B: Lesiones Intraepiteliales de Bajo Grado
L-SIL: Lesión epidermoide intrepitelial de bajo grado.
LCR: Región larga de Control.
OMS: Organización Mundial de la Salud.
OPS: Organización Panamericana de la Salud.
ORF: Open reading frame.
Pap: Papanicolaou.
Pb: Pares de Bases.
PBS: Buffer Fosfato Salino.
PCR: Reacción en Cadena de la Polimerasa.
PCR- EIA: Reacción en cadena de la polimerasa – Enzimo Inmuno Ensayo
Rpm: Revoluciones por Minuto.
SIL: Lesión Intraepitelial Escamosa.
SSC: Salino Sodium Citrato
TAE: Tris Acetato EDTA
TRIS: Hidroximetil amino metano.
TBS: Sistema Bethesda.
VIH: Virus de la Inmunodeficiencia Humana.
VLP: Partículas semejantes a Virus.
VPH: Virus del Papiloma Humano.
VPH-AR: Virus del Papiloma Humano Alto Riesgo.
xviii
VPH-BR: Virus del Papiloma Humano Bajo Riesgo.
WHO: World Health Organization
xix
I.
INTRODUCCIÓN
El cáncer de cérvix es uno de los más importantes problemas de salud en el mundo,
considerado el tercer tipo de cáncer más común entre las mujeres de todo el mundo,
con un estimado de 83.195 nuevos casos y 35.673 muertes en 2012 (ICO, 2014). En
Bolivia anualmente son diagnosticados 2.029 nuevos casos de cáncer cervical, sobre
todo en mujeres de 15 a 44 años, convirtiéndose como la primera causa de cáncer
en mujeres. Anualmente se reportan en Bolivia 845 nuevas muertes por cáncer
cervical, convirtiéndose esta enfermedad en la primera causa de muerte en mujeres
bolivianas (ICO, 2014).
En el 99.7% de los casos de cáncer, se indica que la presencia de Virus del
Papiloma Humano (VPH) es un elemento obligatorio para su desarrollo (Ghosh et al.,
2011). Se han identificado por el dato de secuencias del ADN, 189 tipos de VPH, de
los cuales se han aislado en humanos (120 tipos) (Bernard et al., 2010) de estos 30
diferentes genotipos han sido identificados como causantes de enfermedades de
trasmisión sexual muchos de los cuales inducen lesiones en el cérvix, vagina, vulva
pene y ano (Jung et al., 2004). Quince genotipos son clasificados como de alto
riesgo ( 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68, 73, y 82) estos podrían ser
cancerígenos, otro grupo de 3 genotipos fueron clasificados como de probable de
alto riego (26, 53, y 66), probablemente cancerígeno y 12 fueron clasificados como,
de bajo riesgo (6, 11, 40, 42, 43, 44, 54, 61, 70, 72, 81 y CP6108) (Muñoz et al.,
2003).
La identificación precoz del ADN de los VPH de alto riesgo podría permitir detectar a
aquellas mujeres con mayor riesgo de desarrollar neoplasias intraepiteliales
cervicales (NIC). Esta estrategia puede tener
implicaciones importantes en la
prevención y seguimiento de mujeres a riesgo así como en el enfoque clínico de esta
enfermedad y pueden disminuir la morbimortalidad de muchas mujeres. En la
actualidad, existen varios métodos moleculares que han sido desarrollados para
GARCIA M.I.
1
detectar genotipos de VPH, siendo fáciles, fiables y rápidos para el genotipado del
VPH. Uno de ellos es el INNO-LiPA Genotyping Extra (Innogenetics), que debido al
alto costo que presenta podría ser una desventaja al igual que su alta sensibilidad
(riesgo de contaminación). Hallar una técnica que sea accesible, de bajo costo y bajo
riesgo de contaminación, podría ser de mucha ayuda especialmente en países no
desarrollados. Una alternativa planteada es la técnica de PCR- EIA, que es una
técnica sencilla que combina la PCR (Reacción en cadena de la polimerasa) GP5+/GP6+bio con la técnica de EIA (Enzimo Inmuno Ensayo). El objetivo de este
estudio, es determinar la concordancia de la técnica de PCR GP5+/GP6+bio - EIA
para la detección del Virus del Papiloma
Humano de alto riesgo
positivas para ADN de VPH con la técnica de
hibridación reversa
en muestras
INNO-LiPA
Genotyping Extra, como método gold standard y comparar con los resultados citohistopatológicos. Los resultados de este trabajo nos sugerirán si esta técnica puede
ser implementada para detectar VPH-AR en mujeres a riesgo.
GARCIA M.I.
2
II.
JUSTIFICACIÓN
Es importante identificar los genotipos del Virus del Papiloma Humano de alto riesgo
(VPH-AR), entre ellos los genotipos más prevalentes VPH 16 y VPH 18 ya que estos
son causantes del cáncer de cuello uterino produciendo una morbimortalidad elevada
en diferentes países del mundo.
Aunque existen varios métodos moleculares para la detección e identificación de los
diferentes VPHs, conocidos por su sensibilidad y reproducibilidad que presentan. En
nuestro medio no se realizan pruebas para la genotipificación del VPH, debido a sus
altos costos, la complejidad en el procedimiento y el requerimiento de personal
capacitado que presentan la mayoría de estos métodos.
Por ello, es importante implementar la técnica de Reacción en Cadena de la
Polimerasa GP5+/GP6+bio - Enzimo Inmuno Ensayo (PCR GP5+/GP6+bio-EIA) como
un método alternativo y económico para la detección de VPH de alto riesgo, su
aplicación podrá contribuir al diagnóstico precoz del cáncer de cuello uterino en la
población femenina de nuestro medio.
La finalidad de este trabajo, es comparar los resultados de los diferentes genotipos
de VPHs identificados por el método de INNO-LiPA como gold standard con los
resultados obtenidos por PCR GP5+/GP6+bio – EIA.
III.
HIPOTESIS
La técnica de Reacción en Cadena de la Polimerasa GP5+/GP6+bio - Enzimo Inmuno
Ensayo (PCR GP5+/GP6+bio - EIA) nos permitirá detectar los genotipos de VPH-AR
con la misma capacidad que la técnica de hibridación reversa INNO-LiPA Genotyping
Extra.
GARCIA M.I.
3
IV.
OBJETIVOS
4.1.
Objetivo General
 Comparar la técnica de Reacción en Cadena de la Polimerasa GP5+/GP6+bio Enzimo Inmuno Ensayo (PCR GP5+/GP6+bio -EIA) con la técnica de hibridación
reversa INNO-LiPA Genotyping Extra para la detección de los Virus del
Papiloma Humano de alto riesgo en células cervicales.
4.2.
Objetivos específicos
 Identificar los diferentes genotipos de VPH en nuestra población de estudio
utilizando la técnica de hibridación reversa INNO-LiPA en muestras VPH
positivas por PCR PGMY09/11.
 Determinar los genotipos de VPH-AR más frecuentes en muestras con
citología sin lesiones intraepiteliales, LIE-B y LIE-A para la preparación de dos
cocteles de oligonucleótidos y su aplicación en la técnica PCR GP5 +/GP6+bio –
EIA.
 Comparar los resultados de las técnicas de PCR PGMY09/11, INNO-LiPA
(SPF10) y la PCR GP5+/GP6+bio–EIA para la detección del ADN-VPH.
 Evaluar la capacidad de detección de genotipos de VPH-AR de la técnica
PCR GP5+/GP6+bio -EIA comparándola con la técnica de hibridación reversa
INNO-LiPA Genotyping Extra.
GARCIA M.I.
4
V.
MARCO TEÓRICO
5.1.
Generalidades cáncer de cuello uterino y el VPH
El cáncer de cuello uterino (CACU) también conocido como cáncer cervicouterino o
cáncer cervical, es un cáncer frecuente en mujeres. Este tipo de cáncer es una
enfermedad en la que se presentan cambios en las células que cubren las paredes
del cuello uterino (extremo inferior de la matriz que comunica con la vagina). Estas
células inicialmente normales, a la postre se convierten en precancerosas (OPS,
2004).
El cáncer de cérvix es uno de los más importantes problemas de salud en el mundo,
ya que es el tercer tipo de cáncer más común entre las mujeres de todo el mundo,
con un estimado de 83.195 nuevos casos y 35.673 muertes en el 2012 (ICO, 2014).
En Bolivia anualmente son diagnosticados 2.029 nuevos casos de cáncer cervical,
sobre todo en mujeres de 15 a 44 años, convirtiéndose en la primera causa de
cáncer femenino. Anualmente se reportan en Bolivia 845 nuevas muertes por cáncer
cervical, convirtiéndose esta enfermedad en la primera causa de muerte en mujeres
bolivianas (ICO, 2014).
Hace más de 30 años fue Zur Hausen quien estableció la posible relación del Virus
de Papiloma Humano (VPH) y el cáncer del cuello uterino (Zur Hausen, 2002).
Actualmente el VPH se ha consolidado como el único virus asociado (agente
etiológico) en el desarrollo de cáncer en el tracto anogenital. Prácticamente el 99.7%
de los casos de cáncer de cuello uterino es VPH positivo, lo que indica que la
presencia de VPH es un elemento obligatorio en su desarrollo (Ghosh et al., 2011).
El VPH es altamente transmisible y se considera hoy día como la enfermedad de
transmisión sexual más frecuente en la mayoría de las poblaciones (Castellsagué,
2008). Una revisión sistemática reciente (Li et al., 2011) y un estudio internacional
(de Sanjosé et al., 2010) que incluyó más de 30.000 y 10.500 casos de CACU han
GARCIA M.I.
5
estimado consistentemente que los VPHs 16/18 están asociados al 70% de los casos
de CACU en todo el mundo, con sólo pequeñas variaciones geográficas. Después de
los VPHs 16/18, los seis tipos más comunes fueron los VPHs 45, 33, 31, 52, 58 y 35.
En la región latinoamericana, no se observaron grandes diferencias en esta
distribución, comparada con la descrita para otras partes del mundo (de Sanjosé et
al.,
2010) (Figuras 1 y 2). Con estos datos, podemos concluir que en términos
generales, la distribución de tipos específicos del VPH en el cáncer de cuello uterino
en Latinoamérica no se diferencia, en lo referente a los tipos más comunes, a la
observada en el resto del mundo.
Figura 1. Los 10 tipos de VPH más frecuentes identificados en mujeres con cáncer de
cuello uterino en todo el mundo y en la región latinoamericana. Fuente: (de Sanjosé et al.,
2010).
GARCIA M.I.
6
Figura 2. Contribución relativa de los VPHs 16 y 18 al cáncer de cuello uterino, en los
países latinoamericanos. Fuente: (de Sanjosé et al., 2010).
5.2.
Características generales del virus del papiloma humano (VPH)
Los VPHs son un grupo de virus de ADN doble cadena que pertenecen a la familia
Papovaviridae, no poseen envoltura, y tienen un diámetro aproximado de 52-55 nm
(Castellsagué, 2008). El genoma del VPH posee 8000bp asociadas con histonas, y
se encuentra encerrado en una cápside icosaédrica compuesta de proteínas mayor y
menor de la cápside donde codifica las siguientes regiones de lectura abierta (ORF
open reading frame).

La región temprana (“E”) cubre más del 50% del genoma viral y contiene los
genes estructurales tempranos (E1 a E8), especialmente E6 y E7 que son
responsables de la transformación maligna de las células huésped.
GARCIA M.I.
7

La región tardía ("L") que comprende casi el 40% del genoma del virus, se
encuentra debajo de la región temprana y codifica los L1 y L2 ORFs para la
traducción de la proteína de la cápside tanto mayor (L1) y como la menor (L2)
(Peralta et al., 2013) (Figura 3).
Figura 3. Genoma del VPH lineado, Genes “E”, Genes “L” y LCR “región de control larga”.
Fuente: www.medwave.cl/link.cgi/Medwave/PuestaDia/Cursos/3383?ver=sindiseno).

Finalmente, la región de control larga (LCR), es un segmento de
aproximadamente 850 pb (≈ 10% del genoma del VPH), no tiene ninguna
función de la proteína-codificación pero contiene el origen de la replicación,
así como múltiples sitios de unión del factor de transcripción importante en la
regulación de la transcripción iniciada por ARN polimerasa II (Peralta et al.,
2013). La Tabla 1 resume las principales funciones de las proteínas del VPH.
GARCIA M.I.
8
Tabla 1. Principales funciones de las proteínas de VPH. Fuente: Peralta et al.,
2013.
Proteínas VPH
Funciones
E1
Implicadas en la replicación del VPH productivo (Egawa et al., 2012).
E2
Regula la transcripción de diferentes promotores de VPH (Centeno et al. ,
2008).
E3
Recientemente identificado gen localizado en la región del gen temprano
y sólo se encuentran en algunos tipos de papilomavirus (VPH 1, 11, 16,
31, 33); su función no ha sido identificado (Alp Avcı, 2012).
E4
Representa hasta un 30% de la producción total de proteínas de la
verruga por VPH-1a y puede servir como andamios, transporte, o de la
proteína estructural (Wang et al., 2004).
E5
Inactiva con proteínas del huésped celular (MHC I, Bap31); estas
interacciones son importantes para la actividad biológica de la proteína
en la transformación celular y la evasión de la respuesta inmune.
Juega un papel en la regulación de las vías de transducción a través de la
regulación de fosfatidilinositol-3-quinasa (Venuti et al., 2011).
E6
Inactiva la proteína supresora de tumor p53, que participa en el control
de la proliferación celular y la respuesta celular al estrés genotóxico y en
el daño del ADN (Wise-Draper & Wells, 2008).
E7
Interactúa con la proteína supresora de tumores pRb. Estas interacciones
influyen en la expresión de genes implicados en la progresión de la fase S
del ciclo celular, tales como ciclina A, ciclina D, y los genes de ciclina E.
(Dick & Dyson 2002; Wise-Draper & Wells, 2008).
Gen recientemente identificado se encuentra en la región del gen
temprano y se encontró sólo en algunos tipos de papilomavirus (VPH 1,
11, 16, 31, 33). Una proteína de fusión, E8 ∧ E2C, funciona como un
regulador negativo de la replicación del ADN de VPH que juega un papel
en el control de número de copias virales, así como en el mantenimiento
estable de episomas de VPH (Alp Avcı, 2012).
E8
L1
Proteína de la cápside mayor.
L2
Proteína de la cápside menor ( Toro & Llombart, 2005).
GARCIA M.I.
9
5.3.
Tipos de VPH
Se han identificado por el dato de secuencias del ADN, 189 tipos de VPH, de los
cuales se han aislado 120 tipos en humanos (Bernard et al., 2010), 30 diferentes
genotipos han sido identificados causantes de enfermedades de trasmisión sexual
muchos de los cuales inducen lesiones en el cérvix, vagina, vulva, pene y ano (Jung
et al., 2004). Quince genotipos son clasificados como de alto riesgo (16, 18, 31, 33,
35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68, 73, y 82) podrían ser cancerígenos, otro grupo de 3
genotipos fueron clasificados como probable de alto riego y probablemente
cancerígeno (26, 53 y 66) y 12 fueron clasificados como tipos de bajo riesgo (6, 11,
40, 42, 43, 44, 54, 61, 70, 72, 81 y CP6108) (Muñoz et al., 2003).
Estos genotipos de VPHs están divididos en alto y bajo riesgo de acuerdo a la
asociación con el cáncer del tracto genital. El grupo de VPH –AR especialmente VPH
16, 18, 31 y 45 están asociados con más del 90% de carcinomas cervicales (Muñoz
et al., 2003). El VPH 16 y 18 son los genotipos más frecuentes en mujeres con
cáncer de cuello uterino, mencionado anteriormente (Figura 1 y 2). Se sospecha que
el VPH 18 induce una evolución más rápida hacia el cáncer que el VPH 16 (Burger
et al., 1996). Algunos autores refieren que los VPH como intermedio y bajo riesgo
son también ocasionalmente encontrados en carcinomas cervicales (Muñoz et al.,
2003).
5.4.
Ciclo viral del VPH
El VPH entra en el epitelio a través de micro heridas que expone la membrana basal
del cuello uterino, inicia su ciclo productivo infectando estas células del epitelio,
donde inicia la transcripción de sus genes tempranos (E6, E7, E1, E2, E3, E4, E5 y
E8) (Burchell et al., 2006).
El virus se une a su célula blanco a través de un receptor de membrana, la molécula
A6-Integrina. Una vez ocurrida la infección, el virus se establece dentro del núcleo de
GARCIA M.I.
10
las células basales. El ADN viral permanece en estado episomal (circular) fuera de
los cromosomas del hospedero, replicándose a niveles muy bajos en coordinación
con la división celular (Figura 4).
Figura
4.
Proceso
de
infección
del
VPH.
Fuente:
www.sexualidadescobar.blogspot.com/2013/02/de-venus-al-hpv-segunda-parte.html
Cuando las células infectadas se diferencian y migran desde la capa basal hacia el
estrato espinoso del epitelio, se expresan los genes tardíos L1 y L2, además de E4,
la replicación viral se estimula, produciendo la acumulación de viriones dentro del
núcleo. El análisis de las moléculas de ARN mensajero viral durante las diferentes
etapas de diferenciación de las células infectadas demuestra que la expresión de los
genes tempranos ocurre a lo largo de todos los estratos epiteliales, sin embargo, la
expresión de los genes tardíos se observa únicamente en los queratinocitos (células
más presentes en la epidermis que producen queratina y citocinas) totalmente
diferenciados de los estratos más superficiales, donde también ocurre el ensamblado
de las cápsides virales que dan lugar a la formación de viriones (Baseman & Koutsky
, 2005).
GARCIA M.I.
11
Los VPHs no presentan una fase lítica, por lo tanto se valen de las características
propias de las células que los albergan para propagar su progenie, la cual es liberada
cuando las células terminales del estrato corneo sufren un proceso de descamación
(Burchell et al., 2006; Wang et al., 2003).
5.5.
Transmisión de la infección del VPH
Las infecciones por VPH anogenitales son comúnmente transmitidas sexualmente
(Kjaer et al., 2001) a través de un microtrauma de la mucosa, por ejemplo a nivel del
introito vaginal (Schiffman & Kjaer,
2003). El cuello del útero es especialmente
vulnerable al contagio, probablemente a través del epitelio metaplásico de la unión
escamoso-cilíndrica. Las vías de transmisión genital, distintas al coito, son probables
aunque menos comunes pero es necesario recordar que el virus puede estar
presente en superficies secas, y ser trasmitido por los dedos y otros utensilios
(Sonnex et al., 1999). Este riesgo de transmisión por contacto digital-genital u oralgenital parece ser mínimo. También se ha descrito la trasmisión vertical de la madre
al neonato, siendo persistente el VPH por arriba de 26 meses (LaCour & Trimble,
2012).
5.6.
Cofactores asociados a la infección por VPH
El virus del papiloma es causa necesaria pero no suficiente para el cáncer de cérvix.
Podemos afirmar que, sólo una fracción de las mujeres infectadas con el virus
desarrollará más adelante un cáncer de este tipo (10-15%). Hay cofactores que, con
el virus como premisa, pueden beneficiar al desarrollo tumoral.
GARCIA M.I.
12
5.6.1. Cofactores exógenos

Edad del primer coito: Las características histológicas de la zona de
transformación escamoso-cilíndrica en el exocérvix de las mujeres jóvenes,
pueden explicar el mayor riesgo de infección entre las mujeres que inician
tempranamente la actividad sexual. La inmadurez cervical, las deficiencias de
flujo cervical protector y la ectopia cervical aumentada pueden conducir a una
mayor susceptibilidad para la adquisición de una infección por el VPH en
mujeres adolescentes y adultas jóvenes (Winer et al., 2005).

Número de compañeros sexuales: La asociación entre el número de parejas
sexuales y la probabilidad de detectar ADN del VPH en el tracto genital inferior
es consistente. El tiempo que transcurre entre una pareja y otra, es otro factor
influyente, ya que existe más riesgo de infección si el lapso de tiempo entre
una pareja y otra es corto (Castellsague, 2002).

La multiparidad: Mujeres que han tenido más de 3 hijos podrían tener un
mayor riesgo de desarrollar neoplasia in situ en comparación con las mujeres
nulíparas o con menos de 2 hijos (Muñoz et al., 2002). Esto quizás se debe a
la influencia de hormonas endógenas durante la gestación y al trauma cervical
que ocasiona cada parto, así como a que la zona de transformación está
expuesta durante mucho más tiempo al exocérvix. A todo ello se suma la
paridad a edades muy tempranas, el estado nutricional de la paciente y el
estatus de la inmunidad (Hildesheim et al., 2001).

Otras Infecciones de transmisión sexual: Como Chlamydias, Herpes, VIH
actúan como cofactores en el desarrollo de lesiones preneoplásicas y cáncer
de cuello uterino. El VIH se asocia tanto a la prevalencia, como a la progresión
de infecciones por VPH. Las pacientes portadoras de VIH tienen más riesgo
de infección por el VPH y 9 veces más riesgo de desarrollar cáncer de cérvix
(Winer et al., 2006).
GARCIA M.I.
13

Tabaco: Los carcinógenos químicos relacionados con el cigarrillo podrían
ejercer un efecto mitogénico directo sobre el ADN causándole daño. Por otro
lado, la exposición al tabaco podría afectar la respuesta inmune local efectiva
ante una infección viral ya que disminuye el número de células de Langerhans
(Castellsagué & Muñoz, 2003).
5.6.2. Cofactores virales

Genotipo de VPH: Las mujeres infectadas con VPH oncogénicos (VPH-AR:
16, 18, 31, 33, 45, 52, 58 y 59) tienen un mayor riesgo de desarrollar LIE-A y
cáncer invasor en relación con aquellas infectadas por un tipo de VPH-BR:
VPH 6 u 11 (Muñoz et al., 2003).

Variantes de VPH: Se ha demostrado que las variantes del genotipo viral 16
tienen propiedades diferentes en cuanto a potencial oncogénico. Las variantes
no europeas del VPH 16 (AA) son más oncogénicas que las variantes
europeas, pues las primeras contribuyen más a la persistencia e integración
viral (Ordóñez, 2004).

Carga viral: Se ha propuesto que la determinación de la carga viral podría ser
usada como un marcador de progresión de lesiones intraepiteliales a lesiones
clínicamente significativas (Dalstein et al., 2003).

Persistencia: Es un prerrequisito para el desarrollo de la enfermedad
neoplásica cervical que surge después de un largo período de persistencia
viral. La persistencia del virus favorece la integración del genoma a los
cromosomas de las células infectadas (Tjalma et al., 2005).

Integración del VPH e infección múltiple: Si los VPHs están presentes en
pacientes con LIE-B e inmunosuprimidas por infección con VIH se favorecerá
GARCIA M.I.
14
la persistencia viral y, por ende, se aumentara el riesgo de progresión del
proceso infeccioso (Cuschieri & Cubie, 2005).
5.6.3. Cofactores del huésped

Edad: En diferentes regiones del mundo muestran un pico de prevalencia de
infección por VPH en mujeres cuya edad está alrededor de los 25 años, luego
se aprecia una disminución de las tasas de prevalencia en mujeres de 35 a 54
años y se encuentra un segundo pico después de los 55 años, que
probablemente se debe a la reactivación de infecciones latentes (Castle et al.,
2005; Clifford et al., 2005).

Gestación: Los oncogenes virales transforman las células sólo en
cooperación con los oncogenes celulares o con la exposición de esteroides
humanos ya que estos virus requieren de la proliferación y diferenciación
tisular inducida por estas hormonas (en este caso que ocurren en el
embarazo) para su replicación y expresión (McGlennen, 2000).
5.6.4. Otros cofactores

Condición
nutricional
y
dietética:
Los
estudios
obtenidos
son
controversiales e inconsistentes e inclusive muchos informan no haber hallado
asociación significativa entre el nivel sérico de micronutrientes y la lesión en
cuello uterino (Castle & Giuliano, 2003).
5.7.
Patogénesis
Los VPHs son virus epidermotropos con afinidad y capacidad de infectar cualquier
tipo de epitelio escamoso, solo puede causar infecciones productivas en los epitelios
estratificados de la piel, el tracto anogenital y la cavidad oral. El virus inicialmente se
GARCIA M.I.
15
presenta como un elemento extracromosómico autoreplicativo que se denomina
episoma. En esta fase, la replicación del virus se hace sincrónicamente con la
división de la célula del huésped, por lo que el número de las copias virales no se
disminuye con el tiempo. La fase de incubación dura aproximadamente 6 semanas a
8 meses, período en el cual grandes zonas del epitelio genital y anal son colonizadas
sin que ocurra manifestaciones clínicas ni histológicas; en este momento la infección
es conocida como latente (replicación episomal viral). Esta infección latente sólo es
accesible a la aplicación de técnicas de biología molecular para la identificación del
ADN viral. Sin embargo esta etapa latente de infección puede progresar a una
expresión activa (replicación viral productiva o vegetativa) (Consuegra, 2004). En
otras palabras, los virus de bajo riesgo, permanecen en el núcleo de la célula
infectada en situación episómica y los VPHs de alto riesgo ejercen su actividad
oncogénica (aunque no exclusivamente) tras integrarse en el genoma celular (Chow
& Broker, 2005).
Para comprender la etiopatogenia de esta enfermedad, es necesario entender el
papel del sistema inmune del huésped frente a la infección de VPH. El VPH es un
virus que, aunque tiene poca capacidad inmunogénica sistémica, desencadena una
respuesta inmune que por distintos mecanismos, tiende a controlar la replicación
viral. La respuesta inmune celular es la que mayor compromiso tiene para el control
de esta infección. Cuando esta es efectiva, el individuo se comportará como un
portador asintomático del virus y, cuando fracasa, se producirá la proliferación y
transformación celular que condicionan la aparición de la enfermedad en sus
distintas manifestaciones mucocutaneas, incluyendo las displasias celulares de
distinto grado. La calidad de esta respuesta inmune puede explicar tanto la regresión
ocasional de las lesiones como su progresión hacia formas clínicas patológicas o con
mayor tendencia a la transformación celular, como sucede en casos de
inmunodepresión (infección por el VIH) (Hernández, 2006).
GARCIA M.I.
16
5.8.
Oncogénesis por VPH
La transformación tumoral de la célula (en esta patología) tiene como base biológica
la incapacidad (de la célula) de reparar los errores en la replicación del ADN debido
al bloqueo de proteínas del ciclo celular por parte de los VPH de alto riesgo. Como
consecuencia se produce un estado celular de susceptibilidad a la transformación
neoplásica, el cual sera por procesos de integración o por la intervención de rutas
biológicas diferentes, la pérdida de E2, represor de la transcripción viral, dará lugar a
la expresión de los genes VPH E6 y E7, cuyas proteínas virales se expresan
constantemente en los carcinomas cervicales. Los productos de los genes E6 y E7
desregulan el ciclo de crecimiento de la célula huésped mediante la unión y la
inactivación de dos proteínas supresoras de tumores: la proteína supresora de tumor
(p53) y el producto del gen del retinoblastoma (pRb). El producto del gen E6 del VPH
se une a p53 y objetivos para la degradación rápida (Thomas et al., 1999). En
consecuencia, las actividades normales de p53 que rigen la detención de G1, la
apoptosis y la reparación del ADN están abrogados. El producto del gen E7 del VPH
se une a pRb y esta unión altera el complejo entre pRb y el factor de transcripción
celular E2F-1, lo que resulta en la liberación de E2F-1, que permite la transcripción
de genes cuyos productos son requeridos para la célula para entrar en la fase S del
ciclo celular (Flores et al., 1999) . La inactivación de las proteínas p53 y pRb puede
dar lugar a un aumento de la tasa de proliferación y genómico inestabilidad. Como
consecuencia, la célula huésped acumula más y más daño en el ADN que no puede
ser reparado, lo que lleva a las células cancerosas transformadas
(Park et al.,
1995).
5.9.
Diagnóstico del cáncer y del virus del papiloma humano (VPH)
5.9.1. Clínica
Es una inspección minuciosa, detallada del cuello uterino y la vagina con ayuda de
un espéculo, se debe observar la infección por Papilomavirus Humano que se
GARCIA M.I.
17
caracteriza también por verrugas y condilomas acuminados (lesiones exofíticas) a
nivel de los genitales externos y vagina o como condiloma plano (lesiones planas)
debido a que la infección por VPH produce estos cambios morfológicos en el cuello
uterino (Hurt, 2012).
5.9.2. Citología o Papanicolau
Como método de cribado es rápido, sencillo y poco agresivo, lo que permite
identificar la patología pre y neoplásica. La prueba consiste en obtener una muestra
del epitelio escamoso del cuello cervicouterino (de la unión escamocolumnar del
cérvix), fijarla sobre un portaobjetos y colorearlas (tinción Pap) para posteriormente
ser examinados por citólogos los cambios morfológicos. Sin embargo, el
Papanicolaou no puede detectar directamente el VPH. Un dato sobresaliente es que
entre el 10 y el 30 % de las mujeres que presentan un Papanicolaou normal, están
infectadas con el VPH (Torres, 2011).
La interpretación de las lesiones celulares se ha determinado la terminología según
Bethesda (1988), descrita de la siguiente manera: lesión epidermoide intraepitelial de
bajo grado L-SIL, lesión epidermoide intraepitelial de grado alto H-SIL, carcinoma
epidermoide invasor, que fueron adaptadas en años posteriores y que tienen una
correlación entre ellas (Solomon, 2002) (Tabla 2), y una terminología adicional
relativa a células escamosas atípicas (ASC), células de significado indeterminado
(ASC-US), y células en las que no puede excluirse H-SIL (ASC-H), células
glandulares atípicas (AGC).
GARCIA M.I.
18
Tabla 2: Correlación entre tres clasificaciones diferentes de las lesiones del cuello uterino.
Fuente: (AMYS, 2005)
OMS
Displasia ligera
Displasia moderada
RICHART
Condiloma
CIN- 1 con coilocitos
CIN-2 con o sin coilocitos
BETHESDA
Lesión epidermoide intrepitelial
de bajo grado (L-SIL)
Lesión epidermoide
Displasia grave
Carcinoma in situ (CIS)
Carcinoma
epidermoide invasor
CIN-3 con o sin coilocitos
Intraepitelial grado alto (HSIL).
Carcinoma epidermoide
invasor
Carcinoma epidermoide
invasor
5.9.3. Colposcopia
Esta técnica creada y desarrollada por Hans Hinselman (Hamburgo-1925) consiste
en la visualización del tracto genital mediante un microscopio binocular con una
potente fuente de luz centrada sobre el campo de exploración. Permite identificar la
topografía y extensión de las lesiones precancerosas (Figura 5), localizar las áreas
más sospechosas donde practicar la toma de biopsia y planificar un tratamiento
efectivo. Esta prueba es muy sensible para la detección de las lesiones precursoras
del cáncer de cérvix, sin embargo es poco específica, pues no siempre las imágenes
colposcópicas anormales corresponden a lesiones intraepiteliales. Requiere una
buena formación y experiencia del especialista. En el cual, inspeccionan el cuello
uterino con ayuda de ácido acético al 3-5% y solución yodatada para la identificación
de lesiones de alto grado, los cambios de color denotan la anormalidad del cuello
uterino (Sellors, 2003).
GARCIA M.I.
19
Figura 5. Cambios histológicos en las diferentes lesiones del cuello uterino, Observado
por colposcopia. Fuente: www.asccp.org
5.9.4. Inspección Visual con Ácido Acético (IVAA)
Otro método útil para realizar el tamizaje de las anomalías cervicales es el examen
IVAA, también llamado cervicoscopia, donde se observa el cuello uterino a simple
vista (sin aumento) después de aplicar ácido acético 3-5%, bajo iluminación del
cuello uterino con una fuente de luz. De esta forma, se reportan las anormalidades
como acetoblanco, y cuando se reporta un cérvix normal se denomina no
acetoblanco. Este método se puede utilizar como un complemento de la citología y
así identificar de manera más eficaz los individuos que requieren una colposcopia, no
requiere de instrumentos o aparatos caros, ni infraestructura especializada. Varios
estudios han demostrado que esta prueba es igual de eficaz demostrándose que la
sensibilidad es similar a la citología cervical en la detección de lesiones pre
invasivas, sin embargo, su especificidad es menor que el Pap (Germar, 2003).
GARCIA M.I.
20
5.9.5. Test de Schiller
Tras la aplicación de la solución yodo yodurada de lugol (test de Schiller), el epitelio
escamoso maduro, que tiene glucógeno, se tiñe de color marrón oscuro. Las zonas
yodo negativas o Schiller positivas son epitelios sin glucógeno y corresponden a
zonas de metaplasia, CIN o bajo nivel estrogénico (atrofia e hipotrofia).
5.9.6. Histopatológico

Biopsia
La biopsia es un estudio histológico que permite el diagnostico de benignidad y
malignidad de una lesión colposcópica. La combinación de la colposcopia y de la
biopsia dirigida se considera el gold standard para el diagnóstico de la neoplasia
intraepitelial y el cáncer de cuello uterino (Mitchell et al., 1999). La terminología
según Richart (1973) para las lesiones, se las interpreta de la siguiente manera:
condiloma, CIN-1, CIN-2, CIN-3, del inglés cervical intraepitelial neoplasia, carcinoma
epidermoide invasor) (Tabla 2).
5.9.7. Métodos moleculares
A diferencia de las técnicas arriba mencionadas estos métodos permiten la detección
del ADN incluso cuando está integrado; son los únicos métodos fiables para detectar
la mayoría de infecciones (resuelven el problema de las infecciones subclínicas y
latentes); presentan una elevada sensibilidad y especificidad, y son los únicos
métodos que permiten identificar el tipo de VPH y la presencia de infecciones mixtas.
GARCIA M.I.
21
5.9.7.1. Métodos de detección del ADN - VPH

Hibridación in situ (HIS): La hibridación in situ permite la detección de ADN
viral intacto directamente en los tejidos o secciones preparaciones de células
(in situ). El método se basa en el reconocimiento de la sonda marcada con la
diana complementaria viral. La muestra se fija en la solución de fijación con el
fin de preservar la morfología del tejido y para evitar la pérdida de material
genético (Dutra et al., 2012).

La captura de híbridos (CH): Es un método de amplificación de la señal
basado en la hibridación del ADN-VPH diana en solución, con sondas de ARN
marcadas (Lörincz, 1996). Los híbridos son capturados en placas con
microporos y se detectan con un anticuerpo monoclonal específico y un
sustrato
quimioluminiscente,
proporcionando
así
una
medición
semicuantitativa del ADN-VPH. Se usan dos cocteles diferentes de sondas,
uno para VPH de bajo riesgo: 6,11,42,43 y 44 y otro que contiene sondas para
13 tipos de VPH de alto riesgo: 16,18,31,33,35,39,45,51,52,56,58,59 y 68.

PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa): Se ha logrado la amplificación
selectiva de secuencias específicas de ácidos nucleicos bajo síntesis
enzimática, constituyendo una práctica sencilla para la detección de ADN VPH. Permite la identificación de un solo tipo viral utilizando cebadores que se
unen a secuencias específicas de este o a varios tipos de VPH, mediante
cebadores (primers) generales o de consenso (Iftner & Villa, 2003).
Los cebadores de consenso o generales como MY09/11 (Manos, 1989),
GP5+/GP6+ (de Roda Husman et al., 1995), SPF10 (Kleter et al., 1998; Kleter
et al., 1999) permiten detectar una amplia variedad de genotipos virales
realizando una sola PCR (Figura 6). Tales cebadores reconocen una región
bien conservada de diferentes Papilomavirus Humanos como la región L1 del
genoma viral. Actualmente se están validando el uso y la aplicación, de
GARCIA M.I.
22
PGMY09/11 este sistema de amplificación combina una serie de 18 cebadores
definidos, (amplifican un fragmento de 450 pb) (Figura 6) dirigidos a la misma
posición del genoma viral, esto le confiere una más sensibilidad al ensayo
(Gravitt et al., 2000).
La GP5+ /6+ utiliza cebadores que amplifica un fragmento de 150pb (Figura 6)
y revela una mejor detección del VPH, reflejada por 10 a 100 veces mejor
sensibilidad, en comparación con la GP5/6 (de Roda Husman et al., 1995). En
tanto que SPF10 presenta una más alta sensibilidad explicada por el tamaño
pequeño de los amplicones de 65 pb (Iftner & Villa, 2003) (Figura 6), lo que
permite la detección de alrededor de 43 tipos de ADN de VPH en muestras
con baja carga viral o en muestras con ADN relativamente fragmentado (Kleter
et al.,
1999), como en biopsias de tejido como en material celular de
pacientes con lesiones premalignas y malignas del cuello uterino (van Doorn
et al., 2002).
Figura 6: Localización de los diferentes sistemas de cebadores utilizados en la detección
por PCR del VPH. Fuente: (Ortiz, Torrez & García, 2006)
GARCIA M.I.
23
5.9.7.2. Métodos de genotipificación del ADN-VPH

Abbott RealTime High Risk (HR) VPH
Llamado también multiplex PCR es una reacción en cadena de la polimerasa
cualitativa, ensayo que amplifica la región conservada L1 de VPH y detecta los virus
de VPH de alto riesgo.
En efecto el ensayo de VPH-AR Abbott RealTime puede detectar 14 genotipos de
VPH de alto riesgo: 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66, 68 y por
separado a los genotipos 16, 18. Esta técnica se realiza en la m2000rt, un
instrumento PCR (Abbott Molecular) en tiempo real utilizando los cebadores GP5+ /6+
modificados. El mix de reacción consta de tres cebadores forward y dos cebadores
reverse dirigidos hacia una región L1 conservada (Huang et al., 2009). La señal de
los catorce genotipos del VPH de alto riesgo (arriba mencionados) se genera
mediante el uso de sondas fluorescentes. Los amplicones del control interno (CI) se
generan con un conjunto de cebadores dirigidos hacia una secuencia de beta-globina
humana endógena y se detectan mediante una sonda específica para el CI.
El ensayo Abbott Real Time VPH -AR detecta la secuencia de beta-globina humana
endógena como un control de validez de la muestra para la aceptabilidad de las
células, la extracción de las muestras y la eficiencia de la amplificación (Huang et al.,
2009).

Secuenciación directa de los productos de PCR
La secuenciación de productos amplificados por PCR es el método de referencia,
con ella se obtiene información completa de la secuencia de bases (nucleótidos) de
la región genómica estudiada (ADN de VPH por ej.) lo que permite la determinación
exacta del genotipo del VPH existente en la muestra. Este método comprende
reacciones de secuenciación, análisis de secuencias, bases de datos, etc. El análisis
de la secuencia es una tipificación directa e inequívoca que permite distinguir
GARCIA M.I.
24
variantes y polimorfismos virales del VPH, pero no es un método adecuado para la
detección de infecciones múltiples de VPH porque sólo será detectado el genotipo
predominante (Ortiz, Torrez & García, 2006)

Hibridación de los productos de PCR
La hibridación de los productos de PCR es un método ampliamente utilizado para la
detección y genotipificado del VPH. Este método se realiza mediante la hibridación
del ADN amplificado con sondas específicas. Se han desarrollado diferentes
formatos de hibridación tanto en microplaca como en tira que facilita su utilización
en la práctica clínica. La mayoría de los sistemas están basados en el marcaje de los
productos de PCR
con biotina durante el proceso de amplificación y la posterior
hibridación con sondas específicas (Ortiz, Torrez & García, 2006).
La hibridación reversa en tira es el método más utilizado para el genotipado y la
detección de infecciones múltiples por VPHs. En este diseño se realiza la hibridación
de los productos de PCR con múltiples sondas específicas de tipo, inmovilizadas en
un soporte sólido (tira de nitrocelulosa). Los productos de amplificación,
generalmente marcados con biotina, son desnaturalizados en condiciones alcalinas e
hibridadas con sondas específicas, inmovilizados en las tiras. Los híbridos son
posteriormente detectados mediante una reacción colorimétrica. Las empresas
Innogenetics y Roche Diagnostics han desarrollado dos sistemas representativos de
esta tecnología: INNO-LIPA HPV™ y Linear Array Genotyping HPV test™,
respectivamente (Ortiz, Torrez & García, 2006).
INNO-LiPA Genotyping Extra (Innogenetics): Es un método de hibridación reversa
que permite la identificación de los 28 genotipos VPH mas importantes 6, 11, 16, 18,
31, 33, 35, 39, 40, 42, 43, 44, 45, 51, 52, 53, 54, 56, 58, 59, 66, 68, 70, 71, 73, 74 y
82. Para ello se realiza una extracción de ADN amplificando los extraídos por PCR
GARCIA M.I.
25
con los iniciadores SPF10. Los amplicones resultantes se hibridan en las tiras del kit
previa desnaturalización física, dándonos el resultado correspondiente.
Linear Array Genotyping HPV test™ (Roche Molecular Systems, Inc.,
Branchburg, NJ): A diferencia de INNO-LiPA es un nuevo ensayo de genotipado del
VPH para poder genotipificar 37 genotipos de VPH, al mismo tiempo evaluar la βglobina humano (van Hamont et al., 2006).
Amplicor VPH ADN test™: Es un método desarrollado por la empresa Roche
Diagnostics en microplaca para la detección de trece genotipos de VPHs de alto
riesgo. El cual está basado en la amplificación de un fragmento de 165 pb, del gen
L1, mediante hibridación con una mezcla de sondas específicas. Este sistema
amplifica ADN diana a través de cebadores biotinilados, seguida de una hibridación
de estos ácidos nucleicos para la detección de genotipos de VPH-AR. Debido a las
características del ensayo permite la detección del VPH, pero no el genotipado como
los métodos anteriores (Sandri et al., 2006).
La PCR-EIA es una técnica sencilla que combina la PCR (polymerase chain reaction)
con la técnica de EIA (enzyme immunoassays) para nuevos diagnósticos
moleculares, (Jacobs et al., 1997; Kleter et al., 1998; Kornegay et al., 2001). Las
hibridaciones
a sondas de oligonucleótidos se pueden realizar en placas de
microtitulación, previo marcaje con biotina de uno de los cebadores (GP5 +/GP6+
bio)
que genera productos de PCR biotinilados que son capturados luego en pocillos de
microtitulación recubiertas con estreptavidina. El ADN de doble hebra se
desnaturaliza en condiciones alcalinas y la hebra no unida se elimina mediante
lavado. Un oligonucleótido marcado con digoxigenina se añade la sonda, que se
hibrida con la hebra capturada. Los híbridos se puede detectar después de la unión
del conjugado (anti-DIG-peroxidasa) y reacción del sustrato, después de tres horas
se lee con la ayuda de un espectrofotómetro (405nm). Una ventaja de este método
es la versatilidad del cóctel cuando se trabaja sin kit comerciales, aunque es
GARCIA M.I.
26
necesario seguir trabajando en los cohortes prospectivos a evaluar (Molijn et al.,
2005).

Los microarrays básicamente son como un chip de ADN (del inglés ADN
microarray) es una superficie sólida a la cual se une unas sondas de
fragmentos de ADN. Las superficies empleadas para fijar el ADN son muy
variables y pueden ser de vidrio, cristal, plástico e incluso de silicio. Los chips
de ADN se usan para analizar la expresión diferencial de genes, y se
monitorean de manera simultánea los niveles de miles de ellos. Su
funcionamiento consiste, básicamente, en medir el nivel de hibridación entre la
sonda específica (probe, en inglés), y la molécula diana (target), y se indican
generalmente mediante fluorescencia y a través de un análisis de imagen, lo
cual indica el nivel de expresión del gen. En los últimos años se han
desarrollado diferentes sistemas basados en dicha tecnología, algunos de
ellos disponibles en el mercado como PapilloCheck® (Greiner Bioone,
Alemania) y Clinical Array-papillomavirus (Genomica SAU, España) (Ortiz,
Torrez & García, 2006).
5.9.8. Biomarcadores tumorales en el cáncer cervical
Los biomarcadores se caracterizan por mostrar sensibilidad y especificidad con
mayor exactitud en pruebas de cribado nos permiten identificar de manera más
certera los individuos que se encuentran en peligro de desarrollar cáncer
cervicouterino en el tiempo límite donde se pueden realizar intervenciones antes de
que el cáncer se presente. Los biomarcadores mas conocidos son VPH p16INK4a y
Ki-67 demostrando resultados prometedores.

La p16INK4a
Es una proteína inhibidora de las ciclinas (proteínas involucradas en la
regulación del ciclo celular), que muestra una marcada sobre-expresión en el
GARCIA M.I.
27
tejido cervical precanceroso y canceroso. La sobre-expresión de la proteína
celular p16 permite identificar las células con cambios displásicos en proceso
de oncogénesis cervical inducida por VPH-AR. Por esta razón, p16INK4a es
un elemento de predicción más preciso para la detectar el cáncer cervical
(Hernandez et al., 2005). Los resultados de varios estudios indican que la
tinción inmuno-histoquímica para p16 reduce los diagnósticos falsamente
negativos, mejorando de forma significativa el diagnóstico de las lesiones
premalignas del cérvix uterino (Ordi et al., 2009).

Nuevos marcadores moleculares: tinción dual p16/Ki-67
La proteína Ki-67 es un marcador celular asociado con la proliferación celular.
La detección simultánea de p16 y Ki-67 en una misma célula indica
desregulación del ciclo celular por infección por VPH-AR. La tinción dual tiene
una mayor sensibilidad que la citología, similar a la sensibilidad de los tests de
VPH, pero con un significativo aumento de la especificad. Es independiente de
la edad del paciente o del tipo de VPH (Ordi et al., 2009). El Ki-67 debe
evaluarse en conjunto con otros biomarcadores específicos que permitan
revelar la existencia de alteraciones en el ciclo celular de la neoplasia cervical,
incluyendo el estatus de la infección por VPH, con la finalidad no sólo de
acertar en cuanto a pronóstico de la lesión, sino también para determinar su
utilidad en la pesquisa de cáncer de cuello uterino y sus lesiones precursoras.

Otros biomarcadores tumorales.
Antígeno Carcinoembrionario (CEA). Es una glicoproteína cuyos niveles
sanguíneos pueden estar elevados en personas fumadoras y en aquellas
afectadas de varios tipos de cáncer, incluyendo cáncer de colon, cáncer de
páncreas, cáncer de mama, cáncer de ovario y cáncer de pulmón. Se ubica en
la membrana celular, mostrando un patrón de expresión complejo en tejido
normal y canceroso; sin embargo, está claro que es un excelente marcador de
diferenciación epitelial. Algunos años después de su descubrimiento, se
GARCIA M.I.
28
encontró que el CEA podía medirse en el suero de pacientes con carcinoma
colorectal y otros carcinomas como el cáncer de cuello uterino (Molina et al.,
2005). Esto fue corroborado en líneas celulares creadas a partir de
carcinomas cervicales, mostrando elevados niveles de CEA (Isaka et al.,
2004).
5.10. Tratamiento virus del papiloma humano
Existen diversos tipos de tratamiento, los cuales se dividen en:
5.10.1. Destructivos: Producen una destrucción física de la lesión y, por tanto, no
obtienen
tejido
para
Electrocoagulación,

estudio
histológico.
Vaporización
con
Estos
láser
son
de
la
CO2
termocoagulación,
y
Crioterapia.
Termocoagulación. o coagulación fría, consiste en la destrucción del tejido
mediante calor, aproximadamente entre 100 y 120° C, con una coagulación a
120°C durante 30 min se obtiene una profundidad de destrucción
aproximadamente de 4 mm.

Electrocoagulación. La destrucción del tejido se consigue mediante una
combinación de fulguración (paso de corriente eléctrica) y coagulación,
utilizando
un
electrodo
esférico
o
una
aguja
fina
y
una
unidad
electroquirúrgica.

Vaporización con láser de CO2. Se utiliza unido al colposcopio y por lo tanto,
el área que se destruye se encuentra bajo visión directa del cirujano. Después
del examen colposcopio, se delimita la zona a tratar con el láser. Con el fin de
reducir al mínimo el daño térmico, el haz de laser debe desplazarse
rápidamente sobre el tejido y utilizar la mayor densidad de potencia posible
(Figura 7).
GARCIA M.I.
29

Crioterapia. Consiste en la destrucción de los tejidos con congelación con
óxido nitroso. La destrucción máxima se obtiene con la técnica de doble
congelación (Figura 7). En la actualidad su empleo se limita a lesiones poco
extensas y de bajo grado debido al fracaso que presenta en lesiones más
extensas que afectan a más del 50% del cuello (Carreras et al., 2007) .
a
b
Figura 7: a) Procedimiento de Vaporización con láser CO2 y b) Crioterapia. Fuente:
www.averaorg.adam.com/content.aspx?productId=39&pid=5&gid=002917&print=1
5.10.2. Escisionales: Extirpan la lesión, por ello puede realizarse el estudio
histológico, que permitirá descartar la presencia microinvasión o invasión, que está
presente en un 6-12% y un 2% respectivamente (Ribaldone et al., 2010). Son la
conización y la histerectomía.
GARCIA M.I.
30

Conización. La técnica consiste en la exéresis de toda la zona de
transformación, incluyendo la lesión (Figura 8). La Conización con asa
diatérmica se considera un método seguro y eficaz. La escisión con asa
diatérmica fue introducida por Cartier en 1984 para la toma de biopsias con
fines diagnósticos. En 1989 Prendiville (Prendiville et al., 1989) propuso la
técnica con finalidad terapéutica al incorporar asas de mayor tamaño que
permiten la exéresis de toda la zona de transformación. En Europa la técnica
se conoce como LLETZ (Large Loop Excision of the Transformation Zone), en
Estados Unidos se emplean las siglas LEEP (Loop Electrical Excision
Procedure).

Histerectomía. Es la extirpación quirúrgica del útero, generalmente realizada
por un ginecólogo puede ser total (extirpación del cuerpo, del fondo de ojo, y
el cuello del útero, a menudo llamado "total" o parcial (extirpación del cuerpo
del útero, pero dejando el muñón del cuello uterino, también llamado
"supracervical") (Figura 8). Es el ginecólogo quien más frecuentemente
realizada el procedimiento quirúrgico (Carreras et al., 2007).
a
b
Figura
8:
a)
Conización
y
b)
Histerectomía.
www.nlm.nih.gov/medlineplus/spanish/ency/esp_presentations/100029_4.htm
Fuente:
GARCIA M.I.
31
5.11. Prevención
El programa de prevención y control de cáncer de útero se basa principalmente en
tres componentes; prevención primaria, prevención secundaria y prevención terciaria
(OMS & OPS, 2013).
5.11.1. Prevención primaria frente al cáncer de cuello de útero
La prevención primaria de la infección por VPH es el uso correcto de condón para
evitar contraer la enfermedad. Aunque la OMS promovió desde el 1985 el uso de los
métodos de barrera para evitar las infecciones cervicales y el cáncer cérvico uterino
(WHO, 1985), se ha demostrado que el mismo no es un método 100 % eficaz, y sólo
protege hasta un 70 %, debido a que las personas no lo usan correctamente, sólo lo
hacen al momento de la eyaculación, y las lesiones infectantes están en otras áreas
genitales masculinas, no solamente en el pene (Winer, 2006).
La otra estrategia en la que se trabaja actualmente es la vacunación. Las vacunas
profilácticas contra el VPH fueron hechas con subunidades (pseudocápsidas virales)
denominadas partículas similares al virus VLP (virus like particles = partículas
semejantes a virus) generadas por auto ensamblaje de L1, la principal proteína de la
cápside, de los tipos 16, 18, 6 y 11, aislados o en combinación con sustancias
estimuladoras
de
la
respuesta
no reemplazan el tamizaje, tampoco tratan ni
inmune.
curan el VPH
Estas
ya
vacunas
que generan
respuesta del tipo de anticuerpos neutralizantes en el suero. Como no existe viremia,
entonces las IgG deben actuar en la superficie del epitelio para neutralizar a los virus,
o quizás exista neutralización intracelular (Stanley, 2003), y se deberán dirigir a
mujeres no infectadas entre 15-25 años (Harper,
2005). Los hombres debieran
vacunarse junto con las mujeres para prevenir la transmisión, aunque no tengan
efecto clínico en ellos (Harper, 2005). Siendo conocidas dos tipos de vacunas la
vacuna bivalente frente a VPH 16 y 18, Cervarix® (Laboratorios GlaxoSmithKline) y
GARCIA M.I.
32
la tetravalente frente a VPH 6, 11, 16 y 18, Gardasil® (Laboratorios Merk.
SanofiPasteur/MSD). Estas dos vacunas son diferentes en cuanto a su composición,
carga antigénica, el adyuvante y el sistema de expresión y conformación de las VLP
(Cortés et al., 2009).
La calidad de la respuesta inmune generada por las VLPs implica el mantenimiento
del elevado título de anticuerpos a lo largo del tiempo. Dichas vacunas frente al VPH
inducen concentraciones elevadas de anticuerpos neutralizantes que migran desde
el suero hasta la mucosa cervico-vaginal mediante trasudación o exudación,
obteniendo así niveles de anticuerpos lo suficientemente elevadas en el cuello del
útero como para prevenir la infección (Figura 9) (Schwarz et al., 2008). No se conoce
el nivel mínimo de anticuerpos que resulta protector, pero a mayor título y
persistencia de anticuerpos, mayor será la protección a largo plazo (Schiller & Lowy,
2009).
Figura
9:
Protección
mediana
www.crescenti.com.ar/cancer_cuello_utero/.
por
Ac
neutralizantes.
Fuente:
GARCIA M.I.
33
5.11.2. Prevención secundaria del cáncer de cuello uterino
La prevención secundaria son las actividades de detección del cáncer cervicouterino
que consisten en la aplicación sistemática de una prueba para identificar
anormalidades del cuello uterino (como el Papanicolaou, IVAA y la detección de la
presencia de VPH-AR) en una población asintomática y seguida de un tratamiento
adecuado, si amerita. Las mujeres a las cuales se dirige esta detección quizá se
sientan perfectamente sanas y no vean ninguna razón para acudir a los
establecimientos de salud, siendo estas opciones actuales para prestar servicios de
detección y tratamiento de las lesiones precancerosas. Por ello estos servicios de
detección se pueden proporcionar en forma de servicios organizados u oportunistas
(es decir, aprovechando la visita de una mujer al establecimiento de salud para otra
finalidad) o mediante una combinación de ambos (OMS & OPS, 2013).
5.11.3. Prevención terciaria del cáncer de cuello uterino
El cáncer cervicouterino de tipo invasor se trata con cirugía o radioterapia y la
quimioterapia puede complementar el tratamiento en etapas más avanzadas, pero en
muchos países hay insuficiente capacidad para prestar estos servicios, o bien los
servicios existentes no son accesibles o asequibles a la mayoría de las mujeres
afectadas. Los retos principales que se enfrentan al establecer sistemas de
tratamiento en buenas condiciones son un acceso oportuno y la continuidad hasta la
finalización del tratamiento que requieren y conseguir que a las pacientes con un
cáncer cervicouterino potencialmente mortal se les proporcione alivio del dolor
(acceso a opioides) y del sufrimiento (tanto físico como psicológico) (OMS & OPS,
2013).
GARCIA M.I.
34
VI.
MATERIALES Y MÈTODOS
6.1.
ASPECTOS DEL ESTUDIO
6.1.1. Tipo de estudio
Se realizó un estudio observacional, transversal y cualitativo
6.1.2. Lugar de estudio
El presente trabajo se realizó en el laboratorio de VPH-VIH del Proyecto UMS01R02
de la Facultad de Medicina “Dr. Aurelio Meleán” de la Universidad Mayor de San
Simón, en coordinación con el servicio de ginecología del HMIGU, desde agosto
2013 hasta febrero del 2014.
6.1.3. Población de estudio
En nuestro estudió se emplearon
98 muestras de células endocervicales (que
provienen de un estudio realizado por el Proyecto de VPH, que fueron a la vez
conservadas) de pacientes mujeres entre 18 y 65 años que acudieron a la consulta
externa del Hospital Materno Infantil Germán Urquidi (HMIGU) de la ciudad de
Cochabamba.
6.1.4. Criterios de inclusión
Se incluyeron en el estudio todas aquellas muestras que resultaron positiva para la
PCR PGMY09/11 o PCR anidada (Nested PCR GP5+/GP6+) y para la PCR SPF10
(INNO-LiPA). Todas estas muestras contaban con un resultado positivo para βglobina.
6.1.5. Criterios de exclusión
Se excluyeron en el estudio todas aquellas muestras que resultaron negativo βglobina por PCR.
GARCIA M.I.
35
6.1.6. Recolección de la muestra
Las muestras fueron obtenidas
por cepillado cervical, tomadas con anterioridad
según el criterio del ginecólogo a cargo, el cepillo fue colocado en un frasco que
contenía 10ml de Easy fix, para luego ser transportadas inmediatamente al
laboratorio y ser conservadas en alícuotas a 4°C.
6.1.7. Tipo de Muestreo
El muestreo se determinó de forma no probabilística.
6.2.
El
MATERIALES
material biológico en este estudio es un cepillado cervical y los siguientes
materiales como:

Materiales de Laboratorio

Reactivos y sustancias puras

Reactivos para extracción de ADN

Reactivos para electroforesis

Reactivos para amplificación y separación de segmentos de ADN

Oligonucleótidos

Kit de genotipificación

Equipos de Laboratorio
Son mencionados a más detalle en Anexo 1.
GARCIA M.I.
36
6.3.
METODOLOGIA
6.3.1. Extracción de ADN por el método de congelación-descongelación
La extracción del ADN viral, se realizó a partir de los cepillados cervicales que fueron
almacenadas en una solución de Easy fix, por el método de extracción de
congelamiento y descongelamiento que se encuentra más detallado en el Anexo 5
(protocolo estandarizado en el laboratorio VPH por Vèronique Fontaine).
6.3.2. Amplificación de ADN por PCR
6.3.2.1. Verificación de la calidad del ADN extraído mediante la amplificación
del gen de la β-globina humana
Para la verificación de la calidad del ADN extraído se realizó la amplificación
mediante la PCR de la β-globina humana, empleando los cebadores específicos
GH20, 5'- GAAGAG CCAAGG ACAGGTAC - 3’ y PCO4, 5' - CAACTTCATCCACGT
TCACC - 3' que amplifican un fragmento de 268 pb (Saiki et al., 1986).
Cada reacción de amplificación se realizó en un volumen total de 25 µl (20 µl de
premix que contenía una concentración final 0.2 µM de los cebadores GH20/PCO4,
3.5 mM de MgCl2, 0.2 mM de cada uno de los dNTPs, tampón Green PCR 1X, 1.25
Unidades de Go Taq ADN polimerasa-Promega), a esta mezcla se añadió 5 µl de
ADN. Controles positivos (células que contienen ADN Humano) y negativos (agua
estéril) fueron incluidos en cada corrida. La reacción se llevó a cabo en un
termociclador (BIO-RAD).
Las condiciones del termociclador consistieron en desnaturalización inicial de 95°C
por 2 minutos seguido de 35 ciclos de desnaturalización a 95°C por 30 segundos,
alineamiento a 55°C por 30 segundos y extensión a 72°C por 1 minuto, sucedido por
GARCIA M.I.
37
10 minutos de extensión final a 72°C, las muestras no procesadas inmediatamente
fueron conservadas a 4°C de acuerdo al protocolo del laboratorio.
6.3.2.2. Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) para la detección de ADN
del VPH por la PCR PGMY09/11
En las muestras que resultaron positivas para la amplificación del gen constitutivo de
β-globina humana se realizó la prueba de Reacción en Cadena de la polimerasa
(PCR) para la detección del VPH con los cebadores PGMY09/11 (secuencias en
Anexo 6). Los cebadores designados PGMY son un conjunto de cebadores que
están basados en los cebadores MY09/11, que amplifica un fragmento del gen L1
del VPH de 450 pares de bases (pb) en la región L1 del VPH (Gravitt et al., 2000).
Cada reacción de amplificación se realizó en un volumen total de 25 µl (20 µl de
premix que contenía una concentración final de 2.0 µM (mix de cebadores PGMY), 4
mM Mg Cl2, 0.2 mM de cada uno de los dNTPs, Tampón Green PCR 1X y 1.25
Unidades de GoTaq ADN polimerasa -Promega) a esta mezcla se añadió 5 µl de
ADN. La reacción se llevó a cabo en un termociclador (BIO-RAD) cuyas condiciones
del termociclador consistieron en desnaturalización inicial de 95oC por 2 minutos,
seguido de 40 ciclos de desnaturalización a 94oC por 1 minuto, alineamiento a 55oC
por 1 minuto y extensión a 72oC por 1 minuto, sucedido por 7 minutos de extensión
final a 72oC, las muestras no procesadas inmediatamente fueron conservadas a 4 oC
de acuerdo al protocolo del laboratorio.
Durante todas las corridas de PCR, se utilizó como controles negativos (agua estéril)
y como controles positivos ADN purificado de células HELA, las cuales están
transfectadas con el tipo 18 de VPH y las células SIHA que están transfectadas con
el tipo 16 de VPH.
GARCIA M.I.
38
6.3.2.3. Verificación y visualización del ADN en geles de agarosa por
electroforesis
Los resultados de todas las amplificaciones se visualizaron mediante gel de agarosa
al 2 % (Ver preparación Anexo 3), se depositó solo 15 µl del producto PCR (si la PCR
fue con Tampón Green que contiene 2 colorantes azul y amarillo que se separan
durante la electroforesis para monitorear el proceso de migración) o 12 µl del
producto de PCR más 3µl del Tampón de carga (si la PCR se realizó con Tampón
sin color que no contiene colorantes) en los pocillos correspondientes y en otro
pocillo 5 µl del marcador de peso molecular de 10.000 pares de bases (SmartLadder)
o 1000 pares de bases (Promega). El gel se colocó en la cuba de electroforesis en el
tampón TAE 0,5X (Ver preparación tampones Anexo 2). Se conectó los electrodos a
la fuente de poder a 200 V y se dejó migrar hasta que el colorante alcance la parte
inferior del gel.
Terminada la electroforesis, se visualizó las moléculas de ADN colocando el gel en
Bromuro de Etidio (Anexo 4) por 30 minutos y posteriormente con la ayuda de una
luz ultravioleta de un transiluminador se verificó la presencia de las respectivas
bandas de los productos amplificados.
6.3.3. Genotipificación de ADN
6.3.3.1. Genotipificación por INNO-LiPA Genotyping Extra
Una vez verificado la presencia del ADN del VPH por la PCR PGMY09/11 se
procedió a la genotipificación previa por la técnica de hibridación reversa INNO-LiPA
Genotyping Extra, diseñado para la detección de secuencias especificas en la región
L1 del genoma de VPH e identificación de 28 diferentes genotipos de VPH y 4 líneas
de control.
GARCIA M.I.
39
6.3.3.1.1. Amplificación de SPF10 para INNO-LiPA Genotyping Extra
Se realizó una PCR con los cebadores de SPF10, que amplificó un fragmento de 65
pb en la región L1 del genoma de VPH, previamente al proceso de genotipificación
por INNO- LiPA (Kleter et al., 1998). Donde cada reacción de amplificación se
realizó en un volumen total de 50 µl (40 µl de premix que contenía Tampón AMP mix,
una concentración final de 5 Unidades de Go Taq DNA polimerasa-Promega y H2O
estéril cantidad suficiente) a esta mezcla se añadió 10µl de ADN. Las condiciones del
programa fueron 10 min a 37° C, 9 min a 94° C seguido por 40 ciclos de 30 seg a 94
°C, 45 seg a 52 °C y 45 seg a 72 °C y seguido de una elongación final a 72 °C
durante 5 min en el termociclador (Bio-Rad). Las muestras no procesadas
inmediatamente fueron conservadas a 4°C de acuerdo al protocolo del laboratorio.
Durante todas las corridas de PCR, se utilizaron como controles negativos (muestras
negativas, H2O estéril.) y como controles positivos muestras genotipificadas con
anterioridad.
6.3.3.1.2. Hibridación por INNO-LiPA Genotyping Extra
Una vez obtenido el producto de PCR, el cual fue amplificado usando cebadores
SPF10 (patentado por Innogenetics), y los amplicones biotinilados resultantes fueron
desnaturalizados e hibridados con sondas de oligonucleótidos específicos. Un par de
cebadores adicionales para la amplificación del gen HLADPB1 humana se añade
para controlar la calidad de la muestra y de la extracción. Todas las sondas se
inmovilizan como líneas paralelas sobre tiras de membrana. Después de la
hibridación y del lavado, se añadió fosfatasa alcalina conjugada con estreptavidina,
que se une a cualquier híbrido biotinilado previamente formado.
La incubación con BCIP/NBT cromógeno produce un precipitado púrpura y los
resultados se puede interpretar visualmente usando una sola tira por muestra (Para
ver el procedimiento, Anexo 7 y 8) (Figura 10) y para luego ser interpretadas (Figura
11).
GARCIA M.I.
40
Figura 10: Principio de INNO-LiPA Genotyping Extra, adaptado del folleto de
Innogenetics.
Figura 11: Tiras de INNO-LiPA Genotyping Extra, después del proceso de hibridación
(Fuente propia).
GARCIA M.I.
41
6.3.3.2. Genotipificación por PCR GP5+/GP6+bio- EIA (Reacción en Cadena de la
Polimerasa GP5+/GP6 +bio- Enzimo Inmuno ensayo)
6.3.3.2.1. Amplificación del ADN por PCR GP5+/GP6 +bio
Una vez obtenidos los genotipos por INNO-LiPA se amplificó mediante la PCR
GP5+/GP6
+ ,
bio
empleando los cebadores específicos GP5+, 5'- TTT GTTACT GTG
GTA GAT ACT AC- 3’ y GP6+bio, 5'- GAA AAA TAA ACT GTA AAT CAT ATTC 3' que
amplificó un fragmento de 150 pb en la región L1 del genoma del VPH (Husman,
1995) esta PCR se realizó, previamente al proceso de genotipificación por EIA.
Donde cada reacción de amplificación se realizó en un volumen total de 50 µl (40 µl
de un premix que contenía una concentración final de 1.0 µM de los cebadores
GP5+/GP6+bio, 3.5 mM Mg Cl2, 0.2 mM de cada uno de los dNTPs, Tampón PCR sin
color 1X, 1.25 Unidades de Go Taq ADN polimerasa-Promega) a esta mezcla se
añadió 10 µl de ADN. Las condiciones del programa fueron 2 min a 95° C, seguido
por 40 ciclos de 1 min a 94°C, 2 min a 40°C, y 1 min a 72 °C, seguido de una
elongación final a 72 °C durante 10 min en el termociclador (Bio-Rad). Las muestras
no procesadas inmediatamente fueron conservadas a 4°C de acuerdo al protocolo
del laboratorio.
Durante todas las corridas de PCR GP5+/GP6+bio, se utilizaron como controles
negativos (muestras negativas) y como controles positivos ADN purificado de células
HELA, las cuales están transfectadas con el tipo 18 de VPH y las células SIHA que
están transfectadas con el tipo 16 de VPH y algunas muestras genotipificadas con
anterioridad.
Nota: Este producto de PCR se visualizó en gel de agarosa al 2 % y teñido con
Bromuro de Etidio, explicado adelante.
GARCIA M.I.
42
6.3.3.2.2. Hibridación por EIA (Enzimo Inmuno Ensayo)
Una vez que se obtuvo el producto de PCR, el cual se amplificó usando cebadores
GP5+/GP6+bio, se obtuvo así amplicones biotinilados, se capturaron en pocillos de
microtitulación recubiertas con estreptavidina (Streptavidin coated microplates). Se
desnaturalizó el ADN de doble hebra en condiciones alcalinas con NaOH, se eliminó
la hebra no unida mediante lavado, se añadió oligonucleótidos marcados con
digoxigenina, para que ellos se hibriden con la hebra capturada en este caso
divididos en dos diferentes cocteles (cóctel 1 que reconocen VPH 16 /18 y cóctel 2
que reconocen VPH 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68, 73 y 82). Los híbridos
se pueden detectar después de la unión del conjugado (anti-DIG-peroxidasa). Se
reveló con el sustrato correspondiente (Nitrophenyl phosphate) (Figura 12), se
procedió a
tres horas de incubación y con la ayuda de un espectrofotómetro se
procedió a la lectura a 405nm (Figura 13), como se detalla según el protocolo por
Marc Baay (Anexos 9,10 y 11).
1
5
Uno
de
los
cebadores
marcados con biotina es
capturado en los pocillos
recubiertos con estreptavidina.
2
3
2 El ADN bicatenario se
desnaturaliza en condiciones
6 alcalinas (NaOH) y la hebra
no unida se elimina mediante
6
lavado.
3
3
3
3
3
Un oligonucleótido
marcado se añade la
sonda, que se hibrida con
la hebra capturada.
Esta unión es detectada
por el sustrato.
4
Este hibrido es
detectado por el Ac.
Monoclonal.
Figura 12. Principio de la técnica de EIA en placa Comercial (Streptavidin coated
microplates) (Fuente propia).
GARCIA M.I.
43
*
Figura 13. Placa Comercial (Streptavidin coated microplates) lista para leer con el
espectrofotómetro (Fuente propia).
6.3.4. Método de análisis estadístico
6.3.4.1. Prueba de proporciones de K muestras
Para el análisis de los resultados obtenidos, primeramente se analizó la proporción
de positivos de los tres métodos de PCRs (PGMY09/11, GP5+/GP6
+ -EIA
bio
y SPF10
INNO-LiPA). Un buen método para medir el grado de concordancia entre métodos es
el test kappa, pero no fue posible aplicarlo, al no ser el adecuado, debido a las altas
prevalencias entre los dobles positivos de nuestra población, los cuales distorsionan
el kappa calculado (Thompson & Walters,
1998) y para respaldar nuestros
resultados se llegó a usar el Test de CHI2 de Proporciones cuya fórmula es:
Prueba de proporciones de K muestras:
2
𝑋 𝑝𝑟𝑢𝑒𝑏𝑎 =
(oi − ei)2
ei
GARCIA M.I.
44
La finalidad de esta prueba es evaluar la aseveración que establece que todas las
muestras independientes provienen de poblaciones que presentan la misma
proporción de algún elemento. De acuerdo con esto, las Hipótesis nula y alternativa
son:
Hipótesis nula (H0) de que los métodos son iguales.
Hipótesis alternativa (H1) de que los métodos no son iguales.
6.3.4.2. Índice de Kappa
En nuestros estudio en el que el método PCR GP5 +/GP6
+ -EIA
bio
se comparó frente
al método INNO-LiPA, una herramienta útil fue el Índice de kappa, siendo un
instrumento diseñado por Cohen que ajusta el efecto del azar en la proporción de la
concordancia observada (Cepeda & Pérez, 2001). La estimación por el índice de
kappa sigue la ecuación:
𝐾=
𝑃𝑜 − 𝑃𝑒
1 − 𝑃𝑒
Donde P0 es la proporción de concordancia observada, Pe es la proporción de
concordancia esperada por azar y 1 - Pe, representa el acuerdo o concordancia
máxima posible no debida al azar. Entonces, el numerador del coeficiente kappa
expresa la proporción del acuerdo observado menos el esperado, en tanto que el
denominador es la diferencia entre un total acuerdo y la proporción esperada por
azar. En conclusión, el kappa corrige el acuerdo sólo por azar, en tanto es la
proporción del acuerdo observado que excede la proporción por azar. Si este valor
es igual a 1, estaríamos frente a una situación en que la concordancia es perfecta
(100% de acuerdo o total acuerdo) y por tanto, la proporción por azar es cero;
cuando el valor es 0, hay total desacuerdo y entonces la proporción esperada por
azar se hace igual a la proporción observada (Cortés-Reyes et al., 2009).
GARCIA M.I.
45
Para los casos tales como la evaluación de muchos evaluadores de diferentes
métodos con el mismo tema, el índice de kappa se puede comparar con los
siguientes valores (Tabla 3).
Tabla 3: Recomendación sobre el acuerdo en base a los valores numéricos de kappa.
VALOR DE KAPPA
ACUERDO
<0.20
Pobre
0.21-0.40
Regular
0.41-0.60
Moderado
0.61-0.80
Bueno
0.81-1.00
Muy Bueno
Y para calcular una estimación de las proporciones de los diferentes resultados en
nuestra población, calculamos el Intervalo de Confianza de proporciones al 95%
(Graphpad). Para determinar que la diferencia entre ambos métodos no se deba al
azar (que las diferencias sean estadísticamente significativas). Se analizó los
resultados con el test de McNemar (Vassarstats), en el cual si su p >0,05 la Ho se
acepta.
GARCIA M.I.
46
VII. RESULTADOS
7.1. Identificación de los diferentes genotipos de VPH-AR por el método de
Hibridación Reversa INNO-LiPA Genotyping Extra
Con el propósito de conocer los genotipos de VPH más frecuentes en nuestra
población de estudio, se genotipificarón por INNO-LiPA Genotyping Extra un total de
98 muestras VPH positivas por PGMY09/11 o por Nested PCR GP5+/GP6+. Esta
última PCR se utilizó para confirmar resultados no contundentes por la PCR
PGMY09/11. Todas estas muestras fueron tomadas del Proyecto UMS01R02
realizado en el laboratorio de VPH-VIH en coordinación con el servicio de ginecología
del HMIGU, donde son referidas las mujeres con lesiones cervicales sospechosas.
La frecuencia de los genotipos de VPH en la población total estudiada (es decir sin
considerar edad ni grado de lesiones intraepiteliales) se muestra en la Figura 14. Los
genotipos más frecuentes son el VPH 16
seguido del VPH 52 (45,3 y 41,1 %
respectivamente). Con menor frecuencia (entre 14,7 – 9,5%) se observan los
genotipos de VPH 39, 58, 45, 68 y 51. Los genotipos 31, 18, 33 y 56 están presentes
entre el 8,4 – 5,3%, el genotipo VPH 18 representa el 7,4% y con una frecuencia
menor los VPH 59 y 73 de 3,2 – 2,1% respectivamente. Es importante remarcar que
se encontraron dos muestras en las cuales no se detectó ADN viral por INNO-LiPA y
una muestra en la que no se logró identificar el genotipo a pesar de ser todas ellas
PGMY09/11 positivas, estas muestras no fueron incluidas en los cálculos de
frecuencias.
GARCIA M.I.
47
73
2.1
59
3.2
56
5.3
33
5.3
Genotipos
18
7.4
31
8.4
51
9.5
68
10.5
45
12.6
58
12.6
39
14.7
52
41.1
16
45.3
0
20
%
40
60
Figura 14. Frecuencia de genotipos de VPH en la población total estudiada (n=95).
GARCIA M.I.
48
Mundo
Regiones
viasde
dedesarrollo
desarrollo
Regiones en
en vías
Regiones desarrolladas
Figura 15. Los diez tipos de VPH más frecuente entre las mujeres con y sin lesiones
cervicales en el mundo comparado con regiones en vías de desarrollo y desarrolladas.
Fuente: (ICO, 2014)
GARCIA M.I.
49
7.2. Determinación de los genotipos de VPH-AR más frecuentes en citologías
“sin lesiones intraepiteliales”, “LIE-B” y “LIE-A”, para la aplicación de los
cocteles de oligonucleótidos en la técnica PCR GP5+/GP6+bio –EIA.
Para definir los cocteles de oligonucleótidos digoxigenados en la detección de VPHAR por la técnica de PCR GP5+/GP6+bio –EIA, hemos analizado la frecuencia de
genotipos de VPH-AR por la técnica de Hibridación reversa INNO-LiPA Genotyping
Extra en muestras con resultados de PAP y/o histopatología que reportan sin
“lesiones intraepiteliales (citología normal o inflamatorio)”, “LIE- B” y “LIE-A” (Figuras
16, 17 y 18).
73
3.0
59
3.0
56
3.0
33
3.0
51
3.0
b
9.1
31
68
15.2
50.0
45
15.2
40.0
58
15.2
18
15.2
20.0
36.4
52
%
50
14.7
8.8
10.0
39.4
16
0
38.2
30.0
21.2
39
35.3
%
Genotipos
a
2.9
0.0
100
<25
25-34
35-44
45-54
>54
Edad
Figura 16. a) Tipos de VPH más frecuentes en mujeres con resultado de citologías “sin
lesiones intraepiteliales o citología normal” (N=33), b) Representación del rango de
edades de las mujeres estudiadas.
GARCIA M.I.
50
68
7.1
58
7.1
59
7.1
31
7.1
b
56
14.3
50.0
39
14,0
40.0
33
14,0
30.0
45
%
Genotipos
a
29,0
20.0
52
43,0
16
43,0
0
%
35.7
28.6
21.4
14.3
10.0
0.0
0.0
50
<25
100
25-34
35-44
45-54
>54
Edad
Figura 17. a) Tipos de VPH más frecuentes en mujeres con resultado de citologías con
lesiones de bajo grado (LIE- B; N=14), b) Representación del rango de edades de las
mujeres estudiadas.
18
8.3
58
8.3
45
8.3
b
39
17,0
50.0
68
17,0
40.0
51
17,0
52
41.7
30.0
20.0
25,0
8.3
10.0
16
66.7
0
41.7
%
Genotipos
a
%
50
0.0
100
8.3
0.0
<25
25-34
35-44
45-54
>54
Edad
Figura 18. a) Tipos de VPH más frecuentes en mujeres con resultado de citologías con
lesiones de alto grado (LIE- A; N=12) b) Representación del rango de edades de las
mujeres estudiadas.
GARCIA M.I.
51
Como se observa en las Figuras 16, 17 y 18, el amplio número de genotipos
detectado en la Figura 16 va disminuyendo de acuerdo al grado de lesión y la edad
(Figura 18). Trece genotipos diferentes fueron identificados en mujeres con resultado
de citología sin lesiones intraepiteliales (Figura 16), 10 genotipos en mujeres con
lesiones de bajo grado (Figura 17) y 8 genotipos en mujeres con lesiones de alto
grado (Figura 18). También se puede observar que la edad de las mujeres está
inversamente relacionada con el número de genotipos de VPH detectados. Mujeres
sin lesiones en su mayoría son jóvenes menores de 34 años (73,5%). Por el contrario
las mujeres con lesiones de alto grado son mujeres mayores a 34 años (91,7%)
donde en la mayoría de ellas (66,7%) presentan VPH 16 (Figura 18). Hay que
resaltar que la frecuencia de infecciones múltiples o co-infecciones en este estudio (>
a dos genotipos) es elevada (63,2%), y no varía sustancialmente entre mujeres con
citología normal (CN) 61,4%; LIE-B, 71% o LIE-A, 58,3%.
El VPH 16 y el VPH 52 (Figura 16) son los 2 genotipos más frecuentemente
encontrados
en
mujeres
sin
lesiones
intraepiteliales
(39,4
%
y
36,4%
respectivamente), 43% de las muestras con lesiones de bajo grado presentan ambos
genotipos. En cambio, en mujeres con lesiones de alto grado la frecuencia del VPH
52 disminuye (25%) mientras que el VPH 16 aumenta considerablemente (66,7%).
En cuanto a la frecuencia del VPH 18, este es variable, ya que se encontró en
mujeres sin lesiones o citología normal en un 15,2%, no se lo identifico en mujeres
con lesiones de bajo grado, y finalmente el VPH 18
llego a
estar presente
nuevamente en mujeres con lesiones de alto grado con una frecuencia del 8,3%.
En base a estos resultados dos cócteles de oligonucleótidos que reconocen dos
grupos de VPH - AR fueron preparados para realizar la técnica de EIA: el cóctel 1
con oligonucleótidos digoxigenados que reconocen los VPH 16 y 18 y el cóctel 2,
que reconocen los VPH 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68, 73 y 82. Como se
mencionó anteriormente la justificación para la preparación de estos dos cócteles
fue: la frecuencia y la persistencia de los diferentes VPHs en mujeres con LIE-A.
Aunque la presencia del VPH 18 es inferior o similar a otros genotipos, nosotros lo
GARCIA M.I.
52
hemos incluido en el primer cóctel dada su importante frecuencia en mujeres con
cáncer cervical a nivel mundial, y porque se sospecha que induce una más rápida
evolución hacia el cáncer que el VPH 16 (Burger et al., 1996).
Para la preparación del cóctel 2, se consideró los otros 13 VPH – AR restantes.
Aclaramos que los genotipos: 52, 58, 18, 51 y 45 forman parte de los 10 genotipos
más frecuentemente observados en nuestro estudio y a nivel mundial en mujeres con
LIE-A (Figuras 15 y 18). Los genotipos VPH 31, 33 y 35 también fueron incluidos
dada su importante frecuencia en LIE-A a nivel mundial aunque no forman parte de
los 10 más frecuentes en nuestro estudio. Los genotipos 68 y 39 (no reportados
como los más frecuentes por ICO 2014), fueron incluidos en el cóctel 2 dado que
forman parte del grupo de los 10 VPH-AR más frecuentes en nuestro estudio. Los
genotipos VPH-AR 56, 59, 73 y el VPH 82 fueron incluidos en el cóctel 2 por la
disponibilidad de oligonucleótidos en el laboratorio.
7.3. Comparación de las técnicas de PCR PGMY09/11, SPF 10 INNO-LiPA y PCR
GP5+ /GP6+bio-EIA para la detección de ADN viral.
Para verificar la calidad del ADN extraído en todas las muestras se amplifico un
fragmento del gen de β-Globina (268 pb) que fue visualizado por electroforesis en
gel de agarosa al 2% (Figura 19). Como la base para la amplificación de las dos
técnicas de PCR para la detección de VPH-AR tienen diferentes partidores, lo
primero que hemos realizado es la comparación de estas dos tecnicas con la PCR
inicial empleada para la detección de VPH (PCR PGMY09/11). Como se menciono
en el marco teórico, los tres métodos de PCR amplifican diferentes fragmentos de la
región L1 del genoma del VPH: PGMY09/11 (450 pb), GP5+ /GP6+bio (150 pb; para
el EIA) y SPF10 (para la hibridación reversa con INNO-LiPA; 65 pb). Los productos
amplificados
por
estos
cebadores
fueron
visualizados
mediante
corridas
electroforéticas en gel de agarosa 2% (Figuras 20 y 21).
GARCIA M.I.
53
#1
#2
#3
#4
#5
#6
#7
10000
3000
2000
1500
1000
800
600
400
200
Figura 19. Electroforesis en gel de agarosa al 2% de los productos amplificados por PCR
de una fracción del gen de β-globina humana. Carriles 1y7, Marcador de peso; carril 2,
Control Positivo; Carriles 3, 4, 5, Muestras y Carril 6 Control Negativo.
#1
#2
#3
#4
#5
#6
#7
10000
3000
2500
2000
1000
800
600
400
200
Figura 20. Electroforesis en gel de agarosa al 2% de los productos amplificados por PCR
con los cebadores PGMY09/11. Carril 1, Control Positivo; Carriles 2, 3, 4, 5 Muestras;
Carril 6, Control Negativo y Carril 7 Marcador de peso.
GARCIA M.I.
54
#1
#2
#3
#4
#5
#6
#7
1000
750
500
300
150
50
Figura 21. Electroforesis en gel de agarosa al 2% de los productos amplificados por PCR
con los cebadores GP5+/GP6+bio. Carril 1 y 6, Controles Positivos; Carriles 2, 3, 4,
Muestras; Carril 5, Control Negativo y Carril 7, Marcador de peso.
Cuando comparamos la proporción de positivos entre las tres PCRs (resultados
obtenidos por electroforesis en gel y/o después de la hibridación) para cualquier tipo
de VPH (alto o bajo riesgo), encontramos que la PCR PGMY09/11 detectó ADN del
VPH en 90/98 muestras (91,8%; 95% CI, 0,85 - 0,96), la PCR SPF10 INNO-LiPA
reveló ADN-VPH en 96/98 muestras (97,9%; 95% CI, 0,92 - 0,99) y PCR GP5+ /GP6+
bio
-EIA detectó 84/98 muestras (85,7%; 95% CI, 0,77 - 0,91) (Tabla 4). Utilizando el
test de Chi-cuadrada (X2) ponderada para K muestras concluimos que la diferencia
de proporciones observada entre las tres PCRs no es significativa (p = 0,67), dado
que el valor de la X2calculada es 0,8 menor que X2tabulada (5,99).
GARCIA M.I.
55
Tabla 4. Tabla de Contingencia 2x2 de los resultados de detección del VPH mediante la
amplificación con cebadores: a) PGMY09/11 vs SPF10; b) PGMY09/11 vs GP5+/GP6+bioEIA y c) GP5+/GP6+bio-EIA vs SPF10.
a
b
c
Es importante recalcar que hemos observado una diferencia entre la positividad
detectada en gel de agarosa después de la electroforesis post PCR GP5 +/ GP6+bio
(76,5%) y la positividad detectada luego de la hibridación (85,7%). En efecto, 9 de 84
(11%) muestras (Tabla 5) en las cuales no se visualizó ADN viral después de la
electroforesis post PCR GP5+ /GP6+bio fueron hibridadas en el EIA por uno u otro
cóctel. Como todas las muestras analizadas en este estudio fueron positivas para el
gen de la β-globina (Figura 19), asumimos que existe una baja sensibilidad de
detección de ADN en gel de agarosa sin la subsecuente etapa de hibridación.
Como se mencionó anteriormente en las Tablas 5 y 9 no se muestran los resultados
de tres
muestras PGMY09/11 y PCR GP5+ /GP6+bio positivas; en dos de estas
muestras no se detectó ADN viral por INNO-LiPA y en una no se logró identificar el
genotipo por INNO-LiPA, posiblemente porque este genotipo no está incluido dentro
del grupo del VPHs que identifica el INNO-LiPA, todas estas muestras fueron
incluidas en el análisis estadístico.
GARCIA M.I.
56
Tabla 5. Detección de ADN de VPH por PCR PGMY09/11, PCR GP5+ /GP6+ bio (PCR-EIA)
Infección n°
Mono
Tipo de PGMY Gp5+/Gp6+
EIA* Infección n°
VPH 09/11 Gel
1
6
2
16
3
16
4
16
5
16
6
16
7
16
8
16
9
16
10
16
11
16
12
16
13
16
14
16
15
16
16
16
17
16
18
18
19
45
20
45
21
51
22
51
23
52
24
52
25
53
26
54
27
66
28
66
29
66
30
66
31
66
32
66
33
66
34
68
35
68
⁺
⁺
⁺
⁺
⁺
⁺
⁺
⁺
⁺
⁺
⁺
⁻
⁻
⁺
⁺
⁺
⁺
⁺
⁺
⁺
⁺
⁺
⁺
⁺
⁻
⁻
⁺
⁺
⁺
⁺
⁺
⁺
⁻
⁺
⁺
⁺
⁺
⁺
⁺
⁺
⁺
⁻
⁻
⁻
⁺
⁻
⁻
⁻
⁺
⁺
⁺
⁺
⁺
⁺
⁺
⁺
⁻
⁺
⁺
⁻
⁻
⁺
⁺
⁺
⁺
⁺
⁺
⁺
⁺
⁺
⁻
⁺
⁺
⁺
⁺
⁺
⁺
⁺
⁻
⁺
⁺
⁺
⁻
⁺
⁺
⁺
⁺
⁺
⁺
⁺
⁺
⁺
⁻
⁻
⁺
⁻
⁻
⁻
⁻
⁻
⁻
⁻
⁺
⁺
⁺
Doble
Tipo de PGMY Gp5+/Gp6+
VPH 09/11 Gel
1 16,66
2 6,52
3 16,66
4 16,52
5 45,52
6 6,33
7 16,66
8 58 (52)
9 16,52
10 16, 52
11 6,16
12 52, 56
13 45,51
14 45,52
15 16,66
16 52,66
17 31,74
18 16, 52
19 16, 52
20 45,52
21 39,45
22 51, 52
23 45, 52
24 52,58
25 6,52
26 16,52
27 16, 68
⁺
⁺
⁺
⁺
⁺
⁺
⁺
⁺
⁺
⁺
⁺
⁺
⁺
⁺
⁺
⁺
⁺
⁺
⁺
⁺
⁻
⁺
⁺
⁺
⁺
⁺
⁺
⁺
⁺
⁺
⁺
⁺
⁺
⁺
⁺
⁺
⁻
⁺
⁺
⁺
⁺
⁺
⁺
⁺
⁺
⁺
⁺
⁻
⁻
⁺
⁺
⁻
⁺
⁺
EIA*
⁺
⁻
⁻
⁺
⁺
⁻
⁺
⁺
⁻
⁻
⁺
⁺
⁻
⁺
⁺
⁻
⁻
⁺
⁺
⁺
⁻
⁻
⁺
⁻
⁻
⁺
⁺
Infección n°
Triple
PGMY Gp5+/Gp6+
EIA*
09/11 Gel
Tipo de VPH
1 58,59,66
2 39,68,73
3 16,45,52
4 68,52 (39)
5 16,58 (52)
6 6,11,66
7 53, 58, 66
8 44, 70, 74
9 16,43,66
10 16,44,58
11 16,52,66
12 16,56,52
13 33,45,31
14 16,58,56
15 16, 52, 58
16 18,52,(39)
17 18, 51, (39)
18 6(44,52)
>4
1 11,16,58,39
2 69,71,31,53
3 33,53 (52,54,69 o 71)
4 16, 31, 59, 56, (52, 54)
5 31,33,68 (39,73,54,52)
6 39,52,66,68
7 31,33,52,54,66
8 16,26,39,45,66,68
9 11,16,18,31,39,52,53,54
10 16,18,39,52,58,66
11 18, 45, 51, 58, 68, (39, 52)
12 16,18,51,58,59 (39,52)
13 6,16,68,39,56,66,51,52
14 53,52,66,74
15 33, 51, (52, 54)
⁺
⁺
⁺
⁺
⁺
⁺
⁺
⁺
⁺
⁺
⁺
⁺
⁺
⁺
⁺
⁻
⁻
⁺
⁺
⁺
⁺
⁺
⁺
⁺
⁺
⁻
⁺
⁻
⁻
⁺
⁺
⁻
⁺
⁺
⁺
⁺
⁺
⁺
⁺
⁻
⁺
⁻
⁺
⁻
⁻
⁻
⁻
⁺
⁺
⁺
⁺
⁻
⁺
⁻
⁺
⁺
⁺
⁺
⁺
⁺
⁺
⁺
⁺
⁺
⁺
⁺
⁺
⁺
⁺
⁺
⁺
⁺
⁻
⁺
⁻
⁺
⁺
⁺
⁺
⁺
⁺
⁻
⁻
⁻
⁺
⁻
⁻
⁻
⁺
⁺
⁺
⁺
⁺
⁺
⁺
⁺
⁻
⁻
⁻
EIA*: Se considero positivo, si fue positivo para cualquiera de los dos cocteles.
GARCIA M.I.
57
7.4. Evaluación de la capacidad de detección de genotipos de VPH-AR de la
técnica PCR GP5+/GP6+bio -EIA comparándola con la técnica de hibridación
reversa INNO-LiPA Genotyping Extra.
Con el objetivo de evaluar la capacidad de la técnica de PCR GP5+/GP6+ bio -EIA de
detectar los VPH-AR hemos comparado los genotipos de VPH-AR detectados por
INNO-LiPA con los resultados de las muestras que dieron positivas por hibridación
con cualquiera de los dos cocteles en la PCR GP5+/GP6+ bio -EIA (ver Tablas 6 y 9).
En 82/98 (83,7%; 95% CI, 0,75 - 0,89) muestras que fueron analizadas por INNOLiPA se detectaron uno o más genotipos de alto riesgo. Con la técnica de EIA, 58 de
las 98 fueron reactivas a uno de los dos cocteles (59,2%; 95% CI, 0,49 - 0,68)
mostrándonos claramente que la técnica PCR GP5+/GP6+bio -EIA ha detectado
menos casos VPH -AR (Tabla 6). Aplicando el test de McNemar (p = 0,000008), se
comprueba que existen diferencias significativas entre estas dos proporciones. Un
resumen de los resultados de esta comparación
se muestra en la tabla de
contingencia (Tabla 6). El acuerdo o concordancia entre estas dos técnicas para la
identificación de VPH-AR es “Regular" (kappa = 0,3; 95% IC, 0,13 - 0,47).
Tabla 6. Tabla de Contingencia 2x2 de los resultados de la detección de VPH-AR
obtenidos por INNO-LiPA vs PCR GP5+/GP6+bio – EIA.
INNO-LiPA
Pos
Neg
Total
PCR-EIA
Pos
Neg
Total
55
27
82
3
13
16
58
40
98
GARCIA M.I.
58
Si comparamos la capacidad de ambas técnicas para la detección de los VPH 16/18
(Tabla 7), es decir resultados INNO-LiPA vs los resultados de la PCR GP5+/GP6+bio EIA con el cóctel 1 que contiene oligonucleótidos solo para detectar VPH 16/18, el
índice de kappa es de 0,51 (95% CI, 0,34–0,68), con una concordancia “Moderada”.
La comparación de proporciones medida por McNemar indica que no existen
diferencias significativas (p = 0,15) entre ambas técnicas para la detección de estos
genotipos.
Tabla 7. Tabla de Contingencia 2x2 de los resultados de identificación de VPH 16/18
obtenidos por INNO-LiPA vs PCR GP5+/GP6+bio – EIA.
PCR-EIA
INNO-LiPA
Pos
Neg
Total
Pos
Neg
Total
31
16
47
8
43
51
39
59
98
7.4.1. Concordancia entre INNO-LiPA vs PCR GP5+/GP6+bio- EIA en mono y
múltiples infecciones
Como se mencionó anteriormente, en nuestro estudio la presencia de múltiples
infecciones es elevada 60/95 (63,2 %), observando 15 (15,8%) muestras con más de
4 genotipos, 18 muestras con triples-infecciones (18,9%), 27 muestras con dos
genotipos (28,4%) y 35 con mono-infecciones (36,8%). En este análisis se
descartaron la muestra en la que no se identificó genotipos o que fueron negativas
por INNO-LiPA (Tabla 9).
GARCIA M.I.
59
Cuando analizamos la capacidad de la técnica PCR GP5+/GP6+bio - EIA para la
detección de los VPH -AR en comparación con la técnica de hibridación reversa
INNO-LiPA sin discriminar mono o múltiples infecciones, la
concordancia que
encontramos es “Regular” (kappa = 0,3), esta concordancia mejora cuando se trata
de discriminar VPH 16 /18 (kappa = 0,51). Si realizamos el mismo test de
concordancia en muestras
con mono-infecciones, el acuerdo entre PCR
GP5+/GP6+bio-EIA e INNO-LiPA para la detección de los VPH 16/18 (Tabla 8) es
“Bueno” (kappa = 0,71; 95% IC, 0,48-0,95) y lógicamente no se observan diferencias
significativas entre ambos test (McNemar p=1).
Tabla 8. Tabla de Contingencia 2x2 de los resultados de identificación de VPH 16/18
obtenidos por INNO-LiPA vs PCR GP5+/GP6+bio – EIA en mono infecciones.
PCR-EIA
INNO-LiPA
Pos
Neg
Total
Pos
Neg
Total
15
2
17
3
15
18
18
17
35
GARCIA M.I.
60
Tabla 9. Tipos de VPH detectados por INNO-LiPA y PCR GP5+/GP6+bio -EIA (Cóctel 1 y
Cóctel 2).
Infección n° Tipo de VPH
INNO-LiPA
Mono
1
6
2
16
3
16
4
16
5
16
6
16
7
16
8
16
9
16
10
16
11
16
12
16
13
16
14
16
15
16
16
16
17
16
18
18
19
45
20
45
21
51
22
51
23
52
24
52
25
53
26
54
27
66
28
66
29
66
30
66
31
66
32
66
33
66
34
68
35
68
Infección n° Tipo de VPH
EIA
C1* C2**
⁻
⁺
⁺
⁺
⁺
⁺
⁺
⁺
⁻
⁺
⁺
⁺
⁻
⁺
⁺
⁺
⁺
⁺
⁺
⁻
⁻
⁻
⁻
⁻
⁺
⁻
⁻
⁻
⁻
⁻
⁻
⁻
⁺
⁻
⁻
⁻
⁻
⁻
⁻
⁻
⁻
⁻
⁻
⁻
⁻
⁻
⁻
⁻
⁻
⁻
⁻
⁺
⁺
⁺
⁺
⁺
⁺
⁻
⁻
⁻
⁻
⁻
⁻
⁻
⁻
⁻
⁻
⁺
⁺
⁺
Doble
Infección n° Tipo de VPH
EIA
INNO-LiPA C1* C2**
1 16,66
⁺ ⁻
2 6,52
3 16,66
4 16,52
5 45,52
6 6,33
7 16,66
8 58 (52)
9 16,52
10 16, 52
11 6,16
12 52, 56
13 45,51
14 45,52
15 16,66
16 52,66
17 31,74
18 16, 52
19 16, 52
20 45,52
21 39,45
22 51, 52
23 45, 52
24 52,58
25 6,52
26 16,52
27 16, 68
⁻
⁻
⁺
⁻
⁻
⁺
⁻
⁻
⁻
⁺
⁻
⁻
⁺
⁺
⁻
⁻
⁺
⁺
⁺
⁻
⁻
⁺
⁻
⁻
⁺
⁺
⁻
⁻
⁻
⁺
⁻
⁻
⁺
⁻
⁻
⁻
⁺
⁻
⁺
⁻
⁻
⁻
⁻
⁻
⁺
⁻
⁻
⁺
⁻
⁻
⁻
⁺
Triple
EIA
C1* C2**
INNO-LiPA
1 58,59,66
2 39,68,73
3 16,45,52
4 68,52 (39)
5 16,58 (52)
6 6,11,66
7 53, 58, 66
8 44, 70, 74
9 16,43,66
10 16,44,58
11 16,52,66
12 16,56,52
13 33,45,31
14 16,58,56
15 16, 52, 58
16 18,52,(39)
17 18, 51, (39)
18 6(44,52)
⁻
⁻
⁻
⁻
⁻
⁻
⁻
⁻
⁻
⁻
⁻
⁺
⁺
⁺
⁺
⁻
⁺
⁻
⁺
⁺
⁺
⁻
⁺
⁻
⁺
⁻
⁻
⁻
⁻
⁻
⁺
⁻
⁺
⁻
⁺
⁻
⁺
⁻
⁻
⁻
⁻
⁻
⁻
⁻
⁻
⁻
⁺
⁺
⁻
⁻
⁻
⁻
⁻
⁻
⁻
⁺
⁺
⁺
⁺
⁺
⁺
⁺
⁺
⁻
⁻
⁻
>4
1 11,16,58,39
2 69,71,31,53
3 33,53 (52,54,69 o 71)
4 16, 31, 59, 56, (52, 54)
5 31,33,68 (39,73,54,52)
6 39,52,66,68
7 31,33,52,54,66
8 16,26,39,45,66,68
9 11,16,18,31,39,52,53,54
10 16,18,39,52,58,66
11 18, 45, 51, 58, 68, (39, 52)
12 16,18,51,58,59 (39,52)
13 6,16,68,39,56,66,51,52
14 53,52,66,74
15 33, 51, (52, 54)
*Cóctel 1: Con oligos :16 y 18
** Cóctel 2: Con oligos:31,33,35,39,45,51,52,56,58,59,68,73,82
GARCIA M.I.
61
VIII. DISCUSIÓN
8.1. Frecuencia de genotipos en la población de estudio
La frecuencia de los genotipos observada en nuestra población de estudio mediante
la técnica de Hibridación reversa INNO-LiPA Genotyping coincide con la frecuencia
reportada por ICO 2014 (Figura 15), donde el VPH 16 es el mas frecuente (45,3%),
similar al descrito en todo el mundo sin importar las diferentes regiones (paises en
vias de desarrollo vs paises desarrollados). El segundo genotipo mas frecuentemente
detectado es el VPH 52 con 41,1%, en el reporte de ICO 2014, tambien es el
segundo o tercer genotipo mas frecuente, aunque su porcentaje es mucho menor.
El VPH 68 que figura entre los 10 genotipos mas frecuentes en nuestro estudio
(10,5%), no es mencionado en ningun tipo de lesion ni en las diferentes regiones en
el reporte de ICO (2014). Posiblemente este genotipo esta en mucha menor
frecuencia por lo cual no es mencionado en este reporte.
8.2. Análisis de la frecuencia de genotipos para la preparación de los cocteles
Para definir los cocteles de oligonucleótidos digoxigenados para la detección de
VPH-AR por la técnica de PCR GP5+/GP6+bio–EIA, hemos analizado los genotipos y
su frecuencia presentes en todas las pacientes.
Una primera observación es que, el número de genotipos es mayor en mujeres con
citología normal o inflamatoria, y que este disminuye con la edad y el grado de lesión
(Figuras 16, 17 y 18). Se sabe bien que mujeres con citología normal o LSIL, es
frecuente una mayor variedad de tipos de VPH que en el grupo de mujeres con
lesiones más avanzadas (Szostek et al., 2008) y que mujeres de mayor edad tienen
menor riesgo de contraer infección por el virus, debido probablemente a la inmunidad
adquirida al VPH por exposiciones pasadas (Ho, 1998). Aunque algunas infecciones
producidas por VPH se van a eliminando a lo largo del tiempo, el VPH 16
especialmente, se establece como una infección persistente lo que puede ocasionar
GARCIA M.I.
62
el desarrollo de lesiones de alto grado y cáncer. En efecto la persistencia de VPH 16
y el incremento de su porcentaje en mujeres con lesiones de alto grado está bien
documentada (Szostek et al., 2008; Zerbini et al., 2001).
La importancia clínica de la co-infección en la etiología del cáncer de cérvix es causa
de extenso debate aunque la evidencia apunta a que los genotipos que co-infectan el
cérvix actúan de forma independiente en el desarrollo de las lesiones cervicales. En
este estudio la frecuencia de infecciones múltiples (co-infecciones) es elevada
(63,2%). En la bibliografía se encuentra un amplio rango en el porcentaje de coinfecciones; porcentajes elevados similares al de este estudio han sido observados
por García y col en una población Colombiana (80,6%) (García et al., 2010), sin
embargo la mayoría de los reportes mencionan frecuencia bajas de hasta 8,1%
(Muñoz et al., 2003). Esta variación en la detección de las múltiples infecciones
puede deberse por un lado a factores demográficos y clínicos (inicio de las relaciones
sexuales, números de parejas, inmunidad, etc.) y por otro lado a la distinta
sensibilidad de las técnicas empleadas para la detección e identificación de los VPH.
La técnica que empleamos en este estudio evalúa 28 tipos virales (INNO-LiPA) y 15
tipos virales (PCR GP5+/GP6+bio -EIA), en comparación con los 48 tipos virales
detectados por la técnica de Luminex® xMAP® en el estudio de García y col. (2010)
y los 37 tipos virales detectados por (Muñoz et al., 2003). Hay que remarcar que el
sistema INNO-LiPA, al parecer detecta más infecciones múltiples que otros ensayos
de PCR (Van Doorn et al., 2002) lo que explicaría nuestros resultados.
Otro VPH –AR, es el VPH 18, el cual es el segundo genotipo más frecuente en casos
de cáncer cervical, más carcinogénico que el VPH 16 y la frecuencia del VPH 18 en
nuestro estudio, es notoriamente variable y va desde 15,2% (Normal) a 8,3% (alto
grado) en fusión de tipo de lesión. Aunque nuestros resultados se basan en una
población pequeña de mujeres (n=95), este VPH se posiciona también entre los 10
más frecuentes de manera similar al mostrado en el reporte ICO 2014 (Figura 15).
GARCIA M.I.
63
La frecuencia reportada de este VPH está entre 7,8 y 6,2 % en mujeres con lesiones
de alto y bajo grado.
En base a este análisis de frecuencias de los diferentes genotipos se procedió a la
preparación de los dos cocteles de oligonucleótidos que reconocen los dos grupos de
VPH - AR para realizar la técnica de EIA: el cóctel 1
con oligonucleótidos
digoxigenados que reconocen los VPH 16 y 18 y el cóctel 2, que reconocen los VPH
31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68, 73 y 82.
8.3. Capacidad de detección de ADN viral
La comparación de la detección de ADN viral entre las técnicas de PCR PGMY09/11,
SPF 10 INNO-LiPA y PCRGP5+/GP6+bio-EIA para VPH (alto o bajo riesgo) muestra
que la SPF10 INNO-LiPA detecta ADN viral en más muestras que la PCR
PGMY09/11 y la PCR GP5+ /GP6+bio, no obstante,
el test de Chi-cuadrada (X2)
ponderada no mostro diferencias significativas (p = 0,67) entre las tres PCR. Por lo
tanto podemos indicar que no existe una diferencia sustancial entre estas tres
técnicas ya que las variaciones observadas son mínimas y no influyen
significativamente entre ellas. La PCR SPF10 detecto ADN viral en 6 muestras que
fueron negativas por PGMY09/11, estas muestras probablemente tienen niveles muy
bajos de DNA viral puesto que fueron determinadas como positivas por la Nested
PCR o por la SPF10 anteriormente. La técnica de PCR GP5+ /GP6+bio, fue negativa
en 12 muestras donde la PCR PGMY09/11 y/o PCR SPF10 fueron positivas. Al
parecer los sistemas de PCR que usan cebadores múltiples tales como PGMY09/11
o la SPF10 son más robustos que los sistemas que utilizan cebadores de consenso
individuales tales como GP5+ /GP6+, siendo óptimos para detectar múltiples
infecciones (Iftner & Villa 2003). Esto parece ser cierto ya que en nuestro estudio, la
gran mayoría de las muestras tienen multi-infecciones.
La positividad basada únicamente en la visualización de bandas en agarosa post
electroforesis (sin hibridación) podría en muchos casos influir en la sensibilidad de
estos métodos como se evidencia para la PCR GP5+ /GP6+bio. Este hecho fue
GARCIA M.I.
64
observado por Gillio-Tos y col. (Gillio-Tos et al., 2006) y Raji y col. (Raji et al.,
2011), comentando este último, que la visualización de ADN post PCR tiene un límite
de detección pobre, no es específica y es muy subjetiva en cuanto a la cuantificación
del producto.
8.4. Capacidad de detección de genotipos de VPH-AR de la técnica PCR
GP5+/GP6+bio - EIA.
Cuando se comparó la capacidad de detección de genotipos de VPH-AR por la
técnica de PCR GP5+/GP6+ bio –EIA con los resultados encontrados por INNO-LiPA,
se observó que la concordancia kappa entre ambas técnicas para detectar VPH -AR
fue “Regular” (kappa = 0,3) y la concordancia para la detección de VPHs 16/18 fue
“Moderada” (kappa = 0,51) en mujeres en general (tanto con mono y múltiples
infecciones). La concordancia entre ambas técnicas para la detección de VPH 16 o
18 en caso de
mono-infecciones es “Buena” (kappa = 0,71). Esta mejor
concordancia entre técnicas cuando se analiza muestras con mono-infecciones ya ha
sido observada por Gillio-Tos y col. (kappa = 0,87 muy buena) (Gillio-Tos et al.,
2006) en un estudio similar comparando INNO-LiPA vs PCR-EIA. La mayoría de los
estudios encontrados en la revisión bibliográfica comparan el INNO-LiPA con otros
métodos tales como qPCR (Melkane et al., 2013), multiplex PCR (Else et al., 2010)
y AdvanSure (Chung & Lee,
2014) con concordancias (Test kappa) que van desde
0,44 a 0,98 sin mencionar múltiples o mono infecciones. También hay reportes de
variaciones en la sensibilidad para detectar uno u otro genotipo en función de la
técnica empleada (Chung & Lee,
2014, Gillio-Tos et al.,
2006). Anteriormente
hemos mencionado que el sistema de PCR PGMY09/11 usa un set de múltiples
cebadores, al parecer esta PCR es más robusta para detectar múltiples infecciones
que los sistemas que usan cebadores de consenso simple como GP5+/GP6+ (Iftner &
Villa, 2003).
El sistema de cebadores SPF10 también tiene mayor sensibilidad y robustes para
detectar múltiples infecciones (Iftner & Villa,
2003). La alta sensibilidad de este
último cebador puede ser explicada por el tamaño pequeño de los amplicones (Iftner
GARCIA M.I.
65
& Villa, 2003), lo que permite la detección de ADN del VPH en muestras con baja
carga viral o en muestras con ADN fragmentado (como es el caso en ADN
recuperado de tacos biopsias) (Kleter et al., 1999). Estas características pueden
hacer la diferencia cuando se tienen casos de múltiples infecciones, dado que la
cinética de la PCR podría ser diferente y variar en función de la presencia de gran
cantidad de ciertos genotipos en desmedro de los genotipos presentes en pequeña
cantidad como menciona Iftner & Villa (2003) para PCR SPF10.
Otro aspecto a remarcar es que en nuestros resultados hemos podido observar que
el VPH 52, omnipresente en las muestras genotipificadas por el sistema INNO-LiPA,
no fue detectado por la PCR GP5+/GP6+bio –EIA (en caso de muestras mono
infectadas con VPH 52, coinfectadas con VH16 y/o 18 o con VPH de bajo riesgo),
esta observación también fue descrita por Chung & Lee (2014) y Hesselink y col.
(Hesselink et al., 2008). De principio, pensamos que existía un problema con el
oligonucleótido específico para VPH 52 del cóctel 2, sin embargo revisando la
bibliografía hemos encontrado que, aparentemente los cebadores GP5 + /GP6+ tienen
menor sensibilidad para detectar bajas cargas de VPH 52, en comparación con
MY09/11 o PGMY09/11 (Qu et al., 1997; Chan et al., 2006), este hecho explica
muy bien estas diferencias de sensibilidad entre estas dos PCRs por la detección de
VPH 52 en nuestros ensayos.
Por todo lo mencionado anteriormente pensamos que las variaciones encontradas
(resultados discordantes) no se deben únicamente a las posibles diferencias en la
sensibilidad de los cebadores, sino también se ven afectados por presencia de multiinfecciones. Estos resultados muestran la necesidad de estandarizar los ensayos de
detección y genotipificado del VPH intra e inter laboratorios.
GARCIA M.I.
66
IX.
CONCLUSIONES

Los genotipos de VPH detectados por INNO-LiPA más frecuentes en nuestra
población (en mujeres de todas las edades) son el VPH 16 (45,3%) seguido
de VPH 52 (41,1 %), juntos constituyen el 86,4%. Con menor frecuencia se
observan los VPH 39, 58, 45, 68 y 51 (entre 14,7 y 9,5 %) y con mucha menor
frecuencia los VPH 31, 18, 33 y 56 (8,4- 5,3%), y VPH 59, 73 (3,2% y 2,1%
respectivamente). Se ve que el VPH 18 representa el 7,4%.

Dos cocteles de oligonucleótidos específicos de hibridación para la técnica de
PCR-EIA se prepararon considerando la frecuencia de los genotipos de VPH AR encontrados en diferentes grados de lesión y el comportamiento de estos
que tienden a persistir a medida que aumenta el grado de la lesión o la
alteración citológica en mujeres con LIE-A:
Cóctel 1 con oligonucleótidos que reconocen los VPH 16 por su persistencia
y el VPH 18 por su mayor oncogenecidad.
Cóctel 2, que reconocen los VPH 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68, 73
y 82 con un total de 13 VPH –AR.

Las técnicas de PCR PGMY09/11, PCR GP5+/GP6+bio–EIA y SPF10 para la
detección de VPH, tienen una buena capacidad de detección del ADN viral
(91,4%, 85,7% y 97,9% respectivamente). Aunque la PCR GP5+ /GP6+bio-EIA
presenta una proporción de positivos más baja en comparación con las otras
tres técnicas, esta diferencia no es estadísticamente significativa (p = 0,67).

La concordancia de los resultados obtenidos entre las técnicas INNO-LiPA y
PCR GP5+ /GP6+bio-EIA para la detección de VPH-AR sin discriminar mono o
múltiples infecciones fue regular (kappa = 0,3). Esta concordancia mejora
cuando se trabaja con el cóctel 1 que discrimina VPH 16/18 (kappa = 0,51) y
más aún en muestras con mono-infecciones VPH 16 o 18 (kappa = 0,71). La
GARCIA M.I.
67
capacidad de detección del VPH 52 por la PCR GP5+ /GP6+bio -EIA es menor
sin importar si son muestras con mono o múltiples infecciones.

La técnica de PCR GP5+ /GP6+bio -EIA aunque no permite genotipificar como
lo hace el sistema INNO-LiPA, nos permite detectar una gama de VPH –AR en
una sola prueba y tiene buena capacidad para detectar VPH 16 sobre todo en
mono-infecciones.
GARCIA M.I.
68
X.
RECOMENDACIONES

No obstante que nuestros resultados muestran que la PCR GP5+/GP6+bio -EIA
tiene menos capacidad para detectar genotipos de VPH-AR sobre todo en
multi-infecciones, esta técnica es más eficiente en mujeres con monoinfecciones. Sabemos que la persistencia de la infección de algunos
genotipos, particularmente VPH 16 y 18 es el principal factor para el desarrollo
de CACU, la sensibilidad de esta técnica en mujeres con lesiones superiores a
CIN 2 (por histopatología) debiera se determinada.

En los casos discordantes en la detección de VPH 16/18 por ambos métodos
valdría la pena respaldar estos resultados con un tercer método, con una PCR
específica para VPH 16 y VPH 18 o hacer ADN secuenciación.

En nuestro estudio una desventaja fue la ausencia de muestras con
diagnóstico de cáncer, ya que solo contábamos con un solo caso, y no se
pudo conocer correctamente la frecuencia de genotipos en este tipo de
población. Para analizar y obtener datos relativamente importantes, respecto a
estos casos de VPH, sería interesante considerar una población de mujeres
con diagnóstico de Cáncer de cuello uterino.

Dada la elevada sensibilidad que presentan las técnicas PCRs como por
ejemplo la SPF10 la probabilidad de contaminación es elevada
y crear
problemas en las diferentes aplicaciones de diagnóstico (Morshed et al.,
2008). Por ello, el cumplimiento de procedimientos y normas debe ser riguroso
en un laboratorio de diagnóstico por Biología Molecular.
GARCIA M.I.
69
XI.
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GARCIA M.I.
81
XII.
ANEXOS
ANEXO 1: MATERIALES
 Material biológico.

Cepillado cervical
 Materiales de Laboratorio

Matraces Erlenmeyer

Vasos de precipitación

Probetas graduadas

Material descartable

Pipetas

Frascos de plástico para la recolección de muestras.

Tubos Eppendorf

Puntas para micropipetas

Papel aluminio

Parafilm

Propipetas

Gradillas
 Reactivos y sustancias puras

Agua destilada y agua destilada estéril

SSC 10X (Saline Sodium Citrate)

SSC 1X + 0.5% Tween 20

TRIS-HCl 0.2M

NaOH 0.2M

Nitrophenyl phosphate (tablets) SIGMA N1891-50SET

Monoclonal Anti-digoxin-Alkaline phosphatase SIGMA A1054

Streptavidin coated microplates GREINER BIO-ONE 655990
GARCIA M.I.
82
 Reactivos para extracción de ADN

PBS (Buffer Fosfato Salino)

Tris 10mM pH 7.5
 Reactivos para electroforesis

Agarosa

TRIS-HCl 1M pH 7.5

Marcador de peso molecular
(Promega 50-1000 pb y SmartLadder V 200- 10,000 pb)

Tampón TAE (Tris Acetato EDTA) 50X y 0,5X

Bromuro de etidio

Tampón de carga
 Reactivos para amplificación y separación de segmentos de ADN

dNTPs

Mg Cl2

Tampón Green 5X/ Tampón sin color 5X

Go Taq ADN polimerasa

Cebadores : GH20/ PCO4 , PGMY 09/11, GP5+/GP6 +bio
 Kits

INNO-LiPA Genotyping Extra (Innogenetics)
 Oligonucleótidos

Dig31 GP probe VPH 31

Dig56 GP probe VPH 56

Dig33 GP probe VPH 33

Dig58 GP probe VPH 58

Dig35 GP probe VPH 35

Dig59 GP probe VPH 59

Dig45 GP probe VPH 45

Dig68 GP probe VPH 68

Dig39 GP probe VPH 39

Dig73 GP probe VPH 73

Dig51 GP probe VPH 51

Dig82 GP probe VPH 82

Dig52 GP probe VPH 52
GARCIA M.I.
83

Dig16 GP probe VPH 16

Dig18 GP probe VPH 18
 Equipos de Laboratorio

Balanza analítica

Termociclador (BIO-RAD)

Vortex (Fisher) Scientific

Trans iluminador de luz UV

Cubetas de electroforesis horizontal (Enduro GEL XL)

Conservadores de 4 ºC, -20 ºC y -70 ºC ( Fridge)

Microcentrífuga

Microondas ( LG)

Incubadora 36°C

Espectrofotómetro (BOECO)

Baño maría
GARCIA M.I.
84
ANEXO 2: PREPARACIÓN DE TAMPONES
 Stock Tris-HCl 1M pH 7.5

Tris
121 gr.

Agua
800 ml

Ajustar pH 7.5 con HCl concentrado (± 70 ml)

Enrazar con agua destilada a 1 litro

Autoclavar
 Tris-HCl 10 mM pH 7.5

0,5 ml de Solución stock Tris HCl 1M pH 7.5

49,5 ml de agua destilada estéril
 50X TAE pH 8.5
Esta solución puede ser guardada a temperatura ambiente.

Tris
48.4 gr

Ácido Acético
11.4 ml

EDTA 0.5M pH8
20

Ajustar el volumen a 200ml con agua destilada

Autoclavar
ml
 TAE 1X
Añadir 10 ml de Solución stock TAE 50X a 490ml de agua destilada estéril.
 TAE 0,5X
Añadir 5 ml de Solución stock TAE 50X a 495 ml de agua destilada estéril.
GARCIA M.I.
85
ANEXO 3: PROTOCOLO PREPARACIÓN DE GEL AGAROSA AL 2 %
1. Tomar 2 gr de agarosa previamente pesado.
2. Verter el contenido en el Erlenmeyer.
3. Medir 100 ml en la probeta de Tampón TAE 0,5X.
4. Añadir los 100ml de Tampón TAE al Erlenmeyer que contiene la agarosa.
5. Mezclar suavemente.
6. Calentar la solución en el microondas.
Nota: El microondas se encuentra previamente programado para calentar la solución
durante 30 segundos. Repetir este paso 2 veces más, hasta que la solución hierva y
este transparente y sin burbujas.
7. Retirar el Erlenmeyer del microondas y esperar a que enfrié (hasta que este
tibio).
8. Mientras enfría armar la cuba electroforética de la siguiente manera: De
celdas grandes (Sirven para 28 muestras) y colocar la bandeja transparente y
los 2 peines correspondientes con la protuberancia mirando al frente.
9. Verter la solución de agarosa (100ml) en la bandeja previamente armada.
10. Esperar a que enfrié ( aprox. 15min)
11. Retirar los peines y retirar las bandejas transparentes con el gel.
Nota: Si el gel no se va usar inmediatamente guardar en el refrigerador en una bolsa
Zip bien cerrada para evitar deshidratación.
GARCIA M.I.
86
ANEXO 4: PROTOCOLO PREPARACIÓN DE BROMURO DE ETIDIO
Añadir 15 ul de solución de Bromuro Etidio 10ng/ml (BIO RAD) en 300 ml de
Solución TAE 0,5X para tener el concentración final de 0,5ug/ml.
A
B
C
D
Figura 22: A: Preparación del gel al 2%, B: Solución de Bromuro Etidio BIO-RAD
(10ng/ml), C: Cubeta de electroforesis horizontal (Enduro GEL XL), D: Trans iluminador
de luz UV.
GARCIA M.I.
87
ANEXO
5:
MÉTODO
EXTRACCION
DE
ADN
(CONGELACIÓN-
DESCONGELACIÓN)
1. Tomar los eppendorf con las alícuotas que contienen las muestras de
cepillado cervical guardadas a 4°C.
2. Agitar en Vortex 1 minuto con el fin de homogeneizar los tubos eppendorf.
3. Tomar 500 ul de la muestra y llevar a otro tubo eppendorf.
4. Centrifugar a 3000 rpm por 10min. Descartar el sobrenadante.
5. Lavar con 1ml de PBS y centrifugar a 3000rpm por 10 min.
6. Eliminar el sobrenadante y resuspender el pellet celular en 300 µl de Tampón
(10mM Tris pH 7.5).
7. Agitar en Vortex brevemente para que el pellet se pueda homogeneizar.
8. Transferir 100 ul del pellet resuspendido a dos diferentes tubos de PCR.
9. Congelar a -70oC (mínimo 2 horas, máximo un día).
10. Posteriormente colocar a 95oC por 15 min en el termociclador de PCR, para el
proceso de denaturación.
11. Centrifugar por 30 segundos a velocidad máxima.
12. De un tubo tomar el sobrenadante y conservar a -20oC o sobre hielo si la
utilización es inmediata y el segundo tubo guardar directamente a -20°C sin
desechar el pellet.
GARCIA M.I.
88
ANEXO 6: CEBADORES PARA LA AMPLIFICACIÓN DE LA PCR PGMY09/11
Primers para PGMY 09/11
1 PGMY 11 A_G494 FW 5´-gCACAgggACATAACAATgg3´
2 PGMY 11 B_G495 FW 5´-gCgCAgggCCACAATAATgg3´
3 PGMY 11 C_G496 FW 5´-gCACAgggACATAATAATgg3´
4 PGMY 11 D_G497 FW 5´-gCCCAgggCCACAACAATgg3´
5 PGMY 11 E_G498 FW 5´-gCTCAgggTTTAAACAATgg3´
6 PGMY 11 F_G499 Rev 5´-CgTCCCAAAggAAACTgAT3´
7 PGMY 11 G_G500 Rev 5´-CgACCTAAAggAAACTGAT3´
8 PGMY 11 H_G501 Rev 5´-CgTCCAAAAGGAAACTgATC3´
9 PGMY 11 I_G502 Rev 5´-gCCAAggggAAACTgATC3´
10 PGMY 11 J_G503 Rev 5´ CgTCCCAAAGGATACTGATC3´
11 PGMY 11 K_G504 Rev 5´ CgTCCAAggggATACTGATC3´
12 PGMY 11 L_G505 Rev 5´CgACCTAAAgggAATTgATC3´
13 PGMY 11 M_G506 Rev 5´CgACCTAggTTgATC3´
14 PGMY 11 N_G507 Rev 5´CgACCAAggggATATTgATC3´
15 PGMY 11 P_G508 Rev 5´-gCCCAACggAAACTgATC3´
16 PGMY 11 Q_G509 Rev 5´CgCCCAAgggAAATCTggTC3´
17 PGMY 11 R_G510 Rev 5´CgTCCTAAAGGAAACTGGTC3´
18 HMB01_G511
Rev 5´-gCgACCCAATgCAAATTggT3´
GARCIA M.I.
89
ANEXO 7: PROCEDIMIENTO PARA INNO-LiPA Genotyping Extra
Importante: Antes de comenzar atemperar a temperatura ambiente (20 – 25°C) el
kit por lo menos 60 min, luego prender el baño maría para que este llegue a estar
caliente (49°C) aproximadamente en 15min y cargar la pro pipeta.
 Hibridación
1. Previamente precalentar las soluciones de hibridación y solución astringente a
49°C bajo agitación en el baño María.
2. Añadir 10ul de solución denaturante (DS) en la esquina de cada bandeja
previamente rotulada con su respectivo número.
3. Luego añadir 10ul de producto amplificado a la solución denaturante.
4. Incubar 5 min a temperatura ambiente.
5. Agregar 2ml de solución de hibridación pre-calentada y mezclar nuevamente
por agitación.
6. Colocar las tiras con la ayuda de las pinzas (línea roja en la parte superior), en
las respectivas bandejas.
7. Incubar a 60 min a 49°C en baño maría con agitación.
Nota: El nivel de agua del Baño María debe ser 1/2 o 1/3 de la altura de las
bandejas.
 Lavado Astringente
8. Después retirar las bandejas del Baño María para proceder a aspirar todo el
líquido de cada bandeja.
9. Añadir 2 ml de la solución de lavado astringente pre-calentada y mezclar 10 –
20 segundos.
GARCIA M.I.
90
10. Aspirar toda la solución y añadir 2ml de la solución de lavado astringente precalentada (repetir este paso una vez más, para que sean dos lavadas).
11. Nuevamente añadir 2 ml de la solución de lavado astringente pre-calentada.
12. Incubar 30 min a 49°C en baño maría en agitación.
Nota: Preparar la solución de lavado Rinse y la solución de conjugado de la siguiente
manera:
Ejemplo: Si nuestras muestras son 8 (equivalentes a 8 tiras).
70 ml agua destilada + 17,5 ml stock Rinse (5X)
= 1X
176,75 µl de Conjugado + 17,5 ml de Tampón de Conjugado = 1X
 Adición del conjugado
13. Retirar las bandejas del Baño María y aspirar el líquido.
14. Agregar 2ml de solución de lavado Rinse 1X.
15. Incubar por un minuto a temperatura ambiente en agitación.
16. Aspirar el líquido (repetir este paso dos veces).
17. Finalmente añadir 2ml de solución de conjugado 1X (1/100).
18. Incubar 30 min a temperatura ambiente en agitación.
Nota: Preparar la solución de sustrato (para 8 tiras):
176,75 µl de Sustrato + 17,5 Tampón Sustrato
GARCIA M.I.
91
 Revelado
19. Aspirar el líquido de cada bandeja.
20. Añadir 2 ml de solución de lavado Rinse 1X
21. Incubar por un minuto a temperatura ambiente en agitación.
22. Aspirar el líquido (repetir este paso dos veces).
23. Añadir 2ml de Tampón sustrato.
24. Aspirar y añadir 2 ml de solución de sustrato diluida (1/100).
25. Incubar 30 min a temperatura ambiente en el agitador.
26. Aspirar y añadir 2 ml de H2O destilada.
27. Incubación por 3 min a temperatura ambiente en agitador.
28. Aspirar y añadir 2 ml de H2O destilada.
29. Incubación por 3 min a temperatura ambiente en agitador.
30. Usando las pinzas remover las tiras de la bandeja para ser acomodadas a la
respectiva hoja.
GARCIA M.I.
92
A
B
C
D
E
F
Figura 23: A: Ubicación de las respectivas tiras, B: Aplicación de la solución de
hibridación, C: Incubación en el Baño María, D: Placa antes y después del proceso de
agitación, E: Proceso de stop F: Tiras después de todo el proceso y listas para ser
interpretadas.
GARCIA M.I.
93
ANEXO 8: INTERPRETACION PARA LA TECNICA INNO-LiPA GENOTYPING
EXTRA
1. Las tiras sólo deben leerse cuando están completamente secos.
2. Una línea se considera positivo cuando una banda de color púrpura / marrón
claro aparece.
3. La siguiente ilustración muestra la posición de las diferentes sondas de
oligonucleótidos en la tira de INNO-LiPA Genotyping, estos patrones de líneas
deben compararse con el gráfico de Interpretación suministrado con el kit.
Esta carta marca las líneas positivas (filas) para los diferentes tipos de VPH
(columnas) con una "X".
Tabla 10: Patrón para considerar como interpretables a las líneas reactivas en la tira
de INNO-LiPA. Fuente Innogenetics.
HPV
hDNA
Interpretación
Resultado no válido
Un resultado negativo en la línea de control HDNA indica
inadecuada recolección de muestra, procesamiento, o la
presencia de inhibidores en el extracto de ADN. En este
último caso, las pruebas de una dilución 1:10 del extracto
de ADN puede mejorar el rendimiento de amplificación. Si
no tiene éxito, iniciar un nuevo procedimiento de alícuota
de la muestra.
VPH no detectado
Un resultado negativo en ambas líneas de control del VPH
y las líneas específicas del tipo indica la ausencia de ADN
de VPH, pero no puede oponerse a la presencia de una
infección por VPH.
VPH detectado
Un resultado positivo en al menos una de las líneas
específicas del tipo o líneas de control VPH indica la
presencia de ADN de VPH. La presencia de genotipos de
VPH adicionales no se puede descartar por completo
VPH detectado
Un resultado positivo en al menos una de las líneas
específicas del tipo o líneas de control VPH indica la
presencia de ADN de VPH. La presencia de genotipos de
VPH adicionales no puede ser completamente descartada.
GARCIA M.I.
94
Figura 24: Gráfica para la Interpretación de los resultados suministrado por el kit
INNO-LiPA Genotyping extra. Fuente Innogenetics.
GARCIA M.I.
95
ANEXO 9: SOLUCIONES PARA LA TÉCNICA DE EIA
 SSC- 10X

Na Cl
87,79 gr.

Citrato de sodio
44,1 gr.

Agua destilada estéril csp
1 L
 SSC 1X + 0.5% Tween 20

Añadir 100 ml de SSC-10X a 900 ml de agua destilada estéril para
tener el volumen final de 1000 (SSC-1X).

Añadir 5ml de tween 20.
 NaOH 0,2M

NaOH

Agua destilada estéril csp 1000 ml
8 gr
GARCIA M.I.
96
ANEXO 10: PROCEDIMIENTO PARA LA TÉCNICA DE EIA
 Procedimiento en Streptavidin coated microplates
1. Colocar en cada pocillo de la microplaca 50 µl de Tampón SSC-tween.
2. Añadir 5 µl de la muestra (producto de la PCR GP5+/GP6+bio).
3. Cubrir la placa con parafilm.
4. Incubar en una estufa a 37°C y en humedad durante 1 hora (la placa debe
estar dentro una cámara húmeda).
5. Eliminar el contenido con un movimiento rápido por inversión.
6. Agregar 200 µl de SSC-Tween a cada pocillo con la ayuda de una pipeta
multicanal.
7. Eliminar el contenido con un movimiento rápido y usar un papel absorbente
para las excedencias (repetir este paso hasta lavar 3 veces).
8. Añadir 100 µl de NaOH (0.2M) a cada pocillo.
9. Incubación 15 min a temperatura ambiente cubriendo la placa (sin humedad).
10. Eliminar el contenido con un movimiento rápido y usar un papel absorbente
para las excedencias.
11. Lavar como en el paso 6 – 7 con SSC-Tween.
Nota: Realizar la preparación de los correspondientes cocteles de oligonucleótidos,
en este caso:
Cóctel 1: con los oligonucleótidos 16 y 18
Cóctel 2: con los oligonucleótidos 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68, 73, 82.
Ejemplo: Si necesitamos un volumen de 5ml
5µl de cada oligonucleótidos del stock, ajustar el volumen de 5ml con SSC-Tween.
12. Añadir 50 µl de la mezcla de oligonucleótidos a los pocillos correspondientes.
13. Cubrir la placa e Incubar 1 hora a 37°C en ambiente húmedo.
GARCIA M.I.
97
14. Repetir el paso 6- 7 para los lavados con SSC-Tween.
Nota: 5 minutos antes de completar la hora de incubación preparar el Anticuerpo
Monoclonal. 1/700 con SSC – Tween: 28 ml SSC-Tween + 4µl (Monoclonal Antidigoxin-Alkaline phosphatase)
15. Añadir 50 µl de la dilución del anticuerpo a cada pocillo
16. Cubrir la placa e Incubar 1 hora a 37°C en ambiente húmedo.
17. Repetir el paso 6- 7 para los lavados con SSC-Tween.
Nota: 5 minutos antes de completar la hora de incubación preparar la solución de
Sustrato, dependiendo a la cantidad que se va a usar:
Diluir en un tubo cónico 1 tableta de Fast PNPP (Sigma)
+ 1 tableta Fast tris
Tampón, con 5 ml de agua destilada estéril y cubrir el tubo con papel estañado para
evitar la luz.
18. Añadir 100µl de sustrato preparado y cubrir la placa.
19. Incubar por 3 horas a 37°C en ambiente húmedo.
20. Finalmente leer a una D.O. de 405 nm con un espectrofotómetro.
GARCIA M.I.
98
A
B
C
D
E
F
Figura 25: A: Placa lista, B: Aplicación de SSC- Tween C: Numeración de muestras, D:
Adición de NaOH, E: Placa cubierta con parafilm, F: Adición del cóctel 1.
GARCIA M.I.
99
A
B
C
D
E
F
Figura 26: A: Adición del cóctel 2, B: Adición del anticuerpo Monoclonal, C: Adición del
sustrato, D: Incubadora de 37°C, E: Proceso de incubación en cámara húmeda, F:
Espectrofotómetro.
GARCIA M.I.
100
ANEXO 11: INTERPRETACION PARA LA TECNICA PCR GP5+/GP6+bio- EIA
Toda prueba se realizó con dos controles negativos y dos controles positivos más
controles blancos (nada de muestra). Todas las muestras fueron corridas por
duplicado, tanto para el cóctel 1(rojo) como para el cóctel 2 (naranja) como se
muestra en el esquema de abajo este esquema:
A-1
B
C
D
E
F
G
H
2
Neg 1
Neg 1
Hela(+)
Hela(+)
1
1
3
2
2
3
3
1
1
4 Hela(+) 1ng
2
5
2
5
3
6
3
6
4
4
4
4
Hela(+)
6 Siha(+)
5
8
5
8
6
9
6
9
7
7
7
7
Siha(+)
8
8
8
9
9
10
10
9
11
11
12
12
10
10
11
12
11 Siha(+) Blanco
11 Siha(+) Blanco
12 Neg 2 Blanco
12 Neg 2 Blanco
13
13 Blanco
13
13 Blanco
CUT-OFF
Los cálculos para el Cut-off se realizaron con la siguiente formula:
Cut-off = Promedio (CN+CB)
+3DS
Dónde:
CN: controles negativos como muestras
CB: controles solo Blancos
CALCULO PARA LA INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS:
Resultado=Promedio (Abs. Mx)
Cut-off
Dónde:
Abs.mx: Absorbancias de las muestras
Interpretación: Todo resultado ≥ 1,0 se considera POSITIVO
GARCIA M.I.
101
GARCIA M.I.
102

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