HPLC and LC/MS HPLCトラブルシューティング HPLC Troubleshooting トラブルシューティングの前に、必ず、実験室に備わってい Before you start any troubleshooting, it is essential to observe safe る安全の手引きなどを参照してください。GCで使う溶媒など laboratory practices. Know the chemical and physical properties of の化学的、物理的性質がその中に書かれているし、MSDSシー any solvents used and have the appropriate Material Safety Data トもあるので、必ず、それらのことを知った上で行って下さ Sheets (MSDSs) readily available. All electrically powered い。 症状 Symptom 圧力関連Related Problems Pressure Low Pressure 圧が低い 原因 Cause Low viscosity mobile phase. 移動相の粘度が低い Piston seals leaking. ピストンシールからの漏れ Leak in system. 系内の漏れ High Pressure 圧が高い High viscosity mobile phase. 移動相粘度が大きい Pump flow-rate malfunction. Clean the flow cell according to the manufacturer’s instructions. マニュアルに従って、検出器セルを洗浄する Equilibrate the column with 10 volumes of mobile phase. カラム容積の10倍量の移動相で平衡化する Degass the mobile phase and pass degassed solvent through the flow-cell. 脱気を行った移動相をフローセルに流す（セル耐圧に注意する） Do not exceed the cell’s pressure limit. 検出器セル中に気泡 Old detector lamp. 検出器光源ランプの劣化 Replace the guard cartridge. ガードカートリッジカラムを交換する Wash the column using an appropriate solvent. If this does not resolve the problem, replace the column. 適切な溶媒でカラムを洗浄。駄目な場合は、新品に取り替える Clean the flow cell according to the manufacturer’s instructions. マニュアルに従って、検出器セルを洗浄する Use freshly prepared solvents of HPLC grade. HPLCグレードの溶媒で新しく移動相を作る Replace the lamp, particularly when this has been in use for > 2000 hours. 光源ランプの交換（特に、使用時間が2000時間を越える場合） Use freshly prepared solvents of HPLC grade. HPLCグレードの溶媒で新しく移動相を作る Gradient mobile phase. Consider purer solvents or higher wavelengths. Otherwise, this is normal. グラジエントに起因 高純度溶媒を使用するか、検出波長を長波長にする。（故障ではない） System not equilibrated. Equilibrate the column with 10 volumes of mobile phase. カラム平衡化できていない カラム容積の10倍量の移動相で平衡化する 系内の漏れ Leak in system. Check for and replace any leaking tubing or fittings. カラムオーブンを温調する Temperature fluctuations. Use a thermostatically controlled column oven. 温度変動に起因 配管接続部からの漏れの有無をチェック、交換する Contaminated column. Wash the column using an appropriate solvent. Ensure that a gradient method has a wash period at the end. カラムに汚染 適切な溶媒でカラムを洗浄。ｸﾞﾗｼﾞｴﾝﾄでの最後の追い出し条件をﾁｪｯｸする Contaminated solvents. 移動相溶媒の汚染 ポンプミキシング不良 Blocked solvent reservoir frits. ﾘｻﾞｰﾊﾞ焼結ﾌｨﾙﾀ閉塞 Old detector lamp. 検出器光源ランプの劣化 Where being used, ensure that the proportioning valve is mixing the solvents correctly. 溶媒ミキシングが正しくできているか、プロポーショニングバルブを調べる If the method is isocratic, blend the solvents manually. Ultrasonicate the reservoir frits in water and then methanol. ﾘｻﾞｰﾊﾞーの焼結ﾌｨﾙﾀ(フリット）を水、次にMeOHを用いて、超音波洗浄する Replace the lamp, particularly when this has been in use for > 2000 hours. 光源ランプの交換（特に、使用時間が2000時間を越える場合） System not equilibrated. Equilibrate the column with 10 volumes of mobile phase. カラム平衡化できていない カラム容積の10倍量の移動相で平衡化する Injection solvent too strong. Ensure that the injection solvent is the same or weaker strength than the mobile phase. 試料溶解溶媒極性が高過ぎる 試料溶解溶媒の極性は、移動相と同じか、それより低いものを使用する Injection volume too high. 試料注入量が多過ぎる Reduce the injection volume to avoid overload. オーバーロードにならない様、試料注入量を減らす。一般にピーク幅の40%以下の注入量とする。 Typically injection volumes of < 40% of the expected peak width should be used. 一般にピーク幅の40%以下の注入量とする Injected mass too high. 試料量が多過ぎる オーバーロードとならない様、試料濃度を減らす Reduce the sample concentration to avoid mass overload. Temperature fluctuations. 温度変動に起因 Use a thermostatically controlled column oven. Higher temperatures will produce sharper peaks. カラムｵｰﾌﾞﾝを温調する。カラム温度高いとピークはシャープになる Extra column volume too high. カラム容量が大き過ぎる Old guard cartridge. ガードカラムの劣化 Old column. カラムの劣化 Contaminated column. カラムの汚染 180 Replace guard cartridge. ガードカートリッジカラムを交換する System not equilibrated. カラム平衡化できていない Pump not mixing solvents properly. Negative Peaks 負のピーク Contact manufacturer. Bubbles in flow cell. Contaminated solvents. 移動相溶媒の汚染 Double Peaks スプリットピーク Confirm expected pressure using the Kozeny-Carmen or similar equation. Kozeny-Carmen式などで、圧力をチェック、確認する Consider sample clarification steps such as filtration or SPE. ろ過あるいはSPE前処理などの試料精製を行う Detector contamination. 検出器の汚染 Broad Peaks ブロードピーク Check for and replace any leaking tubing or fittings. 配管接続部からの漏れの有無をチェック、交換する Sample precipitation. 試料からの析出物 Contaminated column. カラムに汚染 ピーク形状関連 Peak Shape Problems Confirm expected pressure using the Kozeny-Carmen or similar equation. Kozeny-Carmen式などで、圧力をチェック、確認する Check for evidence of leaking or wear and replace where necessary. 漏れ･磨耗の有無をチェックし、あれば交換する Working backwards from detector outlet, check source of blockage and replace item as necessary. 検出器(下流）側から、閉塞の有無を調べ、閉塞箇所を交換する Contaminated guard. ガードカラムの汚染 Sloping Baseline BLが傾いている Action Tubing blocked. 配管の閉塞 Detector blockage. 検出器の詰まり Fluctuating Baseline BLが変動する 解決策 溶媒ラインあるいはポンプへの気泡混入 Air in solvent lines or pump. Ensure that the reservoirs and solvent lines are fully primed and the purge valve is fully closed. ﾘｻﾞｰﾊﾞーからの気泡混入の有無、ﾊﾟｰｼﾞﾊﾞﾙﾌﾞﾞが開いていないかﾁｪｯｸする Guard blocked. ガードカラムの詰まり ベースライン（BL)関連 Baseline Related Problems また、電源をオフにして、プラグも抜いてから行って下さい。 instruments should be shut down and unplugged before starting. 保護メガネも必ずして下さい。以下に、一般に良く遭遇するト Eye protection should also be worn. ラブルの原因とその解決策を示しますので、トラブルシュー Following is a chart of common HPLC problems encountered, the ティングに役立てて下さい。 possible causes and solutions for your quick reference. Voided column. カラム内に空隙が生成 Old guard cartridge. ガードカラムの劣化 Reduce diameter and length of connecting tubing. Reduce the volume of the flow cell where possible. カラム内径と接続配管の長さを減らす。可能ならばﾌﾛｰｾﾙ容量を減らす Replace the guard cartridge. ガードカートリッジカラムを交換する Do not use columns that have been used with ion-pair reagents for reverse-phase methods. ｲｵﾝﾍﾟｱｸﾛﾏﾄに使用したｶﾗﾑは他の逆相LC分析に使用しない。性能劣化したｶﾗﾑは交換する Old columns give much lower efficiencies than new column. Replace the column if necessary. Wash the column using an appropriate solvent. If this does not resolve the problem, replace the column. 適切な溶媒でカラムを洗浄。駄目な場合は、新品に取り替える Replace the column. Do not use outside the recommended pH range. カラムを取り替える。カラムは推奨pH範囲内で使用する Replace the guard cartridge. ガードカートリッジカラムを交換する Unbalanced RI detector optics. RI検出器光学系のｱﾝﾊﾞﾗﾝｽ Wash the column using an appropriate solvent. If this does not resolve the problem, replace the column. 適切な溶媒でカラムを洗浄。駄目な場合は、新品に取り替える Replace the column. Do not use outside the recommended pH range. カラムを取り替える。カラムは推奨pH範囲内で使用する Use freshly prepared solvents of HPLC grade. 移動相溶媒を新しく作り直す Check the signal polarity from the detector to the recording device. 検出器信号の極性をチェックする Refer to manufacturer’s instructions. RI検出器マニュアルを参照してください Ion pair method. Inject the sample in the mobile phase. Contaminated column. カラムの劣化 Voided column. カラム内に空隙が生成 Contaminated solvents. 移動相溶媒の汚染 Wrongly wired detector. 信号ケーブル接続間違い All brands and products are trademarks of their respective companies. 㪈㪏㪈 181 Technical Information HPLCトラブルシューティング Symptom Cause Action Flat topped Peaks 台形状のピーク Detector overload. 検出器ｵｰﾊﾞｰﾛｰﾄﾞ Reduce the sample concentration. 試料濃度を減らす Tailing Peaks Old guard cartridge. ガードカラム劣化 Replace the guard cartridge. ガードカートリッジカラムを交換 Injection volume too high. 試料注入量が多過ぎる Reduce the injection volume to avoid overload. Typically injection volumes of < 40% of the expected peak オーバーロードにならない様、試料注入量を減らす。一般にピーク幅の40%以下の注入量とする。 width should be used. Injected mass too high. 試料量が多過ぎる オーバーロードとならない様、試料濃度を減らす Reduce the sample concentration to avoid mass overload. Old column. Do not use columns that have been used with ion-pair reagents for reversed phase methods. ｲｵﾝﾍﾟｱｸﾛﾏﾄに使用したｶﾗﾑは他の逆相LC分析に使用しない。性能劣化したｶﾗﾑは交換する Old columns give much lower efficiencies than new column. Replace the column if necessary. ピーク形状関連 Peak Shape Problems テーリングピーク Detector set-up. 検出器の設定間違い Injection solvent too strong. 試料溶解溶媒の極性が高過ぎる カラムの劣化 Contaminated column. カラムの汚染 Fronting Peaks フロンティングピーク Voided column. カラムに空隙 Old or damaged column. カラム劣化・悪化 ピークの大きさと保持関連 Peak Size and Retention Problems Small Peaks ピークが小さい Ensure that the injection solvent is the same or weaker strength than the mobile phase. 試料溶解溶媒の極性は、移動相と同じか、それより低いものを使用する Wash the column using an appropriate solvent. If this does not resolve the problem, replace the column. 適切な溶媒でカラムを洗浄。駄目な場合は、新品に取り替える Replace the column. Do not use outside the recommended pH range. カラムを取り替える。カラムは推奨pH範囲内で使用する Replace the column. カラムを新品に交換する Degraded sample. 試料劣化 Inject a fresh sample. 新しく試料溶液を作り直す Detector set-up. 検出器設定不良 Check the detector attenuation and re-zero. アテニュエータの設定を確認し、シグナルをゼロにする Low analyte concentration. 試料濃度が低過ぎる No wash solvent. 洗浄溶媒がない Damaged or blocked syringe. シリンジ不良・詰まり Incorrect amount injected. 注入量が正確でない No Peaks ピークが出ない Check the detector attenuation and re-zero. アテニュエータの設定を確認し、シグナルをゼロにする Increase the analyte concentration. 試料濃度を増やす Check that the solvent wash reservoir is filled with a miscible solvent and that the injector is set to wash 移動相と混ざる洗浄溶媒がﾘｻﾞｰﾊﾞに入っているか、試料注入後、洗浄されているかチェックする between injections. Replace the syringe. 新しいシリンジに取り替える Check injector loop size and that no more than 50% of this volume is used for partial loop injections. ｲﾝｼﾞｪｸﾀﾙｰﾌﾟｻｲｽﾞをﾁｪｯｸする（部分注入はﾙｰﾌﾟ容積の半分以下であること） Viscous injection solvent. 溶解溶媒の粘度が高い Reduce syringe draw-time. シリンジ引抜時間を短くする Sample vial empty. バイアルに試料がない Fill sample vial. バイアルに試料を入れる Old detector lamp. 検出器光源の劣化 Leak in system. 系内に漏れ Replace the lamp, particularly when this has been in use for > 2000 hours. 光源ランプの交換（特に、使用時間が2000時間を越える場合） Check for and replace any leaking tubing or fittings. 配管接続部からの漏れの有無をチェック、交換する being used, ensure that the proportioning valve is mixing the solvents correctly. 溶媒ミキシングが正しくできているか、プロポーショニングバルブを調べる。一定組成であれば、 ポンプ溶媒ミキシング不良 Where 移動相を作成してみる。 Pump not mixing solvents properly. Damaged or blocked syringe. シリンジ不良・詰まり Different dwell volume. Old detector lamp. 検出器光源の劣化 Missing Peaks ピークが行方不明 Degraded sample. 試料劣化 Immiscible mobile phase. 不混和移動相 Fluctuations in pH. 移動相pHの変動 Extra Peaks Degraded sample. 試料劣化 余分なピークが現れる Replace the syringe. 新しいシリンジに交換する For gradient methods, check that the dwell volume of any new system is not very different from any previous system. Apply a final hold time if necessary. Replace the lamp, particularly when this has been in use for > 2000 hours. 光源ランプの交換（特に、使用時間が2000時間を越える場合） Inject a fresh sample. 新たに試料を調製し直す Check that any solvent already in the column is miscible with the mobile phase. カラム内の前の移動相と新しい移動相とが混ざるかチェックする。必要な場合は、 i-PrOHまたはEtOHを流してみる。 Flush with propan-2-ol or ethanol where necessary. Buffer the mobile phase so that retention of ionizable compounds is controlled. イオン性成分の保持時間を一定に抑えるよう、移動相に緩衝液を加える Inject a fresh sample. 新たに試料を調製し直す Contaminated solvents. 溶媒の汚染 HPLCｸﾞﾚｰﾄﾞの溶媒で新しく移動相を作る。ｸﾞﾗｼﾞｴﾝﾄ溶出では、しばしば、ｺﾞｰｽﾄﾋﾟｰｸが現れる。 Use freshly prepared solvents of HPLC grade. Gradient methods often show ‘ghost-peaks’. Fluctuations in pH. 移動相pHの変動 Buffer the mobile phase so that retention of ionizable compounds is controlled. イオン性成分の保持時間を一定に抑えるよう、移動相に緩衝液を加える Immiscible mobile phase. 不混和移動相 Contaminated guard cartridge. ガードカラム劣化 Varying Retention 保持時間が変化する If the method is isocratic, blend the solvents manually. Check that any solvent already in the column is miscible with the mobile phase. カラム内の前の移動相と新しい移動相とが混ざるかチェックする。必要な場合は、 i-PrOHまたはEtOHを流してみる。 Flush with propan-2-ol or ethanol where necessary. Replace the guard cartridge. ガードカートリッジカラムを交換 Contaminated column. カラムに汚染 Wash the column using an appropriate solvent. If this does not resolve the problem , replace the column. 適切な溶媒でカラムを洗浄。駄目な場合は、新品に取り替える Leak in system. 系内に漏れ Check for and replace any leaking tubing or fittings. 配管接続部からの漏れの有無をチェック、交換する Contaminated column. カラムの劣化 Wash the column using an appropriate solvent. If this does not resolve the problem, replace the column. 適切な溶媒でカラムを洗浄。駄目な場合は、新品に取り替える System not equilibrated. Equilibrate the column with 10 volumes of mobile phase. カラム平衡化できていない カラム容積の10倍量の移動相で平衡化する Temperature fluctuations. 温度変動に起因 Use a thermostatically controlled column oven. カラムオーブンを温調する Ultrasonicate the reservoir frits in water and then methanol. ﾘｻﾞｰﾊﾞーの焼結ﾌｨﾙﾀ(フリット）を水、次にMeOHを用いて、超音波洗浄する being used, ensure that the proportioning valve is mixing the solvents correctly. 溶媒ミキシングが正しくできているか、プロポーショニングバルブを調べる。一定組成であれば、 ポンプ溶媒ミキシング不良 Where 移動相を作成してみる。 Blocked solvent reservoir frits. ﾘｻﾞｰﾊﾞ焼結ﾌｨﾙﾀ閉塞 Pump not mixing solvents properly. If the method is isocratic, blend the solvents manually. Contaminated solvents. 溶媒の汚染 Use freshly prepared solvents of HPLC grade. HPLCグレードの溶媒で新しく移動相を作る Different dwell volume. For gradient methods, check that the dwell volume of any new system is not very different from any previous system. Apply a final hold time if necessary. Piston seals leaking. ピストンシールの漏れ Air in solvent lines or pump. 溶媒ラインorポンプに気泡混入 Check for evidence of leaking or wear and replace where necessary. 漏れ、磨耗の有無をチェックし、必要に応じ、取り替える Ensure that the reservoirs and solvent lines are fully primed and that the purge valve is fully closed. ﾘｻﾞｰﾊﾞーからの気泡混入の有無、ﾊﾟｰｼﾞﾊﾞﾙﾌﾞﾞが開いていないかﾁｪｯｸする For more information, please request Successful HPLC Operation – A Troubleshooting Guide, TG20094. All brands and products are trademarks of their respective companies. 182㪈㪏㪉 181 HPLC ಽᨆࠍᚑഞߐߖࠆߚߦ 䊃䊤䊑䊦䉲䊠䊷䊁䉞䊮䉫䉧䉟䊄 Ver.1 䊦䊷䉼䊮ᬺോ䈪⊒↢䈜䉎䊃䊤䊑䊦䈫ኻ╷ 䋨Ver.2 ಽᨆᴺ䈱㐿⊒䈫MS䈻䈱ᔕ↪䋩 ࠨࡕࡈࠖ࠶ࠪࡖࠨࠗࠛࡦ࠹ࡈࠖ࠶ࠢᩣᑼળ␠ 183 1 㪈㪏㪊 ߪߓߦ HPLC ಽᨆࠍⴕߞߡࠆߣߪߣ߽ߟߡߒߣᤨޔ㆑߁⁁ᘒߦㆣㆄߔࠆߎߣ߇ࠃߊࠅ߹ߔ⇟৻ޕᄢಾߥߎ ߣߪ⁁ࠃ߽ᦨޔᘒߩᤨߩࠪࠬ࠹ࡓޔࡓࠣ࠻ࡑࡠࠢޔቯ㊂ߩౣᕈࠍ߈ߜࠎߣᛠីߒߡ߅ߊߎߣߢߔߘޕ ࠇ߇ౣߢ߈ߥߊߥߞߚߣ߈ߥ߁ࠃߩߤߦߎߤޔᄌൻ߇ࠇߚ߆ࠍవߕߪࠪࠬ࠹ࡓోࠍࠃߊⷰኤߒࠇߘޔ ࠍᒁ߈ߎߔේ࿃ࠍࠬ࠻ࠕ࠶ࡊߒࠄ߇ߥߒ⏕ߟߕߟ৻ޔේ࿃ࠍ․ቯߒ߈ߴࠆ߆ߒޔኻ╷ࠍߣࠆᔅⷐ߇ ࠅ߹ߔ⚻ߩ⑳ޕ㛎ߢߪߩ࡞ࡉ࠻ޔᄢඨߪὐᬌਇ⦟ߦၮߠߊࠤࠕࠬࡒࠬߦࠃࠆ߽ߩߢޔ೨ߦ⊛⏕ߥὐᬌ ࠍⴕ߁ߎߣߦࠃࠅᧂࠍࠇߘޔὼߦ㒐ߋߎߣ߇᧪ࠆ߽ߩߢߒߚޕᬺ⠪ࠍࠎߢୃℂࠍߒߥߌࠇ߫ߥࠄߥ࠻ ࡉ࡞ߪޔቯᦼὐᬌࠍⴕߞߡࠆⵝ⟎߿ㆡಾߥࠞࡓࠍ↪ߒߡࠆ㒢ࠅߎޕ߁ࠂߒߢߥࠄߎߪ߁ߘޔ ߎߢߪߕ߹ޔ᷹ቯࠍ㐿ᆎߔࠆ೨ߩὐᬌ㗄ࠍ㗅⇟ߦࠬ࠻ࠕ࠶ࡊߒ߹ߒߚޕᰴߦߩ࡞ࡉ࠻ߚߒ↢⊒ޔౝኈ ߆ࠄ⠨߃ࠄࠇࠆේ࿃ࠍࠬ࠻ࠕ࠶ࡊߒޔේ࿃ࠍ․ቯߒ߁ߤޔኻಣߔߴ߈߆ߦߟߡ߹ߣ߹ߒߚᦨޕᓟߦಽ ᨆ߇߁߹ߊߞߡࠆ⁁ᘒࠍࡈࠔࡦࠬߣߒߡ⸥ߔࠆߚߩⵝ⟎߿ࠞࡓߩ↪⸥㍳ߩ⸥ࠍߍ ߹ߒߚޕ ಽᨆ㐿ᆎ೨ߦᰴߩ㗄ࠍὐᬌߒ߹ߒࠂ߁ 㧝㧚ⵝ⟎߇⟎߆ࠇߡࠆⅣႺߪ㧫 Ԙ ቶ᷷ߩᄢ߈ߥᄌേߪࠅ߹ߖࠎ߆㧫 غ ԙ ࿐ߦࡁࠗ࠭ࠍ⊒↢ߐߖࠆࠃ߁ߥᯏ᪾ߪ⟎ߡࠅ߹ߖࠎ߆㧫 غ 㧞㧚ࠞࡓࠍធ⛯ߔࠆ೨ߦ Ԙ ⵝ⟎ߦ೨ߩṁᇦ㧔․ߦႮṁᇦ㧕߇ᱷߞߡ߹ߖࠎ߆㧫 غ ԙ ߔߴߡߩࠗࡦߦ↪ߔࠆ⒖േ⋧߇ḩߚߐࠇߡ߹ߔ߆㧫 غ Ԛ ⒖േ⋧ߪ᷹ቯߦᔅⷐߥలಽߥ㊂߇ࠄࠇߡ߹ߔ߆㧫 غ ԛ ṁᇦ࠴ࡘࡉ߇⒖േ⋧ߩࡆࡦߩᐩ߹ߢዯߡ߹ߔ߆㧫 غ Ԝ ⒖േ⋧ߩ⣕᳇ߪㆡಾߢߔ߆㧫 غ ԝ 㔚Ḯࠤࡉ࡞߿ࠪࠣ࠽࡞ࠤࡉ࡞ߪ㧘ᱜߒߊߒߞ߆ࠅߣធ⛯ߐࠇߡ߹ߔ߆㧫 غ 㧟㧚ࠞࡓࠍធ⛯ߔࠆߣ߈ߪ Ԙ ᱜߒࠞࡓࠍធ⛯ߒߡ߹ߔ߆㧫㧔లႯߩ☸ሶᓘ㧘%QN0Q㧘ࡃ࠶࠴ 0Qߪ એ೨ߣᄌߞߡ߹ߖࠎ߆㧫㧕 غ ԙ એ೨ࠊࠇߡߚṁᇦ㧔ࠆߪࠞࡓߩሽṁᇦ㧕ߪߢߒߚ߆㧫 غ 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Karlsson – Uppsala, Sweden㩷 㪫㪝㪘㩿䍢䍶䍪䍷䍓䍹㈶㉄㪀䈶㪛㪜㪘㩿䍚䍼䍒䍟䍷䍏䍮䍻㪀䈱㒰ᣇᴺ㩷 㩷 㩷 䋨䉳䊜䉼䊦䉴䊦䊖䉨䉲䊄䋩200ȝl䉕4࿁ᵈ䈜䉎㩷 㪫㪝㪘䈶㪛㪜㪘䈲䇮䉫䊤䊐䉜䉟䊃䉦䊷䊗䊮䈱㕙䈮ๆ⌕䈜䉎 2.㩷 THF䋨䊁䊃䊤䊍䊄䊨䊐䊤䊮䋩ᵞᵺ㩷 䈱䈪䇮䈖䉏䉌䉕⒖േ⋧䈮ᷝട䈚䈢႐ว䈲䇮ಽᨆ⚳ੌᓟ䈮 Ⱞ⊕⾰䈱䉰䉟䉵ឃ㒰䉪䊨䊙䊃䈱႐ว Ⱞ⊕⾰䈱䉰䉟䉵ឃ㒰䉪䊨䊙䊃䈱႐ว䇮એਅ䈮␜䈜 䉦䊤䊛䈱ౣ↢䉕ⴕ䈦䈩䇮Hypercarb䉦䊤䊛䈏ㆬᛯᕈ䈶 2䈧䈱ᣇᴺ䈪䉦䊤䊛ᳪᨴ‛⾰䉕ข䉍㒰䈒䈏䈪䈐䉎䇯 ౣ↢䈱ᣇᴺ䈲એਅ䈱ㅢ䉍䈪䈜䇯㩷 ᒙ䈒ᜬ䈘䉏䈩䈇䉎Ⱞ⊕⾰䈱႐ว 1. TFA䉕㒰䈜䉎䈮䈲䇮 1.㩷 0.1M pH 3.0䈱䊥䊮㉄✭ⴣᶧ30ml䈪ᵞᵺ 㩷 㩷 THF(䍡䍢䍵䍩䍢䍼䍹䍪䍵䍻)䉕䉦䊤䊛ኈ㊂䈱70㊂ᵹ䈜䇯 ᒝ䈒ᜬ䈘䉏䈩䈇䉎Ⱞ⊕⾰䈱႐ว 2.㩷 DEA㩿䍚䍼䍒䍟䍷䍏䍮䍻㪀䉕㒰䈜䉎䈮䈲 䉦䊤䊛ᕈ⢻䉕ర䈱⁁ᘒ䈮ᚯ䈜ᔅⷐ䈏䈅䉎䇯 1.㩷 100%᳓ĺ100%CH3CN䈱䉫䊤䉳䉣䊮䊃60ಽ䈪 CH3CN (䍏䍜䍢䍤䍢䍶䍷)䉕䉦䊤䊛ኈ㊂䈱120㊂ᵹ䈜䇯 㩷 㩷 ᵞᵺ 200 㪉㪇㪇 ㊄ዻ䉦䉡䊮䉺䊷䉟䉥䊮䉕䉃䊘䊥䊙䊷䉦䊤䊛䈱ౣ↢㩿ᵞᵺ㪀 ㊄ዻ䉦䉡䊮䉺䊷䉟䉥䊮䉕䉃䊘䊥䊙䊷䉦䊤䊛䈱ౣ↢㩿ᵞᵺ㪀ᣇᴺ䈮䈲䇮㪊䈧䈱ᣇᴺ䈏䈅䉍䉁䈜䇯㩷 ㅒะ䈐䈮䉦䊤䊛䉕ធ⛯䈚䈩䇮ਅ⸥䈱䈮ᓥ䈇䇮ౣ↢㩿ᵞᵺ㪀䈚䈩䈒䈣䈘䈇䇯㩷 Column Type Metal Contamination Organic Column Cleaning Contamination Pump in reverse flow mode Pump in reverse flow mode Hydrogen at 0.1 mL/min with 0.1M at 0.1 mL/min with 20:80 Counter Ion H2SO4 ACN: 0.01M H2SO4@ 65 °C for 4 hr @ 25 °C for 4 to 16 hr Pump in reverse flow mode Calcium at 0.1 mL/min with 0.1M Ca(NO3)2 Pump in reverse flow @ pH 6.3 and 85 °C for 4 to 16 mode hr at 0.1 mL/min with Pump in reverse flow mode 20:80 Sodium at 0.1 mL/min with 0.1M ACN: H2O @ 25 °C Counter Ion NaNO3 for 4 hr Counter Ion @ 85 °C for 4 to 16 hr Pump in reverse flow mode Lead Counter Ion at 0.1 mL/min with 0.1M Pb(NO3)2 @ pH 5.3 and 85 °C for 4 to 16 hr 㪉㪇㪈 201 Pump in reverse flow mode at 0.1 mL/min with 20:80 ACN:H2O @ 25 °C for 4 hr ࠞࡓߩሽṁᇦ 㗅⋧♽ ⍴ᦼ㑆㧦↪ṁᇦ㧔⒖േ⋧ߩ߹߹㧕 㐳ᦼ㑆㧦↪ṁᇦ㧔⒖േ⋧ߩ߹߹㧕 ㅒ⋧♽ ⍴ᦼ㑆㧦R* ߇ࠞࡓߩ↪▸࿐ౝߢࠇ߫↪ޔṁᇦ ਛᦼ㑆㧦ࡔ࠲ࡁ࡞㧛᳓㧔㧦㧕 㐳ᦼ㑆㧦ࡔ࠲ࡁ࡞ 㧑 ᵈᗧ 0* ࠞࡓ㧦ࠕ࠻࠾࠻࡞ 㧑ߢሽ ࠕ࠻ࡦ↪ਇนޕ ᳓ࠍ⒖േ⋧ߢߩ㐳ᦼሽਇน㧔ࠕࡒࡁၮߦࠃࠅޔలႯߩ⚦ሹౝ߇Ⴎၮ ᕈߦ߈ࠆߖߐ↢⊒ࠍ࠼ࠗࡏޔᕟࠇ߇ࠅ߹ߔ㧕 %0 ࠞࡓ㧦᳓ࠍṁᇦߢߪޔട᳓ಽ⸃ߩㅴⴕᐲ߇ 1&5 ࠞࡓࠃࠅ߽ᣧޕ ᯏṁᇦ 㧑ߢߩሽߢߛߦߥࠆ߽ߩ߇ࠆޕ %0 ࠞࡓߩሽᣇᴺߦ㑐ߒߡߪࠍ࡞ࠕࡘ࠾ࡑࠆߡߟߦࡓࠞޔෳᾖ ෳ⠨⾗ᢱ ࠢࡠࡑ࠻ࠣࡈࠖߩᕈ⢻⹜㛎 ᜬ⢻㧔ࠠࡖࡄࠪ࠹ࠖࡈࠔࠢ࠲ 㨗㧕 8 ࠞࡓߩࡏࠗ࠼ࡏࡘࡓ㧔ㅒ⋧♽ߩࠞࡓߩ႐วㅢᏱ㨽㩡㩆㩣ߥ ߤߩలႯߦోߊᜬߐࠇߥߢṁߔࠆൻว‛㧔ታ㓙ߪዋߒ ᜬߐࠇࠆ㧕ࠍᵈߒߡࠆ 8㧦 ⹜ᢱߩᜬᤨ㑆 8㧙8 㨗㧩 8 ಽ㔌ଥᢙ㧔ࠢ࠹ࠖࡆ࠹ࠖ ǩ㧕 㨗㧦 㩕㩩㨺㩂 ߩᜬ⢻ 㨗㧦 㩕㩩㨺㩂 ߩᜬ⢻ 8 㩘㩨㨼㩎㩨㩘㩨㩢㨷㨺㩛 8 㩕㩩㨺㩂 ߩᜬኈ㊂㧔ᜬᤨ㑆㧕 8㧦 㩕㩩㨺㩂 ߩᜬኈ㊂㧔ᜬᤨ㑆㧕 㨗 8㧙8 ǩ㧩 㧩 㨗 8㧙8 ಽ㔌ଥᢙࠍᏀฝߔࠆ࿃ሶ ṁᇦߩ⚵ᚑ᷷ᐲࠞࡓ 19 㪉㪇㪉 202 ಽ㔌ᐲ 4㧔4GUQNWVKQP㧕 㧔T2 㧙 T1㧕 R 㧩 0.5㧔W1 + W2㧕 R ࠍᏀฝߔࠆ࿃ሶ ℂ⺰Ბᢙᜬ⢻㨯ಽ㔌ଥᢙ ℂ⺰Ბᢙ 0㧔ࠞࡓߩല₸㧕 5ǻᴺ㧔W㧦4.4㧑㧕 N㧩25 (T/W)2 4ǻᴺ㧔W㧦13.4㧑㧕 N㧩16 (T/W)2 ඨ୯ᴺ㧔W㧦50%㧕 N㧩5.54 (T/W)2 ࠲ࡦࠫࠚࡦ࠻ᴺ㧔USP㧕 㩕㩩㨺㩂ߩኻ⒓ㇱಽߦ ធ✢ࠍᒁߊ ធ✢ߣࡌࠬࠗ ࡦߣߩὐߩ 㧔W㧕 N㧩16 (T/W)2 ࠹ࡦࠣଥᢙ㧔ࠕࠪࡦࡔ࠻ࡈࠔࠢ࠲㧕 6㧩9㧛㨒 9㧦ࡇࠢߩ ߩ㜞ߐߩ 㨒㧦ࡇࠢ㜞ߐߩ 㧑ߩ⟎㧔೨㧕߆ࠄု✢߹ߢߩ 㧚ࡃࡦ࠼ࠬࡊ࠺ࠖࡦࠣ࠹ࠬ࠻ $5㧔ࠪࠬ࠹ࡓߩ࠺࠶࠼ࡏࡘࡓߩ᷹ቯ㧕 ࠞࡓࠍߪߕߒߡߢࡦࠝ࠾࡙ޔធ⛯ߒߡߊߛߐ ᵹㅦ 㧦 㨙.OKP BS㧔ǴL㧕㧩W1㧛2011000 ᬌེߩᗵᐲ 㧦 㧙#7(5 ᬌེߩᤨቯᢙ㧦 ࠆߪߘࠇએਅ 㩋㨶㨺㩎㩇㩕㩩㨺㩎㩨 㧦 EOOKP ㈩▤ౝᓘ OO ኈ㊂ Ǵ.EO W㧦㩕㩩㨺㩂㜞ߐߩ 4.4%ߩ ㅢᏱߩ HPLC 100r30ǴL ኈ㊂ ㈩▤ౝᓘ +PEJ Ǵ.KPEJ 20 㪉㪇㪊 203 HPLC and LC/MS 分析スケールを小さくする Scaling Down a Method HPLCあるいはLC/MSでのスケール Reasons to Scale Down a HPLC or ダウンが必要となる理由 LC/MS Method There are applications where it is desirable to scale down a method without transferring the method to U-HPLC. These reasons may be to: 試料量が少ないので、感度の増加が • Maximize sensitivity when small amounts 必要とされる of sample are available • Make flow rate compatible with ionization ESIイオン化によるMS検出を行うた め、流速を下げる必要がある technique in MS detection 溶媒消費量を減らし、コスト低減を • Reduce costs by reducing solvent 図りたい consumption Transfer Method to a 内径の細いカラムへの 分析法の変更 Narrower Column UV検出からMS検出に変える場合あるいは Reducing the scale of a separation by reducing ドラッグディスカバリーやプロテオミクス the column internal diameter may be necesなどのように、試料絶対量が少ない場合に sary when transferring a method from UV は、カラム内径を小さくして、分離のス to MS detection, or when only very small ケールを下げる必要があります。MS検出 amounts of sample are available, such as in に変える場合は、イオン化手法あるいはイ オン源デザインにより、最適な流量範囲が drug discovery or proteomics. In the first 決まります。（上の表を参照してくださ case ionization technique or source design い）試料量が限られていて少ない場合は、 determines the best flow rate range (see table 高濃度で検出できるように、クロマト上の above) and in the latter case, method sensiピーク幅を出来るだけ狭くすることが求め られます。もし、他の条件、カラム長さ、 tivity is maximized because solutes elute in 充填剤粒子径、充填剤種類、移動相組成、 more concentrated chromatographic bands. グラジエント条件、カラム温度などが同じ If all other method parameters (column 場合は、内径を細くすることで、変更が求 length and particle size, column chemistry, められるのは、流速のみを次式で計算され mobile phase composition, gradient range る値に変更する必要があります。 and time, separation temperature) are kept unchanged, the change to a narrower column only requires adjustment of the flow rate. F2 = F1 x (dc2 /dc1)2 where F1 – original flow rate (to be reduced) F2 – new flow rate dc1 – original column internal diameter dc2 – new column internal diameter その理由としては、カラム容積が変わるか This is applicable to both isocratic and らです。流速は、移動相条件が一定であっ gradient methods. The new method should ても、グラジエントであっても同じです。 produce a chromatogram with identical 流速が新しい値になっても、原則的に分離 resolution and identical run time. If small 度、分析時間は変わりません。もし、保持 changes in retention times and resolution 時間や分離度が変わるとすると、それは、 後述のシステムドウエル容積(system are observed this is generally caused bydwell volume)が変化することによるものです。 Typical Flow Rates for Analytical, Narrowbore, Capillary and Nanobore Columns (5 µm Particles) Column ID (mm) Flow Rate Range (µL/min) Optimum Flow Rate1 (µL/min) Recommended Injection Volume2 (µL) API Source 4.6 1000 – 1500 1250 30 APCI or High flow ESI 3.0 400 – 600 500 10 APCI or High flow ESI 2.1 200 – 300 250 5 APCI or Micro-ESI 1.0 40 – 60 50 1 Micro-ESI 0.5 10 – 25 12 0.35 Micro-ESI 0.32 4 – 10 5 0.15 Micro-ESI 0.18 1–3 2 0.05 Micro-ESI 0.1 0.4 – 1 0.5 0.015 Nanospray 0.075 0.2 – 0.5 0.3 0.01 Nanospray 1. Recommended for good efficiency and moderate pressure. Higher flow rates may lead to column voids. Lower flow rates are recommended for washing column bed or changing solvents. 2. Estimates based on negligible loss of efficiency and isocratic elution with sample solvent identical to mobile phase. Larger volumes can be introduced under gradient conditions or using weaker sample solvent. 短いカラム長さへの変更 Transfer Method to a Shorter Column グラジエント条件を使用している場 In gradient elution, the simplest way to 合、分析サイクル時間を短縮する最も reduce the method cycle time is to reduce 単純な方法は、カラム長さを短くする the column length. If all other method ことです。もし、他の条件−カラム内 parameters (column ID and particle size, col径、粒子径、充填剤種類、移動相組 umn chemistry, mobile phase composition, 成、グラジエント条件、流速、カラム 温度−が変わらなければ、グラジエン gradient range, flow rate, separation temperトの時間のみ、式Bに従って変更しま ature) are kept unchanged the only requireす。グラジエント時間は、カラム容積 ment is to change the gradient time using の比だけ減少することになります。 the equation below, where gradient time is reduced by the same factor as the reduction in column volume. tg1/Vc1= tg2 /Vc2 where tg1 – gradient time in original method (min) tg2 – gradient time in new method (min) Vc1 – original column volume (mL) Vc2 – new column volume (mL) Column volume Vc (mL) can be estimated using: Vc = 0.68 x π x r2 x L Vc – column volume (mL); L – column length (cm); r – column radius (cm) system dwell volume (discussed below). 㪉㪇㪋 210 To order or for customer support, please see back cover. 204 ドウェル容積 Dwell Volume Dwell Volumeとは、移動相が混合される点か Dwell volume is just as important when scaling らカラムヘッドまでのHPLCシステムの容量 のことです。別の言い方をするとグラジエン down a method as for method transfer to ト分析における、移動相が一定組成のまま遅 U-HPLC. The effect of dwell volume on the れる、その容量を意味します。汎用のHPLC separation is more significant when narrow においては、その容量は、0.5-5mLの範囲で columns are used at low flow rates. For す。このdwell volumeが分離に影響するの instance, if the system has a dwell volume は、低い流量を流す内径の細いカラムを用い る場合です。dwell volumeが2mLを持つ of 2.0 mL and a 4.6 mm ID column is run at HPLCで考えると、通常の4.6mmφのカラム 1 mL/min, it takes 2 minutes for the gradient で流速1mL/分の場合、グラジエント開始の to reach the head of the column; however, ２分後に、カラム先端にグラジエント移動相 if a 2.1 mm ID column is used with a が到達します。しかしながら、2.1mmφのカ ラムで流速が0.4mL/分の場合、グラジエント 0.4 mL/min flow rate it will take 5 minutes の遅れの時間は5分にもなります。従って、 for the gradient to reach the column. In high 内径の細いカラムにより、ハイスループット throughput gradient separations using small 分析を行う際、dwell volumeが大きいと分析 volume columns, dwell volume causes an 時間や、分析終了後、次の試料を分析するた increase in run times and longer re-equilibraめ、グラジエント条件の初期値に戻したりす る、再平衡化時間が長くなってしまいます。 tion time between runs. グラジエント条件の遅れを極力減らす為に、 Several approaches can be taken to 幾つかの方法があります。 minimize these effects: • 小さなグラジエントディレイ容量を持 Select a pump with a small gradient delay つHPLCを使用する（Accela volume (e.g., Thermo Scientific ポンプは、 Accela high 僅か65μLです)。 speed LC system has a delay volume of only 65 µL); グラジエントがカラム先端に達した時 • Delay sample injection until gradient has に、遅れて試料を注入する reached the head of the column; 高流量でHPLCを運転し、移動相はスプ • Set the pump at a higher flow rate and リットさせ、一部をカラムに流すよう split the flow before the column. に工夫する Technical Information 分析スケールを大きくする Scaling Up a Method HPLCあるいはLC/MSでのスケール Reasons to Scale Up an アップが必要となる理由 HPLC Method 分析法のキャパシティを大きくしたい • Increase method capacity ターゲット化合物の単離精製目的 • Isolation and purification of target compounds 試料のスループットを上げたい • Increase sample throughput 混合物試料から目的の成分を単離精製が Analytical methods may require scale up 必要になる場合、分析法のスケールアッ to preparative sizes to isolate and purify プが必要となります。分取を行うに当た compounds from mixtures. In choosing the り、最良のカラムあるいは充填剤を選択 best column and packing material for your する際、カラムサイズの他にカラムの分 離選択性や試料負荷量についても考慮 preparative application, consider the selecし、最も早くて安く行えるようにする必 tivity and loadability of the media as well as 要があります。サーモフィッシャーは、 column dimensions, to give the results you Hypersilカラムなどの分析用カラムと同 need most quickly or economically. We have 様の分離性能・再現性を有する分取用カ established a strong reputation for the manuラム、充填剤も提供いたしております。 スケールアップは、分析用に用いた充填 facture and supply of high quality preparative 剤と同一の充填剤（但し、粒子径は大き silicas and bonded phases, designed to give め）を用いるのが最も簡単です。 弊社 the same levels of performance and reproは、分取用カラムとして、分析用カラム ducibility as our popular analytical silica と同じ充填剤で粒子径が大きい充填剤を ranges such as the Hypersil™ phases. 各種用意いたしております。分取検討用 カラムに、250mm×4.6mmの検討カラ Scale up is easiest when starting from ムが通常、用いられます。分析用カラム an analytical column packed with smaller の分析条件が決まれば、スケールアップ particle size media offering the same selecができます。 tivity as the larger particle size preparative media. The leading families of Thermo Scientific phases are offered in various sizes to complement lab scale operations and facilitate the scale up to preparative chromatography. Scout columns, typically 250 x 4.6 mm packed with the media of interest can also be used to develop the separation. Once the method is finalized on the smaller column, a scaling factor can be applied. Mobile phase viscosity changes with composition 分取LCの為のスケールアップ法 Scaling Up to a Preparative Column カラム背圧(バックプレッシャー) Column Backpressure Flow rate and column load scaling are only カラムの内径を大きくした場合に変更が 必要になるのは、流速および試料負荷量 required when changing the internal diameter ofです。スケールファクターとは、内径が the column. The scaling of flow rates allows 異なる場合でも、保持時間 peak retention times to remain relatively を一定に保つためのものです。移動相の constant between columns with different 流速の典型的な値は、カラム内径と充填 internal diameters. The typical solvent flow 剤粒子径で決まります。このスケール ファクターは、カラムの試料負荷量の計 rate through a column is dependent on its 算にも使用できます。カラム長さが同じ internal diameter and the particle size of the 場合、スケールファクターは、次式で計 column packing material. This scaling factor 算されます。 can also be used to estimate the loading カラムへの試料負荷量も、このスケーリ capacity of a given column. Assuming column ングファクターで計算できます。 length is a constant, the scale factor can be calculated using the following formula: カラム背圧は、カラム長さ、内径、充填 Column operating backpressure is affected 剤粒子径、温度、溶媒、流速により、影 by column length, internal diameter, media 響されます。さらには、グラジエント条 particle size, temperature, solvent properties 件−移動相組成比にも影響を受けます。 and solvent flow rate. It can also be affected カラム背圧は、一般に次式であらわされ by the use of gradients, where the pressure ます。移動相の粘度は、組成比により変 わります。メタノール、アセトニトリル may vary with solvent composition. Typical を水に加えた場合の粘度の変化の例を上 operating backpressure for columns or の図に示します。LC装置で最大のス cartridges can be calculated using the ループットを得るには、移動相の粘度変 following equation: 化も重要になります。 Scale Factor = dc22/dc12 where and dc1 – original column internal diameter (mm) dc2 – new column internal diameter (mm) The column loading capacity and flow rate required for the new larger ID columns can be calculated using this factor. Pressure (atm) = 2.1 x Φ x L x η dp2 x d2 where Φ = column impedance (1000 for 4.6 mm ID columns) L = column length (mm) dp = particle diameter (µm) d = column diameter (mm) η = mobile phase viscosity (centipoises) The mobile phase viscosity varies with composition. As an example, the figure above shows how water viscosity varies with the addition of methanol or acetonitrile. This variability is a critical component in maximizing throughput with respect to the chromatography instrumentation being used. 㪉㪇㪌 www.thermo.com /columns 205 211 HPLC and LC/MS 緩衝液の正しい選択法 Selecting the Right Buffer 右の表は、よく使われる緩衝液とそのpH A partial list of common buffers and their につきまとめたものです。HPLCで最も良 corresponding pH values is shown in the く用いられる緩衝液はリン酸緩衝液です。 Common Buffer Systems table. Perhaps the 緩衝液とは、PH変化に対し抵抗する能力 most common HPLC buffer is some form of を持つものです。しかし、緩衝液の緩衝能 phosphoric acid. Remember that a true buffer を100%発揮するのは、そのpK値のみで す。例えば、リン酸緩衝液は、pH4では、 should have the ability to resist pH change 緩衝能は十分には働きません。酸あるいは when a sample is introduced at a different pH, 塩基性の試料を加えると、pHはpKa値に向 and that buffer capacity is only 100% at the pK かって変化します。以上より、一般に緩衝 value of the acid or base. At pH 4, phosphate 液を使用する場合は、制御可能な移動相の pH範囲は、緩衝液のpKa±1の範囲となり is a poor buffer and would change rapidly ます。必要な緩衝液濃度はカラム充填剤や toward one of its pKa values if a more acidic 試料濃度や試料の性質などに依存します or basic sample were introduced. が、10-100mMの濃度を用います。 As aGOLD rule, one should work within ±1 pH Hypersil aQｶﾗﾑなどのは、通常のア unit of the buffer pKa value for good pH ルキルシリカカラムに比べ、緩衝液濃度は 薄くてすみます。 control of the mobile phase. Adequate buffer concentrations for HPLC tend to be in the 移動相pHを2-3に制御したい場合には、リ ン酸緩衝液あるいはTFA、ギ酸などのより 10 - 100 millimolar level depending on the 強い有機酸が一般的に用いられる。移動相 size and nature of the sample, as well as the pHを4-5に制御したい時は、リン酸塩の代 column packing material. Phases based on わりに酢酸塩やクエン酸塩などの有機酸塩 highly pure silica with robust bondings such 緩衝液を用います。右の図は、適切な移動 相pHを選ぶことが分離に大事なことを示 as the Hypersil GOLD range, are often more すものである。適切な緩衝液を使用してい compatible with dilute buffers than ないと、様々な要因（移動相調製誤差、ポ traditional packings. ンプミキシング変動、大気からの水分の移 When control at a lower pH (2 - 3) is 動相への吸着）により、移動相pHが幾分 desired, phosphate, or stronger organic acids 変化することになります。緩衝液と有機移 動相は混合した場合、塩が析出することが such as TFA or acetic acid, are commonly あるので、注意が必要です。分析終了後 used. If control at pH 4 - 5 is desired, an は、いつも洗浄を行い、焼結フィルタ(フ organic acid buffer such as acetate or citrate リット）に固体を析出させない様にして下 should be considered in place of phosphate. さい。 The figure to the right shows the importance of choosing the correct pH for a separation. Even slight changes in pH, either from measuring errors, mixing complications with the pump, or atmospheric water adsorption into the mobile phase, can alter any method if not properly buffered. Care should be taken when choosing a buffer and organic modifier mixture to ensure that a solution of the two does not produce a solid salt which could cause blockages and system contamination. Buffers should always be flushed from the analytical column and instrument after use to avoid salts being deposited on delicate frits etc. Common Buffer Systems Buffer pKa TFA 0.30 Phosphate MS-Compatible? Yes pK1 2.1 1.1 – 3.1 No pK2 7.2 6.2 – 8.2 No pK3 12.3 11.3 – 13.3 No pK1 3.1 2.1 – 4.1 No pK2 4.7 3.7 – 5.7 No pK3 5.4 4.4 – 6.4 No Formate 3.8 4.4 – 6.4 Yes Acetate 4.8 3.8 – 5.8 Yes Tris Base (Trizma, THAM) 8.3 7.3 – 9.3 Yes Ammonia 9.2 8.2 – 10.2 Yes Borate 9.2 8.2 – 10.2 No Diethylamine 10.5 9.5 – 11.5 Yes Citrate Carbonate pK1 6.4 5.4 – 7.4 Yes pK2 10.3 9.3 – 11.3 Yes Triethanolamine 7.80 Yes BETASIL™ C18, 5 µm, 50 x 4.6 mm Part Number: 70105-054630 Eluent: 50% ACN / 50% 25 mM KH3PO4 at pH indicated Flow Rate: 0.8 mL/min Detector: UV @ 220nm A: pH 2.1 Sample: 1. Uracil 2. Tolmetin 3. Naproxin 4. Fenoprofen 2 3 1 7 7 1 4 4 5 5 6 6 701-085 0 6 MIN 701-086 0 Effect of small changes in pH on the separation of mildly ionizable compounds To order or for customer support, please see back cover. 206 5. Diflunisal 6. Indometacin 7. Ibruprofen B: pH 2.5 2 3 㪉㪇㪍 216 Useful pH Range 6 MIN Technical Information LC/MS用緩衝液の選択 Buffer Selection for LC/MS 緩衝液の選択は、試料及び分析装置に依 Buffer choice will be very dependent on the 存します。理想的には、LC/MSを行う場 analyte and the instrumentation used. Ideally, 合、イオン源を汚染する固体析出がな LC/MS applications should use a volatile い、揮発性の緩衝液を用います。無機 buffer as this will not form a contaminating 酸、不揮発性緩衝液やイオン対試薬など の使用は避けて下さい。典型的なLC/MS deposit on the source. Inorganic acids, 用緩衝液は以下の通りです。 involatile buffers and ion-pair reagents should all be avoided. Typical LC/MS buffers include: • Ammonium acetate/formate/hydrogen carbonate (< 50 mM) • Formic/acetic acid (0.01 – 1% v/v) • Trifluoroacetic acid (< 0.1% v/v) • Trialkylamine (< 0.1% v/v) and aqueous ammonia type bases • TRIS • BIS-TRIS propane Note: There are LC/MS instruments available, for example the Surveyor™ MSQ™ LC/MS, which incorporate a self-cleaning mechanism to reduce the build up of inorganic buffers on the source during routine use. Care should still be taken not to purposefully overcontaminate the instrument source as this will lead to operating difficulties. 移動相溶液の調製法 Preparation of Mobile Phases 正しく移動相を調製することは大事なこと Correct solvent preparation is very です。その理由は調整法を誤ると、種々の important. It can save vast amounts of トラブル、偽のピーク、ベースラインの変 time spent troubleshooting spurious 動を引き起こし、貴重な時間を無駄に費や peaks, baseline noise etc. すことになるからです。 Quality All reagents and solvents should be of the 全て、LCで用いる試薬および溶媒は最高の 品質のものを使用して下さい。HPLCグレー highest quality. HPLC grade reagents may ドの試薬は値段が少し高くなりますが、純 cost slightly more than lower grade 度の違いに注意を払う必要があります。 reagents, but the difference in purity is HPLCグレードには含まれませんが、純度の marked. HPLC grade reagents contain no 低い試薬は、含有不純物によるゴースト ピークを生じさせます。また、緩衝液を調 impurities to produce spurious peaks in a 製時に使用する水についても、高純度のも chromatogram baseline whereas lower のを使う必要があります。脱イオン水は、 grade reagents do contain trace levels of 極微量の有機物を含みますので、それを使 impurities, which may produce spurious 用することは薦められません。 baseline peaks. 緩衝液の調製には、高純度の水を使用する Ensure that any water used in buffer 必要があります。脱イオンだけでは、ト preparation is of the highest purity. レースレベルの有機物が含まれるので、 Deionized water often contains trace levels HPLC用には勧められません。 of organic compounds and therefore is not HPLC用の超純水(18MΩ)は、脱イオン水を イオン交換樹脂を通すことで製造されま recommended for HPLC use. Ultra pure HPLC す。市販の超純水製造装置は、このメカニ water (18 MΩ resistivity) is generated by ズムで大量の超純水を製造するものです。 passing deionized water through an ion または、試薬メーカーから、HPLC用の水を exchange bed. Modern water purification 購入することもできます。 instruments use this mechanism to produce water of suitable quality in high volumes. Preferably, HPLC grade water can be purchased from solvent suppliers. Important: Do not store HPLC grade water in plastic containers. Additives in the plastic may leach into the water and contaminate it. Always store HPLC grade water in glass containers. Buffers 全ての緩衝液は、用事調製して下さい。そ All buffers should be prepared freshly on the れは、長期保存により、pH変化や微生物 day required. This practice ensures that the (菌）の発生が起きることがあるからで buffer pH is unaffected by prolonged storage す。これらは、分離の妨げになります。 and that there is no microbial growth present. Changes in pH and microbial growth will affect chromatography. Mobile Phase – Not Degassed Mobile Phase – Degassed 緩衝液を貯蔵する場合には有効期間があ If buffer solutions are stored, be aware ることを理解してください。緩衝液の有 that they have a finite lifetime. Refer to 効期限などは、薬局方などの解説を参照 pharmacopoeia monographs or similar for 下さい。緩衝剤には、sodium further guidance on buffer shelf life. metabisulfiteなどの安定剤を含むものが あります。これらの安定剤は、光学的、 Buffer reagents can contain a stabilizing クロマト的に影響を与えるので、安定剤 agent, for example, sodium metabisulphite. を含まない試薬を購入するようにしてく These stabilizing agents often affect the ださい。固体試薬は何度も使用する間に optical and chromatographic behavior of 汚染の危険があるので、購入する際は、 buffer solutions, so it is often worth buying 必要最小単位での購入を奨めます。 reagents that contain no stabilizer. Containers of solid reagent are easily contaminated by repeated use. For this reason, we recommend that reagents be purchased in low container weights. Filtration Ideally, all HPLC solvents should be filtered HPLCで用いる移動相は、0.45μmのフィ ルタでろ過してください。これにより、 through a 0.45 µm filter before use (see 閉塞につながる粒子状物質を取り除くこ HyperClean™ Filters page 172). This removes とが出来ます。ろ過後は、溶媒は、ほこ any particulate matter that may cause blockりなどが混入しないようにリザーバにカ ages. After filtration, the solvents should be バー(ふた）つきで保管してください。こ stored in a covered reservoir to prevent reのろ過により、クロマト分離の他に、 HPLC装置の磨耗・損傷も防げます。ポン contamination with dust etc. Filtering HPLC ププランジャ、シール、チェックバルブ solvents will benefit both your chromatograの寿命が延びます。 phy and the wear and tear of the HPLC system. Pump plungers, seals and check valves will perform better and lifetimes will be maximized. Degassing Before the freshly prepared mobile phase is 移動相は使用する前に、溶存気体を完全に 脱気すべきである。脱気には、次の3通り pumped around the HPLC system, it should の方法があります。 be thoroughly degassed to remove all dissolved gasses. Dissolved gas can be removed from solution by: ヘリウム脱気 • Bubbling with helium 超音波脱気 • Sonication • 真空脱気 Vacuum filtration 移動相が脱気されていない場合、低圧の検 If the mobile phase is not degassed, air 出器セル内で気泡が発生することがありま bubbles can form in the low pressure of the す。その結果、装置が不安定になり、ベー detector cell resulting in problems with system スラインの変動やゴーストピークが生じま instability, spurious baseline peaks etc. す。最も効果的な方法は、ヘリウムなどの The most efficient form of degassing is 溶解度の低いガスによるバブリングで脱気 することです。この方法が使える場合は、 bubbling with helium or another low solubility 分析中、弱くバブリングし続けることを奨 gas. If this method is available, we recommend めます。これにより、分析時の空気再溶解 that the mobile phase is continually degassed を防ぐことができます。 at very low levels throughout the analysis. This will inhibit the re-adsorption of gases over the analysis time. Note: Ensure that the solvent reservoir has a vent to the atmosphere to prevent the build up of pressure inside the reservoir. Baseline noise from gas in mobile phase 㪉㪇㪎 www.thermo.com /columns 207 217 HPLC and LC/MS 有機溶媒の性質（対シリカゲル）と混和性 Solvent Properties (vs Silica Gel) and Miscibility 㪉㪇㪏 218 To order or for customer support, please see back cover. 208 Technical Information 発色団の検出波長と吸収強度 Chromophore Detection Wavelengths Chromophores are light absorbing groups. Their behavior is used to allow the detection of analytes. They have one or more detection wavelengths, each of which has a molar adsorbtivity associated with it. The information contained in the following table is intended as a guide to common chromophores. It is not an exhaustive list. λmax (nm) εmax (L/m/cm) Acetylide -C≡C- 175 – 180 6,000 Aldehyde -CHO 210 Strong 280 – 300 11 – 18 Chromophore Amine -NH2 195 2,800 Azidin > C=N- 190 5,000 Azo -N=N- 285 – 400 3 – 25 184 46,700 202 6,900 255 170 Benzene Carboxyl -COOH 200 – 210 50 – 70 Ester -COOR 205 50 Ether -O- 185 1,000 Ethylene -C=C- 190 8,000 Ketone > C=O 195 1,000 270 – 285 18 – 30 220 112,000 275 175 312 5,600 -ONO2 270 12 -(C=C)-2 acyclic 210 – 230 21,000 -(C=C)3 260 35,000 C=C-C=C 219 6,500 C=C-C=N 220 23,000 C=C-C=O 210 – 250 10,000 – 20,000 C=C-NO2 300 – 350 Weak -C≡N 160 -ONO 220 – 230 1,000 – 2,000 300 – 400 10 Napthalene Nitrate Nitrile Nitro -NO2 210 Strong Nitroso -N=O 302 100 Oxime -NOH 190 5,000 174 80,000 195 6,000 N 251 1,700 Sulfone -SO2- 180 Sulfoxide > S-O 210 1,500 Thioether -S- 194 4,600 215 1,600 195 1,400 Pyridine Thiol -SH 㪉㪇㪐 www.thermo.com /columns 209 219 ポリマーチューブの溶剤耐性 19㧚ࡐࡑ࠴ࡘࡉߩ⠴ṁᇦᕈ 1㧦↪น⢻ 2㧦ಽᨆᴺଐሽ 3㧦↪ਇน ήශ㧦ਇ 24 㪉㪈㪇210
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