Nano-Glo Dual-Luciferase Reporter Assay System

Nano-Glo® Dual-Luciferase® Reporter Assay System
INSTRUCTIONS FOR USE OF PRODUCTS N1610, N1620, N1630 AND N1650
Reagent の調製
ONE-Glo™ EX Reagent：
ONE-Glo™ EX Luciferase Assay Buffer 全量を ONE-Glo™ EX Luciferase Assay Substrate のボトルに添加します。ボトルに
蓋をして、基質が溶けるまで転倒混和してください。
NanoDLR™ Stop & Glo® Reagent：
NanoDLR™ Stop & Glo® Reagent は、実験に必要な量を計算し、用事調製してください。
NanoDLR™ Stop & Glo® Substrate が 1/100 になるように新しいチューブに室温の NanoDLR™ Stop & Glo® Buffer を添加して
転倒混和してください。
例：NanoDLR™ Stop & Glo® Reagent を 4ml 作成する場合、15ml のチューブに 4ml の NanoDLR™ Stop & Glo® Buffer を
添加し、40μl の NanoDLR™ Stop & Glo® Substrate を添加する。
測定方法
ONE-Glo™ EX Luciferase
＜マルチチャンネルピペットを使用した 96 well plate のプロトコル＞
Assay Reagent をプレート
1.
に添加し混和する。
プレートを室温に平衡化する。
96 well plate での培地量は 80μl を推奨します。培地と等
20–25°C で 3 分～2 時間インキュベ
量の reagent を加えるため、最終ボリュームは培地の 3 倍
ートする。
になります。Well 間のクロストークを最小限にするため、
プレートは、培養用の白色プレートをご使用ください。
2.
ホタルルシフェラーゼの活性測定
・
培地と等量の ONE-Glo™ EX Reagent を加える。
・
サンプルを最低 3 分間インキュベートする。オービタ
ホタルルシフェラーゼ発光を測定する。
ルシェーカー(300–600 rpm)での混和を推奨。
・
ルミノメーターでホタルルシフェラーゼ活性を測定す
る。測定条件は各ルミノメーターに合わせて設定する*。
NanoDLR™ Stop & Glo®
3.
®
NanoLuc ルシフェラーゼの活性測定
・
最初の培地量と等量の NanoDLR™ Stop & Glo
Reagent をプレートに添加し混和す
®
る。
Reagent を加えよく混ぜる。オービタルシェーカー
(600–900 rpm)で最低 3 分間混和する。ピペッティン
20–25°C で 10 分～2 時間インキュ
グを 2 回行って混和することも可能。
・
ベートする。
10 分以上インキュベートした後（混和時間を含む）、
ルミノメーターで NanoLuc®ルシフェラーゼ活性を測
定する。測定条件は各ルミノメーターに合わせて設定
する*。
NanoLuc® ルシフェラーゼ発光を測定
*
GloMax®プレートリーダーを使用して 96 well プレート
を測定する場合、測定時間は 0.5–1 秒に設定することを推奨します。
技術的なお問合せは：
e-mail: [email protected]・Tel: 03-3669-7980・Fax: 03-3669-7982
www.promega.co.jp
GloMax® Discover System
する。
＜デュアルインジェクターを使用した 96 well plate のプロトコル＞
NanoDLR™ Assay は、デュアルインジェクターを装備したルミノメーターを用いて測定することができるシステムです。
全ての NanoDLR™の実験は下記のインジェクター設定で行ってください。
・
インジェクター #1：ONE-Glo™ EX Reagent 用
・
インジェクター #2：NanoDLR™ Stop & Glo® Reagent 用
インジェクター #2 は、ホタルルシフェラーゼ試薬や Ultra-Glo™ recombinant luciferase を含む試薬の使用は避けてください。使用後の
インジェクター洗浄については、Nano-Glo® Dual-Luciferase® Reporter Assay Technical Manual #TM426 の 3.H. Wash
Protocols for Automated Sample Injection Systems をご覧下さい。また、高速に試薬を注入すると泡が発生し、シグナルの増減
につながります。泡が発生しないようにインジェクターのラインおよびインジェクターの設定を検討してください。
96 well フォーマットでのデュアルインジェクションアッセイ
1.
インジェクター #1 に ONE-Glo™ EX Reagent、インジェクター #2 に NanoDLR™ Stop & Glo® Reagent を充填する。
2.
プレートをインキュベーターから取り出し、室温に平衡化する。サンプル培地量が、80μl/well になるようする。
3.
インジェクター #1 から、80μl の ONE-Glo™ EX Reagent を全ての well に注入する。
4.
3 分間インキュベートする。
5.
全ての well のホタルルシフェラーゼの活性を測定時間 1 秒で測定する。
6.
インジェクター #2 から、80μl の NanoDLR™ Stop & Glo® Reagent を全ての well に注入する。
7.
5 分間インキュベートする。
8.
全ての well の NanoLuc®ルシフェラーゼの活性を測定時間 1 秒で測定する。
9.
Nano-Glo®Dual-Luciferase® Reporter Assay Technical Manual #TM426 に従って分注に使用したインジェクターのライン
を洗浄する。
GloMax®プレートリーダーの測定プロトコルについてはテクニカルサービス部にお問い合わせ下さい。
テクニカルサービス部 [email protected]
技術的なお問合せは：
e-mail: [email protected]・Tel: 03-3669-7980・Fax: 03-3669-7982
www.promega.co.jp
【モデルプロトコル】
HEK293 細胞での NF-κB-応答の実験例：
必要な試薬：
・Dulbecco’s PBS (DPBS)
・0.05% (w/v) trypsin in DPBS
・DMEM
・DMEM supplemented with 10% fetal bovine serum (DMEM/FBS)
・Tumor necrosis factor-α (Sigma T0157), 10μg/ml solution in PBS containing 1mg/ml BSA
・Nano-Glo® Dual-Luciferase® Reporter Assay System
・HEK 293 cells
・トランスフェクション試薬 (例：ViaFect™ Transfection Reagent, Cat.# E4981)
・pNL3.2.NF-κB-RE [NlucP/NF-κB-RE/Hygro] Vector (Cat.# N1111)
・pGL4.53[luc2/PGK] Vector (Cat.#E5011)
・Transfection Carrier DNA (Cat.#E4881)
Day 1：細胞の播種
1.
約 75%コンフルエントになるように細胞を DMEM/FBS 培地に播種する。
2.
培地を除去し、DPBS で細胞を洗浄する。Trypsin/DPBS(1 倍量)を添加し 2 分間インキュベートする。4 倍量の DMEM/FBS を
添加し、細胞懸濁液を回収して遠心により細胞をペレットダウンする。アスピレーターで上清を捨て、新しい DMEM/FBS に懸濁する。
プロメガでは通常 15,000 cells/100μl に調製している。
3.
100μl の細胞懸濁液を 96-well プレートに添加する。トリプリケートで解析が行える十分な well 数を準備する。
4.
プレートに蓋をし、細胞培養用のインキュベーターで 37℃、一晩（または、24 時間）インキュベートする。
Day 2：トランスフェクション
1.
高導入効率のトランスフェクション試薬（例：ViaFect™ Transfection Reagent, Cat.# E4981）を使用してトランスフェクションを
する。
例：各 well に全量 50ng の DNA をトランスフェクションする場合のベクター比率
・ 5ng pNL3.2. NF-κB-RE[NlucP/ NF-κB-RE/Hygro] Vector, Cat.# N1111)
・ 5ng pGL4.53[luc2/PGK] Vector (Cat.#E5011)
・ 40ng Transfection Carrier DNA (Cat.# E4881)
2.
プレートに蓋をし、細胞培養用のインキュベーターで 37℃、一晩または細胞が十分回復するまでインキュベートする。
注意：インキュベーション時間は、使用したトランスフェクション試薬のマニュアルに従ってください。高い導入効率を得るために、ベクター量やト
ランスフェクション試薬との比率など、トランスフェクション条件最適化を行って下さい。トランスフェクションの条件検討は下記サイトをご参照くだ
さい。
ViaFect™ Transfection Reagent Technical Manual #TM409
http://www.promega.jp/resources/protocols/technical-manuals/101/viafect-transfection-reagent-protocol/
技術的なお問合せは：
e-mail: [email protected]・Tel: 03-3669-7980・Fax: 03-3669-7982
www.promega.co.jp
Day 3：トランスフェクションを行った細胞への誘導
1.
必要量の 1×induction 溶液と 1×control 溶液を調製する。1 well あたり 100μl でトータルボリュームを算出し、必要量の 110%
を準備する。
・
1×induction 溶液：10μg/ml TNFα solution を DMEM/FBS で終濃度 20ng/ml になるように希釈する。
・
1×control 溶液：DMEM/FBS
2.
Well から培地を取り除く。
3.
誘導を行う細胞に 100μl の 1×induction 溶液を添加し、コントロール細胞に 100μl の 1×control 溶液を添加する。
4.
プレートを細胞培養用のインキュベーターに戻し、5 時間誘導する。
5.
Nano-Glo® Dual-Luciferase® Reporter Assay System を用いて解析する。
6.
以下のように誘導倍率を計算する。
・誘導を行った細胞の発光値の平均を内部標準の発光値の平均で割る。
この値を誘導した細胞の補正値とする。
・コントロール細胞の発光値の平均を内部標準の発光値の平均で割る。
この値をコントロール細胞の補正値とする。
誘導した細胞の補正値
誘導倍率＝
コントロール細胞の補正値
この Quick Protocol は TM426 を基に作成された簡易型のプロトコルです。
最新、詳細なプロコトルについては以下をご覧ください。
http://www.promega.jp/resources/protocols/technical-manuals/101/nanoglo-dual-luciferase-reporter-assay-protocol/
技術的なお問合せは：
e-mail: [email protected]・Tel: 03-3669-7980・Fax: 03-3669-7982
www.promega.co.jp
Revised 04/15

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