日本語簡易操作ガイド

DRAFT
7300/7500/7500Fast Real-Time PCR System
納品説明補足資料・簡易操作ガイド＊
＊7300/7300withRQ/7500/7500Fast 共通資料です。お持ちの機種によりオプションとなる機能の説明も含まれています。
Rev.A
DRAFT
目次
1
Real Time 定量PCR
4
ケミストリ
・蛍光5`エキソヌクレアーゼアッセイ
ケミストリ（TaqMan®アッセイ
ケミストリ）
・SYBR®Green I Dye アッセイケミストリ
4
6
8
7500/7300/7500Fast の特徴
8
10
・ハードウェア
・ソフトウェア
13
7500/7300/7500Fast 使用注意事項
・Precision Plate Holderのセットに関する注意事項
18
7500/7300/7500Fast Real-Time PCR System　使用フロー
19
反応試薬の選択（推奨条件）
20
SDSシステムソフトウェア簡易操作ガイド(I)
21
Absolute Quantification ～検量線を用いた定量法～
・新規プレートドキュメントの作成：
・7300/7500システムのサーマルサイクリング条件の指定とランの開始：
・7500Fastシステムのサーマルサイクリング条件の指定とランの開始：
・サンプルのセット方法：
・データ解析
・解析結果データのエクスポート
22
30
32
34
41
48
ガイドラインに基づいた反応条件(1)、（2）
50
機種別選択表
54
SDSシステムソフトウェア簡易操作ガイド(II)
55
Relative Quantification ～RQソフトウェアを用いた検量線を用いない相対定量～
・RQ Plateドキュメントの新規作成
・サーマルサイクリング条件の設定とランの開始
・Relative Quantification Study (RQ Study)ドキュメントを用いたデータ解析
・解析データの確認
・解析結果の出力
・比較CT法（∆∆CT法）とは
56
59
60
64
66
67
TaqMan® Probeを用いたSNPsタイピング
68
TaqMan® Probeを用いた＋ / －アッセイ
70
参考資料
71
71
75
・A　マスターミックスの調製
・B　TaqManⓇ
PCRの最適化
補足（異なるタイプのPPHを使用の場合）
i
79
DRAFT
- Real-Time 定量PCR -
PCR反応理論式
[DNA]n = [DNA]0 (1+e)n
[DNA]n : nサイクル目のPCRプロダクト量
[DNA]0 : ターゲットテンプレートの初期量
e : 平均PCR効率
n : サイクル数
PCR効率を100%と考えると、上の式 e = 1 となるので、
[DNA]n = [DNA]0 × 2n
となり、PCRプロダクトは 1サイクルごとに 2の乗数倍で増える。
２倍、４倍、８倍、１６倍、３２倍・・・・・・。
補助線（Threshold Line）と増幅曲線の交点をみると、2倍の初期濃度の差は、１サイクルの差になる
プロダクト量蛍(光量）（Log表示）
PCR
プラトー
Threshold Line
指数関数的
増幅領域
20
21
22
23
24
25
26
サイクル数
CT　(Threshold　Cycle）値
広い濃度範囲のサンプルを指数関数的領域で比較できるので、より正確な定量結果を得るこ
とができる
1
DRAFT
- Real-Time 定量PCR -
PCR（ポリメラーゼ連鎖反応）は
DNA鎖を複製する循環的な酵素反
標的配列分子を指数関数的に増幅
させることができます。その増幅
効率が100％、すなわち標的配列
分子が毎サイクルで2倍に増幅さ
れる場合、20サイクル後には標的
分子が100万倍に増幅されること
になります。しかし、実際のPCR
効率は100％でないため、増幅さ
PCR増幅曲線
PCRプロダクトの対数
応で、前のサイクルで複製された
プロダクトが連続するサイクルで
のテンプレートとして用いられま
す。それゆえにPCRは目的とする
サイクル後期
サイクル中期
サイクル初期
れるプロダクトは以下の式で表さ
れます。
サイクル数　出番は
まだ～？
[DNA] = [DNA]0 (1 + e)c
[DNA] : PCRプロダクト濃度
[DNA]0 : 標的テンプレートの初期濃度
e : 平均PCR効率
c : サイクル数
2
DRAFT
- Real-Time 定量PCR -
サイクル中期
プライマーダイマーを含めた非
特異的PCRプロダクトの生成を
抑制し、標的分子の特異的PCR
プロダクトを効率よく増幅させ
ることは反応条件の最適化で可
能です。一方、あるサイクル数
を過ぎると（一般的にPCRプロ
ダクトが10-8M濃度に達した時）
PCR効率はサイクル数の増加に
伴って低下し、指数関数的な増
幅から直線関数的な増加に変化
サイクル後期（プラトー）
します。
サイクル後期（プラトー）
ボクも
お願いネ!!
手がまわら
ないヨ～
じゃまだヨ～
切っちあゃうぞ
まだかな？
どいて!
プラトー効果を引き起こす要因には次の
また、プラトーに達するサイクル数は増幅さ
ようなものがあります。
れる対象となるDNA配列によって大きく異な
ります。増幅される配列における長さ（アン
・dNTPとプライマーの加水分解
プリコン）、GC含量、二次構造はずべてプラ
・DNAポリメラーゼの熱による失活
トー効果に寄与する重要な要因となります。
・一本鎖PCRフラグメントの再会合による
標的DNAの初期量または初期濃度も同様です。
プライマーアニーリング効率の低下
結局、プラトーに達するサイクル数は各標的
・PCRプロダクトの蓄積によるDNAポリ
配列毎に実験的に決定しなければなりません。
メラーゼの有効濃度の低下
このようにPCRを用いて標的配列分子の定量
・非特異的PCRプロダクトによる競合阻害
を行う場合は初期量とPCRプロダクト量との
・ピロフォスフェートのようなPCR阻害物
間に前式のような関係が成立する指数関数的
の蓄積
増幅領域での測定が前提条件となります（競
・DNAポリメラーゼの５‘－３’エキソ
合PCRは例外です）。
ヌクレアーゼ活性によるPCRプロダクト
の加水分解
3
DRAFT
蛍光5´ヌクレアーゼケミストリ（TaqMan® アッセイケミストリ）
TaqMan®プローブの構造は以下の通りになります。
Reporter
Quencher
R
Q
5‘
3‘
TaqMan®プローブは両末端を異なる蛍光でラベルした20～30塩基のオリゴヌクレオチ
ドで、ターゲット領域に特異的にハイブリダイズするように設計します。尚、
TaqMan®プローブの3‘末端はリン酸化し、プローブから伸長反応が起きないようにし
ます。
5‘末端にはFluoresceine系の蛍光色素（R:リポーター）、3’末端にはRhodamine系の蛍光
色素（Q:クエンチャー）をラベルします。
TaqMan®プローブが単体で存在しているとき、リポーターの励起光を照射するとリポー
ターの蛍光波長がクエンチャーの励起波長に近似しているため、リポーターの蛍光エ
ネルギーはクエンチャーの励起エネルギーとして使用され、クエンチャーが蛍光を発
します。このためTaqMan®プローブが単体で存在しているときにはリポーターの蛍光
が抑制されます。
リポーター蛍光＝クエンチャー励起光
（530-560nm 前後）
リポーター励起光　（488nm）
R
Q
クエンチャー蛍光
（580-620nm 前後）
注！最も一般的な「例」を示しています。機種により励起波長のフィルタリング等が異
なります
参考：改良タイプのTaqManⓇ MGBプローブに関しましては本補足説明資料69ページをご
参照下さい。
4
DRAFT
蛍光5´ヌクレアーゼケミストリ（TaqMan® アッセイケミストリ）
1. Polymerization
TaqMan®プローブの両端には、リポーター蛍光色素（R）とクエンチャー蛍光色素　（Q）がそれぞれ5´末端と3´末端に結合している
5´
3´
5´
FORWARD
PRIMER
R
PROBE
Q
3´
REVERSE
PRIMER
3´
5´
3´
2. Strand displacement
反応前のTaqMan®プローブは、リポーターから蛍光がクエンチ（消光）されている
R
Q
3´
5´
3´
5´
3´
5´
3´
3. Cleavage
各伸長サイクル中に、DNAポリメラーゼの5´-3´エキソヌクレアーゼ活性により
TaqMan®プローブが分解されリポーター蛍光色素が5´末端から遊離する
R
Q
5´
3´
5´
3´
3´
5´
3´
4. Polymerization completed
リポーター蛍光色素は、クエンチャー蛍光色素と距離が離れて蛍光を発する
Q
R
3´
5´
3´
5´
3´
5´
3´
5
DRAFT
SYBR® Green I Dye　アッセイケミストリ＊
1. Reaction setup
SYBR® Green I Dyeは、２本鎖DNAに結合することで強い蛍光を発する
2. Denaturation
DNAが１本鎖に変性する時、SYBR® Green I Dye はDNAから遊離し、蛍光は急激に減少する
3. Polymerization
伸長反応中、プライマーがアニーリングしPCR産物が産生される
FORWARD
PRIMER
REVERSE
PRIMER
4. Polymerization completed
伸長反応に伴い、 SYBR® Green I Dyeは２本鎖DNAに結合し再び蛍光を発する
増加した蛍光を7300/7500/7500Fast＊システムが検出する
＊7500Fastシステムにて行う時には「Standard
7500」もしくは「9600 Emulation」モードにて対応
6
DRAFT
SYBR® Green I Dye　アッセイケミストリ＊
蛍光強度
蛍光強度の変化量
-解離曲線によるPCRプロダクトの検証-
温度　℃
温度　℃
ターゲットのピーク
ターゲットのピーク
と
と
ターゲット以外のピーク
ターゲット以外のピーク
蛍光量の１次微分（変化量）
悪い例
再検討
ターゲットのみのピーク
ターゲットのみのピーク
良い例
温度　℃
＊7500Fastシステムにて行う時には「Standard
7500」もしくは「9600 Emulation」モードにて対応
7
DRAFT
7300/7500/7500Fastハードウェア
7300/7500/7500Fast各部の名称
電源スイッチ
インディケーター
サンプルトレー
96well Plate
＆
ドア
ハロゲンランプ
ファン
プレートホルダー
加熱カバー
ドア
サンプルブロック
8
DRAFT
7300/7500/7500Fastハードウェア
光源：ハロゲンタングステンランプ
7500/7500Fast
・FAM
・SYBR Green
・JOE
・VIC
・・TAMRA
NED
・・NED
CY-3
・・CY-3
・ROX
・TEXAS RED
7300　: Excitation Filter 1, Emission Filter 4
7500　: Excitation Filter 5, Emission Filter 5
7500Fast : Excitation Filter 5, Emission Filter 5
各フィルタを通して96Well全体のデータを取り込みます
9
・CY-5
DRAFT
7300/7500/7500Fastソフトウェア
Spectra
蛍光強度
各フィルタ（7500の例）
Component
蛍光強度
サイクル数
10
DRAFT
7300/7500/7500Fastソフトウェア
増幅曲線
Delta
Rn
サイクル数
検量線
CT
濃度
（増幅効率 e = 10(-1/検量線の傾き)－1）
11
DRAFT
7300/7500/7500Fastソフトウェア
解離曲線
蛍光量の一次微分（変化量）
温度（℃）
（SYBRアッセイのときのDerivative Data）
Report
12
DRAFT
7300/7500/7500Fast 使用注意事項
1) 付属品関係他
・RQソフト (7500/7500Fastは標準添付、7300はオプション（別売り）になります。)
⇒CDケースについている「Registration Code」は重要ですので大切に保管願います。
・Calibration試薬
⇒Calibration試薬は感光性です。
使用時以外は包装内に入れて冷凍保管願います。
保存期間は6ヶ月間が目安となっております。
機種ごと（7300/7500/7500Fast）試薬が異なりますので代用はできません
・予備ハロゲンランプ
⇒ABI PRISM®7000,GeneAmp®5700用とは違うタイプです。
御注文の際は 7500/7300専用 12V 75W ハロゲンランプP/N4345287となります。
・グリーンプレートとブラックプレート
⇒サービステスト用のプレートです。メンテナンス時にのみ使用します。
・Sampleのセット方法注）機種によって異なります！
⇒7300/7500システムの場合・・・以下の組み合わせでの使用が可能です
MicroAmp®Optical 96-Well Reaction Plate + MicroAmp®Optical Caps (Flat)
（PN N8010560）
（PN 4323032）
MicroAmp®Optical 96-Well Reaction Plate + ABI PRISM®Optical Adhesive Covers
（PN N8010560）
（PN 4311971）
0.2mL MicroAmp®Optical Tubes + MicroAmp®Optical Caps (Flat)
（PN N8010933）
（PN 4323032）
0.2mL ABI PRISM®Optical Tubes + MicroAmp®Optical Caps (Flat)
（PN 4316567）
（PN 4323032）
⇒7500Fastシステムの場合・・・以下の組み合わせでの使用が可能です
Optical 96-Well Fast Thermal Cycling Plate with Barcode (code 128) (PN 4346906)
+ ABI PRISM®Optical Adhesive Covers (PN 4311971)
13
DRAFT
7300/7500/7500Fast 使用注意事項
・使用プレート注）機種（システム）によって異なります！　⇒　7500Fastの場合・・・Fastプレート
7300/7500の場合・・・Standardプレート
標準反応ボリューム　20μL　標準反応ボリューム　50μL
7500Fast
7300/7500
・Compression Pad
⇒使用できません。使用するとデータに悪影響がでます。
・トレー＆リテーナー
⇒使用できません。使用すると機械トラブルが発生します。
・チューブ使用時の注意
⇒7300/7500システムでのみ使用できます。チューブ用PPHを使用して8連チューブの場合は
縦方向（A1→H1）、使用チューブが少数の場合はできるだけ中央付近にセットします。
・キャップ
⇒7300/7500システムでのみ使用できます。（本資料３４ページ参照）
14
DRAFT
7300/7500/7500Fast 使用注意事項
2) メンテナンス
奨励メンテナンス計画
本体とPCの
毎週
データの
バックアップ
毎月
Background
Calibration
(7500/7500Fast)
Optical
Calibration
HDの
ディフラグ
半年
ROI Calibration
Background
Calibration
(7500/7500Fast)
Optical
Calibration
PureDye
Calibration
必要に
応じて
サンプルブロック
清掃
ランプ交換
(2000h目安)
Function Test
Windows
Update*
電源再投入
*キャリブレーションに使用するキットは機器によって専用のものとなります。
*Windows Updateに関しましては弊社よりご案内させていただいた場合にのみ行います。
・シャットダウン方法
⇒短期（一週間程度）の場合は使用プレートを取り外し、7300/7500/7500Fast本体→
PC(コンピュータ)の順番で電源を切ります。
⇒長期（一週間以上）の場合はシッピング用または未使用空プレートを入れて、
7300/7500/7500Fast本体→ PC(コンピュータ)の順番で電源を切ります。
・Function Test　⇒必要に応じて装置のご使用の前に実施し、正常動作を確認してください。
「装置およびメンテナンス」ガイドを参照願います。
「New plate Document」→「Instrument」
・Background Calibration
⇒１ヵ月毎のRe Calibrationを奨励。
「装置およびメンテナンス」ガイドを参照願います。
Max ピーク72,000以下であること確認してください。
Max ピーク72,000を超えた場合はサンプルブロックを清掃後、再度ご確認
願います。
・ハードディスクのディフラグ
⇒必要に応じて（フラグメンテーション20％に達する前に実施）
1ヶ月毎に実施を奨励。
「装置およびメンテナンス」ガイドを参照願います。
15
DRAFT
7300/7500/7500Fast 使用注意事項
・Optical Calibration (for the 7500/7500Fast)
⇒Background Calibrationを実施毎にOptical Calibrationを実施してください。
「装置およびメンテナンス」ガイドを参照願います。
・ROI Calibration
⇒６ヵ月毎のRe Calibrationを奨励。
ROI Calibration実施後には必ずBackground Calibrationを実施してください。
「装置およびメンテナンス」ガイドを参照願います。
・Pure Dye Calibration
⇒６ヵ月毎のRe Calibrationを奨励。
Pure Dye Calibration前には必ずBackground Calibrationを実施してください。
「装置およびメンテナンス」ガイドを参照願います。
・サンプルブロックの清掃
⇒Background Runにて確認し、必要に応じて実施します。
「装置およびメンテナンス」ガイドを参照願います。
通常はH2Oで清掃、除去しきれない場合は95%エタノールで清掃、それでも除去しきれない場合
は、10%次亜塩素酸ナトリウム溶液を使用して下さい（キッチンハイター等界面活性剤入り漂白
剤は厳禁）。それぞれの作業ごとにBackground Runにて確認して除去できたかどうかを判断して
下さい。95%エタノール、10%次亜塩素酸ナトリウム溶液を使用したときには必ず最後にH2Oで
リンスを行います。
ご注意：PCRブロックにアクセスするために器械内部の加熱カバードア（p8・下図参照）を奥
にスライドさせますが、作業が終わりましたら必ず元の位置（手前）に引き戻して下さい。加
熱カバードアがきちんと手前に戻っていませんと、エラーメッセージが出てランを開始できま
せん。
加熱カバードア
16
DRAFT
7300/7500/7500Fast 使用注意事項
・ハロゲンランプの交換
⇒ランプの使用時間、コンディションをInstrumentメニューからチェックでき
ますが、切れていなくても2000hを超えた場合は交換を奨励します。
「装置およびメンテナンス」ガイドを参照願います。
⇒新しいランプに交換後、以下のキャリブレーションランを行うことを推奨します。
ROI Calibration
Background Calibration
Optical Calibration （7500/7500Fastシステムのみ）
Pure Dye Calibration
・移設後セットアップ
⇒「装置およびメンテナンス」ガイドを参照願います。
RNase P プレートでテストランを実施、Passすれば使用可能です。
Failの場合は下記のCalibration を順番に実施。
ROI Calibration
Background Calibration
Optical Calibration （7500/7500Fastシステムのみ）
Pure Dye Calibration
注意！ 7500Fastシステム用のRNase P プレートは7300/7500システムには使用できません。
また、7300/7500システム用のRNase P プレートは7500Fastシステムでは使用できません。
・反応プレートのセット
⇒ウェルの底に残った空気の泡はもちろん、反応ボリュームが非常に少ない場合、ウェル壁
面に残っている反応液は定量結果に大きな影響を与えます。アプライドバイオシステムズで
は適正な遠心操作を行いウェルの底部分に全ての反応液が位置している状態（正しい位置）
でのPCR（ラン）を推奨いたします。下図参照（特に7500Fastシステムでは注意）
正しい位置
反応液がウェルの底
に正しく位置している
間違った位置
遠心処理を行ってい
ないため反応液がウェ
ルの壁面に偏って位
置している
17
十分な遠心力と時間で
ないため空気の泡がウェ
ルの底に位置している
DRAFT
Precision Plate Holderのセットに関する注意事項（7300/7500のみ）
新・旧タイプの互換性はありません
7300/7500 Real-Time PCR Systemでは以下に示すように、96Well Pate使用時に用いるPPH
(Precision Plate Holder）と0.2mLチューブ使用時に用いるPPH がそれぞれあります。目的にあ
わせてPPHを選択してから96Well PlateもしくはTubeをセットします。
PPH for 96 well Plate
96 Well プレートの場合に使用します（専用）。
チューブ使用の場合は下記参照。
刻印
FOR USE WITH 96 WELL
PLATES ONLY
PPH for Tubes
0.2mLの8連チューブもしくは0.2mLの単独チュー
ブの場合に使用します（専用）。
8連チューブ用場合は縦方向（A1→H1）
の溝に沿ってセットします。
刻印
FOR USE WITH 8-STRIP &
INDIVIDUAL TUBES ONLY
PPHの裏側にありますピンの位置（2箇所）を合
わせて機器にセットします。（上下/左右/天地
が逆転しないようになっています。）
注意！現状では7500 Fastシステムではチューブによるランには対応していませんので、
PHHは96Well Plate（Fast専用）用のもののみが付属します。
18
DRAFT
7300/7500/7500Fast Real-Time PCR System　使用フロー
PC（コンピュータ）と7300/7500/7500Fast本体との正常なコミュニケーションをはかるた
めに、以下の手順でのご使用をお願い致します。
- 機器のセットアップ 1. 最初にPC（コンピュータ）を立ち上げる
→WindowsのDesktop画面になるのを確認
2. 7300/7500/7500Fast本体の右側にある電源スイッチを押す
→左側のステータスライトが緑色のPOWER 表示となるのを確認
3. PCのDesktop上、7500/7300/7500Fast System Softwareショートカットアイコンを
ダブルクリックしてソフトウェアを立ち上げる
- Plateドキュメントの作成 1. FileメニューからNewを選択し、目的に合わせてAssayを選択
2. Detector、Task等の設定
3. Thermal Cycler　プロトコールの確認（変更）、（ランモードの確認）
4. ラン用SDSファイル形式(.sds)での保存
（必要に応じてテンプレート形式(.sdt)で保存）
- ランの開始～ランの終了～DATA解析 1. Sampleが分注されたPlateもしくはチューブ＊を本体にセット
2. Startボタンをクリックしてランを開始
→残り時間表示の確認
→本体左側のステータスライトが黄色のIN USE点滅表示となるのを確認
3. 必要ならばExtend機能の使用
4. The run completed successfullyウィンドウが表示されてランの終了
5.　DATA解析（Auto CT or Manual）、DATAのExport（カンマ区切りファイル）
- シャットダウン 1. 7300/7500/7500Fast System Softwareの終了
2. 7300/7500/7500Fast本体の電源スイッチを押してOFF
3. PCのシャットダウン
＊
96Well用PPH、チューブ用PPHを選択、チューブは7300/7500システムのみ対応
19
DRAFT
反応試薬の選択（推奨条件）
TaqMan®アッセイケミストリ
定量PCR法のPCRステップでは、TaqMan® Universal PCR Master Mixシリーズ試薬を使って
cDNAを増幅します。
・7300/7500システムでは通常のTaqMan® Universal PCR Master Mix (2X)を使用して約1時間40分
のランを行います。
・7500Fastシステムをご使用の場合にはランモードに合わせて通常のTaqMan® Universal PCR Master Mix (2X) を用いての約1時間40分のラン（「Standard 7500」モードもしくは「9600 Emulation」モード）か、TaqMan® Fast Universal PCR Master Mix (2X), No AmpErase UNG　を使用して約40分のラン（「Fast 7500」モード）を選択して行うことができます。これらの
反応試薬とランモードの組み合わせ以外の反応におけるパフォーマンスの確認は行ってお　りません。Fastマスターミックスについては『TaqMan® Fast Universal PCR Master Mix Protocol
（PN4351891）』をご参照ください。
重要！TaqMan® Fast Universal PCR Master Mix (2X), No AmpEraseⓇ UNGを使用する場合、2時間
以内にプレートの調整を行って2時間以内にランを開始するようにして下さい。プレート調製
終了から2時間以内にランを開始できない（調製開始から4時間以内）場合は、7500Fastにてラ
ンが開始できる状態になるまで冷蔵もしくは冷凍して保存して下さい。室温での放置は避けて
下さい。
SYBR® Green I アッセイケミストリ
定量PCR法のPCRステップでは、SYBR® Green PCR Master Mix試薬を使ってcDNAを増幅します。
・7300/7500システムではSYBR® Green PCR Master Mix (2X)を使用してランを行います。
・7500Fastシステムをご使用の場合には「Standard 7500」モードもしくは「9600 Emulation」モー
ド）のランモードでSYBR® Green PCR Master Mix (2X) を用いてランを行います。
重要！7500Fastシステムの「Fast 7500」ランモードに対応したSYBR® Green I アッセイケミスト
リ用の反応試薬は現在（04/2005）扱っておりません。
20
DRAFT
SDSシステムソフトウェア簡易操作ガイド(I)
Absolute Quantification
～検量線を用いた定量法～
21
DRAFT
コンピューターを起動後、7300/7500/7500Fast本体の電源を入れます。
新規プレートドキュメントの作成：
１．
デスクトップ上の[7300/7500/7500Fast
SDS Software] を、起動します。
２． File メニューより、Newを選択します。
３． [New Document Wizard]が表示されます。
４
５
４． Assay: のドロップダウンリストよりAbsolute Quantification (Standard Curve)を選択します。
５．
Next をクリックします。
６．　過去に作成したDetectorの一覧が表示されます。Detectorは反応系（プライマーセット）毎に作成・
設定を行います。使用したいDetectorを選択し、Addをクリックして右側のDetectors in Documentに
呼び出します。Next をクリックします。
Detectorを選択
Add
Detectors in Document
Nextをクリック
新規の反応系の場合はNew Detectorのボタンをクリックします。
22
DRAFT
７． New Detectorの設定
a) Nameにはターゲットとする遺伝子名を入力します。
a
b
c
b) Reporter Dyeでは検出する蛍光色素を選択します。
Quencher DyeはTaqManプローブの場合は“TAMRA”、TaqMan MGBプローブ及び
SYBR Greenアッセイの時には“(none)”を選択します。
c） Colorのボックスをクリックすると色の選択画面が表示されます。同一プレート上に設定する
Detectorはそれぞれ別の色を選択していただくとDetectorの設定がわかりやすくなります。
入力が完了したらOKボタンをクリックします。
続けて別のDetectorを作成するときはCreate Anotherボタンをクリックします
23
DRAFT
8.
各ウェルにDetectorとTaskを指定します。
a)
同じ反応系で使用するウェルを選択します。
b)
Detector名を確認し、
c)
Useにチェックを入れます。反応系が複数ある場合はa）から繰り返します
d)
Taskを選びます。
Unknown : 定量を行いたいサンプル
Standard : 検量線をかく為のサンプル
NTC
e)
: 鋳型を含まない反応ウェル　Standard :各希釈系列サンプルの濃度（コピー数など）もしくは希釈の相対値（例えば　10,000 をスタートとして１/10倍希釈なら10,000、1,000、100、10・・・・)を対応す
るQuantityの欄に入力します。（単位は入力しません）
8e
8d
8a
8c
9.
8b
9
Finishをクリックします。　ソフトウェアと機器との接続が開始し、プレートドキュメントが作成されます。
10. ウェルを選択し、サンプル名をタイピングしますと直接入力されます。（Ctrlキーを押しながら
クリックすると複数のウェルを同時に選択でき、一度に入力できます。）
同じサンプル名を入力すると、ディテク
タごとにレプリケートとして認識されて、
平均値、標準偏差値が計算されます。
１１．　設定の変更はWell Inspectorを用いて行います。
これまで説明してきましたNew Document Wizardは、New Document作成のためにWell Inspectorを簡略化した機能で、プレートドキュメントの作成が完了するとWizardに戻ることは
できません。このため、「プレートドキュメントの修正・追加など」はWell Inspectorを使用して
「Detectorの作成・削除など」はDetector Managerを使用して行います。
24
DRAFT
Well InspectorとDetector Manager
Well Inspectorの使用方法
Viewのメニューから、もしくはツールバー内の向かって右側のルーペ付きのアイコンをクリックすると
Well Inspectorが表示されます。
同一のサンプルが入っているウェル毎にSample Nameを入力します。
ソフトウェアは解析時Detector毎に、同一のSample Nameの入ったウェルの平均値と標準偏差を
自動算出します。
Well Inspectorを使用したSample Nameの入力
25
DRAFT
Well InspectorとDetector Manager
Well Inspectorの使用方法
Well Inspector画面上ではNew Document Wizardで行った全ての設定・指定を変更することができます。
Well毎のDetectorの指定・変更を行うことができます。
初期濃度の入力・変更ができます。
Taskの指定・変更ができます。
このボタンをクリックするとDetector Manager（page 27）が表示されます。Detector Manager上
でDetectorの追加を行うことができます。
26
DRAFT
Well InspectorとDetector Manager
Detector Managerの使用方法
Detector Managerには、それまでに作成した全てのDetectorがリスト表示されます。
または、Toolsのメニューから、もしくはツールバー内の　アイコンをクリックするとDetector
Managerが表示されます。
使用したいDetectorを検索するために使用します。
メニュー名をクリックするとソートが
かかります。
リスト上で使用するDetectorを選択してからこのボタンをクリック
すると、Well Inspectorに選択したDetectorがコピーされます。
後からDetectorを追加する時にご利用下さい。
Fileをクリックして表示されるプルダウンメニューから、新規のDetectorを作
成したり、不要なDetectorを削除することができます。
27
DRAFT
Well InspectorとDetector Manager
Well Inspectorの使用方法
Detectorの変更例
Detector Manager上で使用するDetectorをクリックしてハイライトで選択されていることを
確認したら、“Add To Plate Document”ボタンをクリックします。
確認画面が表示されるので“OK”ボタンをクリックするとWell Inspector上に選択したDetectorが
登録されます。
使用するDetectorが全てWell Inspectorに表示されていることを確認したらDoneボタンをクリックして
Detector Managerを閉じます。
28
DRAFT
Well InspectorとDetector Manager
Well Inspectorの使用方法
Detectorの変更例続き
変更するウェルを選択します。
Useチェックボックスで、使用しないDetectorのUseのチェックをはずし、使用するDetectorのUseに
チェックを入れます。
設定変更後Taskが全てUnknownに変更になるので、Task及びQuantityの再設定を行います
（Sample Nameは残ったままです）。
29
DRAFT
7300/7500システムでのサーマルサイクリング条件の指定とランの開始：　I
１． [Instrument] タブをクリックします。
１
１１
Start
１２
Extend
７
６
４
３
Addボタン
２
５
６
２．
ランモードの選択をします。
7300システムでは「Standard 7300」モードのみの固定となります。
7500システムの場合は通常は「Standard 7500」モードを選択します。7700システム・
5700システムから反応系を移行する場合や、7000システム・7900システム・7500システ
ムにて「 9600 Emulation」モードでの反応系を既に構築されている場合は「9600
Emulation」モードをプルダウンメニューから選択します。
３．
標準的なPCR 条件がデフォルトで表示されます｡　各ステージの上が温度、下が時間です。
必要に応じて、温度や時間を変更します。また、Addボタンを利用して、Cycle、holdや
stepを追加することも可能です。
４．
SYBR® Green I ケミストリを使っている場合に解離温度を決定するプログラムを付け加え
るには、［Add Dissociation Stage］をクリックします。
５．
実際に分注されているサンプル量［Sample Volume］を入力します。
６．
Dataを取り込むStepをプルダウンメニューから選択できます。
選択できるのは１つのStepのみで、一般的にCycling Stageの最終Step（Extension）を選択
します。選択されたStepはベージュ色に識別されます。また、Dataを取り込むために必要
な時間は、7300で31sec.以上、7500で35sec.以上となっています（ソフトウェアのバージ
ョンにより異なります。SDS ソフトウェア ver.1.2.Xの場合の時間です）。
７．
Ramp Rateは7300システムの「Standard 7300」、7500システムの「9600 Emulation」では
固定となりますので変更できません。
30
DRAFT
7300/7500システムでのサーマルサイクリング条件の指定とランの開始：　I
８．
［File］メニューより［Save As］を選び、プレートドキュメントの名前（ファイル名）
をタイプ入力してから、［Save］をクリックして保存します。保存場所は自由に設定す
ることができますが、PCへの負担を考慮して可能な限りD:ドライブ上への保存を推奨し
ます。
９．
ランをするために必要な保存形式は拡張子.sdsとなります。また、テンプレートとして
保存する場合は拡張子.sdtを選択して保存します。テンプレートは必ずランを行う前の
Plate Documentから作成して下さい（ラン後の.sdsファイルからテンプレートファイル
.sdtを作成した場合は不完全なファイルとなり、ランが正常に行われませんのでご注意
ください）。
１０．
プレートを装置にセットします。次項を参照してください。
１１．
［Start］をクリックします。
１２．
ラン中にサイクリングステージを追加したい場合には[Extend]をクリックします。
[Extend PCR Cycles]ウィンドウが開きますので、追加したいサイクル数を入力してOK
をクリックします。コメントが必要な場合はコメントボックスに書き入れます。1～20
サイクルを追加できます。
注意！Extend 機能は最初に設定されたサイクル数の最後の2サイクルの間は使用できま
せん。サイクルの追加が必要な場合はそれ以前にExtend機能を使用してください。
例）最初に40サイクルと設定してランをスタートさせた場合38サイクル目まではExtend
機能を使用できますが、39サイクル以降になりますと機能しません。
注意！Extend 機能は１回のランニングプログラムの間で１回のみご使用いただけます。
31
DRAFT
7500Fastシステムでのサーマルサイクリング条件の指定とランの開始：　I
１． [Instrument] タブをクリックします。
１
Start
１２
１１
Extend
７
４
６
３
Addボタン
２
５
６
２．ランモードの選択をします。7500Fastシステムでは「Fast 7500」、「Standard 7500」、
「9600 Emulation」のランモードから選択できます。「Fast 7500」モードはTaqMan® Fast
Universal PCR Master Mix (2X), No AmpEraseⓇ UNGを使用する反応を行う場合に選択しま
す。従来のTaqMan® Universal PCR Master Mix (2X) やSYBR® Green PCR Master Mix (2X) な
ど、Fast PCRでの反応系に対応していない試薬を使用する場合には「Standard 7500」、
「9600 Emulation」のランモードから選択します。これらの反応実験の場合は通常「
Standard 7500」モードを選択します。7700システム・5700システムから反応系を移行す
る場合や7000システム・7900システム・7500システムにて「9600 Emulation」モードで反
応系を既に構築されている場合は「9600 Emulation」モードをプルダウンメニューから選
択します。
参照：7500Fastシステムにおける「Standard 7500」、「9600 Emulation」のランモードは
忠実にPCRブロックの温度コントロールを行っておりますが、反応ボリュームの違い（標
準反応ボリュームが50μLから20μLとなります）などから、既存の反応系の移行には、
反応系によって系の再構築が必要となる場合があります。
３．
標準的なFast PCR の条件がデフォルトで表示されています｡各ステージの上側の数値が温度、
下側の数値が時間を示していますので、必要に応じて、温度や時間を変更します。また、
Addボタンを利用して、Cycle、holdやstepを追加することも可能です。
４．
SYBR® Green I ケミストリを使っている場合に解離温度を決定するプログラムを付け加える
には、［Add Dissociation Stage］をクリックします。
注意！SYBR® Green I ケミストリは「Standard 7500」、「9600 Emulation」のランモー
ドにて対応します。
５．
実際に分注されているサンプル量［Sample Volume］を入力します。
32
DRAFT
7500Fastシステムでのサーマルサイクリング条件の指定とランの開始：　II
６．
Dataを取り込むStepをプルダウンメニューから選択できます。
選択できるのは１つのStepのみで、一般的にCycling Stageの最終Stepを選択します。
選択されたStepはベージュ色に識別されます。また、「Fast 7500」モードの場合Dataを取り
込むために必要な時間は24sec.以上、「Standard 7500」、「9600 Emulation」モードの場合
Dataを取り込むために必要な時間は31sec.以上となっています。
７．
Ramp Rateは7500Fastシステムの「Fast 7500」、「9600 Emulation」では固定となりますので
変更できません
８．
［File］メニューより［Save As］を選び、プレートドキュメントの名前（ファイル名）をタ
イプ入力してから、［Save］をクリックして保存します。保存場所は自由に設定することが
できますが、PCへの負担を考慮して可能な限りD:ドライブ上への保存を推奨します。
９．
ランをするために必要な保存形式は拡張子.sdsとなります。また、テンプレートとして保存
する場合は拡張子.sdtを選択して保存します。テンプレートは必ずランを行う前のPlate
Documentから作成して下さい（ラン後の.sdsファイルからテンプレートファイル.sdtを作成
した場合は不完全なファイルとなり、ランが正常に行われませんのでご注意ください）。
１０．
プレートを装置にセットします。次項を参照してください。
１１．
［Start］をクリックします。
１２．
ラン中にサイクリングステージを追加したい場合には[Extend]をクリックします。
[Extend PCR Cycles]ウィンドウが開きますので、追加したいサイクル数を入力してOKをク
リックします。コメントが必要な場合はコメントボックスに書き入れます。1～20サイクル
を追加できます。
注意！Extend機能は最初に設定されたサイクル数の最後の2サイクルの間は使用できません
。サイクルの追加が必要な場合はそれ以前にExtend機能を使用してください。
例）最初に40サイクルと設定してランをスタートさせた場合38サイクル目まではExtend機能
を使用できますが、39サイクル以降になりますと機能しません。
注意！Extend機能は１回のランニングプログラムの間で１回のみご使用いただけます。
33
DRAFT
サンプルのセット方法：
7300/7500システムのみ
１、96 well Plate　と　キャップ　(7500Fastシステムでは使用できません）
MicroAmp® Optical Cap, 8caps/strip
(Flat)
PN 4316567
注！キャップは必ずFlatである必要があります。
MicroAmp® Optical 96-Well Reaction
Plate
PN N801-0560
Splash Free Support Base (PN 4312063)
（安定したサンプル調整作業のサポートと
Well 底面の汚れの防止に役立ちます）
２、Tube　と　キャップ　(7500Fastシステムでは使用できません）
MicroAmp® Optical Caps (Flat) (PN/4323032)
注！キャップは必ずFlatである必要があります。
0.2mL MicroAmp® Optical Tubes (PN/N8010933 )
0.2mL ABI PRISM® Optical Tubes (PN/4316567)
チューブ用
PPH（Precision Plate Holder）
注意！8連チューブの場合必ず縦方向（A1→H1）
にセットします。また、チューブの数が少ない
場合、中央付近にセットすることを推奨します。
34
DRAFT
３、 96 well Plate とAdhesive Cover （シール）7300/7500/7500Fastシステム）
ABI PRISM® Optical Adhesive Cover を使用するには
MicroAmp® Optical 96-Well Reaction Plate を使用する場合 MicroAmp® Optical Caps の代りに
ABI PRISM® Optical Adhesive Cover を使用することができます。7500Fastシステムの場合は
Optical 96-Well Fast Thermal Cycling Plate with Barcode (code 128) とABI PRISM® Optical
Adhesive Coverを使用して下さい。
MicroAmpⓇ Optical 96Well Reaction PlateをSplash Free Support Baseに
セットし、Setup画面で行った設定の通りにサンプルを分注します。
注意！下記参照
ABI PRISMⓇ Optical Adhesive Coverを一枚取り出し、裏側を上に向け
ます（光を反射しない方が裏側です）。
一番端の切り取り線に沿って折り曲げます。
Optical Adhesive
Cover
切り取り線
中央の白いシールの背表紙をめくります。このとき指でシールの中
央部分を触らないようにご注意ください。
MicroAmpⓇ optical 96well Reaction Plate注意！上にABI PRISMⓇ Optical
Adhesive Coverをゆっくりと載せます。両端のタブの部分のみを手
で取り扱うようにします。
注意！7500Fastシステムの場合はOptical 96-Well Fast Thermal Cycling Plate with Barcode (code 128) を使用
35
DRAFT
ABI PRISM® Optical Adhesive Cover を使用するには：
Applicatorを用いてABI PRISMⓇ Optical Adhesive Coverの上を丁
寧になぞり、CoverとPlateの96wellの縁部分を密着させます。
P37～参照
Applicator
Applicatorの端でCoverの端を押さえ、タブのほぼ中央を持って軽
く引いてタブを切り離します。同じようにもう一方のタブも切り
離します。
注記　タブの上端または下端を持って引くとABI PRISMⓇ Optical
Adhesive Coverから糸のようなものが伸びることがあります。
引っ張って
切り離しま
す
Coverをより密着させるために、再度Applicatorｗｐ用いてABI PRISMⓇ
強く何回かこすります。
Optical Adhesive Coverの上を下方向に力を加えながら何回かこすります。
注意！7500Fastシステムの場合はOptical 96-Well Fast Thermal Cycling Plate with Barcode (code 128) を使用
注意！Step 8の操作の後、さらにプレートとCoverを密着させるために「Applicatorの角」を使用して下
図A のように96ウェルの外側に沿った４方向を線状にこすりつけプレートに密着する部分の端が浮か
ないようにします（必ず行ってください）。場合によっては下図Bの様に全てのウェル間の縦横方向を
線状にこすりつけてさらに密着させます。（p37～参照）
A
B
36
DRAFT
ABI PRISM® Optical Adhesive Cover を使用するには：
①
Wellの上面が完全にシールされるように、アプリケーターの平らになったへり
（縁）でプレートの長辺方向に沿って下方向へしっかりと押し付けながら何回
かこすって往復させます。
ノート：押し付ける力はOptical Coverの粘着性を持たせるために必要です。
重要：必ずプレートをSplash Free Support Base (PN 4312063)に設置して作業を
行ってください。
37
DRAFT
ABI PRISM® Optical Adhesive Cover を使用するには：
②
Wellの上面が完全にシールされるように、アプリケーターの平らになったへり
（縁）でプレートの短辺方向に沿って下方向へしっかりと押し付けながら何回
かこすって往復させます。
ノート：押し付ける力はOptical Coverの粘着性を持たせるために必要です。
重要：必ずプレートをSplash Free Support Base (PN 4312063)に設置して作業を
行ってください。
38
DRAFT
ABI PRISM® Optical Adhesive Cover を使用するには：
③
Wellの外周囲が完全にシールされるように、アプリケーターの端の部分でプ
レートの縁の外周囲全てを、しかも、下方向へしっかりと押し付けながらこ
すって密着させます。
ノート：押し付ける力はOptical Coverの粘着性を持たせるために必要です。
重要：必ずプレートをSplash Free Support Base (PN 4312063)に設置して作業を
行ってください。
39
DRAFT
ABI PRISM® Optical Adhesive Cover を使用するには：
④
以上の作業で密着効果が得られない場合、アプリケーターの端の部分を使って
全てのWell間を縦横に筋を入れるようにして押し付けながらこすって、さらに
密着度を高めます。
（36 ページ　B 図　参照）
ノート：押し付ける力はOptical Coverの粘着性を持たせるために必要です。
重要：必ずプレートをSplash Free Support Base (PN 4312063)に設置して作業を
行ってください。
ノート：この作業ではWell間に筋が入るだけでPlateにはくっつきませんが、各
Wellの上面の縁での密着効果は上がります。
40
DRAFT
データ解析：　ランの終了後、プレートドキュメントの設定を変更して再解析することができます。
解析する前に、解析のパラメータ値を指定します。ベースラインとスレッショルドの設定には
、「自動ベースライン／スレッショルド機能（Auto Ct）」と「ベースラインとスレッショルド
の手動決定」の機能があります。
解析設定の指定：Auto Ct機能の使い方：
１．
をクリックするか、［Analysis］メニューより［Analysis Settings］を選びます。
2
3
２．
［Detector］ドロップダウンリストで［All］を選び、[Auto Ct]を選びます。 SDSソフトウェ
アが各ウェルのベースラインとスレッショルドを自動的に決定します。
３．
[OK & Reanalyze]をクリックするか、[OK]して
４．
増幅プロットを検証し、必要に応じてベースラインとスレッショルドを手動で調整します。
ボタンをクリックし解析します。
Analysis Settingsは、上記の通りAnalysisメニューから呼び出して表示する方法と、Amplification Plot
画面の右側にも組み込まれていますので、どちらかを使用して設定を行います。
Detectorごと設定・解析（Manualの場合）
Analysis Settings
41
DRAFT
増幅プロットの検証：
１．
[Results]タブの［Amplification　Plot］タブをクリックし、増幅曲線を表示します。
1
３
５
４
指数関数的増幅領域
６
ベースライ
ン
２
２．全てのウェルを選択します。（選択しないと、プロットは空白のまま表示されません。）
３．［Detector］ドロップダウンリストでDetectorを選びます。選択されたDetectorとウェルの
グラフを表示します。
４．指数関数的領域が直線的に増幅していることを確認します。
５． Threshold Lineが直線的増幅領域の中に設定されていることを確認します。
ベースラインとスレッショルドの手動調整：
６． Detectorのベースラインとスレッショルドを設定します。
［Analysis Settings］で、［Manual Baseline］を選びます。
増幅曲線の増加が［End Cycle］値以降のサイクルで始まるように、［Start (cycle)］と［
End(cycle)］のフィールドに数値を入力します。
［Analysis Settings］で、［Manual Ct］を選びます。
スレッショルドラインが指数関数的増幅領域位置になるように、スレッショルドバーを
調整します
７． [Analyze]ボタンをクリックして再解析します。
８．ステップ３～７を繰り返して、残りすべてのDetectorのベースラインとスレッショルドを
設定します。
注：ベースラインとスレッショルドを手動で調整する場合は、必ずDetectorごと（遺伝子ごと）
に設定・解析します。
42
DRAFT
―ベースラインの設定―　[正しく設定されたベースライン]
増幅曲線がベースラインのEnd
Cycleを越えてから始まっており、
調整の必要はありません。
[早すぎるベースライン]
ベースラインのEnd Cycleを右に大
幅に越えてから増幅曲線が始まっ
ているので、End Cycle 値を
増やす必要があります。
[遅すぎるベースライン]
増幅曲線がベースラインのEnd
Cycle以前に始まっているので、
End Cycle 値を減らす必要が
あります。
43
DRAFT
―スレッショルドラインの設定―
[正しく設定されたスレッショルド]
設定されたスレッショルドは、増幅曲線
の指数関数的増幅領域内にあります。
スレッショルドが最適値を上回ったり下
回って設定されると、レプリケートの標
準偏差が増加します。
[低すぎるスレッショルド]
設定されたスレッショルドは、増幅曲線
の指数関数的増幅領域内より低い領域に
Move up
あります。
この場合、スレッショルドが正しく設定
された場合のプロットよりも、はるかに
大きな標準偏差が生じます。
スレッショルドバーを増幅曲線の指数関
数的増幅領域内に引き上げてください。
[高すぎるスレッショルド]
設定されたスレッショルドは、指数関数
的増幅領域内より高い領域にあります。
Move down
この場合、スレッショルドが正しく設定
された場合のプロットよりも、はるか
に大きな標準偏差が生じます。
スレッショルドバーを増幅曲線の指数関
数的増幅領域内に下げてください。
44
DRAFT
結果の表示：結果は各タブで見ることができます。
Standard Curve (標準曲線)：　このプロットには、standardとして指定されたサンプルのCt
値から標準曲線が表示されます。この標準曲線からの数値を使い、未知のサンプルの量を計算
します。［Detector］で選択した結果の検量線を表示します。（SlopeやR2が表示されます）
Dissociation (解離曲線)：　このプロットにはSYBR® Green Iを使った変性（Tm）曲線データが
表示されます。［Instrument］タブで［Dissociation Protocol］が選択されていた場合。
［Detector］で選択した結果の解離曲線を表示します。Tm値は次のＲｅｐｏｒｔ画面などで確
認できます。
Report (レポート)：　選択されたウェルのデータが表形式で表示されます。 AQアッセイでは、
次のデータ欄が表示されます。 Well、Sample Name、Detector、Task、Ct、Std.Dev. Ct、Qty、
Mean Qty.、Std.Dev. Qty.、Ｔｍ。［Qty.］欄の数値は、各Detectorの標準曲線からの値を使っ
て計算されます。
45
DRAFT
サンプルの削除：1
実験中のエラーにより、不充分にしか、まは
全く増幅されないウェルが発生する可能性が
域外値
あります。通常これらのウェルからは、関連
付けられた反復ウェルの平均値から大幅に
逸脱するCt値が生じます。
これら異常なデータ（域外値）が計算に含ま
れると、誤った測定値が生まれます。
精密な定量を得るために、反復グループに域
外値が無いことを慎重に確認してください。
Ct vs. Well Position Amplification プロットを
使うと、手動で域外値を削除できます。
プロットに
示された域
外値
域外値の削除：
[Omit Well]
チェック
ボックスを
選択します。
１．［Amplification Plot］タブを選択します。
2. ［Data］ドロップダウンリストで［Ct vs.
削除された
ウェルには
×マークが
つきます。
Well Position］を選びます。
3. 検証するウェルを選択し、Ct 値の集まりを
比較して、反復集団が均等であることを確認
削除された域外値
します。
4. 域外値がある場合、
［View］>［Well Inspector］を選んでから、
該当するウェルの［Omit］チェックボック
スを選択します。
５．　をクリックするか、［Analysis］>
［Analyze］を選択して、異常データの無い状
態でランを再解析します。
6. 他のウェルを検証するには、ステップ3～5
を繰り返します。
46
DRAFT
サンプルの削除：2
域外値の削除：
１．［Amplification Plot］タブを選択します。
2. マウスのカーソルを削除したいサンプルの増幅曲線に合わせますとウェルポジション、
サンプル名、ディテクタ名、タスクが表示されます。
3 hr.
β2
3 hr.
β2
3. 該当するウェルを増幅曲線グラフ下の96ウェル表にて選択します。
4. ［Analysis］>［Omit Well］を選択しますと対象の
ウェルに×が表示されます。
５．　をクリックするか、［Analysis］>［Analyze］
を選択して、異常データの無い状態でランを再
解析します。
6. 他のウェルを検証するには、ステップ2～5を
繰り返します。
47
DRAFT
解析結果データのエクスポート：
AQプレートからの数値データはテキストファイルにエクスポートしてから、Microsoft® Excel®など
の表計算
アプリケーションにインポートできます。
•Sample Setup (*.txt)
•Calibration Data (*.csv)
•Spectra (*.csv)
•Component (*.csv)
•Delta Rn (*.csv)
•Ct (*.csv)
•Dissociation (*.csv)
•Results (*.csv)
Reportをエクスポートする場合
１．［File］メニューから［Export］を選んでから、[Results]を選びます。
２．エクスポートファイルの保存場所を決め（Ｄ：ドライブ推奨）、ファイル名を入力します。
３．［Save］クリックします。
注：Windows XPの場合、Desktopにファイルを保存できません。D:ドライブにフォルダを作成して
保存することを推奨いたします。どうしても Desktopに保存されたい場合は、D:ドライブに作成した
フォルダのショートカットアイコンをDesktop上に置いておくと良いでしょう。
48
DRAFT
付録　Excel®を用いて解析：
１．エクセルを起動し、エクスポートデータを開く。
２．サンプルごとのデータを、選び出す。
３． Target遺伝子の結果を内在性コントロール遺伝子の結果で除する。
この後、更にキャリブレーターを設定する
この後、更にキャリブレーターを設定する
場合（キャリブレーターとするサンプルを
場合（キャリブレーターとするサンプルを
１とした時に、他のサンプルは・・・とい
１とした時に、他のサンプルは・・・とい
った場合）には、これらの値をキャリブレ
った場合）には、これらの値をキャリブレ
ーターの値でさらに除する。
ーターの値でさらに除する。
４．エクセル､グラフウィザードを用いてグラフ化する。
49
DRAFT
ガイドラインに基づいた反応条件(1-1）
対象となるランモード・・・「Standard 7300」「Standard 7500」「9600 Emulation」
反応試薬の調整：
準備するもの：
●　Target 遺伝子のプライマ-＆プローブ、内在性コントロール遺伝子のプライマー＆プローブ
定量PCRの為のプライマーの設計のガイドラインを使って設計されたもの。
(TaqMan® Gene Expression Assays, Primer Express® softwareで設計など)
●　TaqMan® Universal PCR Master Mix（2X）（PN 4304437）
●　サンプルｃDNA
試薬の調整：
・Standard；実験の目的とする定量の範囲に合わせて、標準サンプルを段階希釈します。
（5点以上が理想的）
・PCR反応Ready reaction MIXの作成；必要PCR反応数をあらかじめ数えておきます。下記の容量
に必要反応数をかけてMIXを調整します。（足らなくならないよう少し多めに調製します）
7300/7500システム
7500Fastシステム
１ウェルあたりの反応液１ウェルあたりの反応液
TaqMan®Universal PCR Master
Mix (2X)
Forward Primer (10pmol/μL)
Reverse Primer (10pmol/μL)
TaqMan® Probe (5pmol/μL)
d-water
Total:
サンプルcDNA
25μL
10μL
μL
4.5μL (final conc.: 900nM) 1.8μL (final conc.: 900nM)
4.5μL (final conc.: 900nM) 1.8μL (final conc.: 900nM)
2.5μL (final conc.: 250nM) 1μL (final conc.: 250nM)
8.5μL
4.4μL
45μL
19μL
5μL
1μL
TaqMan® Gene Expression Assaysの場合
×必要反応数
μL
μL
μL
μL
μL
7300/7500システム
7500Fastシステム
1ウェルあたり
の反応液
1ウェルあたり
の反応液
25μL
10μL
μL
2.5μL
1μL
μL
d-water
17.5μL
8μL
μL
Total:
45μL
19μL
μL
5μL
1μL
TaqMan® Universal PCR Master
Mix (2X)
TaqMan®Gene Expression Assays
サンプルcDNA
×必要反応数
反応プレートへの分注：
サンプルcDNA 5μL or 1μL (10～100ng) と上記 Mixtureを混合し、反応プレートに分注します。
(トータル反応ボリューム:7300/7500システムでは50μL、7500Fastシステムでは20μLが標準)
注！上記ではサンプルcDNAを5μL あるいは１μL用いた時の例ですが、cDNAの濃度は同じです
（例えば10ng/5μLあるいは10ng/1μL）。実際の使用量はサンプルの濃度（Total RNA換算）によ
り異なります。扱い易いボリュームということで例を挙げていますがサンプルに含まれるPCR阻
害物質の過分な持込は定量結果に影響しますのでご注意ください。
50
DRAFT
ガイドラインに基づいた反応条件(1-2）
PCRサイクルコンディション
● 50℃ for 2 min.
- UNG activation
● 95℃ for 10 min.
- AmpliTaq® Gold activation (hot start)
- UNG deactivation
● 95℃ for 15 sec. / 60℃ for 1 min.＊ ← 40 cycles
- Cycling condition
＊データ取り込み時間は「Standard
7300」で31sec. 「Standard 7500」「9600 Emulation」
で35sec.が最低必要となります（ソフトウェアのバージョンにより異なります）。
UNG （Uracil N-glycosylase）
定量PCRの反応系においてdTTPの替わりにdUTPが使用されている場合、この反応液
で定量PCRを行ったサンプルにはdUTPを含むPCR産物が作成されています。このdUTP
を含むPCR産物が新たな実験反応サンプルにキャリーオーバーしてコンタミした場合
、Uracil N-glycosylase（酵素）はUracil塩基を認識して加水分解するため、PCR開始前
にdUTPを含むPCR産物を分解してコンタミネーションの影響を回避します。反応試薬
の種類によりUNGが含まれるものと含まれないものがありますが、含まれない（No
UNG）試薬の場合、最初の50℃ for 2min.のStageは必要ありません。
SYBR® Green I Dye アッセイの場合
Dissociation Stageを付加することにより、解離曲線を作成できます。PCR産物のTm値か
らターゲット以外のPCR産物の存在を確認することが出来ます。
パッシブリファレンス
データ解析過程でレポーター蛍光色素のシグナルを標準化するために内在性蛍光リファ
レンスとなる蛍光色素としてROXTMが使用されています。最終的な反応溶液の分注
時に生じる液量の違い（ピペッティング誤差）、Wellの汚れや曇りなどWell間に生じ
る蛍光の変動を補正するために、反応液中に一定濃度溶け込んでいるパッシブリファ
レンスを用いて標準化が行われます。
弊社定量PCR用反応試薬（TaqMan® Universal PCR Master Mix、SYBR® Green　PCR
Master Mix ）には、溶液中にパッシブリファレンスとしてのROXTM蛍光色素があらか
じめ一定濃度の割合で混合されています。このパッシブリファレンスによる標準化を
経てより正確な定量結果が導き出されることが期待できます。
51
DRAFT
ガイドラインに基づいた Fast PCR 反応条件(2-1)
対象となるランモード・・・「Fast 7500」のみ
反応試薬の調整：
準備するもの：
●　Target 遺伝子のプライマ-＆プローブ、内在性コントロール遺伝子のプライマー＆プローブ
定量PCRの為のプライマーの設計のガイドラインを使って設計されたもの。
(TaqMan® Gene Expression Assays, Primer Express® softwareで設計など)
●　TaqMan® Fast Universal PCR Master Mix（2X), No AmpEraseⓇ UNG
●　サンプルｃDNA
試薬の調整：
・Standard；実験の目的とする定量の範囲に合わせて、標準サンプルを段階希釈します。
（5点以上が理想的）
・PCR反応Ready reaction MIXの作成；必要PCR反応数をあらかじめ数えておきます。下記の容量
に必要反応数をかけてMIXを調整します。（足らなくならないよう少し多めに調製します）
X必要反応数
１ウェルあたりの反応液
TaqMan® Fast Universal PCR
Master Mix (2X)
Forward Primer (10pmol/μL)
Reverse Primer (10pmol/μL)
TaqMan® Probe (5pmol/μL)
d-water
10μL
μL
1.8μL (final conc.: 900nM)
1.8μL (final conc.: 900nM)
1μL (final conc.: 250nM)
4.4μL
μL
μL
μL
μL
Total:
19μL
μL
サンプルcDNA
1μL
TaqMan® Gene Expression Assaysの場合
1ウェルあたり
の反応液
TaqMan® Fast Universal PCR
Master Mix (2X)
TaqMan®Gene Expression Assays
X必要反応数
10μL
1μL
8μL
d-water
Total:
μL
μL
μL
19μL
1μL
サンプルcDNA
反応プレートへの分注：
サンプルcDNA 1μL (10～100ng) と上記Mixture 19μL を混合し、反応プレートに分注します。
(トータル反応ボリューム　20μL)
注！上記ではサンプルcDNAを1μL （10ng/μL：トータルRNA量換算）用いた時の例です。実
際の使用量はサンプルの濃度（Total RNA換算）により異なります。扱い易いボリュームとい
うことで例を挙げていますがサンプルに含まれるPCR阻害物質の過分な持込は定量結果に影響
しますのでご注意ください。
52
DRAFT
ガイドラインに基づいた Fast PCR 反応条件(2-2)
PCRサイクルコンディション
● 95℃ for 20 sec.
- 酵素activation (hot start)
● 95℃ for 3 sec. / 60℃ for 30 sec.＊ ← 40 cycles
- Cycling condition
＊データ取り込み時間は24sec.が最低必要となります。
パッシブリファレンス
データ解析過程でレポーター蛍光色素のシグナルを標準化するために内在性蛍光
リファレンスとなる蛍光色素としてROXTMが使用されています。最終的な反応溶
液の分注時に生じる液量の違い（ピペッティング誤差）、Wellの汚れや曇りなど
Well間に生じる蛍光の変動を補正するために、反応液中に一定濃度溶け込んでいる
パッシブリファレンスを用いて標準化が行われます。
弊社定量 PCR 用反応試薬（ TaqMan® Fast Universal PCR Master Mix（2X), No
AmpEraseⓇ UNG）には、溶液中にパッシブリファレンスとしてのROXTM蛍光色素
があらかじめ一定濃度の割合で混合されています。このパッシブリファレンスに
よる標準化を経てより正確な定量結果が導き出されることが期待できます。
53
DRAFT
機種別
選択表
7300システム
7500システム
7500Fastシステム
グレイ
ダークグレイ
ブラック
トレイ部分のカラー
ランに使用する
プレートまたは
チューブ
注！使用注意事項
（P13, P14）を確認し
てください
96 wellプレート、８連チューブ、単独チューブ
Fast専用 96 wellプレート
シールまたはキャップ
注！使用注意事項
（P13, P14）を確認し
てください
8連キャップ、アドヒシブカバー
アドヒシブカバーのみ
7300システム
7500システム
Standard 7300 モード
○
×
×
Standard 7500 モード
×
○
○
9600 Emulation モード
×
○
○
Fast 7500 モード
×
×
○
使用可
使用可
ランモード
TaqMan®
Universal
PCR Master Mix
TaqMan® Fast Universal
PCR Master Mix
SYBR® Green
PCR Master Mix
使用可
使用可
7500Fastシステム
使用可*
Standard 7500
9600 Emulation
使用可*
Fast 7500
使用可*
Standard 7500
9600 Emulation
＊対応するランモードがあります。詳細は反応試薬の選択（P20）を参照してください。
54
DRAFT
SDSシステムソフトウェア簡易操作ガイド(II)*
Relative Quantification
～RQソフトウェアを用いた検量線を用いない相対定量～
概要
SDS v1.X with RQソフトウェアでは、Relative Quantification Plate (RQ Plate)ドキュメントと
Relative Quantification Study (RQ Study)ドキュメントを併用して、比較CT法（∆∆CT法）を用
いた相対定量実験及び解析を自動で行うことができます。
Relative Quantification Plate (RQ Plate)ドキュメントを用いたデータ作成
概要
比較CT法（∆∆CT法）を用いた相対定量実験を行う時には、最初にRelative Quantification
Plate (RQ Plate)ドキュメントを用いてリアルタイムPCRアッセイを行います。
注記：Absolute Quantification (AQ Plate)ドキュメントを用いて行ったリアルタイムPCRアッ
セイデータは検量線法のみに対応しています。Relative Quantification Plate (RQ Plate)ドキュ
メントデータは比較CT法（∆∆CT法）のみに対応しています。
それぞれのデータを入れ替えて再解析することはできませんのでご注意ください。
*Relative Quantification 機能は7500/7500Fastシステムには標準で、7300システムにはオプシ
ョンにてご使用いただくことのできるプログラムとなります。
55
DRAFT
RQ Plateドキュメントの新規作成
1. デスクトップ上のアイコンをダブルクリックしてSDS v1.X (with RQ)ソフトウェアをしま
す。
2. FileメニューからNewを選択するとNew Document Wizardダイアログボックスが開きます。
3
4
3. AssayプルダウンメニューからRelative Quantification (ddCt) Plateを選択します。
4. Nextボタンをクリックします。
56
DRAFT
5. 次にDetectorの設定を行います。
5c
5a
5b
a) Detectorのリストに使用するDetectorが登録されているか確認します。
左側のDetectorのリスト中に使用するDetectorが無い場合、Detectorを新規作成します。
b) 使用するDetectorをクリックしてハイライトで選択し、Addをクリックします。
右側のDetector in Documentに選択したDetectorが登録されます。
c) Passive ReferenceがROXになっていることを確認します。
d) Nextボタンをクリックします。
6. 各ウェルの設定を行います。
a)下の96ウェルの画面上で、同じDetectorを設定するウェルをクリック-選択します。
b) DetectorのUseチェックボックスをクリックしてチェックをいれます。
6b
6a
57
DRAFT
c）Task下のプルダウンメニューをクリックして下記の通り設定をします。
ターゲット遺伝子の反応系：”Target”
内在性コントロール遺伝子の反応系：”ENDO”
< Back Next > Finish Cancel
d) この作業を繰り返し、全てのDetector及びTaskの設定を行います。
e) 終了したらFinishボタンをクリックします。
7. RQ Plateドキュメントが開きます。
8. サンプル名を入力します。⊿Ct値を計算するために同じサンプルのターゲット遺伝子と　内在性コントロール遺伝子のサンプル名を同一にする必要があります（大文字・小文字　の区別もします）。
a) 同じサンプルが入るウェルをクリックして選択します。
b)そのまま文字を入力しますと、ウェル上に入力した名称が表示されます。
c) 全てのウェルに対してサンプル名を入力します。
9. Setupタブ画面上での各ウェルの情報を確認します。
もしウェルの設定を変更する場合には、Well Inspector画面を用いて行います（p25参照）。
注記：サンプル毎に異なるRQ Plateドキュメントを作成し、解析は同時に行う予定の場合
（例　1枚目：Liver、2枚目：Lung、3枚目：Bladder）、
全てのPQ PlateプレートでDetectorの設定が共通で、且つn=3以上の内在性コントロールが
含まれていることが必要です。同じRQ Plate上で複数のサンプルを行う場合、サンプル毎に
内在性コントロールを含むことが必要です。
58
DRAFT
サーマルサイクリング条件の設定とランの開始
1. InstrumentタブをクリックするとInstrumentタブ画面が表示されます。
7300/7500システム
7500Fastシステム
2. 温度、時間、反応容量等、サーマルサイクリング条件の設定を行います。
注記：デフォルトでは弊社より供給しているプライマー・プローブセット、及び弊社
推奨条件に従って設計したプライマー・プローブセットを用いて、2ステップRT-PCR
を行うときの推奨条件が表示されます。
重要：複数のRQ Plateドキュメントを同時に解析する予定の場合、全てのRQ Plateド
キュメントで同じサーマルサイクリング条件（ステップ、サイクル数、反応容量、
9600 Emulationの有無）を設定することが必要です。異なる設定があると同時に解析
を行うことができませんのでご注意ください。また、シリアルNo.の異なる機器のデ
ータも同時に解析できません。
注意！いずれの場合においてもランモードの異なるRQプレートを同じRQスタディ上
で解析できませんのでご注意ください。
例）7500Fastシステムの「Fast 7500」モードを使用して得たRQプレートと「Standard
7500」モードを使用して得たRQプレート
3. FileメニューからSaveを選択し、RQ Plateドキュメント名を入力し、任意の場所を
選択して保存します（D:ドライブ推奨）。
4. 実験プレートをセットします。
5. Startボタンをクリックします。
RQ Plateドキュメントでの解析
RQ Plateドキュメント上で解析を行うと蛍光波形データを確認することができます。
59
DRAFT
Relative Quantification Study (RQ Study)ドキュメントを用いたデータ解析
概要
RQ PlateドキュメントをRQ Studyドキュメント上で解析をすることで比較CT法（
∆∆CT法）を用いた相対定量値の算出を行うことができます。
RQ Studyドキュメントでは最大10個のRQ Plateドキュメントを読み込み、同時に
解析を行うことができます。
RQ Studyドキュメントの新規作成・解析
1. FileメニューからNewを選択するとNew Documentダイアログボックスが開きます。
2. AssayプルダウンメニューからRelative Quantification (ddCt) Studyを選択します。
3
3. Nextボタンをクリックすると新規のAdd Platesダイアログボックスが開きます。
4
60
DRAFT
4. RQ Plateドキュメントを読み込みます。
a) Add PlateボタンをクリックするとSelect RQ Plate(s)ダイアログボックスが表示
されます。
b) 登録するRQ Plateドキュメントを選択しOpenボタンをクリックするとAdd Plates
ダイアログボックス上に登録したRQ Plateドキュメントが表示されます。
c) Finishボタンをクリックすると選択したRQ PlateドキュメントがPlateタブ上に表示
されます。
61
DRAFT
5.AnalysisメニューからAnalysis Settingを選択します。
ここで解析の設定を行います。
1
2
3
①　Ct Analysis
解析条件の設定を行います。
Detector毎に、Baselineをマニュアルで設定するか自動で設定するか、Threshold Lineを
マニュアルで設定するか自動で設定するかをそれぞれ選択します。
初めはDetectorを“All”で、Auto Ctにポインタを合わせ、自動解析を行うように設定し
たほうが簡便です。なおこの設定はAmplification Plot上で後から変更することができ
ます。
②　Gene Expression
キャリブレーターサンプルの選択、内在性コントロールとして使用するDetectorの選
択、マルチプレックスPCRか否か、データのばらつきの統計学的な信頼度の設定を行
います。
③　Replicate and Outlier Removal
Replicateがn=3以上の時に、Replicate内で大きくはずれたデータがあったときに自動的
に解析対象外にする機能の設定です。
解析設定が終了したらOKボタンをクリックします。
6. AnalysisメニューからAnalyzeを選択するか、緑の矢印ボタン　をクリックして
解析を行います。
62
DRAFT
7. RQ Studyドキュメント上でデータの確認をします。
A
C
B
A）RQ Detector Grid
ここにはRQ Studyドキュメントに設定されたDetectorが表示され、クリックして
選択することができます。
B）RQ Sample Grid
A)で選択したDetectorで設定されているサンプル及びその情報が表示されます。
Sample Summaryタブ：比較CT法（∆∆CT法）の計算仮定、及び定量値の数値が
表示されます。
Well Information タブ：RQ Plateドキュメント上での設定及びCT値が表示されます。
C）RQ Results Panel
Plateタブ：RQ StudyドキュメントへのRQ Plateドキュメントの登録・削　除を行います。
Amplification Plotタブ：A)で選択したDetectorのAmplification Plotが表示されます。
Threshold LineやBaselineの設定もできます。
Gene Expressionタブ：比較CT法（∆∆CT法）で算出された定量値が棒グラフで表示され
ます。
63
DRAFT
解析データの確認
1. Amplification Plotタブ画面
a）Threshold LineとBaselineの確認
RQ Detector Grid上でDetectorを選択して、RQ Results PaneでAmplification Plotタブをク
リックすると、Detector毎のAmplification Plotを確認することができます。
解析後の波形が良好かご確認ください。
自動解析結果が良好でないときには、Manual Ctに変更してThreshold Line及びBaselineの
設定変更を行うことができます。
変更したら必ず再度解析を行います。
64
DRAFT
2. Gene Expressionタブ画面
a) 定量結果の確認
RQ Detector Grid上でDetectorを選択して、RQ Results PaneでGene Expressionタブをク
リックすると、Detector毎の相対定量値が棒グラフで表示されます。
b）Calibratorを変更し、再解析を行うことでデータの比較ができます。
（例）
Liver
Kidney
Bladder
c）「Detectorごと」、「サンプルごと」の表示を切り替えることができます。
（例）
Detectorごと
Sampleごと
65
DRAFT
解析結果の出力
1.　FileメニューのExportサブメニューからResultsを選択して、下記の中から出力する
データを選択します。
・Sample Summary（定量結果だけ必要な場合はこの形式を選択）
・Well Information
・Both（ウェルの詳細情報と定量結果の両者が必要な場合はこの形式を選択）
2.　出力ファイルのファイル名を入力し、任意の場所を選択し、Saveボタンをクリックし
ます（D:ドライブ推奨）。
3.　csv. 形式のファイルとして出力されます。
66
DRAFT
比較CT法（∆∆CT法）とは
比較CT法（∆∆CT法）とは、基準としたサンプルとのCT値（Threshold Cycle値）の差から
相対値を求める相対定量法です。
比較CT法（∆∆CT法）を用いて相対定量を行うためには、下記の2つの条件を満たしている
ことが必要です。
● PCR増幅効率がほぼ100%であること
● ターゲット遺伝子と内在性コントロール遺伝子の2つの反応系でPCR増幅効率がほぼ一
致していること
*なお弊社推奨条件に従って設計したプライマー・プローブセットは、上記条件を満たし
ている可能性が非常に高いと考えています。
比較CT法（∆∆CT法）と検量線法の違い
比較CT法（∆∆CT法）と検量線法の違いは下表の通りになります。
長所
短所
比較CT 法（∆∆CT 法）検量線作成用サンプルの必要 PCR増幅効率が100%だと仮定
がないので、未知サンプル処しており、実際のPCR増幅効
理数が増え、コストが下がる。率が実験結果に反映されない。
毎回の実験毎に検量線を作成す
毎回PCR増幅効率を反映して
ることが必要なため、未知サン
検量線が作成されるため、得
プル処理数が減り、コストが高
られた定量値の正確性が高い。
くなる。
検量線法
それぞれの長所と短所をご理解いただき、ご検討ください。
比較CT法（∆∆CT法）に関する資料
比較CT法（∆∆CT法）の原理等の詳細については
“ABI PRISM 7700 Sequence Detection Systems User Bulletin #2”をご参照ください。
この資料は弊社ホームページ（www.appliedbyosystems.co.jp）からダウンロードすることが
できます。または、7300/7500/7500Fastに付属する「Real-Time PCR Systems Chemistry
Guide」（PN 4348358）をご参照ください。
当社へのお問い合わせ
アプリケーションサポートへのお問い合わせ
お問い合わせ先の電話番号、電子メールアドレスは下記の通りです。
アプリケーションサポート
フリーダイアル　TEL: 0120-477-392 FAX: 0120-477-120
電子メール　: [email protected]
67
DRAFT
TaqMan® Probeを用いたSNPsタイピング
パーフェクトマッチと１塩基ミスマッチ
A substantial increase in…
indicates…
VIC fluorescence only
homozygosity for Allele 1.
FAM fluorescence only
homozygosity for Allele 2.
both fluorescence signals
heterozygosity.
Allele
Allele 22 homo
homo
Allele
Allele 1,
1, 22 hetero
hetero
FAM
Allele
Allele 11 homo
homo
NTC
NTC
VIC
Allelic DiscriminationのResult画面
詳細な実験の組み方やプログラムの設定に関しましては機器に付属の「Applied Biosystems
7300/7500 Real Time PCR System Allelic Discrimination」ガイドブックを御参照下さい。また、
7500FastシステムのFast 7500モードでのPCR過程を使用してのAllelic Discriminationプログラ
ムのパフォーマンスは検証されておりません。Standard 7500モードをご使用下さい。
68
DRAFT
TaqMan® Probeを用いたSNPsタイピング
TaqMan® プローブについて
TaqMan®
プローブの種類
アプライドバイオシステムズではTaqMan®アッセイのためのプローブと
して下記の2種類をご提供しています。
◆　TaqMan® プローブ
◆　TaqMan® MGB プローブ
プローブの特徴
2種類のプローブのそれぞれの特徴は下記の通りになります。　TaqMan®
プローブ
5’ ラベル
3’ ラベル
特徴
TaqMan®
6-FAMTM
VICTM, or
TETTM
TAMRATM
なし
TaqMan®
MGB
6-FAMTM
VICTM, or
TETTM
Nonfluorescent
quencher
Minor groove binder
TaqMan® MGB Probe
NFQ
R
R
MGB
: Reporter Dye　（FAM　or VIC)
NFQ
: Non-Fluorescent Quencher　MGB
: Minor Groove Binder
★ MGBの付加によりTm値が上がり、短く設計できる
特徴
★ SNPsタイピングの場合１塩基ミスマッチ率が上がる
★ Quencherの蛍光色が出ないため、バックグラウンド
ノイズが低くなる
詳細な実験の組み方やプログラムの設定に関しましては機器に付属の「Applied Biosystems
7300/7500 Real-Time PCR System Allelic Discrimination」ガイドブックを御参照下さい。また、
7500Fastシステムの「Fast 7500」モードでのPCR過程を使用してのAllelic Discriminationプロ
グラムのパフォーマンスは検証されておりません。「Standard 7500」モードをご使用くだ
さい。
69
DRAFT
TaqMan® Probeを用いた＋ / －アッセイ
7300/7500 Real Time PCR System を用いて＋／－アッセイを行うことができます。
サンプル中に存在する特異的な核酸配列を7300/7500機器を用いて検出し、＋／－の判定を行
うものです。7500Fastシステムの場合は下記参照。
＋／－アッセイでは、Internal Positive Control (IPC)の使用を選択することができますが、この
IPCの反応系を併用することで擬陰性の結果を回避することができます。（この場合マルチプ
レックスの反応系となるので、SYBR®　Green I Dye ケミストリでの反応系を組むことはでき
ません）
このアッセイはリアルタイムではなく、エンドポイントの蛍光データを用いて行います。
Results - Plate
Results - Report
TaqMan® Exogenous Internal Positive Control（IPC）キット
弊社よりプラス/マイナス判定の実験系の設計および実験のための試薬キットをご
提供しております。
商品名
TaqMan® Exogenous Internal Positive Control Reagents with
TaqMan® Universal PCR Master Mix
4308320
TaqMan® Exogenous Internal Positive Control Reagents
4308323
TaqMan®
4304437
Universal PCR Master Mix
詳細な実験の組み方やプログラムの設定に関しましては機器に付属の「Applied Biosystems
7300/7500 Real-Time PCR System Plus/Minus Assay」ガイドブックを御参照下さい。また、
7500Fastシステムの「Fast 7500」モードでのPCR過程を使用してのPlus/Minus Assayプログラ
ムのパフォーマンスは検証されておりません。「Standard 7500」モードをご使用ください。
70
DRAFT
参考資料A
注
7500 Fast Real-Time PCR System
7300/7500 Real-Time PCR System
7300/7500 Real-Time PCR System
注！7500 Fast Real-Time PCR System ではサンプル許容容量は10μｌ～30μｌ、標準20μｌです。
71
DRAFT
参考資料A
72
DRAFT
参考資料A
注！7500 Fast Real-Time PCR Systemではランモードに関係なく標準Total反応ボリュームは20μｌですので
ご注意ください。また、7500 Fast Real-Time PCR System ではチューブの使用はできません。
73
DRAFT
参考資料A
注！7500 Fast Real-Time PCR System ではチューブの使用はできません。
注！Wellの底に残った空気の泡はもちろん、反応ボリュームが少ない場合、Well壁面に残っている反応液は定量
結果に大きな影響を与えます。アプライドバイオシステムズでは適正な遠心操作を行いWellの底部分に全ての反
応液が位置している状態でのPCR（ラン）を推奨いたします。（本資料１７ページ参照）
74
DRAFT
参考資料B
®
®
®
®
®
®
®
®
注！参考資料Bの内容に関しまして、TaqManⓇ Fast Universal PCR Master MixとFast PCR サーマルサイク
リングコンディションでの検証は行われておりません。
75
DRAFT
参考資料B
®
®
注！参考資料Bの内容に関しまして、TaqManⓇ Fast Universal PCR Master MixとFast PCR サーマルサイク
リングコンディションでの検証は行われておりません。
76
DRAFT
参考資料B
®
®
注！参考資料Bの内容に関しまして、TaqManⓇ Fast Universal PCR Master MixとFast PCR サーマルサイク
リングコンディションでの検証は行われておりません。
77
DRAFT
参考資料B
注！参考資料Bの内容に関しまして、TaqManⓇ Fast Universal PCR Master MixとFast PCR サーマルサイク
リングコンディションでの検証は行われておりません。
78
DRAFT
補足（異なるタイプのPPHを使用の場合）
7300/7500システムのみ
正しいセット例：
Holder両端のタブが
上向きの状態でセット
Drawer Slot
悪いセット例：
タブが下向きの状態での
セットはしないで下さい ! !
Precision Plate Holderは四隅のFlanges部分がDrawer Supportの上に載るように
トレイに上からセットします
Precision Plate Holder
Flanges を Drawer Supportの
下にもぐりこませないで下さい ! !
トレイ
Drawer Support
Precision Plate Holder Flanges
79
DRAFT
アプライドバイオシステムズジャパン株式会社
DRAFT
アプライドバイオシステムズジャパン株式会社
＜弊社機器修理・保守契約等のご質問とご依頼＞
TEL 0120-203-885 FAX 03-5566-6503
＜弊社製品に関わるアプリケーション等の情報、技術資料ライブラリ＞
下記弊社ウェブサイトをご覧ください。
http://www.appliedbiosystems.co.jp
よくあるご質問：
技術資料ライブラリ：
トップページ→Support→「製品Ｑ＆Ａ」
トップページ→Support→「テクニカルアップデート」
TEL 0120-477-392 FAX 0120-477-120
SDS13-2

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