FLAG融合タンパク質の単離

E. coli Expression System Manual
Product Numbers :
FL-YA, FL-C, FL-S
TABLE OF CONTENTS
FLAGシステム
解説
操作手順
ベクターの選択
ORF融合連結部分の配列確認
細胞質、ペリプラズムにおける融合タンパク質の発現
FLAG融合タンパク質の精製および検出
E. coli FLAG発現システムの特徴および用途
E.
E. coli FLAG EXPRESSION KITS
解説
1
1
3
4
4
5
7
Components of the E. coli Amino-Terminal FLAG Expression Kit
Components of the E. coli Carboxyl-Terminal FLAG Expression Kit
Components of the E. coli FLAG-Shift Expression Kit
7
8
9
10
FLAG発現システムの各要素
pFLAG-MAC and pFLAG-ATS Expression Vectors
pFLAG-CTS and pFLAG-CTC Expression Vectors
pFLAG-1TM and pFLAG-2TMExpression Vectors
pFLAG-Shift12 and pFLAG-Shift12c Expression Vectors
ベクター本体部分のその他の特徴
FLAG-BAP Positive Control Plasmids
N-26 and C-24 Oligodeoxyribonucleotide Primers
11
11
14
15
16
17
19
19
挿入ORF連結部分の確認
一本鎖FLAG DNAの単離
FLAG融合体連結部分の確認
N-26およびC-24プライマーを用いた二本鎖シークエンシング
タンパク質発現宿主
20
20
22
24
25
FLAG融合タンパク質の発現プロトコール
FLAG融合タンパク質を発現する形質転換体のスクリーニング
融合タンパク質発現の最適化
26
26
28
FLAG融合タンパク質の単離
FLAG融合タンパク質の分画（分析用）
Whole Cell Sample
ペリプラズム画分の浸透圧衝撃処理
全細胞抽出液：可溶性および不溶性画分
29
29
31
32
33
FLAG 融合タンパク質の単離（調製用）
浸透圧衝撃法によるペリプラズムからのタンパク質の単離
FLAG 融合タンパク質の全細胞抽出液
34
34
36
FLAG 融合タンパク質のイムノアフィニティー精製
ANTI-FLAG M1 Affinity Gel を用いた FLAG 融合タンパク質の精製
カラムの準備
カラムの洗浄
FLAG 融合タンパク質のカラムへの吸着
グリシンを用いた酸溶出による FLAG 融合タンパク質の溶出
キレート剤（EDTA）による FLAG 融合タンパク質の溶出
FLAG Peptide を用いた競合による FLAG 融合タンパク質の溶出
カラムの保存
カラムのリサイクル
ANTI-FLAG M2 Affinity Gel を用いた FLAG 融合タンパク質の精製
カラムの準備
カラムの洗浄
FLAG 融合タンパク質のカラムへの吸着
グリシンを用いた酸溶出による FLAG 融合タンパク質の溶出
FLAG Peptide を用いた競合による FLAG 融合タンパク質の溶出
カラムの保存
カラムのリサイクル
37
38
39
40
40
40
40
41
41
41
41
42
42
42
43
43
43
43
FLAG マーカーの除去
45
FLAG 融合タンパク質の呈色検出
4- クロロナフトール（4-Chloro Naphthol；4-CN）基質を用いた Dot Blot
による FLAG 融合タンパク質の検出
4-CN 基質を用いた Western Blot による FLAG 融合タンパク質の検出
47
MAPS OF THE SIGMA E. Coli
coli EXPRESSION VECTORS
51
References
61
FLAG System 製品リスト
69
48
50
FLAGシステム
解説
FLAG発現システム1では8アミノ酸のFLAGマーカーペプチドを利用します（図1）
。FLAGベ
クターのマルチクローニングサイト（MCS）に目的タンパク質のオープンリーディングフレー
ム（ORF）を組み込み、FLAG Peptideの上流または下流に隣接して融合させます。これにより、
N末端またはC末端にFLAG Peptideを持つ目的タンパク質が翻訳･発現されます。8アミノ酸
FLAG Peptideに特異的に結合するANTI-FLAG® Monoclonal Antibody M1（IgG2b）およびM2
（IgG1）は、様々な免疫学的手法によるFLAG融合タンパク質の検出に使用できます。さらに、
M1またはM2 ANTI-FLAG抗体をゲルマトリックスに結合させたアフィニティーゲルによ
り、FLAG融合タンパク質を精製することができます。
図１．Flag Marker Peptide
Sequence of the Flag Marker Peptide. All the eight amino acids are required for binding of the
antibodies Ml and M2. Enterokinase recognizes the Asp-Asp-Asp-Asp-Lys sequence at the
carboxy terminal and cleaves after Lys. Note that cleavage will not occur if Lys is followed by a
Pro. In addition, Enterokinase cleavage (see page 35) does not occur at an internal location or at
the carboxy terminus of the FLAG fusion protein. Also note that the FLAG DNA sequence may
vary from one FLAG vector to the next, but the peptide sequence remains the same.
操作手順
E. coli FLAG発現システムは、E. coli を用いたFLAGペプチド融合タンパク質の発現用に設計
されています。FLAG融合タンパク質の発現は、ORFを適切なベクターにクローニングして
行います。融合タンパク質の一般的な発現方法を図2に示しました。
1
図２．General Outline of Methodology for Expression of a Fusion Protein in FLAG
E. coli Expression System.
Strategy for Expression of FLAG Fusion Proteins
2
表1．Recommended Components of the E. coli Expression System for the
Purification and Detection of the FLAG Fusin Proteins
Expression
Vector
Size
(bp)
Control
Plasmid
pFLAG-MAC
5071 pFLAG-ATS-BAP
pFLAGShift12c
5074 pFLAG-Shift12-BAP
pFLAG-2
5052 pFLAG-1-BAP
pFLAG-CTC
5336 pFLAG-CTS-BAP
pFLAG-ATS
5396 pFLAG-ATS-BAP
Control
Protein
N-Terminal
FLAG-BAP
FLAG Confirm
Protein
Protein
Entero
Fusion Fusion Localization Detection Purification kinase
Met
N-26
Cytoplasm
M2
M2 Gel
Yes
C
C-24
Cytoplasm
M2
M2 Gel
No
FLAG-BAP
N
N-26
Periplasm
M1
M2
M1 Gel
M2 Gel
Yes
C-Terminal
FLAG-BAP
C
C-24
Periplasm
M2
M2 Gel
No
C-Terminal
FLAG-BAP
N-Terminal
pFLAG-Shift12 5134 pFLAG-Shift12-BAP
pFLAG-1
5377 pFLAG-1-BAP
pFLAG-CTS
5391 pFLAG-CTS-BAP
For detailed information on the various E. coli Expression Kits, refer to Tables 2, 3 and 4
ベクターの選択
ORFのリーディングフレームが既知の場合、クローニングにはアミノ末端またはカルボキシ
ル末端FLAG Expression Vectorを使用します。アミノ末端を正確に規定する必要がない、
あるいはそれが不可能な場合、およびリーディングフレームが未知の場合でも、FLAG-Shift
Expression Vectorを用いることでタンパク質を発現させることが可能です。このFLAGShift Expression Vectorはクローニング時のリーディングフレームとは無関係にORFを発現さ
せることができる「シフト」配列を含んでいます（詳しくはFLAG-Shift Expression Vectorのセ
クションをご覧下さい）。ORFのリーディングフレームが不明な場合、特にゲノム、ショッ
トガンあるいはcDNAライブラリーからORFをクローニングした際などには、このFLAGShift Expression Vectorが有効です。
3
各FLAG Expression Vectorは共通のマルチクローニングサイト（MCS）を有しており、簡単に
ベクター間でORFを交換できます。キットに含まれる発現ベクターのMCSには、3つのリー
ディングフレームそれぞれに対応する制限酵素サイトが組み込まれています。制限酵素で
MCS内の各サイトを切断すると、5'、3'突出末端あるいは平滑末端が得られます。pFLAG-1
およびpFLAG-2 Expression Vector（キットとは別に販売しております）は共通のMCSを持
っており、各制限酵素サイトのリーディングフレームも同一です。pFLAG-1およびpFLAG2のMCSを制限酵素で切断した場合、すべてのサイトで4塩基5'突出末端が生じます。
ORF融合連結部分の配列確認
FLAGクローンのDNA配列は、FLAG融合連結部分でリーディングフレームが適切であるこ
とを確認する必要があります。制限酵素切断による解析は有効ですが、通常それだけでは
FLAGインサート連結部分配列の厳密な確認には十分ではありません。
N-26およびC-24 oligodeoxyribonucleotide primerは、挿入した遺伝子配列のアミノ末端および
カルボキシル末端FLAG融合連結部をシークエンシングする際に使用します。N-26およびC24プライマーはサイクルシークエンシングにも使用可能です。また、これらはFLAG融合タ
ンパク質の配列を修飾する際に、目的配列の増幅反応用プライマーとしても使用できます。
細胞質、ペリプラズムにおける融合タンパク質の発現
アミノ末端、カルボキシル末端およびFLAG-Shift Expression Vectorは、FLAG融合タンパ
ク質を細胞質、ペリプラズムのどちらで発現させるかに対応して、それぞれ2種類ずつ用意さ
れており、目的に適したベクターの選択が可能です。各ペアの一方はFLAG融合タンパク質
をペリプラズムに発現させるOmpA分泌シグナル配列を有しています。もう一方のベクター
はOmpA分泌シグナル配列を欠いており、FLAG融合タンパク質は細胞質内で発現されます。
4
FLAG融合タンパク質の精製および検出
E. coli FLAG Expression Vectorにより発現させたFLAG融合タンパク質はANTI-FLAG M1
あるいはM2 Affinity Gelによるアフィニティー精製が可能です。使用するゲルはタンパク質
内のFLAGマーカーの位置に応じて決定します（表1）。ANTI-FLAG M1およびM2 Affinity
Gelによる精製では温和な条件を使用するため、生物学的に活性なタンパク質が得られます。
ANTI-FLAG M1 Affinity Gelはカルシウム依存的にFLAG Peptideと結合し、EDTAなどの
キレート剤を用いることで温和な条件で溶出を行うことが可能です。また、FLAG Peptide
により結合を競合させることで、ANTI-FLAG M1およびM2 Affinity Gelから融合タンパク
質を溶出させることも可能です。FLAGマーカーがアミノ末端の先端に位置する場合は、
ANTI-FLAG M1 Monoclonal Antibodyを用いたウェスタンあるいはドットブロットによる検
出が可能です。ANTI-FLAG M2 Monoclonal Antibodyは、FLAGマーカーがアミノ末端ある
いはカルボキシル末端のいずれに存在する場合にも使用できます。FLAG融合タンパク質を
解析する際には、FLAG Peptideをマーカーとして用いることで広範な免疫学的手法を適用
可能です。また、アミノ末端およびMet-アミノ末端融合タンパク質のFLAGマーカーは、
enterokinaseにより除去できます。融合様式の異なるFLAGタンパク質とそれに結合するモ
ノクローナル抗体の関係を図3に示しました。
5
図３．Binding of Monoclonal Antibodies Ml & M2 to FLAG Fusion Proteins
6
E. coli FLAG発現システムの特徴および用途
FLAG Peptideは、FLAG融合タンパク質のアフィニティー精製および免疫検出に有利な以
下の特徴を有しています。
・効率的：タンパク質を精製する際に、抗体の作成などの特殊な試薬の作成やタンパク質の
機能検定などは不要です。
・広い応用範囲：アミノ末端およびカルボキシル末端FLAG融合タンパク質は、E. coli、酵
母、昆虫および動物細胞で発現可能です（以下のセクションをご参照下さい）。
・タンパク質の機能に与える影響が小さい：8アミノ酸の小さなペプチドを使用するため、ネ
イティブタンパク質のコンフォメーションが受ける影響は最小です。
・検出が容易：分子表面に位置する可能性の高い組成を持つ8アミノ酸配列をマーカーとして
使用します。マーカーが表面にあることにより、ANTI-FLAG M1およびM2 Monoclonal
Antibodyにより認識される確率が非常に高くなります。
・穏かな精製条件：ANTI-FLAG M1およびM2 Affinity Gelでは温和な精製条件を用いるため、
生物活性を保持したタンパク質を迅速に回収できます。
・除去が容易：天然に存在することがまれな5アミノ酸のenterokinase認識配列を含んでおり、
タンパク質分解除去により完全なタンパク質を回収できます。
・広い用途：タンパク質-タンパク質、タンパク質-DNA相互作用、タンパク質モニタリング
および超構造の解析などに使用できます。
FLAGテクロノジーは E. coli 1-4,11,13,14,17,18,20,24,45,49,51,59、酵母 1,2,46、昆虫細胞 22,47,60,61および哺乳類細
胞3-10,12,15,16,19,21,23,48,49など、様々な細胞におけるタンパク質発現に使用されています。発現させた
タンパク質は受容体の解析50-54,56,62、シグナル伝達55,63およびアポトーシス57,64など様々な目的で
使用されています。
E. coli FLAG EXPRESSION KITS
解説
以下のE. coli 発現キットをご用意しております。
1. E. coli Amino-Terminal FLAG Expression kit（表2）
2. E. coli Carboxy-Terminal FLAG Expression kit（表3）
3. E. coli FLAG-Shift Expression kit（表4）
7
表2．Components of the E. coli Amino-Terminal FLAG Expression Kit
Kit Component*
pFLAG-ATS
TM
Function
Expression and secretion of Amino-Terminal
Expression Vector
FLAG Fusion protein in periplasm
pFLAG-MACTM
Expression and secretion of Met-Amino-Terminal
Expression Vector
FLAG Fusion protein in cytoplasm
pFLAG-ATS-BAPTM
Positive control for protein expression,
Control Plasmid
detection and purification
N-24 Primer
C-24 Primer
Storage
0 to -20℃
0 to -20℃
0 to -20℃
Sequencing of Amino-Terminal of
FLAG Fusion junction
Sequencing of Carboxy-Terminal of
0 to -20℃
FLAG Fusion junction
ANTI-FLAG
Immunological detection of Amino-terminal FLAG
Monoclonal Antibody
fusion protein from pFLAG-ATS Expression Vector
Immunological detection of Met Amino-terminal
ANTI-FLAG M2
FLAG fusion protein from pFLAG-MAC Expression
Monoclonal Antibody
Vector and Amino-terminal FLAG fusion protein
0 to -20℃
from pFLAG-ATS Expression Vector
ANTI-FLAG M1
Affinity purification of Amino-terminal FLAG fusion
Affinity Gel
protein from pFLAG-ATS Expression Vector
Affinity purification of Amino-terminal FLAG fusion
ANTI-FLAG M2
protein from pFLAG-ATS Expression Vector or
Affinity Gel
Met-Amino-terminal FLAG fusion protein from
2 to 8℃
pFLAG-MAC Expression Vector
FLAG Peptide
N-Terminal FLAGBAP Control Protein
Enterokinase
Peptide elution of FLAG fusion protein
from ANTI-FLAG MI or M2 Affinity Gel
Positive control for detection and purification
Removal of FLAG peptide from Amino-terminal
and Met-Amino-Terminal FLAG Fusion protein
*See Footnotes to Table 4
8
2 to 8℃
0 to -20℃
0 to -20℃
表3．Components of the E. coli Carboxyl-Terminal FLAG Expression Kit
Kit Component*
pFLAG-CTS
Expression Vector
pFLAG-CTC
Expression Vector
pFLAG-CTS-BAP
Control Plasmid
N-24 Primer
C-24 Primer
ANTI-FLAG M2
Monoclonal Antibody
ANTI-FLAG M2
Affinity Gel
FLAG Peptide
C-Terminal FLAGBAP Control Protein
Function
Expression and secretion of Carboxy-Terminal
FLAG Fusion protein in periplasm
Expression and secretion of Carboxy-Terminal
FLAG Fusion protein in cytoplasm
Positive control for protein expression,
detection and purification
Sequencing of Amino-Terminal of
Carboxy-terminal FLAG Fusion junction
Sequencing of Carboxy-Terminal
FLAG Fusion junction
Immunological detection of Carboxy-terminal FLAG
fusion protein from pFLAG-CTS or CTC
Expression Vector
Affinity purification of Carboxy-terminal FLAG
fusion protein from pFLAG-CTS or CTC
Expression Vector
Peptide elution of FLAG fusion protein
from M2 Affinity Gel
Positive control for detection and purification
*For description see Footnotes to Table 4
9
Storage
0 to -20℃
0 to -20℃
0 to -20℃
2 to 8℃
2 to 8℃
0 to -20℃
表4．Components of the E. coli FLAG-Shift Expression Kit
Kit Component*
pFLAG-Shift12
Expression Vector
pFLAG-Shift12cTM
Expression Vector
pFLAG-Shift12TM- BAP
Control Plasmid
TM
N-24 Primer
C-24 Primer
ANTI-FLAG M1
Monoclonal Antibody
ANTI-FLAG M2
Monoclonal Antibody
ANTI-FLAG Ml
Affinity Gel
ANTI-FLAG
Affinity Gel
FLAG Peptide
N-Terminal FLAG-TM BAP
Control Protein
Enterokinase
Function
Expression and secretion of Amino-Terminal
FLAG-Shift Fusion protein in periplasm
Expression of Met-Amino-Terminal
FLAG-Shift Fusion protein in cytoplasm
Positive control for protein expression,
detection and purification
Sequencing of Amino-Terminal of
FLAG-Shift Fusion junction
Sequencing of Carboxy-Terminal of
FLAG-Shift Fusion junction
Immunological detection of Amino-terminal FLAG
fusion protein from pFLAG-Shift12 Expression Vector
Immunological detection of Met-Amino-terminal
FLAG fusion protein from pFLAG-Shift12c Expression
Vector and pFLAG-Shift12 Expression Vector
Affinity purification of Amino-terminal FLAG-Shift
fusion protein from pFLAG-Shift12 Expression Vector
Affinity purification of Amino-terminal FLAG-Shift
fusion protein from pFLAG-Shift12 Expression Vector
Met-Amino-terminal FLAG-Shift fusion protein from
pFLAG-Shift12c Expression Vector
Peptide elution of FLAG-Shift fusion protein from
ANTI-FLAG Ml or M2 Affinity
Positive control for detection of Amino-terminal and
Met-Amino-terminal Shift Fusion proteins
Removal of FLAG peptide from Amino-terminal and
Met-Amino-Terminal FLAG-Shift Fusion protein
Storage
0 to -20℃
0 to -20℃
0 to -20℃
0 to -20℃
0 to -20℃
0 to -20℃
0 to -20℃
2 to 8℃
2 to 8℃
0 to -20℃
0 to -20℃
0 to -20℃
* The Expression Vectors (10μg) are supplied in 1 mM Tris-HCl, 0.1 mM EDTA (pH 8)
The Control Plasmids (1μg) are supplied in 1 mM Tris-HCl, 0.1 mM EDTA (pH 8)
The N-26 and C-24 Primers (1μg) are supplied in 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA (pH 8)
The ANTI-FLAG Antibodies M1 and M2 (200μg) are supplied in PBS with 0.02% sodium azide
The FLAG Peptide (4mg) is supplied in a lyophilized form.
The ANTI-FLAG Affinity Gels (1ml) are supplied in PBS with 0.02% sodium azide
The Control Proteins (100μg) are supplied in a buffer containing 10 mM Tris-HCl,
120 mM NaCl, 0.05 mM ZnCl, 50% glycerol (pH 8)
10
FLAG発現システムの各要素
FLAG発現システムに含まれる試薬を表２∼４にまとめました。以下では、各発現ベクター
の簡単な特徴説明および、これらのベクターに目的DNA配列をクローニングする際のアドバ
イスを概説します。ベクターの詳細なマップは、
「Sigma E. coli Expression Vectorマップ」セ
クション（52ページ。図5∼13）をご覧下さい。
pFLAG-MAC and pFLAG-ATS Expression Vectors
MCSの特徴
・pFLAG-MAC（図5）およびpFLAG-ATS（図6）は、共通の制限酵素サイトを有しており、こ
れらベクター間でORFを交換可能です。
・MCS内にのみ存在する制限酵素サイトを10個有しており、3つすべてのリーディングフレ
ームに対応しています。Kpn IとBgl IIの間にはPst Iサイトが存在しており、ORFのマッ
ピングまたは切断に有用です（注意：Xba Iサイトはdamメチラーゼによるメチル化に影
響を受けます）。
・制限酵素切断により、5'突出、3'突出末端または平滑末端が得られます。
・各リーディングフレームに対応する翻訳終止コドンを有しています（MCS内には終止コド
ンはありません）。
・このMCSはC末端FLAG Expression Vectorと互換性を有しています。
他の特徴
・pFLAG-MACはOmpAシグナルペプチド配列を持たず、Met-アミノ末端FLAG融合タンパ
ク質の細胞質内発現に使用します。
・pFLAG-ATSはOmpAシグナルペプチド配列を有しており、ペリプラズムにおけるアミノ
末端FLAG融合タンパク質の発現が可能です。
11
MCSへのORFの組み込みとphaseの調整
実験の計画段階で、E. coli FLAG Expression Vector内にサブクローニングするORFの翻訳リ
ーディングフレームをどのように合わせるかを検討しておく必要があります。 E. coli
Amino-terminal FLAG Expression Vectorが持つ各制限酵素サイトの翻訳phaseとpUC18ク
ローニングベクターおよびλgt11の比較については、表5をご参照下さい。
目的インサートを持たないクローンの混入を最小限に抑え、インサートポジティブクローン
を効率良く選択可能な手法を用いることが望ましいと言えます。このようにポジティブクロ
ーンを濃縮するためには、実験初期のベクター設計および調製時に余分な作業が必要となり
ますが、選択したクローンは高い割合でインサートを含むため、後のスクリーニングステッ
プにおいて必要とされる労力を大きく削減できます。ここで紹介する方法では、ベクターを
制限酵素で切断することにより、ポジティブクローンを濃縮します。まず、クローニングに
用いる制限酵素サイトを選ぶ際に、少なくとも1つの制限酵素サイトが間に入るようにして、
2つのサイトを選びます。次にこれらのサイトを切断し、インサートの連結反応を行うと、イ
ンサートを含むベクターは切断前のもとの環状ベクターが有していた制限酵素サイトを少な
くとも1つ失っていることになります。最後に、この失われたサイトを切断する制限酵素で連
結反応混合液を処理することにより、混入した環状ベクターを切断します。環状ベクターは
線状のものに比べ形質転換効率が高く、インサートを持つベクターは切断を受けず環状のま
ま残るため、インサートポジティブクローンの割合が高められます。
12
表5．Translational Phase of First Base of Each Restriction Site in the MCS of
Amino-terminal FLAG Expression Vectors
Restriction Site
pFLAG-ATS
pFLAG-MAC
pFLAG-1
pFLAG-2
pUC18
Lambda gt11
Tth III 1(GACN/NNGTC)
1
−
Hind III(A/AGCTT)
1
1
Xho I (C/TCGAG)
1
1(Sal I also)
- (3 for Sal I)
Eco RI (G/AATTC)
3
1
3 (1 for Lambda)
Sma I (CCC/GGG)
2
−
−
3
1
Xma I(C/CCGGG)
2
−
1
Kpn I (GGTAC/C)
3
−
2
Asp 718(G/GTACC)
3
1
2
Bgl II (A/GATCT)
3
−
- (3 for BamHI)
Xba I (T/CTAGA)
3
−
3
Note: An ORF may be transferred between the pFLAG-MAC and pFLAG-ATS Expression Vectors
since both share the same restriction sites in the same phase. An ORF may have to be re-phased if
transferred from Lambda gt11, pUC18 or the pFLAG-1 and pFLAG-2 Expression Vectors. Phase 1 is in
the same reading frame as the FLAG coding sequence.
都合良く天然コード配列のphaseを合わせるのに適切なMCSが存在しない場合、5'突出末端
部位をKlenow酵素により平滑化してベクターを再クローニングすることにより、その位置
以降の全サイトのリーディングフレームを一つずらすことが可能です。例えば、インサー
トが5'平滑末端を有している場合、
（a）平滑インサートの5'末端の塩基がphase1となるように、
Xma IサイトをKlenow酵素により平滑化する、
（b）平滑インサートの5'末端の塩基がphase2
に合うようにベクターをSma Iで切断する、あるいは（c）FLAG Expression VectorをTth III 1、
Hind III、Xho Iサイトのいずれかで切断し、Klenow平滑処理後、平滑末端化されたベクタ
ーを再連結する。新たなベクターは平滑インサートの5'末端の塩基がphase3となるように、
Sma Iで切断する、などの方法によりphaseを調整できます。
13
Klenow酵素による平滑化処理のプロトコ−ル
ベクター濃度は200μg/ml以下とし、0.03U/μlのKlenow酵素、50μMx の各dNTPの存在下、目的
の制限酵素とそれに推奨されるバッファーを用いて、37℃で30分以上、切断反応を行います。
その後、70∼75℃で30分間加熱し、酵素を不活性化させます。
pFLAG-ATSおよびpFLAG-MAC Expression VectorのMCS中のTth III 1サイトを利用して、
FLAG Peptideに続く最初のアミノ酸を変更できます。Tth III 1を直接利用してインサート
をクローニングした場合、最初のアミノ酸はValとなります。しかし、Tth III 1サイトを
Klenow平滑処理することにより、最初のアミノ酸として他のアミノ酸を指定することが可能
です。ただし、挿入する遺伝子配列はFLAGコード配列最後のLysコドンを壊さないために、
AまたはGで始まる必要があります。この処理では5'末端がAまたはGとなる多くの平滑酵素
を利用できます。Tth III 1切断、Klenow平滑処理および再環状化により、Tth III 1を含まない
ベクターが再構築されます。これに伴い、下流の全サイトのphaseが1つずれますが、FLAG
コドンのDNA配列に変更はありません。Hind IIIサイトを利用して直接クローニングした場
合、最初の3アミノ酸はVal-Lys-Leuとなります。
pFLAG-CTS and pFLAG-CTC Expression Vectors
MCSの特徴
・pFLAG-CTC（図7）およびpFLAG-CTS Expression Vector（図8）は、pFLAG-ATSおよび
pFLAG-MAC Expression Vectorと同様なMCSを有しています。
・このMCSは3つすべてのリーディングフレームに対応した制限酵素サイトを有しています。
・制限酵素切断により、5'突出、3'突出末端または平滑末端が得られます。
他の特徴
・MCSのすぐ下流に翻訳終止コドンを有しています（MCS内に終止コドンはありません）。
この終止コドンは、隣接するFLAGペプチド･コード配列と同じphaseに合わせてあります。
MCSへのORFの組み込みとリーディングフレームの調整
Carboxy-terminal FLAG Expression VectorにクローニングするORFは、
（1）MCSのすぐ上
流に存在するATG翻訳開始コドン、および（2）MCSのすぐ下流に存在するC末端FLAG DNA
コード配列にリーディングフレームを合わせる必要があることに注意して下さい。また、C
末端FLAG Peptideまで正確に翻訳するために、インサートに終止コドンが含まれていない
ことを確認してください。
14
表6．Translational Phase of First Base of Each Restriction Site in the MCS of the
pFLAG-CTC and pFLAG-CTS Expression Vectors
Restriction Site
ATG Start Codon
FLAG Peptide
pFLAG-CTC
pFLAG-CTS
pFLAG-CTC
pFLAG-CTS
Nde I (CA/TATG)
1
−
2
−
Hind III (A/AGCTT)
1
2
2
2
Xho I (C/TCGAG)
1
2
2
2
Eco RI (G/AATTC)
3
1
1
1
Sma I (CCC/GGG)
2
3
3
3
Xma I (C/CCGGG)
2
3
3
3
Kpn I (GGTAC/C)
3
1
1
1
Asp 718 (G/GTACC)
3
1
1
1
Bgl II (A/GATCT)
3
1
1
1
Sal I (CG/TCGAC)
3
1
1
1
pFLAG-1TM and pFLAG-2TMExpression Vectors
（これらのベクターはキットには含まれていません。別個にご購入ください。）
MCSの特徴
・pFLAG-1（図9）およびpFLAG-2（図10）は同一のMCSを有しており、ベクター間でのORFの
交換が可能です。
・MCS内にのみ存在する制限酵素サイトを6個有しています。
・制限酵素切断により、5'突出末端が得られます。
・MCSのすぐ下流にはFLAG Peptideと同じリーディングフレームの翻訳終止コドン、およ
びリーディングフレームの異なる2つの終止コドンが存在しています。
他の特徴
・pFLAG-1はOmpAシグナルペプチド配列を有しており、アミノ末端FLAG融合タンパク質
をペリプラズムに発現させます。
・pFLAG-2はOmpAシグナルペプチド配列を持たず、細胞質内におけるMet-アミノ末端FLAG
融合タンパク質の発現が可能です。
15
pFLAG-Shift12 and pFLAG-Shift12c Expression Vectors
MCSの特徴
・pFLAG-Shift12（図11）およびpFLAG-Shift12c Expression Vector（図12）は、同一のマルチ
クローニングサイトを有しており、OmpAシグナルペプチド配列の有（pFLAG-Shift12）、
無（pFLAG-Shift12c）でのみ異なります。
・制限酵素サイトはpFLAG-MACおよびpFLAG-ATS Expression Vectorのものと互換性が
あります。
・制限酵素サイトは全リーディングフレームに対応しており、制限酵素切断により5'突出、
3'突出末端および平滑末端が生じます。
・MCSのすぐ下流に3つの各リーディングフレームに対応する翻訳終止コドンを有しています
（MCS内には終止コドンはありません）
。
注意：Xba Iはdamメチル化の影響を受けます。このサイトが必要とされる場合は、damマ
イナスのホスト株をご使用下さい。
FLAG-Shift Vectorの用途
FLAG-Shift Expression Vector17は一般にショットガンクローニング、cDNAあるいはゲノ
ムライブラリーからのクローニング等、ORFのリーディングフレームが不明な場合のタンパ
ク質発現に有効です。FLAG-Shift Expression VectorはFLAGコード配列とクローニングす
るORFの間に12個のチミジンから成る翻訳「シフト」配列を有しており、ORFの翻訳時に
FLAG配列とクローニングしたORFの連結部分で翻訳フレームシフト31-35が起こります。この
フレームシフトにより、発現されるFLAG融合タンパク質の中には正しいリーディングフレ
ームで翻訳されたものが含まれることになり、もともとクローニングしたORFのリーディン
グフレームとは無関係に適切なリーディングフレームのFLAG融合タンパク質を合成するこ
とが可能となります。各ベクターは同一の制限酵素サイトを同一のリーディングフレームで
有しており、ベクター間でORFを交換できます。
16
ベクター本体部分のその他の特徴
tac プロモーター
E. coli ホスト内におけるDNAコード配列の発現は、tac プロモーター25により制御されます。
このtacプロモーターはtrpプロモーターの-35コンセンサス配列とlacプロモーターの-10コン
センサス配列を組み合わせたものであり、E. coli において融合タンパク質を大量発現する際
に用いられるプロモーターの中でも、最も発現量が高く、最も広く使われているものの一つ
です。lac オペレーターはlaclリプレッサータンパク質の結合部位です。このlaclリプレッサ
ータンパク質は、FLAG融合タンパク質の翻訳を抑制します。lacl リプレッサーは同一のプ
ラスミド上にコードされており、laclqプロモーター（lacl に変異の加えられたもので、より
発現量の高いプロモーター）により構成的に合成されます。FLAG融合タンパク質の合成は
誘導により開始させます。この誘導は lac オペレーターをコードするFLAG Expression
Vectorで形質転換した細胞に、IPTG（Isopropylβ-D thiogalactoside）を添加することにより
行います。IPTGは特異的にlaclリプレッサータンパク質に結合し、リプレッサーがオペレー
ターに結合するのを妨げます。
致死的な影響を与えるおそれのある遺伝子産物は、発現量の大きなプロモーターの制御下に
おいた場合、抑制状態に保つことが重要です。また、非抑制状態における過剰なタンパク質
発現はホスト細胞が正常な増殖を維持する能力、および細胞のメンテナンス機能に過剰な負
担となるおそれがあります。tac プロモーターは、すでに多くの遺伝子で大量発現に使用され
ており、この目的に十分かなうことが証明されています。ただし、tac プロモーターからの発
現は必ずしも完全に抑制されないこともあり26、ある種の致死的遺伝子産物のクローニングに
は使用できないことがあります。
翻訳開始部位
翻訳開始部位はShine-Dalgarnoリボソーム結合部位のコンセンサス配列を含んでおり、ATG
翻訳開始コドンとの位置関係が最適となるように間隔を調整してあります。
OmpA シグナルペプチド
pFLAG-ATS、pFLAG-Shift12、pFLAG-CTSおよびpFLAG-1 Expression Vectorには63塩基
対、21アミノ酸のOmpAシグナルペプチドをコードする配列27が含まれています（図6、8、9、
11）。このOmpAシグナル配列は通常、E. coli 内に豊富に存在するタンパク質であるOmpA
（外膜タンパク質A）の分泌に関わっています。このOmpAシグナルペプチドはタンパク質が
内側の細胞質膜を通ってペリプラズムに輸送される際に、シグナルペプチダーゼによりFLAG
融合タンパク質から除去されます。
17
翻訳終止コドン
アミノ末端FLAGおよびFLAG-Shift Expression Vectorには、MCSの下流に3つすべてのリ
ーディングフレームに対応する翻訳終止コドンが存在しています。カルボキシル末端FLAG
発現ベクターはFLAG DNAコード配列のすぐ下流に、同じリーディングフレームの終止コ
ドンを1つだけ有しています。pFLAG-1およびpFLAG-2 Expression Vectorを除き、すべて
の E. coli FLAG Expression Vectorの MCS内には、終止コドンは存在していません。
pFLAG-1およびpFLAG-2発現ベクターのMCSは、FLAGペプチド･コード配列とはリーディ
ングフレームの異なる2つの終止コドンを含んでいます。
転写ターミネーター
クローニングした遺伝子の転写は、E. coli リボソームRNA転写ターミネーター（rrnB）26により
MCSの下流で強制的に停止します。2つ並んだ停止コドン（T1およびT2）がターミネーターと
して働きます。
選択マーカー
r
E. coli FLAG Expression Vectorはamp（アンピシリン耐性）
選択マーカーを有し、形質転換の
成功したE. coli の同定が可能です。アンピシリン耐性能（ampr）はプラスミド中のβ-ラクタ
マーゼ遺伝子によりコードされます。E. coli の培養培地に50∼100µg/mlのアンピシリンを
加えることで、FLAG Expression Vectorを持つクローンを選択できます。
複製起点
pORI
FLAG発現ベクターはcolE1 二本鎖複製起点によりE. coli ホスト内で複製を行う環状エピソ
ームです。ベクターの二本鎖DNAはクローニング、発現、制限酵素地図作成およびシークエ
ンシングに使用できます。
f1-ori
FLAGベクターは一本鎖DNAのクローニングおよびシークエンシングにも対応するように
設計されており、一本鎖DNA生成用に、f1-ori 複製起点29をプラスミド内にコードしてあり
ます。適切なE. coli 宿主にM13KO730ヘルパーファージを重感染させることにより、複製機
構をf1-ori による制御に切り替え、環状の一本鎖FLAG DNAを生成します。培地にカナマイ
シンを添加しておくと、ヘルパーファージが重感染した宿主だけを選択でき、FLAG発現ベ
クターのトップ鎖（プラス鎖）が、一本鎖としてえられます。（このプラス鎖にはFLAGマー
カーペプチドをコードする24塩基のDNA配列が含まれています。
）
18
FLAG-BAP Positive Control Plasmids
FLAG-BAP Positive Control Plasmidは、FLAG Peptideの融合したBAP（Bacterial Alkaline
Phosphatase）タンパク質（49kD）を発現させます。このプラスミドは他のFLAG融合タン
パク質の発現、アフィニティー精製および検出に対するポジティブコントロールとして
有用です（図13）。
pFLAG-ATS-BAP（図 13）は pFLAG-ATSまたは pFLAG-MAC Expression Vectorによる
ORF発現のためのコントロールです。pFLAG-1-BAP（図13a）はpFLAG-1またはpFLAG-2
Expression VectorによるORF発現のためのコントロールです（いずれもキットには含まれ
ない別売品です）
。pFLAG-CTS-BAP（図13b）はpFLAG-CTSまたはpFLAG-CTC Expression
VectorによるORF発現のコントロールとして適しています。pFLAG-Shift-BAP（図13c）は
pFLAG-Shift12またはpFLAG-Shift12cのいずれかによるORF発現のためのコントロールとして
働きます。各Positive Control Plasmidのベクター本体部分は、 E. coli FLAG Expression
Vectorと同一です（図5∼12）。
N-26 and C-24 Oligodeoxyribonucleotide Primers
N-26およびC-24 Oligodeoxyribonucleotide Primerは、挿入した遺伝子配列のアミノ末端ま
たはカルボキシル末端FLAG融合連結部分をシークエンシングする際に使用します。N-26お
よびC-24プライマーはサイクル･シークエンシングにも適しています。また、これらはFLAG
融合タンパク質の配列を修飾する際に、目的配列の増幅反応用プライマーとしても使用でき
ます。
N-26プライマーはDNAマイナス鎖（マップポジション：1∼26）に結合する26塩基のオリゴ
デオキシリボヌクレオチドです。この結合部位はE. coli FLAG Expression Vector のtac プ
ロモーターのすぐ上流に位置しています（図5∼13）。N-26プライマーはpFLAG-MAC、
pFLAG-ATS、pFLAG-1、pFLAG-2、pFLAG-Shift12およびpFLAG-Shift12c Amino-terminal
Expression Vector内にクローニングしたインサートのアミノ末端FLAG融合連結部分をシ
ークエンシングする際に使用します（図5、9∼12）。
C-24プライマーはFLAGコードDNAプラス鎖に結合する24塩基のoligodeoxyribonucleotideで
す。結合部位はFLAG Expression Vector MCSのすぐ下流、翻訳終止コドンと転写ターミ
ネーターの間に位置しています（図5∼13）
。C-24プライマーはpFLAG-CTSおよびpFLAG-CTC
Carboxy-terminal Expression Vector内にクローニングしたインサートのカルボキシル末端
FLAG融合連結部分をシークエンシングする際に使用します（図7、8）。
融合タンパク質の精製および検出に使用する他の試薬については、後のセクションで解説します。
19
挿入ORF連結部分の確認
単離したFLAGクローンのDNA配列が、FLAG融合連結部分で正しいリーディングフレーム
を有していることを確認する必要があります。制限酵素切断による解析は有効ですが、通常
それだけではFLAGインサート連結部分配列の厳密な確認には十分ではありません。確認は
以下のステップで行います。
・一本鎖DNAの単離
・ DNAのシークエンシング
一本鎖FLAG DNAの単離
成育培地
M9培地
1リットル分の組成（滅菌溶液）
200ml *5X M9 salts
20ml 20% glucose (sterile)
750ml deionized water (sterile)
*5X
64g
15g
25g
5g
M9salts (1 liter, sterile solution)
Sodium phosphate (Di-sodium salt)
Potassium phosphate (Mono potassium salt)
NaCl
Ammonium Chloride
2 X YT 培地
1リットル分の組織（滅菌溶液）
16g Bacto Tryptone
10g Yeast Extract
5g NaCl
20
一本鎖FLAG DNA13は、E. coli FLAG Expression Vectorにクローニングした遺伝子の操作に
有用です。FLAG Expression Vectorはファージf1･ori（f1複製開始点）29を含むファージミド
であり、このf1-oriにより、一本鎖DNAを含む細胞外ファージ粒子の生産が可能となってい
ます。ファージミド粒子はFLAG Expression Vectorのプラス鎖（コード鎖）を含んでいます
（FLAG Peptideのコード配列を含むDNA鎖）。ファージミド粒子は、FLAG Expression
Vectorを保持したE. coli をM13K0730ヘルパーファージで重感染することにより生成します。
下記のプロトコールでは、FLAGファージ粒子による一本鎖DNAの作成とその精製について
解説します。この一本鎖DNAはDNAの改変およびシークエンシングに有用です。FLAG
Expression VectorのMCSにクローニングしたORFのC末端をシークエンシングする場合、
C-24プライマーのみが正しい向きで結合します。一本鎖DNAの生成には、E. coli ホストが
F'遺伝子型を有していることが必須です。
1. ORFを組み込んだFLAG Expression Vectorを持つE. coli 細胞を、50μg/mlのアンピシリン
を加えたM9培地上にプレーティングします。この培地により、一本鎖生成に必要なF'表
現型が選択されます。
2. 37℃で一晩培養します。
3. プレート表面に250μg/mlのアンピシリンを含む2×YTを2ml加え、細菌を懸濁させます。
4. 1mlの細胞懸濁液を250μg/mlのアンピシリンを含む10mlの2×YTに加え、OD600が0.4∼0.6
になるまで培養します。
5. 250μg/mlのアンピシリンを含む50mlの2×YTを500mlフラスコに入れ、4の培養液を1 ml
加えて1/50に希釈し、37℃で30分間、振盪培養します。OD600を測定し、1mlあたりの細
胞数を概算します。
6. M13K07ヘルパーファージを感染の多重度（MOI）が20になるように加えます。30分間培
養した後、70μlの50mg/mlカナマイシンを加え、6時間、振盪培養を続けます。このとき、
培養時間を長くするとDNAの欠失を招くおそれがあります。
7. 17,000×gで30分間遠心して細胞をペレット化し、上清を回収、濾過します。上清1mlあた
り20%ポリエチレングリコールと3.5M酢酸アンモニウムを各0.25mlずつ加えます。転倒混
和して、氷上に2∼48時間静置します。
8. ステップ7と同様に遠心し、上清を除去します。このとき、小さな白いペレットが見られます。
9. 300∼700μlのTEを加えて、ボルテックスを使って溶解し、マイクロ遠心チューブに移します。
21
10. 等量の新鮮な蒸留フェノールを加え、1∼2分間ボルテックスにかけます。遠心し、白い
中間層を乱さないようにして、水層を回収します。
11. 等量の25:24:1フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコールを用いて抽出します。か
すかに白い中間層が見えるまで、4∼6回抽出を続けます。
12. 等量の24：1 クロロホルム／イソアミルアルコールで抽出し、上側の水層を回収します。
13. この水層に1/2量の7.5M酢酸アンモニウムと2倍量のエタノールを加え、-20℃で一晩ある
いは-70℃で30分間冷却し、エタノール沈殿を行います。ペレットは70%エタノールで洗
浄し、空気乾燥または真空乾燥機で乾燥させます。
14. DNAを20∼40μlの蒸留脱イオン水に溶解します。
FLAG融合体連結部分の確認
バッファー
目的のインサートを持つクローンの同定後は、さらに操作を続ける前にDNAを単離し、
FLAG融合体連結部分の配列を確認することをお勧めします。
N-26プライマーはORF の5'末端部分のDNAをシークエンシングする際に使用します。これは
FLAG融合タンパク質のアミノ末端融合連結部分に相当します。また、このプライマーはカル
ボキシル末端FLAG融合タンパク質のアミノ末端をシークエンシングする際にも使用します。
N-26シークエンシングプライマーはtacプロモーターのすぐ上流（ポジション：1-26）でDNAの
マイナス鎖側に結合します。このマイナス鎖はFLAG Expression VectorのFLAG DNAコー
ド配列を含む鎖に相補的な配列の鎖です。このプライマーの配列は以下の通りです。
N-26 Primer: 5' - CAT CAT AAC GGT TCT GGC AAA TAT TC - 3'
Sequencing of N-terminal FLAG fusion junctions
22
FLAG Expression Vectorのtacプロモーターおよびリボソーム結合部位のDNA配列は、2次構
造を形成します。この2次構造の影響により、DNAシークエンシングゲル上でバンドの圧縮
および他の問題が生じることがあります。このため、アミノ末端FLAG融合連結部分を確認
する場合、およびアミノ末端、カルボキシル末端FLAG融合タンパク質をシークエンシング
する場合は7-deaza-dGTPを使用し、両方の鎖をシークエンシングすることをお勧めします。
C-24プライマーはE. coli FLAG Expression Vector に組み込んだORFの3'末端DNAをシーク
エンシングする際に使用します。これはFLAG融合タンパク質のカルボキシル末端融合連結
部分に相当します。また、このプライマーはアミノ末端FLAG融合タンパク質のカルボキシ
ル末端をシークエンシングする際にも使用できます。C-24シークエンシングプライマーは
FLAG Expression VectorのDNAプラス鎖（FLAG DNAコード配列を含む鎖）に、MCSのす
ぐ下流で結合します。C-24プライマーは以下の配列を有しています。
C-24 Primer: 5' - CTG TAT CAG GCT GAA AAT CTT CTC - 3'
Sequencing of C-Terminal FLAG fusion junctions
表7に各E. coli FLAG Expression VectorのMCS 5'末端からN-26プライマー3'末端までの距
離、およびMCS 3'末端からC-24プライマー3'末端までの距離をまとめました。また、本マニ
ュアル巻末のE. coli FLAG Expression Vectorマップも参照してください。
表7．Distances in Base Pairs of FLAG Primers from the 5' & 3' ends of
E. Coli FLAG Expression Vectors
pFLAG-ATS
pFLAG-MAC
pFLAG-CTS
pFLAG-CTC
pFLAG-Shift-12
pFLAG-Shift-12c
N-26 Primer
(5' End)
172
112
202
150
186
126
23
C-24 Primer
(3' End)
21
21
48
48
21
21
N-26およびC-24プライマーを用いた二本鎖シークエンシング
以下のプロトコールはN-26あるいはC-24プライマーを用いて、各塩基に対応する4つのシーク
エンシング反応を2セット（G、A、T、Cの各反応を2回ずつ）行うのに十分な量のプライマー
と鋳型が得られるように設計されています。最初のセクションでは、NaOHを用いた鋳型の
アルカリ変性について説明します。2番目のセクションでは、N-26およびC-24プライマーの
FLAG鋳型へのハイブリダイゼーション･プロトコールについて説明します。これらのプライ
マーはFLAG融合連結部分に相当する短い領域のシークエンシング用に設計されていますが、
通常の方法により400塩基ほどのDNA配列を読むことが可能です。
変性鋳型FLAG DNAの調製
1. 70μlの1×TE（10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0）に溶解した7μgの高度精製
FLAG DNAに5M NaOHを3μ
（1/25量）加え、37℃で5分間、変性させます。
2. 以下の組成で混合した酢酸カリウムとイソプロパノールの混合液を150μl（2倍量）加え、
室温で30分間、変性FLAG DNAを沈殿させます。
酢酸カリウム／イソプロパノール400mlの作成法：
以下の試薬を混合して、100mlの酢酸カリウムを調製します。
60ml
5M 酢酸カリウム
11.5ml 氷酢酸
28.5mlの脱イオン水により最終体積を100 mlとします。
300mlのイソプロパノールを上記の酢酸カリウム混合液に加えます。
3. 10,000×gで5分間遠心し、沈殿した変性FLAG DNAを回収します。
4. 1mlのエタノールでFLAG DNAを洗浄し、乾燥させます。
5. FLAG DNAを20μlの1×TEに溶解します。最終濃度は0.35μg/μlとなります。必要
であれば、この時点で不可逆的に変性したFLAG鋳型DNAを-20℃で保存できます。
24
N-26およびC-24シークエンシングプライマーのFLAG DNAのプライミング
以下のプロトコールでは、上で調製した変性FLAG鋳型DNAの半量（10μl）を使用します。こ
れは4塩基のシークエンシング反応1セット分（G、A、T、Cを1反応ずつ）に対応しています。
1. N-26シークエンシングプライマーをバイアルから3μl分取し、6μlの1×TEを加えて
最終体積9μlとし、シークエンシングプライマーを5pmol/μlの初期濃度から1.67
pmol/μlの最終濃度に希釈します。
2. 2∼3μl（3.5∼5pmol）のシークエンシングプライマーを10μl（1pmol）の変性FLAG鋳
型DNAに加えます。
3. 最終バッファー濃度が1×となるように、適量のシークエンシングバッファーを加
え、12∼13μlのプライマー／FLAG鋳型DNA混合液を70℃で2分間、加熱します。
4. 20分ほどかけて徐々に混合液を室温まで冷やします。
5. プライミングしたFLAG鋳型DNAを4つのチューブに分注し、G、A、T、Cの各DNA
シークエンシング反応で使用します。以上でプライマー／FLAG鋳型混合液をシー
クエンシングに用いる準備が完了しました。
タンパク質発現宿主
すべてのE. coli FLAG Expression Vectorにはlacl リプレッサータンパク質をコードする配
列が含まれています。このため、E. coli FLAG Expression Vectorのtacプロモーターによる
大量発現に使用する宿主細胞としては任意の株を使用可能ですが、タンパク質発現時の問題
発生を避けるためにrecA 株を使用しておくことが最良です。このrecA 株を使用することで、
組換え現象によるDNAの再編成を最小限に抑えることができます。ただし、タンパク質発
現の成否は、主にタンパク質自体の性質に依存します。
特定のホスト株を使用したデータが得られていない場合、タンパク質と宿主の組み合わせは
実験的に決定する必要があります。プロテアーゼ欠損株であれば、融合タンパク質の酵素分
解を最小限に抑制、あるいは除外できます。しかし、タンパク質分解の問題を解決すること
を保証できる株というものはありません。
25
DH5αとBL21（プロテアーゼ欠損株）は最も広く使用されている宿主株であり、FLAG融合
タンパク質を発現させる場合にも第一に試験すべき菌株といえます。これらはATCCから容
易に入手可能です。当社では宿主株としてLE392、LL308およびJM103を用いて、モデル
FLAG融合タンパク質であるFLAG-BAPの発現に成功しています。LE392およびJM103株も
ATCCから入手できます。ただし、上記の宿主は全てのFLAG融合タンパク質の発現に対し
て推奨されるものではないことに注意してください。
FLAG融合タンパク質の発現プロトコール
FLAG融合タンパク質を発現する形質転換体のスクリーニング
・ANTI-M2 Monoclonal Antibodyを用いて、融合タンパク質の発現をスクリーニングします。
この抗体はFLAG融合タンパク質内の任意の位置に挿入されたFLAGマーカーに結合します。
・SDS-PAGEまたはウェスタンブロットにより、予想される分子量を持つタンパク質の発現
を確認します。
以下のコントロールを使用します。
ネガティブコントロール：ORFをクローニングしていないFLAG Expression Vectorからの
タンパク質。
ポジティブコントロール：M2 Monoclonal Antibodyおよび検出系の他の成分が機能してい
ることを示すためのFLAG-BAPポジティブコントロール･タンパク質。
26
E. coli の培養プロトコル：
増殖培地：滅菌LB 培養液（1L）
10g Bacto Tryptone
10g NaCl
5g Bacto Yeast Extract
バッファー：SDS-PAGEサンプルバッファー
400mM DTT
200mM Tris-HCl (pH 6.8)
40%
glycerol
8%
SDS
0.4%
Bromophenol Blue
1. 個々のコロニーを50μg/mlのアンピシリンおよび0.4%のグルコースを含む5mlのLB
培地に植え付け、37℃で一晩培養します。
2. 通気を良くするために125mlフラスコを用い、50μg/mlのアンピシリンおよび0.4%
のグルコースを含む5mlのLB培地（前もって温めておきます）で1の培養液を1:100に
稀釈し、37℃で振盪培養します。
3. OD600が0.2のときに誘導前の培養液を0.5ml取り、マイクロ遠心チューブに移します。
細胞をペレット化した後、25μlのSDS-PAGEサンプルバッファーで再懸濁し、
95℃で5分間、加熱します。残りの培養液には0.5mMの濃度でIPTGを加え、37℃
で2時間、培養を続けます。
4. 誘導の2時間後に0.5mlをマイクロ遠心チューブに移し、細菌をペレット化した後、
100μlのSDS-PAGEサンプルバッファーでペレットを再懸濁し、95℃で5分間、加
熱します。
5. SDS-PAGEまたはANTI-FLAG M2 Monoclonal Antibodyを用いたウェスタンブロッ
トにより、誘導前および誘導後のサンプルを分析します（50ページをご参照下さい）
。
27
融合タンパク質発現の最適化
融合タンパク質の発現には多くの因子が関与しています。最適化を行う際に重要となる条件
としては、以下の因子が挙げられます。
・
・
・
・
・
発現に使用する宿主株
FLAG融合タンパク質の生化学的性質および、それがホスト株に与える生理学的影響
初期誘導時間
誘導温度
誘導時間の長さ
当社のデータによると、LE392ホストにおけるFLAG-BAP融合タンパク質の発現は0.4%グ
ルコースおよび50μg/mlアンピシリンを含むLB培地中、37℃で対数増殖期（OD600＝1.0）ま
で培養した後、500μMのIPTGにより2時間、誘導を行った場合に最適な結果を示しました。
ただし、ここに挙げた条件は全てのFLAG融合タンパク質に対して推奨されるものではない
ことに注意してください。
1. FLAG融合タンパク質を発現しているE. coli を、50μg/ml アンピシリンおよび0.4% グル
コースを含むLB培地により37℃で一晩培養します。
2. 一晩培養した培養を50μg/ml アンピシリンおよび0.4% グルコースを含むLB培地20mlに
より1:100に稀釈し、OD600が0.2∼1.0になるまで37℃で培養を続けます。このとき、発現
量を改善するために、ODあるいは温度を変更してもかまいません。
3. 誘導前の培養液を0.5ml、マイクロ遠心チューブに取り、細菌をペレット化し、25μlの
SDS-PAGEサンプルバッファーで再懸濁します。95℃で5分間加熱した後、凍結して保
存します。
4. 残りの培養液には500μMの最終濃度でIPTGを加え、37℃で培養を続けます。
5. 誘導の2、4、6時間後にOD600を測定し、培養液の一部を分取します。LB培地でIPTGに
よる初期誘導時と等しいODになるように稀釈します。0.5mlをマイクロ遠心チューブに
取り、細胞をペレット化します。25μlのSDS-PAGEサンプルバッファーをペレットに加
え、95℃で5分間加熱し、凍結して保存します。
6. ANTI-FLAG M2 Monoclonal Antibodyを用いたウェスタンブロットにより誘導前と誘
導後のサンプルを分析し、タンパク質発現量を測定します。
28
7. 発現量をさらに改善する必要がある場合は、誘導条件あるいは宿主を変更します。
注意：最初の試みでタンパク質発現が満足できるものでなかった場合は、別の宿主を形質転
換する前に、誘導条件を最適化をご検討ください。
FLAG融合タンパク質の単離
FLAG融合タンパク質の分画
（分析用）
以下のプロトコルでは、FLAG融合タンパク質がE. coli のペリプラズム（ステップ9）、可溶
性全細胞画分（ステップ15）、不溶性全細胞画分（ステップ16）または培養液中（ステップ4c）
のどの画分に存在しているかを試験します。
この分画の結果に応じて、FLAG融合タンパク質を単離･調製する際に（1）浸透圧衝撃処理、
（2）全細胞抽出、
（3）全細胞抽出および界面活性剤、変性剤によるFLAG融合タンパク質の可
溶化、
（4）ゲル濾過による培養上清バッファー交換、のいずれを使用するかを決定します。
ORFをpFLAG-1、pFLAG-ATS、pFLAG-CTSまたはpFLAG-Shift12 Expression Vectorにク
ローニングし、タンパク質をペリプラズムに分泌させた場合はプロトコールの全ステップに
従って下さい。pFLAG-1、pFLAG-ATSまたはpFLAG-Shift12 Expression Vectorにより発
現されたアミノ末端FLAG融合タンパク質がペリプラズム画分に局在する場合は、次の浸透
圧衝撃処理による単離･調製のセクションに進んで下さい。浸透圧衝撃処理の後、ANTIFLAG M1 Affinity GelとEDTAによるキレーション、あるいはANTI-FLAG M2 Affinity
GelとFLAG Peptideによる競合溶出により、タンパク質を精製します。pFLAG-CTS
Expression Vectorにより発現、ペリプラズムへと分泌させたFLAG融合タンパク質の精製
にはANTI-FLAG M2 Affinity Gelのみが使用可能です（図3および表1）。
29
ORFをpFLAG-2、pFLAG-MAC、pFLAG-CTCまたはpFLAG-Shift12c Expression Vectorに
クローニングした場合、融合タンパク質は細胞質内でのみ発現されます。この場合、浸透圧
衝撃処理は必要なく、このプロトコールのステップ1∼4および10∼15のみに従って下さい。
タンパク質が全細胞抽出液に分画される場合、全細胞抽出液を用いた単離･調製のセクショ
ンに進んで下さい。その後、ANTI-FLAG M2 Affinity Gelとペプチド溶出により精製しま
す（図3および表1）。タンパク質が不溶性画分に局在する場合、ANTI-FLAG M2 Affinity
Gelによるアフィニティー精製の前に、界面活性剤または変性剤により可溶化する必要があ
ります。可溶化が必要な場合は必ずANTI-FLAG M1またはM2 Affinity Gelと共に使用可能
な試薬を選択して下さい。
E. coli で発現させた外来タンパク質がペリプラズムに分泌されない場合があります。例えば、
真核生物タンパク質をE. coli 内で発現させた場合、不溶性の封入体を形成することが多々あ
ります36-38。この封入体の形成は不適切なジスルフィド架橋やグリコシル化により、折りた
たみが正しく行われないために引き起こされます。タンパク質の安定性および可溶性には、
正しいグリコシル化およびジスルフィド架橋が必要です。FLAGマーカーは親水性で分子量
も小さなペプチドであり、不適切な折りたたみを引き起こす可能性は低いと言えます。また、
目的タンパク質が膜タンパク質または受容体タンパク質である場合は、疎水性領域を持つ可
能性が高く、OmpAを融合して発現させた場合でもE. coli の内部原形質膜を通過できないこ
とがあります。
目的タンパク質が不溶性全細胞画分に局在する場合は、誘導温度の変更38または界面活性剤、
変性剤による可溶化が必要なことがあります36,37。
30
Whole Cell Sample
1. 50μg/mlのアンピシリンおよび0.4%のグルコースを含むLB培地により、37℃または以前
に最適化した温度で一晩、細菌を培養します。注意：ある種のタンパク質は30℃で、より
分泌効率が高くなります。また、不溶性タンパク質の中には23℃では可溶性となるものが
あります。
2. 100mlの50μg/mlのアンピシリンおよび0.4%のグルコースを含むLB培地で培養液を1:100
に稀釈します。このとき、フラスコは500mlのものを使用します。OD600が0.2または以前
に最適化した誘導ODに達するまで、37℃で振盪培養します。
3. IPTGを500μMとなるように加え、37℃で2時間または以前に最適化した誘導時間だけ培
養を続けます。0.5mlを分取、遠心し、上清を別の容器に移します。次にペレットを25μl
のSDS-PAGEサンプルバッファーで再懸濁し、95℃で5分間、加熱します。このWhole Cell
Sampleは凍結保存します。
4. 残りの培養液を2つに分け、各サンプルを5,000×gで10分間、10℃で遠心して細胞をペレ
ット化します。
（a）このペレットは浸透圧衝撃法（ステップ5∼9）により、FLAG融合タンパク質がペ
リプラズム画分に存在するかを調べるために使用します。注意：凍結･解凍処理
は細胞の破壊を引き起こし、その結果、ペリプラズムに細胞質性タンパク質が混
入するため、このサンプルの凍結は行わないで下さい。
（b）もう一つのペレットは全細胞抽出液（ステップ10∼15）を可溶性（ステップ14）画
分および不溶性画分（ステップ15）へと分画するために使用します。このペレット
は全細胞分画の準備が整うまで、-70℃で凍結保存します。
（c）サンプル（a）または（b）の培養上清1mlを-70℃で保存します。この上清サンプルは
FLAG融合タンパク質が培養液中に分泌されているかを調べるために、ウェスタン
ブロットにより分析します。
31
ペリプラズム画分の浸透圧衝撃処理
浸透圧衝撃用バッファー（細胞1gあたり40mlを使用します）
500mM Sucrose
30mM Tris-HCl (pH 8)
1mM EDTA
5. （4a）のペレットを室温まで温め、細胞1gあたり40mlの0.5M sucrose, 0.03M Tris, 1mM
EDTA, pH8.0で再懸濁します。ORFをpFLAG-2、pFLAG-MAC、pFLAG-CTCまたは
pFLAG-Shift12c Expression Vectorにクローニングした場合は、サンプルにOmpAシグナル
ペプチドは含まれないため、これを省略し、ステップ10に進みます。
6. 浸透圧衝撃を与えるため、3,500×gで10分間、10℃で遠心します。
7. 上清を除去し、ペレット細胞1gあたり25mlの冷蒸留水で素早く再懸濁します。
8. 3,500×gで10分間、4℃で遠心します。
9. 直ちに上清を回収し、50μlのSDS-PAGEサンプルバッファーと50μlの上清を混合した後、
95℃で5分間加熱します。このペリプラズム画分は電気泳動の準備が整うまで凍結します。
残りの上清は、必要な場合、凍結します。
32
全細胞抽出液：可溶性および不溶性画分
バッファー：
抽出バッファーA
50mM
Tris-HCl, pH 8.0
5mM
EDTA
0.25mg/ml lysozyme
50μg/ml sodium azide
抽出バッファーB
1.5M
NaCl
0.1M
CaCl2
0.1M
MgCl2
0.02mg/ml DNase
0.05mg/ml Ovomucoid protease inhibitor
10.（4b）の全細胞サンプルを解凍して室温に戻します。
11. 抽出バッファーAを5ml加えます。室温で5分間または細胞が溶解するまでインキュベート
します（サンプルの粘性が高くなります）。注意：E. coli 細胞の溶解にリゾチームを使用
する場合、SDSゲルに約14kDの濃いタンパク質バンドが生じます。このバンドが以降の
分析で邪魔になる場合は、超音波処理により細胞を破砕してください。
12. 抽出バッファーBを0.5ml加えます。室温で5分間または粘性がなくなるまでインキュベー
トします。
13. 18,000×gで30分間、遠心します。
14. 可溶性の全細胞画分を含む上清を回収し、50μlの上清と50μlのSDS-PAGEサンプルバッ
ファーを混合します。これを95℃まで加熱し、凍結保存します。残りの懸濁液は必要であ
れば、凍結保存します。
15. 不溶性の全細胞物質を含むペレットを5mlの抽出バッファーAで再懸濁し、この溶液50μl
と50μlのSDS-PAGEサンプルバッファーを混合します。これを95℃まで5分間加熱し、凍
結保存します。残りの懸濁液は必要であれば、凍結保存します。
33
全細胞画分（ステップ3）
、培養液サンプル（ステップ4c）
、ペリプラズム･サンプル（ステップ9）
、
可溶性全細胞画分（ステップ14）、および不溶性全細胞画分（ステップ15）を適切なコントロ
ールと共に、SDS-PAGEまたはANTI-FLAG M2 Monoclonal Antibodyを用いたウェスタン
ブロットにより分析します。
FLAG融合タンパク質が主にペリプラズムに存在する場合は（サンプル9）、次のセクション
に解説する浸透圧衝撃処理をアフィニティー精製の前に行い、融合タンパク質を調製します。
FLAG融合タンパク質が可溶性全細胞画分に存在し、ペリプラズム･サンプルには含まれな
い場合は（サンプル14）、後に説明する全細胞抽出液から融合タンパク質を調製します。
FLAG融合タンパク質が不溶性全細胞画分に局在している場合は（サンプル15）、ANTIFLAG M1またはM2 Affinity Gelによる精製の前に、界面活性剤を用いて調製用全細胞抽出
液のFLAG融合タンパク質を可溶化します（FLAG融合タンパク質のイムノアフィニティー
精製に関するセクション中の界面活性剤に関わるセクションを参照して下さい）。目的タン
パク質が培養液中に分泌されている場合は（サンプル4c）、適切なカラムローディングバッ
ファー（TBSまたはTBS/Ca）を用いて、Sephadex G-25カラムにより、上清を脱塩します。
必要であれば、交換バッファーにタンパク質コファクター（protein cofactors）および（また
は）プロテアーゼ阻害剤を加えます。
FLAG融合タンパク質の単離（調製用）
浸透圧衝撃法によるペリプラズムからのタンパク質の単離
以下に述べる浸透圧衝撃処理は、ペリプラズムに分泌されるFLAG融合タンパク質の調製に
適しています。
1. 最適化した増殖および誘導条件に従い、細胞を培養します。
注意：FLAG融合タンパク質の増殖および発現の最適条件については、前述の「発現の最適
化」に関するセクションをご参照ください。
2. 5,000×gで10分間、10℃で遠心し、細胞を回収します。
34
3. 室温で0.1mMストックから蒸留水で稀釈した10mM Tris-HCl（pH 8.0）で細胞を懸濁しま
す。細胞1gあたり40∼80mlを使用します。
4. 3,500×gで10分間、10℃で混合液を遠心します。
5. 上清を除去し、室温で10mM Tris-HCl（pH 8.0）によりペレットを懸濁します。
6. 3,500×gで10分間、10℃で遠心します。
7. 室温で0.5M Sucrose, 0.03M Tris（pH 8.0）, 1 mM Na2EDTAにより細胞ペレットを懸濁
します。細胞1gあたり40mlを使用します。
8. 3,500×gで10分間、10℃で遠心します。
9. 上清を除去し、即座に細胞1gあたり25∼35mlの氷冷蒸留水で細胞ペレットを懸濁します。
10. 3,500×gで10分間、4℃で混合液を遠心します。
11. 上清を直ちに回収します。
12. 等量の2×TBS（pH 7.4）を上清に加えます。
13. 最終濃度が1mMとなるようにCaCl2を加えます。CaCl2はANTI-FLAG M2 Affinity Gelを
用いた精製では省略してもかまいません。
14. 25,000×gで60分間、4℃で混合液を遠心します。
15. 直ちに上清を回収します。
16. 上清をWhatman No 1濾紙を用いて濾過します。
17. 上清をANTI-FLAG M1またはM2 Affinity Gelにアプライします。
35
FLAG融合タンパク質の全細胞抽出液
バッファー：
抽出バッファーA
50mM
Tris (pH 6)
5mM
EDTA
0.25 mg/ml lysozyme
50μg/ml Sodium Azide
抽出バッファーB：
1.5M
NaCl
100mM
Calcium Chloride
100mM
Magnesium Chloride
0.02 mg/ml DNaseⅠ
50μg/ml Ovomucoid protease inhibitor
以下のプロトコールは、可溶性および不溶性全細胞画分中に発現されたタンパク質の調製に
使用します。
1. 前もって最適化した条件に従い、培養および誘導を行います。500mlの培養を5,000×gで
5分間遠心し、E. coli 細胞をペレット化します。
2. 細胞を50mlの抽出バッファーAで懸濁します。室温で5分間または細胞が溶解するまでイ
ンキュベートします（サンプルの粘性が高くなります）。
3. 5mlの抽出バッファーBを加えます。室温で5分間またはサンプルの粘性が無くなるまでイ
ンキュベートします。
4. 25,000×gで1時間、4℃で遠心します。
5. 目的タンパク質が主に可溶性画分に発現される場合は上清を回収し、ANTI-FLAG M1
またはM2 Affinity Columnにアプライします。タンパク質が主に不溶性画分に存在する
場合は、アフィニティー精製の前に画分をペレット化し、界面活性剤または変性剤を用い
て可溶化します。可溶化剤にはANTI-FLAG M1またはM2 Affinity Gelと共に使用可能
な試薬を選択して下さい。
36
FLAG融合タンパク質のイムノアフィニティー精製
FLAG融合タンパク質の精製に使用するANTI-FLAG Affinity Gelは、主に融合タンパク質
の融合様式に応じて選択します。 ANTI-FLAG M1 Affinity Gelは ORFを pFLAG-ATS、
pFLAG-1またはpFLAG-Shift12 Expression Vectorにクローニングして発現させたアミノ末
端FLAG融合タンパク質の精製に使用します（表1および図3）
。FLAG融合タンパク質のANTIFLAG M1 Affinity Gelからの溶出はEDTA、EGTAなどのカルシウム･キレート剤を用い
て、あるいはFLAG Peptideによる結合の競合を用いて温和な条件で行うことが可能です。
グリシン-HCl（pH 3.5）による溶出も可能ですが、これは非常に過酷な条件であり、目的タンパ
ク質が酸性pHにより変性するおそれがあります。ANTI-FLAG M2 Affinity Gelはアミノ末
端およびカルボキシル末端FLAG融合タンパク質の精製に使用できます（表1および図3）。
ANTI-FLAG M2 Affinity GelからのFLAG融合タンパク質の溶出は、FLAG Peptideの競合に
より温和な条件で、あるいはグリシン-HCl（pH 3.5）で行えます。
使用する溶出条件は目的タンパク質の性質に応じて選択します。EDTAはEGTAに比べ、よ
り非特異的に2価陽イオンをキレートし（EGTAは選択的にカルシウムをキレートします）
、よ
り効果的にANTI-FLAG M1 Affinity GelからFLAG融合タンパク質を溶出させます。溶出はカ
ルシウムを欠くバッファーを用いて行うことも可能です。一般に、カルシウムを含まないバ
ッファーによりFLAG融合タンパク質を溶出させた場合、EDTAを用いた場合よりも多くの
画分で溶出が起こります。ペプチド溶出は目的タンパク質の活性にEDTAまたはEGTAによ
りキレートされる2価陽イオンが必要とされる場合に有効です。また、ペプチド溶出は温和で
経済的な方法であり、ANTI-FLAG M2 Affinity Gelを用いてFLAG融合タンパク質を精製する
際には、グリシン-HCl（pH 3.5）溶出よりも適しています。
ANTI-FLAG M1およびM2 Affinity Gelは、理論的にANTI-FLAG Affinity Gel 1 mlあたり
40nmolのFLAG融合タンパク質と結合できます。適切な条件下では、これらは20回以上、再
利用可能です。アフィニティゲルがFLAG融合タンパク質により飽和するようにゲルの使用
量を調節すると、最良の結果が得られます。また、これにより、カラムに混入したタンパク
質による非特異的結合が最小限に抑えられます。当社で FLAG-BAP Positive Control
Proteinを精製した際、TBSバッファーを用いたカラムの流速は0.5∼1 ml/m.でした。しか
し、粘性、微粒子状物質の存在およびカラムの充填特性により、流速は大きく減少します。
DTTやメルカプトエタノール（Mercaptoethanol）などの還元剤がカラムローディングバッフ
ァーに含まれている場合、ANTI-FLAG Monoclonal Antibodyのheavy chainとlight chainを結
ぶジスルフィド結合が還元されます。これにより、ANTI-FLAG Monoclonal Antibodyがアフ
ィニティゲルから溶脱し、結合能が喪失するおそれがあります。
37
バッチモードで使用する場合は、カラムバッファーを過剰（ただし5倍量以下）に加え、FLAG融
合タンパク質とゲルを混合し、4℃で一晩、転倒混和して攪拌して下さい。この後、2,000×gで
遠心し、ゲルビーズをペレット化します。バッファーによる稀釈が過剰な場合、FLAG融合タ
ンパク質とゲルとの結合が遅くなるおそれがあります。しかし、これら条件の最適化により、
目的FLAG融合タンパク質の回収率を改善することが可能です。
ANTI-FLAG M1 Affinity Gelを用いたFLAG融合タンパク質の精製
Buffers:
TBS BUFFER
50mM Tris-HCl (pH 7.4)
150mM NaCl
TBS/Ca BUFFER
50mM Tris-HCl (pH7.4)
150mM NaCl
1mM Calcium Chloride
TBS/EDTA
50mM Tris-HCl (pH7.4)
150mM NaCl
2mM EDTA
TBS/A
50mM Tris-HCl (pH7.4)
150mM NaCl
0.02% Sodium Azide
38
カラムを平衡化し、すべてのバッファーを目的タンパク質の精製に適切な温度に合わせます。
熱に不安定なタンパク質は4℃で精製し、光に不安定なタンパク質は光強度を抑えた条件下
で精製する必要がありますが、ほとんどの場合、室温での精製が可能です。プロテアーゼが
問題となる場合は、4℃でカラムクロマトグラフィーを行います。細胞の残骸および微粒子
はカラムを詰まらせるおそれがあるため、除去する必要があります。染色体DNAやRNAを
含んだ粘性の高いサンプルもカラムを詰まらせるおそれがあるため、超音波処理またはヌク
レアーゼ処理を行い、粘性を減らします。また、精製過程中にFLAG-BAP ポジティブコン
トロールタンパク質を用いた対照実験を含めると有益な場合があります。
ANTI-FLAG M1 Affinity Gelは以下の界面活性剤：5.0%以下のTween-20、5.0% Triton X100、0.1% NP-40、0.1% CHAPS、0.2% Digitoninに対して耐性です。また、1.0M以下の
NaClあるいは1.0Mの尿素と共に使用することもできます。SDS、デオキシコール酸およびグ
アニジン-HCl（Guanidine-HCI）の存在下ではゲルを使用しないでください。
カラムの準備
注意：以下のプロトコールは1mlカラム用です。
1. 空のクロマトグラフィーカラムを安定な支持台に設置します。
2. 上部および下部のタブを取り除き、カラムをTBSで2回すすぎます。バッファーをカラ
ムから排水し、カラム内に残ったTBSは次のステップでANTI-FLAG M1 Affinity Gelを
充填しやすいように、そのままにしておきます。
注意：流速を制御するために、排水チューブをカラムに取りつける場合、チューブの長さは
25cm以下に抑えてください。
3. ANTI-FLAG M1 Affinity Gelを完全に懸濁させ、ゲルビーズを一様なスラリー状にした
後、直ちにスラリーをカラムに移します。
4. ゲルベッドの排水を行った後、バイアルをTBSですすぎ、すすぎ液をカラムに加え、
再び排水します。
注意：通常条件下では、過剰に溶液を排水してもゲルベッドがひび割れることはありません
が、ゲルベッドは乾燥させないようにして下さい。
39
カラムの洗浄
1. 5mlのグリシン-HCl（pH 3.5）で3回、次いで、5mlのTBSで3回ゲルを洗浄します。バッフ
ァーを加える際にゲルベッドを乱さないようにし、また、次の溶液を加える前に、前の
溶液を完全に排水させます。このとき、カラム内にグリシン-HClを20分以上留まらせな
いようにして下さい。
2. 以上でカラムが使用可能となります。
FLAG融合タンパク質のカラムへの吸着
1. FLAG融合タンパク質をANTI-FLAG M1 Affinity Columnに効率良く結合させるために
は、pHが7.0で0.15M塩化ナトリウムとカルシウムが含まれている必要があります。目的の
培養細胞層または培養上清をANTI-FLAG M1 Affinity Columnにローディングする前に、
カラムに少なくとも1mMのCaCl2が含まれていることを確認してください。
注意：サンプルに微粒子が含まれている場合は、カラムにアプライする前に遠心または濾過
を行ってください。粘性の高いサンプルはDNase処理または超音波処理を行う必要が
あります。
2. 重力落下によりサンプルをカラムにローディングします。サンプル量が多い時は、数回
に分けてサンプルをローディングするか、12mlカラムリザーバー(column reservoir)を取
り付けてローディング量を増やします。タンパク質の種類および流速によっては、抗原
の一部しか結合しないことがありますが、結合効率はカラムに複数回通すことにより改
善できます。
3. 12mlのTBS/Ca（1mM CaCl2を含むTBS ）で3回カラムを洗浄します。
グリシンを用いた酸溶出によるFLAG融合タンパク質の溶出
1mlの0.1 Mグリシン（pH 3.5）により、カラムに結合したFLAG融合タンパク質をバイアルに
溶出させます。この際、各バイアルには15∼25μlの1M Tris（pH8.0）を入れておきます。こ
の操作を6回繰り返します。グリシン-HClはカラム内に20分以上留まらせないようにして下
さい。
キレート剤（EDTA）によるFLAG融合タンパク質の溶出
カルシウムイオンをキレートするために、カラムに1mlのTBS/EDTA（2mM EDTAを含む
TBS）を加えて30分間インキュベートします。次いで1mlを10分間隔で流します。FLAG融
合タンパク質の溶出には、通常6回の溶出で十分です。
40
FLAG Peptideを用いた競合によるFLAG融合タンパク質の溶出
カラムを完全に排水させます。結合したFLAG融合タンパク質を、FLAG Peptideにより競
合溶出させます。
FLAG-BAP（細菌アルカリホスファターゼ）および目的融合タンパク質は、1mlの100μg/ml
FLAG Peptide（TBSに溶解）で溶出させます。通常5カラム量（1ml X 5回分）で溶出させる
ことができますが、カラム充填状態、流速およびFLAG融合タンパク質が持つ特性により、
ペプチドの溶出効率が変わることがあります。
カラムの保存
5mlのTBS/A（0.02%のアジ化ナトリウムを含むTBS）で3回洗浄し、再度5mlのTBS/Aを加
えて、排水せずに4℃で保存します。
カラムのリサイクル
カラムは使用後直ちに5mlの0.1Mグリシン-HCl（pH 3.5）で3回洗浄し、再生させて下さい。
このとき、直ちにカラムをTBSにより再平衡化する必要があります（流出液のpHが中性にな
るまで）。ANTI-FLAG M1 Affinity Gelカラムは適切に扱うことで、20回以上、再利用可能
です。しかし、使用可能回数はサンプル条件などによって変わります。
注意：カラム内に0.1M グリシン-HClを20分以上留まらせないようにして下さい。
ANTI-FLAG M2 Affinity Gelを用いたFLAG融合タンパク質の精製
カラムを平衡化し、すべてのバッファーを目的タンパク質の精製に適切な温度に合わせます。
プロテアーゼが問題となる場合は、4℃でカラムクロマトグラフィーを行います。細胞の残骸
および微粒子はカラムを詰まらせるおそれがあるため、除去する必要があります。染色体
DNAやRNAを含んだ粘性の高いサンプルもカラムを詰まらせるおそれがあるため、超音波
処理またはヌクレアーゼ処理を行い、粘性を減らします。また、精製過程中にFLAG-BAP
Positive Control Proteinを用いた対照実験を含めると有益な場合があります。
41
カラムの準備
1. 空のクロマトグラフィーカラムを安定な支持台に設置します。
2. 上部および下部のタブを取り除き、カラムをTBSで2回すすぎます。バッファーをカラ
ムから排水し、カラム内に残ったTBSは次のステップでANTI-FLAG M2 Affinity Gelを
充填しやすいように、そのままにしておきます。
注意：流速を制御するために、排水チューブをカラムに取りつける場合、チューブの長さは
25cm以下に抑えてください。
3. ANTI-FLAG M2 Affinity Gelのバイアルを完全に懸濁させ、ゲルビーズを一様なスラリ
ー状にした後、直ちにスラリーをカラムに移します。
4. ゲルベッドの排水を行った後、バイアルをTBSですすぎ、すすぎ液をカラムに加え、再
び排水します。
注意：通常条件下では、過剰に溶液を排水してもゲルベッドがひび割れることはありません
が、ゲルベッドは乾燥させないようにして下さい。
カラムの洗浄
1. 5mlの0.1Mグリシン-HCl（pH 3.5）で3回、次いで、5mlのTBSで3回ゲルを洗浄します。
バッファーをローディングする際にゲルベッドを乱さないようにし、また、次の溶液を
加える前に、前の溶液を完全に排水させます。
2. 以上でカラムが使用可能となります。
FLAG融合タンパク質のカラムへの吸着
1. FLAG融合タンパク質をANTI-FLAG M2 Affinity Gelに効率良く結合させるためには、
イオン強度およびpHが生理的な条件であることが必要です。サンプルに微粒子が含まれ
ている場合は、カラムにアプライする前に遠心してください。粘性の高いサンプルは
DNase処理または超音波処理を行う必要があります。
2. 重力落下によりサンプルをカラムにローディングします。多量のサンプルを使用する際
には、数回に分けてカラムにローディングします。タンパク質の種類および流速によっ
ては、抗原の一部しか結合しないことがありますが、結合効率はカラムにサンプルを複
数回通すことにより改善できます。
3. 12mlのTBSで3回カラムを洗浄します。
42
グリシンを用いた酸溶出によるFLAG融合タンパク質の溶出
1mlの0.1Mグリシン（pH 3.5）をアプライし、カラムに結合したFLAG融合タンパク質をバイ
アルに溶出させます。これを6回繰り返します。この際、各バイアルには15∼25μlの1M
Tris（pH 8.0）を入れておきます。グリシン-HClはカラム内に20分以上留まらせないようにし
て下さい。
FLAG Peptideを用いた競合によるFLAG融合タンパク質の溶出
M1 Affinity Gelの場合と同様です。41ページをご覧下さい。
カラムの保存
5mlのTBS/A（0.02%のアジ化ナトリウムを含むTBS）で3回洗浄し、再度5mlのTBS/Aを加
えて、排水せずに4℃で保存します。
カラムのリサイクル
カラムは使用後直ちに5mlの0.1Mグリシン-HCl（pH 3.5）で3回洗浄し、再生させて下さい。
このとき、直ちにカラムをTBSにより再平衡化する必要があります（流出液のpHが中性にな
るまで）。ANTI-FLAG M2 Affinity Gel Columnは適切に扱うことで、20回以上、再利用可
能です。しかし、使用可能回数はサンプル条件などにより変わります。
注意：カラム内に0.1Mグリシン-HClを20分以上留まらせないようにして下さい。
43
図４．Proteolytic Cleavage of FLAG Fusion Proteins by Enterokinase
−: indicates that FLAG fusion protein
is not a substrate for enterokinase
＋: indicates that FLAG fusion protein
is a substrate for enterokinase
44
FLAGマーカーの除去
FLAGマーカーは親水性で、かつ分子量も小さいため、ネイティブタンパク質の生物活性を
阻害することはないと考えられます。しかし、FLAG Peptideの除去が必要とされる場合は、
enterokinase（enterokinase）による切断除去が可能です。enterokinase 39-42は、8アミノ酸
FLAGマーカーペプチドのカルボキシル末端側の5アミノ酸を認識します（図1）。この認識配
列が天然に存在することは非常にまれです。このため、enterokinaseによりFLAG融合タン
パク質からFLAGマーカーを除去する際に、ネイティブタンパク質の内部を切断する可能性
はほとんどありません。この認識配列をNBRF Protein Databaseで検索すると、天然の基質
（トリプシノゲン、酵母タンパク質数種）にのみ存在していました。
enterokinaseは分子量115kDのheavy chainと35 kDのlight chainが2つのジスルフィド結合に
より連結されたヘテロ二量体で、計150kDの分子量を有しています。また、この酵素は糖タ
ンパク質であり、炭水化物を35％含んでいます。enterokinaseはN末端FLAG配列に続く最
初のアミノ酸がプロリンである場合には、FLAG Peptideを切断しません。また、FLAGマ
ーカーが融合タンパク質のC末端側に存在する場合、OmpAシグナルペプチドが保持されて
いる場合にも、FLAG配列は除去されません（図4）。
当社のデータによると、FLAG-BAP融合タンパク質1μgをenterokinase反応バッファー中、
37℃で18時間、1unitのenterokinaseにより反応させた場合の切断効率は95%以上でした。た
だし、ここで挙げた実験条件は全てのFLAG融合タンパク質の切断に対して推奨されるもの
ではないことに注意してください。enterokinaseによる切断は、49kDのFLAG-BAPタンパ
ク質バンドから48kD BAPタンパク質バンドへの変換をクマシーブルー（Coomassie Blue）
で染色した10% SDS-PAGEゲルで定量して確認しました。また、ゲル上に他のバンドが生
じないことから、プロテアーゼ活性の欠如も示されました。
FLAG融合タンパク質の切断反応を最適化する際に考慮すべき因子としては、
（1）反応時間
（通常2∼18時間）、
（2）酵素量、
（3）反応温度、などが挙げられます。
バッファー
enterokinase稀釈バッファー
10 mM Tris-HCl (pH 8)
10 mM Calcium Chloride
enterokinase反応バッファー
10 mM Tris-HCl
10 mM CaC12
pH 8.0
45
1. FLAG融合タンパク質のpHを7.4∼8.0に合わせます。
2. FLAG融合タンパク質1μgあたり1.0unitのenterokinaseを加えます。切断はenterokinase
反応バッファーを用いて行います。切断反応液を混合し、37℃でインキュベートします。
3. FLAG Peptideの除去は、ANTI-FLAG M2 Monoclonal Antibody（N末端Met-FLAG
Peptideの場合）
、およびANTI-FLAG M1 Monoclonal Antibody（N末端FLAGペプチド）
を用いたドットブロットをニトロセルロースメンブレン上で行うことにより確認します。
このとき、FLAG融合タンパク質はニトロセルロースメンブレンに結合しますが、フリ
ーのペプチドは結合しません。また、PVDFメンブレンにはフリーのペプチドも結合す
るため、ドットブロット･アッセイによるFLAG Peptide分解除去の判定には使用できま
せん（プロトコールは次のセクションをご覧下さい）。
FLAG融合タンパク質からFLAG Peptideを切断した後に、サンプル混合液からFLAG
Peptideを除去することが望ましい場合があります。このような場合には、FLAG Peptide
（1kD）と目的タンパク質の分子量の違いに基づき、ゲル濾過、透析もしくは限外濾過等の方
法により分離が可能です。
FLAG融合タンパク質の切断後に、enterokinaseを除去することが望ましい場合があります。
この目的に最適な方法というものはありませんが、enterokinaseのいくつかの性質が、この
目的に有用な場合があります。enterokinaseアガロース（Enterokinase Clean Cleave TM
KIT/製品番号：RECOM-E）を切断試薬として使用した場合、FLAG Peptide切断後の
enterokinase除去処理は必要ありません。この製品を使用した場合、アガロースに結合した
enterokinaseは遠心により容易に除去できます。
FLAG融合タンパク質の切断後に、enterokinase活性を阻害することが望ましい場合があり
ます。enterokinaseはセリンプロテアーゼであり、ダイズ･トリプシン阻害剤や膵臓トリプ
シン阻害剤などのセリンプロテアーゼ阻害剤により阻害されることが知られています。また、
この酵素の活性はpH 6∼10で最大となり、至適温度はタンパク質基質ごとに異なります。
46
FLAG融合タンパク質の呈色検出
FLAG融合タンパク質は発現、アフィニティー精製およびenterokinase切断の各過程におい
て、ドット、スロットあるいはウェスタンブロット試験により検出可能です。イムノブロッ
ティングによる検出は、ANTI-FLAG Monoclonal Antibody（M1またはM2）を一次プローブ
に用いて行います。ANTI-FLAG M2 Monoclonal Antibodyは、FLAGマーカーを任意の部
位に持つFLAG融合タンパク質に結合するため、大半のスクリーニングでより有効です（図
3）。ANTI-FLAG M2 Monoclonal AntibodyはCaCl2を必要としませんが、CaCl2が存在する
場合でもFLAG融合タンパク質の検出は阻害されません。FLAG融合タンパク質のブロット
検出には、ニトロセルロースまたはPVDFメンブレンが最適です。タンパク質のブロッティ
ングでは、ナイロンメンブレンの使用は不適です。enterokinaseによるFLAG Peptideの除
去は、ANTI-FLAG M1またはM2 Monoclonal Antibodyを用いたニトロセルロース上でのド
ットブロット分析により容易に確認できます。FLAG Peptideはメンブレンに結合せず、し
たがって、ブロット上では検出されません。PVDFメンブレンはFLAG融合タンパク質だけ
でなくFLAG Peptideをも結合するため、この目的では不適です。また、ネイティブタンパ
ク質は完全なFLAG融合タンパク質よりも分子量が1000Daほど小さいため、10%ゲルを用い
たSDS-PAGE分析によっても、FLAG Peptideの除去を確認できます。
FLAG融合タンパク質の検出感度は、ウェスタンおよびドットブロット検出に用いる発色基
質または化学発光基質による影響を受けます。最も一般的に使用される基質と、その感度の
高さは以下の通りです：
ルミノール（Luminol）＞TMB＞AEC＞NBT/BCIP＞4-CN
FLAG融合タンパク質の検出がうまくいかない場合は、別の基質をお試しください。
アルカリホスファターゼ（alkaline phosphatase）はペルオキシダーゼ（Peroxidase）よりも広
く天然に存在しており、したがって、タンパク質サンプルに混入する可能性がより高いため、
アルカリホスファターゼ･プローブよりもペルオキシダーゼ･プローブの使用が適していると
言えます。
FLAG-BAP Positive Control Proteinは、ANTI-FLAG M1およびM2 Monoclonal Antibody、
2次プローブおよび発色、化学発光検出系が正しく機能していることを示すポジティブコン
トロールとして使用できます。また、これは電気泳動ゲルのマーカーとして、あるいはウェ
スタンブロットにおけるトランスファー効率のコントロールとしても有用です。
47
4-クロロナフトール（4-Chloro Naphthol；4-CN）基質を用いた
Dot BlotによるFLAG融合タンパク質の検出
試薬：
洗浄バッファー
50mM Tris-HCl (pH 7.4)
150mM NaCl
4-CN試薬1
60mg 4-CN
20ml Cold Methanol
4-CN試薬2
60μl
30% Hydrogen peroxide
100ml TBS (pH 7.4)
1. 1μlの培養液もしくはenterokinase切断混合液を、ニトロセルロースメンブレン上に直径
約3∼4mmの小さなドット状に滴下します。1μl以上が検出に必要とされる場合は、乾燥
させて同じ部分に滴下します。
注意：E. coli 培養上清はブロッキングの前に変性させる必要はなく、ニトロセルロースメン
ブレン上に直接、滴下してかまいません。
2. メンブレンを0.2N NaOH、1% SDSで飽和させたWhatman 3MM紙上に1分間置き、次に
0.2M NaH2PO4で飽和させたWhatman MM紙上に1分間置き、最後に0.02M NaH2PO4で
飽和させたWhatman 3MM紙上に1分間置きます。
3. メンブレンから過剰な水分を除去します。
4. TBSでブロッティングメンブレンを湿らせ、3% BSAあるいは他のブロッキング剤を含
むTBS中で、シェーカーを用いて室温で30分間インキュベートしてブロッキングを行い
ます。ブロッキング溶液を捨て、TBSで再び簡単にすすぎます。
48
5. TBSで溶解した10μg/ｍlのANTI-FLAG M1またはM2 Monoclonal Antibody溶液を加
え、室温で30分インキュベートします。回収した抗体溶液は4℃で保存した場合、1週間
まで再利用できます。
6. シェーカー上で5分間、TBSにより3回洗浄します。
7. TBSで稀釈した適切な抗マウスIgGペルオキシダーゼ標識抗体を加え、室温で1時間イン
キュベートします。
8. ステップ6と同様に洗浄します。
9. 新たに調製した4-クロロナフトール（4-CN）の基質溶液を加え、10∼30分間、呈色するま
でインキュベートします。
10. 蒸留水でメンブレンを3回すすぎ、乾燥させます。その後は乾燥した暗所で保存（-70℃）
します。
49
4-CN基質を用いたWestern BlotによるFLAG融合タンパク質の
検出
1. 細胞上清、抽出物または精製FLAG融合タンパク質サンプルをSDSポリアクリルアミド
ゲル電気泳動にかけます43。
2. タンパク質をニトロセルロース･メンブレンにトランスファーします44。
3. BSAを3%含むTBSまたは他の適切なブロッキング剤を用いて、室温でシェーカー上に1
時間おいて、メンブレンをブロッキングし、その後、ブロッキング溶液を除去します。
4. TBSで溶解したANTI-FLAG M1またはM2 Monoclonal Antibody（10μg/ml）を加え、室
温で1時間インキュベートします。抗体溶液は回収して4℃で保存した場合、1週間まで
再利用できます。
5. シェーカー上で5分間、TBSにより3回洗浄します。
6. TBSで稀釈した適切な抗マウス試薬（ヤギ抗マウス･ペルオキシダーゼ標識抗体など）を
加え、室温で1時間インキュベートします。
7. ステップ5を繰り返します。
8. 新たに調製した4-クロロナフトール（4-CN）を加え、ニトロセルロースが呈色するまでイ
ンキュベートします（10∼30分）。
9. 蒸留水でメンブレンをすすぎ、乾燥させます。その後は乾燥した暗所で保存（-70℃）
します。
50
MAPS OF THE SIGMA E. COLI EXPRESSION VECTORS
This section contains the maps and descriptions of the various Sigma Expression Vectors
pFLAG-MAC Expression Vector for the Cytoplasmic Expression of Met-Amino-Terminal
FLAG Fusion Proteins (Figure 5).
pFLAG-ATS Expression Vector for the Periplasmic Expression of the Amino-Terminal
FLAG Fusion Proteins (Figure 6).
pFLAG-CTC Expression Vector for the Cytoplasmic Expression of the CarboxyTerminal FLAG Fusion Proteins (Figure 7).
pFLAG-CTS Expression Vector for the Periplasmic Expression of the CarboxyTerminal FLAG Fusion Proteins (Figure 8).
pFLAG-1 Expression Vector for the Periplasmic Expression of the Amino-Terminal
FLAG Fusion Proteins (Figure 9).
pFLAG-2 Expression Vector for the Cytoplasmic Expression of Met-Amino-Terminal
FLAG Fusion Proteins (Figure 10).
pFLAG-Shift12 Expression Vector for the Periplasmic Expression of the FLAG-Shift
Proteins (Figure 11).
pFLAG-Shift12c Expression Vector for the Cytoplasmic Expression of the FLAG-Shift
Proteins (Figure 12).
FLAG-BAP Positive Control Plasmids (Figure 13).
51
52
Marker
tac Promoter
lacI Binding
RBS
FLAG
MCS
T1T2
N-26
C-24
ampr
pBR322 ori
f1･ori
lac I
Map Position
39 - 99
73
100
115 - 138
133 - 179
231 - 601
1 - 26
223 - 200
693 - 1553
2310
2548 - 3011
4486 - 3404
Description
-35 region of trp promoter to end of lacI binding region.
lacI repressor binding site. Induction with IPTG.
Shine-Dalgarno ribosome binding site.
Octapeptide for binding of ANTI-FLAG M2
antibody and Enterokinase cleavage.
Multiple cloning site for insertion of coding sequences
into pFLAG-MAC.
Ribosomal RNA operon compound terminator.
Binding site for N-26 forward sequencing primer.
Binding site for C-24 reverse sequencing primer.
Ampicillin resistance to host cell.
Double strand replication of pFLAG-MAC.
Single strand replication of positive strand via
M13 K07 Helper Phage.
Repression of tac promoter. 1acI repressor protein is over
produced from lacIq promoter. Induction with IPTG.
図5.Cytoplasmic Expression of Met-Amino-Terminal FLAG Fusion Proteins in E.
coli
53
Marker
tac Promoter
lacI Binding
RBS
ompA
FLAG
MCS
T1T2
N-26
C-24
ampr
pBR322 ori
f1･ori
lac I
Map Position
39 - 99
73
100
112 - 174
175 - 198
193 - 239
291 - 661
1 - 26
283 - 260
753 - 1613
2370
2608 - 3071
4811 - 3729
Description
-35 region of trp promoter to end of lacI binding region.
lacI repressor binding site. Induction with IPTG.
Shine-Dalgarno ribosome binding site.
Signal sequence for secretion of FLAG fusion proteins to
periplasmic space.
Octapeptide for binding of ANTI-FLAG M1 and M2
antibodies and Enterokinase cleavage.
Multiple cloning site for insertion of coding sequences
into pFLAG-ATS.
Ribosomal DNA operon compound terminator.
Binding site for N-26 forward sequencing primer.
Binding site for C-24 reverse sequencing primer.
Ampicillin resistance to host cell.
Double strand replication of pFLAG-ATS.
Single strand replication of positive strand of pFLAG-ATS
via M13 K07 Helper Phage.
Repression of tac promoter. lacI repressor protein is over
produced from lacIq promoter. Induction with IPTG.
図6.Periplasmic Expression of Amino-Terminal FLAG Fusion Proteins in E. coli
54
MCS
T1T2
N-26
C-24
ampr
pBR322 ori
f1･ori
lac I
378 - 582
1 - 26
223 - 200
762 - 1553
2310
2548 - 3011
4751 - 3669
Marker
tac Promoter
lacI Binding
RBS
FLAG
115 - 152
Map Position
39 - 99
73
100
150 - 173
Description
-35 region of trp promoter to end of lacI binding region.
lacI repressor binding site. Induction with IPTG.
Shine-Dalgarno ribosome binding site.
Octapeptide for binding of ANTI-FLAG M2
Monoclonal Antibody. Out of phase with ATG by +2.
Multiple cloning site for insertion of coding sequences
into pFLAG-CTC.
Ribosomal RNA operon compound terminator.
Binding site for N-26 forward sequencing primer.
Binding site for C-24 reverse sequencing primer.
Ampicillin resistance to host cell.
Double strand replication of pFLAG-CTC.
Single strand replication of positive strand of pFLAG-CTC
via M13 K07 Helper Phage.
Repression of tac promoter. lacI repressor protein is over
produced from lacIq promoter. Induction with IPTG.
図7.Cytoplasmic Expression of Carboxy-Terminal FLAG Fusion Proteins in E. coli
55
Marker
tac Promoter
lacI Binding
RBS
ompA
FLAG
MCS
T1T2
N-26
C-24
ampr
pBR322 ori
f1･ori
lac I
Map Position
39 - 99
73
100
112 - 174
205 - 228
170 - 207
295 - 656
1 - 26
278 - 255
748 - 1608
2365
2603 - 3066
4806 - 3721
Description
-35 region of trp promoter to end of lacI binding region.
lacI repressor binding site. Induction with IPTG.
Shine-Dalgarno ribosome binding site.
Signal sequence for secretion of C-FLAG fusion proteins to
periplasmic space.
Octapeptide for binding of ANTI-FLAG M2
Monoclonal Antibody
Multiple cloning site for insertion of coding sequences
into pFLAG-CTS.
Ribosomal RNA operon compound terminator.
Binding site for N-26 forward sequencing primer.
Binding site for C-24 reverse sequencing primer.
Ampicillin resistance to host cell.
Double strand replication of pFLAG-CTS.
Single strand replication of positive strand of pFLAG-CTS
via M13 K07 Helper Phage.
Repression of tac promoter. lacI repressor protein is over
produced from lacIq promoter. Induction with IPTG.
図8.Periplasmic Expression of Carboxy-Terminal FLAG Fusion Proteins in E. coli
56
Marker
tac Promoter
lacI Binding
RBS
ompA
FLAG
MCS
T1T2
N-26
C-24
ampr
pBR322 ori
f1･ori
lac I
Map Position
39 - 99
73
100
112 - 174
175 - 198
196 - 237
272 - 642
1 - 26
264 - 241
734 - 1594
2351
2589 - 3052
4792 - 3710
Description
-35 region of trp promoter to end of lacI binding region.
lacI repressor binding site. Induction with IPTG.
Shine-Dalgarno ribosome binding site.
Signal sequence for secretion of FLAG fusion proteins to
periplasmic space.
Octapeptide for binding of ANTI-FLAG
antibody and Enterokinase cleavage.
Multiple cloning site for insertion of coding sequences
into pFLAG-1.
Ribosomal RNA operon compound terminator.
Binding site for N-26 forward sequencing primer.
Binding site for C-24 reverse sequencing primer.
Ampicillin resistance to host cell.
Double strand replication of pFLAG-1.
Single strand replication of positive strand via
M13 K07 Helper Phage.
Repression of tac promoter. lacI repressor protein is over
produced from lacIq promoter. Induction with IPTG.
図9.Periplasmic Expression of Amino-Terminal FLAG Fusion Proteins in E. coli
57
Marker
tac Promoter
lacI Binding
RBS
FLAG
MCS
T1T2
N-26
C-24
ampr
pBR322 ori
f1･ori
lac I
Map Position
39 - 99
73
100
115 - 138
136 - 177
212 - 582
1 - 26
204 - 181
674 - 1534
2291
2528 - 2992
4467 - 3385
Description
-35 region of trp promoter to end of lacI binding region.
lacI repressor binding site. Induction with IPTG.
Shine-Dalgarno ribosome binding site.
Octapeptide for binding of ANTI-FLAG M2
antibody and Enterokinase cleavage.
Multiple cloning site for insertion of coding sequences
into pFLAG-2.
Ribosomal RNA operon compound terminator.
Binding site for N-26 forward sequencing primer.
Binding site for C-24 reverse sequencing primer.
Ampicillin resistance to host cell.
Double strand replication of pFLAG-2.
Single strand replication of positive strand via
M13 K07 Helper Phage.
Repression of tac promoter. lacI repressor protein is over
produced from lacIq promoter. Induction with IPTG.
図10.Cytoplasmic Expression of Met-Amino-Terminal FLAG Fusion Proteins in E. Coil
58
Marker
N-26
tac Promoter
lacI Binding
RBS
ompA
FLAG
SHIFT
MCS
T1T2
C-24
ampr
pBR322 ori
f1･ori
lac I
Map Position
1 - 26
39 - 99
73
100
112 - 174
175 - 198
200 - 211
212 - 242
294 - 664
286 - 263
756 - 1616
2373
2611 - 3074
4549 - 3467
Description
Binding site for N-26 sequencing primer.
-35 region of trp promoter to end of lacI binding region.
lacI repressor binding site. Induction with IPTG.
Shine-Dalgarno ribosome binding site.
Signal sequence for secretion of FLAG fusion proteins to
periplasmic space.
Octapeptide for binding of ANTI-FLAG M1 or M2 Monoclonal
antibody and Enterokinase cleavage.
Translational Reading Frameshift sequence for expression
of an ORF in all 3 reading frames.
Multiple cloning site
Ribosomal RNA operon compound terminator.
Binding site for C-24 reverse sequencing primer.
Ampicillin resistance to host cell.
Double strand replication of pFLAG-SHIFT12.
Single strand replication of positive strand via
M13 K07 Helper Phage.
Repression of tac promoter. lacI repressor protein is over
produced from lacIq promoter. Induction with IPTG.
図11.Periplasmic Expression of Amino-Terminal FLAG-SHIFT Fusion Proteins in E. coli
59
Marker
N-26
tac Promoter
lacI Binding
RBS
FLAG
SHIFT
MCS
T1T2
C-24
ampr
pBR322 ori
f1･ori
lac I
Map Position
1 - 26
39 - 99
73
100
115 - 138
140 - 151
152 - 182
381 - 585
226 - 203
765 - 1556
2313
2551 - 3014
4489 - 3407
Description
Binding site for N-26 sequencing primer.
-35 region of trp promoter to end of lacI binding region.
lacI repressor binding site. Induction with IPTG.
Shine-Dalgarno ribosome binding site.
Octapeptide for binding of ANTI-FLAG or M2 Monoclonal
antibody and Enterokinase cleavage.
Translational Reading Frameshift sequence for expression
of an ORF in all 3 reading frames.
Multiple cloning site
Ribosomal RNA operon compound terminator.
Binding site for C-24 reverse sequencing primer.
Ampicillin resistance to host cell.
Double strand replication of pFLAG-SHIFT12c.
Single strand replication of positive strand via
M13 K07 Helper Phage.
Repression of tac promoter. lacI repressor protein is over
produced from lacIq promoter. Induction with IPTG.
図12.Cytoplasmic Expression of Amino-Terminal FLAG-SHIFT Fusion Proteins in E. coli
図13.FLAG-BAP Positive Control Plasmids
The FLAG-BAP Positive Control Plasmids are useful positive controls for protein expression, immunological detection and
immunological detection and immuno-affinity purification of FLAG fusion proteins. ▼STOP = Translational stop codon.
60
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Production of Single Stranded DNA
Methods of Enzymology 153, 3 (1987)
(31) Atkins, J.; Weiss, R. and Gesteland ,G.
Ribosome Gymnastics: Degree of Difficulty 9.5, Style 10.0.
Cell 62, 413 - 423 (1990)
(32) Precup, J.; Ulrich, A.K.; Roopnarine, O. and Parker ,J.
Context Specific Misreading of Phenylalanine Codons.
Mol. Gen. Genet. 218, 397 - 401 (1989)
64
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Thermodynamic Stability and Statistical Significance of Potential Stem-loop Structures
Situated at the Frameshift Sites of Retroviruses.
Nucl. Acids Res. 15, 6413 - 52 (1989)
(34) Tsuchihashi, Z. and Kornberg, A.
Translational Frameshifting Generates the Gamma Subunit of DNA Polymerase III
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68
FLAG System 製品リスト
Kits and Components of the FLAG® System
Product #
製品番号
Product Name
品名
Package
Size
FLAG Expression System
FLAG 発現システム
FL-A
FL-C
FL-S
FL-YA
FL-MA
FL-MC
E.coli Amino-Terminal FLAG Expression Kit
大腸菌アミノ末端発現キット
E.coli Carboxy-Terminal FLAG Expression Kit
大腸菌カルボキシ末端発現キット
E.coli FLAG-Shift Expression Kit
大腸菌 FLAG シフト発現キット
Yeast Amino-Terminal FLAG Expression Kit
酵母アミノ末端発現キット
Mammalian Amino-Terminal Transient Expression Kit
哺乳動物アミノ末端発現キット
Mammalian Carboxy-Terminal Transient Expression Kit
哺乳動物カルボキシ末端発現キット
1kit
1kit
1kit
1kit
1kit
1kit
Expression Vectors and control Plasmids
発現用ベクター及びコントロールプラスミド
E.coli expression vectors
大腸菌発現ベクター
E-5769
E-5644
E-5269
E-5394
E-8023
E-7898
E-9023
E-2774
pFLAG-ATS Expression Vector
大腸菌アミノ末端用(ompA)
pFLAG-MAC Expression Vector
大腸菌アミノ末端用(ompA無)
pFLAG-CTS Expression Vector
大腸菌カルボキシ末端用(ompA無)
pFLAG-CTC Expression Vector
大腸菌カルボキシ末端用(ompA)
pFLAG-Shift12 Expression Vector
大腸菌FLAG−Shift(ompA )
pFLAG-Shift12C Expression Vector
大腸菌FLAG−Shift(ompA無 )
pFLAG-1 Expression Vector
大腸菌アミノ末端用(ompA)
pFLAG-2 Expression Vector
大腸菌アミノ末端用(ompA無)
10μg
10μg
10μg
10μg
10μg
10μg
10μg
10μg
E.coli Control Plasmids
大腸菌コントロールプラスミド
C-9079
P-7707
P-5725
P-0226
pFLAG-ATS-BAP Control Plasmid
大腸菌用
pFLAG-CTS-BAP Control Plasmid
大腸菌用
pFLAG-Shift12-BAP Control Plasmid
大腸菌用
pFLAG-1-BAP Control Plasmid
大腸菌用
69
1μg
1μg
1μg
1μg
Yeast expression vectors
酵母発現ベクター
E-9020
YEpFLAG-1 Expression Vector
酵母アミノ末端用(細胞外分泌）
10μg
Yeast Control Plasmids
酵母コントロールプラスミド
C-2082
YEpFLAG-1-BAP Control Plasmid
酵母用
10μg
Mammalian expression vectors
哺乳動物発現ベクター
E-7523
E-7648
E-7773
E-7398
E-7273
pFLAG-CMV-5a Expression Vector
哺乳動物カルボキシ末端用
pFLAG-CMV-5b Expression Vector
哺乳動物カルボキシ末端用
pFLAG-CMV-5c Expression Vector
哺乳動物カルボキシ末端用
pFLAG-CMV-2 Expression Vector
哺乳動物アミノ末端用(細胞内分泌）
pFLAG-CMV-1 Expression Vector
哺乳動物アミノ末端用(細胞外分泌）
10μg
10μg
10μg
10μg
10μg
Mammalian Control Plasmids
哺乳動物用コントロールプラスミド
P-4975
P-5100
P-5225
pFLAG-CMV-1-BAP Positive Control Plasmid
哺乳動物用
pFLAG-CMV-2-BAP Positive Control Plasmid
哺乳動物用
pFLAG-CMV-5b BAP Positive Control Plasmid
哺乳動物用
20μg
20μg
20μg
Antibodies
抗体
Anti-FLAG Monoclonal Antibodies
抗FLAGモノクローナル抗体
F-3040
Anti-FLAG M1 Monoclonal Antibody
アミノ末端発現用（Ca2+依存性)
F-3165
Anti-FLAG M2 Monoclonal Antibody
アミノ、カルボキシ末端発現用
F-4042
Anti-FLAG M5 Monoclonal Antibody
Met-アミノ末端発現用
200μg
1mg
5mg
200μg
1mg
5mg
200μg
1mg
5mg
Antibidies-Biotinylated
ビオチン化抗体
F-9291
Anti-FLAG BioM2 Monoclonal Antibody-Biotin Conjugate
アミノ、カルボキシ末端発現用
F-2922
Anti-FLAG BioM5 Monoclonal Antibody-Biotin Conjugate
Met-アミノ末端発現用
70
200μg
1mg
5x1mg
200μg
1mg
Affinity Gel
アフィニティーゲル
A-1080
Anti-FLAG M1 Agarose Affinity Gels
アミノ末端発現用（Ca2+依存性)
1ml
5ml
10ml
25ml
A-1205
Anti-FLAG M2 Agarose Affinity Gels
アミノ、カルボキシ末端発現用
1ml
5ml
10ml
25ml
Enterokinase, Bovine
FLAGペプチド/フュージョン蛋白の切断
50 un
250 un
FLAG Peptide
フュージョン蛋白/抗体の脱着用
4mg
25mg
Enterokinase
エンテロキナーゼ
E-5144
FLAG Peptide
FLAGペプチド
F-3290
FLAG Control Proteins
FLAGコントロールタンパク
P-7582
Amino-Terminal FLAG-BAP Fusion Protein
大腸菌アミノ末端用
100μg
P-7457
Carboxy-Terminal FLAG-BAP Fusion Protein
大腸菌カルボキシ末端用
100μg
P-5975
Amino-Terminal Met-FLAG-BAP Fusion Protein
哺乳動物 Met-アミノ末端用
100μg
Yeast Host Strain
酵母宿主株
0.1ml
Yeast Host Strain
酵母宿主株
Y-4875
Sequencing Primers
シークエンスプライマー
P-7832
N-26 Sequencing Primer
大腸菌アミノ末端用
1μg
P-7957
C-24 Primer
大腸菌カルボキシ末端用
1μg
P-8959
YαN-21 Sequencing Primer
酵母アミノ末端用
1μg
P-8834
YcC-21 Sequencing Primer
酵母カルボキシ末端用
1μg
P-5350
N-CMV-30 Sequencing Primer
哺乳動物アミノ末端用
C-CMV-24 Sequencing Primer
哺乳動物カルボキシ末端用
1μg
P-5475
71
1μg

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