Strahlenbiologische Charakterisierung
humaner Oropharynx-Karzinom-Zelllinien
Inauguraldissertation
zur Erlangung des Grades eines Doktors
der Humanbiologie
des Fachbereichs Medizin
der Justus-Liebig-Universität Gießen
Vorgelegt von Mayer, Christina (geb. Genzler)
aus Frankfurt am Main
Gießen, 2014
Strahlenbiologische Charakterisierung
humaner Oropharynx-Karzinom-Zelllinien
Inauguraldissertation
zur Erlangung des Grades eines Doktors
der Humanbiologie
des Fachbereichs Medizin
der Justus-Liebig-Universität Gießen
Vorgelegt von Mayer, Christina (geb. Genzler)
aus Frankfurt am Main
Gießen, 2014
Aus der Klinik für Hals-Nasen-Ohren-Heilkunde, Kopf-Halschirurgie und
plastische Operationen der
Universitätsklinikum Gießen & Marburg GmbH, Standort Gießen
Prof. Dr. med. Jens Peter Klußmann, Direktor der Klinik
Gutachter: Prof. Dr. med. Jens Peter Klußmann
Gutachter: Prof. Dr. med. Rita Engenhart-Cabillic
Datum der Disputation: 27. April 2015
Inhaltsverzeichnis
1
Einleitung ............................................................................................................. 1
1.1
Humanes Papilloma-Virus (HPV) und seine Rolle bei der Karzinogenese ...... 1
1.2
Das HPV-Genom, die Transkription viraler Gene und deren Integration in die
zelluläre DNA ............................................................................................................ 3
1.3
Tumore des Kopf-Hals-Bereiches: Inzidenz, Ätiologie, Risikofaktoren ............ 7
1.3.1 Heterogenität der HNSCC und Behandlungsstrategien ................................ 8
1.4
Grundlagen und Wirkung ionisierender Strahlung ........................................... 9
1.4.1 Zelluläre Strahlenantwort und Reparaturmechanismen .............................. 10
1.4.2 Einfluss von HPV auf die zelluläre Wirkung ionisierender Strahlung ........... 12
1.5
2
Zielsetzung ................................................................................................... 13
Materialien und Methoden ................................................................................ 15
2.1
Geräte und Materialien ................................................................................. 15
2.1.1 Spezielle Geräte und Materialien am Standort Gießen ............................... 16
2.1.2 Spezielle Geräte und Materialien am Standort Marburg ............................. 17
2.2
Chemikalien und Reagenzien ....................................................................... 17
2.3
Antikörper und Enzyme ................................................................................ 19
2.4
Primer ........................................................................................................... 20
2.5
Zellkulturen ................................................................................................... 21
2.5.2 Verwendete Zelllinien ................................................................................. 21
2.5.3 Kultivierung der verwendeten Zelllinien ...................................................... 22
2.6
Methoden .................................................................................................... 23
2.6.1 HPV-PCR ................................................................................................... 24
2.6.2 Sequenzierung der HPV E6 und E7-Genregion .......................................... 26
2.6.3 Wachstumskurven und Koloniebildungseffizienz ........................................ 28
2.6.4 Bestrahlung ................................................................................................ 29
2.6.5 Klonogenes Überleben (Dosis-Effekt-Kurven) ............................................ 29
2.6.6 Durchflusszytometrie zur Zellzyklus-Analyse .............................................. 30
2.6.7 Proteinbiochemie........................................................................................ 31
2.7
RNA-Isolation ............................................................................................... 37
2.8
cDNA-Synthese ............................................................................................ 37
2.9
Quantitative real time PCR ........................................................................... 37
2.10 p53 Signaling Pathway RT-PCR Array.......................................................... 39
2.11 qPCR Auswertung ........................................................................................ 41
2.12 Statistik ......................................................................................................... 42
3
Ergebnisse ......................................................................................................... 43
3.1
HPV-Nachweis ............................................................................................. 43
i
3.2
Dosis-Effekt-Beziehung ................................................................................ 43
3.2.1 Wachstumskurven ...................................................................................... 43
3.2.2 Klonogenes Überleben ............................................................................... 44
3.3
Zellzyklusverteilung nach Bestrahlung .......................................................... 45
3.4
Proteinexpressions-Änderung nach Bestrahlung .......................................... 48
3.4.1 Proteinexpression von p16INK4A nach Bestrahlung ...................................... 48
3.4.2 Proteinexpression von Retinoblastom nach Bestrahlung ............................ 49
3.4.3 Proteinexpression von p53 und phospho p53 (Ser15) nach Bestrahlung .... 52
4
3.5
qPCR: mRNA-Expression von viralen Onkogenen E6 und E7 ...................... 54
3.6
Sequenzierung der E6 und E7-Gen-Region der HPV-positiven Zelllinien ..... 56
3.7
p53 Signaling Pathway RT-PCR Array.......................................................... 61
Diskussion ......................................................................................................... 65
4.1
Einfluss ionisierender Strahlung auf HNSCC-Tumorzelllinien ....................... 65
4.1.1 Strahlenempfindlichkeit .............................................................................. 65
4.1.2 Zellzyklus ................................................................................................... 66
4.1.3 Markerproteine bei der primären Strahlenantwort ....................................... 67
4.2
Einfluss ionisierender Strahlung auf virale Onkoproteine .............................. 70
4.3
Einfluss ionisierender Strahlung auf die p53-abhängige Genexpression ....... 72
4.4
Ausblick ........................................................................................................ 74
5
Zusammenfassung............................................................................................ 77
6
Summary............................................................................................................ 78
7
Abkürzungsverzeichnis .................................................................................... 79
8
Abbildungsverzeichnis ..................................................................................... 81
9
Tabellenverzeichnis .......................................................................................... 82
10 Literaturverzeichnis .......................................................................................... 83
11 Publikationsverzeichnis.................................................................................... 93
12 Ehrenwörtliche Erklärung ................................................................................. 94
13 Danksagung....................................................................................................... 95
ii
1
Einleitung
1.1 Humanes Papilloma-Virus (HPV) und seine Rolle bei der Karzinogenese
Bereits 1974 wurden unter der Leitung von Harald zur Hausen (Zur Hausen et al. 1974)
erste Experimente auf der Suche nach Krebs auslösenden Viren in Zervix-Karzinomen
unternommen. 1984 wurden die ersten Virus-Typen aus Zervix-Biopsien isoliert und
ihre DNA kloniert (Dürst et al. 1983). Bei diesen Viren handelt es sich um humane
Papilloma-Viren (HPV). Es sind kleine, unbehüllte DNA-Viren mit einem Durchmesser
von ca. 55 nm, deren Erbinformation aus ringförmig geschlossener, doppelsträngiger
DNA von ungefähr 8000 Basenpaaren besteht. Heute sind mehr als 120 Subtypen der
Gattung bekannt (Longworth und Laimins 2004), die entweder Basalzellen der Haut (βGruppe) oder anogenitale und orale Mukosa (α-Gruppe) infizieren. Innerhalb der αGruppe unterscheidet man zwischen nichtonkogenen oder „low-risk“-HPV Typen wie
HPV-6 und -11, und onkogene oder „high-risk“-HPV Typen wie HPV16 und -18.
Allerdings können nur die durch „high-risk“ HPV-Typen entstandenen Schädigungen
Dysplasien und Karzinome entwickeln, die „low-risk“-Typen bilden meist Kondylome
und Papillome (Zur Hausen 2002).
Eine Infektion mit HPV wird einerseits mit der Anzahl der Sexualpartner in
Zusammenhang gebracht (Kreimer et al. 2004), andererseits scheinen Rauchen und
Alkoholkonsum eine Infektion zu begünstigen (Franceschi et al. 1999).
Die Infektion mit HPV16 erfolgt in der Zervix, indem durch kleinste Läsionen der
obersten Epithelschichten die Basalzellen frei zugänglich sind (Abbildung 1). Diese
werden vom Virus infiziert, indem die virale DNA in die Wirtszelle eingeschleust wird
und dort vorerst episomal in geringer Kopienzahl vorliegt. Auf diese Weise kann eine
persistierende Infektion über mehrere Monate andauern, ohne dass Krebs entsteht.
Für die Vollendung des viralen Lebenszyklus ist eine Ausdifferenzierung der infizierten
Basalzellen erforderlich. Da es sich bei diesen Zellen u. a. um Stammzellen handelt,
können diese zu Zelltypen der darüber liegenden Zellschichten differenzieren. Betrifft
die Infektion eine solche Stammzelle, so wird gewährleistet, dass das Virus nach der
Zellteilung
einerseits
in
der
Tochter-Stammzelle
persistiert,
andererseits
als
Tochterzelle in die oberen Epithelschichten abgegeben wird. Diese Schichten
umfassen meist ausdifferenzierte Zellen, die sich in der G0-Phase des Zellzyklus
befinden und sich daher nicht mehr teilen. In seiner Eigenschaft zur Transformation
ausdifferenzierter Zellen zu proliferierenden Krebs-Zellen kann das Virus in G0-Phase
arretierte Zellen in die G1- und S-Phase treiben (Münger et al. 1989a). Nach der
1
Infektion liegt die virale DNA episomal in der Wirts-Zelle vor. Die Integration in das
Wirts-Genom erfolgt zufällig und ist entscheidend für die Entstehung eines Karzinoms.
Bei der Entstehung eines Zervix-Karzinoms ist in über 95% der Fälle eine Assoziation
mit HPV16 bzw. -18 ursächlich (van den Brule, A J et al. 1990) (Zur Hausen 1996). Seit
den 80er Jahren wurden auch bei Kopf-Hals-Karzinomen onkogene oder „high-risk“HPV-Typen entdeckt (Klussmann et al. 2001). Papillomaviren des Typs 16 und 18 sind
hierbei im Mittel bei bis zu 15-25% der Patienten an der Entstehung von
Plattenepithelkarzinome beteiligt (Kreimer et al. 2005). Besonders betroffen sind in
absteigender Reihenfolge Oropharynx, Larynx/Hypopharynx und die Mundhöhle.
HPV16
A
Abbildung 1: Infektion mit HPV16 in
mehrschichtigem Plattenepithel der
Mehrschichtiges
Plattenepithel
Zervix uteri und der Tonsillenkrypte
Die Basalzellen des mehrschichtigen
Basalzellen
Plattenepithels liegen durch Läsionen
Basalmembran
frei und können durch HPV16 infiziert
werden
(A).
Das
weitmaschige
Kryptenepithel ermöglicht dem Virus
B
Kryptenepithel
Basalzellen
Basalmembran
HPV16
einen
direkten
Zugang
zu
den
Basalzellen (B).
Anders als bei der Zervix uteri bildet
das oropharyngeale Gewebe der
Seitenwand in der Tonsilla palatina
so
genannte
Krypten
Oberflächen-Vergrößerung
zur
aus
(Abbildung 1). Diese Ausstülpungen sind durch retikuläres Plattenepithel mit Basalzellähnlicher Differenzierung gekennzeichnet. Da die Basalmembran in den Krypten porös
ist, um eine direkte Passage von Lymphozyten und Antigen-präsentierenden Zellen zu
ermöglichen, besteht ein enger Kontakt zum lymphatischen Gewebe. Demnach können
Viren direkt durch die Krypten zur Basalmembran gelangen, und die in der Zervix uteri
notwendige Läsion der oberen Epithelschichten ist hier für einen Virus-Kontakt mit der
Basalzellschicht und für deren Infektion wahrscheinlich nicht nötig.
2
1.2 Das HPV-Genom, die Transkription viraler Gene und deren Integration in
die zelluläre DNA
HPV zählen zu den DNA-Viren. Sie beinhalten durch Histone komprimierte,
doppelsträngige DNA, die ungefähr 8000 Basenpaare umfasst. Die Genexpression des
HPV-Genoms
wird
von
verschiedenen
Faktoren
wie
zellulären
und
viralen
Transkriptionsfaktoren, unterschiedlichen Promotoren, differentiellem Spleißen oder
posttranskriptionaler Stabilität viraler mRNAs beeinflusst. Das HPV-Genom kann in drei
funktionelle Bereiche eingeteilt werden, die acht offene Leseraster (ORF) beinhalten
(Abbildung 2). Frühe virale Proteine werden durch die „early region“ (E) kodiert. Diese
umfasst die Gene E1 bis E7. Späte Proteine werden von Genen der „late region“ (L)
gebildet, die die Strukturproteine L1 und L2 beinhalten. Der Bereich URR (upstream
regulatory region) dient der Regulation der DNA-Replikation und Transkription, und der
Bereich NCR (non coding region) bezeichnet eine kleine, hoch variable, nichtkodierende Region.
Abbildung 2: HPV16-Genom
Das HPV16-Genom (aus: (Smith et al.
2011) besteht aus doppelsträngiger DNA
von etwa 8000 Basenpaaren Länge. Es
kodiert für Gene, die früh (E = early genes,
schwarz) und spät (L = late genes, blau) im
HPV-Lebenszyklus exprimiert werden. Die
regulatorische Region (URR = upstream
regulatory region) und eine nicht-kodierende
Region (NCR = non coding region) sind in
grau dargestellt.
Die Funktionen und Eigenschaften der Virusproteine werden im Folgenden für HPV16
beschrieben, da nur dieser „high risk“-Typ im Rahmen der vorliegenden Arbeit
untersucht wurde.
Das E1 Protein ist u.a. für die Replikation des viralen Erbguts zuständig. Es bildet
Hexamere aus, die durch das E2-Protein an Virus-DNA-Sequenzen (E1 binding site)
binden (Frattini und Laimins 1994), und durch seine ATP-abhängige Helikase-Aktivität
die DNA-Synthese vorantreibt (Yang et al. 1993). Weiterhin rekrutiert das E1-Protein
zelluläre Proteine wie die DNA-Polymerase α (Bonne-Andrea et al. 1995).
3
Das E2-Protein bildet homodimere Komplexe, die sich an vier E2-spezifische DNASequenzen innerhalb der Kontroll-Region des Virusgenoms binden (Massimi et al.
1999; Androphy et al. 1987). In seiner Funktion als Haupt-Regulator der viralen
Genexpression und DNA-Replikation kann E2 die Transkription sowohl aktivieren als
auch inhibieren, Mutationen im E2-Gen gehen mit der Immortalisierung humaner Zellen
einher (Romanczuk und Howley 1992).
Das virale E4-Protein wird zwar zeitlich später als die anderen „early genes“
transkribiert, liegt dagegen mengenmäßig am meisten vor. Durch eine Überlappung mit
dem E2-Gen wird es von einem anderen Leserahmen transkribiert, und bildet nach
Transformation ein E1-E4-Fusionsprotein. Dieses interagiert mit Zytoskelett-Proteinen
in ausdifferenzierten Epithelzellen, hat unterstützende Funktion bei Assemblierung und
Freisetzung der Viruspartikel (Roberts et al. 1994; Roberts et al. 1997).
Das E5-Gen kodiert für ein Protein, das durch seine hydrophobe Eigenschaft in
intrazellulären Membranen und in der Plasmamembran detektiert wird und dort mit
wichtigen Wachstumsrezeptoren wie EGF- (epidermal growth factor) oder PDGFRezeptor (platelet derived growth factor) interagiert (DiMaio und Mattoon 2001). Über
die Assoziation mit Membran-gebundenen ATPasen ist das E5-Protein an der
zellulären Transformation beteiligt (Conrad et al. 1993).
Eine wichtige Funktion des E6-Proteins ist die Inaktivierung des zellulären
Tumorsuppressors p53 über Ubiquitin-vermittelte Degradation (Scheffner et al. 1992,
1992; Scheffner et al. 1990; Scheffner et al. 1992), indem es die zelluläre ProteinLigase E6-AP (E6 associated protein) rekrutiert (Huibregtse et al. 1991; Talis et al.
1998). Allerdings genügt bereits die Bindung von E6 an p53, um dessen
transkriptionelle Eigenschaft zu inhibieren (Lechner et al. 1992; Thomas et al. 1999).
Außerdem hat das E6-Protein inhibitorische Wirkung auf die Apoptose, den ZellzyklusArrest nach DNA-Schaden, und es induziert die Expression und Aktivität der
Telomerase (Oh et al. 2001; Yuan et al. 2012). Weiterhin gibt es Hinweise darauf, dass
die Onkoproteine E6 und E7 genomische Instabilität bewirken (Zur Hausen 1996;
White et al. 1994; Korzeniewski et al. 2011), und die effiziente Immortalisierung
humaner Keratinozyten bewirkten (Münger et al. 1989b). Wenngleich beide Proteine
weder enzymatische noch spezifische DNA-bindende Eigenschaften besitzen,
beeinflussen sie dennoch Prozesse wie Zellproliferation, Apoptose und Expression
EMT-induzierender Gene (Hellner et al. 2009).
4
Das E7-Protein bindet an das Tumorsuppressorprotein Retinoblastom (Rb), welches im
hyperphosphorylierten Zustand mit dem Transkriptionsfaktor E2F verbunden ist
(Münger et al. 1989b). Durch die Bindung von E7 an Rb wird E2F freigesetzt und treibt
seinerseits die DNA-Synthese von Proliferations-fördernden Genen an, wie z. B. die
Cycline A und E (Dyson 1998; Zerfass et al. 1995). Das E7-Onkoprotein inaktiviert
außerdem den Cyclin-abhängigen Kinase-Inhibitor p21 (CDKN1A) (Funk et al. 1997)
und führt durch die Inhibierung von Rb zur Akkumulation des Tumorsuppressors
p16INK4A (Sano et al. 1998). Dieses Protein wird als klinischer Marker in Kombination
mit dem Nachweis von HPV-DNA für eine aktive HPV-Infektion herangezogen
(Klussmann et al. 2003).
Die Gene L1 und L2 werden später als die „early genes“ transkribiert, da sie
hauptsächlich in den äußeren Epithelschichten exprimiert werden. Sie kodieren für
Kapsidproteine, die zusammengesetzt das ikosaedrische Kapsid bilden, in das das
virale Genom durch Interaktion mit L2 eingeschlossen wird (Zhou et al. 1994).
Ein wesentlicher Schritt zur Karzinogenese HPV-assoziierter Basalzellen der Zervix ist
die Integration des viralen Erbguts in das Wirts-Genom. Dieser Prozess führt zur
Öffnung der ringförmigen Virus-DNA in der E2-ORF Region und hat zur Folge, dass
benachbarte Regionen deletiert werden (Olthof et al. 2012): Die Gene E4, E5 und
teilweise E2 und L2 (Abbildung 3).
5
E5
L1
E4
E2
HPV16
E1
L1
L2
L2
URR
E6
E7
E1
E2
Transkription
E7
E6
URR
Translation
E6 + E7
Abbildung 3: Integration des HPV16-Genoms
Bei der Integration des HPV16-Genoms wird die Ringstruktur geöffnet und in die zelluläre DNA
eingebaut. Dieser Prozess führt in der Regel zur Transkription beginnend von der Kontrollregion
(URR) und mündet in der Expression der E6 und E7 Onkoproteine.
Für
das
Zervix-Karzinom
ist
bekannt,
dass
das
HPV16-Genom
präferierte
Integrationsstellen besitzt, sog. „fragile sites“, an denen eine Integration leichter
möglich ist (Wentzensen et al. 2004). Diese Bereiche befinden sich in repetitiven
Regionen des humanen Genoms und teilweise auch an Orten mit Krebs-assoziierten
Genen (Li et al. 2013). Das Ereignis der Integration hat den Effekt, dass die Gene E6
und E7 verstärkt gebildet werden (Romanczuk und Howley 1992), was dazu führt, dass
Chromosomen und Zentrosomen-Alterationen angehäuft werden (White et al. 1994). In
Tonsillen-Plattenepithel-Karzinomen wurde die E6- und E7-Überexpression ebenfalls
mit der Integration von HPV-DNA in das Wirtsgenom in Verbindung gebracht
(Klussmann et al. 2001; Andl et al. 1998; Hafkamp et al. 2008; Wiest et al. 2002). Laut
einer aktuellen Studie wurde bei den HPV-positiv getesteten Tonsillen-Karzinomen
jedoch keine genomische Instabilität gefunden (Mooren et al. 2013).
Für das HPV16-Genom wurden zahlreiche natürlich vorkommende Sequenz-Varianten
beschrieben, die je nach Bevölkerungs-Region genetische Variationen enthalten (Chan
et al. 1992). Im Zervix-Karzinom zeichnete sich beim Vergleich von HPV16 GenomSequenzen eine evolutionsbedingte Entwicklung von Virus-Subtyp-Linien ab (Smith et
al. 2011). Weiterhin wurde gefunden, dass verschiedene HPV16-Varianten divergente
biologische Aktivitäten z. B. bei der Regulation des Tumorsuppressors p53 besitzen
(Stöppler et al. 1996).
6
1.3 Tumore des Kopf-Hals-Bereiches: Inzidenz, Ätiologie, Risikofaktoren
Tumore im Kopf-Hals-Bereich bezeichnen Malignome, die aus unterschiedlichen
Regionen des Kopf-Hals-Bereiches hervorgehen. Dieser Bereich ist in fünf Regionen
eingeteilt:
Mundhöhle,
Nasopharynx
(Nasenrachenraum),
Oropharynx
(Mundrachenraum), Hypopharynx (Schlundrachenraum) und Larynx (Kehlkopf). Der
Oropharynx wird in Seitenwand (Tonsillen) Vorderwand (Zungengrund, Vallecula,
linguale Epiglottis) und Dach (Weichgaumen und Uvula) unterteilt.
In über 95% der Fälle handelt es sich bei den Kopf-Hals-Tumoren um
Plattenepithelkarzinome (head and neck squamous cell carcinoma, HNSCC), die
weltweit an sechster Stelle der Häufigkeit der Tumorerkrankungen stehen (Ferlay et al.
2010; Kamangar et al. 2006). Jährlich erkranken ca. 650.000 Menschen neu an
HNSCC, und etwa die Hälfte der Patienten stirbt auch daran (Parkin et al. 2005). Über
eine längere Zeitspanne betrachtet wird jedoch ein Wandel von Inzidenz- und
Mortalitätsraten deutlich (Wittekindt et al. 2012), sodass Trends zur Prognose von
Häufigkeiten sowohl von der Ab- bzw. Zunahme von Risikofaktoren, als auch den
Inzidenzien
einzelner
Sublokalisationen
abhängig
sind
(Husmann
2010).
Krebsneuerkrankungen von Rachen und Mundhöhle lagen im internationalen Vergleich
im Jahr 2006 laut einer Studie des Robert-Koch-Institutes bei den Männern bei
16,4/100.000 und bei den Frauen bei 5,2/100.000. Frauen sind insgesamt deutlich
seltener betroffen. Dementsprechend waren auch die ermittelten Mortalitätsraten
dieser Gruppe geringer. Das Alter der Patienten scheint ebenfalls eine Rolle zu
spielen: Zwischen 40 und 60 Jahren erkranken vermehrt Männer an Mund- und
Rachentumoren (Chaturvedi et al. 2008).
Zwar wird allgemein ein Rückgang der Inzidenzen im Kopf-Hals-Bereich registriert,
allerdings nicht bei allen Sublokalisationen. So wurde beispielsweise 2007 eine erhöhte
Inzidenz bei Mundhöhlen- und Oropharynx-Karzinomen bei jungen Erwachsenen
festgestellt (Shiboski et al. 2005), und in Australien (Hocking et al. 2011), Dänemark
(Blomberg et al. 2011), Kanada (Auluck et al. 2010), USA (Chaturvedi et al. 2008),
Großbritannien (Conway et al. 2006), Schweden (Hammarstedt et al. 2006),
Niederlande (Braakhuis, Boudewijn J M et al. 2009) wurden vermehrt OropharynxKarzinome diagnostiziert.
Insgesamt sind hohe Inzidenz-Raten in Regionen mit hohem Tabak- und AlkoholKonsum berichtet (Parkin und Bray 2006); Chaturvedi et al. 2008), und die
Kombination beider Substanzen scheint sich additiv auszuwirken (Pai und Westra
7
2009, 2009; Franceschi et al. 1999). Dagegen publizierten Llewellyn et al. (2003) eine
Studie, in der 25% der Patienten mit HNSCC-Tumoren angegeben, nie geraucht oder
getrunken zu haben. Da diese Patienten zudem jünger als 45 Jahre waren, scheinen
weitere exogene Risikofaktoren für die Entwicklung von Tumoren des Kopf-HalsBereichs zu existieren. Als mehr oder weniger gut anerkannt gelten übermäßige UVExposition, Ernährung, Mundhygiene, Exposition mit karzinogenen Substanzen (z. B.
Asbest) und Infektionen. Eine Infektion mit HPV gilt als ursächlich für das Auftreten
vermehrter Krebserkrankungen im Oropharynx (Andl et al. 1998; Gillison et al. 2000;
Hammarstedt et al. 2006; Wiest et al. 2002; Zur Hausen 1996). In einer gepoolten
Analyse von Fall-Kontroll-Studien wurde verändertes Sexualverhalten als Risikofaktor
oraler HPV-Infektionen identifiziert (Heck et al. 2010).
1.3.1 Heterogenität der HNSCC und Behandlungsstrategien
Die überwiegende Mehrheit der Kopf-Hals-Tumore stellt HNSCC dar, weshalb
erwartungsgemäß ein homogenes Krankheitsbild vorliegen müsste. Tatsächlich bewirkt
der Einfluss und das Zusammenspiel unterschiedlicher exogener (z. B. Alkohol und
Nikotin)
und
endogener
Faktoren
(z.
B.
genomische
Instabilität,
onkogene
Virusinfektion) eine Heterogenität unter den Plattenepithelkarzinomen. So haben
Patienten mit HPV-positiven Tumoren zwar eine bessere Prognose und ein besseres
Gesamt-Überleben (Ang et al. 2010; Hafkamp et al. 2008; Gillison et al. 2000; Ritchie
et al. 2003), allerdings weisen sie fortgeschrittenere Tumorstadien (Andl et al. 1998)
und mehr Metastasen auf (Hafkamp et al. 2008) im Vergleich zu Patienten mit HPVnegativen Tumoren. Diese Heterogenität wurde seit den 90er Jahren immer wieder
bestätigt, und insbesondere bei Oropharynx-Karzinomen ein kausaler Zusammenhang
mit einer HPV16-Infektion festgestellt (Ang et al. 2010; Chung und Gillison 2009;
Klussmann et al. 2003; Ritchie et al. 2003; Klussmann et al. 2001; Hafkamp et al.
2008; Gillison et al. 2000). Generell werden HPV-positive Tumoren bei Patienten mit
geringerem Nikotin- und Alkohol-Konsum detektiert (Andl et al. 1998; Hafkamp et al.
2008; Sinha et al. 2012), wobei diese Tumoren signifikant seltener genetische
Alterationen und Amplifikationen beinhalten (Klussmann et al. 2009). Noxen-assoziierte
Oropharynx-Karzinome dagegen enthalten signifikant häufiger genetische Deletionen
und Amplifikationen, vor allem im Gen des Tumorsuppressors p53 (Gillison et al. 2000,
2000; Andl et al. 1998). Zusammengefasst bilden HPV- und Noxen-assoziierte
Tumoren zwei verschiedene Tumorentitäten, die durch ihre große Divergenz die
Therapie erschweren.
8
Eine gezielte Tumortherapie sollte demnach nur individuell und Personenbezogen
erfolgen. Stattdessen basiert die gängige Behandlung von Kopf-Hals-Tumoren meist
auf operativer Resektion des Tumors und ggf. Entfernung der Halslymphknoten (NeckDissection)
sowie
anschließender
Radio-
und/oder
Chemotherapie.
Ein
Überlebensvorteil bei kompletter Resektion mit Lokalrezidivrate von nur 12-18% im
Vergleich zu 80% bei nicht vollständiger Resektion ist lange bekannt (Byers et al.
1978). In zahlreichen Publikationen wurde ein besseres Überleben für Patienten mit
HPV-assoziierten Tumoren beschrieben, auch unabhängig von der durchgeführten
Therapie (Ang et al. 2010). Der Stellenwert der Tumorresektion ist für Patienten mit
HPV-assoziiertem Oropharynx-Karzinom somit unklar, wenngleich Fischer et al. (2010)
bei einer Therapie ohne Operation im Gegensatz zu Resektion plus Radiatio/Radiochemotherapie eine vergleichbare Prognose beobachteten.
1.4 Grundlagen und Wirkung ionisierender Strahlung
Ionisierende Strahlung bezeichnet Teilchen- oder elektromagnetische Strahlung, deren
Energie ausreicht, um beim Durchdringen von Materie Elektronen aus Atomhüllen von
Molekülen herauszulösen. Die Atome werden somit sehr reaktiv und als ionisiert
bezeichnet. Zu Teilchenstrahlung zählen α-Strahlung (Heliumionen) und β-Strahlung
(Elektronen, Positronen), zu elektromagnetischer Strahlung Röntgen- und γ-Strahlung.
Letztere entsteht auf natürliche Weise als Nebenprodukt des Kernzerfalls einer
radioaktiven Substanz. In Linearbeschleunigern wird γ-Strahlung künstlich erzeugt,
indem elektrisch geladene Teilchen auf gerader Strecke mit Hilfe einer angelegten
Wechselspannung stark beschleunigt werden und auf eine Anode aufprallen. γStrahlung entsteht hierbei als Abbremsstrahlung von Elektronen. Als ionisierend
werden generell Strahlen ab einer Energie von 124eV bezeichnet. γ-Strahlung wird
dabei mit einer Wellenlänge von unter 5pm definiert, was einer Energie von über
200keV entspricht.
Diejenige Energiedosis (D), die beim Durchtritt von Strahlung durch Materie von der
Materie aufgenommen wird, wird als absorbierte Energie (E) pro Masseeinheit (m) mit
der Einheit Gray (Gy) angegeben (Volkmer 1994):
E [J]
D [Gy] =
m [kg]
Die biologische Wirksamkeit von Strahlung ist abhängig von verschiedenen Faktoren
wie Strahlungsart und Strahlungs-Dosis. Sie beeinflussen, ob und in welchem Ausmaß
9
ein Organismus einen strahleninduzierten Schaden reparieren kann. Da die
Strahlenempfindlichkeit von Organen und Geweben gegenüber ionisierender Strahlung
verschieden ist, reagieren diejenigen Organe und Gewebe mit verstärkter Proliferation
sensibler, denn durch Bestrahlung wird der Prozess der Zellteilung negativ beeinflusst.
Insgesamt kann ionisierende Strahlung im lebenden Organismus direkt beim Auftreffen
auf Materie, aber auch indirekt durch Radikal-Bildung nach dem Auftreffen entstehen.
So können sowohl die DNA als auch Proteine geschädigt werden, wobei veränderte
DNA-Sequenzen möglicherweise schwerere Folgen nach sich ziehen, vor allem wenn
beide DNA-Stränge betroffen sind. Die häufigsten Veränderungen der DNA sind
Basenmodifikationen (single nucleotide polymorphism, SNP) sowie Basenverlust,
Einzel- und Doppelstrangbrüche. Bei Bestrahlung von 1Gy Röntgenstrahlung
entstehen ca. 40 Doppelstrangbrüche, was epigenetische Modifikationen wie die
Methylierung von DNA und die Phosphorylierung von Histonen hervorruft (Rogakou et
al.
1998).
Weiterhin
können
Chromosomen-Bereichen,
zytogenetische
Telomer-Kürzung
Effekte
und
wie
Translokation
frühzeitige
von
Chromosomen-
Kondensation erfolgen (Pernot et al. 2012).
1.4.1 Zelluläre Strahlenantwort und Reparaturmechanismen
Säugetierzellen reagieren auf endogenen (z. B. Radikale) und exogenen Stress (z. B.
Bestrahlung, Alkohol, Nikotin) mit der Aktivierung von Schutzmechanismen, die in
erster Linie die Integrität der DNA sicherstellen. Beschädigte DNA kann von
bestimmten Enzymen in den Zellen erkannt und anschließend repariert werden, wobei
die Reparatur-Effizienz vom Schadensmaß abhängt. Häufen sich DNA-Schäden – vor
allem Doppelstrangbrüche – an, so ist die Wahrscheinlichkeit einer korrekten DNAReparatur vermindert und es entstehen DNA-Modifikationen und -Fragmente. Zellen,
die in hohem Maße beschädigte DNA enthalten, dürfen diese nicht an Tochterzellen
weitergeben. Damit die Tochterzelle allerdings eine vollständige und fehlerfreie DNAKopie
erhält,
müssen
strenge
Kontrollen,
sog.
Checkpoints,
während
der
Zellzyklusprogression passiert werden (Abbildung 4).
10
G2/M-PhaseCheckpoint
Abbildung 4:
Zellzyklus-Phasen
Mitose
G2-Phase
Schematische
M-PhaseCheckpoint
Dar-
stellung der ZellzyklusPhasen mit Kontrollpunkten in Säugetier-
G0-Phase
S-PhaseCheckpoint
zellen.
In
der
G1-
Phase bereitet sich die
Zelle auf die DNA-
G1-Phase
S-Phase
Replikation vor. Wird
der
G1/S-PhaseCheckpoint
G1/S-Phase-
Checkpoint erfolgreich
passiert kann die DNA
in der S-Phase repliziert werden. Sobald der S-Phase-Checkpoint überwunden wurde, bereitet
sich die Zelle auf die Mitose vor und leitet die G2-Phase ein. Nach dem letzten Kontrollpunkt am
G2/M-Phase-Checkpoint teilt sich die Zelle. Sobald die Zellen nicht mehr proliferieren, treten sie
in die G0-Phase ein.
Die vier Phasen des Zellzyklus umfassen die G1-Phase, in der die DNA-Replikation
vorbereitet wird, die S-Phase mit der Replikation, die G2-Phase, in der die Mitose
vorbereitet wird, und die Zellteilung in der Mitose. Ausdifferenzierte und durch
Kontaktinhibition nicht mehr proliferierende Zellen werden als „ruhend“ bezeichnet und
verbleiben in der G0-Phase. Die Checkpoints der M-, G1/S-, S- und G2/M-Phase
dienen als Kontrollpunkte. Ist die Zelle nicht bereit für den Eintritt in die nächste Phase
wird ein Arrest eingeleitet, in welchem Reparatur-Enzyme die DNA-Schäden
korrigieren. Ist die Reparatur erfolgreich tritt die Zelle in die nächste Phase ein. Sind
die Schäden jedoch irreparabel oder fehlerhaft repariert worden, muss die – ggf.
unkontrollierbare – Weitergabe des fehlerhaften Erbguts verhindert werden. Dazu kann
der Prozess der zellulären Seneszenz eingeleitet werden. Im gesunden Gewebe
beschreibt Seneszenz einen Vorgang der natürlichen Alterung, indem ausdifferenzierte
Zellen nicht weiter proliferieren.
Eine weitere Möglichkeit zur Entsorgung geschädigter Zellen ist der programmierte
Zelltod (Apoptose). Bei diesem Prozess wird die DNA kontrolliert fragmentiert und die
Zelloberfläche für Immunzellen wie Phagozyten angreifbar gemacht. Bei der Nekrose
wird die Plasmamembran dagegen zerstört und durch austretende Zellorganellen eine
inflammatorische Immunreaktion hervorgerufen. Versagen die Reparaturmechanismen
11
und die verschiedenen Schutzfunktionen, so können Mutationen und geschädigte
Zellen akkumulieren.
1.4.2 Einfluss von HPV auf die zelluläre Wirkung ionisierender Strahlung
Das Tumorsuppressorprotein p53 ist einer der wichtigsten Regulatoren der zellulären
Strahlenantwort. Es koordiniert in der Zelle u. a. die Funktionen für Apoptose-Induktion,
Zellzyklus-Arrest und Wachstumskontrolle, sowie Reparatur und Replikation der
zellulären DNA. Die Zelle reagiert auf genotoxischen Stress mit der Aktivierung von
p53. Dies wird hauptsächlich durch posttranslationale Modifikationen des p53-Proteins
gewährleistet (Maltzman und Czyzyk 1984), wodurch deren Halbwertszeit stabilisiert
wird und die Translokation vom Zytoplasma in den Zellkern erfolgen kann. Dort bindet
p53 an definierten Regionen an die DNA und gewährleistet durch seine Eigenschaft als
Transkriptionsfaktor die Transkription von Apoptose-Genen bzw. ProliferationsInhibitoren nach Strahleninduziertem DNA-Schaden.
In Tumoren mit HPV-Assoziation wird p53 allerdings durch das virale Onkoprotein E6
inhibiert (Huibregtse et al. 1991; Lechner et al. 1992; Talis et al. 1998; Thomas et al.
1999; Werness et al. 1990; Scheffner et al. 1990). Das p53-kodierende Gen liegt in
HPV-positiven Tumoren meist in der Wildtyp-Form vor (Andl et al. 1998; Gillison et al.
2000; Hafkamp et al. 2003); Wiest et al. 2002), HPV-negative humane Tumore
enthalten dagegen meist ein mutiertes p53-Gen (Dahm-Daphi 2000).
In der Literatur wird die Beteiligung von HPV und p53 an der Strahlensensitivität HPVpositiver Zellen kontrovers diskutiert. Man vermutet einerseits einen Zusammenhang
zwischen der p53-Aktivierung und der Strahlensensitivität HPV-assoziierter Zellen
(Gupta et al. 2009; Kimple et al. 2013). Andererseits zeigten in vitro Experimente, dass
HPV-assoziierte Zellen eine p53-unabhängige Strahlensensitivität besitzen (Patel et al.
2000), wobei Nagel et al. (2013) und Spanos et al. (2009) beim Vergleich HPVpositiver Zelllinien mit HPV-negativen keine erhöhte Strahlensensitivität bei HPVpositiven Zelllinien detektierten.
Ein weiterer wichtiger Tumorsuppressor ist das Retinoblastomprotein (Rb). Die
Hauptfunktion
dieses
Proteins
liegt
in
der
Freisetzung
bzw.
Bindung
des
Transkriptionsfaktors E2F. Im Laufe des Zellzyklus wird Rb in mehreren Schritten
durch Cyclin-abhängige Kinasen phosphoryliert (Buchkovich et al. 1989). Im
hypophosphorylierten Zustand ist es mit E2F verbunden, in hyperphosphorylierter
Form wird E2F freigesetzt und gelangt seinerseits in den Kern, wo es die Transkription
12
der S-Phase-Gene einleitet. Nach UV-induziertem DNA-Schaden wurde in humanen
Melanozyten ein verlängerter G1-Phase-Arrest festgestellt, offenbar bedingt durch eine
inhibierte Rb-Phosphorylierung (Loignon und Drobetsky 2002; Medrano et al. 1995).
Andererseits fanden Loignon und Drobetsky (2002), dass abhängig von der
Strahlungsart der Rb-abhängige G1-Arrest unterschiedlich beeinflusst wird.
Es ist bekannt, dass das virale Onkoprotein E7 das Rb-Protein bindet und es für den
Abbau markiert (Dyson 1998; Münger et al. 2001; Boyer et al. 1996). Slebos et al.
(1994) fanden, dass E7-exprimierende Zellen nach Exposition mit Gamma-Strahlung
keinen G1-Arrest vollzogen, und Lindel et al. (2012) konnten verminderte Rb-Mengen
nach Exposition mit 2 und 7Gy Gamma-Strahlung feststellen, die gleichzeitig mit einer
erhöhten Strahlensensitivität der Zellen korrelierte.
Ein weiterer wichtiger Tumorsuppressor ist der Cyclin-abhängige Kinase-Inhibitor
p16INK4A. Er verhindert die Phosphorylierung von Rb und hält so den Zellzyklus an. Das
p16-Protein bedarf allerdings der Regulation durch ein intaktes Rb-Protein, weshalb in
HPV-assoziierten Zellen mit E7-abhängiger Rb-Degradation p16 überexprimiert wird
(Sano et al. 1998). Das p16 Protein gilt so zusammen mit dem Nachweis der HPVDNA als klinischer Marker einer aktiven HPV-Infektion im Kopf-Hals-Bereich
(Klussmann et al. 2003).
1.5 Zielsetzung
Trotz der distinkten Entitäten HPV- und Noxen-assoziierter HNSCC erfolgt die
Therapie bei den meisten HNSCC-Tumoren mittels radikaler Resektion und
anschließender Radio- und/oder Chemotherapie. Klinische Hinweise darauf, ob eine
alleinige Radiotherapie oder Radiochemotherapie den gleichen Erfolg wie eine
Resektion gefolgt von adjuvanter Radio-/ Radio-Chemotherapie bei HPV-assoziierten
Tumoren bringen würde, existieren nicht und es gibt nur wenige experimentelle Studien
hierzu. Daher sollte anhand von in vitro Experimenten an Zellkulturen untersucht
werden, ob HPV-positive Tumorzelllinien im Vergleich zu HPV-negativen durch
alleinige Bestrahlung effektiv behandelt werden können und welche molekularen
Veränderungen durch eine Bestrahlung hervorgerufen werden.
Zunächst sollte eine strahlenbiologische Charakterisierung der verwendeten Zelllinien
erfolgen. Dafür sollte die Strahlensensitivität gegenüber ionisierender Strahlung
determiniert werden, sowie ihre Auswirkung auf die Zellproliferation und das Reparatur-
13
Verhalten der Zellen. Die bessere Prognose der Patienten mit HPV-assoziierten
Tumoren wird durch eine verstärkte Strahlensensitivität erklärt, die molekularen
Ursachen sind allerdings unbekannt. Daher sollten molekulare Marker identifiziert
werden,
die
in
Strahlenresistenz
HPV-negativen
gegenüber
Tumoren
HPV-positiven
dysreguliert
Tumoren
sind,
eine
verursachen
erhöhte
und
einen
potentiellen Angriffspunkt für eine bessere Therapie darstellen. Hierzu sollte die
Expression der Gene untersucht werden, die an der zellulären Strahlenantwort beteiligt
sind. Die Gen-Produkte sollten ebenfalls analysiert werden, um Unterschiede zwischen
HPV-positiven und -negativen Zelllinien zu definieren. Die unterschiedliche ProteinExpression könnte Aufschluss über eine Resistenzbildung nach Bestrahlung in HPVnegativen Zelllinien geben und so molekulare „targets“ für optimierte Therapieansätze
Noxen-assoziierter Tumore bringen.
Die Expression der viralen Onkogene E6 und E7 ist essentiell für die Transformation
epithelialer Zellen. In wie weit die Bestrahlung einen Einfluss auf die Expression der
viralen Onkogene in HPV-positiven Zellen hat, ist nicht bekannt. Daher sollte die E6und E7-Expression untersucht werden, um Aufschluss über die transkriptionelle
Regulation nach Bestrahlung zu erlangen. Eine veränderte, strahleninduzierte
Genexpression könnte Hinweise zur Erklärung des besseren Gesamtüberlebens HPVpositiver Tumorpatienten liefern. Dies könnte ausschlaggebend für
eine zu
verändernde Therapiemodalität bei HPV-positiven Plattenepithelkarzinomen des
Oropharynx sein.
14
2
Materialien und Methoden
2.1 Geräte und Materialien
In der Arbeit wurden die folgenden Laborgeräte und Materialien verwendet:
Geräte
Hersteller
Neubauer improved Zählkammer
Waagen:
Hartenstein
PCB
Kern
&
ABJ
Deutschland
Sohn
GmbH,
Balingen,
Magnetrührer RCT Basic
IKA Labortechnik, Staufen
pH Meter HI 2211 pH/ORP Meter
Hanna Instruments, Kehl am Rhein
Wärmeschrank Heratherm
Thermo Fisher Scientific, Langenselbold
VWR International GmbH, Darmstadt;
Schüttler
NeoLab, Heidelberg
Mixing Block MB-102
Bioer Technology, China
Vortex Mixer
NeoLab, Heidelberg
Vortex LabDancer
VWR International GmbH, Darmstadt
Wasserbad Aqualine AL2
Lauda GmbH & Co KG, Königshofen
Materialien
Hersteller
Biosphere® Filterspitze farblos
Sarstedt, Nümbrecht
Filterpapier
Rotilabo-Blotting Papier, Roth, Karlsruhe
Imaging Chamber 8 microscope slide
bottom (8 Kammern à 0,88cm²)
Nitrocellulosemembran:
PAA, Pasching, Österreich
Protran Whatman GmbH, Dassel
Nitrocellulose Transfer Membran
Pasteur-Pipetten150mm, 230mm
Reaktionsgefäße
VWR International GmbH, Darmstadt
1,5ml, 2ml
Eppendorf, Hamburg
15ml, 50ml
Sarstedt, Nümbrecht
Serologische Pipetten: 1ml, 5ml, 10ml, Greiner Bio-One GmbH,
25ml
Frickenhausen; Sarstedt, Nümbrecht
3,5cm,
Zellkulturgefäße
6cm,
10cm
Durchmesser
6-, 12-, 24-, 96-well
Zellschaber 16cm, 23cm
Sarstedt, Nümbrecht
Sarstedt, Nümbrecht
Sarstedt, Nümbrecht
15
2.1.1 Spezielle Geräte und Materialien am Standort Gießen
Am Standort Gießen wurden folgende spezielle Geräte und Materialien verwendet:
Geräte und Materialien
Hersteller
Bioanalyzer 2100
Agilent Technologies, Waldbronn
ChemiDoc XRS System incl. Software
ImageLab Version 3.0
BioRad, Dreieich
Glaspipette: Hamilton
Hamilton Company, Nevada, USA
Inkubator Heracell 240i
Thermo Scientific, Waltham, USA
Lichtmikroskop DMI 3000B
Leica, Solms
Nanodrop 2000c
Thermo Fisher Scientific, Langenselbold
Nitrucellulosemembran: Protran
Whatman GmbH, Dassel
Nitrocellulose Transfer Membran
PCR System Thermal Cycler C1000
BioRad, Dreieich
Plattenreader Nanoquant infinite M200 pro
Tecan Group, Männedorf, Schweiz
Applied Biosystems, Life Technologies,
Real time PCR System StepOnePlus
RNA
6000
Nano
Chip
(On-
Carlsbad, CA, USA
Chip-
Electrophoresis), Recorder Nr. 5067-1511
RNA 6000 Nano Reagents Part 1
Spannungsquelle für Kammer Power Pac
Basic, Power Pac HC
Trans-Blot Semi-Dry
Agilent Technologies, Waldbronn
Agilent Technologies, Waldbronn
BioRad, Dreieich
BioRad, Dreieich
Ultraschallgerät Vial Tweeter mit UIS250L Hielscher Ultrasonics GmbH, Teltow
Prozessor
Western Blot System Mini Protean Tetra
System (Glasplatten klein: 10,1 x 7,3 cm)
Western Blot Protean 2 Cell (Glasplatten
groß: 16x16cm)
BioRad, Dreieich
BioRad, Dreieich
Eppendorf Centrifuge 5810R Eppendorf, Hamburg
Zentrifugen:
Mini plate spinner MPS1000
Labnet, New Jersey, USA
Heraeus Pico 17
Thermo Scientific, Waltham, USA
Heraeus Fresco 21
Thermo Scientific, Waltham, USA
16
2.1.2 Spezielle Geräte und Materialien am Standort Marburg
Am Standort Marburg wurden folgende spezielle Geräte und Materialien verwendet:
Geräte und Materialien
Durchflusszytometer
Gelkammer
Hersteller
LSR 2 Flow Cytometer
BD Bioscience
PerfectBlue™
peqlab
Doppelgelsystem Twin ExW S
GmbH, Erlangen
HERACell
Heraeus Holding GmbH,
Inkubatoren
Hanau
Kamera
INCO2 153
Memmert, Schwabach
Hamamatsu Orca-03G
Nikon, Japan
Linearbeschleuniger in Elekta
der
Klinik
Strahlentherapie
Technologies
Supernova,
Fokus- Elekta,
Stockholm,
für Objekt-Abstand (FSD): 100cm. Schweden
und Bestrahlt wurde bei 6 MeV mit
Radioonkologie
einer
Dosisleistung
von
4Gy/min.
Mikroskop
Motorised
research Olympus, Hamburg
microscope IX81
Photometer
Smart Spec Plus
Plattenreader
Mithras
LB
BioRad, Dreieich
940
Microplate Berthold
Reader
Röntgenröhre
Filter
XRad320iX
0,5mm
Technologies,
Bad Wildbach
8:
0,5mm
Kupfer
Aluminium,
+ Precision X-ray Inc., North
Fokus- Bradford, UK
Objekt-Abstand (FSD): 60cm.
Bestrahlt wurde bei 320kV und
10mA mit einer Dosisleistung
von 1,04Gy/min.
Zentrifugen
Heraeus Fresco 21 Centrifuge
Heraeus Holding GmbH,
Megafuge 1.0R
Hanau
2.2 Chemikalien und Reagenzien
In der Arbeit wurden folgende Chemikalien und Reagenzien verwendet:
Chemikalien/Reagenzien
Acrylamid-Lösung (40 %) - Mix 37,5 : 1 für
die Molekularbiologie
Bezugsquelle
Applichem, Darmstadt
Agarose, low melt
Applichem, Darmstadt
AllPrep Kit
QIAgen, Hilden
17
Ammoniumpersulfat (APS)
Applichem, Darmstadt
Pierce,
BCA Protein Assay Kit
Thermo
Fisher
Scientific,
Langenselbold
BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Applied Biosystems, Life Technologies,
Kit
Darmstadt
BSA, bovine serum albumin powder,
≥98%,
Essentially
fatty
acid
free, Sigma-Aldrich, Taufkirchen
essentially globulin free
Chlorophorm:Isoamylalkohol (24:1)
ColorPlus
Prestained
Protein
Applichem, Darmstadt
Marker,
Broad Range
NEB, Frankfurt am Main
DNA-Ladder, 2 log (0,1-10 kbp)
NEB, Frankfurt am Main
DNeasy Blood&Tissue Kit
QIAgen, Hilden
DyeEx 2.0 Spin Kit
QIAgen, Hilden
Gel Loading Dye, Blue (6x)
NEB, Frankfurt am Main
Glycin
Applichem, Darmstadt
High Capacity RNA-to-cDNA Kit
Life Technologies, Darmstadt
Human p53 Signaling, RT2 Profiler PCR
Array, Format C (PAHS-027Z)
Immobilon
Western
Chemiluminescent
HRP Substrate
Immun-Star Western Chemiluminescence
Kit (luminol/enhancer, peroxide solution)
QIAgen, Hilden
Millipore, Darmstadt
BioRad, Dreieich
Magermilchpulver
Applichem, Darmstadt
Midori Green Advence
Biozym, Hessisch Oldendorf
Natriumdodecylsulfat (SDS)
Applichem, Darmstadt
Paraformaldehyd
Applichem, Darmstadt
Phenol:Chlorophorm:Isoamylalkohol
(25:24:1)
Applichem, Darmstadt
Ponceau S Solution
Sigma-Aldrich, Taufkirchen
Propidiumiodid
PromoCell GmbH, Heidelberg
Protease-Inhibitor-Cocktail
Sigma-Aldrich, Taufkirchen
RIPA-Puffer
Sigma-Aldrich, Taufkirchen
RNeasy Mini Kit
QIAgen, Hilden
RT² First Strand Kit
QIAgen, Hilden
SYBR Select Master Mix
Applied Biosystems, Life Technologies,
18
Darmstadt
SYBR Green ROX qPCR Mastermix
QIAgen, Hilden
50x TAE
Applichem, Darmstadt
Tris Base
Applichem, Darmstadt
Tris HCl
Applichem, Darmstadt
TritonX-100
Applichem, Darmstadt
Tween20
Applichem, Darmstadt
Wasser, Chromasolv Plus (für HPLC)
Sigma-Aldrich, Taufkirchen
Hier nicht aufgeführte Chemikalien wurden von den Firmen Applichem (Darmstadt),
Sigma-Aldrich (Taufkirchen), Merck (Darmstadt) oder Roth (Karlsruhe) bezogen.
2.3 Antikörper und Enzyme
Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden folgende Primär-Antikörper angewandt:
Antikörper
β-Tubulin
Klon
TUB 2.1
Spezies
Maus,
Eingesetzte
1: 10 000
Sigma
monoklonal
Cyclin D1
SP4
E2F-1
p16INK4
p53
Aldrich,
Taufkirchen
Kaninchen,
1:500
monoklonal
2%BSA/TBST
Maus,
1:1000
monokolnal
BSA/TBST
G175-
Maus,
1:1500
405
monoklonal
MTBST
7F5
Kaninchen,
1:800
monoklonal
BSA/TBST
KH95
Hersteller
Verdünnung
in DAKO, Dänemark
in
2% BD Pharmingen
in
5% BD Biosciences
in
2% Cell
Signalling
Techn.,
NEB,
Frankfurt/Main
p53
Phospho
DO-7
p53
(Ser15)
Maus,
1:1000
in
monokolnal
BSA/TBST
Kaninchen,
1:3000
monoklonal
BSA/TBST
in
2% BD Biosciences
2% Cell
Signalling
Techn.,
NEB,
Frankfurt/M.
Retinoblastom
4H1
Maus,
1:2000
monoklonal
MTBST
in
5% Cell
Signalling
Techn.,
NEB,
Frankfurt/Main
19
Retinoblastom
G3-245
Maus,
1:800
(aa 332- monoklonal
in
2% BD Biosciences
BSA/TBST
344)
Des Weiteren wurden folgende Sekundär-Antikörper benutzt:
Eingesetzte
Antikörper
Hersteller
Verdünnung
Anti-Hase-IgG
Anti-Maus-IgG
HRP-
1:1000 in 0,5% Cell
konjugiert
BSA/TBST
HRP-
1:1000 in 0,5% Cell
konjugiert
BSA/TBST
Signalling
Techn.,
NEB, Frankfurt/Main
Signalling
Techn.,
NEB, Frankfurt/Main
Außerdem wurden folgende Enzyme verwendet:
Enzym
DNase I, RNase-frei
RNase A
Phusion Hot Start Flex DNA Polymerase
Hersteller
QIAgen, Hilden
Cell Signalling Techn., NEB, Frankfurt/Main
2.4 Primer
Die verwendeten Primersequenzen der HPV-PCR, der HPV16 E6-E7-Sequenzierung,
sowie der qPCR mit P0, E6 und E7 wurden von Dr. Steffen Wagner (Gießen) erstellt
bzw. aus Literaturquellen übernommen. Alle Primer wurden von Eurofins MWG
Operon, (Ebersberg) bezogen. Die Primersequenzen sind in 5‘3‘ Richtung und mit
zugehöriger Schmelztemperatur in nachfolgender Tabelle angegeben:
20
Primer
GP5+
Schmelztem
Sequenz
TTTGTTACTGTGGTAGATACTAC
Quelle
peratur [°C]
fwd
45
GP6+
GAAAAATAAACTGTAAATCATATTC
rev
HPV16
AGCGACCCAGAAAGTTACCA
fwd
E6
GCATAAATCCCGAAAAGCAA
rev
de Roda Husman, A M et
al. 1995
57
Wald et al. 2011
HPV16
CAGCTCAGAGGAGGAGGATG
fwd
E7
GCACAACCGAAGCGTAGAGT
rev
HPV16_E
GCCAACGCCTTACATACCG
fwd
6-E7-Seq
CGTACCCTCTTCCCCATTG
rev
TCGACAATGGCAGCATCTAC
fwd
ATCCGTCTCCACAGACAAGG
rev
57
P0
58
Steffen Wagner
57
Korrespondenz mit Dr. J.
Wagner, Institut für
Kardiovaskuläre
Regeneration, GoetheUniversität Frankfurt/M.
2.5 Zellkulturen
2.5.2 Verwendete Zelllinien
In der vorliegenden Arbeit wurden acht Plattenepithel-Karzinom-Zelllinien verwendet
(Tabelle 1). Alle wachsen adhärent als Monolayer. Die HPV-negativen Zelllinien UMSCC6 und UM-SCC11b, sowie die HPV-positiven Zelllinien UM-SCC-104 und UMSCC-47 wurden von Dr. Thomas E. Carey, Universität Michigan, USA, primär kultiviert
(Lin et al. 2007; Zhao et al. 2011); (Lansford et al. 1999). Die Zelllinie UT-SCC-33
(HPV-negativ) wurde von Dr. Reidar A. Grenman, Universität Turku, Finnland, etabliert
(Lansford et al. 1999), und die HPV-negative Zelllinie UD-SCC-1 wurde durch Dr.
Thomas Hoffmann, Universität Düsseldorf, zur Verfügung gestellt (Balló et al. 1999).
Die HPV-positive Zelllinie UPCI:SCC152 wurde von Dr. Susanne M. Gollin, Universität
Pittsburgh, USA, etabliert (White et al. 2007). Die HPV16-positive 93-VU-147T wurde
durch Dr. Hans Joenje, VU Medical Center Amsterdam, Niederlande, zur Verfügung
gestellt (Friedman et al. 2007).
21
Tabelle 1: Zelllinien-Informationen
Alter und Geschlecht der Patienten, sowie detaillierte Angaben zu HPV-, p53-Status und
Tumorgeweben, aus denen die verwendeten Zelllinien etabliert wurden.
Zelllinie
Alter /
Vorbe-
Ursprungs-
Geschlecht
handlung
gewebe
64/m
keine
Oropharynx
UD-SCC-1
HPV
p53
Ref.
Neg
FS/Wt
Balló et al.
(1999)
UM-SCC-6
37/m
keine
Zunge
neg
Wt
Grénman et al.
(1991)
UM-SCC-11b
65/m
Chemoth.
Larynx
neg
C242S
Lin et al. (2007)
UT-SCC-33
86/w
keine
Mundhöhle
neg
R282W
Lansford et al.
(1999)
UM-SCC-47
53/m
unbekannt
Mundhöhle/
HPV16
Wt
Lansford et al.
Zunge
UM-SCC-104
56/m
Radio+
Mundhöhle
(1999)
HPV16
Wt
Tang et al.
Chemoth.
UPCI:SCC152
47/m
Radioth.
(2012)
Hypopharynx
HPV16
Wt
White et al.
(2007)
93-VU-147T
58/m
keine
Mundhöhle
HPV16
L257R/
Steenbergen et
Wt
al. (1995)
UD = Universität Düsseldorf; UM = Universität Michigan; UPCI = Universität Pittsburgh; UT =
Universität Turku; m = männlich, w = weiblich; Wt = Wildtyp; FS = Frame-Shift-Mutation
(aus: Arenz et al. 2014)
2.5.3 Kultivierung der verwendeten Zelllinien
Die in dieser Arbeit verwendeten Zellen wurden in nachfolgend beschriebenem
Medium mit den aufgeführten Zusätzen kultiviert.
Roswell-Park-Memorial-Institute 1640 (RPMI) ohne L-Glutamine
2mM L-Glutamin
1% Nicht-essentielle Aminosäuren
0,1mg/ml Gentamicin
PAA,
Pasching,
Österreich
10% Fötales Kälberserum (April 2011 bis Juli 2012)
10% Fötales Kälberserum (ab August 2012)
Biochrom, Berlin
Sofern nicht anders angegeben wurden für die Passagierung und die Versuche
folgende Reagenzien verwendet:
22
1x Trypsin/EDTA
PAA,
Accutase
Österreich
1x PBS (steril, ohne Mg, ohne Ca)
Die
Zellen
wurden
in
Pasching,
Inkubatoren
bei
37°C
mit
CO2–Begasung
5%
und
wassergesättigter Atmosphäre in verschiedenen Zellkulturgefäßen kultiviert. Die
Passagierung erfolgte alle vier bis fünf Tage unter sterilen Bedingungen, wobei die
Zelldichte maßgeblich war. Ab einer Konfluenz von ca. 70-80% wurden die Zellen je
nach Wachstumseigenschaften im vorgewärmten Medium verdünnt und in neue
Kulturgefäße ausgesät. Zum Ablösen der Zellen wurde der Zellrasen einmal mit PBS
gewaschen und daraufhin mit ca. 1ml vorgewärmtem Trypsin/EDTA pro 20cm²
überschichtet (Inkubation: 5min bei 37°C). Durch seine proteolytische Eigenschaft wird
Trypsin zur Spaltung von Zell-Zell- und Zell-Oberflächen-Verbindungen eingesetzt.
Nach längerer Inkubationszeit kann die Substanz allerdings einen toxischen Effekt auf
die Zellen haben, weshalb die Reaktion durch Zugabe von Medium gestoppt wird.
Accutase wird in der Zellkultur ebenfalls zum Ablösen von Zellen eingesetzt, wirkt
jedoch auch bei längerer Inkubation nicht toxisch. Zum Ablösen der Zellen mit
Accutase wurde ca. 1ml pro 20cm² verwendet und die Zellen anschließend bei 37°C
inkubiert. Die Zellsuspension wurde in ein 15ml-Reaktionsgefäß überführt, für 4min bei
1200 U/min zentrifugiert und der Überstand verworfen. Das Zellpellet wurde in Medium
durch mehrmaliges auf- und abpipettieren vorsichtig resuspendiert und die Zellen
vereinzelt.
Für die jeweiligen Versuche wurde die Zellzahl der Suspension mit Hilfe einer
Neubauer
Zählkammer
bestimmt
und
die
Zellsuspension
entsprechend
den
Rahmen
einer
Versuchsbedingungen auf Kulturgefäße verteilt.
2.6 Methoden
Die
nachfolgend
beschriebenen
Daten
wurden
im
Forschungskooperation zwischen der Klinik für Hals-Nasen-Ohrenheilkunde, JustusLiebig-Universität Gießen und der Klinik für Strahlentherapie und Radioonkologie,
Phillips-Universität Marburg erhoben. Die Experimente zur Erstellung der WachstumsKurven (s. Abschnitt 2.6.3 und Tabelle 2) wurden Frau Roth und den Doktoranden
Frank Ziemann und Christina Mayer gemeinsam durchgeführt. Die Versuche zur
Plattierungseffizienz als Vorversuch für die Dosis-Effekt-Kurven (s. Abschnitt 2.6.5 und
Abbildung 6) wurden von Andrea Arenz, Maike Roth und den Doktoranden gemeinsam
erstellt. Die Experimente zum klonogenen Überleben der Zelllinien
wurden
23
schwerpunktmäßig von Frank Ziemann und Andrea Arenz geplant, generiert und
ausgewertet. Bei der Erstellung der Dosis-Effekt-Kurven entfiel der größere Anteil auf
Frank Ziemann und Andrea Arenz, Maike Roth und Christina Mayer arbeiteten bei
einigen Versuchen mit. Die Abbildung 6 wurde von Frank Ziemann erstellt und zur
Verfügung gestellt.
Die durchflusszytometrischen Messungen für die Zellzyklus-Analysen (s. Abschnitt
2.6.6 und Abbildung 7) wurden von Andrea Arenz geplant, durchgeführt und
ausgewertet, wobei die Doktoranden bei einzelnen Zeitpunkten die Zellen ausgesät
und geerntet haben. Die Rohdaten der Abbildung 8 und Abbildung 9 sind
schwerpunktmäßig von Andrea Arenz generiert und zur Verfügung gestellt worden.
Die Experimente zur Analyse der Gen-Expression (qPCR) sowie die Western Blot
Analysen wurden im HNO-Forschungslabor in Gießen durchgeführt.
Ein Teil der in dieser Arbeit dargestellten Daten ist in Arenz et al. 2014 bereits
publiziert.
2.6.1 HPV-PCR
Der in der Literatur angegebene HPV-Status der verwendeten Zelllinien wurde
experimentell mit Hilfe der Primer GP5+ und GP6+ überprüft. Diese amplifizieren in
einer PCR-Reaktion die DNA in der L1-Region im HPV16-Genom, sowie in anderen
HPV-Typen, und bilden ein Produkt von 141 Basenpaaren. Zur Untersuchung des
HPV-Status wurden die Zellen geerntet und je ca. 50 000 Zellen in PBS verdünnt. Die
Suspension wurde 8 min bei 95°C denaturiert und anschließend am Vial Tweeter
sonifiziert (Cycle 0,5 50%). Anschließend wurden 1,5µl der Suspension für die PCRReaktion weiterverwendet. Für die Herstellung eines Mastermix wurden Phusion® Hot
Start II High-Fidelity DNA Polymerase mit zugehörigem 5x Puffer, dNTP Set und
Wasser (Chromasolv Plus) verwendet. Der Mastermix setzt sich für ein StandardReaktionsvolumen wie folgt zusammen, für mehrere Reaktionen erfolgt eine
entsprechende Anpassung der Volumen:
24
Reagenz
Menge für eine Reaktion [µl]
Wasser, Chromosolv Plus
8,1
5x Phusion Puffer
4
dNTP Mix 10mM
0,4
Primer GP5+ (10pM/µl)
0,4
Primer GP6+ (10pM/µl)
0,4
Phusion Hot Start II Polymerase
0,2
Zell-PBS-Suspension
1,5
Gesamtvolumen
15
In jedem Versuchsansatz wurden eine Negativ-Kontrolle (mit Wasser anstatt der DNAProbe), sowie eine Positiv-Kontrolle (mit DNA einer bereits HPV-positiv getesteten
Zelllinie) angesetzt. Alle Reagenzien wurden in entsprechende Reaktionsgefäße
pipettiert und im PCR-Cycler mit folgendem Programm prozessiert:
Schritt
Temperatur [°C]
Zeit
Anzahl Zyklen
Initiale Denaturierung
98
45 sec
1
Denaturierung
98
12 sec
40
Primer-Hybridisierung
45
40 sec
40
Elongation
72
15 sec
40
Finale Elongation
72
4 min
1
Abkühlen
8
∞
-
Die PCR-Proben wurden anschließend gelelektrophoretisch ihrer Größe entsprechend
aufgetrennt. Hierzu wurden 10%ige Polyacrylamid-Gele verwendet, die nach der
folgenden Zusamensetzung angefertigt wurden:
Reagenz
Menge für ein Gel [ml]
50x TAE
0,4
Acrylamid-Lösung (40%)
5
TEMED
0,016
6% APS
0,160
ddH2O
14,4
Gesamtvolumen
20
Von den PCR-Proben wurden 10µl mit 2µl 6x Gel Loading Dye Blue versetzt und auf
das Gel aufgetragen. Zur Größenbestimmung der PCR-Produkte wurden 4µl DNAMarker (Low Molecular Weight DNA Ladder) in eine Gelspur gegeben. Die
25
Elektrophorese erfolgte bei 150 Volt konstant für 60min in 1x TAE Laufpuffer.
Anschließend wurde das Gel für 30min in Midori-Green-Lösung inkubiert, kurz (510min) in Wasser gewaschen und unter UV-Licht dokumentiert.
2.6.2 Sequenzierung der HPV E6 und E7-Genregion
Zur Überprüfung der Sequenz der viralen Onkogene E6 und E7 wurde die
entsprechende virale Genregion einer Sequenzierung unterzogen. Dazu erfolgte eine
DNA-Gewinnung mittels DNeasy Blood&Tissue Kit gemäß Herstellerprotokoll. Die
DNA-Konzentration wurde mittels Nanodrop bestimmt und 50ng der isolierten DNA für
die PCR-Reaktion verwendet. Folgende Reagenzien wurden für den Mastermix
eingesetzt:
Reagenz
Menge für eine Reaktion [µl]
Wasser, Chromosolv Plus
5,95
5x Phusion Puffer
3
dNTP Mix 10mM
0,3
Primer HPV16_E6E7_seq_fwd (10pM/µl)
0,3
Primer HPV16_E6E7_seq_rev (10pM/µl)
0,3
Phusion Hot Start II Polymerase
0,147
Chromosomale DNA [50ng]
5
Gesamtvolumen
15
Wie in Abschnitt 2.6.1 wurden in jedem Versuchsansatz eine Negativ- und eine PositivKontrolle angesetzt. Das Programm für die PCR-Reaktion enthielt folgende Schritte:
Schritt
Temperatur [°C]
Zeit
Anzahl Zyklen
Initiale Denaturierung
98
30 sec
1
Denaturierung
98
12 sec
Primer-Hybridisierung
58
40 sec
Elongation
72
30 sec
Finale Elongation
72
4 min
1
Kühlung
8
∞
-
40
Um die Fragmentlänge der PCR-Produkte zu ermitteln wurden Aliquots von 10µl der
Proben gelelektrophoretisch ihrer Größe entsprechend auf einem 1%igen Agarose-Gel
in 1x TAE aufgetrennt. Die Proben wurden mit 6x Gel Loading Dye Blue versetzt und
auf das Gel aufgetragen. Als Größenstandard dienten 4µl 2log DNA-Ladder. Als
Laufpuffer wurde 1x TAE verwendet. Die Elektrophorese erfolgte bei 65mA 1x TAE
26
Laufpuffer. Anschließend wurde das Gel für 30min in Midori-Green-Lösung inkubiert,
kurz (5-10min) in Wasser gewaschen und unter UV-Licht dokumentiert.
Diejenigen PCR-Produkte, die die gewünschte Größe von 1000 Basenpaaren hatten,
wurden über organische Extraktion wie in folgendem Protokoll beschrieben
aufgereinigt: Zu jeder Probe wurden 15µl 3M Natrium-Acetat gegeben und das
Gemisch auf 150µl mit ddH2O aufgefüllt. Anschließend erfolgte die Zugabe von 150µl
Phenol:Chlorophorm:Isoamylalkohol (25:24:1). Die Probe wurde geschüttelt und bei
maximaler Geschwindigkeit für 10min bei Raumtemperatur zentrifugiert. Der obere
wässrige Phase wurde abgenommen und mit 150µl Chlorophorm:Isoamylalkohol (24:1)
versetzt. Nach erneutem Schütteln wurde für 10min bei maximaler Geschwindigkeit
und Raumtemperatur zentrifugiert und der Überstand mit enthaltener DNA in ein neues
Reaktionsgefäß überführt. Nun wurde je das 2,5x Volumen an 100% Ethanol
zugegeben, die Probe gemischt und für 30min bei Raumtemperatur und anschließend
für mindestens 30min bei -20°C inkubiert. Durch Zentrifugation bei maximaler
Geschwindigkeit für 10min bei Raumtemperatur wurde die gefällte DNA sedimentiert,
und jeglicher Überstand entfernt. Das Pellet wurde Luftgetrocknet, die DNA in 20µl
ddH20 gelöst und ihre Konzentration am Nanodrop gemessen.
Die DNA-Sequenzierung erfolgte daraufhin mit Hilfe des BigDye Terminator v3.1 Cycle
Sequencing Kits. Es beinhaltet einen Reaction PreMix, der eine Polymerase und
Nukleotide mit und ohne Fluorochrom-Kopplung enthält. Nach dem Prinzip der Basenspezifischen Kettenabbruch-Reaktion kann die Polymerase nach Einbau eines
markierten Nukleotids an den komplementären Strang kein weiteres Nukleotid
einbauen, weshalb DNA-Fragmente mit Fluorochrom-gekoppelten Nukleotid-Enden
entstehen. Die Reaktionen wurden separat für beide Primer angesetzt, da die
Sequenzierungs-Reaktion nur in 3´-Richtung erfolgt und somit ein Gemisch aus beiden
Primern die Sequenzierung in jeweils entgegengesetzte Richtung bewirken würde:
Reagenz
Volumen für eine Reaktion [µl]
PCR-Produkt (20ng)
1-3
Primer (10pmol): HPV16_E6E7_seq_fwd bzw rev
0,75
BigDye Terminator: Sequencing Puffer (5x)
1,5
BigDye Terminator: Reaction PreMix (2,5x)
1
Wasser, Chromosolv Plus
Gesamt
ad 10
10
27
Das Programm für die PCR-Reaktion enthielt folgende Schritte:
Anzahl
Schritt
Temperatur [°C]
Zeit
Initiale Denaturierung
96
1min
Denaturierung
96
10 sec
Primer-Hybridisierung
50
5 sec
Elongation
60
1min 15sec
Kühlung
8
∞
Zyklen
1
25
-
Um Salze und überschüssige Fluorochrome, die in der Sequenzierungs-PCR nicht an
DNA-Fragmente gebunden worden sind, zu entfernen, wurden die Proben durch GelFiltration aufgereinigt. Hierfür wurde entsprechend der Herstellerangaben des DyeEx
2.0 Spin Kits die Gel-Matrix vorbereitet und die Probe darauf pipettiert. Die markierten
PCR-Produkte gelangen durch die Matrix hindurch, Salze und überschüssige Moleküle
verbleiben dagegen in den Gel-Poren. Nach Zentrifugation wurde das Eluat an das
Institut für Pathologie des Universitätsklinikums Giesen zur Sequenzierung geschickt,
wo die DNA-Moleküle elektrophoretisch entsprechend ihrer Größe aufgetrennt und die
fluoreszierenden End-Nukleotide detektiert wurden. Die Ergebnisse wurden mit Hilfe
der Software GeneStudio Professional v. 2.2.0.0, NCBI BLAST (National Center for
Biotechnology Information, Basic Local Alignment Search Tool) und ClustalW2
analysiert und mit Referenzgenomen von HPV16-Virustypen der NCBI-Datenbank
verglichen.
2.6.3 Wachstumskurven und Koloniebildungseffizienz
Um
Zellen
strahlenbiologisch
Wachstumsgeschwindigkeit
Plattierungseffizienz)
ermittelt
charakterisieren
sowie
werden.
die
Für
zu
können
mussten
Koloniebildungseffizienz
die
Messung
der
die
(sog.
Wachstums-
geschwindigkeit wurden die Zellen wie unter 2.5.3 beschrieben in Suspension gebracht
und mit einer Dichte von 1∙104 Zellen pro cm² in 3,5cm Kulturgefäßen ausgesät. Über
einen Zeitraum von 8 Tagen wurde in regelmäßigen Abständen die Zellzahl mit Hilfe
einer Neubauer Zählkammer bestimmt. Am vierten Tag wurde das Medium in den
Zellkulturgefäßen erneuert um keine Wachstumsstagnation aufgrund verbrauchten
Mediums zu erzeugen. Die Ergebnisse der Zellzahlen pro cm² wurden grafisch in
Abhängigkeit von der Inkubationszeit aufgetragen. Anhand der Steigung im
exponentiellen Bereich der Wachstumskurve wurde die Wachstumsgeschwindigkeit
ermittelt.
28
Die Fähigkeit zur Koloniebildung der Zelllinien wurde untersucht, indem jeweils 100,
200, 300, 400 und 500 Zellen in 6cm Kulturgefäße ausgesät wurden. Etwa 14 Tage
nach der Aussaat wurde das Medium der Kulturschalen abgenommen, der Zellrasen
mit 1x PBS gewaschen und für 15min mit Kristallviolett-Lösung (s.u.) fixiert und gefärbt.
Die Anzahl der Kolonien mit mehr als 50 Tochterzellen wurde unter dem Mikroskop
ermittelt. Das Verhältnis der gezählten Kolonien zur Menge der ausgesäten Zellen
ergibt die Plattierungseffizienz (PE).
0,1% Kristallviolett
Applichem, Darmstadt
10% Paraformaldehyd
Applichem, Darmstadt
Anzahl der Kolonien
PE =
Anzahl der ausgesäten Zellen
2.6.4 Bestrahlung
Für die Erstellung der Dosiseffektkurven wurden die Zellen in der Klinik für
Strahlentherapie
und
Radioonkologie
am
Universitätsklinikum
Marburg
bei
Raumtemperatur an einem Linearbeschleuniger (Elekta Supernova) mit einer
Dosisleistung von 4Gy/min mit Einzeldosen von 1Gy, 2Gy, 4Gy, 6Gy oder 8Gy
bestrahlt. Die Beschleunigungsspannung der Photonen betrug 6 MeV. Die Bestrahlung
der Zellen erfolgte als Monolayer in einem PMMA Phantom, was garantierte, dass sich
das Dosismaximum im Bereich der Zellmonolayer befand. Der Gantrywinkel betrug
180°, der Fokus-Objekt-Abstand 100 cm. Die Dosis wurde mittels Absolutdosimetrie
verifiziert.
Für die Versuche zur RNA- und Proteinexpression wurden die Zellen als Monolayer im
Biomedizinischen Forschungszentrum bei Raumtemperatur mit einer Röntgenröhre
(XRad320iX) für Zellkulturexperimente mit einer Dosisleistung von 1Gy/min mit einer
Einzeldosis von 6Gy bestrahlt. Die Beschleunigungsspannung betrug 320kV und der
Kathodenstrom 10mA. Während der Bestrahlung wurde ein Filter aus 0,5mm Kupfer
und 0,5mm Aluminium verwendet. Der Fokus-Objekt-Abstand betrug 60cm.
2.6.5 Klonogenes Überleben (Dosis-Effekt-Kurven)
Das klonogene Überleben beschreibt die Fähigkeit von Einzelzellen, sich zu teilen und
Kolonien von Tochterzellen zu bilden. Um den Effekt ionisierender Strahlung auf das
Wachstum der verwendeten Zellen zu untersuchen wurde deren klonogenes
Überleben
mittels
Dosis-Effekt-Analysen
ermittelt.
Dazu
wurden
exponentiell
29
wachsende Zellen in 6cm Kulturgefäße mit unterschiedlichen Dichten (200 - 24000
Zellen)
ausgesät.
Die
initial
eingesäte
Zelldichte
musste
der
individuellen
Plattierungseffizienz jeder Zelllinie und dem erwarteten letalen Effekt der Bestrahlung
angepasst werden. Es wurde angestrebt, ein Wachstum von ca. 50 Kolonien pro
Kulturgefäß unabhängig von der Bestrahlungsdosis gewährleisten zu können.
Die Zellen wurden 24h nach ihrer Aussaat mit Dosen von 1 bis 8Gy in der Klinik für
Strahlentherapie am Linearbeschleuniger Elekta Supernova bestrahlt und für 14 bis 18
Tagen bei 37°C ohne Mediumwechsel inkubiert. Anschließend wurden die Zellen wie
unter Abschnitt 2.6.3 beschrieben fixiert und mit 0,1% Kristallviolett angefärbt. Die
Überlebensfraktion (surviving fraction, SF) wird als Quotient der Anzahl von Kolonien
nach Bestrahlung zur Menge ausgesäter Zellen und der Plattierungseffizienz definiert:
Anzahl der Kolonien nach Bestrahlung
SF =
Anzahl der ausgesäten Zellen ∙ PE
Die Ergebnisse des klonogenen Zellüberlebens (survival, S) nach Bestrahlung
(radiation dose, D) wurden halblogarithmisch aufgetragen und anhand des
linearquadradtischen Modells gefittet (Franken, Nicolaas A P et al. 2006):
S (D) / S(0) = exp (αD + βD²)
2.6.6 Durchflusszytometrie zur Zellzyklus-Analyse
Durch die strahleninduzierte Schädigung der DNA wird u. a. die Reproduktion der
Zellen beeinflusst. Über einen Zellzyklusarrest werden Reparatur-Maschinerien in
Gang gesetzt, die die genomischen Schäden beseitigen sollen. Sind diese Schäden
irreparabel oder ist die Funktion der Reparatur-Mechanismen beeinträchtigt, so werden
die Zellen über den Mechanismus des programmierten Zelltods (Apoptose) gezielt
abgetötet. Mit Hilfe des LSR 2 Flow Cytometers (BD Biosciences, Standort: Uniklinik
Marburg)
wurden
Zellzyklus-Analysen
durchgeführt,
die
die
Verteilung
der
Zellpopulation auf die verschiedenen Phasen des Zellzyklus mit Hilfe des DNAinterkalierenden
Farbstoffs
Propidiumiodid
untersuchten.
Da
sich
die
Fluoreszenzintensität des Propidiumiodids proportional zum DNA-Gehalt der Zelle
verhält kann über eine Intensitäts-Änderung zwischen G1- (einfacher DNA-Gehalt), S(ein-
bis
zweifacher
DNA-Gehalt)
und
G2-Phase
(zweifacher
DNA-Gehalt)
unterschieden werden. DNA-haltige Zellfragmente, wie sie etwa bei Apoptose
entstehen, werden vor der G1-Phase gemessen (sog. subG1-Phase). Polyploide
Zellen werden zwar auch erfasst, jedoch ist keine Unterscheidung zwischen „normalen“
30
G2-arrettierten Zelle (DNA-Gehalt: 4N) und polyploiden G1-arrettierten Zellen (DNAGehalt: 2x 2N = 4N) möglich.
Methodisch wurden Zellen in 6cm Kulturgefäße mit unterschiedlichen Dichten ausgesät
und während ihrer exponentiellen Wachstumsphase mit 2 oder 6Gy bestrahlt. Die
Zellen wurden zu definierten Zeitpunkten geerntet, wobei die im Kulturüberstand und
Waschschritt befindlichen Zellen in 15ml Reaktionsgefäßen aufgefangen wurden, um
zu gewährleisten, dass abgeschwommene, apoptotische Zellen in die Messung
eingingen. Der adhärente Zellrasen wurde mittels Accutase abgelöst (siehe 2.5.3),
durch auf- und abpipettieren vereinzelt und mit eiskaltem 70%igem Ethanol fixiert. Die
Suspension wurde über Nacht bei -20°C inkubiert. Vor der durchflusszytometrischen
Messung wurden die Zellen abzentrifugiert, einmal mit PBS gewaschen, und
schließlich mit 500µl 1xPBS und 500µl DNA-Extraktions-Puffer versetzt, der die
Zellmembranen permeabilisiert:
192ml 0,2mM Na2HPO4
8ml 0,1% TritonX-100
pH 7,8
In H2O
Nach Inkubation für 5min bei Raumtemperatur wurde die Suspension zentrifugiert und
die Zellen in 400µl DNA-Färbe-Lösung resuspendiert:
20µg/ml Propidiumiodid
PromoCell GmbH, Heidelberg
200µg RNase A (Stock: 2,5mg/ml)
QIAgen, Hilden
In PBS
PAA, Pasching, Österreich
Die Proben wurden für 30min bei Raumtemperatur unter Lichtausschluss inkubiert und
anschließend der zelluläre DNA-Gehalt am LSR 2 analysiert. Pro Probe wurden
mindestens 20 000 Zellen gemessen, und die Daten mittels FlowJo 7.6 Software (Tree
Star Inc., San Carlos, CA, USA) von Frau Dr. Arenz ausgewertet. Die Anzahl der
gemessenen Zellen wurde in Histogrammen gegen den DNA-Gehalt aufgetragen.
2.6.7 Proteinbiochemie
2.6.7.1 Protein-Isolation aus Gesamt-Zell-Extrakten
Um den Effekt der Bestrahlung auf ausgewählte Proteine, die an der intrinsischen
Strahlenantwort beteiligt sind, zu analysieren wurden die verwendeten Zellen in
Zellkulturgefäße ausgesät und bei einer Konfluenz von 70-80% mit 6Gy bestrahlt und
im Inkubator bis zur weiteren Analyse inkubiert, um externe Stressfaktoren
auszuschließen und so ausschließlich den Bestrahlungseffekt untersuchen zu können.
31
Die unbestrahlte Kontrollgruppe sowie die bestrahlten Zellen wurden zum jeweiligen
Zeitpunkt mittels Trypsin von dem Boden der Kulturgefäße abgelöst, die Zellzahl
bestimmt und die Zellen pellettiert. Sofern nicht anders angegeben wurden alle
folgenden Schritte mit gekühlten Substanzen und auf Eis durchgeführt. Zur ProteinIsolation wurde – abhängig von der Zellzahl – eine Lösung aus RIPA-Puffer und
Protease-Inhibitor-Cocktail auf das Zellpellet pipettiert:
150µl RIPA-Puffer pro 5∙106 Zellen
Sigma-Aldrich, Taufkirchen
15µl Protease Inhibitor Cocktail pro 150µl RIPA
Sigma-Aldrich, Taufkirchen
Die Zellsuspension wurde gemischt und anschließend für 10min bei maximaler
Geschwindigkeit bei 4°C zentrifugiert. Der Überstand wurde abgenommen und für die
Protein-Konzentrations-Bestimmung und Western Blot Analyse verwendet.
Die Western Blot Analyse der Retinoblastom-Proteine erfolgte zusätzlich auch mit
Zellpellets, die mit SDS-Ladepuffer (Rezept siehe Abschnitt 2.6.7.3) versetzt wurden.
Die Proteine der Probe wurden anschließend für 5min bei 95°C denaturiert und je 20µl
des Lysats zur Analyse eingesetzt.
2.6.7.2 Protein-Konzentrations-Messung mittels BCA-Assay
Zur Bestimmung der Protein-Konzentration des Gesamtzelllysats wurde das
Bicinchoninsäure (BCA) Protein Assay Kit verwendet. Diesem Kit liegt ein
biochemisches Verfahren zugrunde, bei dem die Reduktion von Cu2+ zu Cu+
temperaturabhängig
durch
Aminosäurereste
und
Peptidbindungen
erfolgt.
Bicinchoninsäure bildet mit den reduzierten Kupferionen Chelatkomplexe, die einen
Farbumschlag der Lösung herbeiführen, der bei einer Absorption von 562nm
gemessen werden kann. Die in den Proben enthaltene Proteinmenge ist hierbei
proportional zur gebildeten Menge der Chelatkomplexe. Die zu untersuchenden
Proben wurden verdünnt und entsprechend der Herstellerangaben mit Reagent A und
B
versetzt.
Die
Protein-Konzentration
der
Proben
wurde
anhand
einer
Verdünnungsreihe von BSA mit bekannter Protein-Konzentration berechnet.
Pierce® BCA Protein Assay Reagent A: Bicinchoninsäure
Thermo-Fisher
Pierce® BCA Protein Assay Reagent B: Kupfersulfat
Langenselbold
Scientific,
2.6.7.3 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese
Proteine werden über SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-Page) ihrer Größe
entsprechend aufgetrennt. Die Polyacrylamid-Matrix besteht aus quervernetzten
Acrylamid- und N´N´-Methylen-Bisacrylamid-Polymeren, deren Polymerisation mit Hilfe
32
von Ammoniumersulfat-Ionen (APS) gestartet und von Tetramethylerindiamin (TEMED)
katalysiert wird. In Abhängig von der eingesetzten Menge des Acrylamids entstehen
engmaschigere (hohe Konzentration) Gele zur besseren Auftrennung kleinerer
Proteine, oder weitmaschige Gele (geringe Konzentration) zur besseren Auftrennung
größerer Proteine. In der vorliegenden Arbeit wurden diskontinuierliche Gele
verwendet, bestehend aus einem Sammelgel (4%) und einem Trenngel (12% oder 6%)
mit jeweils unterschiedlichen Puffersystemen. Folgende Puffer wurden für die SDSPage verwendet:
10x Laemmli-Laufpuffer:
250 mM Tris Base
1x Laufpuffer als 10x
Konzentrat angesetzt.
1,92 M Glycin
1% Natriumdodecylsulfat (SDS)
in ddH2O
4x Sammelgelpuffer:
15,14g Tris-base (0,5M)
pH 6,8 mit HCl einstellen
10ml 10%iges SDS (0,4%)
in ddH2O
4x SDS-Ladepuffer:
15% Glycerin
4% Natriumdodecylsulfat (SDS)
20% β-Mercaptoethanol
25% 4x Sammelgelpuffer
4% Bromphenolblau
in ddH2O
4x Trenngelpuffer:
1,5M Tris Base
pH 8,8
0,4% Natriumdodecylsulfat (SDS)
in ddH2O
Für die Standard-SDS-Gele (Größe 10,1cm x 7,8cm x 1mm) wurden folgende Mengen
eingesetzt:
Trenngel (12%)
Menge pro Gel
Sammelgel (4%)
Menge pro Gel
4x Trenngelpuffer
5 ml
4x Sammelgelpuffer
2,5ml
ddH2O
8,8ml
ddH2O
6,4ml
40%
Acrylamid- 6ml
Lösung
40%
Acrylamid- 1ml
Lösung
6% APS
160µl
6% APS
90µl
TEMED
16µl
TEMED
9µl
33
Zur besseren Protein-Banden-Auftrennung wurden längere Gelplatten verwendet
(Größe 20cm x 20cm x 1mm) und 12%igen SDS-Gele wurden folgendermaßen
hergestellt:
Trenngel (12%)
Menge pro Gel
Sammelgel (4%)
Menge pro Gel
4x Trenngelpuffer
10ml
4s Sammelgelpuffer
5ml
ddH2O
17,6ml
ddH2O
12,8ml
40%
Acrylamid- 12ml
Lösung
40%
Acrylamid- 2ml
Lösung
6% APS
320µl
6% APS
180µl
TEMED
32µl
TEMED
18µl
Weiterhin wurden 6%igen SDS-Gele mit den größeren Gelplatten hergestellt:
Trenngel (6%)
Menge pro Gel
Sammelgel (4%)
Menge pro Gel
4x Trenngelpuffer
10ml
4s Sammelgelpuffer
5ml
ddH2O
23,6ml
ddH2O
12,8ml
40%
Acrylamid- 6ml
Lösung
40%
Acrylamid- 2ml
Lösung
6% APS
320µl
6% APS
180µl
TEMED
32µl
TEMED
18µl
Der 4x Sammelgelpuffer hat einen pH-Wert von 6,8, weshalb das im LaemmliLaufpuffer enthaltene Glycin vermehrt ungeladen vorliegt und langsam zur Anode
wandert. Die Chlorid-Ionen wandern dagegen schneller und agieren somit als „Leit“Ionen, wohingegen Glycin als „Folge“-Ionen fungieren. Zwischen beiden Molekülen
entsteht ein Feldstärkegradient, innerhalb dessen sich die Proteine in Abhängigkeit
ihrer Mobilität auf der jeweiligen Höhe ansammeln (Stapeleffekt). Der pH-Wert von 8,8
im Trenngel bewirkt, dass das niedermolekulare Glycin überwiegend geladen vorliegt
und daher die Proteine im Trenngel überholt. Die Proteine werden also im Sammelgel
zu einer scharfen Bande fokussiert, im Trenngel dagegen wandern sie im
Wesentlichen ihrer Molekülgröße entsprechend zur Anode. Dies wird durch die
Vorbehandlung der Proben mit 4x SDS-Ladepuffer ermöglicht. Das darin enthaltene βMercaptoethanol führt die Reduktion von Disulfidbrücken und unterstützt damit die
Entfaltung der Proteinkomplexe durch SDS und aufkochen der Probe, sodass alle
Proteine in mehr oder weniger gleichförmigen, ungefalteten Strukturen vorliegen.
Gleichzeitig überdeckt das im Ladepuffer enthaltene SDS die Eigenladung der Proteine
34
und ermöglicht so die Auftrennung der denaturierten Proteine im Wesentlichen
entsprechend ihrer Molekülgröße.
Die zu analysierenden Proteinlösungen wurden mit 4x SDS-Ladepuffer versetzt,
sodass dieser in 1-facher Endkonzentration vorlag. Anschließend wurden die Proben
für 5min bei 95°C denaturiert, kurz auf Eis abgekühlt und auf ein SDS-Gel aufgetragen.
Die Elektrophorese erfolgte bei den Standard-Gelen für ca. 60min bei 200V bis die
Lauffront das untere Ende der Gelplatte erreichte. Bei den größeren SDS-Gelen
variierten Dauer und Stromstärke, sodass sich die zu analysierenden Proteine im
gewünschten Bereich des Trenngels befanden.
2.6.7.4 Western Blot
Der Western Blot dient dem immunologischen Nachweis von Proteinen, die über SDSPolyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-Page) ihrer Größe entsprechend aufgetrennt
wurden. Während des Western Blottings erfolgt die elektrophoretische Übertragung der
aufgetrennten Proteine auf eine Transfermembran (Nitrocellulose). Die Proteine
können auf der Membran anschließend direkt über Ponceau oder indirekt über
Antikörper-Färbung nachgewiesen werden. Dem Transferpuffer wurde erst kurz vor
Gebrauch das Methanol zugesetzt.
31,25 mM Tris Base
Transferpuffer:
240 mM Glycin
10% Methanol (direkt vor Anwendung frisch zugegeben)
Die Nitrozellulose-Membran für ca. 5min vor Aufbau des Blotting Sandwichs im
Transferpuffer äquilibriert. Die Filterpapiere wurden ebenfalls in Transferpuffer
getränkt. Die Blotkammer wurde in aufsteigender Reihenfolge aufgebaut:
Anode – Filterpapier – Membran – Gel – Filterpapier – Kathode
Der Transfer erfolgte 50min bei 10V konstant. Nach dem Transfer wurde die Membran
kurz mit ddH2O gewaschen, die Proteine für 10min mit Ponceau-Lösung angefärbt und
die Färbung im ChemiDoc detektiert. Die Auswertung der Western Blot-Banden
erfolgte über densitometrische Quantifizierung mit Hilfe der Image Lab Software
Version 3.0 (BioRad, Hercules, CA). Zur Normierung diente das Signal des
Haushaltsgens ß-Tubulin.
2.6.7.5 Immundetektion
Die auf Nitrozellulosemembranen gebundenen Proteine wurden mittels spezifischer
Antikörper nachgewiesen. Die Membran wurde zunächst für 1h in Milch-TBST
35
geblockt, anschließend folgten Waschschritte mit 1x MTBST für je 5min. Eine
Inkubation mit dem Protein-spezifischen Primärantikörper erfolgte in der jeweiligen
Verdünnung (s. Abschnitt 2.3) entweder in 2% BSA/TBST oder in 5% MTBST. Je nach
Qualität des Primärantikörpers wurde dieser entweder über Nacht bei 4°C oder für 1h
bei Raumtemperatur auf der Membran belassen. Nach erneutem Waschen für 3x 5min
in TBST erfolgte die Inkubation mit dem Spezies-spezifischen Sekundärantikörper, der
mit einem Nachweisenzym (Horse radish peroxidase, HRP) gekoppelt ist. Über eine
chemische Reaktion kann dieses Enzym das in der Substratlösung enthaltene Luminol
umsetzen, wodurch ein detektierbares Chemilumineszenz-Signal entsteht. Dieses
wurde mit dem ChemiDoc XRS System detektiert. Folgende Lösungen wurden
verwendet:
2% BSA/TBST:
5% Milch-TBST (MTBST):
10x Tris buffered Saline (TBS):
pH 7,4
2% Bovine Serum Albumin
1x TBST
1x TBST
5% Milchpulver
46 mM Tris Base
150 mM NaCl
in H2O
1x TBS + Tween20 (TBST):
1x TBS
0,1% Tween20
Die Western Blot Substratlösungen wurden jeweils direkt vor Verwendung nach
Herstellerangaben frisch angesetzt.
2.6.7.6 Stripping und erneute Immun-Markierung
Um nacheinander unterschiedliche Proteine auf einer Membran nachweisen zu
können, müssen die jeweiligen Primär- und Sekundärantikörper entfernt werden. Dafür
wurde die Membran für 15min in Stripping Lösung 1 inkubiert, anschließend mit
Wasser gewaschen und wiederum für 15min in Stripping Lösung 2 inkubiert. Daraufhin
erfolgte eine erneute Blockierung der freien Bindestellen der Membran mit 5% MTBST
für 1h bei Raumtemperatur. Anschließend wiederholt sich die Behandlung mit Primärund Sekundärantikörper wie in 2.6.7.5 beschrieben. Die Zusammensetzung der
Stripping-Lösungen ist nachfolgend angegeben:
36
Stripping Lösung 1 (pH 2)
Stripping Lösung 2
25mM Glycin
100mM NaOH
10% SDS
10% SDS
In ddH2O
In ddH2O
2.7 RNA-Isolation
Für die Genexpressions-Analyse der HPV-Onkogene E6 und E7 wurden Zellpellets
von HPV-positiven Zelllinien hergestellt (siehe Abschnitt 2.5.3). Aus den Pellets wurde
mit Hilfe des RNeasy Mini Kits nach Angaben des Herstellers die gesamte zelluläre
RNA isoliert, wobei zusätzlich ein DNase-Verdau nach Herstellerprotokoll durchgeführt
wurde. Die Konzentration der isolierten RNA wurde im Nanodrop gemessen.
Für die Human p53 Signaling Pathway RT2 Profiler PCR Arrays wurde die isolierte
RNA zusätzlich über einen RNA 6000 Nano Chip nach dem Herstellerprotokoll auf ihre
Integrität überprüft. Hierbei wird über Kapillar-Gelelektrophorese die Größenverteilung
der RNA-Probe überprüft. Die sog. RNA-Integritäts-Nummer (RIN) wird aus dieser
Verteilung berechnet und gibt Aufschluss über die Qualität der RNA-Präparation. Das
System weist der Probe nach der Analyse einen RIN-Wert zwischen 1 und 10 zu,
wobei ein RIN-Wert von 10 für eine komplett intakte und 1 für eine völlig degradierte
RNA steht. Diese Skala stellt seit einigen Jahren einen international gängigen RNAQualitätsstandard dar (Pfaffl 2004).
2.8 cDNA-Synthese
Für die Expressionsanalyse wurden die RNA-Moleküle unter Verwendung des Enzyms
Reverse Transkriptase in cDNA, sog. komplementäre DNA (cDNA), umgeschrieben.
In der vorliegenden Arbeit wurde zur cDNA-Synthese 1µg der isolierten RNA für die
Verwendung des High Capacity RNA-to-cDNA Kits benutzt. Die Reaktionen wurden
nach Angaben der Hersteller angesetzt und im PCR System Thermal Cycler ebenfalls
nach Herstellerprotokoll durchgeführt.
Für die Human p53 Signaling Pathway RT2 Profiler PCR Arrays wurden 0,5µg der
isolierten Gesamt-Zell-RNA für die cDNA-Synthese eingesetzt und mit Hilfe des RT2
First Strand Kits nach Herstellerangaben die cDNA synthetisiert.
2.9 Quantitative real time PCR
Zur quantitativen Genexpressions-Analyse wird die real time PCR (qPCR) angewandt.
Hierbei erfolgt in jedem Zyklus der PCR-Reaktion der Einbau eines DNA37
interkalierenden Farbstoffs. Theoretisch werden pro Zyklus die eingesetzten cDNAMoleküle verdoppelt, sodass auch das Fluoreszenz-Signal exponentiell ansteigt. Dabei
ist
der
Schwellenwert
entscheidend,
bei
dem
die
Reporterfluoreszenz
die
Hintergrundfluoreszenz signifikant überschreitet und ein exponentieller Anstieg der
Fluoreszenz messbar ist (Threshold-Cycle, CT). Gegen Ende erreicht die Reaktion
mangels Primer und Nukleotide ein Plateau, bei dem die Amplifikationen nach und
nach zum Stillstand kommen und die Signalstärke unverändert bleibt. Die qPCR
erfolgte mit den in Abschnitt 2.4 beschriebenen Primern. Für die Reaktionsansätze
wurde der DNA-interkalierende Farbstoff SYBR Green verwendet. Weiterhin wurden
5ng cDNA pro PCR-Reaktion eingesetzt. Ein Reaktions-Ansatz enthielt 15µl und
umfasste:
Reagenz
Volumen pro Probe [µl]
SYBR Select Master Mix
8,1
Wasser
3,3
Primer fwd (10 pmol)
1,3
Primer rev (10 pmol)
1,3
cDNA (5 ng/µl)
1,0
Die Reaktionsgefäße wurden im PCR-Gerät StepOne Plus platziert. Das Gerät
durchlief folgende Zyklen:
Schritt
Temperatur [°C]
Zeit
Anzahl Zyklen
Initiale Denaturierung
95
10 min
1
Denaturierung
95
15 sec
Primer-Hybridisierung
57
60 sec
Finale Elongation
95
15 sec
1
Abkühlen
70
1 min
1
Schmelzkurve
70-90
Kühlung
8
40
71
∞
-
Nach der initialen Denaturierung wurde nach jedem weiteren Zyklus die FluoreszenzÄnderung gemessen und eine Schmelzkurvenanalyse nach der finalen Elongation und
Abkühlung vollzogen. Hierbei wurde während eines Temperaturanstiegs alle 0,2°C das
Fluoreszenz-Signal gemessen und die Schmelztemperatur anhand einer abrupten
Fluoreszenz-Minderung bestimmt. Diese entsteht durch freigesetzte Farbstoff-Moleküle
beim Schmelzen der PCR-Produkte. Die Schmelztemperatur gibt Aufschluss über die
38
Spezifität des gebildeten PCR-Produkts, denn unspezifische Primerdimere schmelzen
bereits bei niedrigeren Temperaturen als spezifische PCR-Produkte.
Die Effizienz der qPCR wurde mit Hilfe einer Verdünnungsreihe (5ng bis 0,078ng
cDNA) mit cDNA als Matrize ermittelt. Die eingesetzte cDNA-Menge wurde in einer
logarithmischen Funktion gegen die CT-Werte aufgetragen und so die PCR-Effizienz
nach der Formel E=10[-1/Steigung] berechnet.
Als Negativ-Kontrollen wurden Reaktionsansätze mit Wasser bzw. RNA anstatt cDNA
verwendet. Zur Normalisierung der qPCR Ergebnisse wurde die RNA des konstitutiv
exprimierten Haushaltsgens humanes ribosomales Protein P0 verwendet.
2.10 p53 Signaling Pathway RT-PCR Array
Um Komponenten von Signalwegen zu identifizieren, die einerseits durch die p53vermittelte Strahlenantwort verändert, andererseits von HPV beeinflusst sind, wurde
die Genexpression von p53-abhängigen Genen mit Hilfe von Human p53 Signaling
Pathway RT2 Profiler PCR Arrays analysiert. Mit einem Array können 84 Zielgene
untersucht werden. Sie sind in nachfolgender Tabelle aufgelistet und kodieren für
Apoptose-, Zellzyklus-, Zellwachstums-, Proliferations-, Differenzierungs-, sowie DNAReparatur-induzierte Gene, die in der Literatur bereits hinreichend beschrieben sind.
Symbol
APAF1
ATM
ATR
BAI1
Bezeichnung
Apoptotic peptidase activating
factor 1
Ataxia telangiectasia mutated
Ataxia telangiectasia and Rad3
related
Brain-specific
angiogenesis
inhibitor 1
Symbol
JUN
Jun proto-oncogene
KAT2B
K(lysine) acetyltransferase 2B
V-Ki-ras2 Kirsten rat sarcoma
viral oncogene homolog
Myeloid
cell
leukemia
sequence 1 (BCL2-related)
Mdm2 p53 binding protein
homolog (mouse)
Mdm4 p53 binding protein
homolog (mouse)
MutL homolog 1, colon cancer,
nonpolyposis type 2 (E. coli)
MutS homolog 2, colon cancer,
nonpolyposis type 1 (E. coli)
V-myc myelocytomatosis viral
oncogene homolog (avian)
KRAS
MCL1
BAX
BCL2-associated X protein
MDM2
BBC3
BCL2 binding component 3
MDM4
BCL2
B-cell CLL/lymphoma 2
MLH1
BCL2A1
BCL2-related protein A1
MSH2
BRCA1
BH3 interacting domain death
agonist
Baculoviral IAP repeat containing
5
Breast cancer 1, early onset
BRCA2
Breast cancer 2, early onset
BID
BIRC5
Bezeichnung
MYC
MYOD1
Myogenic differentiation 1
NF1
Neurofibromin 1
Nuclear factor of kappa light
polypeptide gene enhancer in
B-cells 1
NFKB1
39
CCNB1
Cyclin B1
PRC1
CCNE1
Cyclin E1
PRKCA
CCNG1
Cyclin G1
PTEN
CCNH
Cyclin H
Cell division cycle 25 homolog A
(S. pombe)
Cell division cycle 25 homolog C
(S. pombe)
PTTG1
Proliferating
cell
nuclear
antigen
P53-induced death domain
protein
Protein
phosphatase,
Mg2+/Mn2+ dependent, 1D
Protein regulator of cytokinesis
1
Protein kinase C, alpha
Phosphatase
and
tensin
homolog
Pituitary tumor-transforming 1
RB1
Retinoblastoma 1
CDK1
Cyclin-dependent kinase 1
RPRM
CDK4
Cyclin-dependent kinase 4
Cyclin-dependent kinase inhibitor
1A (p21, Cip1)
Cyclin-dependent kinase inhibitor
2A (melanoma, p16, inhibits
CDK4)
CHK1 checkpoint homolog (S.
pombe)
CHK2 checkpoint homolog (S.
pombe)
CASP2 and RIPK1 domain
containing adaptor with death
domain
DNA
(cytosine-5-)methyltransferase 1
SESN2
E2F1
E2F transcription factor 1
TNFRSF10D
E2F3
E2F transcription factor 3
TP53
EGFR
Epidermal growth factor receptor
TP53AIP1
EGR1
Early growth response 1
TP53BP2
EI24
Etoposide induced 2.4 mRNA
TP63
ESR1
Estrogen receptor 1
Fas (TNFRSF6)-associated via
death domain
Fas (TNF receptor superfamily,
member 6)
Fas ligand (TNF superfamily,
member 6)
TP73
BTG2
CASP2
CASP9
CDC25A
CDC25C
CDKN1A
CDKN2A
CHEK1
CHEK2
CRADD
DNMT1
FADD
FAS
FASLG
BTG family, member 2
Caspase 2, apoptosis-related
cysteine peptidase
Caspase 9, apoptosis-related
cysteine peptidase
PCNA
PIDD
PPM1D
RELA
SIAH1
V-rel reticuloendotheliosis viral
oncogene homolog A (avian)
Reprimo, TP53 dependent G2
arrest mediator candidate
Sestrin 2
Seven in absentia homolog 1
(Drosophila)
SIRT1
Sirtuin 1
STAT1
Signal transducer and activator
of transcription 1, 91kDa
TADA3
Transcriptional adaptor 3
TNF
Tumor necrosis factor
TNFRSF10B
TRAF2
Tumor necrosis factor receptor
superfamily, member 10b
Tumor necrosis factor receptor
superfamily,
member 10d,
decoy with truncated death
domain
Tumor protein p53
Tumor protein p53 regulated
apoptosis inducing protein 1
Tumor protein p53 binding
protein, 2
Tumor protein p63
Tumor protein p73
TNF receptor-associated factor
2
TSC1
Tuberous sclerosis 1
WT1
Wilms tumor 1
FOXO3
Forkhead box O3
XRCC5
X-ray repair complementing
defective repair in Chinese
hamster cells 5 (double-strandbreak rejoining)
GADD45A
Growth arrest and DNA-damageinducible, alpha
ACTB
Actin, beta
40
GML
Glycosylphosphatidylinositol
anchored molecule like protein
B2M
HDAC1
Histone deacetylase 1
GAPDH
HK2
Hexokinase 2
HPRT1
IGF1R
Insulin-like
receptor
IL6
Interleukin 6 (interferon, beta 2)
growth
factor
1
Beta-2-microglobulin
Glyceraldehyde-3-phosphate
dehydrogenase
Hypoxanthine
phosphoribosyltransferase 1
RPLP0
Ribosomal protein, large, P0
Für die Versuche wurden vier HPV-positive Zelllinien (VU-147T, UM-SCC47, UMSCC104 und UPCI:SCC152) und zwei HPV-negative Zelllinien (UM-SCC11b und UTSCC33) je 4h nach Bestrahlung mit 6Gy untersucht. Nach RNA-Isolation und cDNASynthese wurde die cDNA nach den Herstellerangaben mit SYBR Green ROX qPCR
Mastermix versetzt und auf die Array-Platte gegeben. Die PCR-Reaktion erfolgte im
StepOnePlus und umfasste folgende Zyklen:
Schritt
Temperatur [°C]
Zeit
Anzahl Zyklen
Initiale Denaturierung
95
10 min
1
Denaturierung
95
15 sec
Primer-Hybridisierung
60
60 sec
Finale Elongation
95
15 sec
1
Abkühlen
60
1 min
1
Schmelzkurve
60-95
Kühlung
8
∞
-
40
2.11 qPCR Auswertung
Für die Auswertung der qPCR müssen einerseits die Effizienz der PCR-Reaktionen an
sich, andererseits die Expression von Kontrollgenen berücksichtigt werden. Aus
diesem Grund wurde für die E6 und E7-Expressionsanalyse die relative Quantifizierung
nach Livak und Schmittgen (2001) gewählt. Dabei wird der Expressionsunterschied
anhand der arithmetischen Formel 2-ΔΔCT dargestellt. Die Expression des Zielgens wird
auf die eines nicht regulierten Gens normalisiert und der CT-Wert (Cycle Threshold)
des Zielgens vom CT-Wert des Referenzgens subtrahiert (CT = CTZielgen –
CTReferenzgen). Der Vorteil hierbei liegt in der Reduktion der Varianz der Expressionen.
Da unterschiedliche RNA-Extraktionseffizienzen und Matrixeffekte sowie Fehler bei der
reversen Transkription aller Proben auftreten können werden sie bei der relativen
Quantifizierung „herausgerechnet“ (Pfaffl 2004).
Anschließend wurde die relative
Expression des Zielgens in den bestrahlten Proben auf die Expression der
41
Kontrollproben bezogen und die jeweiligen ΔCT-Werte voneinander abgezogen
(ΔΔCT).
Die p53 Signaling Pathway RT2 PCR Arrays wurden ebenfalls anhand der relativen
Quantifizierung nach Livak und Schmittgen (2001) ausgewertet, die ExpressionsÄnderung wird ebenfalls mit der Formel 2-ΔΔCT dargestellt.
2.12 Statistik
Alle Experimente wurden, soweit nicht anders angegeben, mindestens dreimal
unabhängig voneinander durchgeführt.
Zur Auswertung der qPCR-Ergebnisse wurde die StepOne Software Version 2.2.2
(Applied Biosystems, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) benutzt.
Die statistische Analyse der Dosis-Effekt-Kurven wurden mit Hilfe von GraphPad Prism
Version 5 durchgeführt. Dargestellt sind jeweils die Mittelwerte und Standardabweichungen aus drei im Triplikat durchgeführten Experimenten (Abschnitt 3.2.2).
Für die Analysen der Dosis-Effekt-Kurven und der qPCR Expressionsanalysen wurden
Students T-Tests (Fehlerindex * p<0,05; ** p<0,01; *** p<0,001) verwendet.
42
3
Ergebnisse
3.1 HPV-Nachweis
Die vier Zelllinien UM-SCC47, UM-SCC104, UPCI:SCC152 und 93-VU-147T sind laut
Literatur durch eine Infektion mit HPV Typ 16 charakterisiert (Lansford et al. 1999;
Steenbergen et al. 1995; Tang et al. 2012; White et al. 2007), die anderen vier
Zelllinien UD-SCC1, UM-SCC6, UM-SCC11b und UT-SCC33 enthalten keine virale
DNA (Lansford et al. 1999; Zhao et al. 2011). Um den HPV-Status aller in der
vorliegenden Arbeit verwendeten Zelllinien zu überprüfen, wurde mittels PCR-Reaktion
die DNA der viralen L1-Gen-Region über die Primer GP5+ und GP6+ amplifiziert (de
Roda Husman, A M et al. 1995) und die Amplifikate über nachfolgende
Gelelektrophorese aufgetrennt (Abbildung 5). Die DNA-Banden haben eine Größe von
150 Basenpaaren. Die Zelllinien UD-SCC1, UM-SCC6 und UT-SCC33 sowie die
Negativ-Kontrolle weisen keine DNA-Bande auf. Somit konnte der HPV-Status aller
Zelllinien entsprechend dem in der Literatur angegebenen Status bestätigt werden. Der
HPV-Status wurde in Marburg zusätzlich anhand des Expressions-Nachweises viraler
HPV-E6 und E7-mRNA bestätigt (Arenz et al. 2014).
1
2
3
4
5
6
7
8
9
150
Abbildung 5: HPV-PCR
HPV-PCR mit Primern GP5+ und GP6+. Die Größe des erwarteten PCR-Produkts liegt bei 150
Basenpaaren. 1: Größenstandard, 2: Negativ-Kontrolle, 3: UD-SCC2, 4: UT-SCC33, 5: UMSCC104, 6: UPCI:SCC152, 7: UM-SCC6, 8: VU-147T, 9: Positiv-Kontrolle: bereits HPV-positiv
getestete Zelllinien
3.2 Dosis-Effekt-Beziehung
3.2.1 Wachstumskurven
Für
eine
strahlenbiologische
Charakterisierung
ist
die
Kenntnis
über
die
Wachstumseigenschaften der zu untersuchenden Zelllinien notwendig. Daher wurden
die Verdopplungszeiten der Zelllinien experimentell ermittelt (Tabelle 2). Die
Vermehrung einer definiert ausgesäten Zellmenge wurde zu bestimmten Zeitpunkten
gemessen.
43
Tabelle 2: Verdopplungszeiten
Ermittelte Verdopplungszeiten der untersuchten Zelllinien in Stunden.
Zelllinien
HPV Typ 16
Verdopplungszeit [h]
UD-SCC1
negativ
17,7
UT-SCC33
negativ
32,3
UM-SCC6
negativ
33,9
UM-SCC11b
negativ
20,6
UM-SCC47
positiv
24,1
UM-SCC104
positiv
35,9
93-VU-147T
positiv
36,3
UPCI:SCC152
positiv
42,6
3.2.2 Klonogenes Überleben
Das klonogene Überleben beschreibt die Möglichkeit von Zellen, sich nach Bestrahlung
zu teilen und dabei Kolonien von mindestens 50 Tochterzellen zu bilden (PUCK und
MARCUS 1956). Um das klonogene Überleben nach Exposition mit ionisierender
Strahlung untersuchen zu können, wurde in Vorversuchen die Koloniebildungseffizienz
(sog. Plattierungseffizienz) jeder Zelllinie ermittelt. Anhand der Koloniebildungseffizienz
konnten definierte Zellzahlen ausgesät, bestrahlt und das klonogene Überleben
untersucht werden. Unsere Überlebenskurven zeigen, dass im Bereich geringer Dosen
bis zu 2Gy alle Zelllinien ähnlich viele überlebende Kolonien aufweisen (Abbildung 6 A)
(Arenz et al. 2014). Die HPV-negative Zelllinie UM-SCC6 zeigt die meisten
überlebenden Kolonien im Vergleich zu den anderen getesteten Zelllinien, wohingegen
die HPV-positive Zelllinie UM-SCC-47 nach Inkubation mit mehr als 6Gy keine
Kolonien mehr bildete. Der Anteil (Fraktion) der überlebenden Zellen (SF) nach einer
Dosis von 2Gy ist jedoch bei den HPV-positiven Zelllinien im Mittel signifikant geringer
(p=0,01) als bei den HPV-negativen (Abbildung 6 B) (Arenz et al. 2014).
44
A
1
0.5
Klonogenes Überleben
0.1
0.01
0.001
UD-SCC-1
UM-SCC-47
UT -SCC-33
UM-SCC-104
UM-SCC-6
93-VU-147T
UM-SCC-11b
UPCI:SCC152
Abbildung
6:
Überleben
nach
Bestrahlung
A) Klonogenes Überleben der
untersuchten HPV-positiven
(blau) und HPV-negativen
Zelllinien
(schwarz).
Aufgetragen sind Mittelwerte
mit Standardabweichung.
Dosis [Gy]
B) Anteile überlebender Zellen
0
2
4
6
8
B
nach 2Gy). Aufgetragen sind
SF-2
0.45
0.40
0.35
0.30
0.25
0.20
0.15
0.10
0.05
(SF-2 = surviving fraction
Mittelwerte mit Median und
Standardabweichung
statistischer
Analyse
nach
mit
Students T-Test. (Arenz et
p = 0,0102
al. 2014)
3.3 Zellzyklusverteilung nach Bestrahlung
Exposition mit ionisierender Strahlung bewirkt in gesunden Zellen einen ZellzyklusArrest. Dieser ermöglicht die Reparatur der beschädigten DNA. Bei irreparablen
Schäden wird Apoptose eingeleitet. Die gefundene Strahlensensitivität der vier
untersuchten HPV-positiven Zelllinien wurde im Hinblick auf das Zellzyklus-Verhalten
mit dem der vier HPV-negativen Zellen verglichen.
Die Häufigkeit der DNA-Verteilung (x-Achse) ist in Histogrammen gegen die DNAMenge (y-Achse) exemplarisch für zwei Zelllinien aufgetragen (Abbildung 7). Die Zellen
der HPV-positiven Zelllinie UPCI:SCC152, sowie der HPV-negativen UM-SCC11b
zeigen bereits 10h nach Bestrahlung mit 2 bzw. 6Gy einen veränderten DNA-Gehalt im
Vergleich zur unbestrahlten Kontrolle, da mehr Zellen einen doppelten DNA-Gehalt
(türkiser Peak) aufweisen (Arenz et al. 2014). In den unbestrahlten Kontrollen bleibt die
Verteilung des DNA-Gehalts unabhängig vom HPV-Status in den Kontrollen ähnlich.
20h nach Bestrahlung mit 2Gy werden bei der HPV-positiven Zelllinie vermehrt Zellen
mit doppeltem DNA-Gehalt gemessen, bei der HPV-negative Zelllinie dagegen nicht.
Nach 6Gy enthält die Probe der Zelllinie UPCI:SCC152 zum Zeitpunkt 20h kaum Zellen
mit einfachem DNA-Gehalt, zum Zeitpunkt 96h tragen dagegen mehr Zellen einen
45
einfachen DNA-Gehalt (grüner Peak), und die Häufigkeit der Zellen mit doppeltem
DNA-Gehalt ist zu beiden Zeitpunkten vergleichbar. Die DNA-Verteilung der HPVnegativen Zelllinie nähert sich 96h nach 6Gy wieder der Kontrolle an. Die Zell-Fraktion,
die 96h nach einer Dosis von 6Gy DNA-Fragmente enthielt (siehe Pfeil: SubG1), tritt
bei der Probe der HPV-positiven Zelllinie verstärkt auf.
UPCI:SCC152 (HPV-positiv)
0 Gy
2 Gy
6 Gy
UM-SCC11b (HPV-negativ)
0 Gy
2 Gy
6 Gy
10h
20h
96h
subG1
Abbildung 7: Verteilung der DNA-Gehalte der HPV-positiven Zelllinie UPCI:SCC152 und
der HPV-negativen Zelllinie UM-SCC11b nach Bestrahlung mit 2Gy und 6Gy
In dem Histogramm ist die Häufigkeitsverteilung der DNA-Gehalte einer HPV-positiven Zelllinie
UPCI:SCC152 (links) und einer HPV-negativen Zelllinie UM-SCC11b (rechts) nach Bestrahlung
mit Einzeldosen von 2Gy und 6Gy abgebildet. Der DNA-Gehalt (x-Achse) gibt Aufschluss über
die Zellzyklus-Phase: Grün: Zellen in G1-Phase, Gelb: Zellen in S-Phase, Türkis: Zellen in
G2/M-Phase. HPV-positive Zellen arretieren mit steigender Strahlungsintensität in der G2Phase, und weisen verstärkt fragmentierte DNA auf (subG1-Phase, Pfeil).
Die prozentuale Verteilung der mittleren DNA-Gehalte je nach Bestrahlung ist
entsprechend ihrer Zellzyklus-Phasen in Abbildung 8 zusammengefasst. Die G1Phasen-Verteilung zeigt mit steigender Dosis weniger HPV-positive Zellen mit
einfachem DNA-Gehalt (Arenz et al. 2014). Die DNA-Verteilung der HPV-negativen
Zelllinien ähnelt der Verteilung der Kontrollproben und auch 6Gy bewirken nur eine
kurzfristige Abnahme der Zellen mit einfachem DNA-Gehalt. Alle HPV-negativen
Proben wiesen nach 48h einen wachsenden Anteil G1-Phase-Zellen auf.
Die DNA-Gehalte der HPV-positiven und -negativen Zellen zeigen bis 10h eine
ähnliche S-Phase-Verteilung (Arenz et al. 2014). Nach diesem Zeitpunkt besitzen die
HPV-positiven Zelllinien stark fluktuierende Mengen an S-Phase-Zellen, die HPVnegativen Zelllinien enthalten nach 48h annähernd ähnlich viele Zellen in der S-Phase
wie die Kontrollproben. Entsprechend des wachsenden Anteils HPV-negativer G1Phase-Zellen verringerte sich der Anteil dieser S-Phase-Fraktion 48h nach
Bestrahlung.
46
Entsprechend der DNA-Verteilung der G1-Phase verursacht eine Dosis von 2Gy in
beiden Entitäten einen Anstieg der G2-Phase-Zellen, in den HPV-negativen Zellen flaut
dieser schneller ab (Arenz et al. 2014). Bestrahlung mit 6Gy resultiert in den HPVpositiven Zelllinien mit einem verstärkten und länger andauernden G2-Phasen-Arrest,
verglichen mit den HPV-negativen Zelllinien. Auch hier ist nach 48h ein verminderter
Anteil G2-Phase-Zellen zu verzeichnen, entsprechend der wachsenden Fraktion an
HPV-negativen G1-Phase-Zellen. Insgesamt zeigen HPV-positive Zelllinien mit
steigender Dosis einen verstärkten G2-Arrest, der länger andauert als bei HPVnegativen Zelllinien.
HPV-positiv
0 Gy
2 Gy
6 Gy
HPV-negativ
100
100
80
80
60
60
G1
40
20
20
0
0
4
Anteil der Zellen [%]
40
10
20
28
48
72
96
100
100
80
80
60
60
S
40
20
4
10
20
28
48
72
96
4
10
20
28
48
72
96
4
10
20
28
48
72
96
40
20
0
0
4
10
20
28
48
72
96
100
100
80
80
*
60
40
60
G2
20
40
20
0
0
4
10
20
28
Stunden
48
72
96
Stunden
Abbildung 8: Prozentuale Häufigkeits-Verteilung der DNA-Gehalte bestrahlter Zellen in
den Zellzyklus-Phasen
Der DNA-Gehalt HPV-positiver (UM-SCC47, UPCI:SCC152 links) und HPV-negativer (UDSCC1, UM-SCC6, UM-SCC11b, UT-SCC33 rechts) Zellen in den Zellzyklus-Phasen G1, S und
G2 wurde durchflusszytometrisch nach Bestrahlung bestimmt und die Mittelwerte aufgetragen.
HPV-positive Zellen arretieren mit steigender Strahlenintensität häufiger (*) und zeitlich länger
(Pfeil) in der G2-Phase.
47
Die prozentuale Häufigkeitsverteilung der DNA-Gehalte lässt Zellen mit DNAFragmenten erkennen, die in der Zellzyklus-Analyse als SubG1-Phase auftreten
(Abbildung 9) (Arenz et al. 2014). Diese Fraktion nimmt bei den HPV-negativen
Zelllinien 28h nach Bestrahlung und bei den HPV-positiven Zelllinien erst 48h nach
Bestrahlung dosisabhängig zu. Eine Dosis von 6Gy bewirkt dabei häufiger in den HPVpositiven Zelllinien eine Akkumulation von Zellen mit DNA-Fragmenten als bei den
HPV-negativen Zelllinien.
Anteil der Zellen [%]
HPV-positiv
HPV-negativ
50
50
40
40
30
30
20
20
10
10
0
0 Gy
2 Gy
6 Gy
0
4
10
20
28
48
72
96
Stunden
4
10
20
28
48
72
96
Stunden
Abbildung 9: Prozentuale Häufigkeitsverteilung der Zellen mit DNA-Fragmenten nach
Bestrahlung (SubG1-Phase)
Der DNA-Gehalt HPV-positiver (UM-SCC47, UPCI:SCC152 links) und HPV-negativer Zellen
(UD-SCC1, UM-SCC6, UM-SCC11b, UT-SCC33 rechts) wurde durchflusszytometrisch
bestimmt und die Mittelwerte der SubG1-Fraktionen mit DNA-Fragmenten aufgetragen. Mit
steigender Strahlendosis enthalten HPV-positive Zellen vermehrt DNA-Fragmente.
3.4 Proteinexpressions-Änderung nach Bestrahlung
Die molekularen Ursachen der verstärkten Strahlensensitivität HPV-assoziierter
Tumorzelllinien sind weitgehend unbekannt. Aus diesem Grund sollten molekulare
Marker identifiziert werden, die nach Bestrahlung in HPV-positiven und -negativen
Zellen verändert reguliert sind. Dazu wurden die HPV-negativen Zelllinien UD-SCC1,
UM-SCC6, UM-SCC11b, UT-SCC33, sowie die HPV-positiven Zelllinien UM-SCC47,
UM-SCC104, VU-147T, UPCI:SCC152 mit 6Gy bestrahlt, pellettiert, die Proteine
isoliert, Gelelektrophoretisch ihrer Größe entsprechend aufgetrennt und über
Antikörper-Färbung sichtbar gemacht.
3.4.1 Proteinexpression von p16INK4A nach Bestrahlung
Der Tumorsuppressor p16INK4A gilt klinisch als molekularer Marker für eine aktive HPVInfektion (Klussmann et al. 2003). Dabei wird das virale Onkoprotein E7 verstärkt
exprimiert und markiert das Retinoblastom-Protein (Rb), ein p16-Regulator-Protein,
zum Abbau, woraufhin das p16-Protein akkumuliert. Alle untersuchten HPV-positiven
48
Zelllinien weisen ein p16-Proteinsignal auf, die HPV-negativen Zelllinien dagegen nicht
(Abbildung 10). Die Exposition mit ionisierender Strahlung hatte in den hier
durchgeführten Experimenten keinen sichtbaren Effekt auf die Expression. Somit
bestätigt die p16-Proteinexpression lediglich den bestehenden HPV-Status der
Zelllinien.
-
+
UMSCC6
0
6
UMSCC104
0
6
-
+
UTSCC33
UPCI:
SCC152
0
0
6
HPV16
6
[Gy]
p16
ß-Tubulin
+
+
-
-
UMSCC47
VU147T
UDSCC1
UMSCC11b
HPV16
p16
ß-Tubulin
INK4A
Abbildung 10: p16
-Protein-Expression in vier HPV-positiven und vier HPV-negativen
Zelllinien 24h nach Bestrahlung mit 6Gy
Immunoblot von Gesamt-Zellextrakten der HPV-positiven Zelllinien UM-SCC104, UPCISCC152, UM-SCC47 und VU-147T und der HPV-negativen Zelllinien UM-SCC6, UT-SCC33,
UD-SCC1 und UM-SCC11b. Die Proben wurden 24h nach Bestrahlung mit Einzeldosen von
6Gy genommen. Die p16-Protein-Expression der bestrahlten Zellen wurde mit der der
unbestrahlten Zellen (0Gy) verglichen. Die HPV-positiven Zelllinien zeigen unabhängig von der
Bestrahlung ein p16-Protein-Signal, die HPV-negativen Zelllinien nicht. Als Lade-Kontrolle
diente ß-Tubulin.
3.4.2 Proteinexpression von Retinoblastom nach Bestrahlung
Das HPV16-Onkoprotein E7 bindet an den Tumorsuppressor Rb (Dyson et al. 1989),
und bewirkt über Ubiquitin-vermittelte Degradation so den Abbau der Rb-Proteine
(Boyer et al. 1996). Die HPV-positiven Zelllinien zeigen 24h nach Bestrahlung
tendenziell ein stärkeres Proteinsignal als die unbestrahlten Kontrollen (Abbildung 11).
Die HPV-negativen Zelllinien zeigen ähnliche Proteinmengen ohne und mit
Bestrahlung.
49
-
+
UMSCC6
0
6
-
UMSCC104
0
6
+
HPV16
UTSCC33
UPCI:
SCC152
0
0
6
[Gy]
6
*
*
Rb
ß-Tubulin
+
+
-
-
UMSCC47
VU147T
UDSCC1
UMSCC11b
*
HPV16
*
Rb
ß-Tubulin
Abbildung 11: Rb-Protein-Expression in vier HPV-positiven und vier HPV-negativen
Zelllinien 24h nach Bestrahlung mit 6Gy
Immunoblot
von
Gesamt-Zellextrakten
der
HPV-positiven
Zelllinien
UM-SCC104,
UPCI:SCC152, UM-SCC47, VU-147T und der HPV-negativen Zelllinien UM-SCC6, UT-SCC33,
UD-SCC1 und UM-SCC11b. Die Proben wurden 24h nach Bestrahlung mit Einzeldosen von
6Gy genommen. Die Rb-Protein-Expression der bestrahlten Zellen wurde mit der der
unbestrahlten Zellen (0Gy) verglichen. Die HPV-positiven Zelllinien zeigen nach Bestrahlung ein
verstärktes Rb-Protein-Signal (*). Als Lade-Kontrolle diente ß-Tubulin.
Die Rb-Proteinexpression gibt Aufschluss über die Zellzyklus-Progression nach DNASchaden, wobei der G1-Arrest in E7-exprimierenden Zellen ausbleibt (Slebos et al.
1994), was vermutlich mit verminderten Rb-Protein-Mengen zusammenhängt (Lindel et
al. 2012). Um einen möglichen Bestrahlungseffekt auf die Rb-Protein-Expression
genauer zu untersuchen wurden anschließend frühe Zeitpunkte von 30min bis 6h nach
Bestrahlung betrachtet (Abbildung 12). Die Rb-Protein-Expression wird in der HPVpositiven Zelllinie UM-SCC47 durch Bestrahlung mit 6Gy induziert, wenngleich kein
kontinuierlicher Anstieg zu verzeichnen ist. Die anderen drei HPV-positiven Zelllinien
zeigen keine Veränderung des Rb-Signals nach Bestrahlung in dieser frühen Phase.
Die Western Blots der HPV-negativen Zelllinien weisen ebenfalls keine kontinuierliche
Induktion nach Bestrahlung auf, wobei die Protein-Signale der Zelllinien UM-SCC11b
und UM-SCC47 auffallend ähnlich sind.
50
HPV-positiv
HPV-negativ
VU147T
0,5
0 6
1
0 6
1,5
0 6
UM-SCC11b
2
0
4
6
0
6
6
0
[h]
[Gy]
6
0,5
0 6
1
1,5
0 6 0
2
6 0
4
6 0
6
6 0 6
Rb
ß-Tubulin
UM-SCC104
UT-SCC33
Rb
ß-Tubulin
UM-SCC47
Rb
ß-Tubulin
UPCI:SCC152
Rb
ß-Tubulin
Abbildung 12: Rb-Protein-Expression in vier HPV-positiven und zwei HPV-negativen
Zelllinien zu verschiedenen Zeitpunkten nach Bestrahlung mit 6Gy
Immunoblot von Gesamt-Zellextrakten der HPV-positiven Zelllinien VU-147T, UM-SCC104, UMSCC47, UPCI:SCC152 und der HPV-negativen Zelllinien UM-SCC11b und UT-SCC33. Die
Proben wurden zu den Zeitpunkten 0,5h, 1h, 1,5h, 2h, 4h und 6h nach Bestrahlung mit
Einzeldosen von 6Gy genommen. Die Protein-Expression von Retinoblastom (Rb) in den
bestrahlten Zellen wurde mit der der unbestrahlten Zellen (0Gy) verglichen. Die Rb-ProteinExpression wird nur in den Zelllinien UM-SCC47 und UM-SCC11b nach Bestrahlung induziert,
alle anderen Zelllinien zeigen keine Expressionsunterschiede. Als Lade-Kontrolle diente ß-
Tubulin.
Im Laufe des Zellzyklus wird das Phosphoprotein Rb posttranslational modifiziert
(Buchkovich et al. 1989), was sich anhand von verschieden großen Banden im
Western
Blot
nachweisen
lässt
(Brugarolas
et
al.
1999).
So
ist
das
hyperphosphorylierte Rb (pRbp), das die aktive Molekülform darstellt, wegen vieler
Phosphat-Reste größer und läuft langsamer als das inaktive hypophosphorylierte (pRb)
Protein. Für eine höhere Auflösung der Rb-Protein-Banden wurden ausgewählte
Protein-Lysate mit längeren SDS-Gelen analysiert und ein anderer Puffer (s. 2.6.7.1)
zur Protein-Isolation verwendet. Bestrahlung bewirkt bei der HPV-positiven Zelllinie
VU-147T 24h nach 6Gy eine stärker ausgeprägte obere pRbp-Bande im Vergleich zur
Kontrolle, Rb wird folglich phosphoryliert und aktiviert (Abbildung 13). Die HPV-positive
Zelllinie UM-SCC47 zeigt 24h nach 6Gy innerhalb der drei pRbp-Banden eine stärker
ausgeprägte mittlere Bande im Vergleich zur unbestrahlten Kontrollprobe, Rb wird hier
51
folglich ebenfalls aktiviert. Da verschiedene posttranslationale Phosphat-Modifikationen
von verschiedenen Funktionen des Rb-Proteins zeugen (Buchkovich et al. 1989),
lassen die verschieden starken pRbp-Banden auf unterschiedliche Rb-Funktionen in
den beiden HPV-positiven Zelllinien schließen. In der Zelllinie UM-SCC11b führt die
Bestrahlung keine Änderung des Phosphorylierungsgrades herbei, Rb wird somit nicht
aktiviert.
HPV-positiv
VU147T
0,5
0 6
1
0 6
HPV-negativ
UM-SCC47
24
0 6
0,5
0 6
1
0
6
UM-SCC11b
24
0 6
0,5
0 6
1
0
6
24
0 6
[h]
[Gy]
+
*
pRbp
pRb
Abbildung 13: Protein-Expression von hyper- (pRbp) und hypo-phosphoryliertem Rb
(pRb) in zwei HPV-positiven und einer HPV-negativen Zelllinie zu verschiedenen
Zeitpunkten nach Bestrahlung mit 6Gy
Immunoblot von Gesamt-Zellextrakten der HPV-positiven Zelllinien VU-147T und UM-SCC47,
sowie der HPV-negativen Zelllinie UM-SCC11b. Die Proben wurden zu den Zeitpunkten 0,5h,
1h, 1,5h und 24h nach Bestrahlung mit Einzeldosen von 6Gy genommen. Die Rb-ProteinExpression der bestrahlten Zellen wurde mit der der unbestrahlten Zellen (0Gy) verglichen.
Durch ein längeres Gel werden einzelne Rb-Banden erkennbar. Die HPV-positive Zelllinie VU147T enthält 24h nach 6Gy mehr pRbp (*), ebenso UM-SCC47 (+), die HPV-negative Zelllinie
UM-SCC11b
zeigt
keinen
Unterschied.
Als
Lade-Kontrolle
diente
ß-Tubulin.
pRb:
hypophosphoryliertes Rb; pRbp: hyperphosphoryliertes Rb (n=1)
3.4.3 Proteinexpression von p53 und phospho p53 (Ser15) nach
Bestrahlung
Der Tumorsuppressor p53 ist einer der wichtigsten Faktoren der zellulären
Strahlenantwort
und
wird
nach
strahleninduziertem
DNA-Schaden
durch
Phosphorylierung am Serin 15 aktiviert (Banin et al. 1998). In HPV-assoziierten Zellen
wird das p53-Protein vom viralen Onkoprotein E6 zum Abbau markiert (Scheffner et al.
1990; Werness et al. 1990), jedoch ist die Beteiligung von HPV an der
Strahlensensitivität HPV-assoziierter Tumoren umstritten. Daher wurde die Expression
des gesamten, zellulären p53 und seiner aktivierten Form (phospho p53) nach
Bestrahlung in HPV-positiven und –negativen Zelllinien untersucht (Abbildung 14).
Unter den HPV-positiven Zelllinien weist 24h nach Bestrahlung nur VU-147T ein
schwaches p53-Signal auf. Alle anderen HPV-positiven Zelllinien lassen kein bzw. ein
52
gerade noch nachweisbares Protein-Signal erkennen, die Bestrahlung hat also eher
keinen Einfluss auf die p53-Proteinexpression. Unter den HPV-negativen Zelllinien
zeigen nur UM-SCC11b und UT-SCC33 ein p53-Protein-Signal. Die anderen HPVnegativen Zelllinien weisen kein bzw. ein gerade noch nachweisbares Protein-Signal
auf. Auch hier hat die Bestrahlung möglicherweise keinerlei Einfluss auf die
Proteinexpression.
Die Proteinexpression des aktivierten, phosphorylierten p53 an der Stelle Serin15 zeigt
nur bei der HPV-positiven Zelllinien VU-147T ein sehr schwaches Protein-Signal nahe
der Nachweisgrenze. Die HPV-negativen Zelllinien UM-SCC11b und UT-SCC33
weisen eine klar erkennbare Aktivierung nach Bestrahlung auf, die anderen HPVnegativen Zelllinien nicht.
-
-
-
-
UMSCC6
UTSCC33
UDSCC1
UMSCC11b
0
6
0
6
0
6
0
+
+
+
+
UMSCC47
VU147T
UMSCC104
UPCI:
SCC152
HPV16
6
[Gy]
Phospho p53
0
6
0
6
0
6
0
6
*
p53
ß-Tubulin
Abbildung 14: Protein-Expression von p53 und phosphoryliertem p53 an Serin15 in vier
HPV-negativen und vier HPV-positiven Zelllinien 24h nach Bestrahlung mit 6Gy
Immunoblot von Gesamt-Zellextrakten der HPV-negativen Zelllinien UM-SCC6, UT-SCC33, UDSCC1, UM-SCC11 und der HPV-positiven Zelllinien UM-SCC47, VU-147T, UM-SCC104 und
UPCI:SCC152. Die Proben wurden 24h nach Bestrahlung mit Einzeldosen von 6Gy genommen.
Die Proteinexpression der bestrahlten Zellen wurde mit der der unbestrahlten Zellen (0Gy)
verglichen. Die HPV-negativen Zelllinien UT-SCC33 und UM-SCC11b, sowie die HPV-positive
VU-147T (*) zeigen ohne und mit Bestrahlung ein p53-Signal, und jeweils nach Bestrahlung
eine verstärkte Phosphorylierung von p53. Als Lade-Kontrolle diente ß-Tubulin.
Die strahleninduzierte Aktivierung von p53 findet bereits wenige Minuten nach
Exposition mit ionisierender Strahlung statt (Shieh et al. 1997), weshalb die
Proteinexpression nach Bestrahlung mit 6Gy anschließend noch zu früheren
Zeitpunkten als 24h untersucht wurde. Abbildung 15 zeigt in der HPV-positiven Gruppe
insgesamt keine Veränderung bei der p53-Proteinexpression zwischen 0,5h und 6h
nach Bestrahlung mit 6Gy. Das p53-Signal erscheint in diesen Zelllinien als
Doppelbande. Da die Zelllinie VU-147T sowohl ein WT-p53-Gen als auch mutiertes
p53-Gen enthält (Rieckmann et al. 2013) werden möglicherweise beide p53-Formen im
53
Western Blot als p53-Protein detektiert. Bei der Zelllinie UM-SCC47 liegen
möglicherweise
unterschiedliche
Phosphorylierungs-Zustände
oder
p53-Splice-
Varianten vor. In den untersuchten HPV-negativen Zelllinien hat Exposition mit
ionisierender Strahlung ebenfalls keinen Einfluss auf das p53-Proteinlevel.
Die aktive Form von p53 (phospho p53) ist sowohl in den HPV-positiven als auch HPVnegativen Zellen bereits 0,5h nach Bestrahlung durch eine erhöhte Proteinexpression
nachweisbar (Arenz et al. 2014). Die Signalstärke nimmt bei den HPV-positiven, sowie
der HPV-negativen Zelllinie UT-SCC33 über den gesamten Zeitraum hin ab,
wohingegen die HPV-negative Zelllinie UM-SCC11b ähnliche Expressionsmengen bis
6h nach Bestrahlung aufweist.
HPV-positiv
HPV-negativ
VU147T
0,5
0 6
1
0 6
1,5
0 6
UM-SCC11b
2
0
4
6
0
6
6
0
6
[h]
[Gy]
0,5
0 6
1
0 6
1,5
0 6
2
0
4
6
0
6
6
0
6
Phos p53
p53
ß-Tubulin
UM-SCC47
UT-SCC33
Phos p53
p53
ß-Tubulin
Abbildung 15: Protein-Expression von p53- und phospho- p53 in zwei HPV-positiven und
zwei HPV-negativen Zelllinien zu verschiedenen Zeitpunkten nach Bestrahlung mit 6Gy
Immunoblot von Gesamt-Zellextrakten der HPV-positiven Zelllinien VU-147T und UM-SCC47
sowie der HPV-negativen Zelllinien UM-SCC11b und UT-SCC33. Die Proben wurden zu den
Zeitpunkten 0,5h, 1h, 1,5h, 2h, 4h und 6h nach Bestrahlung mit Einzeldosen von 6Gy
genommen. Die p53- und phospho p53-Proteinexpression der bestrahlten Zellen wurde mit der
der unbestrahlten Zellen (0Gy) verglichen. Die Alle Zelllinien zeigen bereits 0,5h nach 6Gy ein
phospho p53-Signal, das über die Zeit hin abnimmt und nur bei UM-SCC11b
tendenziell
unverändert bleibt. Als Lade-Kontrolle diente ß-Tubulin.
3.5 qPCR: mRNA-Expression von viralen Onkogenen E6 und E7
Die Expression der viralen Onkoproteine E6 und E7 beeinflusst die zentralen
Tumorregulatoren p53 und Rb. Um den Gehalt der viralen Proteine anhand der mRNAExpression abschätzen zu können und gleichzeitig einen möglichen Einfluss
ionisierender Strahlung auf die Expression dieser viralen Onkogene zu untersuchen
54
wurden bestrahlte und unbestrahlte HPV-positive Zellen mittels quantitativer real time
PCR analysiert. Anhand der gemittelten CT-Werte sind bei den E6 und E7Expressionsleveln
nach
Bestrahlung
keine
nennenswerten
Unterschiede
zu
verzeichnen (Tabelle 3). In den untersuchten Zelllinien ist prinzipiell mehr E7- als E6mRNA vorhanden mit Ausnahme der Zelllinie UM-SCC104, bei der vergleichbare
Mengen E6- und E7-mRNA exprimiert werden.
Tabelle 3: mRNA-Expression von E6 und E7 in den HPV-positiven Zelllinien zu
verschiedenen Zeitpunkten nach Bestrahlung mit 6Gy
Die HPV-positiven Zelllinien VU-147T, UM-SCC47, UM-SCC104 und UPCI:SCC152 wurden
30min, 60min und 6h nach Bestrahlung mit Einzeldosen von 6Gy genommen, mittels
quantitativer real time PCR auf den mRNA-Gehalt der Onkogene E6 und E7 hin untersucht und
mit dem mRNA-Gehalt unbestrahlter Zellen (0Gy) verglichen. Dargestellt sind die Mittelwerte
der gemessenen CT-Werte. (n=1 bei UM-SCC104 und UPCI:SCC152).
CT-Werte (Mittelwerte)
93-VU-147T
UM-SCC47
UM-SCC104
UPCI:SCC152
24,9
23,4
23,9
24,7
30min
25
23,6
24,3
24,3
60min
24,9
23,9
23,9
24,1
6h
25,1
24
24
24,6
20,5
18,5
24
22,8
30min
21,1
18,6
24,3
22,7
60min
20,9
18,8
24,2
22,3
6h
20,8
19
24
22,8
0 Gy
E6
6Gy
0 Gy
E7
6Gy
Die relative Quantifizierung nach Livak und Schmittgen (2001) ergab, dass die
prozentuale E6-mRNA-Expression in allen verwendeten Zelllinien 30min nach
Bestrahlung mit 6Gy unterschiedlich ist und innerhalb 6h nach Bestrahlung in den
Zelllinien UM-SCC47, UM-SCC104 und UPCI:SCC152 um 40% im Vergleich zum
Kontrollwert reduziert ist (Abbildung 16). Die Zelllinie VU-147T weist dagegen eine
Expressions-Zunahme um 40% auf. Die prozentuale E7-mRNA-Expression stellt sich
30min und 60min nach Bestrahlung im Vergleich zum Kontrollwert bei allen Zelllinien
als reduziert dar. 6h nach 6Gy wird jedoch in der Zelllinie VU-147T 40% mehr E7mRNA gebildet, wobei die E7-mRNA in den Zelllinien UM-SCC47, UM-SCC104 und
UPCI:SCC152 um 40% reduziert exprimiert wird.
55
Abbildung 16: Relative E6- und E7-mRNA-Expressionsänderung nach Bestrahlung mit
6Gy
Mittels quantitativer real time PCR wurde die E6- und E7-mRNA-Expression in den HPVpositiven Zelllinien VU-147T, UM-SCC47, UM-SCC104 und UPCI:SCC152 zu den Zeitpunkten
30min, 60min, 6h nach Bestrahlung mit 6Gy festgestellt. Die mRNA-Expression der bestrahlten
Zellen wurde auf die der unbestrahlten Zellen und die Expression des Referenzgens relativiert.
–ΔΔCT
Dargestellt ist die relative Expressionsänderung (2
) der E6- und E7-mRNA nach
Bestrahlung. E6 und E7 steigen bei VU-147T nach 6h an, in den anderen Zelllinien sinkt die
Expression.
3.6 Sequenzierung der E6 und E7-Gen-Region der HPV-positiven Zelllinien
Sobald die virale DNA in das Wirts-Genom integriert gehen Teile der Virus-DNA
verloren bzw. werden transkriptionell beeinträchtigt (Olthof et al. 2012). Aufgrund der
detektierten p53- und Rb-Protein-Expression in den HPV-positiven Zelllinien (siehe
Abschnitte 3.4.2 und 3.4.3) wurden die Sequenzen der E6- und E7-Gene experimentell
überprüft. Isolierte Gesamt-DNA der HPV-positiven Zelllinien wurde dafür amplifiziert
(siehe 2.4), im Institut für Pathologie des Uniklinikums Gießen sequenziert und die
Basenfolgen der E6- und E7-Genregion auf Mutationen und Vollständigkeit mit der
HPV16-Genomsequenz der NCBI-Datenbank (National Center for Biotechnology
Information) verglichen. Da in dieser Datenbank derzeit zwei identische HPV16Referenzsequenzen (NC_001526.2 (Kennedy et al. 1991) und K02718 (Seedorf et al.
1985))
zu
finden
sind,
wurde
für
die
Analyse
die
Sequenz
mit
der
Identifikationsnummer NC_001526.2 verwendet. Ein Ausschnitt der vergleichenden
Analyse zwischen dem sequenzierten Genbereich der Zelllinie UM-SCC47 und der
HPV16-Referenzsequenz zeigt kurz hinter dem Start-Codon des E6-Gens (blauer
Kasten, ATG) vier Basen-Austausche (rote Kästen, Abbildung 17): 1) Austausch von
Tymidin durch Cytosin, 2) Austausch von Guanin durch Tymidin, 3) Austausch von
Cytosin durch Guanin, 4) Austausch von Guanin durch Tymidin. Diese Austausche
56
sind in den Chromatogrammen als eindeutig lesbare Peaks erkennbar, weshalb
technische Probleme ausgeschlossen werden können.
Start E6-Gen
HPV16
HPV_16
SCC47_fwd
SCC47_fwd
SCC47_rev
SCC47_rev
410
420
430
440
450
GGTTAGTATA AAAGCAGACA TTTTATGCAC CAAAAGAGAA CTGCAATGTT
GGTTAGTATA AAAGCAGACA TTTTATGCAC CAAAAGAGAA CTGCAATGTT
GGTTAGTATA AAAGCAGACA TTTTATGCAC CAAAAGAGAA CTGCAATGTT
HPV16
HPV_16
SCC47_fwd
SCC47_fwd
SCC47_rev
SCC47_rev
460
470
480
490
500
TCAGGACCCA CAGGAGCGAC CCAGAAAGTT ACCACAGTTA TGCACAGAGC
CCAGGACCCA CAGGAGCGAC CCATAAAGTT ACCAGATTTA TGCACAGAGC
CCAGGACCCA CAGGAGCGAC CCATAAAGTT ACCAGATTTA TGCACAGAGC
1
Abbildung
17:
2
E6-Sequenzvergleich
der
Zelllinie
3 4
UM-SCC47
mit
der
HPV16-
Referenzsequenz
HPV16: Ausschnitt der HPV16-Referenzsequenz (NCBI Accession number: NC_001526.2
(Kennedy et al. 1991)), SCC47_fwd und _rev: Sequenzierte DNA von der Zelllinie UM-SCC47
(Primer HPV16_E6_E7-Seq fwd und rev). Abweichungen in der E6-Basenfolge der Zelllinie sind
rot eingerahmt (1-4). Die Chromatogramme der entsprechenden Positionen lassen eindeutig
zuordenbare Peaks der Basen erkennen, technische Probleme werden ausgeschlossen, somit
treten vermehrt Unterschiede zur Referenzsequenz auf.
Ein Austausch im E7-Genbereichs der Zelllinie UM-SCC47 kurz hinter dem StartCodon (blauer Kasten, ATG) ist dagegen auf technische Fehler beim Auslesen der
Sequenz zurückzuführen (Abbildung 18): 5) Adenin ist durch Guanin ersetzt. Da die
beiden Adenine vor dem scheinbar ausgetauschten Guanin im Chromatogramm in
Form eines großen Peaks abgebildet sind ist davon auszugehen, dass die Basen nicht
separat gemessen wurden und somit das dritte Adenin überlesen wurde.
57
860
870
TGTATGTCTT GTTGCAGATC
TGTATGTCTT GTTGCAGATC
TGTATGTCTT GTTGCAGATC
Start E7-Gen
910
920
HPV_16
ATCATGCATG
GAGATACACC
HPV16
SCC47_fwd
SCC47_fwd ATCATGCATG GAGATACACC
SCC47_rev
SCC47_rev ATCATGCATG GAGATACACC
HPV_16
SCC47_fwd
SCC47_rev
880
890
900
ATCAAGAACA CGTAGAGAAA CCCAGCTGTA
ATCAAGAACA CGTAGAGAAA CCCAGCTGTA
ATCAAGAACA CGTAGAGAAA CCCAGCTGTA
930
940
950
TACATTGCAT GAATATATGT TAGATTTGCA
TACATTGCAT GAATATATGT TAGATTTGCA
TACATTGCAT GAATATATGT TAGATTTGCA
960
970
980
990
1000
HPV16
HPV_16 ACCAGAGACA ACTGATCTCT ACTGTTATGA GCAATTAAAT GACAGCTCAG
SCC47_fwd ACCAGAGACA ACTGATCTCT ACTGTTATGA GCAATTAAGT GACAGCTCAG
SCC47_fwd
SCC47_rev ACCAGAGACA ACTGATCTCT ACTGTTATGA GCAATTAAGT GACAGCTCAG
SCC47_rev
5
Abbildung
18:
E7-Sequenzvergleich
der
Zelllinie
UM-SCC47
mit
der
HPV16-
Referenzsequenz
HPV16: Ausschnitt der HPV16-Referenzsequenz (NCBI Accession number: NC_001526.2,
(Kennedy et al. 1991)), SCC47_fwd und _rev: Sequenzierte DNA von UM-SCC47 (Primer
HPV16_E6_E7-Seq fwd und rev). Eine Abweichung in der E7-Basenfolge der Zelllinie von der
Referenzsequenz ist rot eingerahmt (5), der Austausch ist auf ein technisches Problem
zurückzuführen.
Basen-Substitutionen in der DNA-Sequenz können mitunter schwerwiegende Folgen
für die Aminosäuresequenz der Proteine haben, wie beispielsweise missenseMutationen (entstandenes Codon kodiert eine andere Aminosäure) oder silentMutationen (entstandenes Codon kodiert für die gleiche Aminosäure). Daher wurden
die sequenzierten HPV16-Genbereiche der Zelllinien in ihre Aminosäuresequenz
übersetzt und mit der Aminosäure-Sequenz des HPV16-Referenz-Genoms verglichen.
Alle detektierten Punktmutationen in den untersuchten HPV16-Gen-Bereichen kodieren
entweder für missense- oder silent- Mutationen (Tabelle 4). Die Zelllinie UM-SCC47
weist
die
meisten
Basen-Austausche
auf,
die
Zelllinien
UM-SCC104
und
UPCI:SCC152 tragen deutlich weniger Basen-Austausche. Die Zelllinie VU-147T
enthält keinerlei Punktmutationen in den sequenzierten HPV-Genbereichen. Ob diese
Mutationen die Funktionen der Onkoproteine E6 und E7 beeinträchtigen, kann hier
nicht geklärt werden. Jedoch ist die in Abschnitt 3.4.3 gefundene verstärkte p53Aktivierung der Zelllinie VU-147T wahrscheinlich nicht auf Gen-Mutationen in der E6Gensequenz zurückzuführen.
58
Tabelle 4: Basensequenz-Analyse der untersuchten HPV-E6 und E7-Gen-Regionen und
Konsequenz für die Aminosäure-Sequenz.
E6-Region
Zelllinie
Basenmutation
UM-SCC47
UM-SCC104
UPCI:SCC152
VU-147T
E7-Region
AminosäureCode
Missense:
T50: ATA=I
Missence:
G61 und T63:
GAT=D
Missense:
C105: CAA=Q
Missense:
G202 und
A203: GGA=G
Missense:
T253: TAT=Y
Silent:
C27: TTC=F
Silent:
G203: GTG=V
Silent:
G320: TTG=L
Missense:
G268: GTG=V
Missense:
G49: GGA=G
Missense:
G277: GTG=V
-
R17I
Q21D
Basenmutation
AminosäureCode
Missense:
C707: TCC=S
Missense:
F229S
L231R
G713: CGT=R
E35Q
Missense:
G565: GTA=V
A68G
-
H84Y
-
F
-
V
-
L
-
L89V
-
R17G
-
L89V
-
M184V
-
Basenmutation: Mutierte Base ausgehend von Start-Codon (Fett kennzeichnet Substitution).
Aminosäure-Code: Referenz-Aminosäure, Stelle in Protein-Sequenz, in HPV-AminosäureSequenz der Zelllinie mutierte Aminosäure.
Es
existieren
Varianten
des
HPV16-Genoms,
deren
Basen-Austausche
bekanntermaßen geographisch regional bedingt sind (Chan et al. 1992), zumal
spezielle Bereiche des E6-Gens einem hohen Selektionsdruck zu unterliegen scheinen
(Chen et al. 2005). Um zu überprüfen, ob es sich bei den vorliegenden Austauschen
um bereits bekannte, regionale HPV16-Varianten handelt wurde in der NCBIDatenbank
nach
übereinstimmenden
HPV16-Sequenz-Bereichen
mit
den
sequenzierten Basenfolgen der Zelllinien gesucht und die gefundenen HPV16-GenBereiche verglichen. Ein repräsentativer Ausschnitt eines Sequenz-Vergleichs zeigt,
dass die Basenfolge der Zelllinie UM-SCC47 eine Übereinstimmung mit der African
59
Type 2-Variante aufweist (Abbildung 19). Weiterhin treten konservierte Bereiche auf
(rot), die offensichtlich in den meisten Varianten identisch sind, nicht jedoch mit der
HPV16-Referenzseqzenz (NC_001526.2). Die Basenfolgen African Type 1, African
Type 2, Asian-American und Amazonian stellen Varianten des HPV16-Genoms dar,
die als übereinstimmend mit der eingegebenen Sequenz der Zelllinie in der NCBIDatenbank gefunden wurden.
Start E6-Gen
UM-SCC47
African1
African2
Asian-American
Amazonian
HPV16
TTAGTATAAAAGCAGACATTTTATGCACCAAAAGAGAACTGCAATGTTCCAGGACCCACA
TTAGTATAAAAGCAGACATTTTCTGCACCAAAAGAGAACTGCAATGTTTCAGGACCCACA
TTAGTATAAAAGCAGACATTTTATGCACCAAAAGAGAACTGCAATGTTCCAGGACCCACA
TTAGTATAAAAGCAGACATTTTATGCACCAAAAGAGAACTGCAATGTTTCAGGACCCACA
TTAGTATAAAAGCAGACATTTTCTGCACCAAAAGAGAACTGCAATGTTTCAGGACCCACA
TTAGTATAAAAGCAGACATTTTATGCACCAAAAGAGAACTGCAATGTTTCAGGACCCACA
********************** ************************* ***********
102
120
120
120
119
120
UM-SCC47
African1
African2
Asian-American
Amazonian
HPV16
GGAGCGACCCATAAAGTTACCAGATTTATGCACAGAGCTGCAAACAACTATACATGATAT
GGAGCGACCCACAAAGTTACCAGATTTATGCACAGAGCTGCAAACAACTATACATGATAT
GGAGCGACCCATAAAGTTACCAGATTTATGCACAGAGCTGCAAACAACTATACATGATAT
GGAGCGACCCAGAAAGTTACCACATTTATGCACAGAGCTGCAAACAACTATACATGATAT
GGAGCGACCCACAAAGTTACCAGATTTATGCACAGAGCTGCAAACAACTATACATGATAT
GGAGCGACCCAGAAAGTTACCACAGTTATGCACAGAGCTGCAAACAACTATACATGATAT
*********** ********** * ***********************************
162
180
180
180
179
180
Abbildung 19: Sequenz-Vergleich von verschiedenen HPV16-Stämmen mit der Zelllinie
UM-SCC47 und der HPV16-Referenzsequenz
UM-SCC47: Ausschnitt des Genbereichs um das Start-Codon des E6-Gens der Zelllinie.
HPV16: Ausschnitt der HPV16-Referenzsequenz (NCBI Accession number: NC_001526.2,
(Kennedy et al. 1991)). HPV16-Varianten der NCBI-Datenbank: African Type 1 (African1),
African
Type
2
(African2),
Asian-American
und
Amazonian.
Rot
markiert
sind
übereinstimmende Basenaustausche zwischen Zelllinie und einzelnen HPV16-Varianten, die
von der Referenzsequenz abweichen.
Unter allen getesteten Zelllinien zeigt der untersuchte HPV-Genabschnitt der Zelllinie
VU-147T aufgrund keinerlei Basensubstitutionen die größte Übereinstimmung mit der
HPV16-Referenzsequenz (Tabelle 5). Die Zelllinie UM-SCC47 beinhaltet eine
veränderte Aminosäure in der HPV16-E6-Sequenz, die nicht mit der HPV16-Variante
African Type 2 übereinstimmt (Aminosäure G202). Alle anderen AminosäureAustausche bei der Zelllinie UM-SCC47 entsprechen den Aminosäure-Austauschen
der HPV16-Variante African Type 2. Zusammenfassend beinhalten alle untersuchten
HPV-positiven Zelllinien mit Ausnahme der Zelllinie VU-147T bereits bekannte HPV16Varianten, die nicht mit der HPV16-Referenzsequenz übereinstimmen. Wenngleich
verschiedene HPV16-Varianten unterschiedliche p53-Degradations-Aktivität besitzen
(Stöppler et al. 1996; Mesplède et al. 2012) ist dennoch keine Aussage über die
60
Funktionalität der in den Zelllinien gefundenen, viralen HPV16-Gen-Varianten bei der
p53-Degradation möglich.
Tabelle 5: Zusammenfassung des NCBI-Datenbank-Vergleichs mit den sequenzierten
HPV-positiven Zelllinien
Die den Basensubstitutionen der HPV16-Gen-Bereiche entsprechenden Aminosäure-SequenzMutationen stimmen mit bekannten HPV16-Gen-Varianten überein.
Zelllinie
Identifizierte Varianten
NCBIIdentifikationsNummer
Asian-American Variant
AF402678.1
African Type 2
African Type 1
AF472508.1
(außer G202 (Missense A68G);
African Type 2
AF472509.1
African Type 2 und Referenz
NC_001526 haben A68)
Amazonian
HM057182.1
East Asian Type
AF534061.1
European German 131 Type,
integrated SiHa Variant
HPV16 variant
AF001599.1
U89348
HPV16 variant,
integrated SiHa Variant
European German
131Type
AF536179
East Asian Type
AF534061.1
European German 131 Type,
integrated SiHa Variant
HPV16 Variant
AF001599.1
U89348.1
HPV16 variant
European German
131Type
AF536179
Asian American Variant
East Asian Type
integrated SiHa variant
HPV16 variant
AF402678.1
AF534061.1
AF001599.1
U89348
European German
131Type
AF536179.1
UM-SCC47
UM-SCC104
UPCI:SCC152
VU-147T
Mutationen entsprechen
HPV16 Variante
(keine Mutationen, entspricht
Referenz NC_001526)
3.7 p53 Signaling Pathway RT-PCR Array
Das Tumorsuppressor-Protein p53 übt durch seine Eigenschaft als Transkriptionsfaktor
entscheidenden Einfluss auf Zell-Proliferation und Apoptose nach strahleninduziertem
DNA-Schaden aus. Das HPV-E6-Protein sorgt für eine Degradation von p53, weshalb
postuliert wurde, dass die p53-vermittelte Strahlenantwort in Virus-infizierten Zellen
verändert ist (Gupta et al. 2009; Kimple et al. 2013). Um diese These zu untersuchen
wurde die Expression p53-abhängiger Gene nach strahleninduzierten DNA-Schaden
61
bei HPV-assoziierten Tumorzelllinien untersucht und mit nicht HPV-assoziierten
verglichen.
Hierzu
wurde
mRNA
der
HPV-positiven
Zelllinien
UM-SCC47,
UPCI:SCC152 und VU-147T, sowie der HPV-negativen Zelllinien UM-SCC11b und UTSCC33 4h nach Bestrahlung mit 6Gy isoliert und zu cDNA umgeschrieben. Mit Hilfe
von Human p53
Signaling Pathway
RT2 Profiler
PCR Arrays
wurde die
Expressionsänderung ausgewählter mRNAs von Komponenten des p53-Signalwegs
analysiert. Die CT-Werte der bestrahlten Proben wurden rechnerisch auf die Werte von
nicht regulierten Haushaltsgenen normiert und auf die Werte der Kontroll-Proben
relativiert (siehe Abschnitt 2.11) (Livak und Schmittgen 2001). Dieser Wert (2-ΔΔCT)
bezeichnet die Expressionsänderung und seine Abweichung vom Faktor 1 wurde als
„verändert exprimiert“ definiert, wobei Werte unter 0,66 als vermindert und über 1,5 als
verstärkt exprimiert betrachtet werden.
Die meisten der untersuchten Gene werden zellspezifisch reguliert (Tabelle 6), das
heißt ihre CT-Werte verändern sich nach Bestrahlung unabhängig vom HPV-Status der
Zelllinie und teilweise nur geringfügig (siehe Fold Change). Lediglich drei Gene waren
in mindestens drei von fünf Zelllinien durch Bestrahlung verändert exprimiert. 4h nach
Bestrahlung mit 6Gy war in der Gruppe der HPV-positiven Zelllinien das Gen BIRC5
(Baculoviral IAP repeat containing 5) (Tabelle 6, blauer Kasten) herunterreguliert. Es
kodiert für das Anti-Apoptotische Protein Survivin, das nach p53-Induktion durch
Bestrahlung herunterreguliert wird (Stauber et al. 2007; Hoffman et al. 2002). Dieses
Ergebnis stimmt mit der gefundenen Zellzyklus-Progression und der verstärkten
SubG1-Phase der HPV-positiven Zelllinien überein (Abbildung 9). Im Gegensatz dazu
konnten Preuss et al. (2008) zeigen, dass eine Akkumulation von Survivin-Protein mit
einer HPV-unabhängigen Karzinogenese korreliert, was der hier detektierten,
verminderten mRNA-Expression des BIRC5-Gens in HPV-positiven Zellen entspricht.
Das Gen CCNB1 (Cyclin B1) (Tabelle 6, roter Kasten) ist in allen untersuchten
Zelllinien durch Bestrahlung vermindert exprimiert. Es kodiert für das Protein Cyclin B1,
welches für die Zellzyklus-Progression während der späten G2- und M-Phase
mitverantwortlich ist und durch seine onkogene Eigenschaft in den meisten humanen
Tumoren überexprimiert wird. Zwar fanden Santana et al. (2002) in HPV18-positiven
Zervix-Karzinomzellen (HeLa) nach Transfektion mit onkogenem H-Ras-Protein eine
gesteigerte, p53-unabhängige Cyclin B1-mRNA-Expression, aber Innocente et al.
(1999) detektierten eine durch p53 verminderte CCNB1-Promotor-Aktivität und die
verminderte
Expression
von
CCNB1.
Die
Herunterregulation
der
CCNB1-
Genexpression entspricht somit der Zellzyklus-Progression der HPV-positiven Zellen,
62
jedoch nicht dem gefundenen strahleninduzierten G1-Arrest der HPV-negativen
Zelllinien, die mutiertes p53 exprimieren.
Das Gen CDC25C (Cell division Cycle 25 homolog C) (Tabelle 6, grüner Kasten) ist in
den zwei HPV-positiven Zelllinien UM-SCC47 und UPCI:SCC152 und der HPVnegativen UT-SCC33 nach Bestrahlung vermindert exprimiert. Es kodiert für eine
Phosphatase, die nach strahleninduzierter Induktion von p53 runterreguliert wird, um
den G2-M-Arrest einzuleiten. Durch sequenzspezifische p53-Bindung an die CDC25CPromotor-Region wird die Repression von CDC25C herbeigeführt (St Clair et al. 2004).
Die verminderten mRNA-Expressionen der HPV-positiven Zelllinien entsprechen deren
G2-Arrest nach Bestrahlung.
Tabelle 6: Gen-Expressions-Änderung auf p53 Signaling Array 4h nach Bestrahlung mit
6Gy in den HPV-negativen und -positiven Zelllinien
Genexpression (2
-ΔΔCT
) der HPV-negativen UM-SCC11b und UT-SCC33, sowie der HPV-
positiven UM-SCC47, UPCI:SCC152 und VU-147T 4h nach Bestrahlung mit 6Gy nach qPCR
mit dem p53 Signaling Array.
Fold Change
HPV-negativ
Gen
BCL2A1
Name
BCL2-related protein A1
Baculoviral IAP repeat
BIRC5
containing 5
CCNB1 Cyclin B1
Cell division cycle 25
CDC25C
homolog C (S. pombe)
Fas (TNF receptor
FAS
superfamily, member 6)
Protein regulator of
PRC1
cytokinesis 1
Reprimo, TP53 dependent
RPRM G2 arrest mediator
candidate
TNF
Tumor necrosis factor
TP73
Tumor protein p73
WT1
Wilms tumor 1
HPV-positiv
UM-SCC11b
UT-SCC33
UM-SCC47
1,02
1,03
0,62
UPCI:SCC152 VU-147T
-
-
0,73
0,7
0,57
0,56
0,6
0,62
0,57
0,63
0,4
0,62
0,73
0,61
0,66
0,53
0,82
0,86
1,5
1,12
1,12
0,96
0,7
0,71
0,61
0,54
0,86
1,45
1,85
-
1,18
1,13
0,95
1,14
1,09
1,59
-
0,94
0,71
0,84
1,09
1,2
0,43
0,46
0,83
0,92
Fold Change bezeichnet die Änderung der CT-Werte nach Relativierung auf die unbestrahlte
Kontrolle und die Haushaltsgene. Ein Wert von 1,00 entspricht keiner Veränderung, <1 einer
Runterregulation, >1 einer Hochregulation. ‚-‘: Gen wird nicht exprimiert. Fett gedruckt:
veränderte Gen-Expression bei einem „Cut off“ von <0,66 und >1,5. Bunte Kästen: veränderte
Expression in mindestens drei der untersuchten Zelllinien.
Zusammengefasst zeigen die Ergebnisse der p53 Signaling Array Analyse, dass nach
Bestrahlung sechs Gene (BCL2A1, FAS, PRC1, RPRM, TNF, TP73) in HPV-positiven
63
Zelllinien anders als nach Bestrahlung erwartet reguliert werden, dagegen sind es nur
vier Gene (BCL2A1, BIRC5, PRC1, TNF) in den HPV-negativen Zelllinien (Tabelle 7).
Diese Gene haben im weitesten Sinne eine Apoptose-induzierende Funktion. Sie
werden in den hier untersuchten HPV-positiven Zelllinien nach Bestrahlung vermindert,
in den HPV-negativen Zelllinien jedoch nicht vermindert exprimiert.
Tabelle 7: Eigenschaften und Funktionen der Gene mit stark veränderter Expression in
der p53 Signaling Array Analyse der HPV-negativen und -positiven Zelllinien.
mRNA-Expression in
bestrahlten Zelllinien
Gen
Protein
Merkmale
BCL2-related
BCL2A1
protein A1
B-Zell-LymphomProtein-Familie
BIRC5
Survivin
Protein enthält 1
Baculovirus IAP
Repeat
CCNB1
Cyclin B1
Heterodimer aus
Cdc2 und Cyclin B1
CDC25C
FAS
Funktionen
Anti- und Pro-Apoptotischer Regulator,
reduziert Cytochrom C-Freisetzung,
blockt Caspase-Aktivierung,
hochreguliert durch extrazelluläre Signale
(TNF, Zytokine, etc.)
Fördert Proliferation und verhindert
Apoptose,
Beteiligung bei Chromosom-Anlagerung
und -Trennung;
inhibiert Caspase 9
Fördert Proliferation,
wird zwischen G2-M-Phase exprimiert
Cell division cycle
Induziert Mitose durch Dephosphorylierung
Tyrosin-Phosphatase
25 homolog C
von Cyclin B1-Cdc2-Komplex
Fas-Rezeptor
TNF Receptor,
TransmembranDomäne
PRC1
Proteinregulator Phosphoprotein mit
der Zytokinese 1 10 Untereinheiten
RPRM
Reprimo
G2 Arrest Mediator,
integrales
Membranprotein
TNF
Tumor-Nekrose- Zytokin, löslich,
Faktor
Trimer
TP73
Tumor Protein
p73
Strukturverwand mit
p53
WT1
Wilms tumor 1
Transkriptionsfaktor,
u. a. für Bcl2
Induziert Apoptose nach Fas-LigandBindung
Substrat verschiedener CDKs,
bewirkt Histon-Ubiquitinylierung für GenSilencing
Induktion von G2-M-Arrest,
Inhibierung der CDK1-Aktivität,
bewirkt Translokation des CDC2-CyclB1
Komplexes
regelt Aktivität verschiedener Immunzellen,
löst Apoptose oder Proliferation aus
Tumorsuppressor oder Onkoprotein,
ähnliche Funktion wie p53 (proapoptotische
Funktion beschrieben)
Tumorsuppressor oder Onkoprotein,
stabilisiert p53 und verhindert p53abhängige Apoptose
erwartete
Änderung nach
Bestrahlung
HPV-positiv
HPV-negativ
hochreguliert
wird
weniger/nicht
exprimiert
gleichbleibend
reprimiert
wird weniger
gleichbleibend
reprimiert
wird weniger
wird weniger
degradiert
wird weniger
wird weniger
hochreguliert
gleichbleibend
gleichbleibend/wird
mehr
akkumuliert
wird weniger
wird weniger
hochreguliert
gleichbleibend
wird mehr
hochreguliert
gleichbleibend/
wird weniger
gleichbleibend
hochreguliert
wird weniger
wird mehr
gleichbleibend
gleichbleibend/
wird weniger
gleichbleibend
64
4 Diskussion
Obwohl zwei abgrenzbare Entitäten bei HNSCC-Tumoren vorliegen (konventionelle
und HPV-getriebene Karzinogenese) besteht für beide Patientengruppen die gängige
Therapie aus Operation und/oder Radiotherapie ohne Unterschied. Es wird also keine
zielgerichtete Therapie durchgeführt. Erhalten Patienten mit HNSCC-Tumoren eine
Strahlentherapie, so ist die Prognose bei HPV-Assoziation erheblich besser als bei
HNSCC-Tumoren, die durch konventionelle Noxen hervorgerufen wurden (Ang et al.
2010). Es ergibt sich die Frage, ob die HPV-getriebene Karzinogenese bei HNSCC ein
prädikativer Faktor für die Strahlentherapie ist. Andere biologische Effekte, wie die
Aktivierung des Immunsystems (Tobita et al. 2010), könnten gleichsam für die gute
Prognose der Patienten verantwortlich sein.
Es liegen aktuell nur wenige experimentelle Studien zur Strahlensensitivität von
HNSCC-Tumorzellen vor und die Ergebnisse sind widersprüchlich. So fanden Spanos
et al. (2009), dass HPV-assoziierte HNSCC-Zelllinien radioresistenter seien, Nagel et
al. (2013) konnten keinen Unterschied in der Strahlenresistenz HPV-positiver und
HPV-negativer
Zelllinien
feststellen.
Weiterhin
existieren
derzeit
drei
Veröffentlichungen, die eine erhöhte Strahlensensitivität HPV-positiver HNSCCZelllinien nachweisen konnten (Rieckmann et al. 2013; Gupta et al. 2009; Kimple et al.
2013). Die Aufdeckung einer möglichen erhöhten Strahlensensitivität HPV-assoziierter
HNSCC-Zelllinien in vitro war Ziel dieser Arbeit.
4.1 Einfluss ionisierender Strahlung auf HNSCC-Tumorzelllinien
4.1.1 Strahlenempfindlichkeit
Untersuchungen zum klonogenen Überleben HPV-positiver und -negativer Zelllinien
zeigten, dass die HPV-positiven Zelllinien ein signifikant schlechteres Überleben nach
Bestrahlung mit 2Gy als die HPV-negativen Zelllinien aufwiesen. Dies entspricht dem
berichteten guten Gesamt-Überleben von Patienten mit HPV-assoziierten HNSCC
nach Radiotherapie (Gillison et al. 2000). Gupta et al. (2009) und Rieckmann et al.
(2013) fanden ebenfalls eine verstärkte Strahlenempfindlichkeit bei HPV-assoziierten
HNSCC-Tumorzellen. In einer aktuellen Studie wurden alle derzeit verfügbaren HPVassoziierten Tumorzelllinien auf intrinsische Strahlensensitivität getestet (Kimple et al.
2013). Bei Zellen mit HPV-getriebener Karzinogenese wurde hier gleichfalls eine
signifikant erhöhte Strahlensensitivität festgestellt. Diese Studien untermauern somit
65
das Ergebnis der hier gefundenen erhöhten Radiosensitivität HPV-assoziierter
HNSCC-Tumorzelllinien.
4.1.2 Zellzyklus
Die hohe Strahlensensitivität HPV-positiver Tumorzellen kann möglicherweise durch
eine veränderte Zellzyklus-Progression nach Exposition mit ionisierender Strahlung
erklärt werden. Gesunde Zellen reagieren auf Bestrahlung mit einem Zellzyklusarrest in
der G1-Phase, der die Reparatur geschädigter DNA vor der nächsten Mitose
gewährleistet. Tumorzellen können dagegen trotz geschädigter DNA keinen G1-Arrest
durchführen, meistens bedingt durch Mutationen im Tumorsuppressor-Protein p53, das
u. a. für die DNA-Schadenserkennung verantwortlich ist (Dahm-Daphi 2000). In HPVpositiven HNSCC-Tumorzellen liegt das p53-Protein zwar in WT-Form vor (Andl et al.
1998; Gillison et al. 2000; Hafkamp et al. 2003; Wiest et al. 2002), wird jedoch durch
das virale E6-Protein inhibiert, weshalb auch in HPV-positiven HNSCC-Tumorzellen
trotz DNA-Schaden möglicherweise kein G1-Arrest durchgeführt wird. Durch den
ausbleibenden G1-Arrest erfolgt in Tumorzellen vermutlich eine Zellzyklus-Progression,
die in die Mitose mündet, ohne dass die Zellen die Möglichkeit zur DNASchadensreparatur hatten. Um nach der DNA-Synthese die Zellteilung einleiten zu
können, vollziehen die Zellen weiterhin einen G2-Checkpoint, bei dem wiederum eine
DNA-Schadenskontrolle durchgeführt wird. Beschädigte DNA führt hier erneut zu
einem Zellzyklus-Arrest in der G2-Phase. Die untersuchten HPV-positiven Zelllinien
reagieren auf Bestrahlung mit einem verstärkten und zeitlich länger andauernden G2Arrest im Vergleich zu den HPV-negativen Zelllinien. Die DNA-Synthese in HPVpositiven Tumorzellen scheint somit auch nach strahleninduziertem DNA-Schaden
nicht angehalten zu werden und führt zur Akkumulation fehlerhafter DNA. Auf
irreparable DNA-Schäden reagieren gesunde Zellen mit der Induktion von Apoptose.
Dabei spielen Regulator-Proteine wie p53 und Rb eine zentrale Rolle. Der mitotische
Zelltod ist eine weitere Form der Apoptose, bei der Zellen mit akkumulierten DNASchäden während der Mitose zerstört werden. Gleichzeitig kann die Induktion von
Zelltod auch über vielfältige biologische Effekte wie beispielsweise die Freisetzung von
mitochondrialen
Cytochrom
C
als
Mediatoren
der
Apoptose-Induktion
nach
Bestrahlung herbeiführt werden.
Bei bestrahlten HPV-positiven Tumorzellen wurden vermehrt Zellen mit DNAFragmenten (SubG1-Phase) nachgewiesen, was auf eine gesteigerte Apoptose-Rate
hinweist. Da diese subG1-Zell-Fraktion in HPV-positiven Zellen jedoch erst ca. 28h
nach Bestrahlung gemessen wurde, scheint ein sekundärer Effekt vorzuliegen, der
66
nicht direkt durch die Bestrahlung hervorgerufen wurde. Diese Beobachtung
untermauern Rieckmann et al. (2013) durch die Hypothese, es existiere kein direkter
Zusammenhang zwischen Bestrahlung und Strahleninduzierter Apoptose. Andererseits
könnten die unterschiedlichen experimentellen Methoden wie die Colcemid-basierte
Durchflusszytometrie ausschlaggebend für die abweichenden Ergebnisse und die
daraus resultierende These sein. Konträr zu Rieckmann et al. (2013) beobachteten
Kimple et al. (2013) eine gesteigerte Apoptose-Aktivität in bestrahlten HPV-positiven
Zellen, was die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit unterstützt.
Die ungebremste Zellzyklus-Progression kombiniert mit der Anhäufung fragmentierter
DNA korrelieren daher möglicherweise mit dem guten Ansprechen von Radiotherapie
bei Patienten mit HNSCC- und HPV-getriebener Karzinogenese. Diese Empfindlichkeit
der Zellen kann am ehesten erklärt werden durch das Auftreten mitotischen Zelltodes,
bedingt durch die fortlaufende Zellzyklus-Progression und Akkumulation von DNASchäden.
4.1.3 Markerproteine bei der primären Strahlenantwort
Die molekulare Grundlage einer erhöhten Strahlensensitivität von Patienten mit
HNSCC-Tumoren, bedingt durch HPV-getriebene Karzinogenese, ist bislang nicht
hinreichend bekannt. Daher wurde die Expression von denjenigen Proteinen nach
Bestrahlung untersucht, welchen eine entscheidende Rolle bei der primären
Strahlenantwort zugeschrieben wird.
Das Tumorsuppressor-Protein p16INK4A ist an der Zellzyklus-Regulation beteiligt, indem
er bei DNA-Schaden die Phosphorylierung von Rb durch die Cyclin-abhängige Kinasen
4 und 6 inhibiert. In HPV-positiven Zellen bewirkt die E7-vermittelte Rb-Inhibierung
durch den fehlenden Rückkopplungs-Mechanismus eine Akkumulation von p16Proteinen (Sano et al. 1998). In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass
sich die Protein-Expression von p16INK4A durch Bestrahlung nicht wesentlich verändert.
Ionisierende Strahlung bewirkt zwar bei Mäusen einen Anstieg der p16-Expression in
hämatopoetischen Zellen (Wang et al. 2006), allerdings sind diese Zellen nicht mit den
hier verwendeten HPV-positiven HNSCC-Tumorzellen vergleichbar. Somit bestätigt
das Ergebnis dieser Arbeit lediglich den HPV-Status der untersuchten Zelllinien.
Das
Tumorsuppressor-Protein
Rb
bewirkt
durch
die
Freisetzung
des
Transkriptionsfaktors E2F die Aktivierung der S-Phase-Gene und so die Zellzyklus-
67
Progression. Voraussetzung dafür sind Phosphorylierungen von Rb im Laufe des
Zellzyklus (Buchkovich et al. 1989). Bestrahlung bewirkt dagegen eine Inhibierung der
Rb-Phosphorylierung. In HPV-positiven Zellen wird Rb durch das virale E7Onkoprotein inhibiert und für den Abbau markiert (Dyson 1998; Münger et al. 2001;
Boyer et al. 1996). In der vorliegenden Arbeit konnte 24h nach Bestrahlung in HPVpositiven Zelllinien ein stärkeres Rb-Proteinsignal als in unbestrahlten Zellen detektiert
werden. Dieses Ergebnis deutet darauf hin, dass Rb in HPV-positiven HNSCCZelllinien reduziert exprimiert wird und nach Bestrahlung aufgrund des kontinuierlichen
Abbaus durch das HPV-E7-Onkoprotein (Dyson 1998; Münger et al. 2001; Boyer et al.
1996) den Zellzyklus nicht arretieren kann. Insofern untermauern die Ergebnisse der
Rb-Protein-Expression die Zellzyklus-Analysen der HPV-positiven HNSCC-Zelllinien.
Im Gegensatz dazu postulieren Lindel et al. (2012) bei bestrahlten HPV-positiven
Zellen eine verminderte Rb-Proteinexpression und begründen diese mit der Regulation
durch das virale E2-Gen. Nach Integration der HPV-DNA in das Wirtsgenom wird das
E2-Gen deletiert und infolgedessen die viralen Onkoproteine E6 und E7 verstärkt
exprimiert (Olthof et al. 2012). In allen HPV-positiven Zelllinien, die im Rahmen dieser
Arbeit verwendet wurden, ist die HPV-DNA in das zelluläre Genom integriert (interne
Kommunikation mit Olthof, N.; Huebbers, C.), sodass wahrscheinlich in jeder Zelllinie
ein komplett oder teilweise deletiertes E2-Gen vorliegt. Die gefundene Veränderung
des Rb-Proteinsignals nach Bestrahlung widerspricht somit der Hypothese von Lindel
et al. (2012) laut der bestrahlte HPV-positive Zellen mit integrierter DNA verstärkt HPVE7-Protein exprimieren und somit die Rb-Proteinexpression vermindert wird. Da die
Autoren jedoch ausschließlich Zellen mit episomal bzw. integriertem HPV-Genom
untersuchten, kann die Beteiligung von HPV an der Strahlensensitivität von Tumoren
mit HPV-getriebener Karzinogenese nicht näher definiert werden. Es fehlen sowohl
Untersuchungen mit bestrahlten, gesunden Keratinozyten, sowie mit bestrahlten
HNSCC-Tumorzellen ohne HPV-Assoziation.
Das
Tumorsuppressor-Protein
p53
übernimmt
in
seiner
Funktion
als
Transkriptionsfaktor die Regulation von Apoptose-Induktion, Zellzyklus-Arrest und
Wachstumskontrolle, sowie DNA-Reparatur und Replikation. Nach Strahleninduziertem
DNA-Schaden
erfolgt
die
Aktivierung
des
p53-Proteins
in
Form
von
Phosphorylierungen (Banin et al. 1998). In HPV-positiven Tumorzellen wird p53
allerdings durch HPV-E6 inhibiert und zum Abbau markiert (Scheffner et al. 1990;
Werness et al. 1990), wobei die Beteiligung von HPV an der Strahlensensitivität HPVassoziierter Tumoren kontrovers diskutiert wird. In den HPV-negativen Zelllinien konnte
24h nach Bestrahlung UM-SCC11b und UT-SCC33, sowie in der HPV-positiven VU-
68
147T ein p53-Signal detektiert werden. Das Fehlen eines p53-Proteinsignals bei der
HPV-negativen Zelllinie UD-SCC1 ist am ehesten auf experimentelle Bedingungen
zurückzuführen. Am Standort Marburg erfolgt der Proteinnachweis mit veränderten
Puffersystemen und einer anderen Western Blot Membran (Arenz et al. 2014). In den
HPV-positiven Zelllinien UM-SCC47, UM-SCC104 und UPCI:SCC152 ist 24h nach 6Gy
kaum p53-Protein nachweisbar. Die HPV-positive Zelllinie VU-147T verfügt sowohl
über ein WT-p53- und als auch ein mutiertes p53-Gen, weshalb das p53-Proteinsignal
wahrscheinlich durch Aggregation von mutiertem p53-Protein entstand, da WT-p53 der
Degradation von E6 unterworfen ist. Bestrahlung bewirkt jedoch bereits 0,5h später in
den HPV-positiven Zelllinien UM-SCC47 und VU-147T, sowie den HPV-negativen
Zelllinien UM-SCC11b und UT-SCC33 eine messbare Aktivierung von p53 in Form von
Phosphorylierung an Serin15. Diese Aktivierung nimmt in den HPV-positiven Zelllinien
über die Zeit ab, folglich ist 24h nach Bestrahlung fast kein Phospho-p53-Protein mehr
nachzuweisen. Das starke und lang anhaltende phospho p53-Signal der HPV-positiven
Zelllinie VU-147T widerspricht zwar der Theorie, dass das onkogene E6 die
Degradation des Tumorsuppressors p53 herbeiführt (Scheffner et al. 1990; Werness et
al. 1990). Es scheint jedoch eine p53-vermittelte Strahlenantwort in den HPV-positiven
Tumorzellen zu erfolgen, die zeitabhängig durchgeführt wird. Im Gegensatz dazu
postulieren Ahmed et al. (2009) eine ATM-vermittelte (Ataxia telangiectasia mutated
kinase) Strahlenantwort in humanen Keratinozyten, die bereits 0,5h nach nur 1Gy
aktiviert wird. Leider überprüften die Autoren die p53-Expression weder auf RNA noch
Proteinebene, sodass ein Vergleich mit der p53-abhängigen primären Strahlenantwort
nicht hergestellt werden kann.
In wie weit die im Rahmen der vorliegenden Arbeit gefundene Aktivierung der HPVnegativen Tumorzellen auf die p53-Funktionalität aufgrund der postulierten Mutationen
schließen lässt kann hier nicht abschließend geklärt werden. Im Vergleich zu HNSCCZellen mit p53-Mutation konnten Niemantsverdriet et al. (2005) bei Zellen mit
konditioneller Überexpression von p53 zeigen, dass diese Zellen nach Bestrahlung
einen Zellzyklus-Arrest-Shift von G1 zu G2 durchführen. Dies bekräftigt sowohl den in
dieser Arbeit gefundenen strahleninduzierten G2-Arrest HPV-positiver und den G1Arrest
HPV-negativer
Zellen,
als
auch
die
These
einer
p53-abhängigen
Strahlenantwort, die in HPV-positiven Zelllinien zum erhöhten Zellsterben führen
könnte.
Zusammenfassend konnte gezeigt werden, dass ionisierende Strahlung die Rb- und
p53-Proteinexpression unterschiedlich beeinflusst. Der länger andauernde G2-Arrest
69
und die verspätete Akkumulation von HPV-positiven Zellen mit DNA-Fragmenten
weisen zusammen mit den Western Blot Ergebnissen darauf hin, dass die erhöhte
Strahlensensitivität
HPV-positiver
HNSCC-Tumorzellen
durch
p53-unabhängige
Formen des Zellsterbens zustande kommen könnte. Einen solchen p53-unabhängigen
Weg beschrieben bereits Patel et al. (2000) als Schlussfolgerung auf die gefundene
verstärkte Apoptose-Rate 96h nach Bestrahlung in p53-defizienten im Vergleich zu
bestrahlten WT-p53 HNSCC-Tumorzellen. Einerseits stärkt die tendenziell schwache
und uneinheitliche Reaktion auf Protein-Ebene in bestrahlten HPV-positiven Zellen den
Verdacht eines p53- und Rb-unabhängigen Signalwegs. Andererseits sichern sowohl
p53 als auch Rb in ihrer antiapoptotischen Funktion das Zellüberleben und sorgen
primär für DNA-Reparatur. Es liegt der Verdacht nahe, dass andere Proteine wie
beispielsweise ATM bei Ahmed et al. (2009) die Strahlensensitivität bei Tumoren
bedingen, die durch HPV-getriebene Karzinogenese entstanden. Die verspätete
SubG1-Phasen-Akkumulation könnte als Hinweis auf mitotischen Zelltod aufgrund von
chromosomalen Aberrationen gelten und somit entgegen der p53-vermittelten
Apoptose stehen.
4.2 Einfluss ionisierender Strahlung auf virale Onkoproteine
In wie weit ionisierende Strahlung einen Einfluss auf die Genexpression von HPV16-E6
und -E7 hat ist weitestgehend unbekannt. Daher wurde die mRNA-Expression dieser
Gene in den HPV-positiven Zelllinien untersucht. Es zeigte sich, dass die Mehrheit der
Zelllinien 6h nach Bestrahlung eine um 40% verminderte E6- und E7-mRNAExpression aufwies. Durch Bestrahlung scheinen also die Onkogene E6 und E7
insofern beeinflusst zu werden, als dass ionisierende Strahlung möglicherweise die
Transkription hemmt.
Die Zelllinie VU-147T stellt eine Ausnahme dar, denn sie weist 6h nach Bestrahlung
einen gesteigerten E6- und E7-mRNA-Gehalt auf. Dies könnte mit der verstärkt
exprimierten E6-Splice-Variante E6*I zusammenhängen (Steenbergen et al. 1995). Es
existieren Hinweise, dass das E6*I-Variantenprotein das E6-Protein binden und so die
E6-vermittelte p53-Degradation inhibieren kann (Pim et al. 1997). Weiterhin wird
vermutet, dass die Variante E6*I über Promotor-Aktivierung die Transkription von E6und E7 bewirkt (Shirasawa et al. 1994). In einer jüngeren Studie konnte über stabile
Transfektion mit der E6-Splice-Variante E6*I eine verstärkte Strahlensensitivität im
Vergleich zum normalen E6-Transkript nachgewiesen werden (Pang et al. 2011).
Außerdem postulieren Pang et al. (2011), dass die Isoform E6*I (im Gegensatz zum
70
vollständigen E6-Transkript) keinen Effekt auf WT-p53 hat. Diese These bekräftigt die
in der vorliegenden Arbeit gefundene p53-Aktivierung 24h nach Bestrahlung, während
die anderen HPV-positiven Zelllinien zu diesem Zeitpunkt bereits kein phosphoryliertes
p53 mehr aufwiesen. Anhand der in der vorliegenden Arbeit verwendeten E6-PCRPrimer (Abschnitt 2.4) kann allerdings nicht unterschieden werden, ob es sich beim
entstandenen E6-PCR-Produkt um die E6*I Splice-Variante oder das vollständige E6Transkript handelt. Deshalb bleibt unklar, ob die gesteigerte E6-Expressions bei VU147T durch die amplifizierte E6*I-Splice-Variante oder durch einen Bestrahlungseffekt
entstand. Aufgrund der E6- und E7-Expressionsminderung aller anderen HPVpositiven Zelllinien ist jedoch ein E6-Splice-Varianten-Amplifikat wahrscheinlich.
Weiterhin wurden in den HPV-positiven Zelllinien die E6- und E7-Genbereiche auf
Sequenzmodifikationen überprüft. Zwar weisen die meisten HPV-positiven Zelllinien
Modifikationen auf, diese wurden aber als HPV16-Varianten identifiziert, die in der
Referenz-Datenbank bereits beschrieben sind. Wie auch bei der E6- und E7Genexpression zeigte eine Zelllinie ein anderes Sequenzierungs-Ergebnis: Die Zelllinie
VU-147T verfügt über E6- und E7-Genbereiche, die keine Sequenzmodifikationen
aufweisen und mit der Referenzsequenz (NCBI-Datenbank, Identifikationsnummer
NC_001526.2 (Kennedy et al. 1991)) übereinstimmen. Folglich können selbst HPV16Genomvarianten mit Sequenzmodifikationen in humanen Zellen eine Karzinogenese
herbeiführen. In wie weit die HPV16-Genomvarianten Onkoproteine bilden, die in ihrer
Funktion den Proteinen der HPV16-Referenzsequenz gleichen, ist jedoch nicht klar.
Experimentelle Studien belegen, dass die Onkogene E6 und E7 je nach Variante in
unterschiedlichen Mengen exprimiert werden und auch die p53-Degradations-Aktivität
der einzelnen Varianten unterschiedlich ist (Mesplède et al. 2012; Foster et al. 1994;
Stöppler et al. 1996). Die Vermutung, dass das in den Zellen enthaltene HPV16Genom das p53-Protein-Signal beeinflusst, liegt nahe.
Zusammengefasst konnte gezeigt werden, dass die meisten HPV-positiven Zelllinien
nach Exposition mit ionisierender Strahlung die Genexpression der Onkogene E6 und
E7 vermindern. Allerdings liegen selbst innerhalb der Entität der HPV-positiven
Zelllinien Unterschiede in Bezug auf E6- und E7-Genexpression sowie die HPV16Genomsequenz vor. Ob ein Zusammenhang zwischen den gefundenen SequenzModifikationen, den unterschiedlichen Protein-Signalen und dem Ansprechen auf
Bestrahlung besteht, kann hier nicht geklärt werden.
71
4.3 Einfluss ionisierender Strahlung auf die p53-abhängige Genexpression
Der Tumorsuppressor p53 spielt eine zentrale Rolle bei der primären, zellulären
Strahlenantwort. In der Mehrheit der HNSCC-Tumoren liegen Mutationen oder
Deletionen im p53-Genbereich vor (Dahm-Daphi 2000), wohingegen HNSCC-Tumore,
deren Karzinogenese durch HPV getrieben ist, meist über ein WT-p53-Gen verfügen
(Andl et al. 1998; Gillison et al. 2000; Hafkamp et al. 2003; Wiest et al. 2002). Dies wird
jedoch durch das virale Onkoprotein E6 inhibiert und zum Abbau markiert (Scheffner et
al. 1990; Werness et al. 1990), wobei eine Beteiligung von HPV an der
Strahlensensitivität HPV-positiver HNSCC-Tumoren kontrovers diskutiert wird. Daher
wurde die Expression von p53-regulierten Genen in bestrahlten HPV-positiven Zellen
untersucht und mit der Expression der HPV-negativen Zellen verglichen. Die Gene
gelten als verändert reguliert, wenn die Expressionsänderung (2-ΔΔCT) (Livak und
Schmittgen 2001) den gewählten „cut off“ (<0,66 bzw. >1,5) unter- bzw. überschreiten.
Insgesamt werden die analysierten Gene allerdings größtenteils schwach exprimiert,
weshalb eine detektierte Expressionsänderung bei geringen mRNA-Mengen als sehr
sensitiv angesehen wird. Drei Gene werden nach Bestrahlung mit 6Gy im Verhältnis
stärker verändert exprimiert: Das Gen BIRC5, welches für das antiapoptotische Protein
Survivin kodiert, das Gen CCNB1, welches für das Protein Cyclin B1 kodiert, und das
Gen CDC25C, welches für das gleichnamige Protein cdc25c (Cell Devision Cycle 25C)
kodiert.
Das Gen BIRC5 wird nach p53-Induktion durch Bestrahlung vermindert (Stauber et al.
2007; Hoffman et al. 2002). Es kodiert für das Protein Survivin, das einerseits an der
Chromosomen-Segregation während der Zytokinese, andererseits bei der Inhibierung
der Caspase-9 beteiligt ist. In allen HPV-positiven Zelllinien wird das Gen BIRC5 nach
Bestrahlung vermindert exprimiert, in den HPV-negativen Zellen bleibt es unverändert.
Diese BIRC5-mRNA-Minderung der HPV-positiven Tumorzellen bekräftigt sowohl ihren
strahleninduzierten, länger andauernden G2-Arrest als auch ihre p53-Aktivierung und
kann als Indiz für eine p53-abhängige Strahlenantwort geltend gemacht werden. Diese
These wird durch eine Studie von Hoffman et al. (2002) untermauert, bei der nicht nur
die Bindung von p53 in vivo an die Survivin-Promotor-Region gezeigt wurde, sondern
auch die Verminderung der BIRC5-mRNA nach p53-Induktion detektiert wurde. Im
Gegensatz dazu postulieren Preuss et al. (2008), dass die Expression von SurvivinProtein unabhängig von der HPV-getriebenen Karzinogenese abläuft und folglich auch
p53-unabhängig ist. Da der Nachweis von Survivin in dieser Studie jedoch
ausschließlich über Formalin-fixiertes, in Paraffin eingebettetes Gewebe und über
72
immunhistochemische Färbung erfolgte, ist eine Vergleichbarkeit mit der mRNAExpression der vorliegenden Arbeit – isoliert aus frischem Zellmaterial – nicht gegeben.
Das Gen CCNB1 kodiert für das Protein Cyclin B1, das die Zellzyklus-Progression
während der späten G2- und M-Phase fördert. Nach strahleninduziertem DNASchaden wird die Genexpression von CCNB1 vermindert (Badie et al. 2000). In allen
getesteten HNSCC-Zelllinien ist nach Bestrahlung die mRNA-Expression des CCNB1Gens vermindert. Da das kodierte Protein Cyclin B1 für die G2-M-Phasen-Progression
benötigt wird, entspricht die CCNB1-mRNA-Minderung der HPV-negativen Zellen dem
gefundenen strahleninduzierten G1-Arrest. Da diese Zellen jedoch nur mutiertes p53Protein exprimieren muss eine weitere p53-unabhängige Cyclin B1-Regulation
vorliegen. Chen et al. (2002) fanden in mit HPV18 immortalisierten humanen
Keratinozyten (HK18) eine p53-unabhängige Strahlenantwort, vermittelt durch NFκB
(nuclear factor kappa B). Die Autoren postulieren, dass unter anderem CCNB1
transkriptionell durch NFκB reguliert werde. Anders als nach einmaliger Bestrahlung
mit 6Gy detektieren Chen et al. (2002) nach fraktionierter Bestrahlung allerdings eine
gesteigerte mRNA-Expression in bestrahlten, immortalisierten Keratinozyten. In
HPV18-positiven HeLa-Zellen (Zervix-Karzinom) konnten Santana et al. (2002) durch
die Transfektion mit onkogenem H-Ras-Protein eine gesteigerte, CCNB1-mRNAExpression feststellen. Sowohl bei Chen et al. (2002) als auch bei Santana et al.
(2002) wurde die CCNB1-mRNA-Expression p53-unabhängig gesteuert. Obwohl in
beiden Studien eine CCNB1-Expressions-Minderung detektiert wurde verfügen die von
Chen et al. (2002), Santana et al. (2002), wie auch die hier verwendeten HPV-positiven
Zelllinien über WT-p53. Somit bleibt die Frage nach einer p53-abhängigen
Strahlenantwort, die möglicherweise verspätet angetrieben wird, bestehen.
Das Gen CDC25C kodiert für das Protein cdc25c, welches als Phosphatase die
strahleninduzierte Expression von p53 vermindert und nach Strahleninduziertem DNASchaden reprimiert (Badie et al. 2000). In den untersuchten HPV-positiven Zelllinien
UM-SCC47 und UPCI:SCC152, sowie in der HPV-negativen Zelllinie wird nach
Bestrahlung
die
CDC25C-Expression
vermindert.
Da
CDC25C
durch
die
sequenzspezifische p53-Bindung an die CDC25C-Promotor-Region reprimiert wird (St
Clair et al. 2004) stützt die CDC25C-mRNA-Minderung in den HPV-positiven Zelllinien
die gefundene Strahleninduzierte p53-Aktivierung. Die unveränderte CDC25CExpression in der HPV-positiven Zelllinie VU-147T könnte auf das mutierte p53-Allel
zurückgeführt werden. Dieses ruft möglicherweise eine veränderte Transkription
hervor. Die gefundene CDC25C-RNA-Minderung der bestrahlen HPV-negativen UT-
73
SCC33 Zellen lässt jedoch vermuten, dass es noch einen weiteren p53-unabhängigen
Weg zur Expressionskontrolle gibt.
Insgesamt verdeutlichen die Ergebnisse der p53 Signaling Array-Analyse, dass in
Abhängigkeit vom gewählten „cut off“ nach Bestrahlung sechs Gene (BCL2A1, FAS,
PRC1, RPRM, TNF und TP73) in HPV-positiven und vier Gene (BCL2A1, BIRC5,
PRC1, TNF) in HPV-negativen Zelllinien anders als erwartet reguliert werden. Diese
Gene leiten in gesunden Zellen entweder den p53-abhängigen Zellzyklus-Arrest oder
die p53-abhängige Apoptose ein. Da in beiden Entitäten diese Gene verändert
exprimiert werden wird der Verdacht von p53-unabhängigen Mechanismen, die nach
DNA-Schaden aktiviert werden, bestärkt. In der Literatur wird diese These kontrovers
diskutiert: Koike et al. (2005) zeigten beispielsweise in einer Genexpressions-Analyse
mit bestrahlten, gesunden Keratinozyten, dass die primäre Strahlenantwort nicht von
p53 gesteuert wird. Dagegen fanden Warters et al. (2009) in primären humanen
Keratinozyten nach Bestrahlung hauptsächlich p53-abhängige, transkriptionelle
Zielgene als verändert exprimiert. Weitere Genexpressions-Analysen mit bestrahlten
gesunden Keratinozyten sowie Zellen mit siRNA-vermitteltem p53-Knockdown sind
erforderlich, um den Einfluss von p53 bei der Strahlenantwort zu definieren. Andere
biologische
Mechanismen
wie
beispielsweise
die
Hochregulation
von
Entzündungsfaktoren (z. B. Zytokine) sind bei der Strahlenantwort denkbar und
könnten entscheidenden Einfluss auf zelluläres Überleben nach Bestrahlung haben
(Tobita et al. 2010).
4.4 Ausblick
Bestrahlung
vermindert
das
klonogene
Überleben
HPV-positiver
HNSCC-
Tumorzelllinien signifikant im Vergleich zu HNSCC-Tumorzellen ohne HPV-getriebene
Karzinogenese. Gleichzeitig wurden bei dieser Entität verstärkt Zellen mit DNAFragmenten sowie ein ausbleibender G1-Phasen-Arrest nach Bestrahlung festgestellt.
Welche molekularen Ursachen die höhere Strahlensensitivität HPV-positiver HNSCCTumorzellen bedingen kann hier nicht abschließend dargelegt werden. Ein Hinweis auf
die Beteiligung des p53-Proteins bei der primären Strahlenantwort ist durch dessen
Aktivierung in Form der Phosphorylierung am Serinrest 15 gegeben, wobei die
strahleninduzierte Aktivierung noch eine weitere Phosphorylierung an Serin20 bewirkt,
die im Rahmen dieser Arbeit nicht untersucht wurde. Die These des kompletten p53Abbaus durch das virale E6-Protein könnte weiterhin durch einen fehlerhaften oder
funktionslosen Abbau-Komplex entkräftet werden. In manchen HPV-assoziierten
74
Tumoren könnte das E6-AP-Protein nicht vorhanden bzw. funktionsuntüchtig sein und
mit dem viralen E6-Protein nicht komplexieren (Talis et al. 1998; Huibregtse et al.
1991). Über Western Blot Experimente sowie Co-Immunpräzipitationen mit E6 und p53
könnte diese Hypothese bei den hier verwendeten Zelllinien näher analysiert werden.
Gleichzeitig gäbe der Nachweis von E6 und E7-Protein über Western Blots Aufschluss
über den postulierten p53- und Rb-Abbau in HPV-positiven Zellen. Die Überprüfung
der mRNA- und Protein-Expression der E6*I Splice Variante in der Zelllinie VU-147T
könnte ebenfalls wichtige Informationen über den postulierten Abbau des viralen E6Proteins durch E6*I liefern (Steenbergen et al. 1995).
Die in der vorliegenden Arbeit gefundene, verstärkte Rb-Proteinexpression nach
Bestrahlung könnte auf eine unzureichende Bindung des viralen HPV16E7 hindeuten.
Ob es sich bei der Steigerung der Rb-Proteinexpression tatsächlich um eine
Aktivierung
handelt,
kann
durch
Co-Immunpräzipitation
von
Rb
mit
dem
Transkriptionsfaktor E2F untersucht werden. Zellfraktionierung mit anschließender
Western Blot Analyse von bestrahlten HPV-positiven Tumorzellen kann weiterhin
Aufschluss über die Lokalisation von E2F und dessen transkriptionelle Aktivität geben.
Generell gibt es bei den in dieser Arbeit verwendeten HNSCC-Tumorzelllinien keine
Informationen bezüglich eventueller Mutationen im Rb-Gen und -Protein. Somit würden
Sequenzierung von Gen und Protein hilfreiche Antworten zum detektierten RbProteinsignal liefern.
Neben den hier untersuchten Proteinen ist beispielsweise das ATM-Protein an der
DNA-Schadenserkennung beteiligt (Mirzayans et al. 2012). Experimente zur ATMAktivierung in gesunden Keratinozyten, p53-defizienten (HPV-negativen HNSCCTumorzellen) und p53-WT-Zellen (HPV-positive HNSCC-Tumorzellen) könnten somit
Hinweise für eine mögliche p53-unabhängige Strahlenantwort geben, zumal Ahmed et
al. (2009) bereits eine ATM-Aktivierung in HPV18-positiven Keratinozyten nachweisen
konnten. Inwieweit p53-unabhängige Signalwege in der Zelllinie VU-147T durch viralen
Einfluss zur Hochregulation von p53 (ohne Bestrahlung) führen, bleibt indes noch
ungeklärt.
Zur Überprüfung der Ergebnisse des Human p53 Signaling Pathway RT2 Profiler PCR
Arrays sollten einerseits gesunde Keratinozyten, andererseits Zelllinien mit p53unabhängiger Onkogenese – wie beispielsweise Zellen aus hämatopoetischen
Stammzellen, die CML (chronische myeloischer Leukämie) verursachen – nach
Bestrahlung untersucht werden. So könnte die These der p53-unabhängigen,
75
veränderten Genexpression nach Bestrahlung in den
untersuchten HNSCC-
Tumorzelllinien untersucht werden.
Klinisch könnte der Ansatz, das Immunsystem als Therapiemodalität in Kombination
mit Radiation mit einzubeziehen (Tobita et al. 2010), künftig einen wichtigen Schritt hin
zur effektiveren Tumortherapie sein, nicht nur bei HPV-assoziierten HNSCC-Tumoren.
76
5
Zusammenfassung
Die gängige, klinische Therapie bei HNSCC-Tumoren erfolgt derzeit mittels radikaler
Resektion und adjuvanter Radio- und/oder Chemotherapie. Noxen-assoziierte HNSCCTumore stellen allerdings eine distinkte Entität im Vergleich zu HNSCC-Tumoren mit
HPV-getriebener Karzinogenese dar, wenngleich die Patienten mit HPV-Assoziation
ein
besseres
Gesamtüberleben
aufweisen.
Ob
alleinige
Radiotherapie
bzw.
Radiochemotherapie den gleichen Therapieerfolg wie Resektion mit anschließender
Radio-Chemotherapie bringen würde ist derzeit nicht bekannt. Aus diesem Grund
wurden in der vorliegenden Arbeit HNSCC-Tumorzellen mit und ohne HPV-Assoziation
in vitro bestrahlt und anschließend molekularbiologisch anhand von ZellzyklusAnalysen, Protein- und mRNA-Expression untersucht. Des Weiteren wurde die
Expression der viralen Onkogene E6 und E7 in den HPV-positiven Tumorzelllinien
nach Bestrahlung analysiert.
Die bessere Prognose bei Patienten mit Tumoren aus HPV-getriebener Karzinogenese
wird durch eine erhöhte Strahlensensitivität begründet, was das gefundene, signifikant
verminderte
Überleben
HPV-positiver
HNSCC-Tumorzelllinien
erklären
könnte
(p=0,01) (Arenz et al. 2014). In vitro reagieren die bestrahlten HPV-positiven
Tumorzelllinien verstärkt mit einem zeitlich länger andauernden G2-Arrest im Vergleich
zu den HPV-negativen Zelllinien und akkumulieren DNA-Fragmente, die als Hinweis
auf eine gesteigerte Apoptose-Rate gelten. Die zelluläre Expressions-Analyse der
Marker-Proteine Retinoblastom und p53 zeigte, dass Bestrahlung
zwar die
Proteinexpression verändert, jedoch selbst innerhalb der Entitäten Unterschiede
vorliegen. Die Überprüfung der p53-abhängigen Genprodukte zeigte, dass –
unabhängig von der Entität – Gene reguliert werden, die einen strahleninduzierten
Zellzyklus-Arrest oder Apoptose herbeiführen. Die Expression der viralen Onkoproteine
E6 und E7 war außerdem in der Mehrheit der untersuchten HPV-positiven
Tumorzelllinien nach Bestrahlung vermindert.
Die klinische Heterogenität von HNSCC-Tumoren konnte im Rahmen dieser Arbeit
bestätigt
werden,
wenngleich
eine
erhöhte
Radiosensitivität
HPV-positiver
Tumorzelllinien vorliegt. Molekulare Mechanismen, die nach Bestrahlung das
verstärkte Zellsterben herbeiführen und so das bessere Gesamtüberleben von
Patienten mit HPV-assoziierten Tumoren sichern, werden wahrscheinlich p53unabhängig aktiviert. Vermutlich wird die veränderte virale Genexpression mit der
Aktivierung verschiedener Zelltod-Mechanismen kombiniert.
77
6
Summary
Currently, prevalent clinical treatment of head and neck squamous cell carcinoma
(HNSCC) is resection with adjuvant radio- and/or chemotherapy. Noxa-induced
HNSCC represent a distinct entity compared to HNSCC with a human papilloma virus
(HPV) driven carcinogenesis, however patients with HPV association have a better
overall survival. It is unknown whether exclusive radiotherapy reveals the same
successful outcome as resection with adjuvant therapy. In the present work HNSCC
tumor cell lines with and without HPV association have been irradiated in vitro and
were subsequently molecular biologically analysed for cell cycle behavior, protein and
mRNA expression. In addition, the expression of viral oncogenes E6 and E7 in HPVpositive tumor cell lines after irradiation has been tested.
Improved prognosis of patients with HPV-driven HNSCC is correlated by higher
radiation sensitivity, which was shown by the detected significant decrease of surviving
HPV associated HNSCC tumor cell lines (p=0,01) (Arenz et al. 2014). In vitro irradiated
HPV-positive tumor cell lines react with a prolonged G2 phase arrest compared to
HPV-negative tumor cells, and HPV-positive cells accumulate DNA fragments, which
indicate an increased apoptosis. Cellular expression analysis for marker proteins
Retinoblastoma and p53 revealed that irradiation changes protein expression,
however, differences within entities exist. Examination of p53-depending gene products
demonstrated that genes independent of cellular entity have been regulated, which
promote radiation induced cell cycle arrest or apoptosis. Besides expression of viral
oncogenes E6 and E7 was reduced after irradiation in the majority of tested HPVpositive tumor cell lines.
This work could confirm the clinical heterogenity of HNSCC, even though an increased
radiation sensitivity of HPV-positive tumor cell lines exists. Molecular mechanisms,
which cause the increased cell death after irradiation and therefore ensure the
improved overall survival of patients with HPV-associated tumors, are most probably
p53 independently activated. There is a strong likelihood that altered viral gene
expression and activation of different cell death mechanisms act in combination.
78
7
Abkürzungsverzeichnis
A
Ampere
ATG
Startcodon auf mRNA, das für Protein kodiert
ATP
Adenosintriphosphat
ATM
Ataxia telangiectasia mutated kinase
β
beta
BIRC5
Gen, das für das Protein Survivin kodiert
BSA
Rinderserum-Albumin (engl. Bovine serum albumine)
°C
Grad Zelsius
CCNB1
Gen, das für das Protein Cyclin B1 kodiert
CDC25C
Gen und Protein (engl. Cell division Cycle 25 C)
c
Zenti
cDNA
komplementäre DNA (engl. Complementary DNA)
CT
Cycle Threshold
Cu
Kupfer
D
Dosis
Δ
Delta
ddH2O
Doppelt destilliertes Wasser
DNA
Desoyiribonuklein-Säure (engl. Deoxyribonucleic acid)
dNTP
Nukleosidtriphosphate
EDTA
Ethylendiamintetraacetat
eV
Elektronenvolt
γ
gamma
Gy
Gray
h
Stunde (engl. hour)
HNSCC
Kopf-Hals-Karzinome (engl. Head neck squamous cell carcinoma)
HPV
Humanes Papilloma Virus
keV
Kilo-Elektronenvolt
µ
Mikro
MeV
Mega-Elektronenvolt
min
Minute (engl. minute)
n
Nano
NCBI
National Center for Biotechnology Information
NFκB
Nuklear factor kappa B
PBS
phosphate buffered saline
PCR
Polymerase Kettenreaktion (engl. Polymerase chain reaction)
79
pm
Piko
pRbp
Hyperphosphoryliertes Retinoblastomprotein
pRb
Hypophosphoryliertes Retinoblastomprotein
qPCR
Quantitative real time PCR
Rb
Retinoblastomprotein
RIN
RNA-Integritäts-Nummer
RNA
Ribonuklein-Säure (engl. Ribonucleic acid)
SDS
Sodium dodecylsulfat
SF
Überlebensfraktion (engl. Surviving fraction)
SNP
Single nucleotide polymorphism
UV
Ultraviolett
WT
Wildtyp
γH2AX
Phosphoryliertes Histon H2AX
80
8
Abbildungsverzeichnis
Abbildung 1: Infektion mit HPV16 in mehrschichtigem Plattenepithel der Zervix uteri
und der Tonsillenkrypte ................................................................................................ 2
Abbildung 2: HPV16-Genom ........................................................................................ 3
Abbildung 3: Integration des HPV16-Genoms .............................................................. 6
Abbildung 4: Zellzyklus-Phasen.................................................................................. 11
Abbildung 5: HPV-PCR .............................................................................................. 43
Abbildung 6: Überleben nach Bestrahlung ................................................................. 45
Abbildung 7: Verteilung der DNA-Gehalte der HPV-positiven Zelllinie UPCI:SCC152
und der HPV-negativen Zelllinie UM-SCC11b nach Bestrahlung mit 2Gy und 6Gy .... 46
Abbildung 8: Prozentuale Häufigkeits-Verteilung der DNA-Gehalte bestrahlter Zellen in
den Zellzyklus-Phasen ............................................................................................... 47
Abbildung 9: Prozentuale Häufigkeitsverteilung der Zellen mit DNA-Fragmenten nach
Bestrahlung (SubG1-Phase)....................................................................................... 48
Abbildung 10: p16INK4A-Protein-Expression in vier HPV-positiven und vier HPVnegativen Zelllinien 24h nach Bestrahlung mit 6Gy .................................................... 49
Abbildung 11: Rb-Protein-Expression in vier HPV-positiven und vier HPV-negativen
Zelllinien 24h nach Bestrahlung mit 6Gy .................................................................... 50
Abbildung 12: Rb-Protein-Expression in vier HPV-positiven und zwei HPV-negativen
Zelllinien zu verschiedenen Zeitpunkten nach Bestrahlung mit 6Gy ........................... 51
Abbildung 13: Protein-Expression von hyper- (pRbp) und hypo-phosphoryliertem Rb
(pRb) in zwei HPV-positiven und einer HPV-negativen Zelllinie zu verschiedenen
Zeitpunkten nach Bestrahlung mit 6Gy ....................................................................... 52
Abbildung 14: Protein-Expression von p53 und phosphoryliertem p53 an Serin15 in vier
HPV-negativen und vier HPV-positiven Zelllinien 24h nach Bestrahlung mit 6Gy ....... 53
Abbildung 15: Protein-Expression von p53- und phospho- p53 in zwei HPV-positiven
und zwei HPV-negativen Zelllinien zu verschiedenen Zeitpunkten nach Bestrahlung mit
6Gy ............................................................................................................................ 54
Abbildung 16: Relative E6- und E7-mRNA-Expressionsänderung nach Bestrahlung mit
6Gy ............................................................................................................................ 56
Abbildung 17: E6-Sequenzvergleich der Zelllinie UM-SCC47 mit der HPV16Referenzsequenz ....................................................................................................... 57
81
Abbildung 18: E7-Sequenzvergleich der Zelllinie UM-SCC47 mit der HPV16Referenzsequenz ....................................................................................................... 58
Abbildung 19: Sequenz-Vergleich von verschiedenen HPV16-Stämmen mit der Zelllinie
UM-SCC47 und der HPV16-Referenzsequenz ........................................................... 60
9
Tabellenverzeichnis
Tabelle 1: Zelllinien-Informationen .............................................................................. 22
Tabelle 2: Verdopplungszeiten ................................................................................... 44
Tabelle 3: mRNA-Expression von E6 und E7 in den HPV-positiven Zelllinien zu
verschiedenen Zeitpunkten nach Bestrahlung mit 6Gy ............................................... 55
Tabelle 4: Basensequenz-Analyse der untersuchten HPV-E6 und E7-Gen-Regionen
und Konsequenz für die Aminosäure-Sequenz. .......................................................... 59
Tabelle 5: Zusammenfassung des NCBI-Datenbank-Vergleichs mit den sequenzierten
HPV-positiven Zelllinien.............................................................................................. 61
Tabelle 6: Gen-Expressions-Änderung auf p53 Signaling Array 4h nach Bestrahlung
mit 6Gy in den HPV-negativen und -positiven Zelllinien.............................................. 63
Tabelle 7: Eigenschaften und Funktionen der Gene mit stark veränderter Expression in
der p53 Signaling Array Analyse der HPV-negativen und -positiven Zelllinien. ........... 64
82
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Wittekindt C, Wagner S, Mayer CS, Klußmann JP (2012): Grundlagen der
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Verlag KG Stuttgart · New York ISSN 1439-9121
Wittekindt C, Wagner S, Mayer CS, Klußmann JP (2012): Basics of tumor
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Wagner S, Mayer C, Wittekindt C, Klußmann JP (2012): Humane Papillomaviren
(HPV) bei Kopf-Hals-Karzinomen. Hautarzt, 2012; 63(1): 24-9; PMID: 22179127 ©
Springer-Verlag 2011
Schmidt R, Peters U, Mayer C (2012): Schleimhautschutz des Neugeborenen –
Beobachtungen im Rahmen einer Allergieprävention mit Probiotika. OM & Ernährung,
Nr. 141
Babuke T, Ruonala MO, Meister M, Amaddii M, Genzler C, Esposito A, Tikkanen R
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for their endocytosis. Cell Sign, 2009; 21(8): 1287-97; PMID: 19318123
93
12 Ehrenwörtliche Erklärung
Hiermit erkläre ich, dass ich die vorliegende Arbeit selbständig und ohne unzulässige
Hilfe oder Benutzung anderer als der angegebenen Hilfsmittel angefertigt habe. Alle
Textstellen, die wörtlich oder sinngemäß aus veröffentlichten oder nichtveröffentlichten
Schriften entnommen sind, und alle Angaben, die auf mündlichen Auskünften beruhen,
sind als solche kenntlich gemacht. Bei den von mir durchgeführten und in der
Dissertation
erwähnten
Untersuchungen
habe
ich
die
Grundsätze
guter
wissenschaftlicher Praxis, wie sie in der „Satzung der Justus-Liebig-Universität Gießen
zur Sicherung guter wissenschaftlicher Praxis“ niedergelegt sind, eingehalten sowie
ethische, datenschutzrechtliche und tierschutzrechtliche Grundsätze befolgt. Ich
versichere, dass Dritte von mir weder unmittelbar noch mittelbar geldwerte Leistungen
für Arbeiten erhalten haben, die im Zusammenhang mit dem Inhalt der vorgelegten
Dissertation stehen, oder habe diese nachstehend spezifiziert. Die vorgelegte Arbeit
wurde weder im Inland noch im Ausland in gleicher oder ähnlicher Form einer anderen
Prüfungsbehörde zum Zweck einer Promotion oder eines anderen Prüfungsverfahrens
vorgelegt. Alles aus anderen Quellen und von anderen Personen übernommene
Material, das in der Arbeit verwendet wurde oder auf das direkt Bezug genommen wird,
wurde als solches kenntlich gemacht. Insbesondere wurden alle Personen genannt, die
direkt und indirekt an der Entstehung der vorliegenden Arbeit beteiligt waren. Mit der
Überprüfung
meiner Arbeit
durch
eine
Plagiatserkennungssoftware
bzw.
ein
internetbasiertes Softwareprogramm erkläre ich mich einverstanden.
______________________
____________________________
Ort, Datum
Unterschrift
94
13 Danksagung
Für die Möglichkeit, diese Arbeit im HNO-Forschungslabor des Uniklinikums Gießen
durchführen zu dürfen bedanke ich mich sehr herzlich bei Prof. Dr. Jens Peter
Klußmann.
Prof. Dr. Rita Engenhart-Cabillic spreche ich meinen Dank aus für die Ermöglichung
der Durchführung der Bestrahlungsversuche im Labor der Klinik für Strahlentherapie
und Radioonkologie, Phillips-Universität Marburg.
Für die Bedienung der Röntgenröhre für Zellkulturexperimente im Biomedizinischen
Forschungszentrum in Marburg, sowie deren Bereitstellung als Strahlenschutzbeauftragte danke ich Dr. Kristin Dreffke und Dr. Andrea Arenz. Weiterhin gilt mein
Dank den Physikern Prof. Klemens Zink, Frank Ubrich, Enrico Dittrich und Ralf
Hoffmann, die den Linearbeschleuniger in der Klinik für Strahlentherapie und
Radioonkologie bedient haben, sowie die Dosimetrie erstellt und für jedes Experiment
den Strahlenschutzbeauftragten gestellt haben.
Besonders bedanke ich mich bei Prof. Dr. Claus Wittekindt und Dr. Steffen Wagner für
die hervorragende Betreuung und die fortwährende Unterstützung bei Erstellung dieser
Arbeit. Ebenso bei Dr. Andrea Arenz der Klinik für Strahlentherapie und
Radioonkologie, Phillips-Universität Marburg für die Betreuung und praktischen
Hilfeleistungen, die zum Gelingen dieser Arbeit beitrugen.
Für die Korrektur dieser Arbeit danke ich Prof. Engenhart-Cabillic und Priv. Doz. Dr.
Andrea Wittig aus der Klinik für Strahlentherapie und Radioonkologie herzlich.
Maike Roth aus dem Gießener Forschungslabor trug durch ihre technischen
Hilfestellungen, ihr stetes Engagement und nicht zuletzt durch ihre sehr gute
Zusammenarbeit zum Gelingen dieser Arbeit bei. Stefanie Preising und Frank Ziemann
förderten die Anfertigung dieser Arbeit ebenfalls durch vielseitige technische
Unterstützung im Labor für Strahlentherapie am Standort Marburg.
Den Ärztinnen Shachi Jenny Sharma und Dr. Claudia Holler danke ich für die gute
Zusammenarbeit und technische Unterstützung im Forschungslabor in Gießen.
Mein großer Dank gilt meiner Familie und insbesondere meinem Mann Markus, der
mich zu jeder Zeit nach Kräften unterstützte und mir immer den nötigen Rückhalt gab.
95

ERGOLINE EXCELLENCE 800

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Medizin ABC 05/15 - Dr.König & Kollegen

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