Strahlenbiologische Charakterisierung humaner Oropharynx-Karzinom-Zelllinien Inauguraldissertation zur Erlangung des Grades eines Doktors der Humanbiologie des Fachbereichs Medizin der Justus-Liebig-Universität Gießen Vorgelegt von Mayer, Christina (geb. Genzler) aus Frankfurt am Main Gießen, 2014 Strahlenbiologische Charakterisierung humaner Oropharynx-Karzinom-Zelllinien Inauguraldissertation zur Erlangung des Grades eines Doktors der Humanbiologie des Fachbereichs Medizin der Justus-Liebig-Universität Gießen Vorgelegt von Mayer, Christina (geb. Genzler) aus Frankfurt am Main Gießen, 2014 Aus der Klinik für Hals-Nasen-Ohren-Heilkunde, Kopf-Halschirurgie und plastische Operationen der Universitätsklinikum Gießen & Marburg GmbH, Standort Gießen Prof. Dr. med. Jens Peter Klußmann, Direktor der Klinik Gutachter: Prof. Dr. med. Jens Peter Klußmann Gutachter: Prof. Dr. med. Rita Engenhart-Cabillic Datum der Disputation: 27. April 2015 Inhaltsverzeichnis 1 Einleitung ............................................................................................................. 1 1.1 Humanes Papilloma-Virus (HPV) und seine Rolle bei der Karzinogenese ...... 1 1.2 Das HPV-Genom, die Transkription viraler Gene und deren Integration in die zelluläre DNA ............................................................................................................ 3 1.3 Tumore des Kopf-Hals-Bereiches: Inzidenz, Ätiologie, Risikofaktoren ............ 7 1.3.1 Heterogenität der HNSCC und Behandlungsstrategien ................................ 8 1.4 Grundlagen und Wirkung ionisierender Strahlung ........................................... 9 1.4.1 Zelluläre Strahlenantwort und Reparaturmechanismen .............................. 10 1.4.2 Einfluss von HPV auf die zelluläre Wirkung ionisierender Strahlung ........... 12 1.5 2 Zielsetzung ................................................................................................... 13 Materialien und Methoden ................................................................................ 15 2.1 Geräte und Materialien ................................................................................. 15 2.1.1 Spezielle Geräte und Materialien am Standort Gießen ............................... 16 2.1.2 Spezielle Geräte und Materialien am Standort Marburg ............................. 17 2.2 Chemikalien und Reagenzien ....................................................................... 17 2.3 Antikörper und Enzyme ................................................................................ 19 2.4 Primer ........................................................................................................... 20 2.5 Zellkulturen ................................................................................................... 21 2.5.2 Verwendete Zelllinien ................................................................................. 21 2.5.3 Kultivierung der verwendeten Zelllinien ...................................................... 22 2.6 Methoden .................................................................................................... 23 2.6.1 HPV-PCR ................................................................................................... 24 2.6.2 Sequenzierung der HPV E6 und E7-Genregion .......................................... 26 2.6.3 Wachstumskurven und Koloniebildungseffizienz ........................................ 28 2.6.4 Bestrahlung ................................................................................................ 29 2.6.5 Klonogenes Überleben (Dosis-Effekt-Kurven) ............................................ 29 2.6.6 Durchflusszytometrie zur Zellzyklus-Analyse .............................................. 30 2.6.7 Proteinbiochemie........................................................................................ 31 2.7 RNA-Isolation ............................................................................................... 37 2.8 cDNA-Synthese ............................................................................................ 37 2.9 Quantitative real time PCR ........................................................................... 37 2.10 p53 Signaling Pathway RT-PCR Array.......................................................... 39 2.11 qPCR Auswertung ........................................................................................ 41 2.12 Statistik ......................................................................................................... 42 3 Ergebnisse ......................................................................................................... 43 3.1 HPV-Nachweis ............................................................................................. 43 i 3.2 Dosis-Effekt-Beziehung ................................................................................ 43 3.2.1 Wachstumskurven ...................................................................................... 43 3.2.2 Klonogenes Überleben ............................................................................... 44 3.3 Zellzyklusverteilung nach Bestrahlung .......................................................... 45 3.4 Proteinexpressions-Änderung nach Bestrahlung .......................................... 48 3.4.1 Proteinexpression von p16INK4A nach Bestrahlung ...................................... 48 3.4.2 Proteinexpression von Retinoblastom nach Bestrahlung ............................ 49 3.4.3 Proteinexpression von p53 und phospho p53 (Ser15) nach Bestrahlung .... 52 4 3.5 qPCR: mRNA-Expression von viralen Onkogenen E6 und E7 ...................... 54 3.6 Sequenzierung der E6 und E7-Gen-Region der HPV-positiven Zelllinien ..... 56 3.7 p53 Signaling Pathway RT-PCR Array.......................................................... 61 Diskussion ......................................................................................................... 65 4.1 Einfluss ionisierender Strahlung auf HNSCC-Tumorzelllinien ....................... 65 4.1.1 Strahlenempfindlichkeit .............................................................................. 65 4.1.2 Zellzyklus ................................................................................................... 66 4.1.3 Markerproteine bei der primären Strahlenantwort ....................................... 67 4.2 Einfluss ionisierender Strahlung auf virale Onkoproteine .............................. 70 4.3 Einfluss ionisierender Strahlung auf die p53-abhängige Genexpression ....... 72 4.4 Ausblick ........................................................................................................ 74 5 Zusammenfassung............................................................................................ 77 6 Summary............................................................................................................ 78 7 Abkürzungsverzeichnis .................................................................................... 79 8 Abbildungsverzeichnis ..................................................................................... 81 9 Tabellenverzeichnis .......................................................................................... 82 10 Literaturverzeichnis .......................................................................................... 83 11 Publikationsverzeichnis.................................................................................... 93 12 Ehrenwörtliche Erklärung ................................................................................. 94 13 Danksagung....................................................................................................... 95 ii 1 Einleitung 1.1 Humanes Papilloma-Virus (HPV) und seine Rolle bei der Karzinogenese Bereits 1974 wurden unter der Leitung von Harald zur Hausen (Zur Hausen et al. 1974) erste Experimente auf der Suche nach Krebs auslösenden Viren in Zervix-Karzinomen unternommen. 1984 wurden die ersten Virus-Typen aus Zervix-Biopsien isoliert und ihre DNA kloniert (Dürst et al. 1983). Bei diesen Viren handelt es sich um humane Papilloma-Viren (HPV). Es sind kleine, unbehüllte DNA-Viren mit einem Durchmesser von ca. 55 nm, deren Erbinformation aus ringförmig geschlossener, doppelsträngiger DNA von ungefähr 8000 Basenpaaren besteht. Heute sind mehr als 120 Subtypen der Gattung bekannt (Longworth und Laimins 2004), die entweder Basalzellen der Haut (βGruppe) oder anogenitale und orale Mukosa (α-Gruppe) infizieren. Innerhalb der αGruppe unterscheidet man zwischen nichtonkogenen oder „low-risk“-HPV Typen wie HPV-6 und -11, und onkogene oder „high-risk“-HPV Typen wie HPV16 und -18. Allerdings können nur die durch „high-risk“ HPV-Typen entstandenen Schädigungen Dysplasien und Karzinome entwickeln, die „low-risk“-Typen bilden meist Kondylome und Papillome (Zur Hausen 2002). Eine Infektion mit HPV wird einerseits mit der Anzahl der Sexualpartner in Zusammenhang gebracht (Kreimer et al. 2004), andererseits scheinen Rauchen und Alkoholkonsum eine Infektion zu begünstigen (Franceschi et al. 1999). Die Infektion mit HPV16 erfolgt in der Zervix, indem durch kleinste Läsionen der obersten Epithelschichten die Basalzellen frei zugänglich sind (Abbildung 1). Diese werden vom Virus infiziert, indem die virale DNA in die Wirtszelle eingeschleust wird und dort vorerst episomal in geringer Kopienzahl vorliegt. Auf diese Weise kann eine persistierende Infektion über mehrere Monate andauern, ohne dass Krebs entsteht. Für die Vollendung des viralen Lebenszyklus ist eine Ausdifferenzierung der infizierten Basalzellen erforderlich. Da es sich bei diesen Zellen u. a. um Stammzellen handelt, können diese zu Zelltypen der darüber liegenden Zellschichten differenzieren. Betrifft die Infektion eine solche Stammzelle, so wird gewährleistet, dass das Virus nach der Zellteilung einerseits in der Tochter-Stammzelle persistiert, andererseits als Tochterzelle in die oberen Epithelschichten abgegeben wird. Diese Schichten umfassen meist ausdifferenzierte Zellen, die sich in der G0-Phase des Zellzyklus befinden und sich daher nicht mehr teilen. In seiner Eigenschaft zur Transformation ausdifferenzierter Zellen zu proliferierenden Krebs-Zellen kann das Virus in G0-Phase arretierte Zellen in die G1- und S-Phase treiben (Münger et al. 1989a). Nach der 1 Infektion liegt die virale DNA episomal in der Wirts-Zelle vor. Die Integration in das Wirts-Genom erfolgt zufällig und ist entscheidend für die Entstehung eines Karzinoms. Bei der Entstehung eines Zervix-Karzinoms ist in über 95% der Fälle eine Assoziation mit HPV16 bzw. -18 ursächlich (van den Brule, A J et al. 1990) (Zur Hausen 1996). Seit den 80er Jahren wurden auch bei Kopf-Hals-Karzinomen onkogene oder „high-risk“HPV-Typen entdeckt (Klussmann et al. 2001). Papillomaviren des Typs 16 und 18 sind hierbei im Mittel bei bis zu 15-25% der Patienten an der Entstehung von Plattenepithelkarzinome beteiligt (Kreimer et al. 2005). Besonders betroffen sind in absteigender Reihenfolge Oropharynx, Larynx/Hypopharynx und die Mundhöhle. HPV16 A Abbildung 1: Infektion mit HPV16 in mehrschichtigem Plattenepithel der Mehrschichtiges Plattenepithel Zervix uteri und der Tonsillenkrypte Die Basalzellen des mehrschichtigen Basalzellen Plattenepithels liegen durch Läsionen Basalmembran frei und können durch HPV16 infiziert werden (A). Das weitmaschige Kryptenepithel ermöglicht dem Virus B Kryptenepithel Basalzellen Basalmembran HPV16 einen direkten Zugang zu den Basalzellen (B). Anders als bei der Zervix uteri bildet das oropharyngeale Gewebe der Seitenwand in der Tonsilla palatina so genannte Krypten Oberflächen-Vergrößerung zur aus (Abbildung 1). Diese Ausstülpungen sind durch retikuläres Plattenepithel mit Basalzellähnlicher Differenzierung gekennzeichnet. Da die Basalmembran in den Krypten porös ist, um eine direkte Passage von Lymphozyten und Antigen-präsentierenden Zellen zu ermöglichen, besteht ein enger Kontakt zum lymphatischen Gewebe. Demnach können Viren direkt durch die Krypten zur Basalmembran gelangen, und die in der Zervix uteri notwendige Läsion der oberen Epithelschichten ist hier für einen Virus-Kontakt mit der Basalzellschicht und für deren Infektion wahrscheinlich nicht nötig. 2 1.2 Das HPV-Genom, die Transkription viraler Gene und deren Integration in die zelluläre DNA HPV zählen zu den DNA-Viren. Sie beinhalten durch Histone komprimierte, doppelsträngige DNA, die ungefähr 8000 Basenpaare umfasst. Die Genexpression des HPV-Genoms wird von verschiedenen Faktoren wie zellulären und viralen Transkriptionsfaktoren, unterschiedlichen Promotoren, differentiellem Spleißen oder posttranskriptionaler Stabilität viraler mRNAs beeinflusst. Das HPV-Genom kann in drei funktionelle Bereiche eingeteilt werden, die acht offene Leseraster (ORF) beinhalten (Abbildung 2). Frühe virale Proteine werden durch die „early region“ (E) kodiert. Diese umfasst die Gene E1 bis E7. Späte Proteine werden von Genen der „late region“ (L) gebildet, die die Strukturproteine L1 und L2 beinhalten. Der Bereich URR (upstream regulatory region) dient der Regulation der DNA-Replikation und Transkription, und der Bereich NCR (non coding region) bezeichnet eine kleine, hoch variable, nichtkodierende Region. Abbildung 2: HPV16-Genom Das HPV16-Genom (aus: (Smith et al. 2011) besteht aus doppelsträngiger DNA von etwa 8000 Basenpaaren Länge. Es kodiert für Gene, die früh (E = early genes, schwarz) und spät (L = late genes, blau) im HPV-Lebenszyklus exprimiert werden. Die regulatorische Region (URR = upstream regulatory region) und eine nicht-kodierende Region (NCR = non coding region) sind in grau dargestellt. Die Funktionen und Eigenschaften der Virusproteine werden im Folgenden für HPV16 beschrieben, da nur dieser „high risk“-Typ im Rahmen der vorliegenden Arbeit untersucht wurde. Das E1 Protein ist u.a. für die Replikation des viralen Erbguts zuständig. Es bildet Hexamere aus, die durch das E2-Protein an Virus-DNA-Sequenzen (E1 binding site) binden (Frattini und Laimins 1994), und durch seine ATP-abhängige Helikase-Aktivität die DNA-Synthese vorantreibt (Yang et al. 1993). Weiterhin rekrutiert das E1-Protein zelluläre Proteine wie die DNA-Polymerase α (Bonne-Andrea et al. 1995). 3 Das E2-Protein bildet homodimere Komplexe, die sich an vier E2-spezifische DNASequenzen innerhalb der Kontroll-Region des Virusgenoms binden (Massimi et al. 1999; Androphy et al. 1987). In seiner Funktion als Haupt-Regulator der viralen Genexpression und DNA-Replikation kann E2 die Transkription sowohl aktivieren als auch inhibieren, Mutationen im E2-Gen gehen mit der Immortalisierung humaner Zellen einher (Romanczuk und Howley 1992). Das virale E4-Protein wird zwar zeitlich später als die anderen „early genes“ transkribiert, liegt dagegen mengenmäßig am meisten vor. Durch eine Überlappung mit dem E2-Gen wird es von einem anderen Leserahmen transkribiert, und bildet nach Transformation ein E1-E4-Fusionsprotein. Dieses interagiert mit Zytoskelett-Proteinen in ausdifferenzierten Epithelzellen, hat unterstützende Funktion bei Assemblierung und Freisetzung der Viruspartikel (Roberts et al. 1994; Roberts et al. 1997). Das E5-Gen kodiert für ein Protein, das durch seine hydrophobe Eigenschaft in intrazellulären Membranen und in der Plasmamembran detektiert wird und dort mit wichtigen Wachstumsrezeptoren wie EGF- (epidermal growth factor) oder PDGFRezeptor (platelet derived growth factor) interagiert (DiMaio und Mattoon 2001). Über die Assoziation mit Membran-gebundenen ATPasen ist das E5-Protein an der zellulären Transformation beteiligt (Conrad et al. 1993). Eine wichtige Funktion des E6-Proteins ist die Inaktivierung des zellulären Tumorsuppressors p53 über Ubiquitin-vermittelte Degradation (Scheffner et al. 1992, 1992; Scheffner et al. 1990; Scheffner et al. 1992), indem es die zelluläre ProteinLigase E6-AP (E6 associated protein) rekrutiert (Huibregtse et al. 1991; Talis et al. 1998). Allerdings genügt bereits die Bindung von E6 an p53, um dessen transkriptionelle Eigenschaft zu inhibieren (Lechner et al. 1992; Thomas et al. 1999). Außerdem hat das E6-Protein inhibitorische Wirkung auf die Apoptose, den ZellzyklusArrest nach DNA-Schaden, und es induziert die Expression und Aktivität der Telomerase (Oh et al. 2001; Yuan et al. 2012). Weiterhin gibt es Hinweise darauf, dass die Onkoproteine E6 und E7 genomische Instabilität bewirken (Zur Hausen 1996; White et al. 1994; Korzeniewski et al. 2011), und die effiziente Immortalisierung humaner Keratinozyten bewirkten (Münger et al. 1989b). Wenngleich beide Proteine weder enzymatische noch spezifische DNA-bindende Eigenschaften besitzen, beeinflussen sie dennoch Prozesse wie Zellproliferation, Apoptose und Expression EMT-induzierender Gene (Hellner et al. 2009). 4 Das E7-Protein bindet an das Tumorsuppressorprotein Retinoblastom (Rb), welches im hyperphosphorylierten Zustand mit dem Transkriptionsfaktor E2F verbunden ist (Münger et al. 1989b). Durch die Bindung von E7 an Rb wird E2F freigesetzt und treibt seinerseits die DNA-Synthese von Proliferations-fördernden Genen an, wie z. B. die Cycline A und E (Dyson 1998; Zerfass et al. 1995). Das E7-Onkoprotein inaktiviert außerdem den Cyclin-abhängigen Kinase-Inhibitor p21 (CDKN1A) (Funk et al. 1997) und führt durch die Inhibierung von Rb zur Akkumulation des Tumorsuppressors p16INK4A (Sano et al. 1998). Dieses Protein wird als klinischer Marker in Kombination mit dem Nachweis von HPV-DNA für eine aktive HPV-Infektion herangezogen (Klussmann et al. 2003). Die Gene L1 und L2 werden später als die „early genes“ transkribiert, da sie hauptsächlich in den äußeren Epithelschichten exprimiert werden. Sie kodieren für Kapsidproteine, die zusammengesetzt das ikosaedrische Kapsid bilden, in das das virale Genom durch Interaktion mit L2 eingeschlossen wird (Zhou et al. 1994). Ein wesentlicher Schritt zur Karzinogenese HPV-assoziierter Basalzellen der Zervix ist die Integration des viralen Erbguts in das Wirts-Genom. Dieser Prozess führt zur Öffnung der ringförmigen Virus-DNA in der E2-ORF Region und hat zur Folge, dass benachbarte Regionen deletiert werden (Olthof et al. 2012): Die Gene E4, E5 und teilweise E2 und L2 (Abbildung 3). 5 E5 L1 E4 E2 HPV16 E1 L1 L2 L2 URR E6 E7 E1 E2 Transkription E7 E6 URR Translation E6 + E7 Abbildung 3: Integration des HPV16-Genoms Bei der Integration des HPV16-Genoms wird die Ringstruktur geöffnet und in die zelluläre DNA eingebaut. Dieser Prozess führt in der Regel zur Transkription beginnend von der Kontrollregion (URR) und mündet in der Expression der E6 und E7 Onkoproteine. Für das Zervix-Karzinom ist bekannt, dass das HPV16-Genom präferierte Integrationsstellen besitzt, sog. „fragile sites“, an denen eine Integration leichter möglich ist (Wentzensen et al. 2004). Diese Bereiche befinden sich in repetitiven Regionen des humanen Genoms und teilweise auch an Orten mit Krebs-assoziierten Genen (Li et al. 2013). Das Ereignis der Integration hat den Effekt, dass die Gene E6 und E7 verstärkt gebildet werden (Romanczuk und Howley 1992), was dazu führt, dass Chromosomen und Zentrosomen-Alterationen angehäuft werden (White et al. 1994). In Tonsillen-Plattenepithel-Karzinomen wurde die E6- und E7-Überexpression ebenfalls mit der Integration von HPV-DNA in das Wirtsgenom in Verbindung gebracht (Klussmann et al. 2001; Andl et al. 1998; Hafkamp et al. 2008; Wiest et al. 2002). Laut einer aktuellen Studie wurde bei den HPV-positiv getesteten Tonsillen-Karzinomen jedoch keine genomische Instabilität gefunden (Mooren et al. 2013). Für das HPV16-Genom wurden zahlreiche natürlich vorkommende Sequenz-Varianten beschrieben, die je nach Bevölkerungs-Region genetische Variationen enthalten (Chan et al. 1992). Im Zervix-Karzinom zeichnete sich beim Vergleich von HPV16 GenomSequenzen eine evolutionsbedingte Entwicklung von Virus-Subtyp-Linien ab (Smith et al. 2011). Weiterhin wurde gefunden, dass verschiedene HPV16-Varianten divergente biologische Aktivitäten z. B. bei der Regulation des Tumorsuppressors p53 besitzen (Stöppler et al. 1996). 6 1.3 Tumore des Kopf-Hals-Bereiches: Inzidenz, Ätiologie, Risikofaktoren Tumore im Kopf-Hals-Bereich bezeichnen Malignome, die aus unterschiedlichen Regionen des Kopf-Hals-Bereiches hervorgehen. Dieser Bereich ist in fünf Regionen eingeteilt: Mundhöhle, Nasopharynx (Nasenrachenraum), Oropharynx (Mundrachenraum), Hypopharynx (Schlundrachenraum) und Larynx (Kehlkopf). Der Oropharynx wird in Seitenwand (Tonsillen) Vorderwand (Zungengrund, Vallecula, linguale Epiglottis) und Dach (Weichgaumen und Uvula) unterteilt. In über 95% der Fälle handelt es sich bei den Kopf-Hals-Tumoren um Plattenepithelkarzinome (head and neck squamous cell carcinoma, HNSCC), die weltweit an sechster Stelle der Häufigkeit der Tumorerkrankungen stehen (Ferlay et al. 2010; Kamangar et al. 2006). Jährlich erkranken ca. 650.000 Menschen neu an HNSCC, und etwa die Hälfte der Patienten stirbt auch daran (Parkin et al. 2005). Über eine längere Zeitspanne betrachtet wird jedoch ein Wandel von Inzidenz- und Mortalitätsraten deutlich (Wittekindt et al. 2012), sodass Trends zur Prognose von Häufigkeiten sowohl von der Ab- bzw. Zunahme von Risikofaktoren, als auch den Inzidenzien einzelner Sublokalisationen abhängig sind (Husmann 2010). Krebsneuerkrankungen von Rachen und Mundhöhle lagen im internationalen Vergleich im Jahr 2006 laut einer Studie des Robert-Koch-Institutes bei den Männern bei 16,4/100.000 und bei den Frauen bei 5,2/100.000. Frauen sind insgesamt deutlich seltener betroffen. Dementsprechend waren auch die ermittelten Mortalitätsraten dieser Gruppe geringer. Das Alter der Patienten scheint ebenfalls eine Rolle zu spielen: Zwischen 40 und 60 Jahren erkranken vermehrt Männer an Mund- und Rachentumoren (Chaturvedi et al. 2008). Zwar wird allgemein ein Rückgang der Inzidenzen im Kopf-Hals-Bereich registriert, allerdings nicht bei allen Sublokalisationen. So wurde beispielsweise 2007 eine erhöhte Inzidenz bei Mundhöhlen- und Oropharynx-Karzinomen bei jungen Erwachsenen festgestellt (Shiboski et al. 2005), und in Australien (Hocking et al. 2011), Dänemark (Blomberg et al. 2011), Kanada (Auluck et al. 2010), USA (Chaturvedi et al. 2008), Großbritannien (Conway et al. 2006), Schweden (Hammarstedt et al. 2006), Niederlande (Braakhuis, Boudewijn J M et al. 2009) wurden vermehrt OropharynxKarzinome diagnostiziert. Insgesamt sind hohe Inzidenz-Raten in Regionen mit hohem Tabak- und AlkoholKonsum berichtet (Parkin und Bray 2006); Chaturvedi et al. 2008), und die Kombination beider Substanzen scheint sich additiv auszuwirken (Pai und Westra 7 2009, 2009; Franceschi et al. 1999). Dagegen publizierten Llewellyn et al. (2003) eine Studie, in der 25% der Patienten mit HNSCC-Tumoren angegeben, nie geraucht oder getrunken zu haben. Da diese Patienten zudem jünger als 45 Jahre waren, scheinen weitere exogene Risikofaktoren für die Entwicklung von Tumoren des Kopf-HalsBereichs zu existieren. Als mehr oder weniger gut anerkannt gelten übermäßige UVExposition, Ernährung, Mundhygiene, Exposition mit karzinogenen Substanzen (z. B. Asbest) und Infektionen. Eine Infektion mit HPV gilt als ursächlich für das Auftreten vermehrter Krebserkrankungen im Oropharynx (Andl et al. 1998; Gillison et al. 2000; Hammarstedt et al. 2006; Wiest et al. 2002; Zur Hausen 1996). In einer gepoolten Analyse von Fall-Kontroll-Studien wurde verändertes Sexualverhalten als Risikofaktor oraler HPV-Infektionen identifiziert (Heck et al. 2010). 1.3.1 Heterogenität der HNSCC und Behandlungsstrategien Die überwiegende Mehrheit der Kopf-Hals-Tumore stellt HNSCC dar, weshalb erwartungsgemäß ein homogenes Krankheitsbild vorliegen müsste. Tatsächlich bewirkt der Einfluss und das Zusammenspiel unterschiedlicher exogener (z. B. Alkohol und Nikotin) und endogener Faktoren (z. B. genomische Instabilität, onkogene Virusinfektion) eine Heterogenität unter den Plattenepithelkarzinomen. So haben Patienten mit HPV-positiven Tumoren zwar eine bessere Prognose und ein besseres Gesamt-Überleben (Ang et al. 2010; Hafkamp et al. 2008; Gillison et al. 2000; Ritchie et al. 2003), allerdings weisen sie fortgeschrittenere Tumorstadien (Andl et al. 1998) und mehr Metastasen auf (Hafkamp et al. 2008) im Vergleich zu Patienten mit HPVnegativen Tumoren. Diese Heterogenität wurde seit den 90er Jahren immer wieder bestätigt, und insbesondere bei Oropharynx-Karzinomen ein kausaler Zusammenhang mit einer HPV16-Infektion festgestellt (Ang et al. 2010; Chung und Gillison 2009; Klussmann et al. 2003; Ritchie et al. 2003; Klussmann et al. 2001; Hafkamp et al. 2008; Gillison et al. 2000). Generell werden HPV-positive Tumoren bei Patienten mit geringerem Nikotin- und Alkohol-Konsum detektiert (Andl et al. 1998; Hafkamp et al. 2008; Sinha et al. 2012), wobei diese Tumoren signifikant seltener genetische Alterationen und Amplifikationen beinhalten (Klussmann et al. 2009). Noxen-assoziierte Oropharynx-Karzinome dagegen enthalten signifikant häufiger genetische Deletionen und Amplifikationen, vor allem im Gen des Tumorsuppressors p53 (Gillison et al. 2000, 2000; Andl et al. 1998). Zusammengefasst bilden HPV- und Noxen-assoziierte Tumoren zwei verschiedene Tumorentitäten, die durch ihre große Divergenz die Therapie erschweren. 8 Eine gezielte Tumortherapie sollte demnach nur individuell und Personenbezogen erfolgen. Stattdessen basiert die gängige Behandlung von Kopf-Hals-Tumoren meist auf operativer Resektion des Tumors und ggf. Entfernung der Halslymphknoten (NeckDissection) sowie anschließender Radio- und/oder Chemotherapie. Ein Überlebensvorteil bei kompletter Resektion mit Lokalrezidivrate von nur 12-18% im Vergleich zu 80% bei nicht vollständiger Resektion ist lange bekannt (Byers et al. 1978). In zahlreichen Publikationen wurde ein besseres Überleben für Patienten mit HPV-assoziierten Tumoren beschrieben, auch unabhängig von der durchgeführten Therapie (Ang et al. 2010). Der Stellenwert der Tumorresektion ist für Patienten mit HPV-assoziiertem Oropharynx-Karzinom somit unklar, wenngleich Fischer et al. (2010) bei einer Therapie ohne Operation im Gegensatz zu Resektion plus Radiatio/Radiochemotherapie eine vergleichbare Prognose beobachteten. 1.4 Grundlagen und Wirkung ionisierender Strahlung Ionisierende Strahlung bezeichnet Teilchen- oder elektromagnetische Strahlung, deren Energie ausreicht, um beim Durchdringen von Materie Elektronen aus Atomhüllen von Molekülen herauszulösen. Die Atome werden somit sehr reaktiv und als ionisiert bezeichnet. Zu Teilchenstrahlung zählen α-Strahlung (Heliumionen) und β-Strahlung (Elektronen, Positronen), zu elektromagnetischer Strahlung Röntgen- und γ-Strahlung. Letztere entsteht auf natürliche Weise als Nebenprodukt des Kernzerfalls einer radioaktiven Substanz. In Linearbeschleunigern wird γ-Strahlung künstlich erzeugt, indem elektrisch geladene Teilchen auf gerader Strecke mit Hilfe einer angelegten Wechselspannung stark beschleunigt werden und auf eine Anode aufprallen. γStrahlung entsteht hierbei als Abbremsstrahlung von Elektronen. Als ionisierend werden generell Strahlen ab einer Energie von 124eV bezeichnet. γ-Strahlung wird dabei mit einer Wellenlänge von unter 5pm definiert, was einer Energie von über 200keV entspricht. Diejenige Energiedosis (D), die beim Durchtritt von Strahlung durch Materie von der Materie aufgenommen wird, wird als absorbierte Energie (E) pro Masseeinheit (m) mit der Einheit Gray (Gy) angegeben (Volkmer 1994): E [J] D [Gy] = m [kg] Die biologische Wirksamkeit von Strahlung ist abhängig von verschiedenen Faktoren wie Strahlungsart und Strahlungs-Dosis. Sie beeinflussen, ob und in welchem Ausmaß 9 ein Organismus einen strahleninduzierten Schaden reparieren kann. Da die Strahlenempfindlichkeit von Organen und Geweben gegenüber ionisierender Strahlung verschieden ist, reagieren diejenigen Organe und Gewebe mit verstärkter Proliferation sensibler, denn durch Bestrahlung wird der Prozess der Zellteilung negativ beeinflusst. Insgesamt kann ionisierende Strahlung im lebenden Organismus direkt beim Auftreffen auf Materie, aber auch indirekt durch Radikal-Bildung nach dem Auftreffen entstehen. So können sowohl die DNA als auch Proteine geschädigt werden, wobei veränderte DNA-Sequenzen möglicherweise schwerere Folgen nach sich ziehen, vor allem wenn beide DNA-Stränge betroffen sind. Die häufigsten Veränderungen der DNA sind Basenmodifikationen (single nucleotide polymorphism, SNP) sowie Basenverlust, Einzel- und Doppelstrangbrüche. Bei Bestrahlung von 1Gy Röntgenstrahlung entstehen ca. 40 Doppelstrangbrüche, was epigenetische Modifikationen wie die Methylierung von DNA und die Phosphorylierung von Histonen hervorruft (Rogakou et al. 1998). Weiterhin können Chromosomen-Bereichen, zytogenetische Telomer-Kürzung Effekte und wie Translokation frühzeitige von Chromosomen- Kondensation erfolgen (Pernot et al. 2012). 1.4.1 Zelluläre Strahlenantwort und Reparaturmechanismen Säugetierzellen reagieren auf endogenen (z. B. Radikale) und exogenen Stress (z. B. Bestrahlung, Alkohol, Nikotin) mit der Aktivierung von Schutzmechanismen, die in erster Linie die Integrität der DNA sicherstellen. Beschädigte DNA kann von bestimmten Enzymen in den Zellen erkannt und anschließend repariert werden, wobei die Reparatur-Effizienz vom Schadensmaß abhängt. Häufen sich DNA-Schäden – vor allem Doppelstrangbrüche – an, so ist die Wahrscheinlichkeit einer korrekten DNAReparatur vermindert und es entstehen DNA-Modifikationen und -Fragmente. Zellen, die in hohem Maße beschädigte DNA enthalten, dürfen diese nicht an Tochterzellen weitergeben. Damit die Tochterzelle allerdings eine vollständige und fehlerfreie DNAKopie erhält, müssen strenge Kontrollen, sog. Checkpoints, während der Zellzyklusprogression passiert werden (Abbildung 4). 10 G2/M-PhaseCheckpoint Abbildung 4: Zellzyklus-Phasen Mitose G2-Phase Schematische M-PhaseCheckpoint Dar- stellung der ZellzyklusPhasen mit Kontrollpunkten in Säugetier- G0-Phase S-PhaseCheckpoint zellen. In der G1- Phase bereitet sich die Zelle auf die DNA- G1-Phase S-Phase Replikation vor. Wird der G1/S-PhaseCheckpoint G1/S-Phase- Checkpoint erfolgreich passiert kann die DNA in der S-Phase repliziert werden. Sobald der S-Phase-Checkpoint überwunden wurde, bereitet sich die Zelle auf die Mitose vor und leitet die G2-Phase ein. Nach dem letzten Kontrollpunkt am G2/M-Phase-Checkpoint teilt sich die Zelle. Sobald die Zellen nicht mehr proliferieren, treten sie in die G0-Phase ein. Die vier Phasen des Zellzyklus umfassen die G1-Phase, in der die DNA-Replikation vorbereitet wird, die S-Phase mit der Replikation, die G2-Phase, in der die Mitose vorbereitet wird, und die Zellteilung in der Mitose. Ausdifferenzierte und durch Kontaktinhibition nicht mehr proliferierende Zellen werden als „ruhend“ bezeichnet und verbleiben in der G0-Phase. Die Checkpoints der M-, G1/S-, S- und G2/M-Phase dienen als Kontrollpunkte. Ist die Zelle nicht bereit für den Eintritt in die nächste Phase wird ein Arrest eingeleitet, in welchem Reparatur-Enzyme die DNA-Schäden korrigieren. Ist die Reparatur erfolgreich tritt die Zelle in die nächste Phase ein. Sind die Schäden jedoch irreparabel oder fehlerhaft repariert worden, muss die – ggf. unkontrollierbare – Weitergabe des fehlerhaften Erbguts verhindert werden. Dazu kann der Prozess der zellulären Seneszenz eingeleitet werden. Im gesunden Gewebe beschreibt Seneszenz einen Vorgang der natürlichen Alterung, indem ausdifferenzierte Zellen nicht weiter proliferieren. Eine weitere Möglichkeit zur Entsorgung geschädigter Zellen ist der programmierte Zelltod (Apoptose). Bei diesem Prozess wird die DNA kontrolliert fragmentiert und die Zelloberfläche für Immunzellen wie Phagozyten angreifbar gemacht. Bei der Nekrose wird die Plasmamembran dagegen zerstört und durch austretende Zellorganellen eine inflammatorische Immunreaktion hervorgerufen. Versagen die Reparaturmechanismen 11 und die verschiedenen Schutzfunktionen, so können Mutationen und geschädigte Zellen akkumulieren. 1.4.2 Einfluss von HPV auf die zelluläre Wirkung ionisierender Strahlung Das Tumorsuppressorprotein p53 ist einer der wichtigsten Regulatoren der zellulären Strahlenantwort. Es koordiniert in der Zelle u. a. die Funktionen für Apoptose-Induktion, Zellzyklus-Arrest und Wachstumskontrolle, sowie Reparatur und Replikation der zellulären DNA. Die Zelle reagiert auf genotoxischen Stress mit der Aktivierung von p53. Dies wird hauptsächlich durch posttranslationale Modifikationen des p53-Proteins gewährleistet (Maltzman und Czyzyk 1984), wodurch deren Halbwertszeit stabilisiert wird und die Translokation vom Zytoplasma in den Zellkern erfolgen kann. Dort bindet p53 an definierten Regionen an die DNA und gewährleistet durch seine Eigenschaft als Transkriptionsfaktor die Transkription von Apoptose-Genen bzw. ProliferationsInhibitoren nach Strahleninduziertem DNA-Schaden. In Tumoren mit HPV-Assoziation wird p53 allerdings durch das virale Onkoprotein E6 inhibiert (Huibregtse et al. 1991; Lechner et al. 1992; Talis et al. 1998; Thomas et al. 1999; Werness et al. 1990; Scheffner et al. 1990). Das p53-kodierende Gen liegt in HPV-positiven Tumoren meist in der Wildtyp-Form vor (Andl et al. 1998; Gillison et al. 2000; Hafkamp et al. 2003); Wiest et al. 2002), HPV-negative humane Tumore enthalten dagegen meist ein mutiertes p53-Gen (Dahm-Daphi 2000). In der Literatur wird die Beteiligung von HPV und p53 an der Strahlensensitivität HPVpositiver Zellen kontrovers diskutiert. Man vermutet einerseits einen Zusammenhang zwischen der p53-Aktivierung und der Strahlensensitivität HPV-assoziierter Zellen (Gupta et al. 2009; Kimple et al. 2013). Andererseits zeigten in vitro Experimente, dass HPV-assoziierte Zellen eine p53-unabhängige Strahlensensitivität besitzen (Patel et al. 2000), wobei Nagel et al. (2013) und Spanos et al. (2009) beim Vergleich HPVpositiver Zelllinien mit HPV-negativen keine erhöhte Strahlensensitivität bei HPVpositiven Zelllinien detektierten. Ein weiterer wichtiger Tumorsuppressor ist das Retinoblastomprotein (Rb). Die Hauptfunktion dieses Proteins liegt in der Freisetzung bzw. Bindung des Transkriptionsfaktors E2F. Im Laufe des Zellzyklus wird Rb in mehreren Schritten durch Cyclin-abhängige Kinasen phosphoryliert (Buchkovich et al. 1989). Im hypophosphorylierten Zustand ist es mit E2F verbunden, in hyperphosphorylierter Form wird E2F freigesetzt und gelangt seinerseits in den Kern, wo es die Transkription 12 der S-Phase-Gene einleitet. Nach UV-induziertem DNA-Schaden wurde in humanen Melanozyten ein verlängerter G1-Phase-Arrest festgestellt, offenbar bedingt durch eine inhibierte Rb-Phosphorylierung (Loignon und Drobetsky 2002; Medrano et al. 1995). Andererseits fanden Loignon und Drobetsky (2002), dass abhängig von der Strahlungsart der Rb-abhängige G1-Arrest unterschiedlich beeinflusst wird. Es ist bekannt, dass das virale Onkoprotein E7 das Rb-Protein bindet und es für den Abbau markiert (Dyson 1998; Münger et al. 2001; Boyer et al. 1996). Slebos et al. (1994) fanden, dass E7-exprimierende Zellen nach Exposition mit Gamma-Strahlung keinen G1-Arrest vollzogen, und Lindel et al. (2012) konnten verminderte Rb-Mengen nach Exposition mit 2 und 7Gy Gamma-Strahlung feststellen, die gleichzeitig mit einer erhöhten Strahlensensitivität der Zellen korrelierte. Ein weiterer wichtiger Tumorsuppressor ist der Cyclin-abhängige Kinase-Inhibitor p16INK4A. Er verhindert die Phosphorylierung von Rb und hält so den Zellzyklus an. Das p16-Protein bedarf allerdings der Regulation durch ein intaktes Rb-Protein, weshalb in HPV-assoziierten Zellen mit E7-abhängiger Rb-Degradation p16 überexprimiert wird (Sano et al. 1998). Das p16 Protein gilt so zusammen mit dem Nachweis der HPVDNA als klinischer Marker einer aktiven HPV-Infektion im Kopf-Hals-Bereich (Klussmann et al. 2003). 1.5 Zielsetzung Trotz der distinkten Entitäten HPV- und Noxen-assoziierter HNSCC erfolgt die Therapie bei den meisten HNSCC-Tumoren mittels radikaler Resektion und anschließender Radio- und/oder Chemotherapie. Klinische Hinweise darauf, ob eine alleinige Radiotherapie oder Radiochemotherapie den gleichen Erfolg wie eine Resektion gefolgt von adjuvanter Radio-/ Radio-Chemotherapie bei HPV-assoziierten Tumoren bringen würde, existieren nicht und es gibt nur wenige experimentelle Studien hierzu. Daher sollte anhand von in vitro Experimenten an Zellkulturen untersucht werden, ob HPV-positive Tumorzelllinien im Vergleich zu HPV-negativen durch alleinige Bestrahlung effektiv behandelt werden können und welche molekularen Veränderungen durch eine Bestrahlung hervorgerufen werden. Zunächst sollte eine strahlenbiologische Charakterisierung der verwendeten Zelllinien erfolgen. Dafür sollte die Strahlensensitivität gegenüber ionisierender Strahlung determiniert werden, sowie ihre Auswirkung auf die Zellproliferation und das Reparatur- 13 Verhalten der Zellen. Die bessere Prognose der Patienten mit HPV-assoziierten Tumoren wird durch eine verstärkte Strahlensensitivität erklärt, die molekularen Ursachen sind allerdings unbekannt. Daher sollten molekulare Marker identifiziert werden, die in Strahlenresistenz HPV-negativen gegenüber Tumoren HPV-positiven dysreguliert Tumoren sind, eine verursachen erhöhte und einen potentiellen Angriffspunkt für eine bessere Therapie darstellen. Hierzu sollte die Expression der Gene untersucht werden, die an der zellulären Strahlenantwort beteiligt sind. Die Gen-Produkte sollten ebenfalls analysiert werden, um Unterschiede zwischen HPV-positiven und -negativen Zelllinien zu definieren. Die unterschiedliche ProteinExpression könnte Aufschluss über eine Resistenzbildung nach Bestrahlung in HPVnegativen Zelllinien geben und so molekulare „targets“ für optimierte Therapieansätze Noxen-assoziierter Tumore bringen. Die Expression der viralen Onkogene E6 und E7 ist essentiell für die Transformation epithelialer Zellen. In wie weit die Bestrahlung einen Einfluss auf die Expression der viralen Onkogene in HPV-positiven Zellen hat, ist nicht bekannt. Daher sollte die E6und E7-Expression untersucht werden, um Aufschluss über die transkriptionelle Regulation nach Bestrahlung zu erlangen. Eine veränderte, strahleninduzierte Genexpression könnte Hinweise zur Erklärung des besseren Gesamtüberlebens HPVpositiver Tumorpatienten liefern. Dies könnte ausschlaggebend für eine zu verändernde Therapiemodalität bei HPV-positiven Plattenepithelkarzinomen des Oropharynx sein. 14 2 Materialien und Methoden 2.1 Geräte und Materialien In der Arbeit wurden die folgenden Laborgeräte und Materialien verwendet: Geräte Hersteller Neubauer improved Zählkammer Waagen: Hartenstein PCB Kern & ABJ Deutschland Sohn GmbH, Balingen, Magnetrührer RCT Basic IKA Labortechnik, Staufen pH Meter HI 2211 pH/ORP Meter Hanna Instruments, Kehl am Rhein Wärmeschrank Heratherm Thermo Fisher Scientific, Langenselbold VWR International GmbH, Darmstadt; Schüttler NeoLab, Heidelberg Mixing Block MB-102 Bioer Technology, China Vortex Mixer NeoLab, Heidelberg Vortex LabDancer VWR International GmbH, Darmstadt Wasserbad Aqualine AL2 Lauda GmbH & Co KG, Königshofen Materialien Hersteller Biosphere® Filterspitze farblos Sarstedt, Nümbrecht Filterpapier Rotilabo-Blotting Papier, Roth, Karlsruhe Imaging Chamber 8 microscope slide bottom (8 Kammern à 0,88cm²) Nitrocellulosemembran: PAA, Pasching, Österreich Protran Whatman GmbH, Dassel Nitrocellulose Transfer Membran Pasteur-Pipetten150mm, 230mm Reaktionsgefäße VWR International GmbH, Darmstadt 1,5ml, 2ml Eppendorf, Hamburg 15ml, 50ml Sarstedt, Nümbrecht Serologische Pipetten: 1ml, 5ml, 10ml, Greiner Bio-One GmbH, 25ml Frickenhausen; Sarstedt, Nümbrecht 3,5cm, Zellkulturgefäße 6cm, 10cm Durchmesser 6-, 12-, 24-, 96-well Zellschaber 16cm, 23cm Sarstedt, Nümbrecht Sarstedt, Nümbrecht Sarstedt, Nümbrecht 15 2.1.1 Spezielle Geräte und Materialien am Standort Gießen Am Standort Gießen wurden folgende spezielle Geräte und Materialien verwendet: Geräte und Materialien Hersteller Bioanalyzer 2100 Agilent Technologies, Waldbronn ChemiDoc XRS System incl. Software ImageLab Version 3.0 BioRad, Dreieich Glaspipette: Hamilton Hamilton Company, Nevada, USA Inkubator Heracell 240i Thermo Scientific, Waltham, USA Lichtmikroskop DMI 3000B Leica, Solms Nanodrop 2000c Thermo Fisher Scientific, Langenselbold Nitrucellulosemembran: Protran Whatman GmbH, Dassel Nitrocellulose Transfer Membran PCR System Thermal Cycler C1000 BioRad, Dreieich Plattenreader Nanoquant infinite M200 pro Tecan Group, Männedorf, Schweiz Applied Biosystems, Life Technologies, Real time PCR System StepOnePlus RNA 6000 Nano Chip (On- Carlsbad, CA, USA Chip- Electrophoresis), Recorder Nr. 5067-1511 RNA 6000 Nano Reagents Part 1 Spannungsquelle für Kammer Power Pac Basic, Power Pac HC Trans-Blot Semi-Dry Agilent Technologies, Waldbronn Agilent Technologies, Waldbronn BioRad, Dreieich BioRad, Dreieich Ultraschallgerät Vial Tweeter mit UIS250L Hielscher Ultrasonics GmbH, Teltow Prozessor Western Blot System Mini Protean Tetra System (Glasplatten klein: 10,1 x 7,3 cm) Western Blot Protean 2 Cell (Glasplatten groß: 16x16cm) BioRad, Dreieich BioRad, Dreieich Eppendorf Centrifuge 5810R Eppendorf, Hamburg Zentrifugen: Mini plate spinner MPS1000 Labnet, New Jersey, USA Heraeus Pico 17 Thermo Scientific, Waltham, USA Heraeus Fresco 21 Thermo Scientific, Waltham, USA 16 2.1.2 Spezielle Geräte und Materialien am Standort Marburg Am Standort Marburg wurden folgende spezielle Geräte und Materialien verwendet: Geräte und Materialien Durchflusszytometer Gelkammer Hersteller LSR 2 Flow Cytometer BD Bioscience PerfectBlue™ peqlab Doppelgelsystem Twin ExW S GmbH, Erlangen HERACell Heraeus Holding GmbH, Inkubatoren Hanau Kamera INCO2 153 Memmert, Schwabach Hamamatsu Orca-03G Nikon, Japan Linearbeschleuniger in Elekta der Klinik Strahlentherapie Technologies Supernova, Fokus- Elekta, Stockholm, für Objekt-Abstand (FSD): 100cm. Schweden und Bestrahlt wurde bei 6 MeV mit Radioonkologie einer Dosisleistung von 4Gy/min. Mikroskop Motorised research Olympus, Hamburg microscope IX81 Photometer Smart Spec Plus Plattenreader Mithras LB BioRad, Dreieich 940 Microplate Berthold Reader Röntgenröhre Filter XRad320iX 0,5mm Technologies, Bad Wildbach 8: 0,5mm Kupfer Aluminium, + Precision X-ray Inc., North Fokus- Bradford, UK Objekt-Abstand (FSD): 60cm. Bestrahlt wurde bei 320kV und 10mA mit einer Dosisleistung von 1,04Gy/min. Zentrifugen Heraeus Fresco 21 Centrifuge Heraeus Holding GmbH, Megafuge 1.0R Hanau 2.2 Chemikalien und Reagenzien In der Arbeit wurden folgende Chemikalien und Reagenzien verwendet: Chemikalien/Reagenzien Acrylamid-Lösung (40 %) - Mix 37,5 : 1 für die Molekularbiologie Bezugsquelle Applichem, Darmstadt Agarose, low melt Applichem, Darmstadt AllPrep Kit QIAgen, Hilden 17 Ammoniumpersulfat (APS) Applichem, Darmstadt Pierce, BCA Protein Assay Kit Thermo Fisher Scientific, Langenselbold BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Applied Biosystems, Life Technologies, Kit Darmstadt BSA, bovine serum albumin powder, ≥98%, Essentially fatty acid free, Sigma-Aldrich, Taufkirchen essentially globulin free Chlorophorm:Isoamylalkohol (24:1) ColorPlus Prestained Protein Applichem, Darmstadt Marker, Broad Range NEB, Frankfurt am Main DNA-Ladder, 2 log (0,1-10 kbp) NEB, Frankfurt am Main DNeasy Blood&Tissue Kit QIAgen, Hilden DyeEx 2.0 Spin Kit QIAgen, Hilden Gel Loading Dye, Blue (6x) NEB, Frankfurt am Main Glycin Applichem, Darmstadt High Capacity RNA-to-cDNA Kit Life Technologies, Darmstadt Human p53 Signaling, RT2 Profiler PCR Array, Format C (PAHS-027Z) Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrate Immun-Star Western Chemiluminescence Kit (luminol/enhancer, peroxide solution) QIAgen, Hilden Millipore, Darmstadt BioRad, Dreieich Magermilchpulver Applichem, Darmstadt Midori Green Advence Biozym, Hessisch Oldendorf Natriumdodecylsulfat (SDS) Applichem, Darmstadt Paraformaldehyd Applichem, Darmstadt Phenol:Chlorophorm:Isoamylalkohol (25:24:1) Applichem, Darmstadt Ponceau S Solution Sigma-Aldrich, Taufkirchen Propidiumiodid PromoCell GmbH, Heidelberg Protease-Inhibitor-Cocktail Sigma-Aldrich, Taufkirchen RIPA-Puffer Sigma-Aldrich, Taufkirchen RNeasy Mini Kit QIAgen, Hilden RT² First Strand Kit QIAgen, Hilden SYBR Select Master Mix Applied Biosystems, Life Technologies, 18 Darmstadt SYBR Green ROX qPCR Mastermix QIAgen, Hilden 50x TAE Applichem, Darmstadt Tris Base Applichem, Darmstadt Tris HCl Applichem, Darmstadt TritonX-100 Applichem, Darmstadt Tween20 Applichem, Darmstadt Wasser, Chromasolv Plus (für HPLC) Sigma-Aldrich, Taufkirchen Hier nicht aufgeführte Chemikalien wurden von den Firmen Applichem (Darmstadt), Sigma-Aldrich (Taufkirchen), Merck (Darmstadt) oder Roth (Karlsruhe) bezogen. 2.3 Antikörper und Enzyme Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden folgende Primär-Antikörper angewandt: Antikörper β-Tubulin Klon TUB 2.1 Spezies Maus, Eingesetzte 1: 10 000 Sigma monoklonal Cyclin D1 SP4 E2F-1 p16INK4 p53 Aldrich, Taufkirchen Kaninchen, 1:500 monoklonal 2%BSA/TBST Maus, 1:1000 monokolnal BSA/TBST G175- Maus, 1:1500 405 monoklonal MTBST 7F5 Kaninchen, 1:800 monoklonal BSA/TBST KH95 Hersteller Verdünnung in DAKO, Dänemark in 2% BD Pharmingen in 5% BD Biosciences in 2% Cell Signalling Techn., NEB, Frankfurt/Main p53 Phospho DO-7 p53 (Ser15) Maus, 1:1000 in monokolnal BSA/TBST Kaninchen, 1:3000 monoklonal BSA/TBST in 2% BD Biosciences 2% Cell Signalling Techn., NEB, Frankfurt/M. Retinoblastom 4H1 Maus, 1:2000 monoklonal MTBST in 5% Cell Signalling Techn., NEB, Frankfurt/Main 19 Retinoblastom G3-245 Maus, 1:800 (aa 332- monoklonal in 2% BD Biosciences BSA/TBST 344) Des Weiteren wurden folgende Sekundär-Antikörper benutzt: Eingesetzte Antikörper Hersteller Verdünnung Anti-Hase-IgG Anti-Maus-IgG HRP- 1:1000 in 0,5% Cell konjugiert BSA/TBST HRP- 1:1000 in 0,5% Cell konjugiert BSA/TBST Signalling Techn., NEB, Frankfurt/Main Signalling Techn., NEB, Frankfurt/Main Außerdem wurden folgende Enzyme verwendet: Enzym DNase I, RNase-frei RNase A Phusion Hot Start Flex DNA Polymerase Hersteller QIAgen, Hilden Cell Signalling Techn., NEB, Frankfurt/Main 2.4 Primer Die verwendeten Primersequenzen der HPV-PCR, der HPV16 E6-E7-Sequenzierung, sowie der qPCR mit P0, E6 und E7 wurden von Dr. Steffen Wagner (Gießen) erstellt bzw. aus Literaturquellen übernommen. Alle Primer wurden von Eurofins MWG Operon, (Ebersberg) bezogen. Die Primersequenzen sind in 5‘3‘ Richtung und mit zugehöriger Schmelztemperatur in nachfolgender Tabelle angegeben: 20 Primer GP5+ Schmelztem Sequenz TTTGTTACTGTGGTAGATACTAC Quelle peratur [°C] fwd 45 GP6+ GAAAAATAAACTGTAAATCATATTC rev HPV16 AGCGACCCAGAAAGTTACCA fwd E6 GCATAAATCCCGAAAAGCAA rev de Roda Husman, A M et al. 1995 57 Wald et al. 2011 HPV16 CAGCTCAGAGGAGGAGGATG fwd E7 GCACAACCGAAGCGTAGAGT rev HPV16_E GCCAACGCCTTACATACCG fwd 6-E7-Seq CGTACCCTCTTCCCCATTG rev TCGACAATGGCAGCATCTAC fwd ATCCGTCTCCACAGACAAGG rev 57 P0 58 Steffen Wagner 57 Korrespondenz mit Dr. J. Wagner, Institut für Kardiovaskuläre Regeneration, GoetheUniversität Frankfurt/M. 2.5 Zellkulturen 2.5.2 Verwendete Zelllinien In der vorliegenden Arbeit wurden acht Plattenepithel-Karzinom-Zelllinien verwendet (Tabelle 1). Alle wachsen adhärent als Monolayer. Die HPV-negativen Zelllinien UMSCC6 und UM-SCC11b, sowie die HPV-positiven Zelllinien UM-SCC-104 und UMSCC-47 wurden von Dr. Thomas E. Carey, Universität Michigan, USA, primär kultiviert (Lin et al. 2007; Zhao et al. 2011); (Lansford et al. 1999). Die Zelllinie UT-SCC-33 (HPV-negativ) wurde von Dr. Reidar A. Grenman, Universität Turku, Finnland, etabliert (Lansford et al. 1999), und die HPV-negative Zelllinie UD-SCC-1 wurde durch Dr. Thomas Hoffmann, Universität Düsseldorf, zur Verfügung gestellt (Balló et al. 1999). Die HPV-positive Zelllinie UPCI:SCC152 wurde von Dr. Susanne M. Gollin, Universität Pittsburgh, USA, etabliert (White et al. 2007). Die HPV16-positive 93-VU-147T wurde durch Dr. Hans Joenje, VU Medical Center Amsterdam, Niederlande, zur Verfügung gestellt (Friedman et al. 2007). 21 Tabelle 1: Zelllinien-Informationen Alter und Geschlecht der Patienten, sowie detaillierte Angaben zu HPV-, p53-Status und Tumorgeweben, aus denen die verwendeten Zelllinien etabliert wurden. Zelllinie Alter / Vorbe- Ursprungs- Geschlecht handlung gewebe 64/m keine Oropharynx UD-SCC-1 HPV p53 Ref. Neg FS/Wt Balló et al. (1999) UM-SCC-6 37/m keine Zunge neg Wt Grénman et al. (1991) UM-SCC-11b 65/m Chemoth. Larynx neg C242S Lin et al. (2007) UT-SCC-33 86/w keine Mundhöhle neg R282W Lansford et al. (1999) UM-SCC-47 53/m unbekannt Mundhöhle/ HPV16 Wt Lansford et al. Zunge UM-SCC-104 56/m Radio+ Mundhöhle (1999) HPV16 Wt Tang et al. Chemoth. UPCI:SCC152 47/m Radioth. (2012) Hypopharynx HPV16 Wt White et al. (2007) 93-VU-147T 58/m keine Mundhöhle HPV16 L257R/ Steenbergen et Wt al. (1995) UD = Universität Düsseldorf; UM = Universität Michigan; UPCI = Universität Pittsburgh; UT = Universität Turku; m = männlich, w = weiblich; Wt = Wildtyp; FS = Frame-Shift-Mutation (aus: Arenz et al. 2014) 2.5.3 Kultivierung der verwendeten Zelllinien Die in dieser Arbeit verwendeten Zellen wurden in nachfolgend beschriebenem Medium mit den aufgeführten Zusätzen kultiviert. Roswell-Park-Memorial-Institute 1640 (RPMI) ohne L-Glutamine 2mM L-Glutamin 1% Nicht-essentielle Aminosäuren 0,1mg/ml Gentamicin PAA, Pasching, Österreich 10% Fötales Kälberserum (April 2011 bis Juli 2012) 10% Fötales Kälberserum (ab August 2012) Biochrom, Berlin Sofern nicht anders angegeben wurden für die Passagierung und die Versuche folgende Reagenzien verwendet: 22 1x Trypsin/EDTA PAA, Accutase Österreich 1x PBS (steril, ohne Mg, ohne Ca) Die Zellen wurden in Pasching, Inkubatoren bei 37°C mit CO2–Begasung 5% und wassergesättigter Atmosphäre in verschiedenen Zellkulturgefäßen kultiviert. Die Passagierung erfolgte alle vier bis fünf Tage unter sterilen Bedingungen, wobei die Zelldichte maßgeblich war. Ab einer Konfluenz von ca. 70-80% wurden die Zellen je nach Wachstumseigenschaften im vorgewärmten Medium verdünnt und in neue Kulturgefäße ausgesät. Zum Ablösen der Zellen wurde der Zellrasen einmal mit PBS gewaschen und daraufhin mit ca. 1ml vorgewärmtem Trypsin/EDTA pro 20cm² überschichtet (Inkubation: 5min bei 37°C). Durch seine proteolytische Eigenschaft wird Trypsin zur Spaltung von Zell-Zell- und Zell-Oberflächen-Verbindungen eingesetzt. Nach längerer Inkubationszeit kann die Substanz allerdings einen toxischen Effekt auf die Zellen haben, weshalb die Reaktion durch Zugabe von Medium gestoppt wird. Accutase wird in der Zellkultur ebenfalls zum Ablösen von Zellen eingesetzt, wirkt jedoch auch bei längerer Inkubation nicht toxisch. Zum Ablösen der Zellen mit Accutase wurde ca. 1ml pro 20cm² verwendet und die Zellen anschließend bei 37°C inkubiert. Die Zellsuspension wurde in ein 15ml-Reaktionsgefäß überführt, für 4min bei 1200 U/min zentrifugiert und der Überstand verworfen. Das Zellpellet wurde in Medium durch mehrmaliges auf- und abpipettieren vorsichtig resuspendiert und die Zellen vereinzelt. Für die jeweiligen Versuche wurde die Zellzahl der Suspension mit Hilfe einer Neubauer Zählkammer bestimmt und die Zellsuspension entsprechend den Rahmen einer Versuchsbedingungen auf Kulturgefäße verteilt. 2.6 Methoden Die nachfolgend beschriebenen Daten wurden im Forschungskooperation zwischen der Klinik für Hals-Nasen-Ohrenheilkunde, JustusLiebig-Universität Gießen und der Klinik für Strahlentherapie und Radioonkologie, Phillips-Universität Marburg erhoben. Die Experimente zur Erstellung der WachstumsKurven (s. Abschnitt 2.6.3 und Tabelle 2) wurden Frau Roth und den Doktoranden Frank Ziemann und Christina Mayer gemeinsam durchgeführt. Die Versuche zur Plattierungseffizienz als Vorversuch für die Dosis-Effekt-Kurven (s. Abschnitt 2.6.5 und Abbildung 6) wurden von Andrea Arenz, Maike Roth und den Doktoranden gemeinsam erstellt. Die Experimente zum klonogenen Überleben der Zelllinien wurden 23 schwerpunktmäßig von Frank Ziemann und Andrea Arenz geplant, generiert und ausgewertet. Bei der Erstellung der Dosis-Effekt-Kurven entfiel der größere Anteil auf Frank Ziemann und Andrea Arenz, Maike Roth und Christina Mayer arbeiteten bei einigen Versuchen mit. Die Abbildung 6 wurde von Frank Ziemann erstellt und zur Verfügung gestellt. Die durchflusszytometrischen Messungen für die Zellzyklus-Analysen (s. Abschnitt 2.6.6 und Abbildung 7) wurden von Andrea Arenz geplant, durchgeführt und ausgewertet, wobei die Doktoranden bei einzelnen Zeitpunkten die Zellen ausgesät und geerntet haben. Die Rohdaten der Abbildung 8 und Abbildung 9 sind schwerpunktmäßig von Andrea Arenz generiert und zur Verfügung gestellt worden. Die Experimente zur Analyse der Gen-Expression (qPCR) sowie die Western Blot Analysen wurden im HNO-Forschungslabor in Gießen durchgeführt. Ein Teil der in dieser Arbeit dargestellten Daten ist in Arenz et al. 2014 bereits publiziert. 2.6.1 HPV-PCR Der in der Literatur angegebene HPV-Status der verwendeten Zelllinien wurde experimentell mit Hilfe der Primer GP5+ und GP6+ überprüft. Diese amplifizieren in einer PCR-Reaktion die DNA in der L1-Region im HPV16-Genom, sowie in anderen HPV-Typen, und bilden ein Produkt von 141 Basenpaaren. Zur Untersuchung des HPV-Status wurden die Zellen geerntet und je ca. 50 000 Zellen in PBS verdünnt. Die Suspension wurde 8 min bei 95°C denaturiert und anschließend am Vial Tweeter sonifiziert (Cycle 0,5 50%). Anschließend wurden 1,5µl der Suspension für die PCRReaktion weiterverwendet. Für die Herstellung eines Mastermix wurden Phusion® Hot Start II High-Fidelity DNA Polymerase mit zugehörigem 5x Puffer, dNTP Set und Wasser (Chromasolv Plus) verwendet. Der Mastermix setzt sich für ein StandardReaktionsvolumen wie folgt zusammen, für mehrere Reaktionen erfolgt eine entsprechende Anpassung der Volumen: 24 Reagenz Menge für eine Reaktion [µl] Wasser, Chromosolv Plus 8,1 5x Phusion Puffer 4 dNTP Mix 10mM 0,4 Primer GP5+ (10pM/µl) 0,4 Primer GP6+ (10pM/µl) 0,4 Phusion Hot Start II Polymerase 0,2 Zell-PBS-Suspension 1,5 Gesamtvolumen 15 In jedem Versuchsansatz wurden eine Negativ-Kontrolle (mit Wasser anstatt der DNAProbe), sowie eine Positiv-Kontrolle (mit DNA einer bereits HPV-positiv getesteten Zelllinie) angesetzt. Alle Reagenzien wurden in entsprechende Reaktionsgefäße pipettiert und im PCR-Cycler mit folgendem Programm prozessiert: Schritt Temperatur [°C] Zeit Anzahl Zyklen Initiale Denaturierung 98 45 sec 1 Denaturierung 98 12 sec 40 Primer-Hybridisierung 45 40 sec 40 Elongation 72 15 sec 40 Finale Elongation 72 4 min 1 Abkühlen 8 ∞ - Die PCR-Proben wurden anschließend gelelektrophoretisch ihrer Größe entsprechend aufgetrennt. Hierzu wurden 10%ige Polyacrylamid-Gele verwendet, die nach der folgenden Zusamensetzung angefertigt wurden: Reagenz Menge für ein Gel [ml] 50x TAE 0,4 Acrylamid-Lösung (40%) 5 TEMED 0,016 6% APS 0,160 ddH2O 14,4 Gesamtvolumen 20 Von den PCR-Proben wurden 10µl mit 2µl 6x Gel Loading Dye Blue versetzt und auf das Gel aufgetragen. Zur Größenbestimmung der PCR-Produkte wurden 4µl DNAMarker (Low Molecular Weight DNA Ladder) in eine Gelspur gegeben. Die 25 Elektrophorese erfolgte bei 150 Volt konstant für 60min in 1x TAE Laufpuffer. Anschließend wurde das Gel für 30min in Midori-Green-Lösung inkubiert, kurz (510min) in Wasser gewaschen und unter UV-Licht dokumentiert. 2.6.2 Sequenzierung der HPV E6 und E7-Genregion Zur Überprüfung der Sequenz der viralen Onkogene E6 und E7 wurde die entsprechende virale Genregion einer Sequenzierung unterzogen. Dazu erfolgte eine DNA-Gewinnung mittels DNeasy Blood&Tissue Kit gemäß Herstellerprotokoll. Die DNA-Konzentration wurde mittels Nanodrop bestimmt und 50ng der isolierten DNA für die PCR-Reaktion verwendet. Folgende Reagenzien wurden für den Mastermix eingesetzt: Reagenz Menge für eine Reaktion [µl] Wasser, Chromosolv Plus 5,95 5x Phusion Puffer 3 dNTP Mix 10mM 0,3 Primer HPV16_E6E7_seq_fwd (10pM/µl) 0,3 Primer HPV16_E6E7_seq_rev (10pM/µl) 0,3 Phusion Hot Start II Polymerase 0,147 Chromosomale DNA [50ng] 5 Gesamtvolumen 15 Wie in Abschnitt 2.6.1 wurden in jedem Versuchsansatz eine Negativ- und eine PositivKontrolle angesetzt. Das Programm für die PCR-Reaktion enthielt folgende Schritte: Schritt Temperatur [°C] Zeit Anzahl Zyklen Initiale Denaturierung 98 30 sec 1 Denaturierung 98 12 sec Primer-Hybridisierung 58 40 sec Elongation 72 30 sec Finale Elongation 72 4 min 1 Kühlung 8 ∞ - 40 Um die Fragmentlänge der PCR-Produkte zu ermitteln wurden Aliquots von 10µl der Proben gelelektrophoretisch ihrer Größe entsprechend auf einem 1%igen Agarose-Gel in 1x TAE aufgetrennt. Die Proben wurden mit 6x Gel Loading Dye Blue versetzt und auf das Gel aufgetragen. Als Größenstandard dienten 4µl 2log DNA-Ladder. Als Laufpuffer wurde 1x TAE verwendet. Die Elektrophorese erfolgte bei 65mA 1x TAE 26 Laufpuffer. Anschließend wurde das Gel für 30min in Midori-Green-Lösung inkubiert, kurz (5-10min) in Wasser gewaschen und unter UV-Licht dokumentiert. Diejenigen PCR-Produkte, die die gewünschte Größe von 1000 Basenpaaren hatten, wurden über organische Extraktion wie in folgendem Protokoll beschrieben aufgereinigt: Zu jeder Probe wurden 15µl 3M Natrium-Acetat gegeben und das Gemisch auf 150µl mit ddH2O aufgefüllt. Anschließend erfolgte die Zugabe von 150µl Phenol:Chlorophorm:Isoamylalkohol (25:24:1). Die Probe wurde geschüttelt und bei maximaler Geschwindigkeit für 10min bei Raumtemperatur zentrifugiert. Der obere wässrige Phase wurde abgenommen und mit 150µl Chlorophorm:Isoamylalkohol (24:1) versetzt. Nach erneutem Schütteln wurde für 10min bei maximaler Geschwindigkeit und Raumtemperatur zentrifugiert und der Überstand mit enthaltener DNA in ein neues Reaktionsgefäß überführt. Nun wurde je das 2,5x Volumen an 100% Ethanol zugegeben, die Probe gemischt und für 30min bei Raumtemperatur und anschließend für mindestens 30min bei -20°C inkubiert. Durch Zentrifugation bei maximaler Geschwindigkeit für 10min bei Raumtemperatur wurde die gefällte DNA sedimentiert, und jeglicher Überstand entfernt. Das Pellet wurde Luftgetrocknet, die DNA in 20µl ddH20 gelöst und ihre Konzentration am Nanodrop gemessen. Die DNA-Sequenzierung erfolgte daraufhin mit Hilfe des BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kits. Es beinhaltet einen Reaction PreMix, der eine Polymerase und Nukleotide mit und ohne Fluorochrom-Kopplung enthält. Nach dem Prinzip der Basenspezifischen Kettenabbruch-Reaktion kann die Polymerase nach Einbau eines markierten Nukleotids an den komplementären Strang kein weiteres Nukleotid einbauen, weshalb DNA-Fragmente mit Fluorochrom-gekoppelten Nukleotid-Enden entstehen. Die Reaktionen wurden separat für beide Primer angesetzt, da die Sequenzierungs-Reaktion nur in 3´-Richtung erfolgt und somit ein Gemisch aus beiden Primern die Sequenzierung in jeweils entgegengesetzte Richtung bewirken würde: Reagenz Volumen für eine Reaktion [µl] PCR-Produkt (20ng) 1-3 Primer (10pmol): HPV16_E6E7_seq_fwd bzw rev 0,75 BigDye Terminator: Sequencing Puffer (5x) 1,5 BigDye Terminator: Reaction PreMix (2,5x) 1 Wasser, Chromosolv Plus Gesamt ad 10 10 27 Das Programm für die PCR-Reaktion enthielt folgende Schritte: Anzahl Schritt Temperatur [°C] Zeit Initiale Denaturierung 96 1min Denaturierung 96 10 sec Primer-Hybridisierung 50 5 sec Elongation 60 1min 15sec Kühlung 8 ∞ Zyklen 1 25 - Um Salze und überschüssige Fluorochrome, die in der Sequenzierungs-PCR nicht an DNA-Fragmente gebunden worden sind, zu entfernen, wurden die Proben durch GelFiltration aufgereinigt. Hierfür wurde entsprechend der Herstellerangaben des DyeEx 2.0 Spin Kits die Gel-Matrix vorbereitet und die Probe darauf pipettiert. Die markierten PCR-Produkte gelangen durch die Matrix hindurch, Salze und überschüssige Moleküle verbleiben dagegen in den Gel-Poren. Nach Zentrifugation wurde das Eluat an das Institut für Pathologie des Universitätsklinikums Giesen zur Sequenzierung geschickt, wo die DNA-Moleküle elektrophoretisch entsprechend ihrer Größe aufgetrennt und die fluoreszierenden End-Nukleotide detektiert wurden. Die Ergebnisse wurden mit Hilfe der Software GeneStudio Professional v. 2.2.0.0, NCBI BLAST (National Center for Biotechnology Information, Basic Local Alignment Search Tool) und ClustalW2 analysiert und mit Referenzgenomen von HPV16-Virustypen der NCBI-Datenbank verglichen. 2.6.3 Wachstumskurven und Koloniebildungseffizienz Um Zellen strahlenbiologisch Wachstumsgeschwindigkeit Plattierungseffizienz) ermittelt charakterisieren sowie werden. die Für zu können mussten Koloniebildungseffizienz die Messung der die (sog. Wachstums- geschwindigkeit wurden die Zellen wie unter 2.5.3 beschrieben in Suspension gebracht und mit einer Dichte von 1∙104 Zellen pro cm² in 3,5cm Kulturgefäßen ausgesät. Über einen Zeitraum von 8 Tagen wurde in regelmäßigen Abständen die Zellzahl mit Hilfe einer Neubauer Zählkammer bestimmt. Am vierten Tag wurde das Medium in den Zellkulturgefäßen erneuert um keine Wachstumsstagnation aufgrund verbrauchten Mediums zu erzeugen. Die Ergebnisse der Zellzahlen pro cm² wurden grafisch in Abhängigkeit von der Inkubationszeit aufgetragen. Anhand der Steigung im exponentiellen Bereich der Wachstumskurve wurde die Wachstumsgeschwindigkeit ermittelt. 28 Die Fähigkeit zur Koloniebildung der Zelllinien wurde untersucht, indem jeweils 100, 200, 300, 400 und 500 Zellen in 6cm Kulturgefäße ausgesät wurden. Etwa 14 Tage nach der Aussaat wurde das Medium der Kulturschalen abgenommen, der Zellrasen mit 1x PBS gewaschen und für 15min mit Kristallviolett-Lösung (s.u.) fixiert und gefärbt. Die Anzahl der Kolonien mit mehr als 50 Tochterzellen wurde unter dem Mikroskop ermittelt. Das Verhältnis der gezählten Kolonien zur Menge der ausgesäten Zellen ergibt die Plattierungseffizienz (PE). 0,1% Kristallviolett Applichem, Darmstadt 10% Paraformaldehyd Applichem, Darmstadt Anzahl der Kolonien PE = Anzahl der ausgesäten Zellen 2.6.4 Bestrahlung Für die Erstellung der Dosiseffektkurven wurden die Zellen in der Klinik für Strahlentherapie und Radioonkologie am Universitätsklinikum Marburg bei Raumtemperatur an einem Linearbeschleuniger (Elekta Supernova) mit einer Dosisleistung von 4Gy/min mit Einzeldosen von 1Gy, 2Gy, 4Gy, 6Gy oder 8Gy bestrahlt. Die Beschleunigungsspannung der Photonen betrug 6 MeV. Die Bestrahlung der Zellen erfolgte als Monolayer in einem PMMA Phantom, was garantierte, dass sich das Dosismaximum im Bereich der Zellmonolayer befand. Der Gantrywinkel betrug 180°, der Fokus-Objekt-Abstand 100 cm. Die Dosis wurde mittels Absolutdosimetrie verifiziert. Für die Versuche zur RNA- und Proteinexpression wurden die Zellen als Monolayer im Biomedizinischen Forschungszentrum bei Raumtemperatur mit einer Röntgenröhre (XRad320iX) für Zellkulturexperimente mit einer Dosisleistung von 1Gy/min mit einer Einzeldosis von 6Gy bestrahlt. Die Beschleunigungsspannung betrug 320kV und der Kathodenstrom 10mA. Während der Bestrahlung wurde ein Filter aus 0,5mm Kupfer und 0,5mm Aluminium verwendet. Der Fokus-Objekt-Abstand betrug 60cm. 2.6.5 Klonogenes Überleben (Dosis-Effekt-Kurven) Das klonogene Überleben beschreibt die Fähigkeit von Einzelzellen, sich zu teilen und Kolonien von Tochterzellen zu bilden. Um den Effekt ionisierender Strahlung auf das Wachstum der verwendeten Zellen zu untersuchen wurde deren klonogenes Überleben mittels Dosis-Effekt-Analysen ermittelt. Dazu wurden exponentiell 29 wachsende Zellen in 6cm Kulturgefäße mit unterschiedlichen Dichten (200 - 24000 Zellen) ausgesät. Die initial eingesäte Zelldichte musste der individuellen Plattierungseffizienz jeder Zelllinie und dem erwarteten letalen Effekt der Bestrahlung angepasst werden. Es wurde angestrebt, ein Wachstum von ca. 50 Kolonien pro Kulturgefäß unabhängig von der Bestrahlungsdosis gewährleisten zu können. Die Zellen wurden 24h nach ihrer Aussaat mit Dosen von 1 bis 8Gy in der Klinik für Strahlentherapie am Linearbeschleuniger Elekta Supernova bestrahlt und für 14 bis 18 Tagen bei 37°C ohne Mediumwechsel inkubiert. Anschließend wurden die Zellen wie unter Abschnitt 2.6.3 beschrieben fixiert und mit 0,1% Kristallviolett angefärbt. Die Überlebensfraktion (surviving fraction, SF) wird als Quotient der Anzahl von Kolonien nach Bestrahlung zur Menge ausgesäter Zellen und der Plattierungseffizienz definiert: Anzahl der Kolonien nach Bestrahlung SF = Anzahl der ausgesäten Zellen ∙ PE Die Ergebnisse des klonogenen Zellüberlebens (survival, S) nach Bestrahlung (radiation dose, D) wurden halblogarithmisch aufgetragen und anhand des linearquadradtischen Modells gefittet (Franken, Nicolaas A P et al. 2006): S (D) / S(0) = exp (αD + βD²) 2.6.6 Durchflusszytometrie zur Zellzyklus-Analyse Durch die strahleninduzierte Schädigung der DNA wird u. a. die Reproduktion der Zellen beeinflusst. Über einen Zellzyklusarrest werden Reparatur-Maschinerien in Gang gesetzt, die die genomischen Schäden beseitigen sollen. Sind diese Schäden irreparabel oder ist die Funktion der Reparatur-Mechanismen beeinträchtigt, so werden die Zellen über den Mechanismus des programmierten Zelltods (Apoptose) gezielt abgetötet. Mit Hilfe des LSR 2 Flow Cytometers (BD Biosciences, Standort: Uniklinik Marburg) wurden Zellzyklus-Analysen durchgeführt, die die Verteilung der Zellpopulation auf die verschiedenen Phasen des Zellzyklus mit Hilfe des DNAinterkalierenden Farbstoffs Propidiumiodid untersuchten. Da sich die Fluoreszenzintensität des Propidiumiodids proportional zum DNA-Gehalt der Zelle verhält kann über eine Intensitäts-Änderung zwischen G1- (einfacher DNA-Gehalt), S(ein- bis zweifacher DNA-Gehalt) und G2-Phase (zweifacher DNA-Gehalt) unterschieden werden. DNA-haltige Zellfragmente, wie sie etwa bei Apoptose entstehen, werden vor der G1-Phase gemessen (sog. subG1-Phase). Polyploide Zellen werden zwar auch erfasst, jedoch ist keine Unterscheidung zwischen „normalen“ 30 G2-arrettierten Zelle (DNA-Gehalt: 4N) und polyploiden G1-arrettierten Zellen (DNAGehalt: 2x 2N = 4N) möglich. Methodisch wurden Zellen in 6cm Kulturgefäße mit unterschiedlichen Dichten ausgesät und während ihrer exponentiellen Wachstumsphase mit 2 oder 6Gy bestrahlt. Die Zellen wurden zu definierten Zeitpunkten geerntet, wobei die im Kulturüberstand und Waschschritt befindlichen Zellen in 15ml Reaktionsgefäßen aufgefangen wurden, um zu gewährleisten, dass abgeschwommene, apoptotische Zellen in die Messung eingingen. Der adhärente Zellrasen wurde mittels Accutase abgelöst (siehe 2.5.3), durch auf- und abpipettieren vereinzelt und mit eiskaltem 70%igem Ethanol fixiert. Die Suspension wurde über Nacht bei -20°C inkubiert. Vor der durchflusszytometrischen Messung wurden die Zellen abzentrifugiert, einmal mit PBS gewaschen, und schließlich mit 500µl 1xPBS und 500µl DNA-Extraktions-Puffer versetzt, der die Zellmembranen permeabilisiert: 192ml 0,2mM Na2HPO4 8ml 0,1% TritonX-100 pH 7,8 In H2O Nach Inkubation für 5min bei Raumtemperatur wurde die Suspension zentrifugiert und die Zellen in 400µl DNA-Färbe-Lösung resuspendiert: 20µg/ml Propidiumiodid PromoCell GmbH, Heidelberg 200µg RNase A (Stock: 2,5mg/ml) QIAgen, Hilden In PBS PAA, Pasching, Österreich Die Proben wurden für 30min bei Raumtemperatur unter Lichtausschluss inkubiert und anschließend der zelluläre DNA-Gehalt am LSR 2 analysiert. Pro Probe wurden mindestens 20 000 Zellen gemessen, und die Daten mittels FlowJo 7.6 Software (Tree Star Inc., San Carlos, CA, USA) von Frau Dr. Arenz ausgewertet. Die Anzahl der gemessenen Zellen wurde in Histogrammen gegen den DNA-Gehalt aufgetragen. 2.6.7 Proteinbiochemie 2.6.7.1 Protein-Isolation aus Gesamt-Zell-Extrakten Um den Effekt der Bestrahlung auf ausgewählte Proteine, die an der intrinsischen Strahlenantwort beteiligt sind, zu analysieren wurden die verwendeten Zellen in Zellkulturgefäße ausgesät und bei einer Konfluenz von 70-80% mit 6Gy bestrahlt und im Inkubator bis zur weiteren Analyse inkubiert, um externe Stressfaktoren auszuschließen und so ausschließlich den Bestrahlungseffekt untersuchen zu können. 31 Die unbestrahlte Kontrollgruppe sowie die bestrahlten Zellen wurden zum jeweiligen Zeitpunkt mittels Trypsin von dem Boden der Kulturgefäße abgelöst, die Zellzahl bestimmt und die Zellen pellettiert. Sofern nicht anders angegeben wurden alle folgenden Schritte mit gekühlten Substanzen und auf Eis durchgeführt. Zur ProteinIsolation wurde – abhängig von der Zellzahl – eine Lösung aus RIPA-Puffer und Protease-Inhibitor-Cocktail auf das Zellpellet pipettiert: 150µl RIPA-Puffer pro 5∙106 Zellen Sigma-Aldrich, Taufkirchen 15µl Protease Inhibitor Cocktail pro 150µl RIPA Sigma-Aldrich, Taufkirchen Die Zellsuspension wurde gemischt und anschließend für 10min bei maximaler Geschwindigkeit bei 4°C zentrifugiert. Der Überstand wurde abgenommen und für die Protein-Konzentrations-Bestimmung und Western Blot Analyse verwendet. Die Western Blot Analyse der Retinoblastom-Proteine erfolgte zusätzlich auch mit Zellpellets, die mit SDS-Ladepuffer (Rezept siehe Abschnitt 2.6.7.3) versetzt wurden. Die Proteine der Probe wurden anschließend für 5min bei 95°C denaturiert und je 20µl des Lysats zur Analyse eingesetzt. 2.6.7.2 Protein-Konzentrations-Messung mittels BCA-Assay Zur Bestimmung der Protein-Konzentration des Gesamtzelllysats wurde das Bicinchoninsäure (BCA) Protein Assay Kit verwendet. Diesem Kit liegt ein biochemisches Verfahren zugrunde, bei dem die Reduktion von Cu2+ zu Cu+ temperaturabhängig durch Aminosäurereste und Peptidbindungen erfolgt. Bicinchoninsäure bildet mit den reduzierten Kupferionen Chelatkomplexe, die einen Farbumschlag der Lösung herbeiführen, der bei einer Absorption von 562nm gemessen werden kann. Die in den Proben enthaltene Proteinmenge ist hierbei proportional zur gebildeten Menge der Chelatkomplexe. Die zu untersuchenden Proben wurden verdünnt und entsprechend der Herstellerangaben mit Reagent A und B versetzt. Die Protein-Konzentration der Proben wurde anhand einer Verdünnungsreihe von BSA mit bekannter Protein-Konzentration berechnet. Pierce® BCA Protein Assay Reagent A: Bicinchoninsäure Thermo-Fisher Pierce® BCA Protein Assay Reagent B: Kupfersulfat Langenselbold Scientific, 2.6.7.3 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese Proteine werden über SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-Page) ihrer Größe entsprechend aufgetrennt. Die Polyacrylamid-Matrix besteht aus quervernetzten Acrylamid- und N´N´-Methylen-Bisacrylamid-Polymeren, deren Polymerisation mit Hilfe 32 von Ammoniumersulfat-Ionen (APS) gestartet und von Tetramethylerindiamin (TEMED) katalysiert wird. In Abhängig von der eingesetzten Menge des Acrylamids entstehen engmaschigere (hohe Konzentration) Gele zur besseren Auftrennung kleinerer Proteine, oder weitmaschige Gele (geringe Konzentration) zur besseren Auftrennung größerer Proteine. In der vorliegenden Arbeit wurden diskontinuierliche Gele verwendet, bestehend aus einem Sammelgel (4%) und einem Trenngel (12% oder 6%) mit jeweils unterschiedlichen Puffersystemen. Folgende Puffer wurden für die SDSPage verwendet: 10x Laemmli-Laufpuffer: 250 mM Tris Base 1x Laufpuffer als 10x Konzentrat angesetzt. 1,92 M Glycin 1% Natriumdodecylsulfat (SDS) in ddH2O 4x Sammelgelpuffer: 15,14g Tris-base (0,5M) pH 6,8 mit HCl einstellen 10ml 10%iges SDS (0,4%) in ddH2O 4x SDS-Ladepuffer: 15% Glycerin 4% Natriumdodecylsulfat (SDS) 20% β-Mercaptoethanol 25% 4x Sammelgelpuffer 4% Bromphenolblau in ddH2O 4x Trenngelpuffer: 1,5M Tris Base pH 8,8 0,4% Natriumdodecylsulfat (SDS) in ddH2O Für die Standard-SDS-Gele (Größe 10,1cm x 7,8cm x 1mm) wurden folgende Mengen eingesetzt: Trenngel (12%) Menge pro Gel Sammelgel (4%) Menge pro Gel 4x Trenngelpuffer 5 ml 4x Sammelgelpuffer 2,5ml ddH2O 8,8ml ddH2O 6,4ml 40% Acrylamid- 6ml Lösung 40% Acrylamid- 1ml Lösung 6% APS 160µl 6% APS 90µl TEMED 16µl TEMED 9µl 33 Zur besseren Protein-Banden-Auftrennung wurden längere Gelplatten verwendet (Größe 20cm x 20cm x 1mm) und 12%igen SDS-Gele wurden folgendermaßen hergestellt: Trenngel (12%) Menge pro Gel Sammelgel (4%) Menge pro Gel 4x Trenngelpuffer 10ml 4s Sammelgelpuffer 5ml ddH2O 17,6ml ddH2O 12,8ml 40% Acrylamid- 12ml Lösung 40% Acrylamid- 2ml Lösung 6% APS 320µl 6% APS 180µl TEMED 32µl TEMED 18µl Weiterhin wurden 6%igen SDS-Gele mit den größeren Gelplatten hergestellt: Trenngel (6%) Menge pro Gel Sammelgel (4%) Menge pro Gel 4x Trenngelpuffer 10ml 4s Sammelgelpuffer 5ml ddH2O 23,6ml ddH2O 12,8ml 40% Acrylamid- 6ml Lösung 40% Acrylamid- 2ml Lösung 6% APS 320µl 6% APS 180µl TEMED 32µl TEMED 18µl Der 4x Sammelgelpuffer hat einen pH-Wert von 6,8, weshalb das im LaemmliLaufpuffer enthaltene Glycin vermehrt ungeladen vorliegt und langsam zur Anode wandert. Die Chlorid-Ionen wandern dagegen schneller und agieren somit als „Leit“Ionen, wohingegen Glycin als „Folge“-Ionen fungieren. Zwischen beiden Molekülen entsteht ein Feldstärkegradient, innerhalb dessen sich die Proteine in Abhängigkeit ihrer Mobilität auf der jeweiligen Höhe ansammeln (Stapeleffekt). Der pH-Wert von 8,8 im Trenngel bewirkt, dass das niedermolekulare Glycin überwiegend geladen vorliegt und daher die Proteine im Trenngel überholt. Die Proteine werden also im Sammelgel zu einer scharfen Bande fokussiert, im Trenngel dagegen wandern sie im Wesentlichen ihrer Molekülgröße entsprechend zur Anode. Dies wird durch die Vorbehandlung der Proben mit 4x SDS-Ladepuffer ermöglicht. Das darin enthaltene βMercaptoethanol führt die Reduktion von Disulfidbrücken und unterstützt damit die Entfaltung der Proteinkomplexe durch SDS und aufkochen der Probe, sodass alle Proteine in mehr oder weniger gleichförmigen, ungefalteten Strukturen vorliegen. Gleichzeitig überdeckt das im Ladepuffer enthaltene SDS die Eigenladung der Proteine 34 und ermöglicht so die Auftrennung der denaturierten Proteine im Wesentlichen entsprechend ihrer Molekülgröße. Die zu analysierenden Proteinlösungen wurden mit 4x SDS-Ladepuffer versetzt, sodass dieser in 1-facher Endkonzentration vorlag. Anschließend wurden die Proben für 5min bei 95°C denaturiert, kurz auf Eis abgekühlt und auf ein SDS-Gel aufgetragen. Die Elektrophorese erfolgte bei den Standard-Gelen für ca. 60min bei 200V bis die Lauffront das untere Ende der Gelplatte erreichte. Bei den größeren SDS-Gelen variierten Dauer und Stromstärke, sodass sich die zu analysierenden Proteine im gewünschten Bereich des Trenngels befanden. 2.6.7.4 Western Blot Der Western Blot dient dem immunologischen Nachweis von Proteinen, die über SDSPolyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-Page) ihrer Größe entsprechend aufgetrennt wurden. Während des Western Blottings erfolgt die elektrophoretische Übertragung der aufgetrennten Proteine auf eine Transfermembran (Nitrocellulose). Die Proteine können auf der Membran anschließend direkt über Ponceau oder indirekt über Antikörper-Färbung nachgewiesen werden. Dem Transferpuffer wurde erst kurz vor Gebrauch das Methanol zugesetzt. 31,25 mM Tris Base Transferpuffer: 240 mM Glycin 10% Methanol (direkt vor Anwendung frisch zugegeben) Die Nitrozellulose-Membran für ca. 5min vor Aufbau des Blotting Sandwichs im Transferpuffer äquilibriert. Die Filterpapiere wurden ebenfalls in Transferpuffer getränkt. Die Blotkammer wurde in aufsteigender Reihenfolge aufgebaut: Anode – Filterpapier – Membran – Gel – Filterpapier – Kathode Der Transfer erfolgte 50min bei 10V konstant. Nach dem Transfer wurde die Membran kurz mit ddH2O gewaschen, die Proteine für 10min mit Ponceau-Lösung angefärbt und die Färbung im ChemiDoc detektiert. Die Auswertung der Western Blot-Banden erfolgte über densitometrische Quantifizierung mit Hilfe der Image Lab Software Version 3.0 (BioRad, Hercules, CA). Zur Normierung diente das Signal des Haushaltsgens ß-Tubulin. 2.6.7.5 Immundetektion Die auf Nitrozellulosemembranen gebundenen Proteine wurden mittels spezifischer Antikörper nachgewiesen. Die Membran wurde zunächst für 1h in Milch-TBST 35 geblockt, anschließend folgten Waschschritte mit 1x MTBST für je 5min. Eine Inkubation mit dem Protein-spezifischen Primärantikörper erfolgte in der jeweiligen Verdünnung (s. Abschnitt 2.3) entweder in 2% BSA/TBST oder in 5% MTBST. Je nach Qualität des Primärantikörpers wurde dieser entweder über Nacht bei 4°C oder für 1h bei Raumtemperatur auf der Membran belassen. Nach erneutem Waschen für 3x 5min in TBST erfolgte die Inkubation mit dem Spezies-spezifischen Sekundärantikörper, der mit einem Nachweisenzym (Horse radish peroxidase, HRP) gekoppelt ist. Über eine chemische Reaktion kann dieses Enzym das in der Substratlösung enthaltene Luminol umsetzen, wodurch ein detektierbares Chemilumineszenz-Signal entsteht. Dieses wurde mit dem ChemiDoc XRS System detektiert. Folgende Lösungen wurden verwendet: 2% BSA/TBST: 5% Milch-TBST (MTBST): 10x Tris buffered Saline (TBS): pH 7,4 2% Bovine Serum Albumin 1x TBST 1x TBST 5% Milchpulver 46 mM Tris Base 150 mM NaCl in H2O 1x TBS + Tween20 (TBST): 1x TBS 0,1% Tween20 Die Western Blot Substratlösungen wurden jeweils direkt vor Verwendung nach Herstellerangaben frisch angesetzt. 2.6.7.6 Stripping und erneute Immun-Markierung Um nacheinander unterschiedliche Proteine auf einer Membran nachweisen zu können, müssen die jeweiligen Primär- und Sekundärantikörper entfernt werden. Dafür wurde die Membran für 15min in Stripping Lösung 1 inkubiert, anschließend mit Wasser gewaschen und wiederum für 15min in Stripping Lösung 2 inkubiert. Daraufhin erfolgte eine erneute Blockierung der freien Bindestellen der Membran mit 5% MTBST für 1h bei Raumtemperatur. Anschließend wiederholt sich die Behandlung mit Primärund Sekundärantikörper wie in 2.6.7.5 beschrieben. Die Zusammensetzung der Stripping-Lösungen ist nachfolgend angegeben: 36 Stripping Lösung 1 (pH 2) Stripping Lösung 2 25mM Glycin 100mM NaOH 10% SDS 10% SDS In ddH2O In ddH2O 2.7 RNA-Isolation Für die Genexpressions-Analyse der HPV-Onkogene E6 und E7 wurden Zellpellets von HPV-positiven Zelllinien hergestellt (siehe Abschnitt 2.5.3). Aus den Pellets wurde mit Hilfe des RNeasy Mini Kits nach Angaben des Herstellers die gesamte zelluläre RNA isoliert, wobei zusätzlich ein DNase-Verdau nach Herstellerprotokoll durchgeführt wurde. Die Konzentration der isolierten RNA wurde im Nanodrop gemessen. Für die Human p53 Signaling Pathway RT2 Profiler PCR Arrays wurde die isolierte RNA zusätzlich über einen RNA 6000 Nano Chip nach dem Herstellerprotokoll auf ihre Integrität überprüft. Hierbei wird über Kapillar-Gelelektrophorese die Größenverteilung der RNA-Probe überprüft. Die sog. RNA-Integritäts-Nummer (RIN) wird aus dieser Verteilung berechnet und gibt Aufschluss über die Qualität der RNA-Präparation. Das System weist der Probe nach der Analyse einen RIN-Wert zwischen 1 und 10 zu, wobei ein RIN-Wert von 10 für eine komplett intakte und 1 für eine völlig degradierte RNA steht. Diese Skala stellt seit einigen Jahren einen international gängigen RNAQualitätsstandard dar (Pfaffl 2004). 2.8 cDNA-Synthese Für die Expressionsanalyse wurden die RNA-Moleküle unter Verwendung des Enzyms Reverse Transkriptase in cDNA, sog. komplementäre DNA (cDNA), umgeschrieben. In der vorliegenden Arbeit wurde zur cDNA-Synthese 1µg der isolierten RNA für die Verwendung des High Capacity RNA-to-cDNA Kits benutzt. Die Reaktionen wurden nach Angaben der Hersteller angesetzt und im PCR System Thermal Cycler ebenfalls nach Herstellerprotokoll durchgeführt. Für die Human p53 Signaling Pathway RT2 Profiler PCR Arrays wurden 0,5µg der isolierten Gesamt-Zell-RNA für die cDNA-Synthese eingesetzt und mit Hilfe des RT2 First Strand Kits nach Herstellerangaben die cDNA synthetisiert. 2.9 Quantitative real time PCR Zur quantitativen Genexpressions-Analyse wird die real time PCR (qPCR) angewandt. Hierbei erfolgt in jedem Zyklus der PCR-Reaktion der Einbau eines DNA37 interkalierenden Farbstoffs. Theoretisch werden pro Zyklus die eingesetzten cDNAMoleküle verdoppelt, sodass auch das Fluoreszenz-Signal exponentiell ansteigt. Dabei ist der Schwellenwert entscheidend, bei dem die Reporterfluoreszenz die Hintergrundfluoreszenz signifikant überschreitet und ein exponentieller Anstieg der Fluoreszenz messbar ist (Threshold-Cycle, CT). Gegen Ende erreicht die Reaktion mangels Primer und Nukleotide ein Plateau, bei dem die Amplifikationen nach und nach zum Stillstand kommen und die Signalstärke unverändert bleibt. Die qPCR erfolgte mit den in Abschnitt 2.4 beschriebenen Primern. Für die Reaktionsansätze wurde der DNA-interkalierende Farbstoff SYBR Green verwendet. Weiterhin wurden 5ng cDNA pro PCR-Reaktion eingesetzt. Ein Reaktions-Ansatz enthielt 15µl und umfasste: Reagenz Volumen pro Probe [µl] SYBR Select Master Mix 8,1 Wasser 3,3 Primer fwd (10 pmol) 1,3 Primer rev (10 pmol) 1,3 cDNA (5 ng/µl) 1,0 Die Reaktionsgefäße wurden im PCR-Gerät StepOne Plus platziert. Das Gerät durchlief folgende Zyklen: Schritt Temperatur [°C] Zeit Anzahl Zyklen Initiale Denaturierung 95 10 min 1 Denaturierung 95 15 sec Primer-Hybridisierung 57 60 sec Finale Elongation 95 15 sec 1 Abkühlen 70 1 min 1 Schmelzkurve 70-90 Kühlung 8 40 71 ∞ - Nach der initialen Denaturierung wurde nach jedem weiteren Zyklus die FluoreszenzÄnderung gemessen und eine Schmelzkurvenanalyse nach der finalen Elongation und Abkühlung vollzogen. Hierbei wurde während eines Temperaturanstiegs alle 0,2°C das Fluoreszenz-Signal gemessen und die Schmelztemperatur anhand einer abrupten Fluoreszenz-Minderung bestimmt. Diese entsteht durch freigesetzte Farbstoff-Moleküle beim Schmelzen der PCR-Produkte. Die Schmelztemperatur gibt Aufschluss über die 38 Spezifität des gebildeten PCR-Produkts, denn unspezifische Primerdimere schmelzen bereits bei niedrigeren Temperaturen als spezifische PCR-Produkte. Die Effizienz der qPCR wurde mit Hilfe einer Verdünnungsreihe (5ng bis 0,078ng cDNA) mit cDNA als Matrize ermittelt. Die eingesetzte cDNA-Menge wurde in einer logarithmischen Funktion gegen die CT-Werte aufgetragen und so die PCR-Effizienz nach der Formel E=10[-1/Steigung] berechnet. Als Negativ-Kontrollen wurden Reaktionsansätze mit Wasser bzw. RNA anstatt cDNA verwendet. Zur Normalisierung der qPCR Ergebnisse wurde die RNA des konstitutiv exprimierten Haushaltsgens humanes ribosomales Protein P0 verwendet. 2.10 p53 Signaling Pathway RT-PCR Array Um Komponenten von Signalwegen zu identifizieren, die einerseits durch die p53vermittelte Strahlenantwort verändert, andererseits von HPV beeinflusst sind, wurde die Genexpression von p53-abhängigen Genen mit Hilfe von Human p53 Signaling Pathway RT2 Profiler PCR Arrays analysiert. Mit einem Array können 84 Zielgene untersucht werden. Sie sind in nachfolgender Tabelle aufgelistet und kodieren für Apoptose-, Zellzyklus-, Zellwachstums-, Proliferations-, Differenzierungs-, sowie DNAReparatur-induzierte Gene, die in der Literatur bereits hinreichend beschrieben sind. Symbol APAF1 ATM ATR BAI1 Bezeichnung Apoptotic peptidase activating factor 1 Ataxia telangiectasia mutated Ataxia telangiectasia and Rad3 related Brain-specific angiogenesis inhibitor 1 Symbol JUN Jun proto-oncogene KAT2B K(lysine) acetyltransferase 2B V-Ki-ras2 Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog Myeloid cell leukemia sequence 1 (BCL2-related) Mdm2 p53 binding protein homolog (mouse) Mdm4 p53 binding protein homolog (mouse) MutL homolog 1, colon cancer, nonpolyposis type 2 (E. coli) MutS homolog 2, colon cancer, nonpolyposis type 1 (E. coli) V-myc myelocytomatosis viral oncogene homolog (avian) KRAS MCL1 BAX BCL2-associated X protein MDM2 BBC3 BCL2 binding component 3 MDM4 BCL2 B-cell CLL/lymphoma 2 MLH1 BCL2A1 BCL2-related protein A1 MSH2 BRCA1 BH3 interacting domain death agonist Baculoviral IAP repeat containing 5 Breast cancer 1, early onset BRCA2 Breast cancer 2, early onset BID BIRC5 Bezeichnung MYC MYOD1 Myogenic differentiation 1 NF1 Neurofibromin 1 Nuclear factor of kappa light polypeptide gene enhancer in B-cells 1 NFKB1 39 CCNB1 Cyclin B1 PRC1 CCNE1 Cyclin E1 PRKCA CCNG1 Cyclin G1 PTEN CCNH Cyclin H Cell division cycle 25 homolog A (S. pombe) Cell division cycle 25 homolog C (S. pombe) PTTG1 Proliferating cell nuclear antigen P53-induced death domain protein Protein phosphatase, Mg2+/Mn2+ dependent, 1D Protein regulator of cytokinesis 1 Protein kinase C, alpha Phosphatase and tensin homolog Pituitary tumor-transforming 1 RB1 Retinoblastoma 1 CDK1 Cyclin-dependent kinase 1 RPRM CDK4 Cyclin-dependent kinase 4 Cyclin-dependent kinase inhibitor 1A (p21, Cip1) Cyclin-dependent kinase inhibitor 2A (melanoma, p16, inhibits CDK4) CHK1 checkpoint homolog (S. pombe) CHK2 checkpoint homolog (S. pombe) CASP2 and RIPK1 domain containing adaptor with death domain DNA (cytosine-5-)methyltransferase 1 SESN2 E2F1 E2F transcription factor 1 TNFRSF10D E2F3 E2F transcription factor 3 TP53 EGFR Epidermal growth factor receptor TP53AIP1 EGR1 Early growth response 1 TP53BP2 EI24 Etoposide induced 2.4 mRNA TP63 ESR1 Estrogen receptor 1 Fas (TNFRSF6)-associated via death domain Fas (TNF receptor superfamily, member 6) Fas ligand (TNF superfamily, member 6) TP73 BTG2 CASP2 CASP9 CDC25A CDC25C CDKN1A CDKN2A CHEK1 CHEK2 CRADD DNMT1 FADD FAS FASLG BTG family, member 2 Caspase 2, apoptosis-related cysteine peptidase Caspase 9, apoptosis-related cysteine peptidase PCNA PIDD PPM1D RELA SIAH1 V-rel reticuloendotheliosis viral oncogene homolog A (avian) Reprimo, TP53 dependent G2 arrest mediator candidate Sestrin 2 Seven in absentia homolog 1 (Drosophila) SIRT1 Sirtuin 1 STAT1 Signal transducer and activator of transcription 1, 91kDa TADA3 Transcriptional adaptor 3 TNF Tumor necrosis factor TNFRSF10B TRAF2 Tumor necrosis factor receptor superfamily, member 10b Tumor necrosis factor receptor superfamily, member 10d, decoy with truncated death domain Tumor protein p53 Tumor protein p53 regulated apoptosis inducing protein 1 Tumor protein p53 binding protein, 2 Tumor protein p63 Tumor protein p73 TNF receptor-associated factor 2 TSC1 Tuberous sclerosis 1 WT1 Wilms tumor 1 FOXO3 Forkhead box O3 XRCC5 X-ray repair complementing defective repair in Chinese hamster cells 5 (double-strandbreak rejoining) GADD45A Growth arrest and DNA-damageinducible, alpha ACTB Actin, beta 40 GML Glycosylphosphatidylinositol anchored molecule like protein B2M HDAC1 Histone deacetylase 1 GAPDH HK2 Hexokinase 2 HPRT1 IGF1R Insulin-like receptor IL6 Interleukin 6 (interferon, beta 2) growth factor 1 Beta-2-microglobulin Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Hypoxanthine phosphoribosyltransferase 1 RPLP0 Ribosomal protein, large, P0 Für die Versuche wurden vier HPV-positive Zelllinien (VU-147T, UM-SCC47, UMSCC104 und UPCI:SCC152) und zwei HPV-negative Zelllinien (UM-SCC11b und UTSCC33) je 4h nach Bestrahlung mit 6Gy untersucht. Nach RNA-Isolation und cDNASynthese wurde die cDNA nach den Herstellerangaben mit SYBR Green ROX qPCR Mastermix versetzt und auf die Array-Platte gegeben. Die PCR-Reaktion erfolgte im StepOnePlus und umfasste folgende Zyklen: Schritt Temperatur [°C] Zeit Anzahl Zyklen Initiale Denaturierung 95 10 min 1 Denaturierung 95 15 sec Primer-Hybridisierung 60 60 sec Finale Elongation 95 15 sec 1 Abkühlen 60 1 min 1 Schmelzkurve 60-95 Kühlung 8 ∞ - 40 2.11 qPCR Auswertung Für die Auswertung der qPCR müssen einerseits die Effizienz der PCR-Reaktionen an sich, andererseits die Expression von Kontrollgenen berücksichtigt werden. Aus diesem Grund wurde für die E6 und E7-Expressionsanalyse die relative Quantifizierung nach Livak und Schmittgen (2001) gewählt. Dabei wird der Expressionsunterschied anhand der arithmetischen Formel 2-ΔΔCT dargestellt. Die Expression des Zielgens wird auf die eines nicht regulierten Gens normalisiert und der CT-Wert (Cycle Threshold) des Zielgens vom CT-Wert des Referenzgens subtrahiert (CT = CTZielgen – CTReferenzgen). Der Vorteil hierbei liegt in der Reduktion der Varianz der Expressionen. Da unterschiedliche RNA-Extraktionseffizienzen und Matrixeffekte sowie Fehler bei der reversen Transkription aller Proben auftreten können werden sie bei der relativen Quantifizierung „herausgerechnet“ (Pfaffl 2004). Anschließend wurde die relative Expression des Zielgens in den bestrahlten Proben auf die Expression der 41 Kontrollproben bezogen und die jeweiligen ΔCT-Werte voneinander abgezogen (ΔΔCT). Die p53 Signaling Pathway RT2 PCR Arrays wurden ebenfalls anhand der relativen Quantifizierung nach Livak und Schmittgen (2001) ausgewertet, die ExpressionsÄnderung wird ebenfalls mit der Formel 2-ΔΔCT dargestellt. 2.12 Statistik Alle Experimente wurden, soweit nicht anders angegeben, mindestens dreimal unabhängig voneinander durchgeführt. Zur Auswertung der qPCR-Ergebnisse wurde die StepOne Software Version 2.2.2 (Applied Biosystems, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) benutzt. Die statistische Analyse der Dosis-Effekt-Kurven wurden mit Hilfe von GraphPad Prism Version 5 durchgeführt. Dargestellt sind jeweils die Mittelwerte und Standardabweichungen aus drei im Triplikat durchgeführten Experimenten (Abschnitt 3.2.2). Für die Analysen der Dosis-Effekt-Kurven und der qPCR Expressionsanalysen wurden Students T-Tests (Fehlerindex * p<0,05; ** p<0,01; *** p<0,001) verwendet. 42 3 Ergebnisse 3.1 HPV-Nachweis Die vier Zelllinien UM-SCC47, UM-SCC104, UPCI:SCC152 und 93-VU-147T sind laut Literatur durch eine Infektion mit HPV Typ 16 charakterisiert (Lansford et al. 1999; Steenbergen et al. 1995; Tang et al. 2012; White et al. 2007), die anderen vier Zelllinien UD-SCC1, UM-SCC6, UM-SCC11b und UT-SCC33 enthalten keine virale DNA (Lansford et al. 1999; Zhao et al. 2011). Um den HPV-Status aller in der vorliegenden Arbeit verwendeten Zelllinien zu überprüfen, wurde mittels PCR-Reaktion die DNA der viralen L1-Gen-Region über die Primer GP5+ und GP6+ amplifiziert (de Roda Husman, A M et al. 1995) und die Amplifikate über nachfolgende Gelelektrophorese aufgetrennt (Abbildung 5). Die DNA-Banden haben eine Größe von 150 Basenpaaren. Die Zelllinien UD-SCC1, UM-SCC6 und UT-SCC33 sowie die Negativ-Kontrolle weisen keine DNA-Bande auf. Somit konnte der HPV-Status aller Zelllinien entsprechend dem in der Literatur angegebenen Status bestätigt werden. Der HPV-Status wurde in Marburg zusätzlich anhand des Expressions-Nachweises viraler HPV-E6 und E7-mRNA bestätigt (Arenz et al. 2014). 1 2 3 4 5 6 7 8 9 150 Abbildung 5: HPV-PCR HPV-PCR mit Primern GP5+ und GP6+. Die Größe des erwarteten PCR-Produkts liegt bei 150 Basenpaaren. 1: Größenstandard, 2: Negativ-Kontrolle, 3: UD-SCC2, 4: UT-SCC33, 5: UMSCC104, 6: UPCI:SCC152, 7: UM-SCC6, 8: VU-147T, 9: Positiv-Kontrolle: bereits HPV-positiv getestete Zelllinien 3.2 Dosis-Effekt-Beziehung 3.2.1 Wachstumskurven Für eine strahlenbiologische Charakterisierung ist die Kenntnis über die Wachstumseigenschaften der zu untersuchenden Zelllinien notwendig. Daher wurden die Verdopplungszeiten der Zelllinien experimentell ermittelt (Tabelle 2). Die Vermehrung einer definiert ausgesäten Zellmenge wurde zu bestimmten Zeitpunkten gemessen. 43 Tabelle 2: Verdopplungszeiten Ermittelte Verdopplungszeiten der untersuchten Zelllinien in Stunden. Zelllinien HPV Typ 16 Verdopplungszeit [h] UD-SCC1 negativ 17,7 UT-SCC33 negativ 32,3 UM-SCC6 negativ 33,9 UM-SCC11b negativ 20,6 UM-SCC47 positiv 24,1 UM-SCC104 positiv 35,9 93-VU-147T positiv 36,3 UPCI:SCC152 positiv 42,6 3.2.2 Klonogenes Überleben Das klonogene Überleben beschreibt die Möglichkeit von Zellen, sich nach Bestrahlung zu teilen und dabei Kolonien von mindestens 50 Tochterzellen zu bilden (PUCK und MARCUS 1956). Um das klonogene Überleben nach Exposition mit ionisierender Strahlung untersuchen zu können, wurde in Vorversuchen die Koloniebildungseffizienz (sog. Plattierungseffizienz) jeder Zelllinie ermittelt. Anhand der Koloniebildungseffizienz konnten definierte Zellzahlen ausgesät, bestrahlt und das klonogene Überleben untersucht werden. Unsere Überlebenskurven zeigen, dass im Bereich geringer Dosen bis zu 2Gy alle Zelllinien ähnlich viele überlebende Kolonien aufweisen (Abbildung 6 A) (Arenz et al. 2014). Die HPV-negative Zelllinie UM-SCC6 zeigt die meisten überlebenden Kolonien im Vergleich zu den anderen getesteten Zelllinien, wohingegen die HPV-positive Zelllinie UM-SCC-47 nach Inkubation mit mehr als 6Gy keine Kolonien mehr bildete. Der Anteil (Fraktion) der überlebenden Zellen (SF) nach einer Dosis von 2Gy ist jedoch bei den HPV-positiven Zelllinien im Mittel signifikant geringer (p=0,01) als bei den HPV-negativen (Abbildung 6 B) (Arenz et al. 2014). 44 A 1 0.5 Klonogenes Überleben 0.1 0.01 0.001 UD-SCC-1 UM-SCC-47 UT -SCC-33 UM-SCC-104 UM-SCC-6 93-VU-147T UM-SCC-11b UPCI:SCC152 Abbildung 6: Überleben nach Bestrahlung A) Klonogenes Überleben der untersuchten HPV-positiven (blau) und HPV-negativen Zelllinien (schwarz). Aufgetragen sind Mittelwerte mit Standardabweichung. Dosis [Gy] B) Anteile überlebender Zellen 0 2 4 6 8 B nach 2Gy). Aufgetragen sind SF-2 0.45 0.40 0.35 0.30 0.25 0.20 0.15 0.10 0.05 (SF-2 = surviving fraction Mittelwerte mit Median und Standardabweichung statistischer Analyse nach mit Students T-Test. (Arenz et p = 0,0102 al. 2014) 3.3 Zellzyklusverteilung nach Bestrahlung Exposition mit ionisierender Strahlung bewirkt in gesunden Zellen einen ZellzyklusArrest. Dieser ermöglicht die Reparatur der beschädigten DNA. Bei irreparablen Schäden wird Apoptose eingeleitet. Die gefundene Strahlensensitivität der vier untersuchten HPV-positiven Zelllinien wurde im Hinblick auf das Zellzyklus-Verhalten mit dem der vier HPV-negativen Zellen verglichen. Die Häufigkeit der DNA-Verteilung (x-Achse) ist in Histogrammen gegen die DNAMenge (y-Achse) exemplarisch für zwei Zelllinien aufgetragen (Abbildung 7). Die Zellen der HPV-positiven Zelllinie UPCI:SCC152, sowie der HPV-negativen UM-SCC11b zeigen bereits 10h nach Bestrahlung mit 2 bzw. 6Gy einen veränderten DNA-Gehalt im Vergleich zur unbestrahlten Kontrolle, da mehr Zellen einen doppelten DNA-Gehalt (türkiser Peak) aufweisen (Arenz et al. 2014). In den unbestrahlten Kontrollen bleibt die Verteilung des DNA-Gehalts unabhängig vom HPV-Status in den Kontrollen ähnlich. 20h nach Bestrahlung mit 2Gy werden bei der HPV-positiven Zelllinie vermehrt Zellen mit doppeltem DNA-Gehalt gemessen, bei der HPV-negative Zelllinie dagegen nicht. Nach 6Gy enthält die Probe der Zelllinie UPCI:SCC152 zum Zeitpunkt 20h kaum Zellen mit einfachem DNA-Gehalt, zum Zeitpunkt 96h tragen dagegen mehr Zellen einen 45 einfachen DNA-Gehalt (grüner Peak), und die Häufigkeit der Zellen mit doppeltem DNA-Gehalt ist zu beiden Zeitpunkten vergleichbar. Die DNA-Verteilung der HPVnegativen Zelllinie nähert sich 96h nach 6Gy wieder der Kontrolle an. Die Zell-Fraktion, die 96h nach einer Dosis von 6Gy DNA-Fragmente enthielt (siehe Pfeil: SubG1), tritt bei der Probe der HPV-positiven Zelllinie verstärkt auf. UPCI:SCC152 (HPV-positiv) 0 Gy 2 Gy 6 Gy UM-SCC11b (HPV-negativ) 0 Gy 2 Gy 6 Gy 10h 20h 96h subG1 Abbildung 7: Verteilung der DNA-Gehalte der HPV-positiven Zelllinie UPCI:SCC152 und der HPV-negativen Zelllinie UM-SCC11b nach Bestrahlung mit 2Gy und 6Gy In dem Histogramm ist die Häufigkeitsverteilung der DNA-Gehalte einer HPV-positiven Zelllinie UPCI:SCC152 (links) und einer HPV-negativen Zelllinie UM-SCC11b (rechts) nach Bestrahlung mit Einzeldosen von 2Gy und 6Gy abgebildet. Der DNA-Gehalt (x-Achse) gibt Aufschluss über die Zellzyklus-Phase: Grün: Zellen in G1-Phase, Gelb: Zellen in S-Phase, Türkis: Zellen in G2/M-Phase. HPV-positive Zellen arretieren mit steigender Strahlungsintensität in der G2Phase, und weisen verstärkt fragmentierte DNA auf (subG1-Phase, Pfeil). Die prozentuale Verteilung der mittleren DNA-Gehalte je nach Bestrahlung ist entsprechend ihrer Zellzyklus-Phasen in Abbildung 8 zusammengefasst. Die G1Phasen-Verteilung zeigt mit steigender Dosis weniger HPV-positive Zellen mit einfachem DNA-Gehalt (Arenz et al. 2014). Die DNA-Verteilung der HPV-negativen Zelllinien ähnelt der Verteilung der Kontrollproben und auch 6Gy bewirken nur eine kurzfristige Abnahme der Zellen mit einfachem DNA-Gehalt. Alle HPV-negativen Proben wiesen nach 48h einen wachsenden Anteil G1-Phase-Zellen auf. Die DNA-Gehalte der HPV-positiven und -negativen Zellen zeigen bis 10h eine ähnliche S-Phase-Verteilung (Arenz et al. 2014). Nach diesem Zeitpunkt besitzen die HPV-positiven Zelllinien stark fluktuierende Mengen an S-Phase-Zellen, die HPVnegativen Zelllinien enthalten nach 48h annähernd ähnlich viele Zellen in der S-Phase wie die Kontrollproben. Entsprechend des wachsenden Anteils HPV-negativer G1Phase-Zellen verringerte sich der Anteil dieser S-Phase-Fraktion 48h nach Bestrahlung. 46 Entsprechend der DNA-Verteilung der G1-Phase verursacht eine Dosis von 2Gy in beiden Entitäten einen Anstieg der G2-Phase-Zellen, in den HPV-negativen Zellen flaut dieser schneller ab (Arenz et al. 2014). Bestrahlung mit 6Gy resultiert in den HPVpositiven Zelllinien mit einem verstärkten und länger andauernden G2-Phasen-Arrest, verglichen mit den HPV-negativen Zelllinien. Auch hier ist nach 48h ein verminderter Anteil G2-Phase-Zellen zu verzeichnen, entsprechend der wachsenden Fraktion an HPV-negativen G1-Phase-Zellen. Insgesamt zeigen HPV-positive Zelllinien mit steigender Dosis einen verstärkten G2-Arrest, der länger andauert als bei HPVnegativen Zelllinien. HPV-positiv 0 Gy 2 Gy 6 Gy HPV-negativ 100 100 80 80 60 60 G1 40 20 20 0 0 4 Anteil der Zellen [%] 40 10 20 28 48 72 96 100 100 80 80 60 60 S 40 20 4 10 20 28 48 72 96 4 10 20 28 48 72 96 4 10 20 28 48 72 96 40 20 0 0 4 10 20 28 48 72 96 100 100 80 80 * 60 40 60 G2 20 40 20 0 0 4 10 20 28 Stunden 48 72 96 Stunden Abbildung 8: Prozentuale Häufigkeits-Verteilung der DNA-Gehalte bestrahlter Zellen in den Zellzyklus-Phasen Der DNA-Gehalt HPV-positiver (UM-SCC47, UPCI:SCC152 links) und HPV-negativer (UDSCC1, UM-SCC6, UM-SCC11b, UT-SCC33 rechts) Zellen in den Zellzyklus-Phasen G1, S und G2 wurde durchflusszytometrisch nach Bestrahlung bestimmt und die Mittelwerte aufgetragen. HPV-positive Zellen arretieren mit steigender Strahlenintensität häufiger (*) und zeitlich länger (Pfeil) in der G2-Phase. 47 Die prozentuale Häufigkeitsverteilung der DNA-Gehalte lässt Zellen mit DNAFragmenten erkennen, die in der Zellzyklus-Analyse als SubG1-Phase auftreten (Abbildung 9) (Arenz et al. 2014). Diese Fraktion nimmt bei den HPV-negativen Zelllinien 28h nach Bestrahlung und bei den HPV-positiven Zelllinien erst 48h nach Bestrahlung dosisabhängig zu. Eine Dosis von 6Gy bewirkt dabei häufiger in den HPVpositiven Zelllinien eine Akkumulation von Zellen mit DNA-Fragmenten als bei den HPV-negativen Zelllinien. Anteil der Zellen [%] HPV-positiv HPV-negativ 50 50 40 40 30 30 20 20 10 10 0 0 Gy 2 Gy 6 Gy 0 4 10 20 28 48 72 96 Stunden 4 10 20 28 48 72 96 Stunden Abbildung 9: Prozentuale Häufigkeitsverteilung der Zellen mit DNA-Fragmenten nach Bestrahlung (SubG1-Phase) Der DNA-Gehalt HPV-positiver (UM-SCC47, UPCI:SCC152 links) und HPV-negativer Zellen (UD-SCC1, UM-SCC6, UM-SCC11b, UT-SCC33 rechts) wurde durchflusszytometrisch bestimmt und die Mittelwerte der SubG1-Fraktionen mit DNA-Fragmenten aufgetragen. Mit steigender Strahlendosis enthalten HPV-positive Zellen vermehrt DNA-Fragmente. 3.4 Proteinexpressions-Änderung nach Bestrahlung Die molekularen Ursachen der verstärkten Strahlensensitivität HPV-assoziierter Tumorzelllinien sind weitgehend unbekannt. Aus diesem Grund sollten molekulare Marker identifiziert werden, die nach Bestrahlung in HPV-positiven und -negativen Zellen verändert reguliert sind. Dazu wurden die HPV-negativen Zelllinien UD-SCC1, UM-SCC6, UM-SCC11b, UT-SCC33, sowie die HPV-positiven Zelllinien UM-SCC47, UM-SCC104, VU-147T, UPCI:SCC152 mit 6Gy bestrahlt, pellettiert, die Proteine isoliert, Gelelektrophoretisch ihrer Größe entsprechend aufgetrennt und über Antikörper-Färbung sichtbar gemacht. 3.4.1 Proteinexpression von p16INK4A nach Bestrahlung Der Tumorsuppressor p16INK4A gilt klinisch als molekularer Marker für eine aktive HPVInfektion (Klussmann et al. 2003). Dabei wird das virale Onkoprotein E7 verstärkt exprimiert und markiert das Retinoblastom-Protein (Rb), ein p16-Regulator-Protein, zum Abbau, woraufhin das p16-Protein akkumuliert. Alle untersuchten HPV-positiven 48 Zelllinien weisen ein p16-Proteinsignal auf, die HPV-negativen Zelllinien dagegen nicht (Abbildung 10). Die Exposition mit ionisierender Strahlung hatte in den hier durchgeführten Experimenten keinen sichtbaren Effekt auf die Expression. Somit bestätigt die p16-Proteinexpression lediglich den bestehenden HPV-Status der Zelllinien. - + UMSCC6 0 6 UMSCC104 0 6 - + UTSCC33 UPCI: SCC152 0 0 6 HPV16 6 [Gy] p16 ß-Tubulin + + - - UMSCC47 VU147T UDSCC1 UMSCC11b HPV16 p16 ß-Tubulin INK4A Abbildung 10: p16 -Protein-Expression in vier HPV-positiven und vier HPV-negativen Zelllinien 24h nach Bestrahlung mit 6Gy Immunoblot von Gesamt-Zellextrakten der HPV-positiven Zelllinien UM-SCC104, UPCISCC152, UM-SCC47 und VU-147T und der HPV-negativen Zelllinien UM-SCC6, UT-SCC33, UD-SCC1 und UM-SCC11b. Die Proben wurden 24h nach Bestrahlung mit Einzeldosen von 6Gy genommen. Die p16-Protein-Expression der bestrahlten Zellen wurde mit der der unbestrahlten Zellen (0Gy) verglichen. Die HPV-positiven Zelllinien zeigen unabhängig von der Bestrahlung ein p16-Protein-Signal, die HPV-negativen Zelllinien nicht. Als Lade-Kontrolle diente ß-Tubulin. 3.4.2 Proteinexpression von Retinoblastom nach Bestrahlung Das HPV16-Onkoprotein E7 bindet an den Tumorsuppressor Rb (Dyson et al. 1989), und bewirkt über Ubiquitin-vermittelte Degradation so den Abbau der Rb-Proteine (Boyer et al. 1996). Die HPV-positiven Zelllinien zeigen 24h nach Bestrahlung tendenziell ein stärkeres Proteinsignal als die unbestrahlten Kontrollen (Abbildung 11). Die HPV-negativen Zelllinien zeigen ähnliche Proteinmengen ohne und mit Bestrahlung. 49 - + UMSCC6 0 6 - UMSCC104 0 6 + HPV16 UTSCC33 UPCI: SCC152 0 0 6 [Gy] 6 * * Rb ß-Tubulin + + - - UMSCC47 VU147T UDSCC1 UMSCC11b * HPV16 * Rb ß-Tubulin Abbildung 11: Rb-Protein-Expression in vier HPV-positiven und vier HPV-negativen Zelllinien 24h nach Bestrahlung mit 6Gy Immunoblot von Gesamt-Zellextrakten der HPV-positiven Zelllinien UM-SCC104, UPCI:SCC152, UM-SCC47, VU-147T und der HPV-negativen Zelllinien UM-SCC6, UT-SCC33, UD-SCC1 und UM-SCC11b. Die Proben wurden 24h nach Bestrahlung mit Einzeldosen von 6Gy genommen. Die Rb-Protein-Expression der bestrahlten Zellen wurde mit der der unbestrahlten Zellen (0Gy) verglichen. Die HPV-positiven Zelllinien zeigen nach Bestrahlung ein verstärktes Rb-Protein-Signal (*). Als Lade-Kontrolle diente ß-Tubulin. Die Rb-Proteinexpression gibt Aufschluss über die Zellzyklus-Progression nach DNASchaden, wobei der G1-Arrest in E7-exprimierenden Zellen ausbleibt (Slebos et al. 1994), was vermutlich mit verminderten Rb-Protein-Mengen zusammenhängt (Lindel et al. 2012). Um einen möglichen Bestrahlungseffekt auf die Rb-Protein-Expression genauer zu untersuchen wurden anschließend frühe Zeitpunkte von 30min bis 6h nach Bestrahlung betrachtet (Abbildung 12). Die Rb-Protein-Expression wird in der HPVpositiven Zelllinie UM-SCC47 durch Bestrahlung mit 6Gy induziert, wenngleich kein kontinuierlicher Anstieg zu verzeichnen ist. Die anderen drei HPV-positiven Zelllinien zeigen keine Veränderung des Rb-Signals nach Bestrahlung in dieser frühen Phase. Die Western Blots der HPV-negativen Zelllinien weisen ebenfalls keine kontinuierliche Induktion nach Bestrahlung auf, wobei die Protein-Signale der Zelllinien UM-SCC11b und UM-SCC47 auffallend ähnlich sind. 50 HPV-positiv HPV-negativ VU147T 0,5 0 6 1 0 6 1,5 0 6 UM-SCC11b 2 0 4 6 0 6 6 0 [h] [Gy] 6 0,5 0 6 1 1,5 0 6 0 2 6 0 4 6 0 6 6 0 6 Rb ß-Tubulin UM-SCC104 UT-SCC33 Rb ß-Tubulin UM-SCC47 Rb ß-Tubulin UPCI:SCC152 Rb ß-Tubulin Abbildung 12: Rb-Protein-Expression in vier HPV-positiven und zwei HPV-negativen Zelllinien zu verschiedenen Zeitpunkten nach Bestrahlung mit 6Gy Immunoblot von Gesamt-Zellextrakten der HPV-positiven Zelllinien VU-147T, UM-SCC104, UMSCC47, UPCI:SCC152 und der HPV-negativen Zelllinien UM-SCC11b und UT-SCC33. Die Proben wurden zu den Zeitpunkten 0,5h, 1h, 1,5h, 2h, 4h und 6h nach Bestrahlung mit Einzeldosen von 6Gy genommen. Die Protein-Expression von Retinoblastom (Rb) in den bestrahlten Zellen wurde mit der der unbestrahlten Zellen (0Gy) verglichen. Die Rb-ProteinExpression wird nur in den Zelllinien UM-SCC47 und UM-SCC11b nach Bestrahlung induziert, alle anderen Zelllinien zeigen keine Expressionsunterschiede. Als Lade-Kontrolle diente ß- Tubulin. Im Laufe des Zellzyklus wird das Phosphoprotein Rb posttranslational modifiziert (Buchkovich et al. 1989), was sich anhand von verschieden großen Banden im Western Blot nachweisen lässt (Brugarolas et al. 1999). So ist das hyperphosphorylierte Rb (pRbp), das die aktive Molekülform darstellt, wegen vieler Phosphat-Reste größer und läuft langsamer als das inaktive hypophosphorylierte (pRb) Protein. Für eine höhere Auflösung der Rb-Protein-Banden wurden ausgewählte Protein-Lysate mit längeren SDS-Gelen analysiert und ein anderer Puffer (s. 2.6.7.1) zur Protein-Isolation verwendet. Bestrahlung bewirkt bei der HPV-positiven Zelllinie VU-147T 24h nach 6Gy eine stärker ausgeprägte obere pRbp-Bande im Vergleich zur Kontrolle, Rb wird folglich phosphoryliert und aktiviert (Abbildung 13). Die HPV-positive Zelllinie UM-SCC47 zeigt 24h nach 6Gy innerhalb der drei pRbp-Banden eine stärker ausgeprägte mittlere Bande im Vergleich zur unbestrahlten Kontrollprobe, Rb wird hier 51 folglich ebenfalls aktiviert. Da verschiedene posttranslationale Phosphat-Modifikationen von verschiedenen Funktionen des Rb-Proteins zeugen (Buchkovich et al. 1989), lassen die verschieden starken pRbp-Banden auf unterschiedliche Rb-Funktionen in den beiden HPV-positiven Zelllinien schließen. In der Zelllinie UM-SCC11b führt die Bestrahlung keine Änderung des Phosphorylierungsgrades herbei, Rb wird somit nicht aktiviert. HPV-positiv VU147T 0,5 0 6 1 0 6 HPV-negativ UM-SCC47 24 0 6 0,5 0 6 1 0 6 UM-SCC11b 24 0 6 0,5 0 6 1 0 6 24 0 6 [h] [Gy] + * pRbp pRb Abbildung 13: Protein-Expression von hyper- (pRbp) und hypo-phosphoryliertem Rb (pRb) in zwei HPV-positiven und einer HPV-negativen Zelllinie zu verschiedenen Zeitpunkten nach Bestrahlung mit 6Gy Immunoblot von Gesamt-Zellextrakten der HPV-positiven Zelllinien VU-147T und UM-SCC47, sowie der HPV-negativen Zelllinie UM-SCC11b. Die Proben wurden zu den Zeitpunkten 0,5h, 1h, 1,5h und 24h nach Bestrahlung mit Einzeldosen von 6Gy genommen. Die Rb-ProteinExpression der bestrahlten Zellen wurde mit der der unbestrahlten Zellen (0Gy) verglichen. Durch ein längeres Gel werden einzelne Rb-Banden erkennbar. Die HPV-positive Zelllinie VU147T enthält 24h nach 6Gy mehr pRbp (*), ebenso UM-SCC47 (+), die HPV-negative Zelllinie UM-SCC11b zeigt keinen Unterschied. Als Lade-Kontrolle diente ß-Tubulin. pRb: hypophosphoryliertes Rb; pRbp: hyperphosphoryliertes Rb (n=1) 3.4.3 Proteinexpression von p53 und phospho p53 (Ser15) nach Bestrahlung Der Tumorsuppressor p53 ist einer der wichtigsten Faktoren der zellulären Strahlenantwort und wird nach strahleninduziertem DNA-Schaden durch Phosphorylierung am Serin 15 aktiviert (Banin et al. 1998). In HPV-assoziierten Zellen wird das p53-Protein vom viralen Onkoprotein E6 zum Abbau markiert (Scheffner et al. 1990; Werness et al. 1990), jedoch ist die Beteiligung von HPV an der Strahlensensitivität HPV-assoziierter Tumoren umstritten. Daher wurde die Expression des gesamten, zellulären p53 und seiner aktivierten Form (phospho p53) nach Bestrahlung in HPV-positiven und –negativen Zelllinien untersucht (Abbildung 14). Unter den HPV-positiven Zelllinien weist 24h nach Bestrahlung nur VU-147T ein schwaches p53-Signal auf. Alle anderen HPV-positiven Zelllinien lassen kein bzw. ein 52 gerade noch nachweisbares Protein-Signal erkennen, die Bestrahlung hat also eher keinen Einfluss auf die p53-Proteinexpression. Unter den HPV-negativen Zelllinien zeigen nur UM-SCC11b und UT-SCC33 ein p53-Protein-Signal. Die anderen HPVnegativen Zelllinien weisen kein bzw. ein gerade noch nachweisbares Protein-Signal auf. Auch hier hat die Bestrahlung möglicherweise keinerlei Einfluss auf die Proteinexpression. Die Proteinexpression des aktivierten, phosphorylierten p53 an der Stelle Serin15 zeigt nur bei der HPV-positiven Zelllinien VU-147T ein sehr schwaches Protein-Signal nahe der Nachweisgrenze. Die HPV-negativen Zelllinien UM-SCC11b und UT-SCC33 weisen eine klar erkennbare Aktivierung nach Bestrahlung auf, die anderen HPVnegativen Zelllinien nicht. - - - - UMSCC6 UTSCC33 UDSCC1 UMSCC11b 0 6 0 6 0 6 0 + + + + UMSCC47 VU147T UMSCC104 UPCI: SCC152 HPV16 6 [Gy] Phospho p53 0 6 0 6 0 6 0 6 * p53 ß-Tubulin Abbildung 14: Protein-Expression von p53 und phosphoryliertem p53 an Serin15 in vier HPV-negativen und vier HPV-positiven Zelllinien 24h nach Bestrahlung mit 6Gy Immunoblot von Gesamt-Zellextrakten der HPV-negativen Zelllinien UM-SCC6, UT-SCC33, UDSCC1, UM-SCC11 und der HPV-positiven Zelllinien UM-SCC47, VU-147T, UM-SCC104 und UPCI:SCC152. Die Proben wurden 24h nach Bestrahlung mit Einzeldosen von 6Gy genommen. Die Proteinexpression der bestrahlten Zellen wurde mit der der unbestrahlten Zellen (0Gy) verglichen. Die HPV-negativen Zelllinien UT-SCC33 und UM-SCC11b, sowie die HPV-positive VU-147T (*) zeigen ohne und mit Bestrahlung ein p53-Signal, und jeweils nach Bestrahlung eine verstärkte Phosphorylierung von p53. Als Lade-Kontrolle diente ß-Tubulin. Die strahleninduzierte Aktivierung von p53 findet bereits wenige Minuten nach Exposition mit ionisierender Strahlung statt (Shieh et al. 1997), weshalb die Proteinexpression nach Bestrahlung mit 6Gy anschließend noch zu früheren Zeitpunkten als 24h untersucht wurde. Abbildung 15 zeigt in der HPV-positiven Gruppe insgesamt keine Veränderung bei der p53-Proteinexpression zwischen 0,5h und 6h nach Bestrahlung mit 6Gy. Das p53-Signal erscheint in diesen Zelllinien als Doppelbande. Da die Zelllinie VU-147T sowohl ein WT-p53-Gen als auch mutiertes p53-Gen enthält (Rieckmann et al. 2013) werden möglicherweise beide p53-Formen im 53 Western Blot als p53-Protein detektiert. Bei der Zelllinie UM-SCC47 liegen möglicherweise unterschiedliche Phosphorylierungs-Zustände oder p53-Splice- Varianten vor. In den untersuchten HPV-negativen Zelllinien hat Exposition mit ionisierender Strahlung ebenfalls keinen Einfluss auf das p53-Proteinlevel. Die aktive Form von p53 (phospho p53) ist sowohl in den HPV-positiven als auch HPVnegativen Zellen bereits 0,5h nach Bestrahlung durch eine erhöhte Proteinexpression nachweisbar (Arenz et al. 2014). Die Signalstärke nimmt bei den HPV-positiven, sowie der HPV-negativen Zelllinie UT-SCC33 über den gesamten Zeitraum hin ab, wohingegen die HPV-negative Zelllinie UM-SCC11b ähnliche Expressionsmengen bis 6h nach Bestrahlung aufweist. HPV-positiv HPV-negativ VU147T 0,5 0 6 1 0 6 1,5 0 6 UM-SCC11b 2 0 4 6 0 6 6 0 6 [h] [Gy] 0,5 0 6 1 0 6 1,5 0 6 2 0 4 6 0 6 6 0 6 Phos p53 p53 ß-Tubulin UM-SCC47 UT-SCC33 Phos p53 p53 ß-Tubulin Abbildung 15: Protein-Expression von p53- und phospho- p53 in zwei HPV-positiven und zwei HPV-negativen Zelllinien zu verschiedenen Zeitpunkten nach Bestrahlung mit 6Gy Immunoblot von Gesamt-Zellextrakten der HPV-positiven Zelllinien VU-147T und UM-SCC47 sowie der HPV-negativen Zelllinien UM-SCC11b und UT-SCC33. Die Proben wurden zu den Zeitpunkten 0,5h, 1h, 1,5h, 2h, 4h und 6h nach Bestrahlung mit Einzeldosen von 6Gy genommen. Die p53- und phospho p53-Proteinexpression der bestrahlten Zellen wurde mit der der unbestrahlten Zellen (0Gy) verglichen. Die Alle Zelllinien zeigen bereits 0,5h nach 6Gy ein phospho p53-Signal, das über die Zeit hin abnimmt und nur bei UM-SCC11b tendenziell unverändert bleibt. Als Lade-Kontrolle diente ß-Tubulin. 3.5 qPCR: mRNA-Expression von viralen Onkogenen E6 und E7 Die Expression der viralen Onkoproteine E6 und E7 beeinflusst die zentralen Tumorregulatoren p53 und Rb. Um den Gehalt der viralen Proteine anhand der mRNAExpression abschätzen zu können und gleichzeitig einen möglichen Einfluss ionisierender Strahlung auf die Expression dieser viralen Onkogene zu untersuchen 54 wurden bestrahlte und unbestrahlte HPV-positive Zellen mittels quantitativer real time PCR analysiert. Anhand der gemittelten CT-Werte sind bei den E6 und E7Expressionsleveln nach Bestrahlung keine nennenswerten Unterschiede zu verzeichnen (Tabelle 3). In den untersuchten Zelllinien ist prinzipiell mehr E7- als E6mRNA vorhanden mit Ausnahme der Zelllinie UM-SCC104, bei der vergleichbare Mengen E6- und E7-mRNA exprimiert werden. Tabelle 3: mRNA-Expression von E6 und E7 in den HPV-positiven Zelllinien zu verschiedenen Zeitpunkten nach Bestrahlung mit 6Gy Die HPV-positiven Zelllinien VU-147T, UM-SCC47, UM-SCC104 und UPCI:SCC152 wurden 30min, 60min und 6h nach Bestrahlung mit Einzeldosen von 6Gy genommen, mittels quantitativer real time PCR auf den mRNA-Gehalt der Onkogene E6 und E7 hin untersucht und mit dem mRNA-Gehalt unbestrahlter Zellen (0Gy) verglichen. Dargestellt sind die Mittelwerte der gemessenen CT-Werte. (n=1 bei UM-SCC104 und UPCI:SCC152). CT-Werte (Mittelwerte) 93-VU-147T UM-SCC47 UM-SCC104 UPCI:SCC152 24,9 23,4 23,9 24,7 30min 25 23,6 24,3 24,3 60min 24,9 23,9 23,9 24,1 6h 25,1 24 24 24,6 20,5 18,5 24 22,8 30min 21,1 18,6 24,3 22,7 60min 20,9 18,8 24,2 22,3 6h 20,8 19 24 22,8 0 Gy E6 6Gy 0 Gy E7 6Gy Die relative Quantifizierung nach Livak und Schmittgen (2001) ergab, dass die prozentuale E6-mRNA-Expression in allen verwendeten Zelllinien 30min nach Bestrahlung mit 6Gy unterschiedlich ist und innerhalb 6h nach Bestrahlung in den Zelllinien UM-SCC47, UM-SCC104 und UPCI:SCC152 um 40% im Vergleich zum Kontrollwert reduziert ist (Abbildung 16). Die Zelllinie VU-147T weist dagegen eine Expressions-Zunahme um 40% auf. Die prozentuale E7-mRNA-Expression stellt sich 30min und 60min nach Bestrahlung im Vergleich zum Kontrollwert bei allen Zelllinien als reduziert dar. 6h nach 6Gy wird jedoch in der Zelllinie VU-147T 40% mehr E7mRNA gebildet, wobei die E7-mRNA in den Zelllinien UM-SCC47, UM-SCC104 und UPCI:SCC152 um 40% reduziert exprimiert wird. 55 Abbildung 16: Relative E6- und E7-mRNA-Expressionsänderung nach Bestrahlung mit 6Gy Mittels quantitativer real time PCR wurde die E6- und E7-mRNA-Expression in den HPVpositiven Zelllinien VU-147T, UM-SCC47, UM-SCC104 und UPCI:SCC152 zu den Zeitpunkten 30min, 60min, 6h nach Bestrahlung mit 6Gy festgestellt. Die mRNA-Expression der bestrahlten Zellen wurde auf die der unbestrahlten Zellen und die Expression des Referenzgens relativiert. –ΔΔCT Dargestellt ist die relative Expressionsänderung (2 ) der E6- und E7-mRNA nach Bestrahlung. E6 und E7 steigen bei VU-147T nach 6h an, in den anderen Zelllinien sinkt die Expression. 3.6 Sequenzierung der E6 und E7-Gen-Region der HPV-positiven Zelllinien Sobald die virale DNA in das Wirts-Genom integriert gehen Teile der Virus-DNA verloren bzw. werden transkriptionell beeinträchtigt (Olthof et al. 2012). Aufgrund der detektierten p53- und Rb-Protein-Expression in den HPV-positiven Zelllinien (siehe Abschnitte 3.4.2 und 3.4.3) wurden die Sequenzen der E6- und E7-Gene experimentell überprüft. Isolierte Gesamt-DNA der HPV-positiven Zelllinien wurde dafür amplifiziert (siehe 2.4), im Institut für Pathologie des Uniklinikums Gießen sequenziert und die Basenfolgen der E6- und E7-Genregion auf Mutationen und Vollständigkeit mit der HPV16-Genomsequenz der NCBI-Datenbank (National Center for Biotechnology Information) verglichen. Da in dieser Datenbank derzeit zwei identische HPV16Referenzsequenzen (NC_001526.2 (Kennedy et al. 1991) und K02718 (Seedorf et al. 1985)) zu finden sind, wurde für die Analyse die Sequenz mit der Identifikationsnummer NC_001526.2 verwendet. Ein Ausschnitt der vergleichenden Analyse zwischen dem sequenzierten Genbereich der Zelllinie UM-SCC47 und der HPV16-Referenzsequenz zeigt kurz hinter dem Start-Codon des E6-Gens (blauer Kasten, ATG) vier Basen-Austausche (rote Kästen, Abbildung 17): 1) Austausch von Tymidin durch Cytosin, 2) Austausch von Guanin durch Tymidin, 3) Austausch von Cytosin durch Guanin, 4) Austausch von Guanin durch Tymidin. Diese Austausche 56 sind in den Chromatogrammen als eindeutig lesbare Peaks erkennbar, weshalb technische Probleme ausgeschlossen werden können. Start E6-Gen HPV16 HPV_16 SCC47_fwd SCC47_fwd SCC47_rev SCC47_rev 410 420 430 440 450 GGTTAGTATA AAAGCAGACA TTTTATGCAC CAAAAGAGAA CTGCAATGTT GGTTAGTATA AAAGCAGACA TTTTATGCAC CAAAAGAGAA CTGCAATGTT GGTTAGTATA AAAGCAGACA TTTTATGCAC CAAAAGAGAA CTGCAATGTT HPV16 HPV_16 SCC47_fwd SCC47_fwd SCC47_rev SCC47_rev 460 470 480 490 500 TCAGGACCCA CAGGAGCGAC CCAGAAAGTT ACCACAGTTA TGCACAGAGC CCAGGACCCA CAGGAGCGAC CCATAAAGTT ACCAGATTTA TGCACAGAGC CCAGGACCCA CAGGAGCGAC CCATAAAGTT ACCAGATTTA TGCACAGAGC 1 Abbildung 17: 2 E6-Sequenzvergleich der Zelllinie 3 4 UM-SCC47 mit der HPV16- Referenzsequenz HPV16: Ausschnitt der HPV16-Referenzsequenz (NCBI Accession number: NC_001526.2 (Kennedy et al. 1991)), SCC47_fwd und _rev: Sequenzierte DNA von der Zelllinie UM-SCC47 (Primer HPV16_E6_E7-Seq fwd und rev). Abweichungen in der E6-Basenfolge der Zelllinie sind rot eingerahmt (1-4). Die Chromatogramme der entsprechenden Positionen lassen eindeutig zuordenbare Peaks der Basen erkennen, technische Probleme werden ausgeschlossen, somit treten vermehrt Unterschiede zur Referenzsequenz auf. Ein Austausch im E7-Genbereichs der Zelllinie UM-SCC47 kurz hinter dem StartCodon (blauer Kasten, ATG) ist dagegen auf technische Fehler beim Auslesen der Sequenz zurückzuführen (Abbildung 18): 5) Adenin ist durch Guanin ersetzt. Da die beiden Adenine vor dem scheinbar ausgetauschten Guanin im Chromatogramm in Form eines großen Peaks abgebildet sind ist davon auszugehen, dass die Basen nicht separat gemessen wurden und somit das dritte Adenin überlesen wurde. 57 860 870 TGTATGTCTT GTTGCAGATC TGTATGTCTT GTTGCAGATC TGTATGTCTT GTTGCAGATC Start E7-Gen 910 920 HPV_16 ATCATGCATG GAGATACACC HPV16 SCC47_fwd SCC47_fwd ATCATGCATG GAGATACACC SCC47_rev SCC47_rev ATCATGCATG GAGATACACC HPV_16 SCC47_fwd SCC47_rev 880 890 900 ATCAAGAACA CGTAGAGAAA CCCAGCTGTA ATCAAGAACA CGTAGAGAAA CCCAGCTGTA ATCAAGAACA CGTAGAGAAA CCCAGCTGTA 930 940 950 TACATTGCAT GAATATATGT TAGATTTGCA TACATTGCAT GAATATATGT TAGATTTGCA TACATTGCAT GAATATATGT TAGATTTGCA 960 970 980 990 1000 HPV16 HPV_16 ACCAGAGACA ACTGATCTCT ACTGTTATGA GCAATTAAAT GACAGCTCAG SCC47_fwd ACCAGAGACA ACTGATCTCT ACTGTTATGA GCAATTAAGT GACAGCTCAG SCC47_fwd SCC47_rev ACCAGAGACA ACTGATCTCT ACTGTTATGA GCAATTAAGT GACAGCTCAG SCC47_rev 5 Abbildung 18: E7-Sequenzvergleich der Zelllinie UM-SCC47 mit der HPV16- Referenzsequenz HPV16: Ausschnitt der HPV16-Referenzsequenz (NCBI Accession number: NC_001526.2, (Kennedy et al. 1991)), SCC47_fwd und _rev: Sequenzierte DNA von UM-SCC47 (Primer HPV16_E6_E7-Seq fwd und rev). Eine Abweichung in der E7-Basenfolge der Zelllinie von der Referenzsequenz ist rot eingerahmt (5), der Austausch ist auf ein technisches Problem zurückzuführen. Basen-Substitutionen in der DNA-Sequenz können mitunter schwerwiegende Folgen für die Aminosäuresequenz der Proteine haben, wie beispielsweise missenseMutationen (entstandenes Codon kodiert eine andere Aminosäure) oder silentMutationen (entstandenes Codon kodiert für die gleiche Aminosäure). Daher wurden die sequenzierten HPV16-Genbereiche der Zelllinien in ihre Aminosäuresequenz übersetzt und mit der Aminosäure-Sequenz des HPV16-Referenz-Genoms verglichen. Alle detektierten Punktmutationen in den untersuchten HPV16-Gen-Bereichen kodieren entweder für missense- oder silent- Mutationen (Tabelle 4). Die Zelllinie UM-SCC47 weist die meisten Basen-Austausche auf, die Zelllinien UM-SCC104 und UPCI:SCC152 tragen deutlich weniger Basen-Austausche. Die Zelllinie VU-147T enthält keinerlei Punktmutationen in den sequenzierten HPV-Genbereichen. Ob diese Mutationen die Funktionen der Onkoproteine E6 und E7 beeinträchtigen, kann hier nicht geklärt werden. Jedoch ist die in Abschnitt 3.4.3 gefundene verstärkte p53Aktivierung der Zelllinie VU-147T wahrscheinlich nicht auf Gen-Mutationen in der E6Gensequenz zurückzuführen. 58 Tabelle 4: Basensequenz-Analyse der untersuchten HPV-E6 und E7-Gen-Regionen und Konsequenz für die Aminosäure-Sequenz. E6-Region Zelllinie Basenmutation UM-SCC47 UM-SCC104 UPCI:SCC152 VU-147T E7-Region AminosäureCode Missense: T50: ATA=I Missence: G61 und T63: GAT=D Missense: C105: CAA=Q Missense: G202 und A203: GGA=G Missense: T253: TAT=Y Silent: C27: TTC=F Silent: G203: GTG=V Silent: G320: TTG=L Missense: G268: GTG=V Missense: G49: GGA=G Missense: G277: GTG=V - R17I Q21D Basenmutation AminosäureCode Missense: C707: TCC=S Missense: F229S L231R G713: CGT=R E35Q Missense: G565: GTA=V A68G - H84Y - F - V - L - L89V - R17G - L89V - M184V - Basenmutation: Mutierte Base ausgehend von Start-Codon (Fett kennzeichnet Substitution). Aminosäure-Code: Referenz-Aminosäure, Stelle in Protein-Sequenz, in HPV-AminosäureSequenz der Zelllinie mutierte Aminosäure. Es existieren Varianten des HPV16-Genoms, deren Basen-Austausche bekanntermaßen geographisch regional bedingt sind (Chan et al. 1992), zumal spezielle Bereiche des E6-Gens einem hohen Selektionsdruck zu unterliegen scheinen (Chen et al. 2005). Um zu überprüfen, ob es sich bei den vorliegenden Austauschen um bereits bekannte, regionale HPV16-Varianten handelt wurde in der NCBIDatenbank nach übereinstimmenden HPV16-Sequenz-Bereichen mit den sequenzierten Basenfolgen der Zelllinien gesucht und die gefundenen HPV16-GenBereiche verglichen. Ein repräsentativer Ausschnitt eines Sequenz-Vergleichs zeigt, dass die Basenfolge der Zelllinie UM-SCC47 eine Übereinstimmung mit der African 59 Type 2-Variante aufweist (Abbildung 19). Weiterhin treten konservierte Bereiche auf (rot), die offensichtlich in den meisten Varianten identisch sind, nicht jedoch mit der HPV16-Referenzseqzenz (NC_001526.2). Die Basenfolgen African Type 1, African Type 2, Asian-American und Amazonian stellen Varianten des HPV16-Genoms dar, die als übereinstimmend mit der eingegebenen Sequenz der Zelllinie in der NCBIDatenbank gefunden wurden. Start E6-Gen UM-SCC47 African1 African2 Asian-American Amazonian HPV16 TTAGTATAAAAGCAGACATTTTATGCACCAAAAGAGAACTGCAATGTTCCAGGACCCACA TTAGTATAAAAGCAGACATTTTCTGCACCAAAAGAGAACTGCAATGTTTCAGGACCCACA TTAGTATAAAAGCAGACATTTTATGCACCAAAAGAGAACTGCAATGTTCCAGGACCCACA TTAGTATAAAAGCAGACATTTTATGCACCAAAAGAGAACTGCAATGTTTCAGGACCCACA TTAGTATAAAAGCAGACATTTTCTGCACCAAAAGAGAACTGCAATGTTTCAGGACCCACA TTAGTATAAAAGCAGACATTTTATGCACCAAAAGAGAACTGCAATGTTTCAGGACCCACA ********************** ************************* *********** 102 120 120 120 119 120 UM-SCC47 African1 African2 Asian-American Amazonian HPV16 GGAGCGACCCATAAAGTTACCAGATTTATGCACAGAGCTGCAAACAACTATACATGATAT GGAGCGACCCACAAAGTTACCAGATTTATGCACAGAGCTGCAAACAACTATACATGATAT GGAGCGACCCATAAAGTTACCAGATTTATGCACAGAGCTGCAAACAACTATACATGATAT GGAGCGACCCAGAAAGTTACCACATTTATGCACAGAGCTGCAAACAACTATACATGATAT GGAGCGACCCACAAAGTTACCAGATTTATGCACAGAGCTGCAAACAACTATACATGATAT GGAGCGACCCAGAAAGTTACCACAGTTATGCACAGAGCTGCAAACAACTATACATGATAT *********** ********** * *********************************** 162 180 180 180 179 180 Abbildung 19: Sequenz-Vergleich von verschiedenen HPV16-Stämmen mit der Zelllinie UM-SCC47 und der HPV16-Referenzsequenz UM-SCC47: Ausschnitt des Genbereichs um das Start-Codon des E6-Gens der Zelllinie. HPV16: Ausschnitt der HPV16-Referenzsequenz (NCBI Accession number: NC_001526.2, (Kennedy et al. 1991)). HPV16-Varianten der NCBI-Datenbank: African Type 1 (African1), African Type 2 (African2), Asian-American und Amazonian. Rot markiert sind übereinstimmende Basenaustausche zwischen Zelllinie und einzelnen HPV16-Varianten, die von der Referenzsequenz abweichen. Unter allen getesteten Zelllinien zeigt der untersuchte HPV-Genabschnitt der Zelllinie VU-147T aufgrund keinerlei Basensubstitutionen die größte Übereinstimmung mit der HPV16-Referenzsequenz (Tabelle 5). Die Zelllinie UM-SCC47 beinhaltet eine veränderte Aminosäure in der HPV16-E6-Sequenz, die nicht mit der HPV16-Variante African Type 2 übereinstimmt (Aminosäure G202). Alle anderen AminosäureAustausche bei der Zelllinie UM-SCC47 entsprechen den Aminosäure-Austauschen der HPV16-Variante African Type 2. Zusammenfassend beinhalten alle untersuchten HPV-positiven Zelllinien mit Ausnahme der Zelllinie VU-147T bereits bekannte HPV16Varianten, die nicht mit der HPV16-Referenzsequenz übereinstimmen. Wenngleich verschiedene HPV16-Varianten unterschiedliche p53-Degradations-Aktivität besitzen (Stöppler et al. 1996; Mesplède et al. 2012) ist dennoch keine Aussage über die 60 Funktionalität der in den Zelllinien gefundenen, viralen HPV16-Gen-Varianten bei der p53-Degradation möglich. Tabelle 5: Zusammenfassung des NCBI-Datenbank-Vergleichs mit den sequenzierten HPV-positiven Zelllinien Die den Basensubstitutionen der HPV16-Gen-Bereiche entsprechenden Aminosäure-SequenzMutationen stimmen mit bekannten HPV16-Gen-Varianten überein. Zelllinie Identifizierte Varianten NCBIIdentifikationsNummer Asian-American Variant AF402678.1 African Type 2 African Type 1 AF472508.1 (außer G202 (Missense A68G); African Type 2 AF472509.1 African Type 2 und Referenz NC_001526 haben A68) Amazonian HM057182.1 East Asian Type AF534061.1 European German 131 Type, integrated SiHa Variant HPV16 variant AF001599.1 U89348 HPV16 variant, integrated SiHa Variant European German 131Type AF536179 East Asian Type AF534061.1 European German 131 Type, integrated SiHa Variant HPV16 Variant AF001599.1 U89348.1 HPV16 variant European German 131Type AF536179 Asian American Variant East Asian Type integrated SiHa variant HPV16 variant AF402678.1 AF534061.1 AF001599.1 U89348 European German 131Type AF536179.1 UM-SCC47 UM-SCC104 UPCI:SCC152 VU-147T Mutationen entsprechen HPV16 Variante (keine Mutationen, entspricht Referenz NC_001526) 3.7 p53 Signaling Pathway RT-PCR Array Das Tumorsuppressor-Protein p53 übt durch seine Eigenschaft als Transkriptionsfaktor entscheidenden Einfluss auf Zell-Proliferation und Apoptose nach strahleninduziertem DNA-Schaden aus. Das HPV-E6-Protein sorgt für eine Degradation von p53, weshalb postuliert wurde, dass die p53-vermittelte Strahlenantwort in Virus-infizierten Zellen verändert ist (Gupta et al. 2009; Kimple et al. 2013). Um diese These zu untersuchen wurde die Expression p53-abhängiger Gene nach strahleninduzierten DNA-Schaden 61 bei HPV-assoziierten Tumorzelllinien untersucht und mit nicht HPV-assoziierten verglichen. Hierzu wurde mRNA der HPV-positiven Zelllinien UM-SCC47, UPCI:SCC152 und VU-147T, sowie der HPV-negativen Zelllinien UM-SCC11b und UTSCC33 4h nach Bestrahlung mit 6Gy isoliert und zu cDNA umgeschrieben. Mit Hilfe von Human p53 Signaling Pathway RT2 Profiler PCR Arrays wurde die Expressionsänderung ausgewählter mRNAs von Komponenten des p53-Signalwegs analysiert. Die CT-Werte der bestrahlten Proben wurden rechnerisch auf die Werte von nicht regulierten Haushaltsgenen normiert und auf die Werte der Kontroll-Proben relativiert (siehe Abschnitt 2.11) (Livak und Schmittgen 2001). Dieser Wert (2-ΔΔCT) bezeichnet die Expressionsänderung und seine Abweichung vom Faktor 1 wurde als „verändert exprimiert“ definiert, wobei Werte unter 0,66 als vermindert und über 1,5 als verstärkt exprimiert betrachtet werden. Die meisten der untersuchten Gene werden zellspezifisch reguliert (Tabelle 6), das heißt ihre CT-Werte verändern sich nach Bestrahlung unabhängig vom HPV-Status der Zelllinie und teilweise nur geringfügig (siehe Fold Change). Lediglich drei Gene waren in mindestens drei von fünf Zelllinien durch Bestrahlung verändert exprimiert. 4h nach Bestrahlung mit 6Gy war in der Gruppe der HPV-positiven Zelllinien das Gen BIRC5 (Baculoviral IAP repeat containing 5) (Tabelle 6, blauer Kasten) herunterreguliert. Es kodiert für das Anti-Apoptotische Protein Survivin, das nach p53-Induktion durch Bestrahlung herunterreguliert wird (Stauber et al. 2007; Hoffman et al. 2002). Dieses Ergebnis stimmt mit der gefundenen Zellzyklus-Progression und der verstärkten SubG1-Phase der HPV-positiven Zelllinien überein (Abbildung 9). Im Gegensatz dazu konnten Preuss et al. (2008) zeigen, dass eine Akkumulation von Survivin-Protein mit einer HPV-unabhängigen Karzinogenese korreliert, was der hier detektierten, verminderten mRNA-Expression des BIRC5-Gens in HPV-positiven Zellen entspricht. Das Gen CCNB1 (Cyclin B1) (Tabelle 6, roter Kasten) ist in allen untersuchten Zelllinien durch Bestrahlung vermindert exprimiert. Es kodiert für das Protein Cyclin B1, welches für die Zellzyklus-Progression während der späten G2- und M-Phase mitverantwortlich ist und durch seine onkogene Eigenschaft in den meisten humanen Tumoren überexprimiert wird. Zwar fanden Santana et al. (2002) in HPV18-positiven Zervix-Karzinomzellen (HeLa) nach Transfektion mit onkogenem H-Ras-Protein eine gesteigerte, p53-unabhängige Cyclin B1-mRNA-Expression, aber Innocente et al. (1999) detektierten eine durch p53 verminderte CCNB1-Promotor-Aktivität und die verminderte Expression von CCNB1. Die Herunterregulation der CCNB1- Genexpression entspricht somit der Zellzyklus-Progression der HPV-positiven Zellen, 62 jedoch nicht dem gefundenen strahleninduzierten G1-Arrest der HPV-negativen Zelllinien, die mutiertes p53 exprimieren. Das Gen CDC25C (Cell division Cycle 25 homolog C) (Tabelle 6, grüner Kasten) ist in den zwei HPV-positiven Zelllinien UM-SCC47 und UPCI:SCC152 und der HPVnegativen UT-SCC33 nach Bestrahlung vermindert exprimiert. Es kodiert für eine Phosphatase, die nach strahleninduzierter Induktion von p53 runterreguliert wird, um den G2-M-Arrest einzuleiten. Durch sequenzspezifische p53-Bindung an die CDC25CPromotor-Region wird die Repression von CDC25C herbeigeführt (St Clair et al. 2004). Die verminderten mRNA-Expressionen der HPV-positiven Zelllinien entsprechen deren G2-Arrest nach Bestrahlung. Tabelle 6: Gen-Expressions-Änderung auf p53 Signaling Array 4h nach Bestrahlung mit 6Gy in den HPV-negativen und -positiven Zelllinien Genexpression (2 -ΔΔCT ) der HPV-negativen UM-SCC11b und UT-SCC33, sowie der HPV- positiven UM-SCC47, UPCI:SCC152 und VU-147T 4h nach Bestrahlung mit 6Gy nach qPCR mit dem p53 Signaling Array. Fold Change HPV-negativ Gen BCL2A1 Name BCL2-related protein A1 Baculoviral IAP repeat BIRC5 containing 5 CCNB1 Cyclin B1 Cell division cycle 25 CDC25C homolog C (S. pombe) Fas (TNF receptor FAS superfamily, member 6) Protein regulator of PRC1 cytokinesis 1 Reprimo, TP53 dependent RPRM G2 arrest mediator candidate TNF Tumor necrosis factor TP73 Tumor protein p73 WT1 Wilms tumor 1 HPV-positiv UM-SCC11b UT-SCC33 UM-SCC47 1,02 1,03 0,62 UPCI:SCC152 VU-147T - - 0,73 0,7 0,57 0,56 0,6 0,62 0,57 0,63 0,4 0,62 0,73 0,61 0,66 0,53 0,82 0,86 1,5 1,12 1,12 0,96 0,7 0,71 0,61 0,54 0,86 1,45 1,85 - 1,18 1,13 0,95 1,14 1,09 1,59 - 0,94 0,71 0,84 1,09 1,2 0,43 0,46 0,83 0,92 Fold Change bezeichnet die Änderung der CT-Werte nach Relativierung auf die unbestrahlte Kontrolle und die Haushaltsgene. Ein Wert von 1,00 entspricht keiner Veränderung, <1 einer Runterregulation, >1 einer Hochregulation. ‚-‘: Gen wird nicht exprimiert. Fett gedruckt: veränderte Gen-Expression bei einem „Cut off“ von <0,66 und >1,5. Bunte Kästen: veränderte Expression in mindestens drei der untersuchten Zelllinien. Zusammengefasst zeigen die Ergebnisse der p53 Signaling Array Analyse, dass nach Bestrahlung sechs Gene (BCL2A1, FAS, PRC1, RPRM, TNF, TP73) in HPV-positiven 63 Zelllinien anders als nach Bestrahlung erwartet reguliert werden, dagegen sind es nur vier Gene (BCL2A1, BIRC5, PRC1, TNF) in den HPV-negativen Zelllinien (Tabelle 7). Diese Gene haben im weitesten Sinne eine Apoptose-induzierende Funktion. Sie werden in den hier untersuchten HPV-positiven Zelllinien nach Bestrahlung vermindert, in den HPV-negativen Zelllinien jedoch nicht vermindert exprimiert. Tabelle 7: Eigenschaften und Funktionen der Gene mit stark veränderter Expression in der p53 Signaling Array Analyse der HPV-negativen und -positiven Zelllinien. mRNA-Expression in bestrahlten Zelllinien Gen Protein Merkmale BCL2-related BCL2A1 protein A1 B-Zell-LymphomProtein-Familie BIRC5 Survivin Protein enthält 1 Baculovirus IAP Repeat CCNB1 Cyclin B1 Heterodimer aus Cdc2 und Cyclin B1 CDC25C FAS Funktionen Anti- und Pro-Apoptotischer Regulator, reduziert Cytochrom C-Freisetzung, blockt Caspase-Aktivierung, hochreguliert durch extrazelluläre Signale (TNF, Zytokine, etc.) Fördert Proliferation und verhindert Apoptose, Beteiligung bei Chromosom-Anlagerung und -Trennung; inhibiert Caspase 9 Fördert Proliferation, wird zwischen G2-M-Phase exprimiert Cell division cycle Induziert Mitose durch Dephosphorylierung Tyrosin-Phosphatase 25 homolog C von Cyclin B1-Cdc2-Komplex Fas-Rezeptor TNF Receptor, TransmembranDomäne PRC1 Proteinregulator Phosphoprotein mit der Zytokinese 1 10 Untereinheiten RPRM Reprimo G2 Arrest Mediator, integrales Membranprotein TNF Tumor-Nekrose- Zytokin, löslich, Faktor Trimer TP73 Tumor Protein p73 Strukturverwand mit p53 WT1 Wilms tumor 1 Transkriptionsfaktor, u. a. für Bcl2 Induziert Apoptose nach Fas-LigandBindung Substrat verschiedener CDKs, bewirkt Histon-Ubiquitinylierung für GenSilencing Induktion von G2-M-Arrest, Inhibierung der CDK1-Aktivität, bewirkt Translokation des CDC2-CyclB1 Komplexes regelt Aktivität verschiedener Immunzellen, löst Apoptose oder Proliferation aus Tumorsuppressor oder Onkoprotein, ähnliche Funktion wie p53 (proapoptotische Funktion beschrieben) Tumorsuppressor oder Onkoprotein, stabilisiert p53 und verhindert p53abhängige Apoptose erwartete Änderung nach Bestrahlung HPV-positiv HPV-negativ hochreguliert wird weniger/nicht exprimiert gleichbleibend reprimiert wird weniger gleichbleibend reprimiert wird weniger wird weniger degradiert wird weniger wird weniger hochreguliert gleichbleibend gleichbleibend/wird mehr akkumuliert wird weniger wird weniger hochreguliert gleichbleibend wird mehr hochreguliert gleichbleibend/ wird weniger gleichbleibend hochreguliert wird weniger wird mehr gleichbleibend gleichbleibend/ wird weniger gleichbleibend 64 4 Diskussion Obwohl zwei abgrenzbare Entitäten bei HNSCC-Tumoren vorliegen (konventionelle und HPV-getriebene Karzinogenese) besteht für beide Patientengruppen die gängige Therapie aus Operation und/oder Radiotherapie ohne Unterschied. Es wird also keine zielgerichtete Therapie durchgeführt. Erhalten Patienten mit HNSCC-Tumoren eine Strahlentherapie, so ist die Prognose bei HPV-Assoziation erheblich besser als bei HNSCC-Tumoren, die durch konventionelle Noxen hervorgerufen wurden (Ang et al. 2010). Es ergibt sich die Frage, ob die HPV-getriebene Karzinogenese bei HNSCC ein prädikativer Faktor für die Strahlentherapie ist. Andere biologische Effekte, wie die Aktivierung des Immunsystems (Tobita et al. 2010), könnten gleichsam für die gute Prognose der Patienten verantwortlich sein. Es liegen aktuell nur wenige experimentelle Studien zur Strahlensensitivität von HNSCC-Tumorzellen vor und die Ergebnisse sind widersprüchlich. So fanden Spanos et al. (2009), dass HPV-assoziierte HNSCC-Zelllinien radioresistenter seien, Nagel et al. (2013) konnten keinen Unterschied in der Strahlenresistenz HPV-positiver und HPV-negativer Zelllinien feststellen. Weiterhin existieren derzeit drei Veröffentlichungen, die eine erhöhte Strahlensensitivität HPV-positiver HNSCCZelllinien nachweisen konnten (Rieckmann et al. 2013; Gupta et al. 2009; Kimple et al. 2013). Die Aufdeckung einer möglichen erhöhten Strahlensensitivität HPV-assoziierter HNSCC-Zelllinien in vitro war Ziel dieser Arbeit. 4.1 Einfluss ionisierender Strahlung auf HNSCC-Tumorzelllinien 4.1.1 Strahlenempfindlichkeit Untersuchungen zum klonogenen Überleben HPV-positiver und -negativer Zelllinien zeigten, dass die HPV-positiven Zelllinien ein signifikant schlechteres Überleben nach Bestrahlung mit 2Gy als die HPV-negativen Zelllinien aufwiesen. Dies entspricht dem berichteten guten Gesamt-Überleben von Patienten mit HPV-assoziierten HNSCC nach Radiotherapie (Gillison et al. 2000). Gupta et al. (2009) und Rieckmann et al. (2013) fanden ebenfalls eine verstärkte Strahlenempfindlichkeit bei HPV-assoziierten HNSCC-Tumorzellen. In einer aktuellen Studie wurden alle derzeit verfügbaren HPVassoziierten Tumorzelllinien auf intrinsische Strahlensensitivität getestet (Kimple et al. 2013). Bei Zellen mit HPV-getriebener Karzinogenese wurde hier gleichfalls eine signifikant erhöhte Strahlensensitivität festgestellt. Diese Studien untermauern somit 65 das Ergebnis der hier gefundenen erhöhten Radiosensitivität HPV-assoziierter HNSCC-Tumorzelllinien. 4.1.2 Zellzyklus Die hohe Strahlensensitivität HPV-positiver Tumorzellen kann möglicherweise durch eine veränderte Zellzyklus-Progression nach Exposition mit ionisierender Strahlung erklärt werden. Gesunde Zellen reagieren auf Bestrahlung mit einem Zellzyklusarrest in der G1-Phase, der die Reparatur geschädigter DNA vor der nächsten Mitose gewährleistet. Tumorzellen können dagegen trotz geschädigter DNA keinen G1-Arrest durchführen, meistens bedingt durch Mutationen im Tumorsuppressor-Protein p53, das u. a. für die DNA-Schadenserkennung verantwortlich ist (Dahm-Daphi 2000). In HPVpositiven HNSCC-Tumorzellen liegt das p53-Protein zwar in WT-Form vor (Andl et al. 1998; Gillison et al. 2000; Hafkamp et al. 2003; Wiest et al. 2002), wird jedoch durch das virale E6-Protein inhibiert, weshalb auch in HPV-positiven HNSCC-Tumorzellen trotz DNA-Schaden möglicherweise kein G1-Arrest durchgeführt wird. Durch den ausbleibenden G1-Arrest erfolgt in Tumorzellen vermutlich eine Zellzyklus-Progression, die in die Mitose mündet, ohne dass die Zellen die Möglichkeit zur DNASchadensreparatur hatten. Um nach der DNA-Synthese die Zellteilung einleiten zu können, vollziehen die Zellen weiterhin einen G2-Checkpoint, bei dem wiederum eine DNA-Schadenskontrolle durchgeführt wird. Beschädigte DNA führt hier erneut zu einem Zellzyklus-Arrest in der G2-Phase. Die untersuchten HPV-positiven Zelllinien reagieren auf Bestrahlung mit einem verstärkten und zeitlich länger andauernden G2Arrest im Vergleich zu den HPV-negativen Zelllinien. Die DNA-Synthese in HPVpositiven Tumorzellen scheint somit auch nach strahleninduziertem DNA-Schaden nicht angehalten zu werden und führt zur Akkumulation fehlerhafter DNA. Auf irreparable DNA-Schäden reagieren gesunde Zellen mit der Induktion von Apoptose. Dabei spielen Regulator-Proteine wie p53 und Rb eine zentrale Rolle. Der mitotische Zelltod ist eine weitere Form der Apoptose, bei der Zellen mit akkumulierten DNASchäden während der Mitose zerstört werden. Gleichzeitig kann die Induktion von Zelltod auch über vielfältige biologische Effekte wie beispielsweise die Freisetzung von mitochondrialen Cytochrom C als Mediatoren der Apoptose-Induktion nach Bestrahlung herbeiführt werden. Bei bestrahlten HPV-positiven Tumorzellen wurden vermehrt Zellen mit DNAFragmenten (SubG1-Phase) nachgewiesen, was auf eine gesteigerte Apoptose-Rate hinweist. Da diese subG1-Zell-Fraktion in HPV-positiven Zellen jedoch erst ca. 28h nach Bestrahlung gemessen wurde, scheint ein sekundärer Effekt vorzuliegen, der 66 nicht direkt durch die Bestrahlung hervorgerufen wurde. Diese Beobachtung untermauern Rieckmann et al. (2013) durch die Hypothese, es existiere kein direkter Zusammenhang zwischen Bestrahlung und Strahleninduzierter Apoptose. Andererseits könnten die unterschiedlichen experimentellen Methoden wie die Colcemid-basierte Durchflusszytometrie ausschlaggebend für die abweichenden Ergebnisse und die daraus resultierende These sein. Konträr zu Rieckmann et al. (2013) beobachteten Kimple et al. (2013) eine gesteigerte Apoptose-Aktivität in bestrahlten HPV-positiven Zellen, was die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit unterstützt. Die ungebremste Zellzyklus-Progression kombiniert mit der Anhäufung fragmentierter DNA korrelieren daher möglicherweise mit dem guten Ansprechen von Radiotherapie bei Patienten mit HNSCC- und HPV-getriebener Karzinogenese. Diese Empfindlichkeit der Zellen kann am ehesten erklärt werden durch das Auftreten mitotischen Zelltodes, bedingt durch die fortlaufende Zellzyklus-Progression und Akkumulation von DNASchäden. 4.1.3 Markerproteine bei der primären Strahlenantwort Die molekulare Grundlage einer erhöhten Strahlensensitivität von Patienten mit HNSCC-Tumoren, bedingt durch HPV-getriebene Karzinogenese, ist bislang nicht hinreichend bekannt. Daher wurde die Expression von denjenigen Proteinen nach Bestrahlung untersucht, welchen eine entscheidende Rolle bei der primären Strahlenantwort zugeschrieben wird. Das Tumorsuppressor-Protein p16INK4A ist an der Zellzyklus-Regulation beteiligt, indem er bei DNA-Schaden die Phosphorylierung von Rb durch die Cyclin-abhängige Kinasen 4 und 6 inhibiert. In HPV-positiven Zellen bewirkt die E7-vermittelte Rb-Inhibierung durch den fehlenden Rückkopplungs-Mechanismus eine Akkumulation von p16Proteinen (Sano et al. 1998). In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass sich die Protein-Expression von p16INK4A durch Bestrahlung nicht wesentlich verändert. Ionisierende Strahlung bewirkt zwar bei Mäusen einen Anstieg der p16-Expression in hämatopoetischen Zellen (Wang et al. 2006), allerdings sind diese Zellen nicht mit den hier verwendeten HPV-positiven HNSCC-Tumorzellen vergleichbar. Somit bestätigt das Ergebnis dieser Arbeit lediglich den HPV-Status der untersuchten Zelllinien. Das Tumorsuppressor-Protein Rb bewirkt durch die Freisetzung des Transkriptionsfaktors E2F die Aktivierung der S-Phase-Gene und so die Zellzyklus- 67 Progression. Voraussetzung dafür sind Phosphorylierungen von Rb im Laufe des Zellzyklus (Buchkovich et al. 1989). Bestrahlung bewirkt dagegen eine Inhibierung der Rb-Phosphorylierung. In HPV-positiven Zellen wird Rb durch das virale E7Onkoprotein inhibiert und für den Abbau markiert (Dyson 1998; Münger et al. 2001; Boyer et al. 1996). In der vorliegenden Arbeit konnte 24h nach Bestrahlung in HPVpositiven Zelllinien ein stärkeres Rb-Proteinsignal als in unbestrahlten Zellen detektiert werden. Dieses Ergebnis deutet darauf hin, dass Rb in HPV-positiven HNSCCZelllinien reduziert exprimiert wird und nach Bestrahlung aufgrund des kontinuierlichen Abbaus durch das HPV-E7-Onkoprotein (Dyson 1998; Münger et al. 2001; Boyer et al. 1996) den Zellzyklus nicht arretieren kann. Insofern untermauern die Ergebnisse der Rb-Protein-Expression die Zellzyklus-Analysen der HPV-positiven HNSCC-Zelllinien. Im Gegensatz dazu postulieren Lindel et al. (2012) bei bestrahlten HPV-positiven Zellen eine verminderte Rb-Proteinexpression und begründen diese mit der Regulation durch das virale E2-Gen. Nach Integration der HPV-DNA in das Wirtsgenom wird das E2-Gen deletiert und infolgedessen die viralen Onkoproteine E6 und E7 verstärkt exprimiert (Olthof et al. 2012). In allen HPV-positiven Zelllinien, die im Rahmen dieser Arbeit verwendet wurden, ist die HPV-DNA in das zelluläre Genom integriert (interne Kommunikation mit Olthof, N.; Huebbers, C.), sodass wahrscheinlich in jeder Zelllinie ein komplett oder teilweise deletiertes E2-Gen vorliegt. Die gefundene Veränderung des Rb-Proteinsignals nach Bestrahlung widerspricht somit der Hypothese von Lindel et al. (2012) laut der bestrahlte HPV-positive Zellen mit integrierter DNA verstärkt HPVE7-Protein exprimieren und somit die Rb-Proteinexpression vermindert wird. Da die Autoren jedoch ausschließlich Zellen mit episomal bzw. integriertem HPV-Genom untersuchten, kann die Beteiligung von HPV an der Strahlensensitivität von Tumoren mit HPV-getriebener Karzinogenese nicht näher definiert werden. Es fehlen sowohl Untersuchungen mit bestrahlten, gesunden Keratinozyten, sowie mit bestrahlten HNSCC-Tumorzellen ohne HPV-Assoziation. Das Tumorsuppressor-Protein p53 übernimmt in seiner Funktion als Transkriptionsfaktor die Regulation von Apoptose-Induktion, Zellzyklus-Arrest und Wachstumskontrolle, sowie DNA-Reparatur und Replikation. Nach Strahleninduziertem DNA-Schaden erfolgt die Aktivierung des p53-Proteins in Form von Phosphorylierungen (Banin et al. 1998). In HPV-positiven Tumorzellen wird p53 allerdings durch HPV-E6 inhibiert und zum Abbau markiert (Scheffner et al. 1990; Werness et al. 1990), wobei die Beteiligung von HPV an der Strahlensensitivität HPVassoziierter Tumoren kontrovers diskutiert wird. In den HPV-negativen Zelllinien konnte 24h nach Bestrahlung UM-SCC11b und UT-SCC33, sowie in der HPV-positiven VU- 68 147T ein p53-Signal detektiert werden. Das Fehlen eines p53-Proteinsignals bei der HPV-negativen Zelllinie UD-SCC1 ist am ehesten auf experimentelle Bedingungen zurückzuführen. Am Standort Marburg erfolgt der Proteinnachweis mit veränderten Puffersystemen und einer anderen Western Blot Membran (Arenz et al. 2014). In den HPV-positiven Zelllinien UM-SCC47, UM-SCC104 und UPCI:SCC152 ist 24h nach 6Gy kaum p53-Protein nachweisbar. Die HPV-positive Zelllinie VU-147T verfügt sowohl über ein WT-p53- und als auch ein mutiertes p53-Gen, weshalb das p53-Proteinsignal wahrscheinlich durch Aggregation von mutiertem p53-Protein entstand, da WT-p53 der Degradation von E6 unterworfen ist. Bestrahlung bewirkt jedoch bereits 0,5h später in den HPV-positiven Zelllinien UM-SCC47 und VU-147T, sowie den HPV-negativen Zelllinien UM-SCC11b und UT-SCC33 eine messbare Aktivierung von p53 in Form von Phosphorylierung an Serin15. Diese Aktivierung nimmt in den HPV-positiven Zelllinien über die Zeit ab, folglich ist 24h nach Bestrahlung fast kein Phospho-p53-Protein mehr nachzuweisen. Das starke und lang anhaltende phospho p53-Signal der HPV-positiven Zelllinie VU-147T widerspricht zwar der Theorie, dass das onkogene E6 die Degradation des Tumorsuppressors p53 herbeiführt (Scheffner et al. 1990; Werness et al. 1990). Es scheint jedoch eine p53-vermittelte Strahlenantwort in den HPV-positiven Tumorzellen zu erfolgen, die zeitabhängig durchgeführt wird. Im Gegensatz dazu postulieren Ahmed et al. (2009) eine ATM-vermittelte (Ataxia telangiectasia mutated kinase) Strahlenantwort in humanen Keratinozyten, die bereits 0,5h nach nur 1Gy aktiviert wird. Leider überprüften die Autoren die p53-Expression weder auf RNA noch Proteinebene, sodass ein Vergleich mit der p53-abhängigen primären Strahlenantwort nicht hergestellt werden kann. In wie weit die im Rahmen der vorliegenden Arbeit gefundene Aktivierung der HPVnegativen Tumorzellen auf die p53-Funktionalität aufgrund der postulierten Mutationen schließen lässt kann hier nicht abschließend geklärt werden. Im Vergleich zu HNSCCZellen mit p53-Mutation konnten Niemantsverdriet et al. (2005) bei Zellen mit konditioneller Überexpression von p53 zeigen, dass diese Zellen nach Bestrahlung einen Zellzyklus-Arrest-Shift von G1 zu G2 durchführen. Dies bekräftigt sowohl den in dieser Arbeit gefundenen strahleninduzierten G2-Arrest HPV-positiver und den G1Arrest HPV-negativer Zellen, als auch die These einer p53-abhängigen Strahlenantwort, die in HPV-positiven Zelllinien zum erhöhten Zellsterben führen könnte. Zusammenfassend konnte gezeigt werden, dass ionisierende Strahlung die Rb- und p53-Proteinexpression unterschiedlich beeinflusst. Der länger andauernde G2-Arrest 69 und die verspätete Akkumulation von HPV-positiven Zellen mit DNA-Fragmenten weisen zusammen mit den Western Blot Ergebnissen darauf hin, dass die erhöhte Strahlensensitivität HPV-positiver HNSCC-Tumorzellen durch p53-unabhängige Formen des Zellsterbens zustande kommen könnte. Einen solchen p53-unabhängigen Weg beschrieben bereits Patel et al. (2000) als Schlussfolgerung auf die gefundene verstärkte Apoptose-Rate 96h nach Bestrahlung in p53-defizienten im Vergleich zu bestrahlten WT-p53 HNSCC-Tumorzellen. Einerseits stärkt die tendenziell schwache und uneinheitliche Reaktion auf Protein-Ebene in bestrahlten HPV-positiven Zellen den Verdacht eines p53- und Rb-unabhängigen Signalwegs. Andererseits sichern sowohl p53 als auch Rb in ihrer antiapoptotischen Funktion das Zellüberleben und sorgen primär für DNA-Reparatur. Es liegt der Verdacht nahe, dass andere Proteine wie beispielsweise ATM bei Ahmed et al. (2009) die Strahlensensitivität bei Tumoren bedingen, die durch HPV-getriebene Karzinogenese entstanden. Die verspätete SubG1-Phasen-Akkumulation könnte als Hinweis auf mitotischen Zelltod aufgrund von chromosomalen Aberrationen gelten und somit entgegen der p53-vermittelten Apoptose stehen. 4.2 Einfluss ionisierender Strahlung auf virale Onkoproteine In wie weit ionisierende Strahlung einen Einfluss auf die Genexpression von HPV16-E6 und -E7 hat ist weitestgehend unbekannt. Daher wurde die mRNA-Expression dieser Gene in den HPV-positiven Zelllinien untersucht. Es zeigte sich, dass die Mehrheit der Zelllinien 6h nach Bestrahlung eine um 40% verminderte E6- und E7-mRNAExpression aufwies. Durch Bestrahlung scheinen also die Onkogene E6 und E7 insofern beeinflusst zu werden, als dass ionisierende Strahlung möglicherweise die Transkription hemmt. Die Zelllinie VU-147T stellt eine Ausnahme dar, denn sie weist 6h nach Bestrahlung einen gesteigerten E6- und E7-mRNA-Gehalt auf. Dies könnte mit der verstärkt exprimierten E6-Splice-Variante E6*I zusammenhängen (Steenbergen et al. 1995). Es existieren Hinweise, dass das E6*I-Variantenprotein das E6-Protein binden und so die E6-vermittelte p53-Degradation inhibieren kann (Pim et al. 1997). Weiterhin wird vermutet, dass die Variante E6*I über Promotor-Aktivierung die Transkription von E6und E7 bewirkt (Shirasawa et al. 1994). In einer jüngeren Studie konnte über stabile Transfektion mit der E6-Splice-Variante E6*I eine verstärkte Strahlensensitivität im Vergleich zum normalen E6-Transkript nachgewiesen werden (Pang et al. 2011). Außerdem postulieren Pang et al. (2011), dass die Isoform E6*I (im Gegensatz zum 70 vollständigen E6-Transkript) keinen Effekt auf WT-p53 hat. Diese These bekräftigt die in der vorliegenden Arbeit gefundene p53-Aktivierung 24h nach Bestrahlung, während die anderen HPV-positiven Zelllinien zu diesem Zeitpunkt bereits kein phosphoryliertes p53 mehr aufwiesen. Anhand der in der vorliegenden Arbeit verwendeten E6-PCRPrimer (Abschnitt 2.4) kann allerdings nicht unterschieden werden, ob es sich beim entstandenen E6-PCR-Produkt um die E6*I Splice-Variante oder das vollständige E6Transkript handelt. Deshalb bleibt unklar, ob die gesteigerte E6-Expressions bei VU147T durch die amplifizierte E6*I-Splice-Variante oder durch einen Bestrahlungseffekt entstand. Aufgrund der E6- und E7-Expressionsminderung aller anderen HPVpositiven Zelllinien ist jedoch ein E6-Splice-Varianten-Amplifikat wahrscheinlich. Weiterhin wurden in den HPV-positiven Zelllinien die E6- und E7-Genbereiche auf Sequenzmodifikationen überprüft. Zwar weisen die meisten HPV-positiven Zelllinien Modifikationen auf, diese wurden aber als HPV16-Varianten identifiziert, die in der Referenz-Datenbank bereits beschrieben sind. Wie auch bei der E6- und E7Genexpression zeigte eine Zelllinie ein anderes Sequenzierungs-Ergebnis: Die Zelllinie VU-147T verfügt über E6- und E7-Genbereiche, die keine Sequenzmodifikationen aufweisen und mit der Referenzsequenz (NCBI-Datenbank, Identifikationsnummer NC_001526.2 (Kennedy et al. 1991)) übereinstimmen. Folglich können selbst HPV16Genomvarianten mit Sequenzmodifikationen in humanen Zellen eine Karzinogenese herbeiführen. In wie weit die HPV16-Genomvarianten Onkoproteine bilden, die in ihrer Funktion den Proteinen der HPV16-Referenzsequenz gleichen, ist jedoch nicht klar. Experimentelle Studien belegen, dass die Onkogene E6 und E7 je nach Variante in unterschiedlichen Mengen exprimiert werden und auch die p53-Degradations-Aktivität der einzelnen Varianten unterschiedlich ist (Mesplède et al. 2012; Foster et al. 1994; Stöppler et al. 1996). Die Vermutung, dass das in den Zellen enthaltene HPV16Genom das p53-Protein-Signal beeinflusst, liegt nahe. Zusammengefasst konnte gezeigt werden, dass die meisten HPV-positiven Zelllinien nach Exposition mit ionisierender Strahlung die Genexpression der Onkogene E6 und E7 vermindern. Allerdings liegen selbst innerhalb der Entität der HPV-positiven Zelllinien Unterschiede in Bezug auf E6- und E7-Genexpression sowie die HPV16Genomsequenz vor. Ob ein Zusammenhang zwischen den gefundenen SequenzModifikationen, den unterschiedlichen Protein-Signalen und dem Ansprechen auf Bestrahlung besteht, kann hier nicht geklärt werden. 71 4.3 Einfluss ionisierender Strahlung auf die p53-abhängige Genexpression Der Tumorsuppressor p53 spielt eine zentrale Rolle bei der primären, zellulären Strahlenantwort. In der Mehrheit der HNSCC-Tumoren liegen Mutationen oder Deletionen im p53-Genbereich vor (Dahm-Daphi 2000), wohingegen HNSCC-Tumore, deren Karzinogenese durch HPV getrieben ist, meist über ein WT-p53-Gen verfügen (Andl et al. 1998; Gillison et al. 2000; Hafkamp et al. 2003; Wiest et al. 2002). Dies wird jedoch durch das virale Onkoprotein E6 inhibiert und zum Abbau markiert (Scheffner et al. 1990; Werness et al. 1990), wobei eine Beteiligung von HPV an der Strahlensensitivität HPV-positiver HNSCC-Tumoren kontrovers diskutiert wird. Daher wurde die Expression von p53-regulierten Genen in bestrahlten HPV-positiven Zellen untersucht und mit der Expression der HPV-negativen Zellen verglichen. Die Gene gelten als verändert reguliert, wenn die Expressionsänderung (2-ΔΔCT) (Livak und Schmittgen 2001) den gewählten „cut off“ (<0,66 bzw. >1,5) unter- bzw. überschreiten. Insgesamt werden die analysierten Gene allerdings größtenteils schwach exprimiert, weshalb eine detektierte Expressionsänderung bei geringen mRNA-Mengen als sehr sensitiv angesehen wird. Drei Gene werden nach Bestrahlung mit 6Gy im Verhältnis stärker verändert exprimiert: Das Gen BIRC5, welches für das antiapoptotische Protein Survivin kodiert, das Gen CCNB1, welches für das Protein Cyclin B1 kodiert, und das Gen CDC25C, welches für das gleichnamige Protein cdc25c (Cell Devision Cycle 25C) kodiert. Das Gen BIRC5 wird nach p53-Induktion durch Bestrahlung vermindert (Stauber et al. 2007; Hoffman et al. 2002). Es kodiert für das Protein Survivin, das einerseits an der Chromosomen-Segregation während der Zytokinese, andererseits bei der Inhibierung der Caspase-9 beteiligt ist. In allen HPV-positiven Zelllinien wird das Gen BIRC5 nach Bestrahlung vermindert exprimiert, in den HPV-negativen Zellen bleibt es unverändert. Diese BIRC5-mRNA-Minderung der HPV-positiven Tumorzellen bekräftigt sowohl ihren strahleninduzierten, länger andauernden G2-Arrest als auch ihre p53-Aktivierung und kann als Indiz für eine p53-abhängige Strahlenantwort geltend gemacht werden. Diese These wird durch eine Studie von Hoffman et al. (2002) untermauert, bei der nicht nur die Bindung von p53 in vivo an die Survivin-Promotor-Region gezeigt wurde, sondern auch die Verminderung der BIRC5-mRNA nach p53-Induktion detektiert wurde. Im Gegensatz dazu postulieren Preuss et al. (2008), dass die Expression von SurvivinProtein unabhängig von der HPV-getriebenen Karzinogenese abläuft und folglich auch p53-unabhängig ist. Da der Nachweis von Survivin in dieser Studie jedoch ausschließlich über Formalin-fixiertes, in Paraffin eingebettetes Gewebe und über 72 immunhistochemische Färbung erfolgte, ist eine Vergleichbarkeit mit der mRNAExpression der vorliegenden Arbeit – isoliert aus frischem Zellmaterial – nicht gegeben. Das Gen CCNB1 kodiert für das Protein Cyclin B1, das die Zellzyklus-Progression während der späten G2- und M-Phase fördert. Nach strahleninduziertem DNASchaden wird die Genexpression von CCNB1 vermindert (Badie et al. 2000). In allen getesteten HNSCC-Zelllinien ist nach Bestrahlung die mRNA-Expression des CCNB1Gens vermindert. Da das kodierte Protein Cyclin B1 für die G2-M-Phasen-Progression benötigt wird, entspricht die CCNB1-mRNA-Minderung der HPV-negativen Zellen dem gefundenen strahleninduzierten G1-Arrest. Da diese Zellen jedoch nur mutiertes p53Protein exprimieren muss eine weitere p53-unabhängige Cyclin B1-Regulation vorliegen. Chen et al. (2002) fanden in mit HPV18 immortalisierten humanen Keratinozyten (HK18) eine p53-unabhängige Strahlenantwort, vermittelt durch NFκB (nuclear factor kappa B). Die Autoren postulieren, dass unter anderem CCNB1 transkriptionell durch NFκB reguliert werde. Anders als nach einmaliger Bestrahlung mit 6Gy detektieren Chen et al. (2002) nach fraktionierter Bestrahlung allerdings eine gesteigerte mRNA-Expression in bestrahlten, immortalisierten Keratinozyten. In HPV18-positiven HeLa-Zellen (Zervix-Karzinom) konnten Santana et al. (2002) durch die Transfektion mit onkogenem H-Ras-Protein eine gesteigerte, CCNB1-mRNAExpression feststellen. Sowohl bei Chen et al. (2002) als auch bei Santana et al. (2002) wurde die CCNB1-mRNA-Expression p53-unabhängig gesteuert. Obwohl in beiden Studien eine CCNB1-Expressions-Minderung detektiert wurde verfügen die von Chen et al. (2002), Santana et al. (2002), wie auch die hier verwendeten HPV-positiven Zelllinien über WT-p53. Somit bleibt die Frage nach einer p53-abhängigen Strahlenantwort, die möglicherweise verspätet angetrieben wird, bestehen. Das Gen CDC25C kodiert für das Protein cdc25c, welches als Phosphatase die strahleninduzierte Expression von p53 vermindert und nach Strahleninduziertem DNASchaden reprimiert (Badie et al. 2000). In den untersuchten HPV-positiven Zelllinien UM-SCC47 und UPCI:SCC152, sowie in der HPV-negativen Zelllinie wird nach Bestrahlung die CDC25C-Expression vermindert. Da CDC25C durch die sequenzspezifische p53-Bindung an die CDC25C-Promotor-Region reprimiert wird (St Clair et al. 2004) stützt die CDC25C-mRNA-Minderung in den HPV-positiven Zelllinien die gefundene Strahleninduzierte p53-Aktivierung. Die unveränderte CDC25CExpression in der HPV-positiven Zelllinie VU-147T könnte auf das mutierte p53-Allel zurückgeführt werden. Dieses ruft möglicherweise eine veränderte Transkription hervor. Die gefundene CDC25C-RNA-Minderung der bestrahlen HPV-negativen UT- 73 SCC33 Zellen lässt jedoch vermuten, dass es noch einen weiteren p53-unabhängigen Weg zur Expressionskontrolle gibt. Insgesamt verdeutlichen die Ergebnisse der p53 Signaling Array-Analyse, dass in Abhängigkeit vom gewählten „cut off“ nach Bestrahlung sechs Gene (BCL2A1, FAS, PRC1, RPRM, TNF und TP73) in HPV-positiven und vier Gene (BCL2A1, BIRC5, PRC1, TNF) in HPV-negativen Zelllinien anders als erwartet reguliert werden. Diese Gene leiten in gesunden Zellen entweder den p53-abhängigen Zellzyklus-Arrest oder die p53-abhängige Apoptose ein. Da in beiden Entitäten diese Gene verändert exprimiert werden wird der Verdacht von p53-unabhängigen Mechanismen, die nach DNA-Schaden aktiviert werden, bestärkt. In der Literatur wird diese These kontrovers diskutiert: Koike et al. (2005) zeigten beispielsweise in einer Genexpressions-Analyse mit bestrahlten, gesunden Keratinozyten, dass die primäre Strahlenantwort nicht von p53 gesteuert wird. Dagegen fanden Warters et al. (2009) in primären humanen Keratinozyten nach Bestrahlung hauptsächlich p53-abhängige, transkriptionelle Zielgene als verändert exprimiert. Weitere Genexpressions-Analysen mit bestrahlten gesunden Keratinozyten sowie Zellen mit siRNA-vermitteltem p53-Knockdown sind erforderlich, um den Einfluss von p53 bei der Strahlenantwort zu definieren. Andere biologische Mechanismen wie beispielsweise die Hochregulation von Entzündungsfaktoren (z. B. Zytokine) sind bei der Strahlenantwort denkbar und könnten entscheidenden Einfluss auf zelluläres Überleben nach Bestrahlung haben (Tobita et al. 2010). 4.4 Ausblick Bestrahlung vermindert das klonogene Überleben HPV-positiver HNSCC- Tumorzelllinien signifikant im Vergleich zu HNSCC-Tumorzellen ohne HPV-getriebene Karzinogenese. Gleichzeitig wurden bei dieser Entität verstärkt Zellen mit DNAFragmenten sowie ein ausbleibender G1-Phasen-Arrest nach Bestrahlung festgestellt. Welche molekularen Ursachen die höhere Strahlensensitivität HPV-positiver HNSCCTumorzellen bedingen kann hier nicht abschließend dargelegt werden. Ein Hinweis auf die Beteiligung des p53-Proteins bei der primären Strahlenantwort ist durch dessen Aktivierung in Form der Phosphorylierung am Serinrest 15 gegeben, wobei die strahleninduzierte Aktivierung noch eine weitere Phosphorylierung an Serin20 bewirkt, die im Rahmen dieser Arbeit nicht untersucht wurde. Die These des kompletten p53Abbaus durch das virale E6-Protein könnte weiterhin durch einen fehlerhaften oder funktionslosen Abbau-Komplex entkräftet werden. In manchen HPV-assoziierten 74 Tumoren könnte das E6-AP-Protein nicht vorhanden bzw. funktionsuntüchtig sein und mit dem viralen E6-Protein nicht komplexieren (Talis et al. 1998; Huibregtse et al. 1991). Über Western Blot Experimente sowie Co-Immunpräzipitationen mit E6 und p53 könnte diese Hypothese bei den hier verwendeten Zelllinien näher analysiert werden. Gleichzeitig gäbe der Nachweis von E6 und E7-Protein über Western Blots Aufschluss über den postulierten p53- und Rb-Abbau in HPV-positiven Zellen. Die Überprüfung der mRNA- und Protein-Expression der E6*I Splice Variante in der Zelllinie VU-147T könnte ebenfalls wichtige Informationen über den postulierten Abbau des viralen E6Proteins durch E6*I liefern (Steenbergen et al. 1995). Die in der vorliegenden Arbeit gefundene, verstärkte Rb-Proteinexpression nach Bestrahlung könnte auf eine unzureichende Bindung des viralen HPV16E7 hindeuten. Ob es sich bei der Steigerung der Rb-Proteinexpression tatsächlich um eine Aktivierung handelt, kann durch Co-Immunpräzipitation von Rb mit dem Transkriptionsfaktor E2F untersucht werden. Zellfraktionierung mit anschließender Western Blot Analyse von bestrahlten HPV-positiven Tumorzellen kann weiterhin Aufschluss über die Lokalisation von E2F und dessen transkriptionelle Aktivität geben. Generell gibt es bei den in dieser Arbeit verwendeten HNSCC-Tumorzelllinien keine Informationen bezüglich eventueller Mutationen im Rb-Gen und -Protein. Somit würden Sequenzierung von Gen und Protein hilfreiche Antworten zum detektierten RbProteinsignal liefern. Neben den hier untersuchten Proteinen ist beispielsweise das ATM-Protein an der DNA-Schadenserkennung beteiligt (Mirzayans et al. 2012). Experimente zur ATMAktivierung in gesunden Keratinozyten, p53-defizienten (HPV-negativen HNSCCTumorzellen) und p53-WT-Zellen (HPV-positive HNSCC-Tumorzellen) könnten somit Hinweise für eine mögliche p53-unabhängige Strahlenantwort geben, zumal Ahmed et al. (2009) bereits eine ATM-Aktivierung in HPV18-positiven Keratinozyten nachweisen konnten. Inwieweit p53-unabhängige Signalwege in der Zelllinie VU-147T durch viralen Einfluss zur Hochregulation von p53 (ohne Bestrahlung) führen, bleibt indes noch ungeklärt. Zur Überprüfung der Ergebnisse des Human p53 Signaling Pathway RT2 Profiler PCR Arrays sollten einerseits gesunde Keratinozyten, andererseits Zelllinien mit p53unabhängiger Onkogenese – wie beispielsweise Zellen aus hämatopoetischen Stammzellen, die CML (chronische myeloischer Leukämie) verursachen – nach Bestrahlung untersucht werden. So könnte die These der p53-unabhängigen, 75 veränderten Genexpression nach Bestrahlung in den untersuchten HNSCC- Tumorzelllinien untersucht werden. Klinisch könnte der Ansatz, das Immunsystem als Therapiemodalität in Kombination mit Radiation mit einzubeziehen (Tobita et al. 2010), künftig einen wichtigen Schritt hin zur effektiveren Tumortherapie sein, nicht nur bei HPV-assoziierten HNSCC-Tumoren. 76 5 Zusammenfassung Die gängige, klinische Therapie bei HNSCC-Tumoren erfolgt derzeit mittels radikaler Resektion und adjuvanter Radio- und/oder Chemotherapie. Noxen-assoziierte HNSCCTumore stellen allerdings eine distinkte Entität im Vergleich zu HNSCC-Tumoren mit HPV-getriebener Karzinogenese dar, wenngleich die Patienten mit HPV-Assoziation ein besseres Gesamtüberleben aufweisen. Ob alleinige Radiotherapie bzw. Radiochemotherapie den gleichen Therapieerfolg wie Resektion mit anschließender Radio-Chemotherapie bringen würde ist derzeit nicht bekannt. Aus diesem Grund wurden in der vorliegenden Arbeit HNSCC-Tumorzellen mit und ohne HPV-Assoziation in vitro bestrahlt und anschließend molekularbiologisch anhand von ZellzyklusAnalysen, Protein- und mRNA-Expression untersucht. Des Weiteren wurde die Expression der viralen Onkogene E6 und E7 in den HPV-positiven Tumorzelllinien nach Bestrahlung analysiert. Die bessere Prognose bei Patienten mit Tumoren aus HPV-getriebener Karzinogenese wird durch eine erhöhte Strahlensensitivität begründet, was das gefundene, signifikant verminderte Überleben HPV-positiver HNSCC-Tumorzelllinien erklären könnte (p=0,01) (Arenz et al. 2014). In vitro reagieren die bestrahlten HPV-positiven Tumorzelllinien verstärkt mit einem zeitlich länger andauernden G2-Arrest im Vergleich zu den HPV-negativen Zelllinien und akkumulieren DNA-Fragmente, die als Hinweis auf eine gesteigerte Apoptose-Rate gelten. Die zelluläre Expressions-Analyse der Marker-Proteine Retinoblastom und p53 zeigte, dass Bestrahlung zwar die Proteinexpression verändert, jedoch selbst innerhalb der Entitäten Unterschiede vorliegen. Die Überprüfung der p53-abhängigen Genprodukte zeigte, dass – unabhängig von der Entität – Gene reguliert werden, die einen strahleninduzierten Zellzyklus-Arrest oder Apoptose herbeiführen. Die Expression der viralen Onkoproteine E6 und E7 war außerdem in der Mehrheit der untersuchten HPV-positiven Tumorzelllinien nach Bestrahlung vermindert. Die klinische Heterogenität von HNSCC-Tumoren konnte im Rahmen dieser Arbeit bestätigt werden, wenngleich eine erhöhte Radiosensitivität HPV-positiver Tumorzelllinien vorliegt. Molekulare Mechanismen, die nach Bestrahlung das verstärkte Zellsterben herbeiführen und so das bessere Gesamtüberleben von Patienten mit HPV-assoziierten Tumoren sichern, werden wahrscheinlich p53unabhängig aktiviert. Vermutlich wird die veränderte virale Genexpression mit der Aktivierung verschiedener Zelltod-Mechanismen kombiniert. 77 6 Summary Currently, prevalent clinical treatment of head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) is resection with adjuvant radio- and/or chemotherapy. Noxa-induced HNSCC represent a distinct entity compared to HNSCC with a human papilloma virus (HPV) driven carcinogenesis, however patients with HPV association have a better overall survival. It is unknown whether exclusive radiotherapy reveals the same successful outcome as resection with adjuvant therapy. In the present work HNSCC tumor cell lines with and without HPV association have been irradiated in vitro and were subsequently molecular biologically analysed for cell cycle behavior, protein and mRNA expression. In addition, the expression of viral oncogenes E6 and E7 in HPVpositive tumor cell lines after irradiation has been tested. Improved prognosis of patients with HPV-driven HNSCC is correlated by higher radiation sensitivity, which was shown by the detected significant decrease of surviving HPV associated HNSCC tumor cell lines (p=0,01) (Arenz et al. 2014). In vitro irradiated HPV-positive tumor cell lines react with a prolonged G2 phase arrest compared to HPV-negative tumor cells, and HPV-positive cells accumulate DNA fragments, which indicate an increased apoptosis. Cellular expression analysis for marker proteins Retinoblastoma and p53 revealed that irradiation changes protein expression, however, differences within entities exist. Examination of p53-depending gene products demonstrated that genes independent of cellular entity have been regulated, which promote radiation induced cell cycle arrest or apoptosis. Besides expression of viral oncogenes E6 and E7 was reduced after irradiation in the majority of tested HPVpositive tumor cell lines. This work could confirm the clinical heterogenity of HNSCC, even though an increased radiation sensitivity of HPV-positive tumor cell lines exists. Molecular mechanisms, which cause the increased cell death after irradiation and therefore ensure the improved overall survival of patients with HPV-associated tumors, are most probably p53 independently activated. There is a strong likelihood that altered viral gene expression and activation of different cell death mechanisms act in combination. 78 7 Abkürzungsverzeichnis A Ampere ATG Startcodon auf mRNA, das für Protein kodiert ATP Adenosintriphosphat ATM Ataxia telangiectasia mutated kinase β beta BIRC5 Gen, das für das Protein Survivin kodiert BSA Rinderserum-Albumin (engl. Bovine serum albumine) °C Grad Zelsius CCNB1 Gen, das für das Protein Cyclin B1 kodiert CDC25C Gen und Protein (engl. Cell division Cycle 25 C) c Zenti cDNA komplementäre DNA (engl. Complementary DNA) CT Cycle Threshold Cu Kupfer D Dosis Δ Delta ddH2O Doppelt destilliertes Wasser DNA Desoyiribonuklein-Säure (engl. Deoxyribonucleic acid) dNTP Nukleosidtriphosphate EDTA Ethylendiamintetraacetat eV Elektronenvolt γ gamma Gy Gray h Stunde (engl. hour) HNSCC Kopf-Hals-Karzinome (engl. Head neck squamous cell carcinoma) HPV Humanes Papilloma Virus keV Kilo-Elektronenvolt µ Mikro MeV Mega-Elektronenvolt min Minute (engl. minute) n Nano NCBI National Center for Biotechnology Information NFκB Nuklear factor kappa B PBS phosphate buffered saline PCR Polymerase Kettenreaktion (engl. Polymerase chain reaction) 79 pm Piko pRbp Hyperphosphoryliertes Retinoblastomprotein pRb Hypophosphoryliertes Retinoblastomprotein qPCR Quantitative real time PCR Rb Retinoblastomprotein RIN RNA-Integritäts-Nummer RNA Ribonuklein-Säure (engl. Ribonucleic acid) SDS Sodium dodecylsulfat SF Überlebensfraktion (engl. Surviving fraction) SNP Single nucleotide polymorphism UV Ultraviolett WT Wildtyp γH2AX Phosphoryliertes Histon H2AX 80 8 Abbildungsverzeichnis Abbildung 1: Infektion mit HPV16 in mehrschichtigem Plattenepithel der Zervix uteri und der Tonsillenkrypte ................................................................................................ 2 Abbildung 2: HPV16-Genom ........................................................................................ 3 Abbildung 3: Integration des HPV16-Genoms .............................................................. 6 Abbildung 4: Zellzyklus-Phasen.................................................................................. 11 Abbildung 5: HPV-PCR .............................................................................................. 43 Abbildung 6: Überleben nach Bestrahlung ................................................................. 45 Abbildung 7: Verteilung der DNA-Gehalte der HPV-positiven Zelllinie UPCI:SCC152 und der HPV-negativen Zelllinie UM-SCC11b nach Bestrahlung mit 2Gy und 6Gy .... 46 Abbildung 8: Prozentuale Häufigkeits-Verteilung der DNA-Gehalte bestrahlter Zellen in den Zellzyklus-Phasen ............................................................................................... 47 Abbildung 9: Prozentuale Häufigkeitsverteilung der Zellen mit DNA-Fragmenten nach Bestrahlung (SubG1-Phase)....................................................................................... 48 Abbildung 10: p16INK4A-Protein-Expression in vier HPV-positiven und vier HPVnegativen Zelllinien 24h nach Bestrahlung mit 6Gy .................................................... 49 Abbildung 11: Rb-Protein-Expression in vier HPV-positiven und vier HPV-negativen Zelllinien 24h nach Bestrahlung mit 6Gy .................................................................... 50 Abbildung 12: Rb-Protein-Expression in vier HPV-positiven und zwei HPV-negativen Zelllinien zu verschiedenen Zeitpunkten nach Bestrahlung mit 6Gy ........................... 51 Abbildung 13: Protein-Expression von hyper- (pRbp) und hypo-phosphoryliertem Rb (pRb) in zwei HPV-positiven und einer HPV-negativen Zelllinie zu verschiedenen Zeitpunkten nach Bestrahlung mit 6Gy ....................................................................... 52 Abbildung 14: Protein-Expression von p53 und phosphoryliertem p53 an Serin15 in vier HPV-negativen und vier HPV-positiven Zelllinien 24h nach Bestrahlung mit 6Gy ....... 53 Abbildung 15: Protein-Expression von p53- und phospho- p53 in zwei HPV-positiven und zwei HPV-negativen Zelllinien zu verschiedenen Zeitpunkten nach Bestrahlung mit 6Gy ............................................................................................................................ 54 Abbildung 16: Relative E6- und E7-mRNA-Expressionsänderung nach Bestrahlung mit 6Gy ............................................................................................................................ 56 Abbildung 17: E6-Sequenzvergleich der Zelllinie UM-SCC47 mit der HPV16Referenzsequenz ....................................................................................................... 57 81 Abbildung 18: E7-Sequenzvergleich der Zelllinie UM-SCC47 mit der HPV16Referenzsequenz ....................................................................................................... 58 Abbildung 19: Sequenz-Vergleich von verschiedenen HPV16-Stämmen mit der Zelllinie UM-SCC47 und der HPV16-Referenzsequenz ........................................................... 60 9 Tabellenverzeichnis Tabelle 1: Zelllinien-Informationen .............................................................................. 22 Tabelle 2: Verdopplungszeiten ................................................................................... 44 Tabelle 3: mRNA-Expression von E6 und E7 in den HPV-positiven Zelllinien zu verschiedenen Zeitpunkten nach Bestrahlung mit 6Gy ............................................... 55 Tabelle 4: Basensequenz-Analyse der untersuchten HPV-E6 und E7-Gen-Regionen und Konsequenz für die Aminosäure-Sequenz. .......................................................... 59 Tabelle 5: Zusammenfassung des NCBI-Datenbank-Vergleichs mit den sequenzierten HPV-positiven Zelllinien.............................................................................................. 61 Tabelle 6: Gen-Expressions-Änderung auf p53 Signaling Array 4h nach Bestrahlung mit 6Gy in den HPV-negativen und -positiven Zelllinien.............................................. 63 Tabelle 7: Eigenschaften und Funktionen der Gene mit stark veränderter Expression in der p53 Signaling Array Analyse der HPV-negativen und -positiven Zelllinien. ........... 64 82 10 Literaturverzeichnis Ahmed, Kazi Mokim; Nantajit, Danupon; Fan, Ming; Murley, Jeffrey S.; Grdina, David J.; Li, Jian Jian (2009): Coactivation of ATM/ERK/NF-kappaB in the low-dose radiation-induced radioadaptive response in human skin keratinocytes. 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Alle Textstellen, die wörtlich oder sinngemäß aus veröffentlichten oder nichtveröffentlichten Schriften entnommen sind, und alle Angaben, die auf mündlichen Auskünften beruhen, sind als solche kenntlich gemacht. Bei den von mir durchgeführten und in der Dissertation erwähnten Untersuchungen habe ich die Grundsätze guter wissenschaftlicher Praxis, wie sie in der „Satzung der Justus-Liebig-Universität Gießen zur Sicherung guter wissenschaftlicher Praxis“ niedergelegt sind, eingehalten sowie ethische, datenschutzrechtliche und tierschutzrechtliche Grundsätze befolgt. Ich versichere, dass Dritte von mir weder unmittelbar noch mittelbar geldwerte Leistungen für Arbeiten erhalten haben, die im Zusammenhang mit dem Inhalt der vorgelegten Dissertation stehen, oder habe diese nachstehend spezifiziert. Die vorgelegte Arbeit wurde weder im Inland noch im Ausland in gleicher oder ähnlicher Form einer anderen Prüfungsbehörde zum Zweck einer Promotion oder eines anderen Prüfungsverfahrens vorgelegt. Alles aus anderen Quellen und von anderen Personen übernommene Material, das in der Arbeit verwendet wurde oder auf das direkt Bezug genommen wird, wurde als solches kenntlich gemacht. Insbesondere wurden alle Personen genannt, die direkt und indirekt an der Entstehung der vorliegenden Arbeit beteiligt waren. Mit der Überprüfung meiner Arbeit durch eine Plagiatserkennungssoftware bzw. ein internetbasiertes Softwareprogramm erkläre ich mich einverstanden. ______________________ ____________________________ Ort, Datum Unterschrift 94 13 Danksagung Für die Möglichkeit, diese Arbeit im HNO-Forschungslabor des Uniklinikums Gießen durchführen zu dürfen bedanke ich mich sehr herzlich bei Prof. Dr. Jens Peter Klußmann. Prof. Dr. Rita Engenhart-Cabillic spreche ich meinen Dank aus für die Ermöglichung der Durchführung der Bestrahlungsversuche im Labor der Klinik für Strahlentherapie und Radioonkologie, Phillips-Universität Marburg. Für die Bedienung der Röntgenröhre für Zellkulturexperimente im Biomedizinischen Forschungszentrum in Marburg, sowie deren Bereitstellung als Strahlenschutzbeauftragte danke ich Dr. Kristin Dreffke und Dr. Andrea Arenz. Weiterhin gilt mein Dank den Physikern Prof. Klemens Zink, Frank Ubrich, Enrico Dittrich und Ralf Hoffmann, die den Linearbeschleuniger in der Klinik für Strahlentherapie und Radioonkologie bedient haben, sowie die Dosimetrie erstellt und für jedes Experiment den Strahlenschutzbeauftragten gestellt haben. Besonders bedanke ich mich bei Prof. Dr. Claus Wittekindt und Dr. Steffen Wagner für die hervorragende Betreuung und die fortwährende Unterstützung bei Erstellung dieser Arbeit. Ebenso bei Dr. Andrea Arenz der Klinik für Strahlentherapie und Radioonkologie, Phillips-Universität Marburg für die Betreuung und praktischen Hilfeleistungen, die zum Gelingen dieser Arbeit beitrugen. Für die Korrektur dieser Arbeit danke ich Prof. Engenhart-Cabillic und Priv. Doz. Dr. Andrea Wittig aus der Klinik für Strahlentherapie und Radioonkologie herzlich. Maike Roth aus dem Gießener Forschungslabor trug durch ihre technischen Hilfestellungen, ihr stetes Engagement und nicht zuletzt durch ihre sehr gute Zusammenarbeit zum Gelingen dieser Arbeit bei. Stefanie Preising und Frank Ziemann förderten die Anfertigung dieser Arbeit ebenfalls durch vielseitige technische Unterstützung im Labor für Strahlentherapie am Standort Marburg. Den Ärztinnen Shachi Jenny Sharma und Dr. Claudia Holler danke ich für die gute Zusammenarbeit und technische Unterstützung im Forschungslabor in Gießen. Mein großer Dank gilt meiner Familie und insbesondere meinem Mann Markus, der mich zu jeder Zeit nach Kräften unterstützte und mir immer den nötigen Rückhalt gab. 95
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