Jahrestätigkeitsbericht2012/2013
Institut für Mikrobiologie der Bundeswehr
Institut für Mikrobiologie der Bundeswehr
Anschrift:
Institut für Mikrobiologie der Bundeswehr
Neuherbergstraße 11
80937 München
Tel.: 089 / 992692 - 3982
Fax: 089 / 992692 - 3983
AllFSpWNBw 6816
Email: [email protected]
Vorwort
Prof. Dr. Lothar Zöller, Oberstarzt
Leiter des Instituts für Mikrobiologie der Bundeswehr MÜNCHEN
Sehr geehrte Leserinnen und Leser,
die Jahresberichte 2012 und 2013 des Instituts für Mikrobiologie der Bundeswehr erscheinen zusammengefasst
in einem Band, in komprimierter Form und ausschließlich in einer Online-Version. Der Verzicht auf die gedruckte
Ausgabe wird heute zunehmend auch im Fachbuchhandel zum Standard - so könnte man es begründen.
Allerdings liegt der wahre Grund der Vereinfachung in einer Vielzahl von Aufgaben, die in den Jahren 2013 und
2014 auf das Institut einstürzten, so dass die Erstellung der Jahresberichte immer wieder nachrangig priorisiert
werden musste. Die vorliegenden Jahresberichte 2012 und 2013 dienen daher vorwiegend dokumentarischen
Zwecken und tragen der Absicht Rechnung, in der Jahresberichtfolge des Instituts für Mikrobiologie der
Bundeswehr keine Lücke entstehen zu lassen. Dies wäre auch schade, denn es gab in den beiden Jahren eine
Vielzahl von Aktivitäten, die die stetige und steile Weiterentwicklung des Instituts verdeutlichen. So ging zum
Beispiel im Jahr 2012 endlich die institutseigene Homepage ans Netz, womit eine Forderung des Wissenschaftsrats aus dem Jahre 2007 erfüllt wurde. Ebenfalls im Jahr 2012 erreichte das Institut einen weiteren bedeutenden
Meilenstein, als das gesamte Leistungsspektrum des Instituts durch die Deutsche Akkreditierungsstelle nach
DIN EN ISO 15189 flexibel akkreditiert wurde. Damit war das Institut die einzige Einrichtung in Deutschland mit
einem vollakkreditierten umfassenden Leistungsspektrum im Bereich der Diagnostik von Infektionskrankheiten
durch hochpathogene Erreger. Anfang 2013 wurde durch den Abschluss eines Kooperationsvertrages mit der
Technischen Universität München die Vernetzung des Instituts am Standort institutionalisiert. Ende 2012
veranstaltete das Institut einen Workshop des Netzwerks Nagetier-übertragene Pathogene und im Herbst 2013
stand die Medical Biodefense Conference an, die mit 500 Teilnehmern aus 39 Nationen erneut alle Rekorde
brach. Ende 2013 übernahm das Institut auf Weisung des Bundesverteidigungsministeriums im Rahmen des
Biosicherheitsprogramms des Auswärtigen Amtes die Projektleitung bei Biosicherheitsprojekten in Kasachstan,
Georgien und Tansania. Dies brachte einen erneuten kräftigen Zuwachs bei der ohnedies durch weitere
Drittmittelprojekte bereits deutlich angestiegenen Mitarbeiterzahl des Instituts. Dies sind nur einige der Highlights
aus den Jahren 2012 und 2013, weitere finden sich in dieser Dokumentation.
Es bleibt festzuhalten, dass sich das Institut im Hinblick auf seine Außenbeziehungen, seine wissenschaftliche
Vernetzung, seinen Anteil an Drittmittelprojekten, seine innere Struktur und sein Leistungsspektrum planmäßig
weiterentwickelt hat und auf dem Gebiet des medizinischen B-Schutzes, aber auch im Bereich der natürlichen
Infektionen durch hochpathogene Erreger der Bundeswehr Urteils- und Handlungsfähigkeit auf höchstem Niveau
sicherstellt.
Prof. Dr. Lothar Zöller
3
Inhaltsverzeichnis
Das IMB in den Jahren 2012 und 2013: Entwicklungen, Ereignisse, Fakten
Am Ziel: Akkreditierung des Zentralbereichs Diagnostik
8
Qualitätsmanagement-Bericht
10
Forschungsallianz mit der Technischen Universität München
11
Forschung und Lehre Hand in Hand
12
Fest eingeplant: Drittmittelforschung im IMB
14
German Partnership Program for Excellence in Biological and Health Security: Die Projekte des IMB 16
Bioforensik im Aufwind
17
Deutsch-Mongolische Forschungskooperation: Der Pest und anderen Krankheiten auf der Spur
18
Forschungskooperation mit dem Institut Pasteur in Antananarivo, Madagaskar
21
NATO-Übungen Precise Response 2012 und 2013
24
2. Internationales Symposium zur Entwicklung von ABC-Abwehrfähigkeiten:
Die medizinische B-Aufklärung präsentiert sich
25
Medical Biodefense Conference 2013: Fortsetzung einer Erfolgsgeschichte
26
10 Jahre Neubauplanung für das Zentrum Medizinischer ABC-Schutz
28
Der neue Internetauftritt des IMB
29
Das IMB als Partnerinstitut des DZIF (Deutsches Zentrum für Infektionsforschung)
30
Zentralbereich Diagnostik
Überblick
Murines Fleckfieber: Importierte Infektion nach Kreta-Aufenthalt
Fallbeispiel: Unklare Effloreszenzen bei einem HIV-Patienten
STAN-Projekte und Unterprojekte
Drittmittel– und Sonderforschungsprojekte
33
34
36
38
39
Bakteriologie und Toxinologie
Überblick
Paläogenetische Detektion und Charakterisierung von Yersinia pestis aus 1500 Jahre-altem
Skelettmaterial
EQuATox, das Netzwerk “Establishment of Quality Assurance for the Detection of Biological
Toxins of Potential Bioterrorism Risk”
Sauer macht aktiv – Studie zur antimikrobiellen Empfindlichkeitsprüfung im nicht-neutralen pH-Milieu
STAN-Projekte und Unterprojekte
Drittmittel– und Sonderforschungsprojekte
41
42
44
46
48
70
Virologie und Rickettsiologie
Überblick
Rift Valley-Fieber IgG-Seroprävalenz in Tansania
Seroprävalenz von West Nil-Antikörpern bei Bewohnern von Regionen mit hohem
Virus-Invasionspotential
Untersuchungen zum Vorkommen von Flaviviren und Rickettsien in Nagetieren in Afghanistan
STAN-Projekte und Unterprojekte
Drittmittel– und Sonderforschungsprojekte
4
77
78
80
82
84
94
Infektionsepidemiologie, Immunologie & Risikoanalyse
Überblick
SimpleProbe-Sonden – Einfache Sonden für komplexe Analysen
Übertragung der Tularämie durch Zecken: Eine unterschätzte Gefahr?
Francisella-Infektionen direkt unter der Lupe
STAN-Projekte und Unterprojekte
Drittmittel– und Sonderforschungsprojekte
99
100
102
104
106
118
B-Spezialdiagnostik und Hochsicherheitslabor
Überblick
Kuhpockenviren zeigen überraschend große Unterschiede in der Virulenz
Milzbrand, Heroin und Bundeswehr: Genetische Untersuchungen zu einem neuen Ausbruch
von Injektionsmilzbrand in Heroinkonsumenten
Variationen im adaA-Gen von Coxiella burnetii liefern Hinweise auf mikroevolutionäre Vorgänge
STAN-Projekte und Unterprojekte
Drittmittel– und Sonderforschungsprojekte
121
122
124
126
128
148
Medizinische B-Aufklärung und Verifikation
Überblick
Das „European Mobile Lab“ Projekt - Aufbau schnell-verlegbarer Laboreinheiten zur
Felddiagnostik gefährlicher Krankheitserreger in Afrika
Entwicklung und Erprobung eines Schutzsystems zur Aufbereitung potenziell infektiöser
Proben im Feld
Entwicklung gefriergetrockneter Reagenzienmischungen für die Echtzeit-RT-PCR
STAN-Projekte und Unterprojekte
Drittmittel– und Sonderforschungsprojekte
153
154
156
158
160
176
Anhang
Veröffentlichungen 2012
Veröffentlichungen 2013
Impressum
178
188
198
5
Am Ziel:
Akkreditierung des Zentralbereichs Diagnostik
Akkreditierungsverfahren vorbereitet. Da fast keines
der Untersuchungsverfahren kommerziell verfügbar
ist, mussten mehr als 100 Methoden selbst entwickelt
und auf die Anwendbarkeit in der Diagnostik geprüft
werden. Um die hohen Qualitätsstandards konstant
bereithalten und erfüllen zu können, wurde eigens ein
neuer
Funktionsbereich,
der
Zentralbereich
Diagnostik (ZBD,) am Institut eingerichtet.
Das Ergebnis: Im Dezember 2012 wurde der ZBD
erfolgreich durch die DAkkS akkreditiert. Knapp 120
Untersuchungsverfahren
für
insgesamt
29
Krankheitserreger wurden zuvor über mehrere Tage
durch drei Gutachter der DAkkS auf Grundlage der
DIN EN ISO/IEC 15189 für Medizinische Laboratorien
geprüft. Dabei wurden nicht nur wissenschaftlichen
Verfahren
betrachtet,
sondern
auch
die
organisatorischen
Rahmenbedingungen,
das
Qualitätsmanagementsystem und die Kompetenz der
Mitarbeiter. „Besonders hervorzuheben ist, dass der
Zentralbereich
Diagnostik
des
Instituts
für
Mikrobiologie die Begutachtung mit nur einigen
wenigen, unkritischen Abweichungen exzellent
gemeistert hat. Dies ist bei einer Erstakkreditierung
ein herausragendes Ergebnis“, sagte der Leiter der
Abteilung „Gesundheit und Forensik“ der DAkkS, Uwe
Zimmermann, in München anlässlich der feierlichen
Übergabe der Akkreditierungsurkunde der DAkkS an
den Institutseiter, Oberstarzt Prof. Dr. Lothar Zöller
(siehe Abb. 1).
Um die Qualität von medizinischen Untersuchungen
zu
gewährleisten,
stellt
die
europäische In-vitro-Diagnostika-Richtlinie und
die Richtlinie der Bundesärztekammer zur
Qualitätssicherung
laboratoriumsmedizinischer
Untersuchungen hohe Anforderungen. Das
Qualitätsmanagement ist daher mittlerweile ein
fester Bestandteil der medizinischen Mikrobiologie. Darüber hinaus ist es üblich, sich die
Einhaltung der Richtlinien durch eine Akkreditierung bestätigen zu lassen. Die europäische
Norm für die Akkreditierung von medizinischen
Laboratorien ist die DIN EN ISO 15189. Die
Deutsche Akkreditierungsstelle (DAkkS) ist die
nationale Akkreditierungsstelle der Bundesrepublik Deutschland. Sie begutachtet, bestätigt
und überwacht als unabhängige Stelle unter
anderem die Fachkompetenz von Laboratorien.
Mit einer Akkreditierung bestätigt die DAkkS, dass
diese Stellen ihre Aufgaben fachkundig und nach
geltenden internationalen Normen erfüllen. Kurz:
Die DAkkS prüft die Prüfer. Die Zuverlässigkeit
und Qualität der komplexen mikrobiologischen
Untersuchungsverfahren des Instituts für Mikrobiologie der Bundeswehr hat die DAkkS in einem
umfangreichen
und
anspruchsvollen
Akkreditierungsverfahren geprüft.
Das Institut hatte sich über mehrere Jahre auf das
Abbildung 1: Uwe Zimmermann, Leiter der Abteilung „Gesundheit und Forensik“ der DAkkS (li.), überreicht in Anwesenheit von Generalarzt Dr.
Erika Franke (re.) die Akkreditierungsurkunde an den Institutsleiter, Oberstarzt Prof. Dr. Lothar Zöller (2. v.re.), die Leiterin des ZBD, Dr. Sabine
Schmoldt (hi. li.) und den Leiter Qualitätsmanagement, Oberfeldarzt Dr. Roman Wölfel (hi. re.)
Foto: SanAkBw Fachmedienzentrum
6
Unter den Gästen der Feierstunde waren auch
Generalarzt Dr. Erika Franke als Stellvertreterin des
Amtschefs des Sanitätsamtes der Bundeswehr und
der ehemalige Leiter des Instituts, Oberstarzt a.D. Dr.
Ernst-Jürgen Finke. Generalarzt Dr. Franke betonte in
ihrem Grußwort die Tatsache, dass das Instituts für
Mikrobiologie
der
Bundeswehr
unter
den
Einrichtungen mit Sicherheitsforschungsaufgaben im
Bereich des B-Schutzes in Deutschland das erste
Institut sei, das sich vollumfänglich mit seinem
diagnostischen Spektrum akkreditiert hat. Die
Akkreditierung sei ein weiterer Beleg für die hohen
Qualitätsstandards, die im Sanitätsdienst der
Bundeswehr für die Patienten angestrebt werden.
Das Leistungsspektrum des Instituts ist nicht nur für
den medizinischen B-Schutz relevant, sondern kann
darüber hinaus von allen Sanitätsdienststellen im
Rahmen ihrer Diagnostik für spezielle Infektionserkrankungen genutzt werden. Insbesondere bei
importierten Infektionen, bei Tropenerkrankungen und
bei seltenen endemischen Infektionserkrankungen
kann die Untersuchungskapazität des Instituts
eingesetzt werden. Ein vollständiges Analysenverzeichnis, sowie Laboranforderungsscheine können
direkt vom Institut für Mikrobiologie der Bundeswehr
angefordert, oder von seiner Internetseite heruntergeladen werden.
Abbildung 2: Die Akkreditierungsurkunde des Zentralbereichs Diagnostik.
7
Qualitä tsmanagement-Bericht
Nachdem im Laufe des Jahres 2013 die Anzahl der
QM-Dokumente die 1000-Marke überschritten hatte,
wurde eine Lenkung der Dokumente gemäß den
Vorgaben der DIN EN ISO 15189 immer schwieriger.
Aus diesem Grund wurde eine umfangreiche
Marktrecherche, einschließlich einer Befragung bei
verschiedenen Laboranwendern in München und
Umgebung bezüglich einer geeigneten Software zur
Dokumentenlenkung durchgeführt. Im III. Quartal
2013 wurde dann die Dokumentenlenkungssoftware
„roXtra“ beschafft, welche im November innerhalb von
zwei Tagen am Institut für Mikrobiologie der
Bundeswehr installiert wurde. Mit der Installation der
Software ist es nun möglich, von jedem
Bildschirmarbeitsplatz am Institut auf alle QMDokumente zuzugreifen. Zudem ist es möglich,
einzelne Benutzergruppen festzulegen, welche auf
ausgewählte
QM-Dokumentenkreise
zugreifen
können. Dies hat besonders im Bereich des
Hochsicherheitslabors mit dem eigenen Dokumentenkreis „L3“ einen sicherheitserheblichen Vorteil.
Nach der abgeschlossenen Überführung der
Untersuchungsverfahren aus den Forschungsabteilungen in den Zentralbereich Diagnostik
(ZBD) wurde bereits Anfang 2012 der Antrag auf
Erstakkreditierung
bei
der
Deutschen
Akkreditierungsstelle GmbH (DAkkS) gestellt. Im
Jahr 2012 lag der Schwerpunkt deshalb in der
Vorbereitung der Erstakkreditierung.
Die zweitägige Begehung zur Erstakkreditierung
durch drei externe Begutachter der DAkkS
(Systembegutachter, Fachbegutachter für Virologie
bzw. Bakteriologie) fand im September 2012 statt. Am
Ende konnte sich das Ergebnis mit nur zwei nichtkritischen Abweichungen im Bereich QM-System und
eine im Bereich Virologie sehen lassen. Im Bereich
Bakteriologie wurden keine Abweichungen festgestellt. Die Abstellung der nicht-kritischen Abweichungen war innerhalb kürzester Zeit vollzogen.
Am 11. Januar 2013 wurde schließlich die
Akkreditierungsurkunde durch den Leiter der
Abteilung Gesundheit und Forensik der DAkkS im
Rahmen einer Feierstunde übergeben. Bei dieser
Veranstaltung war die Kommandeurin der Sanitätsakademie Frau Generalarzt Dr. Franke anwesend.
Die
Projektgruppe
„Ständige
Arbeitsgruppe
Arbeitsschutz“ (STAGA) erarbeitete unter Mitwirkung
der Betriebsärztin, der Fachkraft für Arbeitssicherheit
und dem QMB ein QM-gelenktes Gefährdungsbeurteilungssystem. Alle betreffenden Dokumente
wurden unter dem Dokumententyp Gefährdungsbeurteilung (GU) zusammengefasst und beinhalten
derzeit über 70 Einzeldokumente.
Parallel zu der Vorbereitung der Erstakkreditierung,
wurden 2012 und 2013 jeweils 7 Qualitätsaudits
durchgeführt. Diese dienen als Überwachung der
kontinuierlichen Umsetzung der Qualitätsvorgaben
der DIN EN ISO 15189 in den Funktionsbereichen
des Zentralbereichs Diagnostik. Hierzu wurden
Begehungen in den Bereichen Qualitätsmanagementsystem,
Allgemeiner
Laborbetrieb,
Molekulare
Diagnostik, Bakteriologie, Serologie, Zellkultur und
Nährbodenküche durchgeführt. Bei allen Audits zeigte
sich eine ausgesprochen hohe Identifikation des
eingesetzten Personals mit den jeweiligen Arbeitsprozessen.
Für
das
Jahr
2014
stehen
nun
die
Aktualitätsüberprüfung
möglichst
aller
QMDokumente, sowie der Abschluss der Überführung
der QM-Dokumente in die roXtra-Software und die
bevorstehende 1. Überwachungsbegehung durch die
DAkkS im Vordergrund der Qualitätsmanagementarbeit.
Zudem
hat
der
ZBD
im
Bereich
der
Qualitätssicherung und der damit verbundenen
Teilnahme im Jahr 2012 an 22 nationalen (INSTAND)
und 7 internationalen (QCMD, QUANDHIP, ENIVD)
Ringversuchen sowie 9 Laborvergleichen teilgenommen. Im Jahr 2013 nahm der Akkreditierungsbereich
an 25 nationalen (INSTAND) und an 7 internationalen
(QCMD, QUANDHIP, ENIVD) Ringversuchen sowie
an 12 Laborvergleichen teil. Für beide Jahre war
dabei die Lenkung von über 800 QM-Dokumenten,
wie bereits im Jahr 2011, die größte Herausforderung.
8
Forschungsallianz mit der
Technischen Universitä t Mü nchen
Bundeswehreinrichtung als wichtigen Beitrag für Staat
und Gesellschaft. Frau Generalarzt Dr. Franke wies
daraufhin, dass die Zusammenarbeit mit der TUM
bereits lebendige Praxis sei, die der Kooperationsvertrag nun noch unterstreiche. In der Tat ist das
Institut für Mikrobiologie der Bundeswehr bereits seit
2010 zusammen mit der TUM, der LudwigMaximilians-Universität und dem Helmholtz-Zentrum
München gemeinsam Partner im Deutschen Zentrum
für Infektionsforschung, in dem die besten infektiologischen Forschungseinrichtungen des Landes durch
das Bundesministerium für Bildung und Forschung
gefördert werden.
Im Rahmen der durch ein Klarinettenquartett des
Gebirgsmusikkorps
aus
Garmisch-Partenkirchen
musikalisch umrahmten Feierstunde wurde durch
Mitarbeiter des Instituts für Mikrobiologie der
Bundeswehr und des Instituts für Mikrobiologie,
Immunologie und Hygiene der TUM ein gemeinsames
Forschungsprojekt vorgestellt, bei dem es um die
Entwicklung eines neuen Antibiotika-Wirkmechanismus bei Francisella tularensis, dem Erreger der
Hasenpest geht. In seinem Festvortrag gab
Regierungsdirektor Privatdozent Dr. Graß ein Beispiel
für die Anwendung der Forschungsmethoden des
Instituts für Mikrobiologie der Bundeswehr auf den
durch kontaminiertes Heroin hervorgerufenen Milzbrandausbruch in verschiedenen Ländern Europas.
Im Rahmen einer akademischen Feierstunde an
der Technischen Universität München (TUM)
unterzeichneten am 21. Februar der Präsident der
TUM, Herr Professor Dr. Herrmann, und die
Stellvertreterin des Amtschef des Sanitätsamtes
der Bundeswehr, Frau Generalarzt Dr. Franke,
einen Kooperations-vertrag über eine neue zivilmilitärische Forschungsallianz. Kooperationspartner sind das Institut für Mikrobiologie der
Bundeswehr sowie das Institut für Mikrobiologie,
Immunologie und Hygiene und das Institut für
Virologie der TUM.
Die Vereinbarung umfasst insbesondere eine enge
wissenschaftliche Zusammenarbeit auf den Gebieten
Mikrobiologie, Virologie und Infektionsepidemiologie
und sieht gemeinsame Forschungsprojekte ebenso
vor wie den Austausch von Personal sowie die
wechselseitige
Nutzung
der
vorhandenen
Forschungsinfrastruktur. Wissenschaftliche Mitarbeiter
des Instituts für Mikrobiologie der Bundeswehr
beteiligen sich an der Lehre der TUM, der Ausbildung
des wissenschaftlichen Nachwuchses, sowie der
Betreuung von Dissertationen. Weiterbildungsassistenten des Instituts für Mikrobiologie der
Bundeswehr können einen Teil ihrer Weiterbildung an
den Partnerinstituten der TUM absolvieren, wobei auf
eine wissenschaftliche Ausrichtung der Weiterbildung
Wert gelegt wird. Anstoß für die Kooperation war die
Empfehlung des Wissenschaftsrats der Bundesregierung für eine engere Vernetzung der Ressortforschungseinrichtungen mit den Universitäten am
Standort.
In seiner Ansprache begrüßte der Präsident der TUM
die Zusammenarbeit der Universität mit einer
Am Ende der Veranstaltung konnten die Direktoren
der drei Institute, Herr Prof. Dr. Dirk Busch, Frau Prof.
Dr. Ulla Protzer und Herr Oberstarzt Prof. Dr. Lothar
Zöller den frisch unterzeichneten Vertrag aus den
Händen des Präsidenten und der Stellvertreterin des
Amtschefs mit den besten Wünschen für eine
erfolgreiche Zusammenarbeit in Empfang nehmen.
Abbildung 1: Der Präsident der Technischen Universität München, Prof.
Dr. Herrmann und die Stellvertreterin des Amtschefs des Sanitätsamtes der Bundeswehr, Frau Generalarzt Dr. Franke, bei der Unterzeichnung des Kooperationsvertrages.
Dahinter von links nach rechts: Frau
Prof. Dr. Protzer, Direktorin des Instituts für Virologie der TUM, Herr Prof.
Dr. Busch, Direktor des Instituts für
Mikrobiologie, Immunologie und Hygiene der TUM und Herr Prof. Dr. Zöller,
Leiter des Instituts für Mikrobiologie
der Bundeswehr
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Forschung und Lehre Hand in Hand
Die Sanitätsakademie in München ist die größte
Ausbildungseinrichtung
für
ärztliches
und
nichtärztliches Personal im Sanitätsdienst der
Bundeswehr. Dabei unterstützt das Institut für
Mikrobiologie der Bundeswehr – selbst bereits
seit vielen Jahren durch einen hohen Anteil
habilitierter Wissenschaftler mit der deutschen
Hochschullandschaft verzahnt – die Lehrgänge
der Akademie im Bereich des Medizinischen BSchutzes. 2012 wurden die fachlichen Inhalte der
einwöchigen Ausbildung „Medizinischer ABCSchutz“ grundlegend überarbeitet und an
moderne didaktische Konzepte angepasst.
Überblick. Unter Berücksichtigung von Zielgruppe
und vorgegebenem Zeitrahmen von 7 Unterrichtseinheiten für den Anteil Medizinischer B-Schutz
wurden Lernziel und fachliche Inhalte neu definiert.
Die Lehrinhalte wurden an das heutige Verständnis
vom B-Schutz angepasst. Die aktuelle Erkenntnisund Bedrohungslage zu biologischen Kampfstoffen
und
daraus
möglicherweise
resultierenden
Krankheitsausbrüche wurden in den Lehrgang
integriert. Im Ergebnis resultieren vier Seminare und
als innovatives didaktisches Element ein Tutorium im
Stil des Problem-orientierten Lernens. Begleitend
wurde das Skript mit spezifischen Hintergrund-
10
informationen und Literaturstellen überarbeitet.
Ziele und Struktur. Die Lehrgangsteilnehmer sollen
nicht mit Detailwissen zu seltenen Erregern
überfrachtet, sondern vielmehr dazu befähigt werden,
ungewöhnliche
biologische
Schadensereignisse
selbstständig
zu
erkennen,
grundlegende
Vorgehensweisen zu verstehen und anzuwenden. Die
Vorträge sind daher bewusst interaktiv gestaltet und
binden die Teilnehmer wo immer möglich durch
gezieltes Hinterfragen oder Anschauungsmaterial wie
den Probennahme-Rucksack der Abteilung für Mobile
B-Aufklärung und Verifikation ein.
Zusätzlich wurde in den Lehrgang ein Fallseminar
integriert, das im Stil des Problem-orientierten
Lernens (POL) durchgeführt wird. POL bedeutet die
selbständige
Erarbeitung
eines
strukturierten
medizinischen Falles aus dem medizinischen BSchutz in Kleingruppen bis zu maximal 10
Teilnehmern. Diese Lern- und Lehrmethode wurde
entwickelt, um den klassischen universitären
Frontalunterricht (Vorlesung) mit nachgewiesenermaßen schwankenden Lernerfolgen zu ergänzen.
Ursprünglich an der McMasters University (Kanada)
entwickelt, ist sie inzwischen fester Bestandteil der
Curricula vieler medizinischer Fakultäten wie der
Ludwig-Maximilians-Universität München oder der
Universität Leipzig.
Erfahrungen. Die Durchführung eines solchen POLTutoriums bringt zwar einen organisatorischen und
personellen Mehraufwand mit sich, dafür können aber
Lernziele eines sehr speziellen Fachgebietes viel
spezifischer und detaillierter in der Arbeitsatmosphäre
einer Kleingruppe vermittelt werden. Der Dozent kann
anders als in einen Vortrag auch auf zurückhaltende
Charaktere eingehen und sie zur Mitarbeit motivieren.
Alle bisherigen Evaluationen haben gezeigt, dass die
Lehrgangsteilnehmer das neue Modell durchweg
positiv aufgenommen haben. Aufgrund des großen
Erfolges dieses Pilotlehrgangs werden derzeit weitere
Lehrgänge mit anderen Zielgruppen und Inhalten in
einer Projektgruppe „Lehre und Ausbildung“ am
Institut für Mikrobiologie der Bundeswehr neu
konzipiert.
Handlungskompetenz. Das Institut für Mikrobiologie
der Bundeswehr erwartet sich von dieser Methode,
dass sich die Lehrgangsteilnehmer intensiver als
bisher und praxisnah mit dem medizinischen BSchutz auseinandersetzen und den Komplex als
solchen als wichtig erkennen. Weiterhin sollten die
Teilnehmer angeregt werden, ihr erworbenes Wissen
künftig nach dem Lehrgang im täglichen ärztlichen
Alltag anzuwenden und zu vertiefen. Es besteht kein
Zweifel, dass sich ein derart komplexes Fachgebiet
nicht abschließend innerhalb der gegebenen kurzen
Zeit vermitteln lässt. Im Idealfall sollten die Lehrgangsteilnehmer nun in die richtige Richtung denken,
und die Notwendigkeit erkannt haben, sich weiterhin
mit dem Thema zu befassen. Die zu bearbeitenden
Fälle wurden praxisnah entwickelt und orientieren sich
konkret
an
den
Einsatzerfordernissen
des
Sanitätsdienstes in Missionen wie KFOR (Kosovo)
und ISAF (Afghanistan).
Weitere Lehr- und Ausbildungstätigkeiten in 2012
und 2013:
Neben
den
oben
aufgeführten
regelmäßig
ausgebildeten Med.-B-Schutzinhalten des PUMALehrganges wurden jeweils zweimal pro Jahr
Ausbildungsleistungen im Rahmen der Desinfektorenausbildung, des Lehrgangs AK 0217 („Beauftragter
Sanitätsstabsoffizier und Feldwebel für die ZivilMilitärische Zusammenarbeit im Gesundheitsdienst“)
und des Lehrgangs AK 7211 („Fachausbildung
wehrveterinärmedizinische Tätigkeit Sanitätsoffizier
Veterinär“) erbracht.
Auch der einmal im Jahr organisierte Informationstag
für die Teilnehmer des Generalstabs-Lehrgangs aus
Deutschland und anderen NATO-Mitgliedsländern
fand bei den über 100 Teilnehmern ein sehr reges
Interesse. Besonders die Fähigkeiten der stationären
und mobilen Labordiagnostikkapazitäten wurden
intensiv dargestellt und mit den Teilnehmern
diskutiert.
Ablauf. Das POL findet im Rahmen eines
Kleingruppenunterrichts unter der Supervision eines
Tutors statt. In einem Tutorium werden durch die
Gruppe Lernziele anhand eines vorbereiteten
Lernfalles (sog. „paper cases“) erarbeitet. Allen Fällen
liegt dabei eine reale Krankheitsgeschichte zugrunde,
die nach didaktischen Gesichtspunkten modifiziert
wurde. Zunächst führt die Gruppe eine gründliche
Textanalyse durch und trennt dabei medizinisch
relevante Informationen von Distraktoren. Ein
Lehrgangsteilnehmer nimmt mit Unterstützung durch
die gesamte Gruppe wichtige Elemente wie
Anamnese und Symptome an Tafel oder Flipchart auf,
um damit Differentialdiagnosen und diagnostische
Maßnahmen abzuleiten bzw. zu planen. Dabei ergibt
sich immer eine lebhafte Diskussion um Fragen wie:
„Welche Differenzialdiagnosen kommen warum oder
warum nicht in Betracht?“, „Welche Diagnostik ist im
Einsatz vor Ort möglich, welche nur in Deutschland
oder an spezialisierten Bundeswehrinstituten?“ oder
„Welche Therapiemöglichkeiten gibt es?“.
Um Eigenverantwortung und -inititative zu fördern,
bleibt der Tutor bei dem Prozess im Hintergrund,
greift aber, wo didaktisch notwendig, steuernd in die
Diskussion ein und achtet darauf, dass sich alle
Gruppenmitglieder einbringen und die vorgegebenen
Lernziele erreichen. Wenn ein Teilziel erreicht wurde,
wird der Fall fortentwickelt. Neue Aspekte werden
dann wieder niedergeschrieben und erneut diskutiert.
Am Ende wird der Fall noch einmal kurz von einem
Lehrgangsteilnehmer zusammengefasst. Der Tutor
erläutert abschließend noch spezifische Aspekte und
klärt alle ggf. noch offenen Fragen.
Fachlichen Weiterbildungsseminare mit internen und
externen Referenten fanden im Institut an insgesamt
52 Tagen statt und wurden von der Bayerischen
Landesärztekammer (BLÄK) und der Akademie für
tierärztliche Fortbildung (ATF) mit den entsprechenden Anerkennungspunkten bewertet.
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Fest eingeplant:
Drittmittelforschung im IMB
Schwächen. Immerhin ist die Einwerbung von
Drittmitteln für Projekte, die nicht im Kernauftrag der
jeweiligen Einrichtungen liegen, grundsätzlich möglich.
Allerdings erschweren die über mehrere Institutionen
und Hierarchieebenen der Wehrverwaltung verteilten
Zuständigkeiten für Vertragsabschlüsse, sowie die
Mittelbewirtschaftung durch die Bundeswehrdienstleistungszentren, die für solche Aufgaben nur
unzulänglich personell ausgestattet sind, die
Akquisition von Großprojekten, z. B. von der EU.
Gemessen an den bestehenden Einschränkungen hat
sich der Umfang Drittmittel-geförderter Projekte am
Institut für Mikrobiologie der Bundeswehr sehr gut
entwickelt. Insgesamt hat das Institut bis Ende des
Berichtsjahres 26 Drittmittelprojekte mit einem
Gesamtfördervolumen von über sieben Millionen Euro
eingeworben (siehe Tabelle 1 und Abbildung 1).
Drittmittelgeber sind nationale Einrichtungen, wie das
Auswärtige Amt (AA), das BMBF, das BMG, das RKI,
die DFG und der bayerische Staat aber auch die die
EU und die European Defence Agency.
Im Rahmen der Dienstaufgaben der beiden
Konsiliarlabore für Tularämie und Brucella fördert das
RKI seit Jahren Forschungsprojekte der Konsiliarlabore. Seit 2011 gehört das Institut mit renommierten
Münchner Forschungseinrichtungen zu einem von
sieben Partnerstandorten des Deutschen Zentrums für
Infektionsforschung (DZIF). In einem von der EU
geförderten Projekt bringt das Institut seine Expertise
auf dem Gebiet der mobilen Diagnostik ein. Seit 2013
fördert das AA im Rahmen des Biosicherheitsprogrammes drei Projekte in den Staaten Tansania,
Georgien und Kasachstan. Beginnend mit dem
Haushaltsjahr 2004 stieg der Betrag der eingeworbenen Gelder kontinuierlich auf jährlich ca. 400 bis 500 T€
an. Im Jahr 2012 kam es - bedingt durch Gerätebeschaffungen im EU-Projekt - zu einem Anstieg auf
über 1 Million €. Die Entwicklung der eingeworbenen
Drittmittelgelder ist in
Abbildung 1 dargestellt.
Drittmittel sind mehr als nur eine wichtige
finanzielle Unterstützung für die Forschung: Da sie
im
Wettbewerb
mit
anderen
Forschungsinstitutionen eingeworben werden, sind sie auch
ein wichtiger Indikator für die Exzellenz der
Forschung. Daher fordert auch der Wissenschaftsrat von den Ressortforschungseinrichtungen die
Drittmitteleinwerbung und bewertet sie als
Kriterium für die wissenschaftliche Leistungsfähigkeit.
Die Einwerbung von Drittmitteln ist dem Institut
grundsätzlich dann möglich, wenn das betreffende
Projekt im Zusammenhang mit dem Institutsauftrag,
wenn auch nicht in dessen Kern, steht. Mit den
Richtlinien des BMVg für die Forschung mit Drittmitteln
(Drittmittelerlass) vom 3. Mai 1994 waren zwar formale
Grundlagen für die Einwerbung von Drittmitteln
geschaffen, es bestanden jedoch „institutionelle und
haushaltsrechtliche Vorgaben, welche die Einwerbung
von Forschungsdrittmitteln unattraktiv machen“. Dies
stellte der Wissenschaftsrat anlässlich seiner
Begutachtung des Instituts in seiner 2007
erschienenen Stellungnahme fest. Weiterhin empfahl
er, „die Bundesregierung solle dafür Sorge tragen,
dass eingeworbene Forschungsdrittmittel grundsätzlich nicht zu einer Minderung des Grundhaushaltes der
Institute führen, sondern uneingeschränkt in die
Forschungs- und Entwicklungs-(F&E)-Arbeit der
Institute fließen können. Dort sollten sie genutzt
werden, um Stellen für Nachwuchswissenschaftlerinnen und -wissenschaftler zu finanzieren und
eigenständig entwickelte F&E-Projekte aus dem
Aufgabenbereich der Institute durchzuführen“. Der
neue Drittmittelerlass aus dem Jahr 2010, der im Jahr
2012 neu gefasst wurde, trägt dem teilweise
Rechnung, hat aber noch immer gravierende
Abbildung 1: Übersicht über das mit Drittmittelprojekten eingeworbene Fördervolumen am InstMikroBioBw
12
Thema
Förderer
Dauer
EU
01/2004 – 12/2006
BMBF
08/2006 – 07/2008
EU
01/2006 – 12/2008
RKI
01/2009 – 12/2009
BMBF
10/2007 – 09/2010
Chipbasiertes Durchfluss-PCR-System für die mobile vollständige Nukleinsäureanalytik von biologischen Gefahrstoffen
BMBF
01/2008 – 12/2011
Robust and autonomous airborne threat identification system as lab-on-a-chip
device with integrated optoelectronic sensors and combined pathogen enrichment
EDA
02/2008 – 02/2011
European Network of P4 Laboratories
EU
10/2007 – 09/2010
Development and commercial production of standardized PCR-assays for the
detection of hemorrhagic fever viruses and variola virus and their implementation into diagnostic service of EU P4 laboratories
Mit mikrofluidischen Modulen zu hochintegrierten Kassetten für medizinische
Analysesysteme
Genomic inventory, forensic markers, and assessment of potential therapeutic
and vaccine targets for viruses relevant in biological crime and terrorism
Werkvertrag 2009 zur Erarbeitung eines Konzepts für eine wissenschaftliche
Zusammenarbeit von NRZ und Konsiliarlaboren
Erforschung der molekularen Pathogenese des Q-Fiebers und ihre Anwendung in der Diagnostik und Epidemiologie in Deutschland
Studie zum Vorkommen Nagetier-Übertragene Zoonosen entlang eines KlimaSTMUGV
gradienten im Nationalpark Bayerischer Wald
08/2008 – 12/2011
Seroepidemiologie vektor-übertragener Infektionen in Mbeya, SüdwestTansania
DFG
10/2009 – 12/2011
Arboviren in Deutschland: Isolierung und Charakterisierung von in Zecken
zirkulierenden Arbovirus-Stämmen
BMBF
08/2007 – 12/2012
Funktioneller Genom- und Proteomvergleich von Coxiella burnetii zur
Diagnostik und Therapieentwicklung des Q-Fiebers einschl. Untersuchung
der Wechselwirkung der „Host-Pathogen“ Interaktion auf der Ebene der RNA
Transkripte beim Menschen
BMBF
10/2010 – 09/2013
Konsiliarlabor für Tularämie; FKZ 1369-372
RKI
01/2010 – 12/2013
Konsiliarlabor für Tularämie; FKZ 1369-438
RKI
01/2011 – 12/2013
Entwicklung Real-time PCR-basierter Testkits zur Point-of-Care Diagnose
sicherheitsrelevanter Erreger
BMBF
01/2011 – 12/2012
Konsiliarlabor für Brucella; FKZ 1369-456
RKI
01/2010 – 12/2013
Konsiliarlabor für Brucella; FKZ 1369-448
RKI
01/2010 – 12/2013
Technology and Data Integration with the Bundeswehr Institute of Microbiology DHS
04/2010 – 08/2013
Quality Assurance Exercises and Networking on the Detection of Highly
Infectious Pathogens
EU
08/2011 – 07/2014
Inactivation of bacterial biothreat agents on metallic copper surfaces
ICA
06/2011 – 12/2012
Deutsches Zentrum für Infektionsschutz
BMBF
07/2011 – 06/2016
Establishment of Mobile Laboratories for Pathogens up to Risk Group 4 in
combination with CBRN Capacity Building in sub-Saharan Africa
EU
11/2011 – 11/2015
Aufbau eines vorderasiatischen Netzwerks für Biologische Sicherheit und
Diagnostik gefährlicher Infektionskrankheiten: AA Georgien
AA
09/2013 – 10/2016
Aufbau eines deutsch-tansanischen Netzwerkes zur Diagnostik und Epidemiologie von gefährlichen Infektionskrankheiten: AA Tansania
AA
07/2013 – 07/2016
Aufbau eines deutsch-kasachischen Netzwerkes zur Diagnostik von Infektionskrankheiten: AA Kasachstan
AA
10/2013 – 09/2016
Tabelle 1: Übersicht über Drittmittelprojekte am InstMikroBioBw.
Abkürzungen: BMBF – Bundesministerium für Bildung und Forschung; DFG – Deutsche Forschungsgemeinschaft; DHS – U.S. Department of
Homeland Security; EDA- European Defense Agency; EU – Europäische Union; ICA – International Copper Association, Ltd.; RKI – Robert
Koch-Institut; STMUGV – Bayerisches Staatsministerium für Umwelt, Gesundheit und Verbraucherschutz; AA – Auswärtiges Amt
13
German Partnership Program for Excellence in
Biological and Health Security: Die Projekte des IMB
Daneben soll das Bewusstsein der Partnerländer für
biologische Gefahren verbessert (Awareness Raising)
und die Fachexpertise, Umsetzungs- und Reaktionsfähigkeiten der nationalen Partnerinstitutionen der
nationalen Partnerinstitutionen gestärkt werden
(Capacity Development).
Biologische Substanzen und Erreger - ob natürlich
oder künstlich hergestellt - können auf Grund ihres
hohen Ansteckungspotenzials für den Menschen eine
Bedrohung für die weltweite Sicherheit darstellen.
Bakterien, Viren und biologische Gifte können von
staatlichen und nicht-staatlichen Gruppierungen
gleichermaßen nach dem Prinzip der dualen
Verwendungsmöglichkeiten (dual-use) für friedliche
aber auch für terroristische Zwecke eingesetzt
werden. Die unsachgemäße Handhabung birgt ein
hohes Risiko des Ausbruchs und der Verbreitung von
Pandemien. Zudem besteht die Gefahr, dass
staatliche und nicht-staatliche Gewaltakteure in Besitz
gefährlicher Erreger gelangen und diese zu
Anschlägen missbrauchen. Dazu kommt, dass in
vielen Ländern die politischen Rahmenbedingungen
diese Risiken weiter begünstigen. Auf Grund von
Historie oder politischen Hintergründen sind die
technischen Voraussetzungen für die Entwicklung und
Verbreitung kritischer Substanzen und Erreger in
manchen Ländern vorhanden. In vielen Partnerländern der deutschen Entwicklungszusammenarbeit
fehlen fachlich kompetente Experten und Einrichtungen, die eine biologische Sicherheit gewährleisten
würden.
Das InstMikroBioBw führt im Auftrag des Auswärtigen
Amtes drei internationale Partnerschaftsprojekte
durch:
♦ Aufbau eines vorderasiatischen Netzwerks für
Biologische Sicherheit und Diagnostik gefährlicher
Infektionskrankheiten in Georgien
♦ Aufbau eines deutsch-kasachischen Netzwerks
zur Diagnostik von Infektionskrankheiten verursacht
durch potentielle B-Agenzien
♦ Aufbau eines deutsch-tansanischen Netzwerks
zur Diagnostik und Epidemiologie von Infektionskrankheiten verursacht durch potentielle B-Agenzien
Durch gezielte Forschung in diesen Partnerländern
und deren Unterstützung leistet das InstMikroBioBw
einen Beitrag zur Erhöhung der Sichtbarkeit der
Bemühungen Deutschlands im Bereich Biosicherheit.
Das Institut für Mikrobiologie der Bundeswehr beteiligt
sich seit August 2013 mit drei Projekten in
Kasachstan, Georgien und Tansania am deutschen
Beitrag zur G7-Initiative „Globale Partnerschaft gegen
die Verbreitung von Massenvernichtungswaffen und materialien“. Mit Hilfe dieses vom Auswärtigen Amt
initiierten und finanzierten deutschen Biosicherheitsprogramm (Deutsches Partnerschaftsprogramm für
biologische Sicherheit und Gesundheitssicherstellung;
German Partnership Program for Excellence in
Biological and Health Security) sollen Partnerländer
beim Ausbau ihrer Kapazitäten in diesem Bereich
unterstützt werden. Damit ist das Programm Teil des
deutschen Engagements in der Globalen Partnerschaft der G8-Staaten gegen die Verbreitung von
Massenvernichtungswaffen und -materialien. Es
besteht aus insgesamt zwölf Einzelprojekten, welche
durch verschiedene deutsche Fachinstitute organisiert
und geleitet werden. Hierzu gehören neben dem
Robert-Koch Institut (RKI) das Bernhard-Nocht-Institut
für Tropenmedizin (BNI-TM), das Friedrich-LoefflerInstitut (FLI) und das Institut für Mikrobiologie der
Bundeswehr (IMB).
Die Ziele des Programmes sind insbesondere die
Verringerung des Risikos einer Ausbringung
biologischer Agenzien (Biosafety/Biosecurity), der
Aufbau von Systemen zur frühzeitigen Erkennung
ungewöhnlicher Krankheitsausbrüche (Surveillance)
sowie die Entdeckung und Charakterisierung
gefährlicher Krankheitserreger in der Umwelt.
14
Bioforensik im Aufwind
Krankheitserreger am IMB zu etablieren und die DNSTypisierungsdatenbank
auszubauen.
In
Zusammenarbeit mit der Arbeitsgruppe von Paul
Keim und David Wagner von der Northern Arizona
University, USA, konnten weitere Typisierungstechniken etabliert werden. Das Institut verfügt nun
über eine breite Palette verschiedener TypisierungsTools für B-Schutz relevante Erreger. Die
Harmonisierung und Standardisierung der eingesetzten Typisierungsassays war dabei eine wichtige
Voraussetzung zum Aufbau einer gemeinsamnutzbaren Erregertypisierungsdatenbank. Durch die
Generierung kompatibler Datensätze sind nun
effektive Rückverfolgungsanalysen gewährleistet.
In vielen Einsatzgebieten der Bundeswehr
kommen hochpathogene bakterielle und virale
Krankheitserreger, wie z.B. Bacillus anthracis
(Milzbrand), Yersinia pestis (Pest), Lassa-,
Dengue- und Ebola-Virus endemisch vor. Im Falle
eines
ungewöhnlichen
Krankheitsausbruchs
durch solche Erreger muss deshalb stets geprüft
werden, ob es sich um ein natürliches Ausbruchsgeschehen oder um eine möglicherweise absichtliche Freisetzung eines biologischen Agens
handelt. Eine der schwierigsten Aufgaben der
medizinischen B-Aufklärung ist somit die
zweifelsfreie und ggf. auch im juristischen Sinne
beweiskräftige Unterscheidung zwischen einem
natürlichen und einem absichtlich herbeigeführten
Krankheitsgeschehen.
Insbesondere die Einführung der VollgenomSequenziertechnologie
stellte
eine
weitere
Herausforderung
dar.
Im
Rahmen
eines
Sonderforschungsprojektes konnte ein VollgenomSequenziergerät (Ion Torrent, Life Technologies)
beschafft werden. Dieses Gerät ermöglicht eine
Genomsequenzierung innerhalb weniger Stunden und
ist somit besonders für Situationen geeignet, in denen
eine rasche Informationsgewinnung und -auswertung
erforderlich ist.
Die Bioforensik ist dabei die Wissenschaftsdisziplin,
welche sich mit Rückverfolgungsanalysen zur
Täterermittlung oder zum Aufspüren der Infektionsquelle beschäftigt. Sie verbindet klassische kriminalistische Forensik mit epidemiologischen Methoden
und mit modernen molekularen Typisierungsmethoden, welche die Erstellung eines erregerspezifischen, molekularen Fingerabdrucks von
biologischen Agenzien auf
Ebene einzelner
Erregerstämme (Isolate) ermöglicht (Mikrobielle
Forensik). Die stammspezifische Signatur kann
hilfreich bei der Ermittlung der natürlichen Quelle oder
des Täters bei einer absichtlichen Freisetzung sein.
Dies hat die Aufklärung der Anthrax-Briefattentate in
den USA 2001 eindrucksvoll gezeigt, wo es gelang,
die Quelle bis in das entsprechende Labor
zurückzuverfolgen.
In den kommenden Jahren sollen nun auf
europäischer Ebene durch die Bündelung von
Ressourcen und die enge Zusammenarbeit der
Spezialisten verschiedener Länder die Fähigkeiten in
der mikrobiellen Forensik ausgebaut werden. Das
Institut für Mikrobiologie ist deshalb als starker
Partner im European Biodefense Laboratory Network
(EBLN) der European Defence Agency (EDA)
vertreten. Ein Ziel eines gemeinsam betriebenen EDA
-Forschungsprojekts ist dabei die Harmonisierung und
Standardisierung der Analysenverfahren sowie der
Aufbau einer molekularen Datenbank für Bioagenzien.
Ein weiterer Schwerpunkt wird die Implementierung
von Qualitätssicherungsmaßnahmen sein. Nur so
können die aus dem Aufklärungsprozess von der
Probennahme bis hin zur Interpretation der
molekularen
Typisierungsdaten
resultierenden
Aussagen die geforderte juristische Belastbarkeit
erlangen.
Ein wichtiges Instrument bei Rückverfolgungsanalysen stellt der Abgleich des molekularen
Fingerabdrucks des zu untersuchenden Agens mit
vorhandenen Einträgen in der Typisierungsdatenbank
dar - ähnlich dem Abgleich von Fingerabdrücken bei
der klassischen Täteridentifizierung. Nur wenn der
passende
molekulare
Fingerabdruck
in
der
Datenbank hinterlegt ist, lässt sich eine eindeutige
Zuordnung treffen. Aus diesem Grund ist der Aufbau
umfassender Typisierungsdatenbanken mit den
dazugehörigen Metadaten, wie z.B. geographische
Herkunft, Jahr der Isolierung, Wirt, etc. essentiell für
effiziente bioforensische Analysen. Eine Europa- und
weltweite Zusammenarbeit mit Staaten in denen
potenzielle B-Agenzien endemisch vorkommen, ist
deshalb für den Aufbau so umfassender Datenbanken
unabdingbar.
Die Hauptaufgabe der Arbeitsgruppe Bioforensik
bestand 2012 und 2013 zunächst darin, weitere
molekulare
Typisierungstechniken
für
diverse
15
Deutsch-Mongolische Forschungskooperation:
Der Pest und anderen Krankheiten auf der Spur
Als Pendant zum Robert Koch-Institut in Deutschland
übernimmt das NCZD in der Hauptstadt Ulan Bator
die zentrale Rolle bei der Überwachung und
Bekämpfung wichtiger Infektionskrankheiten. Eine der
Hauptaufgaben liegt im Monitoring von Naturherden
wichtiger Infektionserreger in der gesamten Mongolei.
Hierfür unterhält das NCZD unter Leitung des
Gesundheitsministeriums zahlreiche Außenstationen
in den verschiedenen Provinzen. Deren Aufgabe ist
es, Proben zu sammeln, vorläufig zu charakterisieren
und für weitere, bestätigende Analysen an das NCZD
zu senden.
Hintergründe der militärisch-zivilen Zusammenarbeit zwischen dem National Center for Zoonotic
Diseases (NCZD), Ulanbator, und dem Institut für
Mikrobiologie der Bundeswehr (InstMikroBioBw)
In der Mongolei kommen viele der für uns relevanten
Erreger, darunter die Erreger der Pest (Yersinia
pestis), des Milzbrands (Bacillus anthracis), der
Brucellose (Brucella spp.) und der Tularämie
(Francisella tularensis) endemisch vor. Zudem erfolgt
jährlich
eine
Vielzahl
von
Meldungen
zu
Erkrankungen für beispielsweise FrühsommerMeningo-Enzephalitis
(FSME-Virus),
Borreliose
(Borrelia spp.), Rickettsiosen (Rickettsia spp.), QFieber (Coxiella burnetii), Tollwut (Rabies Virus) und
Rotz
(Burkholderia
mallei).
Den
genannten
Krankheiten ist gemeinsam, dass es sich dabei um
Zoonosen handelt, somit die Erreger vom infizierten
Tier auf den Menschen - und umgekehrt - übertragen
werden können. Einige der Erreger werden durch
Vektoren wie Flöhe und Zecken (z.B. Pest,
Rickettsiosen, FSMEV) übertragen. Eine weitere
Gemeinsamkeit ist, dass die Erreger zumeist ein
natürliches Reservoir, wie Nutztiere (Schafe, Ziegen,
Kamele, Rinder) oder Wildtiere (Nagetiere bei der
Pest) besitzen. Eine Infektion des Menschen erfolgt
entweder durch direkten Kontakt mit infizierten Tieren,
den Verzehr kontaminierter Lebensmittel oder über
Vektoren.
Zur
gezielten
Bekämpfung
der
Erkrankungen ist ein fundiertes Wissen über die
Erreger selbst und deren Übertragungswege
unabdingbar.
Im Rahmen der Zusammenarbeit zwischen dem
InstMikroBioBw und dem NCZD sollen verschiedene
Erreger besser charakterisiert und ihr Vorkommen in
Naturherden untersucht werden. Ein weiteres Ziel der
Kooperation stellt die Ausbildung mongolischer
Wissenschaftler und die Etablierung molekularer
Nachweis- und Erreger-Typisierungsmethoden am
NCZD dar.
Phänotypische und molekulare Charakterisierung
mongolischer Y. pestis-Stämme
In den vergangenen Jahren lag der Schwerpunkt der
wissenschaftlichen
Zusammenarbeit
auf
einer
umfassenden
Charakterisierung
mongolischer
Y. pestis-Stämme, da diese zu Beginn der
Untersuchungen nur unzureichend charakterisiert
waren. Insgesamt konnten in den Jahren 2010 bis
2013 zweihundert Y. pestis-Stämme mittels phäno-
Abbildung 1: SNP-basierter
Minimum spanning tree
von Y. pestis mit Y. pseudotuberculosis als Root
(modifiziert nach Morelli et
al.) Die Lokalisation der
mongolischen Y. pestisStämme ist farblich markiert
(Balken)
16
Es ist demnach davon auszugehen, dass die
Mehrzahl an verschiedenen Y. pestis Genotypen und
Biovare humanpathogen sind. Dabei konnte gezeigt
werden, dass Y. pestis-Stämme des Biovar Microtus
(Branch 0, 0.PE3 und 0.PE4, Abb. 1) ebenfalls
humanpathogen sind. Von diesen wurde bisher
angenommen, dass sie ausschließlich in Nagetieren
vorkommen. Unsere Ergebnisse stehen in Einklang
mit den Ergebnissen einer Forschergruppe aus China,
welche über 200 chinesische Peststämme mittels
Vollgenomsequenzanalysen untersucht hat.
typischer Methoden (Anzucht auf verschiedenen
Nährmedien, biochemische Analysen, Antibiotikaresistenzbestimmung) und molekularer Methoden
(Single-Nucleotide-Polymorphism, SNP; MultipleVariable-Number of Tandem-Repeat-Analysen, MLVA
und Clustered Regularly interspaced Short Palindromic Repeats Analysen, CRISPR) charakterisiert
werden.
Die Ergebnisse eines Teils der Untersuchungen
wurden in den Fachzeitschriften Vector Borne and
Zoonotic Diseases (KIEFER et al.) und in PlosOne
(RIEHM et al.) veröffentlicht.
Feldexpedition
zur
Untersuchung
eines
Pestnaturherds in der mongolischen Provinz
Khentii
In hochauflösenden VNTR-Analysen bildeten die
Mehrzahl der Y. pestis-Stämme ein Mongoleispezifisches Cluster und unterscheiden sich somit von
allen anderen bisher analysierten Y. pestis-Stämmen.
Die phylogenetische Eingruppierung der mongolischen Pest-Stämme in den bestehenden Stammbaum
von Y. pestis zeigte eine hohe Ähnlichkeit zu anderen
Y. pestis-Stämmen aus dem zentralasiatischen
Raum, insbesondere China und Russland. Nur in
Zentralasien finden sich phylogenetisch gesehen alte
Y. pestis-Genotypen, vor allem innerhalb des
ausschließlich
in
Nagetieren
Zentralasiens
vorkommenden Y. pestis-Biovars Microtus.
Nach langer Vorbereitungszeit konnte im Juni 2013
ein wichtiger Meilenstein der mongolisch-deutschen
Kooperation verwirklicht werden, eine gemeinsame
Feldexpedition in ein Pestendemiegebiet ca. 200km
nordwestlich der Hauptstadt Ulanbator (Abbildung 2).
Ziel war die Untersuchung der Nagetierpopulation auf
die Prävalenz verschiedener Infektionserreger,
insbesondere Y. pestis.
Das Institut für Mikrobiologie der Bundeswehr war mit
drei Wissenschaftlern der Abteilung Bakteriologie und
Toxinologie (OSV Dr. Riehm, RD PD Dr. Scholz und
OTL d. R. Dr. Daniel Kiefer) vertreten und wurde von
einem Mitarbeiter der fachvorgesetzten Dienstelle
(OFV Prof. Dr. Dr. Helmut Kreppel) unterstützt. Die
mongolische Seite war mit vier Mitarbeitern des NCZD
und mit über 15 Mitarbeitern der Außenstelle Khentii
beteiligt, darunter Biologen, Veterinärmediziner und
erfahrene Jäger.
Eine zusammenfassende Darstellung der Verteilung
mongolischer Y. pestis-Stämme innerhalb des
Stammbaum von Y. pestis ist in Abbildung 1 gezeigt.
Eine weitere wissenschaftliche Fragestellung, die
durch diese Untersuchungen geklärt werden sollte
war, ob ein bestimmter Y. pestis-Genotyp für
Infektionen beim Menschen verantwortlich ist oder ob
die Verteilung der Genotypen mit denen in den
Naturherden vorkommenden Genotypen vergleichbar
ist. In 2012 wurden deshalb 100 Peststämme
humanen Ursprungs ausgewählt und die Genotypen
mit den bisherigen Ergebnissen von aus Vektoren
(Flöhen, Nagetieren) isolierten Stämmen verglichen.
Mitten in einer nahezu unbewohnten Landschaft
wurde ein Feldlabor aufgebaut (Abbildung 3). Wie in
der Mongolei üblich, erfolgte die Unterbringung in
traditionellen Zelten, sogenannten Gyr.
Dabei zeigte sich bei den humanen Stämmen eine
ähnliche Genotyp-Verteilung wie in den Naturherden.
Abbildung 2: Geographische Karte Mongolei. Stern: Hauptstadt
Ulanbator; Markierte Fläche: Provinz Khentii. (Quelle: Google Maps)
Abbildung 3: Teil des Feldlabors. Links: Umkleidezelt im traditionellem Stil, rechts: Sektionszelt zur Organentnahme.
17
Deutsch-Mongolische Forschungskooperation:
Der Pest und anderen Krankheiten auf der Spur
Abbildung 4: Sherman Fallen verschiedener Größe
Abbildung 5: Dr. Kiefer beim Bestücken der Fallen mit einem
selbsthergestellten Köder
Während der 10-tägigen Expedition konnten
insgesamt 200 Nagetiere lebend mittels sogenannter
„Sherman-Traps“ (Abbildungen 4 und 5) gefangen
werden. Dazu wurden die Fallen mit einem Köder
bestückt und je nach Nagetierart an geeigneten
Stellen aufgestellt. Meist dauerte es nur wenige
Minuten bis Stunden zum Fangen der Tiere.
festliche Aktivitäten und den Austausch von
Gastgeschenken
zum
Zeichen
gegenseitiger
Wertschätzung. Die Neugier war groß, so hatten wir
fast jeden Tag Besuch (Abbildung 7).
Nach zehn Tagen harter gemeinsamer Feldarbeit
waren wir ein Stück weiter zusammengewachsen.
Auch ein Abschied braucht Zeit in der Mongolei, so
zog sich dieser über viele Stunden hin mit dem
Versprechen bald wieder zukommen.
Nach fachgerechter Tötung der Tiere erfolgte die
Entnahme von Blut und verschiedenen Organen
(Abbildung 6), welche für spätere Untersuchungen am
NCZD und am InstMikroBioBw in alkoholischer
Lösung konserviert und inaktiviert wurden. Insgesamt
konnten
über
1000
Proben
für
weitere
Untersuchungen gewonnen werden.
Weltweit
berühmt
ist
die
mongolische
Gastfreundschaft. Es gibt kein Zusammentreffen ohne
Zurückblicken konnten wir auf eine äußerst
erfolgreiche Expedition. Vor uns lag die Analyse der
über 1000 Proben am Institut für Mikrobiologie der
Bundeswehr, gemeinsam mit drei mongolischen
Wissenschaftlern, welche zu Ausbildungszwecken im
Anschluss an die Expedition am InstMikroBioBw ein
dreimonatiges Praktikum absolvieren sollten.
Abbildung 6: Zusammenarbeit
Wissenschaftler bei der Sektion
Abbildung 7: Unsere jüngste Besucherin zusammen mit OSV Dr.
Riehm
deutscher
und
mongolischer
18
Forschungskooperation mit dem Institut
Pasteur in Antananarivo, Madagaskar
Die wissenschaftliche Kooperation zwischen dem
Institut für Mikrobiologie der Bundeswehr (IMB) und
dem IPM besteht bereits seit mehreren Jahren. 2010
kam es zu einem Personalwechsel in der Arbeitsgruppe Pest am IPM. Die ehemalige Leiterin des
Pestlabors und Ansprechpartnerin des IMB, Dr.
Rahalison, wechselte an das amerikanische Center
for Disease Control, Atlanta, USA. Eine persönliche
Basis mit der neuen Leiterin des Pestlabors, Dr.
Rajerison, konnte im Sommer 2012 geschaffen werden. Zwei Mitarbeiter des IMB besuchten das WHOReferenzlabor am IPM, um vier gemeinsame Projekte
zu diskutieren und zu bearbeiten (Abbildung 2).
Yersinia pestis, der Erreger der humanen Pest, ist
- wie die Erkrankung - auf der ostafrikanischen
Insel Madagaskar seit Ende des 19. Jahrhunderts
endemisch. Das Institut Pasteur in Madagaskars
Hauptstadt Antananarivo (Institut Pasteur in
Madagaskar, IPM) wurde 1898 zur Aufklärung und
Bekämpfung der Zoonose Pest gegründet (Abbildung 1). Aufgrund seiner großen Expertise ist das
Institut seit 2003 das WHO Referenzlabor für Pest.
Der WHO Goldstandard für die Pestdiagnostik ist die
bakteriologische Erregerkultur. Weitere Methoden zur
Bestätigung der klinischen Verdachtsdiagnose sind
die Anwendung eines immunchromatographischen
Schnelltests (ICT), die Serologie oder die PCR. Die
Laborgruppe Pest unterhält zudem einen Tierstall für
Mäuse und Ratten. In dem dort verwendeten
diagnostischen Algorithmus werden Kultur-negative
klinische Proben zusätzlich in Mäuse inokuliert. Mit
dieser Methode kann in seltenen Fällen noch ein
Y. pestis-Stamm kultiviert und damit die Diagnose
Pest bestätigt werden. Ferner gibt es in der Abteilung
für Entomologie eine Flohzucht. Die Tiere werden für
Projekte eingesetzt, in denen die Erregerübertragung
durch Vektoren oder das Erregerverhalten im Vektor
studiert werden. Die Laborausstattung am IPM
entspricht einem niedrigen europäischen Standard.
Jedoch werden mehr und mehr moderne Geräte,
beispielsweise Echtzeit-PCR-Geräte zur Diagnostik
eingesetzt.
Im Zuge der madagassisch-deutschen Kooperation
wurde
bereits
2008
inaktiviertes
humanes
Probenmaterial von verdächtigen und bestätigten
Pestfällen aus dem Endemiegebiet Madagaskar an
das IMB transferiert und dort mittels Echtzeit PCR
untersucht. Die Ergebnisse wurden 2011 gemeinsam
publiziert (RIEHM J ET AL., MOL CELL PROBES,
2011). Dieses klinische Probenmaterial konnte zudem
zur Validation der Diagnostik-PCRs im Zuge der
Akkreditierung gemäß DIN EN ISO 15189 des
Zentralbereichs Diagnostik des IMB im Jahr 2012
verwendet werden. Nach Bestätigung der Diagnose
Beulenpest wurden die klinischen Proben weiterhin
dazu verwendet den Genotyp des Pesterregers zu
bestimmen und in Korrelation zum geographischen
Ursprung der humanen Infektion zu analysieren. Die
demographischen Daten wurden während des
Forschungsaufenthalts in Madagaskar im Sommer
2012 gemeinsam analysiert. Weiterhin konnten
Proben aus einem ungewöhnlichen Lungenpestausbruch des Jahrs 2011 im Norden von Madagaskar
hinzugefügt werden. Beim Verfassen eines gemeinsamen Manuskripts konnte das Fachlabor Pest am
InstMikroBioBw Expertise zu einer authentischen
Neben der Pest wird am IPM auch die Diagnostik von
Malaria, Tuberkulose, Leptospirose, Rickettsiosen
und diversen Viruserkrankungen betrieben. Das
Institut bietet der Bevölkerung von Madagaskar
zudem Beratung und Impfung gegen tropische
Infektionskrankheiten an.
Abbildung 1: Frontansicht des Eingangs des Institut Pasteur in
Madagaskars Hauptstadt Antananarivo. Das Institut wurde 1898
zur Forschung und Bekämpfung des Pesterregers gegründet.
Abbildung 2: Die Arbeitsgruppe Pest des Instituts besteht aus 3
Wissenschaftlern, 10 technischen Assistenten und 3 weiteren
Kollegen. Die Aufgaben umfassen neben der Forschung auch die
epidemiologische Feldarbeit.
19
Forschungskooperation mit dem Institut
Pasteur in Antananarivo, Madagaskar
der ICT und keinen diagnostischen Mehrwert bietet,
wird sie diesen als Alternativtest zur bakteriologischen
Kultur nach den erzielten Ergebnissen nicht ablösen.
Seit einiger Zeit stellt die Firma Miprolab, Göttingen,
ebenfalls
einen
ICT
zum
Nachweis
des
Y. pestis-spezifischen F1 Antigens her und vertreibt
diesen in Deutschland. In Kooperation mit dem
Wehrwissenschaftlichen Institut der Bundeswehr,
Munster, wurde dieser ICT für Umweltproben
entwickelt und getestet. Im Rahmen eines
Forschungs- und Entwicklungsprojekts der Abteilung
Immunologie des IMB soll die Anwendung des ICT für
klinisches Probenmaterial optimiert und validiert
werden. Ziel ist die Zulassung des Tests gemäß DIN
EN ISO15189 für die humane Diagnostik.
Ausbruchsuntersuchung gewinnen (RICHARD ET
AL., EMERG INFECT DIS, 2015). Bisher war in
diesem weit-nördlichen Gebiet Madagaskars noch
keine Pesterkrankung diagnostiziert worden. Daher
wurden zusätzlich PCR-positive Tierproben aus
diesem
Gebiet
molekulargenetisch
typisiert.
Insgesamt erfolgte der Transfer von 10 DNAs an das
InstMikroBioBw zur Analyse im Labor. Die
Interpretation der Ergebnisse und die Integration der
gewonnenen Daten in den bestehenden Datensatz
erlaubten den Schluss, dass das Ausbruchsgebiet
bereits ein eigenständiges Endemiegebiet der Pest
gewesen sein muss.
Seit mehreren Jahren wurde in Kooperation mit der
deutschen Firma TibMolbiol Trockenchemie zur
Echtzeit-PCR-Diagnostik unter dem Begriff ready-mixPCR, für verschiedene Erreger entwickelt und im
Labor erprobt. Der sensitivste Test zur Detektion von
Y.-pestis-DNA zielte auf das Gen des Plasminogen
Activators (pla) das bis zu 180-fach pro
Bakteriengenom vorkommt. Im Rahmen des
Forschungsaufenthalts am IPM sollte die ready-mixPCR zum Nachweis des Y. pestis-spezifischen plaGens anhand von vorcharakterisiertem klinischen
Material erprobt werden (Abbildung 3). Dazu wurden
149 humane Pestproben nach Verdünnung 1:10 und
1:50 mit PBS zur Inaktivierung und DNA-Freisetzung
ausschließlich kurz gekocht und direkt in die PCR
eingesetzt. Jede PCR wurde an zwei verschiedenen
Geräten getestet. Als Inhibitionskontrolle wurde die
Amplifizierung künstlicher Lambda-DNA in jedem
Ansatz gemessen. Der in diesem Projekt gewonnene
Datensatz umfasst die klinische Diagnose „Pest“,
Ergebnisse
eines
immunchromatographischen
Schnelltests (ICT) zum Nachweis des Y. pestisspezifischen F1-Antigens und die bakteriologische
Kultur als WHO-Goldstandard der Pestdiagnostik.
Im Rahmen der Kooperation mit dem IPM im PestEndemiegebiet besteht die Möglichkeit Prototypen
des deutschen ICT anhand von humanem
Probenmaterial zu testen. Zunächst wurde das
Detektionslimit anhand von artifiziellem F1 Antigen
ermittelt (Abbildung 4a und 4b). Es folgte die Testung
Abbildung 4a: Durchführung der Testung mittels ICT.
Die PCR detektierte 84 der 149 Proben (56%) und ist
damit sensitiver als der Goldstandard mit 27%
(Abbildung 3). Der seit Jahren am IPM angewandte
F1-Antigen ICT jedoch detektierte 83% der Proben.
Da die ready-mix-PCR immer noch aufwändiger ist als
Abbildung 4b: Auswertung des ICT: negatives (links), schwach
positives (Mitte) und eindeutig positives Ergebnis (rechts).
Abbildung 3: Ergebnisse der ready-mix-PCR zur Detektion des
Y. pestis-spezifischen pla-Gens. Die PCR wurde verglichen mit der
klinischen
Diagnose,
dem
IPM-internen
ICT
und
der
bakteriologischen Kultur.
20
von 30 klinischen Proben: 10 Proben mit dem
klinischen Verdacht auf Beulenpest ohne Bestätigung,
10 Proben, die im IPM-eigenen ICT und 10 Proben,
die zusätzlich in der bakteriologischen Kultur positiv
getestet worden waren (Abb. 5). Der Test ergab keine
falsch positiven Ergebnisse bei den 10 negativ
vorcharakterisierten Proben. Die 10 positiven Proben,
die keinen bakteriologischen Befund ergaben,
detektierte der Test alle richtig. Von 10 Proben, die
kulturell angezüchtet werden konnten, detektierte der
Test 9 Proben als positiv. Die Ergebnisse zeigen,
dass der Test zur Anwendung an klinischem Material
bereits sehr gut geeignet ist. Der hauseigene ICT des
IPM ist hinsichtlich der Sensitivität mit einem
Detektionslimit von 5 ng/ml jedoch um den Faktor 5
besser, da der ICT der Fa. Miprolab lediglich 25 ng/ml
F1 Antigen detektierte.
Ein weiteres gemeinsames wissenschaftliches Projekt
betrifft den Nachweis des Y. pestis-spezifischen F1Antigens aus historischem Skelettmaterial, wie es
bereits in publizierten Fachartikeln beschrieben
wurde. Am IMB besteht ein Kooperationsprojekt mit
dem Anthropologischen Institut der LudwigMaximilians-Universität München. Ziel ist der
Nachweis und die Typisierung des Pesterregers aus
historischem Material des Mittelalters und Altertums.
Im Zuge des Forschungsaufenthalts am IPM konnten
30 IPM-in house ICT Kits zum Nachweis des F1Antigens von Y. pestis ans IMB transferiert werden.
Die praktische Durchführung dieses Projekts war
jedoch nicht erfolgreich.
Die Expertise am IPM und der wissenschaftliche
Kontakt zu Kollegen in einem Pestendemiegebiet soll
durch die Kooperation mit Dr. Rajerison weiterhin
gepflegt werden. Dr. Rajerison wurde zur Medical
Biodefence Conference im Oktober 2013 nach
München eingeladen. Zusammen mit einer weiteren
Kollegin aus Madagaskar hielt sie hochinteressante
Vorträge über den Lungenpestausbruch 2011 und die
Rolle von Ratten bzw. Pestresistenz in Ratten im
Endemiegebiet Madagaskar.
Abbildung 5: Ergebnisse der Testung des deutschen ICT. Die
Methode wurde verglichen mit der klinischen Diagnose, dem IPMinternen ICT und der bakteriologischen Kultur.
21
Beide Seiten der Kooperation profitieren von
gemeinsamen Projekten und Ergebnissen, die, wie
bisher,
auch
in
Publikationen
mit
hohem
internationalem Niveau münden können. Hinsichtlich
der flexiblen Akkreditierung des InstMikroBioBw
gemäß DIN EN ISO 15189 besteht in dieser
Kooperation die Möglichkeit, neue Testsysteme an
vorcharakterisierten
und bestätigten
humanen
Probenmaterialien für den Pesterreger Y. pestis zu
validieren.
NATO-U3 bungen Precise Response
2012 und 2013
advice) für den jeweiligen Befehlshaber bereitzustellen und auf dessen Anforderung ggf. auch weiter
spezifisch vor Ort zu unterstützen. Jedes
Einsatzelement musste dabei mit den ihm
zugeordneten Kräften verschiedene CBRN-Lagen
bewältigen. Bei dieser Gelegenheit konnte eine
situative
Probennahmeund
Aufklärungsunterstützung für CBRN-Aufklärungskräfte anderer
Nationen in sieben B-Szenarien geleistet werden.
Zum wiederholten Mal wurde bei den Übungen das
gemeinsame Vorgehen mit internationalen EODKräften in einem integrierten Einsatz geübt. Das Ziel
dabei war durch den parallelen Einsatz von EOD- und
B-Aufklärungskräften schneller als bei einem seriellen
Ablauf Ergebnisse zu erzielen. Die Zusammenarbeit
des B-Aufklärungstrupps mit einem australischen
EOD-Team war komplikationslos. Es gelang den
Beteiligten rasch das eigene Vorgehen auf die
Notwendigkeiten
der
jeweils
anderen
Seite
anzupassen. Eine im Szenario vorhandene USBV
wurde schnell und komplikationslos durch die EODKräfte erkannt und neutralisiert. Proben aus einer
biologischen Beiladung konnten so ohne weiteren
Zeitverlust genommen werden und wurden durch den
B-Aufklärungstrupp korrekt bewertet. Im schnellverlegbaren Feldlabor wurden alle Proben gemäß
dem SIBCRA Protokoll angenommen, dokumentiert
und untersucht. Erstmals wurde hierfür ein
standardisierter
Probenbegleitschein
an
die
teilnehmenden Nationen verteilt. Dieser diente auch
der lückenlosen Dokumentation des Untersuchungsganges im schnell verlegbaren B-Labor. Insgesamt
wurden dabei 2012 mehr als 300 und 2013 mehr als
400 Einzeltestungen auf verschiedene B-Kampfstoffe
durchgeführt. Für jede eingelieferte Probe wurde ein
schriftlicher Befund erstellt und innerhalb von 24
Stunden nach Probeneingang dem Einsender
übergeben. Alle im Rahmen der Übungen 2012 und
2013 ausgebrachten B-Agenzien konnten durch das
Laborpersonal korrekt identifiziert werden.
2012 und 2013 nahm die Abteilung Med. BAufklärung und Verifikation des Instituts für
Mikrobiologie der Bundeswehr zum dritten und
vierten Mal in Folge mit jeweils zehn Soldatinnen
und Soldaten als Teil der Task Force Med. ABCSchutz an der NATO-Übung Precise Response in
Suffield, Kanada, teil. Im Rahmen jeder dieser
Übungsteilnahmen wurden das schnell-verlegbare
B-Labor sowie ein B-Aufklärungstrupp in Kanada
eingesetzt.
Das schnell-verlegbare B-Labor wurde in den
Übungsraum verlegt, aufgebaut und mit dem Auftrag
der Untersuchung der in den verschiedenen BioSzenarien gewonnenen Proben betrieben. Alle
teilnehmenden Nationen konnten während der Übung
bestimmen, ob sie die Proben im kanadischen Labor
(sofortige Entsorgung der Proben und Erstellung
eines „Übungsbefundes“) oder im deutschen B-Labor
(Aufarbeitung und molekularbiologische Diagnostik
der Proben mit anschließender Befunderstellung)
abgeben wollten. Der Med. B-Aufklärungstrupp führte
insgesamt zahlreiche B-Aufklärungsübungen eigenständig durch. Das standardisierte Vorgehen zur BAufklärung und Probennahme wurde in allen Fällen
an die jeweilige Einsatzsituation angepasst und
umgesetzt. Lagebeurteilung,
Probenpriorisierung
sowie die Durchführung der Probennahme und VorOrt-Testung konnten sachgerecht und fachlich korrekt
durchgeführt werden. Im schnell verlegbaren B-Labor
konnten aus allen genommenen Proben die jeweiligen
Darstellungsmittel nachgewiesen werden.
Im zweiten Abschnitt der Übungen wurden die BAufklärungstrupps zur Expertenberatung jeweils
insgesamt
drei
wechselnden,
multinationalen
Führungselementen unterstellt. Die Aufgabe für die
Angehörigen des B-Aufklärungstrupps bestand darin,
eine fachliche Beratung (Subject-matter-expert [SME]
Abbildung 1: Das schnell-verlegbare B-Labor im Einsatz in
Kanada
Abbildung 2: B-Aufklärungstrupp bei der Probennahme
22
2. Internationales Symposium zur Entwicklung von ABCAbwehrfä higkeiten:
Die medizinische B-Au;klä rung prä sentiert sich
Vorträgen an der Veranstaltung teil. Zentraler
Bestandteil der Präsentation war die schnellverlegbare B-Laborausstattung, die in einem am
Institut mitentwickelten, luftgestützten Laborzeltsystem ausgestellt wurde.
Das umfassende Fähigkeitskonzept, das von der
forensischen Probennahme an Menschen, Tieren und
in der Umwelt, über den Probentransport bis hin zum
bestätigten Erregernachweis im Feld reicht, traf auf
großes Interesse bei den internationalen Besuchern
des Symposiums. Auch für die teilnehmenden
Soldaten des Instituts bot die Veranstaltung
zahlreiche Gelegenheiten zum Erfahrungsaustausch
und zur Weiterentwicklung und Vertiefung der
Kontakte zu Partnern im Bereich der ABC-Abwehr in
Deutschland und Europa.
Mit zwei Vorträgen zu den Bereichen Bioforensik und
Ausbildung in der B-Aufklärung konnte das Institut für
Mikrobiologie der Bundeswehr auch im Fachprogramm des Symposiums eigene Beiträge und
Ergebnisse aus den angewandten translationalen
Forschungsarbeiten
auf
dem
Gebiet
des
Medizinischen B-Schutzes darstellen.
Militärische und zivile Behörden aus allen Ländern
müssen beim Schutz der Bevölkerung vor
terroristischen
Bedrohungen
noch
enger
zusammenarbeiten. Nationale und internationale
Kooperation war daher eines der Kernthemen auf
dem 2. Internationalen ABC-Abwehrkongress in
Berlin. Für den Bereich des medizinischen BSchutzes nahm die Abteilung Med. B-Aufklärung
und Verifikation an der Veranstaltung teil und
präsentierte bereits zum zweiten Mal ihre
Fähigkeiten
in
B-Aufklärung,
Diagnostik,
Forschung und Ausbildung.
Wie können Polizei und Feuerwehren die
Bevölkerung vor Terroranschlägen schützen, bei
denen chemische, biologische und nukleare
Kampfstoffe eingesetzt werden? Und welchen Beitrag
kann das Militär dazu leisten? Diese Fragen standen
im Mittelpunkt des „2. Internationalen Symposiums
zur Entwicklung von ABC-Abwehrfähigkeiten“, zu dem
die Studiengesellschaft der Deutschen Gesellschaft
für Wehrtechnik vom 22. bis 24. Oktober 2012 im
Berliner Congress Center eingeladen hatte. Mehr als
1000 Teilnehmer aus 60 Staaten waren der Einladung
gefolgt. Rund 80 Referenten führten das internationale Publikum durch das zweitägige Haupt- und
Fachprogramm, das alle Elemente der ABC-Abwehr
aus Sicht der Politik, der operativen Ebenen und der
Wirtschaft beleuchtete. Die Veranstaltung wurde von
einer Ausstellung im Innen- und Außenbereich des
Kongresszentrums begleitet, auf der sich zahlreiche
Unternehmen und Institutionen vorstellten.
Nach der sehr positiven Resonanz auf die Ausstellung
beim 1. CBRN-Symposium im Jahr 2010 nahm die
Abteilung Med. B-Aufklärung und Verifikation des
Instituts für Mikrobiologie der Bundeswehr 2012 zum
zweiten Mal mit einem Messestand und zwei
Abbildung 2: Im Gespräch mit einem Ausstellungsbesucher
Abbildung 1: Ausstellung
der schnell-verlegbaren
B-Aufklärungsund
Laborausstattung
23
Medical Biodefense Conference 2013:
Fortsetzung einer Erfolgsgeschichte
einer der bekanntesten Biowaffenexperten, Dr. Milton
Leitenberg von der Universität Maryland (USA),
Details aus seinem neuesten Buch über das
ehemalige sowjetische Biowaffenprogramm. Bei der
Eröffnungssitzung am 23. Oktober 2013 traten mit
Prof. Dr. Martin Maiden (Universität Oxford, UK) und
Prof. Dr. Christian Drosten (Universität Bonn) gleich
zwei internationale Spitzenforscher als Redner auf.
Maiden zeigte in seinem beeindruckenden Vortrag die
Möglichkeiten moderner bakteriologischer Genomanalysemethoden auf. Drosten, Mitentdecker des
SARS-Coronavirus, faszinierte das Publikum mit
einem Vortrag über die unerschöpfliche Virenvielfalt in
natürlichen Reservoirwirten, aus denen heraus immer
wieder neue Infektionserreger die Speziesbarriere
zum Menschen überwinden. Eindrucksvoll belegte er
damit die Rolle der Natur als „größtem Bioterroristen“,
wie es einmal der niederländische Virologe Osterhaus
treffend formulierte.
Fast 500 Experten aus dem militärischen Bereich,
von Regierungsorganisationen, Universitäten,
staatlichen Forschungseinrichtungen und der
Industrie fanden sich vom 22.–25. Oktober 2013 an
der Sanitätsakademie der Bundeswehr in
München zur Medizinischen B-Schutztagung
„Medical Biodefense Conference 2013“ ein.
Die Internationalität der Tagung war einmal mehr
beeindruckend, konnte doch der Tagungspräsident,
Oberstarzt Prof. Dr. Lothar Zöller, Leiter des Instituts
für Mikrobiologie der Bundeswehr (IMB), Teilnehmer
aus 39 Nationen begrüßen, deren Flaggen auf dem
Podium des Auditorium Maximum „Hans Scholl“
aufgereiht waren.
Mit Stolz verwies Prof. Dr. Zöller in seiner
Eröffnungsrede auf den damit erreichten neuen
Teilnehmerrekord bei diesem „Weltforum der MedicalBiodefense-Forschung“. Für die gastgebende Sanitäts
-akademie begrüßte der neue Direktor Wissenschaft,
Generalarzt Dr. Norbert Weller, die Gäste aus aller
Welt. Internationale Fachtagungen wie diese stünden
fortan im Fokus des Interesses der „neuen
Sanitätsakademie“, betonte Dr. Weller. Auch der
Präsident der Deutschen Gesellschaft für Wehrmedizin und Wehrpharmazie (DGWMP), Generalarzt
a. D. Dr. Christoph Veit, wandte sich mit einem Grußwort an das Publikum. Die DGWMP war bereits zum
dritten Mal Partner des IMB bei der Organisation
dieser traditionellen, im Jahre 1994 begründeten
Tagung und trug eine Industrieausstellung mit 27
Ausstellungsständen sowie ein wissenschaftliches
Satellitensymposium bei.
Das umfangreiche Konferenzprogramm war in
parallele Sitzungen zu verschiedenen Themenschwerpunkten aufgeteilt, die ausnahmslos hervorragend besucht waren. Große Aufmerksamkeit fand
zum Beispiel die Sitzung des Deutschen Zentrums für
Infektionsforschung (DZIF), die sich schwerpunktmäßig mit dem Middle East Respiratory Syndrome
(MERS) befasste. In der wissenschaftlich herausragenden „Pest-Sitzung“ traten unter dem Motto
„Black death still alive?“ einige der weltweit führenden
Pestforscher auf. Oberstabsveterinär Dr. Julia Riehm
(IMB) präsentierte dabei die neuesten Genomtypisierungsdaten über die in ihrer Arbeitsgruppe
untersuchten Pestbakterien-Stämme. Professor Dr.
Dave Wagner von der Northern Arizona University
beantwortete schließlich die rhetorisch gemeinte
Motto-Frage mit einem klaren „Ja“ und erbrachte
dafür den molekularen Beweis. In einem durchaus
nicht unumstrittenen Vortrag wies die international
renommierte Biowaffenexpertin, Jill Bellamy van Alst
auf die mögliche Bedrohung durch ein syrisches BWaffenprogramm hin, für dessen Existenz sie starke
Verdachtsmomente sieht.
Ein anspruchsvolles Programm mit 100 Vorträgen und
109 Posterpräsentationen, verteilt über zweieinhalb
Tage, erwartete die Teilnehmer, die sich bereits am
Vortag der offiziellen Eröffnung bei einer „Special
Lecture“ einstimmen konnten. Dabei präsentierte
Viel Aufmerksamkeit fand auch der interaktive Fallund Szenario-Workshop, bei dem die Zuhörer
Gelegenheit
hatten,
mit
Hilfe
eines
TEDAbstimmungssystems
ihre
Meinung
zu
den
präsentierten klinischen Fällen sowie dem Szenario
eines Anschlags auf das Münchner Oktoberfest
einzubringen. In weiteren Fokus-Sitzungen wurden
die neuesten Entwicklungen auf dem Gebiet der
mobilen Laboratorien sowie die neuesten Diagnostika
und Therapeutika-Entwicklungen vorgestellt. Im
Rahmen der Industrieausstellung präsentierte das
IMB das unter Federführung von Oberfeldarzt Dr.
Wölfel im Rahmen eines EU-Projekts entwickelte
Abbildung 1: In einer "Special Lecture" präsentierte Milton Leitenberg unter dem Vorsitz von Ernst-Jürgen Finke Daten aus
seinem neuesten Buch über das ehemalige sowjetische Biowaffenprogramm.
24
Abbildung 2: Glückliche Gewinner eines Posterpreises
mobile Biolabor, das künftig durch die Europäische
Union der WHO für Ausbruchsuntersuchungen zur
Verfügung gestellt werden soll. Am Rande der
Tagung trafen sich zahlreiche NATO-Arbeitsgruppen
und Netzwerke, deren Mitglieder die regulären Treffen
mit einer Tagungsteilnahme verbanden. Ausländische
Militärdelegationen aus Aserbaidschan, Jordanien,
Pakistan, Tunesien und der Mongolei nahmen im
Rahmen der bilateralen Jahresprogramme an der
Tagung teil. Delegationen aus Kasachstan und
Georgien waren angereist, um die Projektaktivitäten
im Rahmen des deutschen Beitrags zum „G8-GlobalPartnership“-Programm
zur
Stärkung
der
Biosicherheit mit dem Institut für Mikrobiologie der
Bundeswehr abzustimmen.
Vorabend der Tagung zu einem „Icebreaker“. Ebenso
gut besucht war der Bayerische Abend im
Augustinerkeller,
bei
dem
die
Stadtkapelle
Unterschleißheim
mit
bayerischer
Blasmusik
aufspielte. Die Mitarbeiter des Instituts für
Mikrobiologie der Bundeswehr sowie zahlreiche
Teilnehmer waren in Dirndl und Lederhosen
erschienen und sorgten für gute Laune und angeregte
Unterhaltung. Die traditionell familiäre Atmosphäre
der Medical Biodefense Conference war trotz der
hohen Teilnehmerzahl auch bei dieser Tagung wieder
spürbar
und
gehörte
neben
der
hohen
wissenschaftlichen Qualität der Beiträge zu den
Alleinstellungsmerkmalen, die diese Konferenz
auszeichnen.
Abgerundet
wurde
die
Medical
Biodefense
Conference 2013 durch das von der DGWMP
organisierte und unterstützte Rahmenprogramm. Über
300 Tagungsteilnehmer trafen sich bereits am
Die nächste internationale Medical Biodefense
Conference ist im Frühjahr 2016 wiederum in
München geplant.
Abbildung 3: Das Konferenzdinner im Hofbräukeller
25
10 Jahre Neubauplanung fü r das
Zentrum Medizinischer ABC-Schutz
Im August 2002 kam es zu einem starken personellen
Aufwuchs des Instituts. Das nach altem Personalschlüssel ausgebrachte und daher viel zu kleine Labor
der Schutzstufe 3 sowie die fehlende Laborkapazität
der Schutzstufe 4 ermöglichten es prospektiv nicht
mehr, den Institutsauftrag, die Handlungsfähigkeit im
Medizinischen B-Schutz, nachhaltig sicherzustellen.
Eine weitere Beeinträchtigung der Auftragserfüllung
stellt die geplante Generalsanierung der über 70 Jahre
alten Bausubstanz dar, in der sich das Institut
augenblicklich noch befindet. Daher wurde im Jahr
2002 mit infrastrukturellen Planungen für ein Zentrum
Medizinischer ABC-Schutz begonnen. Die dann in den
Folgejahren veranlassten Planungsmaßnahmen und
der aktuelle Sachstand sind in der Tabelle aufgeführt.
Datum
Planungsschritt
05.11.02
Die Oberfinanzdirektion Karlsruhe beauftragt die Erarbeitung eines Raumbedarfsplanes einschließlich eines Raumbuches für die Institute für Mikrobiologie und Radiobiologie.
24.11.03
06.04.05
12.09.05
27.06.06
Vorlage der „Grundlagenermittlung Zentrum Medizinischer ABC-Schutz“ inkl. Betriebskostenabschätzung durch Heinle, Wischer und Partner beim Bundesministerium der Verteidigung
(BMVg)
Überarbeitung der am 24.11.03 erstellten Vorlage „Grundlagenermittlung Zentrum Medizinischer ABC-Schutz“ durch die Abteilung Sanitätsinfrastruktur Management der Bundeswehr
(SIM Bw)
Infrastrukturbesprechung mit Beauftragung des Staatlichen Bauamtes München 1 zur Klärung
der Unterbringung der Institute sowie Weiterleitung des Raumprogrammes durch die Wehrverwaltung an das Bundesministerium für Finanzen (BMF) mit dem Ziel der haushaltsmäßigen
Anerkennung
Die Ressortverhandlung mit dem BMF führt zur Anerkennung des Raumprogrammes. Die Unterbringung der beiden Institute soll zusammen mit dem Institut für Pharmakologie und Toxikologie der Bundeswehr als Zentrum für Medizinischen ABC-Schutz realisiert werden.
21.12.06
Nach Durchführung von Abstimmungsbesprechungen stellt die Bauverwaltung das Ergebnis
der Realisierbarkeitsuntersuchung dem BMVg vor: Realisierung des Institutsbaus (sog. Fingerlösung) mit fünf eigenständigen, abtrennbaren Laborbereichen (davon ein Bereich für S3Labore und ein Bereich für das S4-Labor); Dienst- und Peripherieräume werden in bestehender
Bausubstanz ausgebracht.
25.03.08
Vorlage der geprüften Entscheidungsunterlage (ES)-Bau Teil V durch die Landesbaudirektion:
Kosten 57 Mio €
25.07.08
Vorlage der ES-Bau beim BMVg zur Prüfung und haushaltsmäßigen Anerkennung
12.03.09
Vorlage einer Ergänzung zur ES-Bau bei BMVg (sog. Riegellösung) zur haushaltsmäßigen
Anerkennung und Beauftragung
28.09.10
gemäß Protokoll der Ressortverhandlung ist die Entwurfsunterlage (EW)-Bau zweigeteilt, d. h.
für einen Umbau/Neubau ohne S4-Labor bzw. für den Neubau des S4-Labors aufzustellen und
dem BMF unabhängig von der Kostenhöhe in Gesamtheit vorzulegen.
10.03.11
Genehmigung der Baumaßnahme mit haushaltsmäßiger Anerkennung einer reduzierten Kostenobergrenze von 50 Mio €.
13.04.11
Beauftragung des Staatlichen Bauamtes München 1 mit der weiterführenden Planung durch
die Landesbaudirektion
2012
Die Auflagen des seit Januar 2012 geltenden Sabotageschutz-Gesetzes führen aufgrund der
für alle Mitarbeiter der Planungsbüros verpflichtend durchzuführenden Sicherheitsüberprüfungen zu erheblichen Verzögerungen.
2013
08/2013
Die Sicherheitsüberprüfungen liegen nunmehr vor. Durch das Staatliche Bauamt wurde eine
aktualisierte Kostenschätzung in Höhe von 55,38 Mio € vorgelegt, für die Baustellenabsicherung sind weitere 2 Mio € zu kalkulieren.
Nach Beauftragung und Einarbeitung der Planungsbüros erfolgte eine erste Planungsbesprechung.
Die in 2007 erstellte ES-Bau wurde komplett überarbeitet. Das neue Raumbuch wurde vom
BMF unter Vorbehalt haushaltsmäßig anerkannt. Der vom Bundesrechnungshof geforderte
Prüfvermerk, eine Mitnutzung des Labors der Schutzstufe 4 in Hamburg sei zu prüfen, muss
allerdings noch ausgeräumt werden.
26
Der neue Internetauftritt des IMB
Im Sommer 2012 war es endlich soweit: Der lange
geplante und unter Mitwirkung aller Abteilungen
intensiv vorbereitete Internetauftritt des Instituts ging
„ans Netz“. In einer übersichtlichen Menüstruktur kann
sich der interessierte Leser nun rasch einen Überblick
über die Fähigkeiten des Instituts und über laufende
Projekte verschaffen oder bei Bedarf in die Details der
Arbeit der Fachabteilungen, Arbeitsgruppen und
Konsiliarlabore einsteigen. Eine News-Spalte stellt auf
der Startseite zudem die aktuellen Ereignisse heraus.
Außerdem kann man mit nur einem Klick die
neuesten Seminarangebote aufrufen. Das gesamte
Leistungsspektrum des Zentralbereichs Diagnostik
steht ebenso zum Download bereit wie der
Einsendeschein des Instituts. Die Seite wird sehr gut
frequentiert was sich auch in der hohen Zahl an
Initiativbewerbungen niederschlägt, die das Institut
seither erhält.
27
Das IMB als Partnerinstitut des DZIF
(Deutsches Zentrum fü r Infektionsforschung)
Das Institut für Mikrobiologie der Bundeswehr ist
seit 2010 Partner-Institut des DZIF am Standort
München. Seine Aktivitäten finden in der
laufenden Förderperiode in Form zweier Projekte
statt, die in der TTU Emerging Infections
durchgeführt werden. Eines der Projekte befasst
sich mit der Entwicklung eines Schnelltests zum
Nachweis von Affenpockenviren, das zweite mit
der molekularen Epidemiologie des FSME Virus.
Die Projekte sind in den Jahresberichten durch
die betreffenden Abteilungen näher beschrieben.
Der Institutsleiter nimmt regelmäßig an den
Sitzungen
des
Leitungsausschusses
der
Partnereinrichtungen am Standort München teil.
28
Zentralbereich Diagnostik
Der
Zentralbereich
Mikrobiologie
der
diagnostik
zum
störungen
beim
Diagnostik
am
Bundeswehr
Nachweis
für
Zentralbereich Diagnostik ist daher Mitglied des
Spezial-
europäischen Netzwerkes für die Diagnostik von
B-Gesundheits-
Hochpathogenen Bakterien („ENHPB - European
bietet
von
differenzial-
Network for Highly Pathogenic Bacteria“), das aus
Infektions-
dem europäischen Projekt „EQADeBa - Establishment
erregern auf dem neuesten Stand der Wissenschaft.
of Quality Assurances for Detection of Highly
Zum Leistungsspektrum gehören zahlreiche Bakterien
Pathogenic Bacteria of Potential Bioterrorism Risk“
wie z.B. Bacillus anthracis, Yersinia pestis oder
hervorgegangen ist und erfolgreich eine externe
Francisella tularensis und Viren wie Orthopockenviren
Qualitätskontrolle
oder Hämorrhagische-Fieber-Viren (z.B. Marburg-,
laboratorien aufgebaut hat. Das Netzwerk ENHPB hat
Lassa- und Ebola-Virus). Da eine zweifelsfreie
sich 2011 mit dem Netzwerk für hochpathogene Viren
Diagnostik bei diesen Erregern, insbesondere bei der
(European Network of P4 Laboratories) zusammen-
Aufklärung von natürlichen Ausbrüchen vs. absichtlich
getan und die erneute Förderung von der EU für ein
ausgebrachten Erregern, von besonderer Bedeutung
Projekt zur externen Qualitätssicherung erhalten. Das
ist, hat der Zentralbereich Diagnostik die Testver-
nun
fahren in ein Qualitätsmanagementsystem eingebettet
Assurance
und
diagnostisch
sich
im
Menschen
Institut
relevanten,
Jahr
2012
und
gefährlichen
erfolgreich
nach
laufende
der
Projekt
Exercises
europäischen
„QUANDHIP
and
Spezial-
–
Networking
Quality
on
the
der
Detection of Highly Infectious Pathogens“ hat neben
Europäischen Norm für Medizinische Laboratorien
der externen Qualitätskontrolle die Schwerpunkte in
DIN EN ISO 15189 akkreditiert. In dieser Norm
der Standardisierung der antimikrobiellen Empfindlich-
werden besondere Anforderungen an die Qualität und
keitsprüfung von Bakterien, der Austestung von
Kompetenz des Laboratoriums gestellt. Dabei werden
Schnelltests für den Nachweis von biologischen
neben der Prä- und Postanalytik insbesondere an die
Agenzien und in der Identifizierung von hoch-
interne und externe Qualitätskontrolle besondere
pathogenen Bakterien mittels MALDI-TOF-MS. Neben
Forderungen gestellt. Für die externe Qualitäts-
der
kontrolle wird beispielsweise eine Teilnahme an
bakteriologischen
Ringversuchen für jeden angebotenen Parameter
Zentralbereich Diagnostik 2012-2014 besonders bei
gefordert. Aufgrund der Besonderheit des Erreger-
der Standardisierung der antimikrobiellen Empfindlich-
spektrums des Instituts kann diese Forderung durch
keitsprüfung eingebracht.
kommerzielle Anbieter nicht erfüllt werden. Der
29
Teilnahme
an
den
virologischen
Ringversuchen
hat
sich
und
der
Murines Fleck;ieber:
Importierte Infektion nach Kreta-Aufenthalt
Arthralgien.
Laborchemisch
fielen
erhöhte
Transaminasen, eine erhöhte gamma-GT und ein
Procalcitonin von 2,1 ng/ml auf. Es bestand eine
Thrombopenie von 79/nl. Sonografisch wurde eine
Hepatosplenomegalie und ein leichter Aszites
diagnostiziert. Im Röntgenthorax zeigten sich feinretikuläre Infiltrate. Die Patientin berichtete keine
Erkrankungen im beruflichen oder privaten Umfeld,
keine Insekten- oder Tierbisse. Vorerkrankungen
bestanden bei der Patientin nicht. Alle Blutkulturen
blieben negativ. Aufgrund der bereits therapierefraktären Fieberkontinua unter Ceftriaxon wurde ein
atypischer Erreger vermutet.
Umfangreiche serologische Untersuchungen aus
Untersuchungsmaterialien vom siebenten Erkrankungstag auf Salmonellen, Mycoplasmen, Brucellen,
Bartonellen, Coxiellen, Anaplasma und Rickettsien
blieben negativ. Hinweise für eine Legionellose, virale
Hepatitis oder HIV-Infektion ergaben sich nicht.
Vor der Einleitung einer neuerlichen empirischen
antibiotischen Therapie erfolgte eine Knochenmarkspunktion zur Anlage einer Knochenmarkkultur und
histopathologischen
Begutachtung
des
Stanzzylinders. Unter der sich anschließenden empirischen
antibiotischen Therapie mit Ciprofloxacin entfieberte
die Patientin prompt, das Exanthem war innerhalb von
24 Stunden komplett regredient. Die Knochenmarkskulturen blieben nach sieben Tagen der Inkubation
steril, Hinweise für eine hämatologische Erkrankung
bestanden nicht.
Aufgrund eines epitheloidzelligen Granuloms im
histopathologischen Präparat des Knochenmarks
stellte die Patientin sich am 18. Tag nach
Erkrankungsbeginn
zur
serologischen,
laborchemischen und klinischen Verlaufskontrolle in der
infektiologischen Ambulanz vor. Klinisch und
laborchemisch fand sich eine restitutio ad integrum.
Serologisch hingegen konnte am Institut für
Mikrobiologie der Bundeswehr ein deutlicher
Titeranstieg gegen Rickettsien der Fleckfieber-Gruppe
Im September 2012 diagnostizierte der ZBD ein
murines Fleckfieber bei einer Patientin mit
unklarem Fieber und Exanthem nach KretaAufenthalt. Murines Fleckfieber ist neben dem
häufigerem „Fievre Boutonneuse“ (R. conorii)
eine wichtige und weitgehend unbekannte
Differentialdiagnose bei Reiserückkehrern aus
dem östlichen Mittelmeerraum mit der typischen
klinischen
Konstellation:
hohes
Fieber,
stammbetontes
Exanthem,
Erhöhung
der
Transaminasen und Thrombopenie. In der
aktuellen Literatur werden kleinere, über mehrere
Jahre gesammelte Fallserien vom griechischen
Festland und den griechischen Inseln berichtet
Eine 51-jährige Patientin kehrte Anfang September
2012 von einem 10-tägigen Urlaub auf Kreta zurück.
Bereits am Rückreisetag entwickelte die Patientin
hohes Fieber > 40°C axillär gemessen. Am zweiten
Tag nach der Reiserückkehr erfolgte die stationäre
Aufnahme in einem peripheren Krankhaus. Die
Patientin litt unter persistierendem Fieber. Es zeigten
sich bei Krankenhausaufnahme lediglich eine geringe
CRP-Erhöhung von 80 mg/dl (Normbereich bis 5 mg/
dl), keine pulmonalen Infiltrate sowie unauffällige
sonografische Untersuchungsbefunde des Herzens
und des Abdomens. In einer Blutkulturflasche des
einzigen abgenommen Sets wurde Staphylococcus
epidermidis nachgewiesen. Dieser Befund wurde als
Kontamination gewertet. Nach Einleitung einer
empirischen Therapie mit Ceftriaxon trat keine
klinische Besserung ein. Die Patientin beendete
gegen ärztlichen Rat die stationäre Behandlung. Am
siebten Tag nach Reiserückkehr erfolgte schließlich,
auf Drängen des Hausarztes, die stationäre
Aufnahme in der infektiologischen Abteilung des
Landkreises.
Bei
der
Aufnahme
bestanden
Fieberkontinua von 40°C, ein makulopapulöses
stammbetontes Exanthem, sowie Myalgien und
Abbildung 1: Indirekter Immunfluoreszenztest des Serums vom 27.09.2012: positiv für Rickettsia conorii (A: gelbe Pfeile), negativ für
Rickettsia typhi (B).
30
(R. prowazekii, R. typhi) – im indirekten Immunfluoreszenztest für IgG nachgewiesen werden (Abbildung 1)
der beweisend für eine Infektion mit R. typhi oder
R. prowazekii ist. Die Serologie der Erreger der
Zeckenbissfieber-Gruppe (R. conorii, R. ricketsii,
R. akari, R. sibirica und R. australis) zeigte keine IgGAntikörper. Die Befunde der Ausgangsserologie
wiesen Werte auf, die unterhalb des Cut-offs lagen
(siehe Tabelle 1). Aus Blutproben in der akuten
Krankheitsphase sowie aus dem in Paraffin
eingebetteten Knochenmark-Stanzzylinder wurde der
molekularbiologische Direktnachweis mittels EchtzeitPCR des Citratsynthase-Gens (gltA) versucht – leider
konnten keine Rickettsien-spezifischen Sequenzen
amplifiziert werden. Aufgrund von Kreuzreaktivitäten
ist eine zuverlässige serologische Unterscheidung
zwischen R. prowazekii und R. typhi mittels IIFT nicht
möglich. Vor dem Hintergrund der epidemiologischen
Situation im Reiseland und des klinischen Verlaufs
muss eine Murine Fleckfiebererkrankung angenommen werden. R.-typhi-Infektionen werden in
vereinzelten Fallberichten mit epitheloidzelligen
Knochenmarksgranulomen in Verbindung gebracht (J.
BORDE et al. EPIDEMIOLOG BULLETIN 49/2012).
Serum vom Serum vom
18.09.2012 27.09.2012
Rickettsia typhi IgG Titer
<1:64
1:2048
Rickettsia prowazekii Titer
<1:64
1:2048
Rickettsia conori IgG Titer
<1:64
<1:64
Tabelle 1: Verlaufsserologisch konnte ein deutlicher Titeranstieg
gegen Rickettsien der Fleckfieber-Gruppe (R. prowazekii,
R. typhi) nachgewiesen werden.
31
Fallbeispiel: Unklare Ef;loreszenzen
bei einem HIV-Patienten
Im bei Aufnahme angefertigten CT-Thorax war ein
flächiges Infiltrat im linken Oberlappen, alveoläre
Infiltrate bipulmonal, große Lymphknoten mediastinal
und ein Pleuraerguss links erkennbar. Die ebenfalls
bei Aufnahme angefertigten CT-Schädel und
Abdomen waren unauffällig. Es wurde eine kalkulierte
Therapie mit Moxifloxacin, Cotrimoxazol, Voriconazol,
Oseltamivir und Ceftazidim begonnen. Aufgrund
progredienter Verschlechterung wurde die Therapie
auf Linezolid, Ganciclovir und Meropenem umgestellt.
Zusätzlich wurde eine antiretrovirale Therapie
gestartet. Nach sieben Tagen verstarb der Patient auf
der Intensivstation an einer Lungenembolie.
Unklare Haut-Effloreszenzen bei HIV-Patienten
führen meist zur Verdachts-Diagnose eines
Karposi-Sarkoms. In dem hier geschilderten Fall
eines multi-morbiden Patienten mit schweren
infektiologischen und internistischen Grunderkrankungen wird eine ungewöhnliche Differenzialdiagnose des Karposi-Sarkoms diagnostiziert.
Ein 35-jähriger Patient wurde Ende Oktober 2012 mit
respiratorischer
Insuffizienz
bei
beginnendem
Lungenversagen in ein Krankenhaus eingeliefert.
Unter antibiotischer Therapie verschlechterte sich der
Gasaustausch zunehmend, so dass der Patient
bereits nach einem Tag im septischen Schock mit
kardialer Dekompensation und akutem Nierenversagen auf die Intensivstation verlegt wurde. Es
bestanden weiterhin eine Bronchopneumonie mit
schwerem Lungenversagen und ein Pleuraerguß. Als
Grunderkrankung war eine HIV-Krankheit der
klinischen Kategorie C bekannt. Zusätzlich bestand
der Verdacht auf eine Tuberkulose, die sich jedoch im
weiteren Verlauf nicht bestätigte. Nebenbefundlich
bestanden bei dem Patienten eine Hepatitis B und C
und eine EBV-Infektion. Des Weiteren bestand ein
chronischer Heroinabusus mit Methadonsubstitution.
Bereits bei Aufnahme des Patienten waren
Effloreszenzen am rechten Oberschenkel und rechten
Unterarm aufgefallen, die im weiteren Verlauf auch im
Bereich des Gesäßes, Bauches und des Kopfes
auftraten (siehe Abbildung 1). Es wurde die
Verdachtsdiagnose eines Karposi-Sarkoms gestellt
und eine Biopsie veranlasst. Im pathohistologischen
Befund zeigten sich eosinophile Einschlußkörperchen
und
es
bestand
der Verdacht
auf
eine
Orthopockenvirus-Infektion. Daraufhin wurde das
Material zum Institut für Mikrobiolgie der Bundeswehr
für eine Orthopockenvirusdiagnostik eingesendet.
Abbildung 1: Hauteffloreszenzen des Patienten.
32
Abbildung 2: Orthopockenvirus-EchtzeitPCR
Die Orthopockenvirus-Echtzeit PCR war positiv (siehe
Abbildung 2). Die Sequenzierung des OrthopockenHA-Gens ergab Kuhpockenvirus. Zusätzlich wurde
aus der Hautbiopsie Kuhpockenvirus in der Zellkultur
angezüchtet. Der Antikörpernachweis gegen Orthopockenvirus blieb negativ. Im Serum des Patienten
wurde jedoch ebenfalls Kuhpockenvirus-spezifische
Nukleinsäure nachgewiesen. Dies spricht für eine
generalisierte Kuhpockenvirus-Infektion. Haustiere
waren bei dem Patienten nicht bekannt. Eine weitere
Anamnese zur Infektionsquelle war ebenso wie eine
Obduktion des Patienten leider nicht möglich.
Kuhpockenvirus gehört zur Familie der Poxviridae,
Genus Orthopoxvirus. Es handelt sich um ein
quaderförmiges 400nm großes DNA-Virus mit
resistenter Eiweißhülle. Das Krankheitsbild hat eine
Inkubationszeit von 8-12 Tagen und äußert sich
normalerweise als selbstlimitierende, lokale Infektion;
typischerweise an Händen, Gesicht, Körperstamm.
Zusätzlich können eine lokale Lymphknotenschwellung und Allgemeinsymptome auftreten. Eine
Beteiligung der Augen und oralen Schleimhäute ist
33
möglich und es kommt in der Regel zu einer narbigen
Abheilung. Bei Immunsuppression, wie es bei dem
geschilderten Fall vorlag, kann eine Generalisierung
auftreten. Es gibt hierzu aber nur Einzelfallbeschreibungen in der Literatur. Eine Generalisierung
bei einer Immunsuppression durch eine HIVErkrankung wurde bisher nicht beschrieben. Das
Reservoir der Kuhpockenviren sind Wildnager
(symptomatisch oder asymptomatisch). Der Mensch
stellt ebenso wie Katzen, Rinder und Zootiere das
Endglied von Infektketten dar. Die Übertragung erfolgt
durch Kontakt zu infizierten Tieren, ebenso ist eine
Laborinfektion möglich. Die Diagnostik erfolgt durch
direkten
Erregernachweis
(PCR,
Zellkultur,
Elektronenmikroskopie) aus Exsudat, Vesikelinhalt
und Krusten; bei generalisierter Infektion auch aus
EDTA-Blut. Des Weiteren ist eine Serologie aus zwei
Serumproben im Krankheitsverlauf möglich. Die bei
dem
Patienten
nachgewiesenen
intrazytoplasmatischen eosinophilen Einschlußkörperchen
sind typisch für eine Kuhpockenvirusinfektion.
STAN-UNTERPROJEKT 34-2001-15 | B-Spezialdiagnostik und Hochsicherheitslabor
STAN-PROJEKT 51-2011 | Zentralbereich Diagnostik
Evaluierung des Gerä tes PLEX-ID mit dem Erregerspektrum B-Agenzien inklusive relevanter Non-Target-Erreger
wurden in den Ergebnissen auch andere Erreger
angezeigt.
Die
Auswertung
gestaltete
sich
entsprechend schwierig.
Des Weiteren wurde das PLEX-ID-System parallel zu
den Routine-Verfahren (Erreger-spezifische PCRs
und bakteriologische Kultur) in einem Ringversuch
eingesetzt. Der Ringversuch bestand aus 10 Proben
mit lebenden Erregern der Risikogruppe 3 und 10
Proben in den Matrices Milch bzw. Serum. Das PLEX
-ID war in der Lage, Target- und Nichttarget-Erreger
zu
identifizieren.
Allerdings
waren
die
Hintergrundsignale im Ergebnislayout in den
inaktivierten Proben sehr hoch. Hier wurden Erreger
identifiziert, die als Material-spezifisch anzusehen
sind (z.B. Pseudomonas fluorescence/stutzeri in
Milch). Dies erschwerte die Gesamtauswertung. Eine
mögliche
Kreuzkontamination
ist
nicht
auszuschließen. Diese Ergebnisse wurden als Poster
auf der Fachtagung der Deutschen Gesellschaft für
Hygiene und Mikrobiologie 2012 präsentiert.
Bearbeiter
OSA Dr. Thoma
Laufzeit
01/2011 bis 12/2013
Sachstand
Derzeit stehen nur gezielte Verfahren zum schnellen
direkten Erregernachweis zur Verfügung. Mit der
neuen molekularbiologischen Diagnostikplattform
zum universellen Nachweis von Infektionserregern
auf der Basis von Nukleinsäureamplifikation und
massenspektrometrischer Identifizierung (PLEX-ID)
soll diese Fähigkeitslücke geschlossen werden.
Zielsetzung
Es ist geplant die Eignung des Assays für klinische
Proben auszutesten, indem die Nachweisgrenze und
der Einfluss von klinischen Probenmatrizes im
Vergleich zu den Inhouse-PCRs untersucht wird. Die
Evaluierung der PLEX-ID Technologie erfolgt in
Kooperation mit der Firma LABCON-OWL GmbH,
Bad Salzuflen.
Bewertung
Das PLEX-ID-System kann als eine orientierende,
zusätzliche Screeningmethode eingesetzt werden.
Allerdings
erschwert
die
Möglichkeit
von
Kreuzkontaminationen und die Detektion von
Umgebungskeimen eine sichere Identifizierung. Die
Primärdiagnostik muss daher immer durch PCRbasierte Methoden erfolgen.
Methoden
Die Identifizierung von Target-Bakterien und nah
verwandten Non-Target-Bakterien aus DNS von
Kulturmaterial
und
bekannt
positivem
Patientenmaterial
soll
durch
die
PLEX-ID
Technologie im Vergleich zu den am Institut
etablierten spezifischen Target-PCRs durchgeführt
werden. Hierbei sollen die Nachweisgrenzen und der
Einfluss von diversen klinischen Probenmatrizes (z.B.
Stuhl,
Serum)
ermittelt
werden.
Etablierte
molekularbiologische Nachweismethoden dienen als
Referenzmethode.
Ausblick
Der Verdacht möglicher Kreuzkontaminationen hat
sich bestätigt. Das Gerät PLEX-ID wurde aufgrund
von erheblichen Kontaminationsproblemen Anfang
Oktober 2012 komplett vom Markt genommen. Die
Firma LABCON-OWL GmbH gibt das Gerät Anfang
2013 komplett an die Firma Abbott zurück. Eine
Weiterführung des Projektes ist damit nicht mehr
möglich, zumal die hier verwendeten Assays in einer
eventuellen künftigen Neukonfiguration des Gerätes
nicht mehr verfügbar sein werden.
Ergebnisse
Die Eignung des PLEX-ID Biothreat Assay für
klinisches Probenmaterial wurde anhand des
Erregers Bacillus anthracis getestet. Es wurden
insgesamt 27 Stämme verschiedener Bacillus spp.
(B. anthracis n=10, B. cereus n=8, B. thuringiensis
n=3, B. weihenstephanensis n=1, B. mycoides n=1,
B. globigii n=1, Bacillus sp. unbekannt n=3)
untersucht. Die Nachweisgrenze und der Einfluss von
klinischen Probenmatrizes (Stuhl, Serum, Sputum,
EDTA) wurden im Vergleich zu den Inhouse-PCRs
untersucht. In den Matrices Serum und Sputum
waren die Nachweisgrenzen akzeptabel, allerdings
34
STAN-UNTERPROJEKT 34-2001-15 | B-Spezialdiagnostik und Hochsicherheitslabor
DRITTMITTELPROJEKT 03155083 | Zentralbereich Diagnostik
Quality Assurance Exercises and Networking on the
Detection of Highly Infectious Pathogens (QUANDHIP)
versuchen wurden inaktivierte Proben von BSL4
Erregern mittels molekularbiologischer Methoden
untersucht. Der ZBD hat für alle Parameter des
Analysespektrums 100% richtige Ergebnisse erzielt.
Lediglich im ersten virologischen Ringversuch 2012
gelang der differenzialdiagnostisch angeforderte
Nukleinsäurenachweis von Herpes Simplex Virus
(HSV) nicht.
In der inter-Laborvalidation der AG AST wurden 35
Bakterienisolate mittels einer standardisierten
Arbeitsanweisung in sechs EU Speziallaboratorien
getestet. Beim den bakteriologischen Treffen wurden
die Ergebnisse diskutiert. Insbesondere bei der
Bestimmung der antimikrobiellen Empfindlichkeit von
langsam wachsenden Bakterien, wie Brucella spp.
und Francisella tularensis kam es zu größeren
Abweichungen zwischen den Laboratorien. In den
Ringversuchen der AG MALDI wurden Probleme bei
der Differenzierung von Targeterregern und nah
verwandten Spezies identifiziert (z.B. Bacillus
anthracis vs. Bacillus cereus).
Bearbeiter
MedDir Dr. Schmoldt, OSA Dr. Thoma
Laufzeit
08/2011 bis 01/2015
Sachstand
Für die Diagnostik von Bakterien der Risikogruppe 3
und Viren der Risikogruppe 4 ist eine externe
Qualitätssicherung der eingesetzten Testverfahren
derzeit nur durch Beteiligung an Netzwerken zur
Qualitätssicherung möglich. Dazu gehört das von der
Europäischen Kommission als Joint Action geförderte
Projekt (EAHC Nr. 2010 21 02) QUANDHIP. Der
Projektleiter ist das Robert Koch-Institut.
Zielsetzung
Das Ziel ist es, 38 Speziallaboratorien aus 23
europäischen Ländern in einem Konsortium zu
verbinden und im Rahmen von Arbeitsgruppen
standardisierte Methoden zum Nachweis von
biologischen Agenzien zu entwickeln. Es sind
bakteriologische und virologische Ringversuche zur
externen Qualitätskontrolle und regelmäßige Treffen
und Trainingsangebote zum Erfahrungs- und
Methodenaustausch geplant.
Bewertung
Die Bearbeitung der Ringversuche ist mittlerweile
auch bei hohem Probenaufkommen sehr routiniert.
Bei
den
Targeterregern
gibt
es
kaum
Verbesserungsbedarf. HSV wurde 2013 in das
Analysenspektrum neu aufgenommen. Die AST AG
muss die Auswertung der Ergebnisse abschließen
und die Ursache der Abweichung bei langsam
wachsenden Bakterien finden. Zusätzlich ist geplant
die Aufnahme der Methode in die EUCAST
Richtlinien voranzutreiben. Die Identifizierung von
Targeterregern mittels MALDI-TOF MS wird im ZBD
seit 2013 in einem SOFO-Projekt verbessert.
Methoden
Der ZBD hat 2012-2014 an je drei bakteriologischen
und virologischen Ringversuchen teilgenommen. Des
Weiteren leitet der ZBD die Arbeitsgruppe (AG) zur
Standardisierung der antimikrobiellen Empfindlichkeitsprüfung (AG AST) und ist Mitglied der Arbeitsgruppe MALDI-TOF (AG MALDI). Die AG AST hat in
einer inter-Laborvalidation die Methode Mikrodilution
geprüft. Die AG MALDI hat die Methode MALDI-TOF
MS in zwei zusätzlichen Ringversuchen ausgetestet.
Außerdem fanden 2012-2014 acht QUANDHIP
Treffen statt und der ZBD hat 2013 eine
Trainingswoche für drei QUANDHIP Mitglieder
angeboten und zwei Institutsmitarbeiter haben je an
einer Trainingswoche am italienischen Referenzlabor
für Anthrax in Foggia/Italien bzw. am Robert Koch
Institut in Berlin teilgenommen.
Ausblick
Das Projekt wurde bis zum 31.01.2015 verlängert
und ab März 2015 ist ein Folgeprojekt geplant, für
das sich der ZBD erneut beworben hat.
Ergebnisse
In den bakteriologischen Ringversuchen wurden die
eingesandten Proben mittels molekularbiologischer
Methoden und zusätzlich mittels bakteriologischer
Kultur untersucht. In den virologischen Ring-
35
Abteilung fü r Bakteriologie
und Toxinologie
Die Abteilung für Bakteriologie und Toxinologie
betreibt Fachlabore für Yersinia pestis, Brucella spp.,
Burkholderia mallei und Burkholderia pseudomallei
sowie für verschiedene Toxine, insbesondere
Clostridium-botulinum-Neurotoxine,
Rizin
und
Staphylokokken Enterotoxine. Seit 2010 betreut die
Abteilung auch das nationale Konsiliarlabor für
Brucella und ist dort im Netzwerk Zoonosen vertreten.
Neben der Optimierung diagnostischer Verfahren zum
Erregernachweis bildet die Entwicklung und
Anwendung molekularer Feintypisierungs-Assays
sowie der Aufbau von Typisierungsdatenbanken für
die oben genannten Erreger den Schwerpunkt der
Abteilung.
Im
Vordergrund
stehen
hierbei
molekularepidemiologische
Fragestellungen
im
Rahmen von Ausbruchsuntersuchungen und Studien
zur Phylogenie und Evolution der Erreger.
Während im vergangenen Jahr vor allem die
Etablierung von Typisierungsassays für die oben
genannten Erreger im Vordergrund stand, rückte in
2012 und 2013 zunehmend die Anwendung dieser
Assays und die Generierung von Typisierungsdaten
zum Aufbau von Typisierungsdatenbanken in den
Vordergrund.
So konnten von hunderten Stämmen der verschiedenen Bakterienarten Typisierungsdaten generiert
und in die Datenbank eingepflegt werden. Aufgrund
36
der
vorausgegangenen
Harmonisierung
und
Standardisierung der Typisierungsassays kann die
Datenbank breitflächig für entweder molekularepidemiologische Fragestellungen aber auch für
bioforensische
Rückverfolgungsanalysen
im
Zusammenhang mit kriminellen Handlungen, wie z.B.
einer absichtlichen Freisetzung eines biologischen
Agens, genutzt werden (siehe Kap AG Bioforensik).
Bei
der
Erregercharakterisierung
spielt
die
Vollgenomsequenzierung eine immer größere Rolle,
da sie die Gewinnung und Analyse von Daten auf
höchster Informationsebene ermöglicht. Aus diesem
Grund wurden in der Abteilung für verschiedene
Erreger entsprechende Projekte initiiert und die
Voraussetzungen geschaffen, Vollgenomsequenzierungen selbstständig durchzuführen. Durch die
Vollgenomsequenzierung und vergleichende Genomanalysen von 10 atypischen Brucella-Stämmen
konnten erstaunliche Einblicke in die Evolution dieses
medizinisch relevanten Erregers erzielt werden.
Unsere Arbeiten konnten 2012 in insgesamt 14 und
2013 in 10 Veröffentlichungen in angesehenen
Fachzeitschriften publiziert werden. An dieser Stelle
möchten wir uns bei allen Kooperationspartnern
bedanken, ohne deren Mitwirkung die Arbeiten in
diesem Umfang und dieser Tiefe nicht möglich
gewesen wären.
Palä ogenetische Detektion und Charakterisierung von
Yersiniapestisaus 1500 Jahre-altem Skelettmaterial
Die dritte - immer noch andauernde - Pandemie
begann in den 1850er Jahren in der chinesischen
Provinz Yunnan und hat sich von dort nach Afrika,
den Amerikas, Australien, Europa und anderen Teilen
Asiens ausgebreitet. Während die zweite und dritte
Pandemie gut dokumentiert und wissenschaftlich
gesichert sind, wird die erste Pandemie immer noch
kontrovers diskutiert.
Die beiden ersten Pestpandemien müssen über eine
retrospektive Erregeridentifizierung erforscht werden.
Die genetische Information (DNA) wird dabei in der
Regel aus Zähnen extrahiert, da diese in der
Zahnpulpa optimal vor den langjährigen Witterungseinflüssen geschützt ist.
Der Pesterreger Yersinia pestis konnte in
verschiedenen Skeletten aus dem Mittelalter
(14./15. Jhd.) und aus der Zeit von Kaiser
Justinian (6. Jhd.) nachgewiesen und genetisch
charakterisiert werden. Durch die Anwendung
modernster molekularer Methoden konnten wir
zudem zeigen, dass Asien als wahrscheinlichster
geografischer Ursprung der Justinianischen Pest
anzusehen ist.
Die Pest ist eine berüchtigte, meist tödlich
verlaufende Infektionskrankheit, die durch das
Bakterium Yersinia pestis verursacht wird, welches in
vielen Ländern der Welt immer noch endemisch
vorkommt. Dort persistiert der Erreger in wildlebenden
Nagetierpopulationen und kann durch Vektoren aus
diesem natürlichen Reservoir auf den Menschen
übertragen werden. Obwohl derzeit die Erkrankung
Pest aufgrund der geringen Fallzahlen einen relativ
geringen infektiologischen Stellenwert besitzt, zeigt
die Geschichte das verheerende Potential von
Y. pestis als Seuchenerreger. So sind drei der
verheerendsten Pandemien in der Geschichte der
Menschheit mit der Pest assoziiert (Abbildung 1).
Die erste Pandemie, Justinianische Pest, nahm
historischen Berichten gemäß um 540 n. Chr. in
Ägypten ihren Anfang, erreichte kurze Zeit später
Konstantinopel und verbreitete sich schließlich im
gesamten spätantiken Mittelmeerraum.
Die zweite Pandemie dauerte mehrere hundert Jahre,
hatte ihren Ursprung in Zentralasien, und erreichte in
Europa ihren Höhepunkt zwischen 1348 und 1351 eine Zeitspanne, die auch als der „Schwarze Tod“
bekannt ist.
In Kooperation mit dem Institut für Anthropologie und
Humangenetik der Ludwig-Maximilians-Universität
München konnten mehrere Skelette aus der Zeit
Kaiser Justinians und dem Mittelalter untersucht
werden (Abbildung 1). In unserer Studie wurden 17
Individuen aus vier unterschiedlichen Epochen und
Standorten untersucht (Tabelle 1). Die jüngste
Gruppe schloss drei Soldaten aus Brandenburg ein,
deren zeitliche Herkunft auf den 30-jährigen Krieg
(1631) datiert wurde. Drei Individuen stammten aus
dem 14./15. Jhd. aus der Schweiz, Basel und wurde
aus einem historischen Friedhof geborgen, der vom
Ende des 13. Jhd. bis zum Beginn des 19. Jh. genutzt
wurde. Acht Individuen stammten aus Manching-Pichl
(Bayern) und waren im 14. Jhd. in einer Kapelle
bestattet worden, die heute noch vor Ort steht. Die
älteste untersuchte Gruppe von drei Individuen
stammte aus der Zeit des Kaisers Justinian, aus dem
6. Jhd. n. Chr. Diese wurden aus einem Reihengräberfeld aus Aschheim bei München geborgen
(Abbildung 1 und 2, Tabelle 1).
Abbildung 1: Die Abbildung stellt die zeitliche Einordnung der untersuchten Proben dar. Die bisher ältesten Pestopfer stammten aus der Zeit
des Kaisers Justinian (560 n. Chr.). Jüngere Pestopfer stammten aus dem Mittelalter und wurden in Bayern, Basel (Schweiz) und Brandenburg
geborgen. Die jüngste Pestpandemie begann erst zwei Jahrhunderte später, Mitte des 19. Jhd.
37
Abbildung 2: Das Bild zeigt das
historische Grab der Individuen
A19, A120 und A126. Die Skelette
sind 1500 Jahre alt, dennoch
konnte der Pesterreger in DNA aus
den Zähnen identifiziert und
molekular charakterisiert werden.
werden. Die Pest könnte damit tatsächlich - wie in
historischen Werken beschriebenen - eine zentrale
Rolle beim Untergang des Oströmischen Reichs unter
Kaiser Justinian gespielt haben. Unsere Analysen
zeigen weiterhin und erstmalig, dass die Pest damals
schon das Gebiet nördlich der Alpen (heutiges
Bayern) erreicht hat. Die Ergebnisse der Studie
wurden
in
zwei
Fachzeitschriften
publiziert
(HARBECK ET AL., PLOS PATHOGENS, 2013;
SEIFERT ET AL., PLOS ONE, 2013).
Der Nachweis Y. pestis-spezifischer DNA und eine
molekulare Feintypisierung mittels PCR aus
Zahnmaterial von Pestopfern aus dem Mittelalter
gelangen bei mehreren Individuen. Der PCR
Nachweis aus Proben des 6. Jhd. gelang bei acht
Individuen, aber nur bei einem Individuum (A120)
reichte die DNA-Menge aus, um eine weitere
Typisierung durchzuführen. Nach der Analyse von
insgesamt fünf Schlüsselpositionen am Genom von
Y. pestis mittels SNP-Typisierung konnte der
Pesterreger in der Probe A120 eindeutig zwischen
dem Bereich der Genotypen N03 und N05 zugeordnet
werden (Abbildung 3, roter Bereich). Da bisher alle
Y. pestis-Stämme der Genotypen N03 bis N05
beschrieben wurden aus Asien stammen, kann Asien
als wahrscheinlichster Ursprung der Justinianischen
Pest angenommen werden.
Durch diese Studie konnte Y. pestis eindeutig in
Pestopfern aus dem 6. Jhd. n. Chr. identifiziert
Abbildung 3: Die Abbildung stammt aus der Publikation
HARBECK ET AL., PLOS PATH. 2013. Sie zeigt einen phylogenetischen Stammbaum der bisher beschriebenen Pestisolate weltweit.
Mithilfe der Methode der SNP-Typisierung gelang es die DNA der vor
1500 Jahren verstorbenen Pestopfer einzuordnen (roter Bereich).
Zeitalter (A.D.) Land
Ort
weitere Umstände
Anzahl
untersuchter
Individuen
Pest-positivgetestete
Individuen
1630
Deutschland
Brandenburg
30-jähriger Krieg
3
2
14./15. Jhd.
Schweiz
Basel
Friedhof über 600 Jahren
3
0
14. Jhd.
Deutschland
Manching-Pichl
Kapelle existiert heute noch
8
8
560
Deutschland
Aschheim
Reihengräberfeld bei München
3
2
Tabelle 1: Ursprung und Alter der auf Pest getesteten Skelette mit Ergebnissen.
38
EQuATox, das Netzwerk “Establishment of Quality Assurance for the Detection of Biological Toxins of Potential
Bioterrorism Risk”
und Saxitoxin fokussieren (Abbildung 2). Neben einer
Vielzahl an relevanten toxischen Agenzien ist diese
Priorisierung analog zu Einschätzungen durch NATO
Gremien oder dem amerikanischen CDC getroffen
worden. Die Toxine könnten potenziell bei
Terroranschlägen eingesetzt werden, da sie verfügbar
und einfach zu präparieren sind, eine hohe Toxizität
besitzen und die medizinische Prophylaxe oder
Therapie derzeit nur marginal abgedeckt ist.
Seit 2012 nimmt ein Vertreter des InstMikroBioBw
regelmäßig an den Treffen von EQuATox teil. Zudem
leitete dieser die Durchführung der Ringversuche zu
Rizin (2013) und den Staphylokokken-Enterotoxinen
(2014) am InstMikroBioBw. Im Ringversuch Rizin
wurden 8 Proben in den Matrizes PBS, Milch und
Serum abgeprüft. Die Detektion des etwa 60 kD
großen Proteintoxins Rizin wird am Institut durch
einen Schnelltest, ELISA, Protein-Gelelektrophorese
und Western Blot abgedeckt. Der indirekte Nachweis
des Rizin-Gens mittels PCR ist ebenfalls QM-gerecht
am Institut validiert. Neben dem quantitativen
Proteinnachweis ist die Einschätzung der Toxizität
des
detektierten
Materials
essentiell.
Die
Das EU-Projekt EQuATox wurde 2012 als
Plattform zur Standardisierung der Detektion von
biologischen Toxinen gegründet. Im Rahmen des
Projekts werden Ringversuche durchgeführt. Die
Ergebnisse fließen in die Bewertung der
angewendeten Methoden ein. Ziel ist die
Vernetzung von Kompetenzen und Expertise im
internationalen,
insbesondere
europäischen
Raum.
Das Netzwerk EQuATox wurde von neun
internationalen Partnern unter der Leitung des Robert
Koch-Instituts im Jahr 2012 initiiert. Ein Ziel des
Netzwerks ist die Bewertung von Methoden und
Protokollen zur Detektion von biologischen Toxinen
an unterschiedlichen europäischen Institutionen
(Abbildung 1). Expertise wird dabei aus den
nationalen
Sektoren
Sicherheit,
Verifikation,
Gesundheit und Lebensmittelsicherheit erwartet.
Zunächst soll sich das Netzwerk EQuATox auf die vier
biologischen
Toxingruppen
Rizin,
Clostridium
botulinum Neurotoxine, Staphylokokken-Enterotoxine
Abbildung 1: Die Arbeiten im EU-Projekts EQuATox gliedern sich in acht Arbeitspakete (WP). Neben der Sammlung von Methoden und
Durchführung von Ringversuchen (proficiency tests, PT) werden Maßnahmen zum Qualitätsmanagement und die Verteilung von Informationen
und Empfehlungen erarbeitet.
39
Abbildung 2: Die Abkürzung EQuATox steht für Establishment of Quality Assurance for the Detection of Biological Toxins of Potential
Bioterrorism Risk. Das EU-Projekt soll die Detektion von biologischen Toxinen innerhalb Europas vereinheitlichen und optimieren. In Bildern
sind symbolisch die Toxine Rizin, Botulinum Neurotoxine (BoNT), Staphylokokken-Enterotoxine und die Muscheltoxine dargestellt.
Rizinpflanzenexprimiert neben dem hochtoxischen
Rizin (MW: 60 kD, LD50: 3 µg/ kg KG) weitere,
ähnliche Substanzen. Je nach Hybrid enthalten die
Samen beispielsweise auch das 70-fach geringer
toxische Ricinus-communis-Agglutinin (MW: 120 kD,
LD50: 200 µg/ kg KG), das immunologisch wie Rizin
detektiert wird und damit die Bewertung eines solchen
Tests verfälschen kann (Abbildung 3). Am
InstMikroBioBw erfolgt die Unterscheidung dieser
beiden toxischen Varianten durch einen Western Blot
(Abbildung 4). Die tatsächliche Toxizität einer Rizinenthaltenden Probe kann schließlich nur in einem
Bioassay bestimmt werden. Für Rizin sind dafür
Protokolle mittels Zellkultur publiziert. Das Etablieren
eines solchen Tests am InstMikroBioBw steht derzeit
noch aus.
Für das Jahr 2014 wird der Ringversuch zu den
Staphylokokken Enterotoxinen erwartet. Zudem wird
diskutiert werden, in welchem Rahmen das Netzwerk
EQuATox weiterlaufen kann. Das InstMikroBioBw
sollte in jedem Fall den Kontakt zu den europäischen
Institutionen mit gleichem Interesse weiterhin
aufrechterhalten.
Abbildung 3 (modifiziert nach YERMAKOVA A ET AL., PLOS ONE,
2012): Die Toxizität eines Rizin-Extrakts ist abhängig von der
Zusammensetzung und Konzentration von zwei verschiedenen
Molekülen. Während die LD50 der Agglutinin-Dimers (RCA-120) nur
bei 200µg/ kg KG liegt, ist diese für das AB-Monomer Rizin (RCA-60)
etwa 70-fach höher, bei 3 µg/ kg KG.
Abbildung 4: Während des Ringversuchs zu Rizin erfolgte eine
Differenzierung von RCA-60 und RCA-120 im Western Blot. Die
negativen Proben (1, 3-5, 7-8) zeigen keine spezifischen Banden. Die
Positivkontrollen (K+) zeigen ein Gemisch aus RCA-60 und RCA-120.
Probe 2 ist hochpositiv für RCA-120(*), Probe 6 für RCA-60 (oo).
40
Sauer macht aktiv – Studie zur antimikrobiellen Emp;indlichkeitsprü fung im nicht-neutralen pH-Milieu
Obwohl es im Rahmen bakterieller Infektionen zu
lokal azidotischen Bedingungen kommt, liegt das
Aktivitätsmaximum vieler Antibiotika im neutralen
pH-Bereich. Mit Finafloxacin wurde ein neues
Fluorchinolon identifiziert, das von dieser Regel
abweicht. Im Rahmen einer in-vitro-Studie am
Institut für Mikrobiologie der Bundeswehr wird
untersucht, ob diese Substanz auch bei
Infektionen mit hochpathogenen gramnegativen
Bakterien geeignet sein könnte.
Strukturell handelt es sich bei Finafloxacin um ein an
Position C-6 eines Chinolon-Grundgerüstes fluoriertes
Chinolon, das sich von anderen Vertretern seiner
Klasse durch eine charakteristische Cyano-Gruppe an
Position C-8 unterscheidet (siehe Abbildung 1).
Funktionell wird die neue Substanz wie Moxifloxacin
der Gruppe 4 mit breitem Wirkungsspektrum gegen
gramnegative
und
grampositive
Bakterien
einschließlich Anaerobiern und Biofilmbildnern
zugeordnet, da neben der Topoisomerase II (Gyrase)
auch die Topoisomerase IV inhibiert wird. Bisherige
Studien zeigen zudem eine deutlich stärkere Affinität
zur bakteriellen Topoisomerase im Vergleich zur
humanen Isoform, was mit einem günstigen
Nebenwirkungsprofil einhergehen könnte.
Ziel der Untersuchungen zu Finafloxacin am Institut
für Mikrobiologie der Bundeswehr ist es, erste in-vitroDaten zur Wirksamkeit der Substanz gegenüber
hochpathogenen Bakterien zu erheben. Dazu wurden
neben Francisella tularensis, dem Erreger der
Tularämie, verschiedene Isolate von Yersinien,
Burkholderien und Brucellen aus der institutseigenen
Stammsammlung ausgewählt und in die Studie
eingeschlossen. Methodisches Rückgrat bildet die
Mikrobouillondilutionsmethode mit Bestimmung der
minimalen Hemmkonzentration (MHK), die als
Goldstandard der Empfindlichkeitsprüfung gilt (siehe
Abbildung 2). Dazu wurden spezielle Testplatten
konzipiert, um standardisiert Bakterienstämme in
Flüssigkulturen bei unterschiedlichen pH-Werten
gegenüber
verschiedenen
Fluorchinolonen
(Finafloxacin, Moxifloxacin und Ciprofloxacin) und
über einen weiten Konzentrationsbereich zu testen.
Nach einer erregerspezifischen Inkubationszeit von
24 bis 48 Stunden wird dabei die phänotypische
Resistenz durch Nachweis des Wachstums in Anwesenheit verschiedener Antibiotikakonzentrationen
mittels einer photometrischen Messung objektiv
ausgewertet. Parallel werden Daten mittels der
Neben Krankheitsbild und Erreger schränken vor
allem unerwünschte Arzneimittelnebenwirkungen und
zunehmend auch (Multi-)Resistenzen die Auswahl der
beim individuellen Patienten anwendbaren Antibiotika
stark ein. Berücksichtigt man, dass in den letzten
Jahrzehnten vergleichsweise wenige innovative
Substanzklassen zur Marktreife entwickelt wurden, so
stellt die Entwicklung und Prüfung neuer Antibiotika
eine der wichtigsten Aufgaben der anwendungsorientierten mikrobiologische Forschung dar.
So kommt es beispielsweise bei der Tularämie, einer
auf der nördlichen Hemisphäre verbreiteten Zoonose,
bei verzögertem Therapiebeginn zu einer Persistenz
der Bakterien in lokalen Lymphknoten und damit
einhergehend zu langwierigen Krankheitsverläufen.
Insgesamt
weisen
viele
der
bisherigen
antimikrobiellen Wirkstoffe ein Aktivitätsmaximum im
neutralen pH-Bereich auf, obwohl bakterielle
Infektionen in Verbindung mit Immunabwehrmechanismen zu lokal azidotischen Verhältnissen
führen. Eine interessante Ausnahme davon wurde bei
der neuen Substanz Finafloxacin beobachtet, die im
Vergleich zu anderen, ähnlich wirkenden Antibiotika
(wie Ciprofloxacin) insbesondere im leicht sauren
Milieu gegenüber einigen Bakteriengattungen eine
höhere Aktivität zeigt.
Abbildung 1: Finafloxacin – von der Strukturformel zur Tablette.
Abbildung 2: Resistenztestung im Flüssigmedium – Goldstandard
der Empfindlichkeitsprüfung.
41
Abbildung 4: Vergleich der MHK-Verteilung für Francisella
tularensis gegenüber Ciprofloxacin (A), Moxifloxacin (B) und
Finafloxacin (C) im neutralen und leicht sauren pH-Milieu.
Abbildung 3: Resistenztestung auf Festmedien – Deutliche
Wachstumshemmung durch Finafloxacin.
Gradientendiffusionsmethode erhoben, die als
abgeleitetes Testverfahren in vielen Laboren der
klinischen Mikrobiologie verbreitet ist (s. Abbildung 3).
Die ersten vorläufigen Ergebnisse der bis 2014
geplanten Studie sind vielversprechend. Sie
bestätigen,
dass
Finafloxacin
auch
bei
hochpathogenen
Bakterien
eine
interessante
Therapieoption darstellen können, da niedrige MHKWerte als Maß für die Empfindlichkeit gegenüber der
antimikrobiellen Substanz auch im leicht sauren Milieu
erzielt werden können (siehe Abbildung 4).
Experimente zur Bakterizidie werden folgen. Derzeit
laufen für Harnwegs- und respiratorische Infektionen
durch typische Krankenhauskeime parallel bereits
klinische Phase II- und III-Studien zu der neuen
Substanz durch den Hersteller.
42
STAN-PROJEKT IMB-29-2001 | Bakteriologie und Toxinologie
Diagnostik, Immunpathogenese und Epidemiologie der Pest
♦ STAN-Unterprojekt 29-2001-18
Typisierung des Pesterregers aus Beulenpestaspiraten aus klinischen Materialien
♦ STAN-Unterprojekt 29-2001-19
Untersuchung klinischer Proben mit Verdacht auf Pestinfektion mittels ready-mix-PCR, Madagaskar
♦ STAN-Unterprojekt 29-2001-20
Charakterisierung historischer Pest-DNA
♦ STAN-Unterprojekt 29-2001-21
Etablierung bioforensischer Typisierungsmethoden für Yersinia pestis
♦ STAN-Unterprojekt 29-2001-22
Nachweis von Yersinia pestis aus Ektoparasiten aus der Mongolei
Fragestellung
Ziele
Yersinia pestis wird aufgrund der hohen Pathogenität
in die höchste Gruppe der potenziellen B-Kampfstoffe
eingeordnet. Lebensbedrohliche Krankheitsbilder wie
Lungenpest oder Pestsepsis können nach kurzer
Inkubationszeit auftreten. Validierte Verfahren und
handelsübliche Diagnostika für die molekulare,
biochemische und immunologische Identifizierung
bzw. Typisierung des Erregers und die Diagnose der
Pest sind nur sehr begrenzt verfügbar. Die molekulare
Identifizierung von Y. pestis ist am Institut inzwischen
QM-gerecht etabliert. In Deutschland ist derzeit kein
Impfstoff zugelassen. Verfügbare Impfstoffe zum
Schutz vor Y. pestis werden aufgrund mangelnder
Wirksamkeit und Erfahrung am Menschen zur Nutzung
in Deutschland nicht empfohlen.
Ziele sind die Entwicklung, Etablierung und
Evaluierung von Verfahren zur Diagnose der Pest, zur
Identifizierung, Differenzierung und Typisierung von
Y. pestis, insbesondere auch aus klinischen
Materialien. Erreger-Wirts-Wechselbeziehungen und
Krankheitsausbrüche
in
Einsatzregionen
der
Bundeswehr sollen aufgeklärt werden. Ein PestFachlabor soll für die Bundeswehr zur Verfügung
gestellt werden.
43
43
STAN-UNTERPROJEKT 34-2001-15 | B-Spezialdiagnostik und Hochsicherheitslabor
STAN-UNTERPROJEKT 29-2001-18 | Bakteriologie und Toxinologie
Typisierung des Pesterregers aus Beulenpestaspiraten aus klinischen Materialien
für alle 100 Proben erfolgreich abgeschlossen
werden. Die MLVA-45 Analysen wurden durch die
amerikanische Forschungsgruppe um Paul Keim
durchgeführt und waren für etwa 80% der Proben
erfolgreich.
Bearbeiter
OSV Dr. Riehm, RDir PD Dr. Scholz
Laufzeit
07/2011 bis 06/2014
Ergebnisse 2013
Im Jahr 2013 konnten die fehlenden Ergebnisse zur
SNP-Analyse mit Hilfe der konventionellen PCR und
Sequenzanalyse vervollständigt werden. Die Gesamt
-heit des Datensatzes lieferte sehr gute Ergebnisse
zur Phylogeographie der Pest in Madagaskar. Im
laufenden Prozess konnten weitere Proben aus
Madagaskar am InstMikroBioBw analysiert werden.
Diese stammten gezielt aus dem zentralen Hochland,
einem Regenwaldgebiet mit hoher Abundanz an Pest
-empfänglichen Tierspezies. Die Auswertung der
Daten wird aufgrund der noch verblindeten Epidaten
weitere Monate in Anspruch nehmen.
Sachstand
Die Anzucht des Pesterregers aus klinischen
Materialien gelingt oft nur nach sofortigem Bearbeiten
der Probe. Dies stellt in Entwicklungsländern ein
großes Problem dar, wodurch eine hohe Rate an
falsch-negativen Kulturergebnissen (Goldstandard)
zu verzeichnen ist. Der indirekte Erregernachweis
mittels PCR besitzt hingegen eine höhere
Sensitivität. Molekular-epidemiologische Analysen
konnten bisher nur aus Isolatmaterial durchgeführt
werden. Im Rahmen dieses Projekts soll die
Erregertypisierung direkt aus der klinischen Probe
erfolgen.
Bewertung
Der Nachweis von Y. pestis DNA- und die konventionelle Typisierung mittels PCR-Amplifizierung und
anschließender Sequenzierung gelingt problemlos
aus klinischem Material. Auf diese Weise erzielte
Ergebnisse, wie SNP- und CRISPR-Analysen, sind
eindeutig auswertbar. Die melt-MAMA-Technologie
ist für klinisches Material weniger gut geeignet, da die
Konzentration der spezifischen Y. pestis DNA nicht
exakt eingestellt werden kann und Störsignale die
Auswertung einschränken. Ähnliche Probleme
zeigten sich in der Längenbestimmung bei MLVAAnalysen. Zusammenfassend wird bewertet, daß die
Typisierung von Y. pestis aus klinischem Material
erfolgreich angewendet werden kann. Die bisher
erfolgte Interpretation der Ergebnisse zeigt, dass
verschiedene Genotypen von Y. pestis für die
Infektionen
von
Menschen
in
Madagaskar
verantwortlich sind. Vergleichende Analysen von
Tierproben aus dem zugehörenden Endemiegebiet
bieten zudem die Grundlage für epidemiologische
Zusammenhänge und Infektketten.
Zielsetzung
Die Typisierung des Pesterregers Y. pestis soll aus
mehr als 100 klinischen Proben (Bubonenaspirat,
Sputum) von Pestpatienten aus Madagaskar direkt,
ohne Erregerisolierung, erfolgen. Dabei kommen
verschiedene molekulare Typisierungsverfahren zum
Einsatz, welche anschließend auf ihre Anwendbarkeit
hin verglichen werden.
Methoden
In einem hierarchischen Ansatz werden zunächst
Single
Nucleotide
Polymorphisms
(SNPs)
ausgewählt,
die
für
den
geographisch
vorherrschenden Genotypen (Madagaskar: 1.ORI)
diskriminierend sind. Höheres Auflösungsvermögen
bietet die Methode clustered regularly interspaced
short palindromic
repeats
(CRISPR)-Analyse.
Alternativ zur CRISPR-Analyse können Multi
Locus VNTR Analysen (MLVA) verwendet werden.
Letztere sind am InstMikroBioBw derzeit noch nicht
etabliert, können aber bei Kooperationspartnern
durchgeführt werden.
Ausblick
Nach vollständiger Auswertung der Laborergebnisse,
Zusammenführung mit den demographischen Daten
mittels der Software Bionumerics und der
Interpretation aller Resultate sollen die Daten im
kommenden
Jahr
gemeinsam
mit
den
Arbeitsgruppen am Institut Pasteur in Madagaskar
und der amerikanischen Northern Arizona University
(Paul Keim) publiziert werden.
Ergebnisse 2012
Im Jahr 2012 konnte aus der Gesamt-DNA von
klinischen Proben (Bubonenaspirat, Sputum) die
Erregertypisierung durchgeführt werden. Jede von
100 Proben wurde auf 12 kanonische SNPs mittels
der melt-MAMA-Technologie analysiert. Dies gelang
jedoch nur für ca. 60% der untersuchten Proben. Die
Analyse mittels CRISPR konnte am InstMikroBioBw
44
STAN-UNTERPROJEKT 34-2001-15 | B-Spezialdiagnostik und Hochsicherheitslabor
STAN-UNTERPROJEKT 29-2001-19 | Bakteriologie und Toxinologie
Untersuchung klinischer Proben mit Verdacht auf
Pestinfektion mittels ready-mix- PCR, Madagaskar
Kühlung von Reagenzien notwendig ist. Zudem ist
die vorgegebene Konfektionierung gut geeignet, um
wenige oder einzelne Proben ohne Materialverlust
gezielt zu untersuchen. Die Sensitivität der ready-mix
-PCR ist jedoch im Vergleich mit dem
immunchromatographischen Schnelltest um knapp
30% geringer. Immerhin ist die Sensitivität verglichen
mit der Goldstandardmethode (Kultur) um knapp 20%
besser.
Bearbeiter
OSV Dr. Riehm
Laufzeit
01/2012 bis 12/2012
Sachstand
In Kooperation mit der Firma TibMolbiol, Berlin,
wurde PCR Trockenchemie in Form eines ready-mix
für Echtzeit PCR Verfahren entwickelt. Für den
Targeterreger Y. pestis konnte ein sensitiver Assay
anhand von isolierter Gesamt-DNA und artifizieller
DNA erprobt und validiert werden. Eine Testung
anhand von klinischem Material wurde bislang noch
nicht durchgeführt.
Ausblick
Die
Sensitivität
der
ready-mix-Echtzeit-PCR
Trockenchemie müsste soweit optimiert werden,
dass sie mit der des immunchromatographischen
Schnelltests vergleichbar wäre. In Kooperation mit
der Firma TibMolbiol ist eine Weiterführung des
Projekts derzeit jedoch nicht geplant.
Zielsetzung
Die lyophilisiert erhältlichen ready-mix-Reaktionen
sollen für die Anwendung an klinischem Material im
Pestendemiegebiet Madagaskar in Kooperation mit
dem Institut Pasteur getestet werden. Eine
Bewertung des Stellenwerts für die Diagnostik vor Ort
soll vorgenommen werden.
Methoden
Die DNA-Gewinnung aus den klinischen Materialien
Beulenaspiraten
und
Sputum
erfolgt
durch
Verdünnen mit PBS (1:20 und 1:50) und Aufkochen
für 10 min. Je 5µl Probenvolumen werden für die
Echtzeit PCR eingesetzt. Parallel zur PCR erfolgt der
Nachweis des Y. pestis-spezifischen F1-Kapselantigens mittels eines immunchromatographischen
Schnelltests.
Ergebnisse
Insgesamt wurden 149 humane Proben mit der
klinischen Diagnose Pest getestet. 84 Proben wurden
mittels der ready-mix-PCR detektiert (56%). Die
Goldstandardmethode bei der Diagnostik von Pest ist
die Kultur. Aus den 149 klinischen Proben konnten in
40 Fällen Isolate gewonnen werden (27%). Der
immunchromatographische
Schnelltest
zum
Nachweis des Y. pestis-spezifischen F1 Antigens
detektierte 123 der klinischen Proben (83%) als
positiv.
Bewertung
Die Durchführung der Echtzeit PCR mit lyophilisierten
ready-mix-Reaktionen hat im Vergleich zur frischen,
gefrorenen PCR-Chemie den Vorteil, dass keine
45
STAN-UNTERPROJEKT 34-2001-15 | B-Spezialdiagnostik und Hochsicherheitslabor
STAN-UNTERPROJEKT 29-2001-20 | Bakteriologie und Toxinologie
Charakterisierung historischer Pest-DNA
Probe aus dem 6. Jhd. gelang die Typisierung mittels
5 verschiedener SNPs. Erstmalig ist somit der
eindeutige
Nachweis
gelungen,
dass
die
Justinianische Pest (erste Pandemie von 560-750 n.
Chr.) tatsächlich durch den Pesterreger verursacht
wurde und dass dieser das Gebiet nördlich der Alpen
erreicht hat. Die phylogeographische Zuordnung legt
Zentralasien als Ursprung nahe. Die Beschreibung
der Justinianischen Pest konnte in der Fachzeitschrift
PLOS Pathogens publiziert werden (HARBECK M ET
AL., PLOS PATHOGENS, 2013).
Bearbeiter
OSV Dr. Riehm, RDir PD Dr. Scholz
Laufzeit
01/2012 bis 01/2014
Sachstand
Einige moderne Diagnostikmethoden und einzelne
Typisierungsassays zur Analyse von Y. pestis-DNA
sind bereits am InstMikroBioBw etabliert und werden
ständig weiterentwickelt. Klinisches Material, aber
auch DNA aus historischen Pestgräbern (6. Jhd. und
14. Jhd. n.Chr.) stellen jedoch höhere Ansprüche an
die Testsysteme. Erfahrungen auf diesem Gebieten
fehlen bisher am Institut. Historische DNA von
vermuteten Pestopfern wird vom Kooperationspartner, dem Institut für Anthropologie und
Humangenetik der Ludwig-Maximilians-Universität
München, zur Verfügung gestellt.
Ergebnisse 2013
Weitere
historische
Individuen
konnten
im
Kalenderjahr 2013 analysiert werden. Es handelte
sich dabei um Opfer der zweiten Pestpandemie
(1347-1650) und der Periode des "Schwarzen
Todes" (1347-1351). Proben aus Bayern und
Brandenburg zeigten hierbei einen identischen
Y. pestis-Genotyp, obwohl diese zeitlich gesehen 200
Jahre und geographisch 500 km getrennt waren.
Zudem gelang in diesem Kalenderjahr die
Vollgenomsequenzierung eines 1500 Jahre alten
Y. pestis-Genoms aus der ersten Pandemie. Der
identifizierte Genotyp ist offenbar heute ausgestorben
und mündete evolutionär gesehen in einer
Sackgasse. Dieses Ergebnis konnte ebenfalls bereits
publiziert werden (WAGNER ET AL., LANCET
INFECTIOUS DISEASES, 2014).
Zielsetzung
Ziel ist das Etablieren von Identifizierungsmethoden
des Pesterregers aus historischem Material.
Anschließende Verfahren zur Erregertypisierung
sollen phylogenetische Analysen ermöglichen, die
ggf. Hinweise zur Aufklärung von Pandmietypen von
Y. pestis geben.
Methoden
Historische DNA soll anhand von Echtzeit-PCR
gescreent und quantifiziert werden. Eine Bestätigung
dieser Ergebnisse und eine Einschätzung hinsichtlich
des Erhaltungsgrades sollen durch Sequenzierung
nach konventioneller PCR erfolgen. Mittels EndpunktGenotypisierung sollen kanonische SNPs bestimmt
werden.
Bewertung
Die Identifizierung von historischer Pest DNA ist nicht
unumstritten,
gelang
jedoch
mit
vielen
Arbeitskontrollen
aufgrund
des
hohen
Validationsstatus der molekularen Assays sehr gut.
Die erzielten Ergebnisse zur Justinianischen Pest
aus dem 6. Jhd. n. Chr. sind in der Wissenschaft
bisher einzigartig.
Ergebnisse 2012
Durch den Kooperationspartner wurden vermutete
Pestopfer identifiziert und die DNA mittels
verschiedener DNA Extraktionsprotokolle extrahiert.
Ein Screeningassay für den quantitativen Nachweis
von Y. pestis-DNA und ein konventioneller Assay mit
anschliessender
Sequenzierung
wurden
am
InstMikroBioBw etabliert und validiert. Diese
Methoden konnten in der Fachzeitschift PLOS One
veröffentlicht werden (SEIFERT L ET AL. 2013). Die
Assays zur Genotypisierung historischer Pest-DNA
wurden im Kalenderjahr 2012 etabliert und
erfolgreich an den Proben durchgeführt. Von einer
Ausblick
Im Kalenderjahr 2014 werden die Interpretationen
und Diskussionen der Ergebnisse fortgeführt, die in
einer weiteren Publikation münden sollen.
46
STAN-UNTERPROJEKT 34-2001-15 | B-Spezialdiagnostik und Hochsicherheitslabor
STAN-UNTERPROJEKT 29-2001-21 | Bakteriologie und Toxinologie
Etablierung bioforensischer Typisierungsmethoden fü r Yersiniapestis bewertet und validiert. Vorteil des Assays ist das 96well Format. Weiterhin kann aus dieser Plattform die
Quantifizierung bis auf die Kopienzahl pro Volumen
berechnet werden. Die Bewertung von klinischen
Proben und die Interprätation der Typisierungsergebnisse können mit der Erregerquantifizerung in
einem direkten Verhältnis stehen. Die Fachabteilung
am InstMikroBioBw ist damit in der Lage, DNA des
Pesterregers innerhalb weniger Stunden in einen
phylogeographischen Stammbaum einzuordnen. Es
gelang beispielsweise mehr als 40 Proben der
historischen Pestskelette in minimalen Volumina von
1µl mit sehr hoher Präzision zu typisieren (s. STANUnterprojekt 29-2001-20). Aber auch mehr als 100
Patientenproben, bei denen der Pestnachweis
gelang, konnten mit dieser Expertise typisiert werden
(s. STAN-Unterprojekt 29-2001-18).
Bearbeiter
OSV Dr. Riehm, RDir PD Dr. Scholz
Laufzeit
01/2012 bis 12/2014
Sachstand
In einem natürlichen Ausbruchszenario, aber auch
bei B-Angriffen und einer absichtlichen Ausbringung
von biologischen Agenzien, muss der biologische
Kampfstoff eindeutig identifiziert werden können. Am
Institut sind bereits Identifizierungsverfahren für Y.
pestis etabliert, es existieren aber keine molekularen
Typisierungsverfahren. Für Rückverfolgungsanalysen, d.h., um den Ursprung des Agens, mögliche
Ausbringungsquellen oder Hinweise auf den Täter zu
ermitteln, muss der Erreger jedoch auf Isolatebene
eindeutig identifiziert werden. Dafür sind molekulare
Typisierungsverfahren das Werkzeug und sollen
etabliert, bewertet und schließlich validiert werden.
Ergebnisse 2013
Im Kalenderjahr 2013 wurde dieses Projekt nicht
bearbeitet.
Zielsetzung
Ziel ist das Etablieren und die Bewertung der
Leistung neuer Typisierungsverfahren für Y. pestis.
Die QM-gerechte Validation soll für die bestehenden
Assays im Anschluss erfolgen. Eine Auswertung und
der Auf- bzw. Ausbau einer Datenbank erfolgt mittels
der Software Bionumerics. Der internationale
Austausch von Daten mit der Mongolei, Madagaskar
und den USA ist geplant.
Bewertung
Typisierungsverfahren und die dazugehörende
Expertise innerhalb einer spezifischen Fachabteilung
aufzubauen, ist extrem wertvoll. Davon profitieren
darauf aufbauende Projekte, wie die Analyse von
historischen Proben, klinische Proben aus den
Endemiegebieten Madagaskar oder Mongolei.
Generierte Daten fließen in die eigene Datenbank ein
und können mit Kooperationspartnern ausgetauscht
werden.
Methoden
Das Analysespektrum umfasst molekulare Verfahren,
wie PCR, Sequenzierung, MLVA- und SNPAnalysen. Der Aufbau von Datenbanken erfolgt
bioinformatisch mittels Bionumerics. Die Etablierung
erfolgt in enger Anlehnung an die bereits an der
Northern Arizona University (Paul Keim), USA,
etablierten Methoden. Eine Portierung der Methoden
auf
die
am
InstMikroBioBw
vorhandenen
Geräteplattformen ist dafür Voraussetzung. Die
Methoden werden anschließend optimiert und nach
QM-Kriterien validiert. Neben der Y. pestisStammsammlung des InstMikroBioBw dienen auch
Pestthermolysate aus der Mongolei, sowie klinische
Proben aus Madagaskar zur Validation.
Ausblick
Ein Projekt zur Bewertung neuer Typisierungsmethoden von Y. pestis sollte unbedingt fortgeführt
werden. Kürzlich publizierte neue MLVA-Loci
erweitern das Wissen um die Phylogeographie in
Endemiegebieten der Pest wie China oder
Nordamerika.
Ergebnisse 2012
Im Kalenderjahr 2012 wurden Endpunkttypisierungsassays mit der Plattform Roche, LC480 aufgesetzt,
47
STAN-UNTERPROJEKT 34-2001-15 | B-Spezialdiagnostik und Hochsicherheitslabor
STAN-UNTERPROJEKT 29-2001-22 | Bakteriologie und Toxinologie
Nachweis von Yersiniapestisaus Ektoparasiten
aus der Mongolei
Bearbeiter
Dr. Kiefer, RDir PD Dr. Scholz
InstMikroBioBw überführt. Y. pestis-DNA konnte in
keinem der Flöhe nachgewiesen werden.
Laufzeit
01/2012 bis 12/2012
Bewertung
Die Isolierung von DNA aus alkoholfixierten Flöhen
gestaltete sich als schwierig. Die Proben wurden
während einer Mongoleiexpedition vor 8 Jahren
gewonnen. Es kann angenommen werden, dass sich
die DNA während dieser Zeit weitgehend abgebaut
hat. Eine weitere Möglichkeit als Ursache für die
geringe DNA-Ausbeute stellt der verwendete Alkohol
dar. So ist nicht sichergestellt, dass es sich dabei um
98%igen analysenreinen Ethanol handelte. Trotzdem
konnten durch die zahlreichen Optimierungsversuche
wichtige
Erkenntnisse
beim
Umgang
mit
problematischem Material gewonnen werden. Die
etablierten PCR-Assays können nun für die
Flohartendifferenzierung verwendet werden. Der
fehlende Nachweis von Y. pestis ist durch die geringe
Probenanzahl und die generell geringe Prävalenz
des Erregers in Flöhen begründet.
Sachstand
Über 200 Floharten können Y. pestis, den Erreger
der Pest, übertragen. Bisher ist jedoch wenig über
die Prävalenz von Y. pestis-DNA in den verschiedenen Parasiten bekannt. Die Artenbestimmung von
Flöhen erfolgt derzeit makroskopisch, benötigt
jahrelange Erfahrung und ist sehr zeitintensiv.
Inwiefern die Artbestimmung durch die Sequenzanalyse des Cytochrom B-Gens erfolgen kann, muss
noch untersucht werden und ist Bestandteil des
Projekts. Die Analyse von Wirtstier-VektorBeziehungen in natürlichen Pestendemiegebieten
kann der verbesserten Risikoabschätzung dienen.
Bislang wurden Pestvektoren, wie Flöhe, Zecken
oder Läuse makro- und mikroskopisch bestimmt und
den verschiedenen Arten zugeordnet.
Ausblick
Das Screenen von Vektoren aus Endemiegebieten
bleibt hochinteressant und kann von den Erfahrungen
aus diesem STAN-Projekt profitieren. Arthropoden,
wie Flöhe sollten höchstens für kurze Zeit in Alkohol
konserviert werden. Die Anzahl der zu untersuchenden Vektoren sollte zwischen 500 und 1000
liegen.
Zielsetzung
Die Untersuchung von 100 potenziellen Pestvektoren
aus dem Endemiegebiet Mongolei soll mittels
molekularbiologischer
Verfahren
durchgeführt
werden. Eine Referenzdatenbank von Vektorsequenzen, wie der Cytochromoxidase II (CO II), soll
erstellt werden.
Methoden
Nach lichtmikroskopischen Untersuchungen werden
mögliche Pestvektoren aus dem Endemiegebiet
Mongolei identifiziert und taxonomisch bestimmt.
Mittels molekularer Methoden werden Sequenzen
generiert und mittels der Software BioNumerics
analysiert sowie eine Datenbank erstellt.
Ergebnisse
Von 100 in Alkohol asservierten Flöhen wurde die
Gesamt-DNA extrahiert und aufgereinigt. Die dabei
gewonnenen Mengen variierten sehr stark zwischen
den einzelnen Flöhen und die Ausbeute war generell
gering. Aus diesem Grund erfolgte nach der DNAPräparation eine random-DNA Amplifikation zur
Anreicherung vorhandener DNA. Insgesamt gelang
die COII Artenbestimmung von 8 Flöhen. Weitere
Sequenzen wurden aus der kanadischen Datenbank:
„Barcoding of Life“ in die Datenbank des
48
STAN-PROJEKT IMB-32-2001 | Bakteriologie und Toxinologie
Diagnostik, Prophylaxe und Epidemiologie des Rotzes und der Melioidose
♦ STAN-Unterprojekt 32-2001-17
Etablierung eines Verfahrens zum Antikörpernachweis bei Melioidose
♦ STAN-Unterprojekt 32-2001-18
Etablieren der Multi Locus Variable Number of Tandem Repeats Analysis (MLVA) für die Typisierung von Burkholderia spp.
♦ STAN-Unterprojekt 32-2001-20
Etablierung bioforensischer Typisierungsmethoden
♦ STAN-Unterprojekt 32-2001-21
Etablieren und Validierung einer real-time PCR zur Identifizierung und Differenzierung von Burkholderia pseudomallei und B. mallei
Fragestellung
Ziele
Burkholderia
mallei
(Rotzerreger)
und
B.
pseudomallei (Erreger der Melioidose) gelten als
potenzielle B-Kampfstoffe. Sie verursachen schwere
eitrige, therapieresistente, chronische und oft tödlich
verlaufende
Infektionen.
Kommerzielle
oder
standardisierte Verfahren für die molekulare,
biochemische und immunologische Identifizierung
bzw. Typisierung von Burkholderia spp. und zur
Diagnostik von Rotz und Melioidose sind nicht
verfügbar. Zulassungsfähige, wirksame Impfstoffe gibt
es nicht. Die Immunpathogenese dieser Erreger ist
weitgehend unbekannt. Gesicherte Erkenntnisse über
Expositions- und Infektionsrisiken für Soldaten bei
Einsätzen in Rotz- und Melioidose-Endemiegebieten
fehlen.
Ziel ist die Entwicklung, Etablierung und Evaluierung
von Verfahren zur Diagnostik von Rotz und
Melioidose
hinsichtlich
Erregeridentifizierung,
-differenzierung
und
-typisierung,
sowie
die
Aufklärung der Erreger-Wirts-Wechselbeziehungen.
Weiterhin soll die präklinische Prüfung von
Kandidaten für Immun- und Chemoprophylaxe, sowie
die Aufklärung von Krankheitsausbrüchen in
Einsatzregionen der Bundeswehr ermittelt werden.
Fachlabore für Rotz und Melioidose sollen für die
Bundeswehr bereitgestellt werden.
49
49
STAN-UNTERPROJEKT 34-2001-15 | B-Spezialdiagnostik und Hochsicherheitslabor
STAN-UNTERPROJEKT 32-2001-17 | Bakteriologie und Toxinologie
Etablierung eines Verfahrens zum Antikö rpernachweis bei Melioidose
positive (n=36) und negative bzw. kreuzreaktive
(n=217) Patientenseren eingesetzt. Die Sensitivität,
Spezifität, Inter- und Intra-Assay-Präzision lagen bei
94,4 %, 95,4 %, 100 % bzw. 100 %. Der etablierte
serologische Nachweis von Antikörpern gegen B.
pseudomallei LPS-Typ-A mittels Westernblot erfüllt
somit die QM-Validitätskriterien und kann in Zukunft
im Zentralbereich Diagnostik eingesetzt werden. Der
Westernblot zum Nachweis von LPS-Typ-B2
Antikörper zeigte bereits in der frühen Phase der
Validation ein typisches LPS-Typ-B2 Bandenmuster
auch in den negativen und vor allem in den
kreuzreaktiven Seren. Deshalb wurde auf eine
weitere Validation dieses Antigens in dieser Phase
verzichtet. Wie oben erwähnt nimmt dieser LPS-Typ
eine Sonderrolle ein und kann, auch aufgrund dieser
ersten Validationsergebnisse, nicht als Antigen zum
sicheren Nachweis von Antikörper gegen B.
pseudomallei eingesetzt werden.
Bearbeiter
OSA Dr. Thoma
Laufzeit
04/2011 bis 04/2013
Sachstand
Derzeit ist weltweit kein kommerzieller Test für die
serologische
Diagnostik
nach
Burkholderia
pseudomallei-Infektion des Menschen verfügbar.
Eine entsprechende Serodiagnostik fehlt daher im
diagnostischen Algorithmus für die Melioidosediagnostik im Zentralbereich Diagnostik. Ein
Antikörpernachweis bei Patienten aus Nicht-Endemiegebieten kann eine wichtige differenzialdiagnostische Hilfe sein. Eine Verzögerung der Diagnose
einer Melioidose verläuft unter Umständen tödlich, da
das Antibiotikaregime, welches z.B. zur empirischen
Behandlung einer bakteriellen Sepsis eingesetzt wird,
bei B. pseudomallei oft nicht adäquat ist.
Bewertung
Das Generieren von LPS-Genotyp-A und LPSGenotyp-B2 zeigte sich als komplexer, zeitintensiver,
jedoch durchführbarer Prozess. Die Reinheit des
Extraktionsverfahrens konnte an positiven bzw.
negativen Patientenseren getestet werden: Typische
LPS-Typ-A Bandenmuster waren nur bei positiven
Patientenseren nachweisbar. Hintergrundsignale, als
Zeichen mangelnder Spezifität, waren nicht
feststellbar. LPS-Typ-B2 Bandenmuster waren auch
bei negativen Patientenseren nachweisbar, weshalb
dieser LPS-Typ als Antigen für einen sicheren
Nachweis von B. pseudomallei Antikörper nicht
geeignet ist. Die Validation für den Nachweis von
LPS-Genotyp-A wurde erfolgreich gem. QMRichtlinien durchgeführt. Dieser Test kann nun in das
Portfolio „Melioidosediagnostik“ des Zentralbereichs
Diagnostik integriert werden.
Zielsetzung
Der Nachweis von Antikörpern gegen B.
pseudomallei soll mittels Westernblot und ELISAVerfahren etabliert werden und nach QM-Richtlinien
validiert werden. Anschließend soll die Implementierung der Serodiagnostik der Melioidose in den
Zentralbereich Diagnostik erfolgen.
Methoden
Ein IgG-/IgM-Antikörpernachweis soll gegen B.
pseudomallei unter Verwendung von Lipopolysaccharid (LPS) Genotyp-A und -Genotyp-B2 gemäß
QM-Richtlinien entwickelt werden. Daraus sollen
Westernblot, ELISA-Verfahren und ggf. ein immunchromatischer Schnelltest entwickelt werden. Die
Beziehungen zu Kooperationspartnern aus Endemiegebieten (z.B. Mahidol-Oxford Tropical Medicine
Research Unit, Thailand) sollen intensiviert werden.
Ausblick
Das Etablieren und die Validation eines ELISA und
ggf. eines immunologischen Schnelltests für den
Nachweis von LPS-Genotyp-A kann in einem
Folgeprojekt untersucht werden. Im Weiteren kann
der Nachweis von B. pseudomallei-LPS-Genotyp-B
in ein serologisches Nachweisverfahren überführt
werden, um damit diagnostische Lücken zu
schließen. Allerdings kann sich die Beschaffung von
LPS-Typ-B typischem Material als schwierig
erweisen, da dieser Typ relativ selten ist und vor
allem
nur
in
Australien
zu
finden
ist.
Kooperationspartner aus diesem Endemiegebiet (z.B.
Prof. Bart Currie, Menzies School of Health
Research, Darwin, Australien) wären daher eine
Voraussetzung für weitere Arbeiten.
Ergebnisse
Die Methode zur Extraktion von LPS-Genotyp-A und
-Genotyp-B2 wurde etabliert und optimiert. Das LPSTyp-A herrscht in Südostasien und Australien in 97,7
% bzw. 85,3 % vor. Das LPS-Typ-B2 ist eine
Variante des LPS-Typ-B und nimmt eine Sonderrolle
ein. Inwieweit sich dieser LPS-Typ mit Seren gegen
LPS-Typ-A und LPS-Typ-B, aber auch LPS-Typen
von anderen gramnegativen Bakterien verhält, ist
bisher unklar. LPS-Typ A und LPS-Typ-B2 wurden in
einem
Westernblot
aufgetragen.
In
einem
Validationsverfahren (Ermittlung der Sensitivität,
Spezifität, Inter- und Intra-Assay-Präzision) wurden
50
STAN-UNTERPROJEKT 34-2001-15 | B-Spezialdiagnostik und Hochsicherheitslabor
STAN-UNTERPROJEKT 32-2001-18 | Bakteriologie und Toxinologie
Etablieren der Multi Locus Variable Number of Tandem
Repeats Analysis (MLVA) fü r die Typisierung von Burkholderia
spp.
die Nukleotidsequenz aller amplifizierten Produkte
bestimmt und analysiert. Dabei zeigte sich, dass
nicht alle Marker das gewünschte Diskriminierungspotential besitzen, bzw. nicht alle B. malleiStämme mit allen Markern ein Produkt ergaben. Aus
diesem Grund wurde der Assay um vier eigene
Marker erweitert. Der final etablierte MLVA Assay
beinhaltet nun insgesamt 23 +4 Loci.
Bearbeiter
RDir PD Dr. Scholz
Laufzeit
01/2011 bis 12/2013
Sachstand
Zur Differenzierung von Burkholderia pseudomalleiIsolaten ist derzeit am InstMikroBioBw das sog. Multi
Locus Sequence Typing (MLST) etabliert. Diese
Methode ist für den Erreger B. mallei nicht zu
Typisierungszwecken
geeignet,
da
sich
unterschiedliche B. mallei Stämme in der MLST nicht
unterscheiden. Im Gegensatz zur MLST ist die Multi
Locus VNTR Analyse (MLVA) aufgrund der höheren
Auflösung geeignet, einzelne B. mallei-Stämme
voneinander zu unterscheiden. So kann z.B. bei einer
Infektion mit dem Erreger eine Reinfektion von einer
Neuinfektion unterschieden werden. Die MLVA
erlaubt zudem die molekularepidemiologische
Untersuchung von Ausbrüchen und bioforensische
Rückverfolgungsanalysen
Ergebnisse 2013
Die neuen 4 Loci wurden ebenfalls an allen 60
B. mallei-Stämmen erprobt und zeigten ein hohes
Diskriminierungspotential. Zur Reduzierung des
Arbeitsaufwandes
wurde
ein
Multiplex-MLVA
entwickelt. Der finale MLVA besteht nun aus
insgesamt 7 Mastermix-Ansätzen zu jeweils 3-5
VNTR-Markern. Die Auswertung erfolgt, basierend
auf verschiedenen Farbstoffen und Fragmentlängen,
am Kapillarsequenziergerät. Alle 60 am Institut
vorhandenen B. mallei-Stämme wurden analysiert
und die gewonnenen Typisierungsdaten in die
Datenbank
eingepflegt.
In
Verbindung
mit
Genomanalysen war es mit dem entwickelten Assay
möglich, den kürzlich stattgefundenen Rotzausbruch
in Bahrain molekularepidemiologisch zu untersuchen.
Beide Verfahren zeigten, dass der Ausbruch von
mindestens zwei verschiedenen B. mallei-Stämmen
verursacht wurden (SCHOLZ et al., 2014 PLOS
Neglected Tropical Diseases).
Zielsetzung
Ziel ist das Etablieren der MLVA Typisierungsmethode für B. pseudomallei und B. mallei Stämme.
Am Institut vorhandene Stämme sollen anschließend
charakterisiert und die gewonnenen Daten in die
Typisierungsdatenbank eingepflegt werden.
Bewertung
Die Etablierung eines Multiplex-MLVA für den
Rotzerreger B. mallei verschafft dem Institut eine
Expertise, die für die molekularepidemiologische
Untersuchung eines Rotzausbruchs oder für
bioforensische Analysen im Falle einer absichtlichen
Freisetzung Voraussetzung ist. Das Institut wird
dadurch für Kooperationspartner aus Rotzendemiegebieten ein attraktiver Partner.
Methoden
Aus verschiedenen Publikationen wurden geeignete
VNTR-Loci mit unterschiedlicher Repeatlänge
ausgewählt, die sich als aussagekräftige und stabile
Loci bewährt haben. Von vorhandenen Stämmen soll
DNA präpariert und entsprechende Loci zunächst
mittels konventioneller PCR amplifiziert werden. Die
exakte Anzahl der Repeats wird zunächst durch DNA
-Sequenzierung bestimmt, anschließend wird die
molekulare Längenbestimmung am Haus-internen
Sequenzer etabliert. Letztendlich soll ein MultiplexMLVA etabliert werden.
Ausblick
Der entwickelte MLVA soll zur Beantwortung weiterer
Fragestellungen eingesetzt werden. Eine dieser
offenen Fragen ist, wie sich der Erreger auf
molekularer Ebene während einer Infektion
verändert.
Ergebnisse 2012
Im Kalenderjahr 2012 konnten insgesamt 23
verschiedene VNTR Loci mit geeignetem Diskriminierungsfaktor anhand von Veröffentlichungen
ausgewählt und mittels 60 Isolaten aus der B. mallei
Stammsammlung in Einzelansätzen validiert werden.
Um die exakten Repeatlängen zu ermitteln, wurde
51
STAN-UNTERPROJEKT 34-2001-15 | B-Spezialdiagnostik und Hochsicherheitslabor
STAN-UNTERPROJEKT 32-2001-20 | Bakteriologie und Toxinologie
Etablierung bioforensischer Typisierungsmethoden
müssen.
Bearbeiter
OSV Dr. Riehm, RDir PD Dr. Scholz
Ergebnisse 2013
Die 12 SNP-Loci wurden anhand der B. malleiStammsammlung getestet. Dabei zeigten sich
Schwierigkeiten bei der Interpretation der Schmelzkurven, so dass der Allelzustand bestimmter SNPs
nicht eindeutig zu ermitteln war.
Laufzeit
01/2012 bis 12/2014
Sachstand
Derzeit sind die Typisierungsmethoden Multi Locus
Sequence Typing (MLST) und Multi Locus Variable
Number of Tandem Repeats Analysis (MLVA) für
Burkholderia mallei und B. pseudomallei am Institut
etabliert, bzw. werden derzeit etabliert. Die
Charakterisierung von pathogenen B. pseudomallei/
mallei-Stämmen ist mit diesen Methoden nicht bei
allen Stämmen ausreichend. Neue und kürzlich
publizierte Methoden und Methoden, die sich in
wissenschaftlichem
Austausch
mit
dem
Kooperationspartner der Arbeitsgruppe um Paul
Keim, Flagstaff, USA, eröffnen, bieten Möglichkeiten
zu noch detaillierteren Analysen, insbesondere
phylogenetischen Rekonstruktionen. Es soll deshalb
ein Single Nucleotide Polymorphism (SNP)-basierter
Mismatch Amplification Mutation Assay (Melt-MAMA)
am Institut etabliert werden.
Bewertung
Es handelt sich bei MELT-MAMA um eine unsichere
Typisierungsmethode. Mittlerweile ist diese Methode
durch die Etablierung der Vollgenomsequenzierung
am Institut bereits überholt, da diese eine wesentlich
akkuratere in silico Analyse von SNPs erlaubt.
Ausblick
Das Projekt wurde eingestellt.
Zielsetzung
Ziel ist das Etablieren von neuen, aktuellen
Typisierungsverfahren, wie der SNP-basierten Isolatcharakterisierung. Zunächst werden Isolate der
Stammsammlung des InstMikroBioBw mittels dieser
Methode analysiert, die Ergebnisse bioinformatisch
ausgewertet und in die Datenbank eingetragen.
Methoden
Der SNP-basierte Melt-MAMA Assay basiert auf
Schmelzkurvenanalyse. Zwei verschiedene Rückwärtsprimer bedingen je nach Genotyp eine
unterschiedliche Abschmelzkinetik und erlauben so
die Zuordnung zu einem SNP-Genotyp. Die SNPs
werden an mehreren Stellen eines Genoms
analysiert. Durch bioinformatische Auswertung wird
der entsprechende Stamm charakterisiert. Anhand
der Melt-MAMA Methode können in kurzer Zeit viele
Proben kostengünstig auf zahlreiche SNPs hin
analysiert werden.
Ergebnisse 2012
Insgesamt wurden 12 Melt-MAMA Assays etabliert.
Zur Optimierung der typischen Schmelzkurven fehlen
bisher noch insgesamt sieben Kontrollstämme, die
von
Kooperationspartnern
beschafft
werden
52
STAN-UNTERPROJEKT 34-2001-15 | B-Spezialdiagnostik und Hochsicherheitslabor
STAN-UNTERPROJEKT 32-2001-21 | Bakteriologie und Toxinologie
Etablieren und Validierung einer real-time PCR zur Identi;izierung und Differenzierung von Burkholderiapseudomallei und
B.mallei
Bearbeiter
OSA Georgi
Ergebnisse 2013
Das neue Verfahren wurde im Jahr 2013 erfolgreich
bei den molekularbiologischen Ringversuchen zu
Burkholderia spp. parallel zur etablierten Methode
eingesetzt.
Laufzeit
01/2012 bis 06/2014
Bewertung
Die kurz als BurkDiff bezeichnete PCR wurde nach
Modifikation der ursprünglich publizierten PCR
erfolgreich auf eine Geräteplattform unserer
stationären Diagnostik etabliert. Das Verfahren hat
sich bereits in den externen Qualitätskontrollen im
Jahr 2013 bewährt. Die im Rahmen der Validation
erhobenen Parameter zeigen, dass damit ein neues
robustes, sensitives und spezifisches Werkzeug zur
Identifizierung und Bestätigung von Rotz oder
Melioidose zur Verfügung steht.
Sachstand
Die Erreger von Rotz und Melioidose sind genetisch
sehr eng verwandt. Die Etablierung einer sensitiven
und zugleich spezifischen Methode zur direkten
Identifizierung und Differenzierung aus klinischem
Untersuchungsmaterial ist daher schwierig.
Zielsetzung
Die molekularbiologische Differenzierung zwischen
Burkholderia mallei und B. pseudomallei erfolgt am
Institut für Mikrobiologie der Bundeswehr derzeit mit
zwei PCR-Reaktionen, die im Sinne einer
Stufendiagnostik
hintereinander
durchgeführt
werden. Das Verfahren ist zeitintensiv und ist in
seiner Anwendung auf die Matrix Kulturmaterial
beschränkt. Eine Unterscheidung der beiden Erreger
aus klinisch relevanten Materialien ist daher nur nach
kultureller Anzucht möglich, die ebenfalls zeitintensiv
ist und nicht immer gelingt.
Primäres Ziel des Projektes ist die Etablierung einer
neuen PCR als Alternative oder Ersatz des
bisherigen Vorgehens. Darüber hinaus soll geprüft
werden, ob die Methode bei genügender Sensitivität
und Spezifität für die Direktuntersuchung von klinisch
relevanten Materialien geeignet ist.
Ausblick
In der letzten Projektphase wird das neue Verfahren
nun vom Forschungsbereich in den akkreditierten
Bereich der stationären Diagnostik überführt und
unter Anpassung der Verfahrens- und Arbeitsanweisungen in den entsprechenden Algorithmus
integriert.
Methoden
Im Rahmen des Projektes wird eine von unserem
Kooperationspartner (Arbeitsgruppe um Prof. Paul
Keim, USA) entwickelte und publizierte Echtzeit-PCR
(SNP dual probe allelic discrimination assay)
modifiziert und auf lokal verfügbare Geräteplattformen angepasst.
Ergebnisse 2012
Nach Optimierung der Laufparameter, wie MgCl2Konzentration
und
Thermoprofil,
wurden
verschiedene
Stämme
(sog.
Negativund
Positivpanel) des Institutes mit der neuen PCR
untersucht. Unsere Ergebnisse bestätigen das insilico vorhergesagte gute Diskriminationsvermögen
der Methode zwischen B. mallei und B. pseudomallei
bei hoher Sensitivität.
53
STAN-PROJEKT IMB-37-2003 | Bakteriologie und Toxinologie
Spezialdiagnostik, Immunpathogenese und
Epidemiologie der Brucellose
♦ STAN-Unterprojekt 37-2003-13
Etablierung bioforensischer Typisierungsmethoden
Fragestellung
Ziele
Brucella spp., Erreger der Brucellose, sind potenzielle
B-Kampfstoffe. Standardisierte Verfahren für die
molekulare, biochemische und immunologische
Identifizierung bzw. Typisierung von Brucella spp. und
die Diagnostik der Brucellose sind, bis auf
serologische Methoden für den Antikörpernachweis,
nicht verfügbar. Effiziente zulassungsfähige Impfstoffe
sind nicht erhältlich. Gesicherte Erkenntnisse über
Expositions- und Infektionsrisiken für Soldaten bei
Einsätzen in Brucellose-Enzootie-/-Endemiegebieten,
z.B. im Kosovo oder Afghanistan, fehlen. Die
Immunpathogenese des Erregers ist weitgehend
unbekannt.
Ziel ist die Entwicklung, Etablierung und Evaluierung
von Verfahren zur Diagnostik der Brucellose, zur
Erregeridentifizierung und -differenzierung sowie zur
Typisierung.
Erreger-Wirts-Wechselbeziehungen
müssen aufgeklärt, Kandidaten für die Immun- und
Chemoprophylaxe bzw. Substanzen zur Therapie
ermittelt
werden.
Krankheitsausbrüche
in
Einsatzregionen der Bundeswehr mit dem Verdacht
auf Brucellose sollen aufgeklärt werden. Ein
Brucellose-Fachlabor soll für die Bundeswehr zur
Verfügung gestellt werden.
54
54
STAN-UNTERPROJEKT 34-2001-15 | B-Spezialdiagnostik und Hochsicherheitslabor
STAN-UNTERPROJEKT 37-2003-13 | Bakteriologie und Toxinologie
Etablierung bioforensischer Typisierungsmethoden
Ergebnisse 2013
Mittels des in 2012 entwickelten MLVA konnten über
200 Brucella-Stämme verschiedener Arten typisiert
werden. Der umfangreiche Datensatz wurde in die
BioNumerics Typisierungsdatenbank eingepflegt und
ausgewertet.
Bearbeiter
RDir PD Dr. Scholz, Fr. Projahn
Laufzeit
01/2012 bis 12/2014
Sachstand
In einem natürlichen Ausbruchszenario, aber auch
bei B-Angriffen und einem absichtlichen Ausbringen
von biologischen Agenzien muss der biologische
Kampfstoff eindeutig identifiziert und zugeordnet
werden
können.
Am
Institut
sind
bereits
Identifizierungsverfahren für das Genus Brucella und
seine Arten etabliert, es existieren aber keine
hochauflösenden
molekularen
Typisierungsverfahren. Für Rückverfolgungsanalysen, um die
mögliche Quelle der Ausbringung oder den Täter zu
ermitteln, muss der Erreger jedoch auf Stammebene
eindeutig
identifiziert
werden.
Molekulare
Typisierungsverfahren sind das geeignete Werkzeug
dazu.
Bewertung
Das Etablieren des MLVA-Typisierungsassays für
Brucella spp. verschafft dem InstMikroBioBw eine
Expertise, die für die molekularepidemiologische
Untersuchung eines Brucella-Ausbruchs oder für
bioforensische Rückverfolgungsanalysen Voraussetzung ist. Der Assay kann auch dazu eingesetzt
werden, um die Frage zu beantworten, ob es sich bei
einer Brucella-Infektion um eine Neuerkrankung oder
um ein Rezidiv handelt. Das Institut kann sich durch
Aufbau einer Datenbank auf einem internationalen
und hohen Niveau mit anderen Kooperationspartnern
austauschen.
Ausblick
Die Methodenetablierung ist abgeschlossen. Der
MLVA findet laufend Anwendung bei diagnostischen
Fragestellungen und Forschungsprojekten.
Zielsetzung
Ziel ist das Etablieren und die Validierung von
Typisierungsverfahren für Brucella spp. Die
Auswertung soll mittels der Software BioNumerics
erfolgen. Ein intensiver Austausch soll auf
internationalem Niveau, insbesondere mit der Arbeitsgruppe um Paul Keim, Flagstaff, USA erfolgen.
Methoden
Die Kooperation mit der Arbeitsgruppe um Paul Keim
ermöglichte den Transfer und erleichterte die
Etablierung eines Protokolls für die Multi Locus
VNTR Analyse (MLVA) zur Typisierung von Brucella
spp.
Ausgewählte
Teststämme
dienen
zur
Einstellung des Testsystems mittels konventioneller
PCR und anschließender Längenbestimmung am
Haus-internen Kapillarsequenzer. Die Auswertung
erfolgt mittels der Genemapper-Software und die
finale Analyse mittels der Software BioNumerics.
Ergebnisse 2012
Im Kalenderjahr 2012 konnte am InstMikroBioBw die
MLVA-Typisierung (15 Marker) für Brucella spp.
erfolgreich etabliert und an 15 Stämmen bereits
angewendet werden. Das modifizierte Protokoll
beinhaltet 3 Mastermixe zu je 5 Loci und kann
innerhalb weniger Tage für Brucella-Isolate am
Institut durchgeführt werden.
55
STAN-PROJEKT IMB-45-2003 | Bakteriologie und Toxinologie
Pathogenese, Spezialdiagnostik und Prophylaxe
von B-Intoxikationen
♦ STAN-Unterprojekt 45-2003-13
Nachweis von Toxingenen mittels PCR-Technik: Rizin
♦ STAN-Unterprojekt 45-2003-14
Botulinum Neurotoxine: molekularbiologischer Nachweis der Toxingene
Fragestellung
Ziele
Biologische Toxine nehmen nach Einschätzung
nationaler und internationaler Gremien einen immer
höheren Stellenwert als potenzielle bioterroristische
Kampfstoffe ein. In Veröffentlichungen der NATO
werden inzwischen neun toxische Agenzien neben 13
bakteriellen und 17 viralen Erregern als potenzielle
biologische Kampfstoffe gelistet. Grund für die
Nennung einer immer höheren Anzahl von Toxinen ist
die höhere Anwendungswahrscheinlichkeit durch eine
vergleichsweise
einfache
Beschaffung
und
Aufbereitung
dieser
Agenzien.
Zudem
sind
biologische Toxine in diversen Lebensmitteln, Wasser
oder Pulverform relativ stabil. Ferner existieren bereits
Anleitungen im Internet, wie biologische Toxine aus
natürlichen Matrizes gewonnen und extrahiert werden
können.
Für jede Toxingruppe, bzw. jedes toxische Agens, das
potenziell als biologischer Kampfstoff eingeschätzt
wurde, sollen direkte Nachweisverfahren etabliert
werden. Meist sind immunologische Tests, wie z.B.
ELISA
und
Westernblotting
ausreichend.
Grundsätzlich sollte jedoch der diagnostische
Goldstandard etabliert werden. Neben dem direkten
Toxinnachweis sollte für jedes Proteintoxin zusätzlich
der Toxingen-Nachweis mittels PCR etabliert werden.
Dieser Diagnostikansatz darf aufgrund der hohen
Sensitivität und Spezifität der Methodik und
letztendlich der schnellen und robusten Handhabung
nicht fehlen. Kommerziell erhältliche Tests sollen
hinsichtlich ihres Leistungsspektrums anhand von
klinischen Matrizes geprüft werden.
Der Nachweis von Intoxikationen des Menschen oder
der direkte Toxinnachweis unterscheidet sich
grundlegend
von
der
Diagnostik
von
Infektionskrankheiten. Symptome, die Agenzien wie
z.B. Clostridium botulinum Neurotoxin, Rizin, Abrin,
Staphylococcus aureus Enterotoxin, diverse Algenund Pilztoxine verursachen reichen von Lähmungen,
Sprachstörungen,
Erbrechen,
Diarrhoe,
Kreislaufkollaps über weitere wenig-spezifische
Symptome
bis
hin
zur
perakuten
Vergiftungserscheinungen mit Todesfolge. Auf dem
Markt sind nur wenige kommerzielle Testsysteme
erhältlich, keines davon ist für die Diagnostik an
klinischen Proben zugelassen. Grundsätzlich ist
Toxin-haltiges Material oder eine Intoxikation durch
den direkten Toxinnachweis oder den Nachweis von
Toxin-Antikörpern
nach
Serokonversion
zu
diagnostizieren. Ferner besteht die Möglichkeit den
Nachweis Toxin-kodierender Gene mittels PCR/
Echtzeit PCR durchzuführen.
56
56
STAN-UNTERPROJEKT 34-2001-15 | B-Spezialdiagnostik und Hochsicherheitslabor
STAN-UNTERPROJEKT 45-2003-13 | Bakteriologie und Toxinologie
Nachweis von Toxingenen mittels PCR-Technik:
Rizin
Ausblick
Die
QM-gerechte Validation
der
PCR ist
abgeschlossen. Die Methode kann in den
Zentralbereich Diagnostik übergeben werden.
Bearbeiter
OSV Dr. Riehm
Laufzeit
01/2012 bis 12/2012
Sachstand
Die Diagnostik von biologischen Toxinen umfasst
neben dem direkten Proteinnachweis auch den
Nachweis der für die Toxine kodierenden Gene
mittels PCR. Am InstMikroBioBw gibt es keinen PCRNachweis für das Rizin-Gen von Ricinus communis.
Zielsetzung
Ziel ist das Etablieren und die QM-gerechte
Validierung eines PCR Assays zum Nachweis Rizinkodierender Gene in Pflanzen. Nach der
Reakkreditierung des Instituts gemäß ISO 17025 und
der Übergabe der Methode in den Zentralbereich
Diagnostik kann der molekulare Rizin-Gen Nachweis
damit offiziell angeboten werden.
Methoden
Der Nachweis von Ricinus-communis-DNA soll
mittels Echtzeit-PCR-Verfahren aus verschiedenen
Probenmatrizes sensitiv und spezifisch erfolgen.
Ergebnisse
Nach Literaturrecherche konnte eine spezifische
Target-Sequenz identifiziert werden. Primer und
Sonden zur Amplifizierung wurden ausgewählt. Nach
Validation gemäß ISO 15189 und der Durchführung
einer
Probit-Analyse
konnte
anhand
von
synthetischen DNA-Konstrukten eine Nachweisgrenze von 8 Genkopien pro PCR-Ansatz ermittelt
werden. Im Rahmen der Validationsarbeiten wurde
die Spezifität der PCR an diversen Rizin-DNAExtrakten (Schrot aus Bohnen, Pflanzenteile) und
anhand von fünf DNA-Extrakten aus Wolfsmilchgewächsen - Nahverwandte der Rizinpflanze - getestet.
Die PCR zeigte hier eine 100%ige Spezifität.
Bewertung
Der qualitative und quantitative Nachweis des RizinGens von Ricinus communis aus verschiedenen
Probenmatrizes unterstützt die Diagnostik bei der
Abklärung einer Intoxikation. Einen direkten
Proteintoxinnachweis kann aber die PCR nicht
ersetzen.
57
STAN-UNTERPROJEKT 34-2001-15 | B-Spezialdiagnostik und Hochsicherheitslabor
STAN-UNTERPROJEKT 45-2003-14 | Bakteriologie und Toxinologie
Botulinum Neurotoxine:
molekularbiologischer Nachweis der Toxingene
Ergebnisse 2013
Im Jahr 2013 wurde Untersuchungen mit den neuen
Oligonukleotiden
durchgeführt.
Durch
die
Validationsarbeit konnten robuste und spezifische
PCR Assays entwickelt werden. Das Detektionslimit
liegt für BoNT A, B und E derzeit bei 100 Gen-Kopien
und für BoNT F bei 500 Gen-Kopien. Die Validation
wird voraussichtlich 2014 abgeschlossen.
Bearbeiter
OSV Dr. Riehm
Laufzeit
01/2012 bis 12/2014
Sachstand
Der Nachweis der Toxingene von Clostridium
botulinum ist am Institut nicht QM-gerecht etabliert.
Die PCR stellt jedoch ein Standardnachweisverfahren dar, das auch am "Zentrum für Biologische
Sicherheit, Mikrobielle Toxine" des Robert KochInstituts in Berlin etabliert ist.
Bewertung
Die umfangreichen Validierungsarbeiten erfassen
immer auch die Prüfung auf Spezifität. Wenn diese
für eine Diagnostik-PCR nicht gegeben ist, müssen
die Targetsequenzen verändert werden. Dies ist in
diesem Projekt geschehen und verzögerte damit
zeitlich die Fertigstellung der Validation. Im
vorliegenden Fall der vier BoNT-spezifischen Echtzeit
-PCR-Assays konnte die eindeutige Spezifität nur
durch das neue Platzieren von Oligonukleotiden
(Primern und Sonden) erreicht werden.
Zielsetzung
Ziel ist die Etablierung und Optimierung von PCRs
zum Nachweis der humantoxischen Botulinum
Neurotoxine (BoNT) A, B, E und F. Nach Validation
gemäß den Anforderungen nach ISO 15189 und dem
Bestimmen der Nachweisgrenze durch Probitanalyse
sollen die PCR Verfahren in das Analysenspektrum
des Zentralbereich Diagnostik integriert werden.
Ausblick
Die vier neuen PCR-Assays werden gemäß ISO
15189 am InstMikroBioBw validiert. Die Methode wird
anschließend an den Zentralbereich Diagnostik
übergeben werden.
Methoden
Der Gen-Nachweis der BoNT A, B, E und F und
entsprechenden Subtypen erfolgt mittels PCR. Für
jedes Toxin soll ein Echtzeit-Singleplex-PCR-Assay
etabliert und validiert werden. Um jeweils alle
Toxinsubtypen erfassen zu können, werden
Sequenzen aus der Genbank gesammelt und
verglichen werden.
Ergebnisse 2012
Zunächst wurden bereits publizierte PCR-Assays
etabliert. Die Assays wurden anhand unterschiedlicher Toxin-bildender Clostridium botulinum Stämme
getestet. Wie in der Literatur beschrieben, kann das
Genom dieser Bakterien für mehr als einen
Toxintypen kodieren. Es stellte sich jedoch heraus,
dass die publizierten Assays nicht ausschließlich
spezifisch die jeweilige Toxin-Gen-Gruppe erfasst.
Bei standardisiert eingesetzer DNA-Menge (1 ng)
zeigten sich unspezifische positive Reaktionen mit
späten CT Werten (CT 35-39) und untypischen
Amplifizierungskurven, die eine exakte Auswertung
erschwerten oder verhinderten. Daher sollen andere
Amplifizierungsregionen innerhalb der Toxingene
ausgewählt werden, zudem sollen neue - kürzlich
publizierte - Toxinsubtypen mit berücksichtigt
werden.
58
STAN-PROJEKT IMB-50-2010 | Bakteriologie und Toxinologie
Differenzierung bakterieller B-Erreger mittels
MALDI TOF MS
♦ STAN-Unterprojekt 50-2010-01
Differenzierung bakterieller B-Erreger mittels MALDI TOF-MS
Fragestellung
Ziele
Die zweifelsfreie Identifizierung von B-Agenzien
erfordert
die
Anwendung
von
grundsätzlich
unterschiedlichen Techniken (Bestätigungsmethode).
Neben der molekularbiologischen, immunologischen
und klassischen biochemischen Charakterisierung
kann dieses Ziel mit modernen massenspektrometrischen Verfahren schnell und zuverlässig erreicht
werden. Mit der innovativen MALDI-TOF-MSTechnologie (Matrix Assisted Laser Desorption
Ionization Time Of Flight Mass Spectrometry) können
Bakterien anhand ihrer Proteinzusammensetzung
schnell und spezifisch meist bis auf Speziesebene
identifiziert werden. Dies erfolgt durch einen Abgleich
gemessener Spektren mit den Referenzspektren einer
Datenbank. Bislang sind ca. 3.500 verschiedene
Massenspektren, v.a. häufiger und klinisch relevanter
Bakterien und Hefen eingepflegt. Die Datenbank zur
Erkennung B-Waffen-fähiger-Erreger umfasst derzeit
nur einige wenige Spektren auf der Basis einzelner
Erreger und muss weiter ausgebaut werden.
Ziel ist zunächst das Implementieren der Methode in
das Methodenspektrum des Instituts, insbesondere im
Zentralbereich Diagnostik. Erreger, die potenziell als
bakterielle B-Kampfstoffe gelten, sollen analysiert und
die resultierenden Spektren in die bestehende
Datenbank eingepflegt werden. Ferner kann auch der
Nachweis und die Differenzierung von biologischen
Toxinen mittels Massenspektrometrie in das
Methodenspektrum implementiert werden.
59
59
STAN-UNTERPROJEKT 34-2001-15 | B-Spezialdiagnostik und Hochsicherheitslabor
STAN-UNTERPROJEKT 50-2010-01 | Bakteriologie und Toxinologie
Differenzierung bakterieller B-Erreger mittels
MALDI TOF-MS
werden, dass die Methode auch für die Untersuchung
von Ausbruchsuntersuchungen geeignet ist. Dabei
zeigte sich eine im Vergleich zu molekularen
Analysen (MLVA; Genomsequenzierung) nahezu
identische Clusterung der Stämme.
Bearbeiter
OSA Dr. Genzel, OSA Georgi
Laufzeit
01/2010 bis 12/2014
Bewertung
Mit der Methode MALDI-TOF MS können auch eng
verwandte Spezies schnell und zuverlässig
identifiziert werden. Die Analyse ist im Vergleich zu
biochemischen Methoden deutlich kürzer und kann
zudem nach Inaktivierung der Proben außerhalb des
BSL-3-Labors durchgeführt werden. Die Kultivierung
des Keims und die Identifizierung mittels MALDI-TOF
MS kann als unabhängige Bestätigungsmethode zur
Nukleinsäureamplifikationstechnik
dienen.
Die
Technik
ermöglich
darüber
hinaus
eine
phylogenetische Typisierung der Stämme.
Sachstand
Die Identifizierung bakterieller Reinkulturen durch
MALDI-TOF MS ist schneller als die bisher
etablierten biochemischen und molekularbiologischen
Methoden. Eine zuverlässige Identifizierung hängt
maßgeblich von den Referenzspektren in der
Datenbank ab, mit der die Spektren der untersuchten
Bakterien verglichen werden, wobei für B-Agenzien
bisher wenige Referenzspektren existieren.
Zielsetzung
Ziel ist es, die Referenzdatenbank Biotyper® um die
Spektren der institutseigenen Stammsammlung zu
erweitern, um das Diagnostikum MALDI-TOF MS zur
besseren Identifizierung von B-Agenzien zu
befähigen.
Ausblick
Das Projekt wird über das ursprünglich geplante
Projektende 2012 hinaus um zwei Jahre fortgeführt,
um die Datenbank fortlaufend um neue Spektren
(insbesondere zu Yersinia pestis / Y. pseudotuberculosis und Brucella spp.) aus der ständig wachsenden
Stammsammlung am Institut für Mikrobiologie der
Bundeswehr zu erweitern.
Methoden
Aus der Stammsammlung des Institutes werden
verschiedene für den Medizinischen B-Schutz
relevante Bakteriengattungen angezüchtet, daraus
spezifische Referenzspektren generiert und mit den
Spektren anderer, nah verwandter und klinisch
relevanter Spezies verglichen. Durch Erweiterung
und
Modifikation
der
Datenbank
soll
die
Zuverlässigkeit der Identifizierung weiter erhöht
werden.
Ergebnisse 2012
Durch
die
neu
erstellten
institutseigenen
Referenzspektren zu 50 ausgewählten Stämmen von
Burkholderia pseudomallei, B. mallei und B.
thailandensis konnte die MALDI Biotyper® Referenzdatenbank sinnvoll erweitert werden. Es konnte
gezeigt werden, dass sich auch die genetisch eng
verwandten Erreger von Rotz und Melioidose mittels
MALDI-TOF MS differenzieren lassen. Die Daten
wurden 2012 publiziert (KARGER ET AL., BMC
MICROBIOLOGY, 2012).
Ergebnisse 2013
Für den Rotzausbruch in Bahrain 2010/2011 konnte
nach Vergleich der einzelnen Spektren und Abgleich
mit molekularbiologischen Untersuchungen gezeigt
60
STAN-PROJEKT IMB-52-2011 | Bakteriologie und Toxinologie
Antimikrobielle Emp;indlichkeitstestung
B-Waffen relevanter Erreger
♦ STAN-Unterprojekt 52-2011-01
Antimikrobielle Empfindlichkeitstestung B-Waffen relevanter Erreger
Fragestellung
Ziele
Daten zur Resistenz gegenüber Standardtherapeutika
sind von bakteriellen B-Agenzien bisher kaum
beschrieben. Die Resistenzentwicklung von Bakterien
gegen hochwirksame Antiinfektiva stellt weltweit ein
Problem dar. Die absichtlichen Veränderungen von
B-Waffen-fähigen
Erregern
hinsichtlich
ihrer
Antibiotikaresistenz ist zu erwarten. Eine richtige und
frühzeitig begonnene Initialtherapie führt zur
drastischen Senkung der Mortalität bei schweren
Infektionen. Die als potenzielle B-Waffen geeigneten
bakteriellen Erreger müssen daher zuverlässig und
schnell auf Resistenzen überprüft werden können. Die
Methoden hierfür sind bisher nur unzureichend am
InstMikroBioBw etabliert und validiert.
Mögliche Resistenzen der B-Waffen-relevanten
Erreger gegenüber Antibiotika müssen schnell und
zuverlässig erkannt werden, um in kürzester Zeit
Prophylaxe- und Therapievorschläge abzugeben.
Gängige Verfahren sollen etabliert, angewandt und
weiterentwickelt werden. Ziel ist die Implementierung
der Methoden in den Zentralbereich Diagnostik.
Molekulare Ursachen der Antibiotikaresistenz, wie
Resistenzplasmide, Gentransfer oder Mutationen
sollen zudem analytisch erforscht werden.
61
61
STAN-UNTERPROJEKT 34-2001-15 | B-Spezialdiagnostik und Hochsicherheitslabor
STAN-UNTERPROJEKT 52-2011-01 | Bakteriologie und Toxinologie
Antimikrobielle Emp;indlichkeitstestung
B-Waffen relevanter Erreger
bei normalem pH-Wert von 7,3 eine Subspeziesunabhängige,
unimodale
Verteilung
der
Empfindlichkeit gegenüber allen untersuchten
Fluorchinolonen. Der Modalwert der minimalen
Hemmkonzentration (MHK) lag dabei für Finafloxacin
mit zwei bzw. vier Verdünnungsstufen signifikant
niedriger als für Ciprofloxacin bzw. Moxifloxacin. Bei
einem pH-Wert von 5,8 verstärkte sich der Effekt
noch: 100% der Stämme wiesen dann MHKs für
Finafloxacin von ≤0,008 mg/L auf, wogegen die
Werte für Moxifloxacin signifikant höher lagen (0,064
bis 0,25 mg/L).
Bearbeiter
OSA Dr. Genzel, OSA Georgi
Laufzeit
07/2011 bis 06/2014
Sachstand
Im Gegensatz zu den klinisch häufig auftretenden
Bakterien wie Staphylokokken oder Enterobakterien
werden antimikrobielle Empfindlichkeitsprüfungen zu
hochpathogenen Erreger nur an wenigen Instituten
routinemäßig durchgeführt. Zudem sind diese
Untersuchungen wenig standardisiert.
Ergebnisse 2013
Die erfolgversprechenden Untersuchungen wurden
2013 auf insgesamt 68 Stämme von Yersinien der
Risikogruppe 2 und 3 ausgedehnt. Auch hier
bestätigte sich die im Vergleich zu anderen
Fluorchinolonen stärke antimikrobielle Wirksamkeit
der neuen Substanz Finafloxacin im leicht azidotisch
Milieu. So lag bei einem pH-Wert von 5,8 der MHKModalwert aller Y. enterocolitica-Stämme bei ≤0,008
mg/L (Finafloxain), 0,5 mg/L (Ciprofloxacin) bzw. 1,0
mg/L (Moxifloxacin).
Zielsetzung
Die am Institut vorhandene Stammsammlung bietet
großes Potential, strukturiert Daten zur Verteilung der
minimalen Hemmkonzentration (MHK) gegenüber
verschiedenen Antibiotika bei Bakterien zu erheben,
die als B-Kampfstoffe bewertet werden. Gleichzeitig
können neue Substanzen wie Finafloxacin oder
Tigecyclin in die Untersuchungen einbezogen
werden, um Therapiealternativen zu den gängigen
Standardantibiotika zu entwickeln.
Bewertung
Erste vorläufige Daten zur in-vitro Aktivität von
Finafloxacin konnten bereits 2012 (Francisella spp.)
und 2013 (Yersinia spp.) auf wissenschaftlichen
Fachtagungen präsentiert werden. Insbesondere im
lokal azidotischen Milieu bakterieller Infektionsprozesse scheint die Substanz herkömmlichen
Vertretern der Wirkstoffgruppe überlegen zu sein.
Methoden
Das Projekt stützt sich auf den Goldstandard der
antimikrobiellen Empfindlichkeits-prüfung ab: die
Mikrobouillondilutionsmethode im 96-well-Plattenformat. Dazu wurden zwei Testplatten entwickelt, die
eine Auswahl lyophilisierter Antibiotika in definierten
Konzentrationen enthalten. Dabei ermöglicht die
erste Platte die parallele Testung von 12
verschiedenen gegen gramnegative Bakterien
wirksame Antibiotika, während die zweite Platte
speziell entwickelt wurde, um die Empfindlichkeit
gegenüber Fluorchinolonen einschließlich der
innovativen Substanz Finafloxacin bei verschiedenen
pH-Werten zu testen. Zusätzlich werden Daten mit
der abgeleiteten Methode Gradientendiffusion
erhoben, um Ergebnisse aus Publikationen und
anderen Laboren besser bewerten zu können.
Ausblick
Bis zum Ende der Projektlaufzeit werden weitere
Gattungen und Arten hochpathogener gramnegativer
Bakterien aus dem Erregerspektrum des Instituts
unter standardisierten Bedingungen getestet. Die
Ergebnisse zur Antibiotikaresistenz bei klinischen
und Wildtyp-Isolaten können so zu besser
begründeten Empfehlungen bei der kalkulierten
Initialtherapie dieser Infektionen führen.
Ergebnisse 2012
Nach
Etablierung
der
Methode
mit
dem
Referenzkeim E. coli wurde begonnen, ausgewählte
hochpathogene, gramnegative Keime im Doppelansatz in beiden Testplattenkonfigurationen zu
untersuchen. Schwerpunkt in 2012 war die Testung
verschiedener Francisella-Spezies. Dabei zeigte sich
62
STAN-UNTERPROJEKT 34-2001-15 | B-Spezialdiagnostik und Hochsicherheitslabor
SONDERFORSCHUNG 24Z1-S-431112 | Bakteriologie und Toxinologie
Phä notypische und molekulare Typisierung von YersiniapestisStä mmen aus der Mongolei zum Au;bau von Datenbanken fü r
bioforensische Nachweisanalysen
Ergebnissen der phänotypischen Analysen. Ein
Stamm erwies sich als multiresistent gegenüber den
üblicherweise zur Therapie eingesetzten Antibiotika.
Die
Genomsequenz
dieses
Stammes
wird
gegenwärtig
analysiert.
Die
durchgeführten
molekularen Analysen erlauben eine genaue
phyleographische Zuordnung und die forensische
Rückverfolgung mongolischer Y. pestis Stämme.
Letztere setzen sich von den beschriebenen
zentralasiatischen Gruppen (z.B. Stämme aus China)
deutlich ab. Die gewonnenen Daten wurden in die
Instituts-interne Datenbank eingepflegt und dienen
für zukünftige Projekte als Referenz. Die Ergebnisse
wurden in 2 Fachzeitschriften publiziert (KIEFER D
ET AL., VECTOR BORNE ZOONOTIC DIS., 2012;
RIEHM JM ET AL., PLOS ONE, 2012). Weiterhin
konnte im Berichtszeitraum DNA von weiteren 100
Stämmen humanen Ursprungs nach Deutschland
transferiert werden. Die Analyse der DNA mittels
Gelelektrophorese zeigte, dass die verschiedenen
Y. pestis Isolate unterschiedliche Plasmide tragen.
Bisher sind bei Y. pestis nur 3 Plasmide beschrieben,
die für die Virulenz von Y. pestis von entscheidender
Bedeutung sind. In weiteren Analysen sollen die
atypischen Plasmide genauer analysiert werden.
Bearbeiter
RDir PD Dr. Scholz, OSV Dr. Riehm
Laufzeit
01/2011 bis 12/2013
Sachstand
Mongolische Y. pestis Stämme sind bisher noch nicht
abschließend charakterisiert worden. Bisher konnte
eine Auswahl von 100 mongolischen Y. pestis
Stämmen, die aus infizierten Tieren und Vektoren
isoliert worden waren, analysiert werden. Die
Ergebnisse wurden 2012 in zwei Fachzeitschriften
publiziert. Der bisherige Erfolg der Kooperation
schaffte ein hohes Vertrauensverhältnis zwischen
den mongolischen und deutschen Instituten. Die
weiterführende Analyse der bereits transferierten
Stämme sowie die Analyse von zusätzlichen
Stämmen aus Pestpatienten werden gegenwärtig
durchgeführt.
Zielsetzung
Ziel ist die phänotypische und molekulare
Typisierung von Y. pestis Stämmen aus der
Mongolei. Die gewonnenen Daten sollen zur
Aufklärung der Evolution des Pesterregers beitragen
und zugleich den Aufbau von Typisierungsdatenbanken für bioforensische Nachweisanalysen
ermöglichen. Ein weiteres Ziel ist die Klärung, ob nur
eine
Untergruppe
der
in
Naturreservoiren
vorkommenden Stämme für Infektionen des
Menschen verantwortlich ist oder ob humane
Infektionen durch eine heterogene Population von
Y. pestis Stämmen verursacht werden.
Ergebnisse 2013
Die akquirierten Y. pestis Stämme wurden mittels
SNP Analysen untersucht und phylogenetisch in den
Stammbaum des Pesterregers eingruppiert. Dabei
zeigte sich, dass auch Stämme des Branch 0
humanpathogen
sein
können,
obwohl
man
ursprünglich davon ausgegangen war, dass diese
nicht humanpathogen sind. Dies steht im Einklang
mit den Ergebnissen einer großangelegten
Vollgenomsequenzierstudie (mehr als 200 Genome),
die von chinesischen Kollegen durchgeführt und
publiziert wurde. Eine Vollgenomsequenzierung von
3 ausgewählten mongolischen Y. pestis Stämmen
mittels PacBio (Lifescience Technologies) zur
Generierung hoch akkurater Genomsequenzen
wurde begonnen. Ebenfalls in 2013 erfolgte eine
dreiwöchige Feldexpedition mehrerer Wissenschaftler des Instituts in ein Pestendemiegebiet in der
Mongolei (siehe detaillierter Sonderbericht). Es
wurden dabei 200 Nagetiere vor Ort gefangen und
die Organe präpariert. Diese wurden an das Institut
für Mikrobiologie verbracht und gemeinsam mit
mongolischen Wissenschaftlern auf das Vorhandensein Y. pestis-spezifischer DNA hin untersucht.
Hierfür wurden drei mongolische Wissenschaftler für
drei Monate am InstMikroBioBw ausgebildet.
Methoden
Mittels molekularbiologischer Methoden wurden
kanonische Single Nucleotide Polymorphism (SNP)
bestimmt und Multi Locus VNTR Analysen (MLVA)
durchgeführt. Letztere wurden durch die Analyse von
Clustered Regularly Interspaced Short Prokaryotic
Repeats (CRISPR) Analysen unterstützt. Von
einzelnen Stämmen werden Vollgenomsequenzierungen durchgeführt.
Ergebnisse 2012
Bisher konnten die Methoden auf die 100 bereits
transferierten Peststämme erfolgreich angewendet
werden. Die Zuordnung der Peststämme zu
entsprechenden Biovaren korrelierte mit den
63
STAN-UNTERPROJEKT 34-2001-15 | B-Spezialdiagnostik und Hochsicherheitslabor
SONDERFORSCHUNG 24Z1-S-431112 | Bakteriologie und Toxinologie
Bewertung
Die detaillierten phänotypischen und molekularen
Analysen von Y. pestis Stämmen aus der Mongolei
sind einzigartig und liefern wichtige neue
Erkenntnisse zur Evolution des Pesterregers. Die
Kooperation verläuft trotz der großen Distanz sehr
erfolgreich. Bereits mehrfach erfolgte nun ein
Transfer von Y. pestis-DNA an das InstMikroBioBw.
Durch die erfolgreiche, mehrmonatige Ausbildung
mongolischer
Wissenschaftler
wurde
ein
wesentliches Ziel der Kooperation zwischen beiden
Institutionen
erreicht.
Die
durchgeführte
Feldexpedition erbrachte wichtige Erkenntnisse für
zukünftige Untersuchungen von Pest-Naturherden.
Durch
die
Integrierung
der
molekularen
Typisierungsdaten
in
die
Datenbank
des
InstMikroBioBw konnte diese enorm aufgewertet
werden.
Ausblick
Geplant sind umfangreiche Vollgenomsequenzierungen ausgewählter Stämme in Zusammenarbeit
mit der Northern University, Arizona, USA. Die
Typisierung von Y. pestis Stämmen, die aus
humanen Patienten isolierten wurden, soll klären, ob
Infektionen des Menschen durch eine bestimmte
Y. pestis-Gruppe verursacht wird oder ob
verschiedene Stämme dafür verantwortlich sind.
64
STAN-UNTERPROJEKT 34-2001-15 | B-Spezialdiagnostik und Hochsicherheitslabor
DRITTMITTELPROJEKT FKZ 1369-456 | Bakteriologie und Toxinologie
Seroprä valenzstudie seltener Zoonoseerreger
im Rahmen des RKI-Netzwerk Zoonosen
Bearbeiter
RDir PD Dr. Scholz
Netzwerkes zusammen mit den Daten zu anderen
Krankheitserregern veröffentlicht.
Laufzeit
01/2012 bis 12/2013
Bewertung
Aufgrund der Ergebnisse kann davon ausgegangen
werden, dass Waldarbeiter höchstwahrscheinlich
keine Risikopopulation für eine Brucella-Infektion
darstellen, da die hier ermittelte Seroprävalenz
vergleichbar mit bereits veröffentlichten Daten zur
Normalbevölkerung ist. Eine Untersuchung der 8000
Blutspenderseren wurde deshalb nicht durchgeführt.
Sachstand
Die Prävalenz von anti-Brucella-Antikörpern in der
deutschen Normalbevölkerung und in besonders
exponierten Personengruppen ist nur unzureichend
bekannt. Aus diesem Grund wurde im Rahmen des
RKI Netzwerks Zoonosen eine Seroprävalenzstudie
initiiert.
Die
Kollektive
„Waldarbeiter“
als
Risikopopulation und "gesunde Blutspender" bieten
die Möglichkeit für viele der im Netzwerk vertretenen
Erreger, darunter Brucella, von der Prävalenz dieser
Infektionen in beiden Gruppen auf die Situation in der
Gesamtbevölkerung zu schließen. Das Institut für
Mikrobiologie ist durch die Konsiliarlabore für
Francisella und Brucella im RKI-Netzwerk Zoonosen
vertreten und nimmt an der Studie teil.
Ausblick
Die Studie wird eingestellt.
Zielsetzung
Ziel der Seroprävalenzuntersuchung in zwei
unterschiedlichen Kollektiven ist die Gewinnung von
Daten zur Häufigkeit und geographischen Verteilung
von in Deutschland selten auftretenden Zoonosen (u.
a. Brucellose, Q-Fieber, Tularämie, FSME).
Methoden
Mittels ELISA sollen über 600 Seren von
Waldarbeitern und 8000 Seren von Blutspendern aus
Nord Rhein Westfalen auf anti-Brucella IgG und IgM
Antikörper untersucht werden. Dies soll Hinweise
darüber
geben,
ob
Waldarbeiter
eine
Risikopopulation
für
eine
Brucella-Infektion
darstellen.
Ergebnisse 2012
Von 607 eingesandten Serumproben konnten bisher
300 Seren auf Brucella mittels ELISA untersucht
werden. Dabei zeigten lediglich fünf Seren einen
relevant-erhöhten IgG/IgM Titer (Seroprävalenz
1,67%).
Ergebnisse 2013
Die
Untersuchungen
von
weiteren
130
Waldarbeiterseren bestätigten die Ergebnisse von
2012. Die für die Brucellose erhobenen Daten
werden in einer gemeinsamen Publikation des
65
STAN-UNTERPROJEKT 34-2001-15 | B-Spezialdiagnostik und Hochsicherheitslabor
DRITTMITTELPROJEKT FKZ 1369-448 | Bakteriologie und Toxinologie
Phä notypische und molekulare Charakterisierung atypischer Brucellen
ENVIRON MICROBIOL; AL DAHOUK ET AL, 2012;
APPL ENVIRON MICROBIOL; HOFER ET AL, 2012,
VET MICROBIOL). Die molekulare Typisierung
mittels MLST der 21 Isolate aus Afrikanischen
Grabfröschen
zeigte
eine
unerwartet
hohe
genetische Diversität. Von jedem Cluster wurden
daher zwei Isolate, insgesamt acht Stämme,
Vollgenom-sequenziert.
Erste
vergleichende
Genomanalysen weisen darauf hin, dass es sich um
„Ur-Brucellen“ handelt, also um die Vorläufer der
heute bekannten humanpathogenen Brucella-Arten.
Weitere
spezifische
Genomanalysen
werden
gegenwärtig durchgeführt.
Bearbeiter
RDir PD Dr. Scholz
Laufzeit
01/2012 bis 12/2013
Sachstand
In den letzten Jahren wurden vermehrt atypische
Brucella-Stämme isoliert, die sich keiner der
bestehenden Arten zuordnen lassen. Die Ätiologie
dieser Brucellen aber auch ihre phylogenetische
Position innerhalb der Gattung Brucella ist noch
weitgehend ungeklärt. Die atypischen Isolate
stammen aus verschiedenen Tierarten (Primaten,
Füchsen, Nagetieren bis hin zu Fröschen) aber auch
aus
Patienten
mit
Brucellose-ähnlichen
Erkrankungen. Aufgrund ihrer atypischen Merkmale
stellen diese Brucellen auch für die Diagnostik eine
Herausforderung dar.
Ergebnisse 2013
Die
in
2012
und
2013
durchgeführten
Untersuchungen führten zur Beschreibung einer
weiteren Brucella-Art in Primaten, B. paponis
(WHATMORE et al., 2014, INT. J. Syst: Evol.
Microbiol.). Die Auswertung der Daten zu den
Genomsequenzen von insgesamt 8 BrucellaStämmen aus Afrikanischen Grabfröschen, zeigten,
dass es sich um mindesten 6 neue verschiedene
Brucella-Arten handelt. Das Vorhandensein von
Gensequenzen
anderer
Boden-assoziierter
Bakterien, wie Ochrobactrum, Agrobacterium,
Burkholderia und Mesorhizobium in den Genomen
dieser Brucellen weist auf ein Reservoir im Boden
hin. Es zeigt auch, dass diese Brucellen zu einem
massiven Gentransfer befähigt sind.
Zielsetzung
Es sollen in diesem Projekt atypische Brucellen in
einem polyphasischen Ansatz, bestehend aus einer
Reihe von Untersuchungen zum Phänotyp und zum
Genotyp genauer charakterisiert werden. Unsere
Ergebnisse sollen letztendlich zu einem neuen und
umfassenderen Verständnis der Gattung Brucella
beitragen.
Methoden
Die Bestimmung des Phänotyps erfolgt durch
klassische Methoden der Mikrobiologie, wie Anzucht
auf verschiedenen Nähmedien bei unterschiedlichen
Temperaturen,
Empfindlichkeit
gegenüber
verschiedenen
Farbstoffe,
Bestimmung
der
Antibiotikaresistenz
und
der
biochemischen
Eigenschaften
sowie
Typisierung
mit
Bakteriophagen. Molekulare Methoden beinhalten
den Nachweis der Brucella-spezifischen Gene
bscp31 und IS711, die Arten-differenzierende
Multiplex-PCR „Bruceladder“ sowie MLST und MLVA
bis hin zu Genomsequenzierungen.
Bewertung
Vor allem durch die Vollgenomsequenzierung und
vergleichenden
Genomanalysen
konnten
erstaunliche und neue Einblicke in die Evolution
dieses medizinisch relevanten Erregers erzielt
werden. Unsere Untersuchungen zeigen deutlich,
dass die Gattung Brucella eine weit höhere Diversität
besitzt als bisher angenommen. Eine Neubeschreibung der Gattung Brucella, welche die
Eigenschaften der neuen Brucella-Arten mitberücksichtigt, erscheint als notwendig. Für die neu
beschriebenen Brucella-Arten konnten spezifische
PCR-Nachweise etabliert werden.
Ergebnisse 2012
Phänotypisch konnten zwei Isolate von Rotfüchsen
aus Österreich, elf B. microti-Stämme sowie 21
Isolate aus Afrikanischen Grabfröschen analysiert
werden. Bisher sind daraus vier Publikationen
entstanden (FISCHER D ET AL; 2012, J ZOO
WILDL. MED; EISENBERG ET AL:, 2012, APPL
Ausblick
Durch das unerwartet gehäufte Auftreten potentiell
neuer Brucella-Arten wurden die anfänglich
gesteckten Ziele bei weitem übertroffen. Ziel ist die
Weiterführung des Projekts in den Jahren 2014 und
2015.
66
STAN-UNTERPROJEKT 34-2001-15 | B-Spezialdiagnostik und Hochsicherheitslabor
DRITTMITTELPROJEKT DHS-09-ST-108-001 | Bakteriologie und Toxinologie
Technology and Data Integration with the Bundeswehr Institute of Microbiology
Technologie und Datenaustausch des Institutes fü r Mikrobiologie der Bundeswehr, DEU und der Northern Arizona University / Center for Microbial Genetics
and Genomics, USA
vorhandenen Stämme mit den neuen Methoden.
Während eines Forschungsaufenthalts wurde ein
gemeinsames Troubleshooting durchgeführt. Es
erfolgte ein Versand lebender Stämme und von
DNAs in die USA. Von Seiten der NAU wurden 5
B. anthracis-Lebendstämme und 40 DNAs an das
InstMikroBioBw verschickt. Die Typisierung von
DNAs des InstMikroBioBw durch den Kooperationspartner wurde begonnen. Es konnten bereits 40
B. anthracis-Stämme mittels MLVA typisiert und die
Daten an das InstMikroBioBw transferiert werden.
Bearbeiter
RDir PD Dr. Scholz
Laufzeit
04/2010 bis 08/2013
Sachstand
Die molekulare Typisierung auf Isolatebene ist eine
Grundvoraussetzung für bioforensische Rückverfolgungsanalysen bei einer absichtlichen Ausbringung
von B-Agenzien. Dazu werden verschiedene
molekulare
Typisierungs-Assays
benötigt.
Im
Rahmen des Projektes konnten bereits eine Reihe
von molekularen Typisierungsassays für verschiedene B-Agenzien, wie z.B. Y. pestis, B. anthracis,
F. tularensis erfolgreich am InstMikroBioBw etabliert
werden. Die Typisierung und Generierung von
Typisierungsdaten unter Anwendung der neuen
Typisierungsassays mit Stämmen der Stammsammlung des InstMikroBioBw hat begonnen.
Ergebnisse 2013
Nahezu alle vom Kooperationspartner zur Verfügung
gestellten Typisierungs-Assays wurden am Institut für
Mikrobiologie der Bundeswehr etabliert. Mehr als 80
B. mallei, 100 Y. pestis, 80 B. anthracis, 150
Francisella- und über 150 Brucella-Stämme wurden
mit
den
diversen
Typisierungsmethoden
charakterisiert und die Daten in die Typisierungsdatenbank eingepflegt.
Zielsetzung
In Kooperation mit der Northern Arizona University
(NAU) sollen Typisierungs-Assays ausgetauscht und
vereinheitlicht werden. Generierte Typisierungsdaten
werden in Datenbanken hinterlegt. Dies ermöglicht
bei ungewöhnlichen Krankheitsausbrüchen eine
eindeutige Charakterisierung des auslösenden Agens
und möglicherweise eine eindeutige und juristisch
belastbare
Aussage
über
dessen
Herkunft
(Infektionsquelle, Verursacher).
Bewertung
Die
Etablierung
der
Methodenund
der
Stammtransfers
sind
trotz
großer
Distanz,
gesetzlicher Hürden und Verwaltungsaufwand
gelungen. Die zur Verfügungstellung detaillierter
Typisierungsprotokolle durch den Kooperationspartner erlaubte diese rasch und erfolgreich am IMB
zu etablieren. Die Bereitstellung finanzieller Mittel
ermöglichte es, die IT-Infrastruktur am Institut
wesentlich zu verbessern.
Methoden
Multi Locus Variable Number of Tandem Repeats
Analysen (MLVA) sollen für B. mallei und Y. pestis
etabliert werden. Kanonische SNPs sollen bestimmt
werden und mit den Methoden "melt-MAMA" und
"endpoint genotyping" für die Erreger B. mallei,
Y. pestis, F. tularensis und B. anthracis etabliert
werden.
Ausblick
Das Projekt wurde erfolgreich zu Ende geführt. Für
2014 und 2015 sind eine Reihe gemeinsamer
Publikationen geplant.
Ergebnisse 2012
Zunächst
erfolgte
der
Austausch
von
Methodenprotokollen, die dem InstMikroBioBw in
Form von SOPs bereitgestellt wurden. Die Assays
konnten erfolgreich auf die am InstMikroBioBw
vorhandenen Geräte-Plattformen übertragen werden.
Die Optimierung der Assays anhand ausgewählter
Referenzstämme ist abgeschlossen. Gegenwärtig
erfolgt die Typisierung der am InstMikroBioBw
67
Abteilung fü r Virologie
und Rickettsiologie
Die Teileinheit 020, Virologie und Rickettsiologie, hat
als ihren Kernauftrag die anwendungsorientierte
Forschung
auf
den
Gebieten
Diagnostik,
Epidemiologie, Therapie, Prophylaxe und Biotypisierung/Bioforensische
Verifikation
von
BGesundheitsstörungen, die durch solche Viren und
Rickettsien verursacht werden, die potentiell als BKampfstoffe eingesetzt werden können. Das Jahr
2012 war vor allem durch den Abschluss der
Validierungsarbeiten für die Akkreditierung der
virologischen und rickettsiologischen Diagnostik
geprägt. Hierbei bestand u.a. die Herausforderung,
molekulare Nachweise für hämorrhagische Fieberviren der Sicherheitsstufe 4 zu validieren. Auch
mussten die strikten zeitlichen Vorgaben eingehalten
werden. In Summe wurden von der TE 020 insgesamt
60 Testverfahren (28 serologische Teste, 19
molekularbiologische Teste und 13 ZellkulturIsolierungsverfahren)
an
den
Zentralbereich
Diagnostik abgegeben. Auch im Jahr 2013 wurden in
Kooperation mit dem Zentralbereich Diagnostik die
virologischen und rickettsiologischen Nachweisverfahren am Laufen gehalten. Besonders aufwendig
war jeweils die Herstellung der Positivkontrollen für
die hauseigenen molekularbiologischen Nachweisverfahren.
Die Forschungsaktivitäten der TE konzentrierten sich
zum einen auf die Frühsommer-MeningoenzephalitisViren (FSMEV). Es konnten in beiden Jahren neue
FSME-Herde entdeckt werden und damit weitere
neue FSMEV-Stämme isoliert und molekularbiologisch charakterisiert werden. Damit verfügt die
68
TE 020 über eine der umfassendsten FSMEVStammsammlungen der Welt. Erstmals wurde das
Gesamtgenom eines FSMEV-Eigenisolats (sibirischer
Subtyp) aus mongolischen Zecken sequenziert. In
Kooperation mit dem Friedrich-Löffler-Institut, Insel
Riems gelang es 11 Gesamtgenome von FSME-Viren
aus einem Naturherd über einen Zeitraum von 5
Jahren zu sequenzieren. Die damit gewonnenen
Daten werden erstmals u.a. zur Beantwortung von
Fragen zur genetischen Stabilität des FSMEV
innerhalb eines Herdes genutzt. Für Hantaviren
wurden neue molekularbiologische Daten für S-, Mund L-Segmente erhoben. Diese Ergebnisse ergeben
nun ein vollständigeres Bild über die molekulare
Epidemiologie dieser Viren und tragen damit zum
Verständnis der starken Aktivitätsschwankungen in
den letzten Jahren bei. Erstmals gelang die
Sequenzierung eines Rickettsien-Gesamtgenoms
(Eigenisolat von Rickettsia helvetica). Diese
Ergebnisse können helfen, standardisierte Verfahren
zur Biotypisierung von Rickettsien verfügbar zu
machen. Die für die Gesamtgenom-Sequenzierung
von Rickettsien entwickelten Aufreinigungsverfahren
werden mittlerweile von anderen Forschergruppen
genutzt. Insgesamt nahmen die internationalen
Kontakte der TE020 zu führenden Arbeitsgruppen auf
den Gebieten der FSME, der Hantaviren und der
Rickettsien erkennbar zu. Der enorme Zuwachs an
genetischen Daten für verschiedene Viren (FSMEV,
Hantaviren, Chikungunya-Viren) und Rickettsien (u.a.
Rickettsia helvetica, Rickettsia monacensis, Rickettsia
raoultii) erweiterte die Datenbasis für bioforensische
Fragestellungen beträchtlich.
Rift Valley-Fieber IgG-Seroprä valenz
in Tansania
Afrika hinaus nach Südeuropa wird für möglich
gehalten.
Rift Valley-Fieber ist eine wichtige Zoonose in
weiten Teilen Afrikas. Aufgrund der hohen
Pathogenität und Infektiosität spielt der Erreger
als potentielles B-Agens eine Rolle. In einer
Seroprävalenz-Untersuchung
in
SüdwestTansania konnte eine hochendemische Region für
Rift
Valley-Fieber
entdeckt
werden.
Der
endemische Herd ließ sich insbesondere durch
andere Umweltfaktoren von anderen Regionen
abgrenzen.
Im Rahmen einer Zusammenarbeit mit der AG Prof.
Hölscher, Abt. für Infektions- und Tropenmedizin der
Universität München, wurde eine SeroprävalenzStudie in der Region Mbeya, Südwest-Tansania,
durchgeführt. Dazu wurden 1.228 Seren der EMIDIStudie stratifiziert ausgewählt. Die Seren wurden aus
neun unterschiedlichen Teilen der Region mit
unterschiedlicher Meereshöhe (480 m bis 1.700 m
ü.M.) und Umwelt (urban vs. ländlich) selektiert. In
jedem getesteten Areal wurden zwischen 80 und 200
Seren untersucht. Die Testung des RVF-IgG erfolgte
mittels Indirekter Immunfluoreszenz unter Nutzung
kommerzieller Objektträger (Euroimmun, Lübeck;
Abbildung 3).
Rift Valley-Fieber (RVF) ist eine durch Stechmücken
übertragene Virusinfektion, die ihren Namen nach
dem Ort der Erstbeschreibung der Erkrankung, dem
Großen Grabenbruch (Rift Tal) in Kenia, besitzt.
Möglicherweise wurde diese Infektion schon in der
Bibel erwähnt, denn viele Medizinhistoriker sehen die
5. Plage im Alten Testament als durch RVF
verursacht. Bei Haustieren (Rinder, Schafe, Ziegen)
tritt u.a. ein epizootisches Abortieren auf. Beim
Menschen führt es zu einer Hämorrhagischen-FieberSymptomatik, zu Enzephalitis und zu Optikus-Neuritis
mit einem hohen Risiko der Erblindung. Die
Übertragung erfolgt durch Stechmücken und durch
Milch und Fleisch infizierter Haus- und Wildtiere. RVF
ist in großen Teilen Afrikas und auf Teilen der
Arabischen Halbinsel verbreitet.
64/1228 Seren (5,2%) zeigten eine reaktive
Immunfluoreszenz. Allerdings war die RVF-IgGPrävalenz in den einzelnen untersuchten Regionen
sehr ungleich verteilt. Die höchste Prävalenz konnte
in der Region Kyela am Malawi-See nachgewiesen
werden. Dort lag die Prävalenzrate mit 29.3% (44/150
Seren) signifikant höher als in allen anderen
untersuchten Teilregionen (Abbildung 2).
Da über alle Seren ausreichende standardisierte
Hintergrund-Informationen durch die EMINI-Studie
vorlagen, konnten die Ergebnisse für statistische
Auswertung von epidemiologischen Risikofaktoren
genutzt werden. Hierbei zeigte sich eine klassische
Altersverteilung für eine endemisch auftretende
Infektion mit einer kontinuierlichen Zunahme der
Prävalenz mit dem Alter. Die höchste Zunahme der
Prävalenz war in der Altersgruppe der 20-30jährigen.
Signifikant häufiger trat die Infektion in der Höhe von
480m ü.M. und in der Nähe des Malawi-Sees auf
(Abbildung 4). Hier hatten u.a. die Tages-, die Nacht-
Für den Medizinischen B-Schutz ist RVF von hohem
Interesse aufgrund der schweren und bisher nicht
therapierbaren klinischen Bilder und der hohen
Infektiosität. Daneben besitzt es eine überragende
medizinische und veterinärmedizinische Bedeutung.
Obwohl der Übertragungszyklus des RVF-Virus
grundsätzlich geklärt scheint, sind viele Aspekte des
natürlichen Auftretens des RVF bisher unbekannt
(Abbildung 1). Daneben wird RVF-Virus als eines der
invasivsten Viren angesehen. Eine Ausbreitung über
Abbildung 1: Ökologie des Rift Valley Fiebers in Ostafrika
Abbildung 2: Seroprävalenz von Rift Valley Fieber-Virus IgG in den
Studienorten in Tansania
69
und die Maximaltemperaturen einen signifikanten
Einfluss auf das Auftreten. Dahingegen hatte der
sozioökonomische Status oder der Besitz von
Haustieren keinen statistisch signifikanten Einfluss auf
das Auftreten der Infektion in der Bevölkerung.
Infektionen, z.B. im Rahmen von Einsätzen in Afrika,
mittels der gewonnenen Ergebnisse vorab z.B. über
GIS-Systeme abzuklären. Im Fall von positiven
Bewertungen sind Maßnahmen zum Schutz vor einer
Übertragung durch RVF-Virus zu ergreifen. In der
getesteten Region müssen Bewohner der Region
Kyela im Fall fieberhafter Infektionen mit oder ohne
hämorrhagischen Symptomen, Enzephalitis oder
Optikus-Neuritis differenzialdiagnostisch auf eine
RVF-Infektion untersucht werden.
Die Auswertung der Ergebnisse zeigt, dass das
Auftreten von RVF-Infektion unabhängig von
sozioökonomischen Faktoren vor allem durch
ökologische Faktoren bedingt wird. Damit ergibt sich
insbesondere die Möglichkeit Risikogebiete für RVF-
Abbildung 3: Immunfluoreszenz von Rift Valley Fieber-Virus IgG
Abbildung 4: Ufer des Malawi-Sees in der Nähe der Stadt Kyela, ein
Hochendemiegebiet für Rift Valley Fieber
70
Seroprä valenz von West Nil-Antikö rpern bei Bewohnern von Regionen mit hohem Virus-Invasionspotential
WNV führt nur in 20% der Infektionen zu manifesten
Erkrankungen beim Menschen. Damit ist vorstellbar,
dass WNV in einer Region zirkuliert, ohne dass es
zwangsläufig
zu
menschlichen
Erkrankungen
kommen muss. Daneben gibt es in Deutschland kaum
Diagnostiklabore, die routinemäßig WNV-Infektionen
diagnostizieren. Die Überwachung von Stechmücken
auf das Vorhandensein von WNV ist sehr aufwendig,
da nur ein kleiner Teil (< 1:1.000) der Stechmücken
Virusträger sind. Im Rahmen eines SerosurveillanceProjekts wurden 1.245 Seren aus sechs Regionen im
Süden Deutschlands auf IgG-Antikörper gegen WNV
getestet (Abbildung 2). Die Seren entstammten einer
pseudonymisierten Serumbank, mit Postleitzahlen für
den jeweiligen Wohnort des Spenders. Die Regionen
waren so gewählt, dass sie in Flusstälern mit
Hauptverkehrsrouten von Süden/Südosten/Westen
nach Deutschland liegen. Zum Ausschluss von
serologischen Kreuzreaktionen mit dem verwandten
FSME-Virus oder mit anderen Flaviviren oder
Flavivirus-Impfungen
wurden
Antikörper-positive
Seren zum Ausschluss entsprechender Kreuzreaktionen auf weitere, wichtige Flaviviren (Gelbfieber-,
Dengue-, Japan-Enzephalitis-, FSME-Virus) getestet.
Die Testung erfolgte mittels indirekter Immunfluoreszenz.
West Nil-Virus ist aktuell das sich am schnellsten
ausbreitende humanpathogene Flavivirus in
Europa. Aufgrund der Veränderung des Klimas
wird mit der Einwanderung und Etablierung des
West Nil-Virus in Deutschland gerechnet. In einer
Seroprävalenz-Studie konnte gezeigt werden,
dass Bewohner potentiell gefährdeter Regionen
Deutschlands
bisher
keine
serologischen
Hinweise für eine West Nil-Virus-Infektion zeigen.
West Nil-Virus (WNV) ist ein durch verschiedene
Stechmücken-Arten übertragenes Flavivirus mit einem
hohen Potential für eine rasche geographische
Ausbreitung. Das WNV zirkuliert zwischen Stechmücken und verschiedenen Vogelarten (Abbildung 1).
In den USA breitete es sich innerhalb weniger Jahre
über den gesamten Kontinent aus. In Europa wurden
in den letzten Jahren vermehrt Ausbrüche durch West
Nil-Virus im Süden und Südosten des Kontinents
registriert. Süddeutschland ist durch vielerlei
Verkehrsverbindungen mit den nahen endemischen
Regionen im Süden und Südosten Europas
verbunden. In den letzten zwei Jahren wurden
vermehrt mediterrane Stechmückenarten (Aedes
albopictus) entlang der Hauptverkehrsrouten aus dem
Süden entdeckt, die eine kontinuierliche Einschleppung von potentiellen Vektoren und infizierten
Stechmücken für WNV nach Deutschland aufzeigen.
Abbildung 1: Ökologischer Übertragungszyklus des West Nil-Virus
71
Abbildung 2: Regionen in Süddeutschland, die auf das
Vorkommen von West Nil-Virus Antikörpern untersucht wurden.
Abbildung 3: Mögliche Einschleppungswege des West Nil-Virus
nach Mitteleuropa
Insgesamt konnte bei drei der getesteten Seren eine
Infektion auf WNV nachgewiesen werden (Tabelle 1).
Ein Serum reagierte in der Region Bad Tölz
(Prävalenz 0,45%). Jeweils ein positives Serum
wurde in der Region Oberrhein und in der Region
Saarland gefunden (Prävalenz jeweils 0,40%). Die
IgG-Titer reagierten spezifisch gegen WNV, lagen
jedoch im niedrigen Bereich (1:20, 1:40), so dass von
länger zurückliegenden Infektionen ausgegangen
werden muss.
könnte (Abbildung 3). Die vorliegenden Ergebnisse
zeigen, dass bisher keine endemischen Infektionen in
den getesteten Regionen nachweisbar sind. Die
nachgewiesene, sehr niedrige Prävalenzrate lässt auf
sporadische Infektionen (vermutlich durch Reisen
erworben) schließen. Nicht zuletzt aufgrund des sich
ändernden Klimas ist jedoch mit einer Einschleppung
und Etablierung des WNV in Mitteleuropa in den
nächsten Jahren zu rechnen. Dabei dürften die
modernen Verkehrsmittel eine wichtige Rolle spielen,
wie an der zunehmend häufig beobachteten
Einschleppung
mediterraner
Stechmücken-Arten
festzustellen ist. Der vorliegend gewählte Ansatz einer
Antikörper-Surveillance von Bewohnern in durch
Einschleppung des WNV gefährdeten Regionen stellt
eine kostengünstige und weniger personalaufwendige
Alternative zum Stechmücken-Monitoring dar. Das
InstMikroBioBw ist in der Lage Infektionen mit WNV
serologisch,
molekularbiologisch
und
durch
Virusisolierung nachzuweisen.
Die vorliegende Studie ist eine der größten je in
Deutschland durchgeführten Seroprävalenz-Studien
zum Nachweis von WNV-IgG-Antikörpern. Bisher
hatten sich die Untersuchungen hauptsächlich auf
Personen mit Kontakt zu Vögeln konzentriert. In der
vorliegenden Untersuchung war jedoch der Ansatz
verfolgt worden, dass WNV unbemerkt aus dem
Süden Europas über die Hauptverkehrsadern
(Autobahnen, Flussschiffahrt) oder über den Vogelzug
eingeschleppt wurde und bisher unbemerkt zirkulieren
Region
N
WNV-IgG
WNV-IgM
FSMEV
DENV
YFV
Bad Tölz
220
1 (1:40)
<1:10
<1:10
<1:10
<1:10
Landshut
225
0
Regensburg
210
0
Deggendorf
210
0
Oberrhein
240
1 (1:20)
<1:10
<1:10
<1:10
<1:10
Saarland
240
1 (1:20)
<1:10
<1:10
<1:10
<1:10
Gesamt
1.245
3
0
0
0
0
Tabelle 1: Seroprävalenz gegen West Nil-IgG in 6 Standorten in Süddeutschland mit einem potentiellen West NilVirus-Einschleppungsrisiko (WNV: West Nil-Virus; FSMEV: FSME-Virus; DENV: Dengue-Virus; YFV: Gelbfieber-Virus).
72
Untersuchungen zum Vorkommen von Flaviviren
und Rickettsien in Nagetieren in Afghanistan
panRickettsien Echtzeit-PCR geprüft. Zudem wurden
Transsudate (Bauchhöhlenspülflüssigkeit) von 439
Tieren mittels kommerzieller Immunfluoreszenzteste
(IFT) für Rickettsia typhi als Vertreter für die
Typhusgruppe der Rickettsien und R. conorii für die
Fleckfieber (spotted fever)-Gruppe der Rickettsien
getestet. Zur Untersuchung auf Flavivirus-Antikörper
wurde ein kommerzieller IFT-Biochip eingesetzt, der
Antikörper gegen Gelbfiebervirus (YFV), FrühsommerMeningoenzephalitis-Virus (TBEV), West-Nil Virus
(WNV) und Japanische Enzephalitis Virus (JEV)
detektiert.
Bislang gibt es in Einsatzgebieten der Bundeswehr kaum Daten zu von Kleinsäugern übertragbaren Krankheitserregern. In einer Pilotstudie
wurden Kleinsäuger auf Rickettsien und Flaviviren
untersucht. In 1% wurde Rickettsien-DNA, in 10%
Antikörper gegen Rickettsien und in 2%
Antikörper gegen Flaviviren nachgewiesen. Die
Ergebnisse bestätigen frühere Ergebnisse aus
Untersuchungen humaner Seren.
Wildlebende Kleinsäuger sind Überträger von
verschiedenen viralen, bakteriellen und parasitären,
auf den Menschen übertragbaren, Krankheitserregern. Im militärischen Bereich haben Infektionserkrankungen im Verlauf von Einsätzen große
Bedeutung. Für Einsatzgebiete in Afghanistan gibt es
wenige Daten über die Bedeutung von Kleinsäugern
und der Durchseuchung der dort heimischen
Populationen mit zoonotischen Erregern. Im Rahmen
eines Sonderforschungsprojektes, das vom FriedrichLoeffler-Institut geleitet wurde (SOFO 22Z1-S851112) wurden Nagetiere und Insektenfresser aus
verschiedenen Lagern der Bundeswehr gesammelt. In
der Abteilung Virologie und Rickettsiologie wurden
Proben auf Flaviviren (Antikörper) und Rickettsien
(Antikörper, DNA) untersucht. Ziel der Studie war es,
das Vorkommen dieser beiden für den Medizinischen
B-Schutz relevanten Erregergruppen bei im Lager
gefangenen Tieren in Einsatzgebieten in Afghanistan
zu untersuchen.
In
dem
molekularbiologischen
Test,
der
panRickettsien Echtzeit-PCR, waren von den 441
Ohren-DNAs vier (1%) positiv: ein grauer
Zwerghamster (Cricetulus migratorius) aus Mazar-eSharif und drei Hausmäuse (Mus musculus), wobei
zwei aus Mazar-e-Sharif und eine aus Kunduz
stammten. Die serologischen Untersuchungen
ergaben insgesamt bei 52 Proben eine serologische
Reaktivität mit Rickettsien oder Flaviviren (Abbildung
3). Zwei Mus musculus aus Mazar-e-Sharif waren
zugleich R. conorii und Flavivirus-Antikörper-reaktiv.
Eine Rickettsien-Antikörper-Reaktivität zeigten 10%
(n=46/429) der Proben, wobei zwei aus Fayazabad,
vier aus Kunduz und 40 aus Mazar-e-Sharif waren.
Zwei Proben stammten von Cricetulus migratorius, die
restlichen 44 von Hausmäusen. Eine Austitration
ergab für zehn Transsudate (2,3%) eine Reaktivität
mit einem Vertreter der Typhusgruppe, für 33 mit der
Fleckfiebergruppe und für drei eine Kreuzreaktivität
mit beiden Gruppen (Abbildung 4A). Mit Flaviviren
reagierten zehn Transsudate (Abbildung 4B). Die
Austitration zeigte eine Reaktion von fünf TBEV. Zwei
Proben reagierten mit YFV und zwei weitere Proben
mit JEV. Eine Probe zeigte gleichzeitig gegen WNV
und YFV eine Reaktion mit gleich hohen AntikörperTitern.
Im Jahr 2012 wurden Proben von 442 Kleinsäugern
(Hausmäuse, Hamster, Spitzmäuse, Ratten) aus
Mazar-e-Sharif, Kunduz und Fayzabad in Afghanistan
(Abbildung 1, 2) für die Untersuchungen zur
Verfügung gestellt. Ohrenproben von 441 Tieren
wurden in Zellkultur-Medium homogenisiert und
daraus DNS mittels kommerzieller Kits isoliert. Das
Vorkommen rickettsialer DNA wurde mit einer
Abbildung 1: Topographische
Beprobungsorten
Karte
von
Afghanistan
mit
Abbildung 2: Immunfloreszenz eines Rickettsia conorii-positiven
Hausmaus-Transsudates aus Afghanistan (grün; rot: Kernfärbung
mit Evans Blue)
73
Zusammenfassend wurde in diesen Untersuchungen
erstmals durch serologische Nachweise gezeigt, dass
vor allem kommensale Kleinsäuger (Hausmaus), die
in drei militärischen Lagern in Afghanistan gesammelt
wurden, Infektionen mit für den Medizinischen BSchutz relevanten Rickettsien und verschiedenen
Flaviviren durchlaufen haben. Diese retrospektiven
Daten wurden bei den Rickettsien durch den
Nachweis rickettsialer DNS ergänzt, wobei die
Rickettsienart in den Proben nicht weiter bestimmt
werden konnte. Für Soldaten in Lagern kann daher
ein Kontakt mit Nagetieren ein Infektionsrisiko für die
beiden untersuchten Erregergruppen bedeuten. Die
Ergebnisse aus den Kleinsäugern bestätigen teilweise
Untersuchungen, die am InstMikroBioBw an einem
Serumpanel aus der einheimischen Bevölkerung
durchgeführt wurden, in der eine hohe Rickettsienund Flavivirus-Durchseuchung festgestellt wurde.
Abbildung 3: Immunfluoreszenz eines TBEV-positiven HausmausTranssudates aus Afghanistan
A) Ergebnisse der Rickettsien-reaktiven Transsudate
Rickettsien-Antikörper Reaktivität
Fangort
Spezies
Mazar-e-Sharif
Mus musculus
8
28
3
39
Mazar-e-Sharif
Cricetulus migratorius
0
1
0
1
Fayzabad
Mus musculus
0
1
0
1
Fayzabad
Cricetulus migratorius
1
0
0
1
Kunduz
Mus musculus
1
3
0
4
10
33
3
46
R. typhi
SUMME
R. conorii R. conorii / typhi
Summe
B) Ergebnisse der Flavivirus-reaktiven Transsudate
Fangort
Spezies
Mazar-e-Sharif
Mus musculus
Kunduz
Mus musculus
SUMME
Transsudate mit Flavivirus Antikörper-Reaktivität
TBEV
WNV/YFV
YEV
JEV
Summe
4
1
2
2
9
1
0
0
0
1
5
1
2
2
10
Abbildung 4: Zusammenfassung der in den serologischen Untersuchungen reaktiven Kleinsäugertranssudate aus Afghanistan
74
STAN-PROJEKT IMB-53-2012 | Virologie und Rickettsiologie
Epidemiologie, Surveillance, Risikoanalyse
viraler und rickettsialer Erkrankungen
♦ STAN-Unterprojekt 34-2012-02
Screening von Ohrenproben von Nagetieren aus Südafrika auf Rickettsien
Fragestellung
Ziele
In den letzten Jahren treten zunehmend neue
Krankheitserreger aus der Gruppe der Viren und
Rickettsien auf, die aufgrund ihrer Infektiosität und
Pathogenität auch als potenzielle B-Kampfstoffe in
Frage kommen. Ähnliche Übertragungswege und
Ausbreitungstendenzen beinhalten auch ähnliche
Infektionsrisiken.
Aufgrund
ihres
natürlichen
Vorkommens außerhalb von Deutschland, aber in
potentiellen Einsatzgebieten der Bundeswehr, sind
insbesondere Arbeiten zur Epidemiologie mit solchen
Erregern in Deutschland schwierig durchzuführen.
Zum besseren Verständnis der Epidemiologie, zur
Entwicklung von Überwachungssystemen und zur
Risikoanalyse eignen sich daher Erreger-Modelle, die
ähnliche
epidemiologische
Auftretensmuster
aufweisen.
Ziel dieses Projekts ist die Entwicklung und
Etablierung von viralen und rickettsialen InfektionsModellen mit Erregern, die durch Vektoren und
Vertebratenwirte/-reservoire übertragen werden. Dazu
werden für Zecken-übertragene Viren das FSMEVirus, für Nagetier-übertragene Viren das PuumalaVirus (Hantavirus) und für Rickettsien entsprechende
Arten aus der Zeckenbissfieber-Gruppe als Modell
verwendet. Hierzu sollen die Erreger-Wirt (Vektor)Wechselbeziehungen
aufgeklärt
werden,
um
ungewöhnliche Krankheitsausbrüche als solche zu
erkennen sowie enzootisch/endemischer Lagen in
Deutschland
und
den
Einsatzregionen
der
Bundeswehr aufklären zu können. Diese Ergebnisse
tragen zur Erstellung von Risikoanalysen zum Schutz
der Soldaten bei. Durch epidemiologische Analysen
können in Verbindung mit der Identifizierung und
Differenzierung
der
verursachenden
Erreger
natürliche und nicht-natürliche Ausbruchsgeschehen
durch Viren und Rickettsien in den Einsatzgebieten
der Bundeswehr unterschieden werden.
75
75
STAN-UNTERPROJEKT 34-2001-15 | B-Spezialdiagnostik und Hochsicherheitslabor
STAN-UNTERPROJEKT 53-2012-02 | Virologie und Rickettsiologie
Screening von Ohrenproben von Nagetieren
aus Sü dafrika auf Rickettsien
Ergebnisse
Alle 1616 Ohrenproben wurden homogenisiert und
DNS isoliert. Bislang wurden 1050 Proben in der
panRickettsien-PCR bereits untersucht. 186 Proben
(17,7%) waren positiv in der PanRickettsien-PCR,
wobei die Prävalenz von 14% (Spitzmäuse) bis zu
56% (Gattung Rhabdomys, afrikanische StriemenGrasmäuse) variiert. Die bislang erhaltenen
Rickettsien-Prävalenzen der Rickettsien-positiven
Tiere sind in den Fangorten bzw. Provinzen
unterschiedlich, sie beträgt zwischen 2% und 56%.
Von den 186 panRickettsien PCR-positiven Proben
wurden 30 Proben in der ompB PCR untersucht,
wovon wiederum 19 Proben ein Amplifikat ergaben.
Erste
Sequenzauswertungen
zeigten,
dass
verschiedene Rickettsienarten gefunden wurden,
darunter auch neue Rickettsienspezies.
Bearbeiter
RDir PD Dr. Eßbauer
Laufzeit
06/2012 bis 12/2012
Sachstand
Rickettsien gelten als hochinfektiöse Erreger mit
teilweise hoher Pathogenität. Bislang gibt es wenige
Daten
zu
den
in
Afrika
vorkommenden
Rickettsienarten. Insbesondere ist die medizinische
Bedeutung von Rickettsien in Afrika weitgehend
unklar, sie werden jedoch als zweithäufigste Ursache
(nach Malaria) für fieberhafte Infektionen diskutiert.
Der Zugang zu Patientenmaterial ist aufgrund
mangelhafter Eignung oder Qualität der Proben
(Lagerung, falsches Material) schwierig oder gar
unmöglich. Die Untersuchung von übertragenden
Vektoren (Zecken, Läuse, Flöhe) oder möglichen
Reservoirwirte (z.B. Nagetiere, Insektenfresser) von
Rickettsien ist derzeit die einzige Möglichkeit,
umfassendere
Informationen
zu
in
Afrika
vorkommenden Rickettsien zu gewinnen.
Bewertung
Die bisher erzielten Ergebnisse dieser Studie
erweitern die Kenntnis der geographischen
Verbreitung verschiedener Rickettsienarten und die
hohe Durchseuchungsrate in verschiedenen, in
dieser Studie erstmals untersuchten Kleinsäugerarten. Sie weisen auch darauf hin, dass Rickettsien in
mehreren Regionen Südafrikas verbreitet in
bestimmten Spezies mit hoher Prävalenz vorhanden
sind. Weitere Auswertungen werden zeigen, welche
humanpathogenen Rickettsienspezies vorkommen
können und welche eventuell in der Diagnostik von
Rickettsiosen in Südafrika berücksichtigt werden
sollten.
Zielsetzung
Aus
Südafrika
stammende
Proben
von
verschiedenen Nagetier- und Insektenfresser-Arten
werden auf die vorkommende Rickettsienarten
untersucht. Ziel ist es, die Prävalenz der Rickettsien/arten in den Kleinsäugerarten zu bestimmen, um
über das Vorkommen in den Tieren Aussagen über
die Rickettsien-Epidemiologie im südlichen Afrika zu
ermöglichen. Weiterhin sollen Erkenntnisse über die
Rolle von Nagetieren und Insektenfressern im
natürlichen Zyklus verschiedener Rickettsienarten
sowie die Eignung von Ohrengewebe für den
Nachweis von Rickettsien in ausgewählten Gebieten
Südafrikas gewonnen werden.
Ausblick
Die restlichen 566 isolierten DNAs werden in der
panRickettsien-PCR untersucht. Von allen positiven
Proben wird ein Multi Locus Sequence Typing
erfolgen. Basierend auf allen Daten wird eine
Auswertung der vorkommenden Rickettsienspezies
und Prävalenzen in den Tierarten und untersuchten
Regionen Südafrikas erfolgen. Anzuchtversuche von
positiven Proben sind geplant.
Methoden
Es stehen aus dem Jahr 2012 insgesamt 1616
Ohrproben von Kleinsäugern von 9 Gattungen aus 18
Standorten für die Untersuchungen zur Verfügung.
Ohrproben wurden mit Schlagmatrix homogenisiert
und die enthaltenen DNS mit kommerziellen
Extraktionskits isoliert. Die DNA wurde mit einer
panRickettsien Echt-Zeit-PCR gescreent. Von dabei
positiven Proben erfolgt die Rickettsien-Typisierung
vorerst mit einer konventionellen partiellen ompB
Gen-spezifischen
PCR
und
anschließender
Sequenzierung.
76
STAN-PROJEKT IMB-54-2012 | Virologie und Rickettsiologie
Pathogenese viraler und rickettsialer
Erkrankungen
♦ STAN-Unterprojekt 54-2012-01
Optimierung von Methoden zur zellbiologischen Charakterisierung von FSMEV mittels Laser
Scanning Mikroskopie
♦ STAN-Unterprojekt 54-2012-02
Etablierung von PCR-Microarrays zur zellulären Charakterisierung von viralen Virulenzfaktoren
am Modell FSMEV
Fragestellung
Ziele
In den letzten Jahren treten zunehmend neue und
aufgrund ihrer Infektiosität und Pathogenität als
potenzielle B-Kampfstoffe in Frage kommende
Krankheitserreger aus der Gruppe der Viren und
Rickettsien auf. Diese gehören z.T. bekannten, z.T.
neuen, bisher unbekannten Familien und Gattungen
an. Schon geringste Veränderungen an neuen
Erregern können deren Pathogenese entscheidend
beeinflussen. Zur Unterscheidung hochpathogener
von gering pathogenen oder apathogenen Varianten
einer
Art
müssen
Testmethoden
für
Pathogenitätsmarker etabliert sein. Weiter stellt die
Kenntnis der Pathogenese einer Infektion die
Grundlage für die Entwicklung von Diagnostika,
Therapeutika und ggf. von Impfstoffen dar.
Entwicklung und Etablierung von Verfahren und
Technik-Plattformen
zur
Bestimmung
der
Pathogenität von Viren und Rickettsien mit
potenzieller Med B-Bedeutung. Identifizierung von für
die Pathogenese wichtigen Erreger-Eigenschaften
(Wachstum,
zelluläre
und
subzelluläre
Veränderungen, Identifikation verantwortlicher Genomund
Proteom-Eigenschaften).
Etablierung
von
Verfahren
zur
eindeutigen
Bestimmung
der
Pathogenität von Viren und Rickettsien im
Zusammenhang mit ungewöhnlichen Ausbruchsgeschehen oder einer absichtlichen Ausbringung.
77
77
STAN-UNTERPROJEKT 34-2001-15 | B-Spezialdiagnostik und Hochsicherheitslabor
STAN-UNTERPROJEKT 54-2012-01 | Virologie und Rickettsiologie
Optimierung von Methoden zur zellbiologischen Charakterisierung von FSMEV mittels Laser Scanning Mikroskopie
Ergebnisse
Die optimierte Darstellungsmethodik zeigte den
Verlauf von Veränderungen subzellulärer Strukturen
einer in vitro-Infektion von humanen Neuroblastomund Glioblastom-Zelllinien mit FSMEV unterschiedlicher Subtypen und pathogenen Eigenschaften. Die
bisherigen Ergebnisse zeigen, dass die eigentliche
Virusreplikation in den Zellen bis etwa 72 h nach der
Infektion nicht zu einer Veränderung der
untersuchten Zellstrukturen führt. Damit müssen die
entsprechenden Veränderungen nach 96h nach
Infektion durch Replikations-unabhängige Prozesse
verursacht sein.
Bearbeiter
OSA Dr. Vollmar
Laufzeit
01/2012 bis 12/2012
Sachstand
FSMEV wird in der CDC-Liste als Agens der
Kategorie B und ist auch in der SIBCRA-Liste
verzeichnet. Vieles ist über die neuro-pathogenetischen Vorgänge der FSMEV-Infektion noch unklar
und Gegenstand aktueller Forschungen. Die
Konfokale Laser Scanning Mikroskopie (LSM) bietet
die Möglichkeit, subzelluläre Strukturen, so auch
Virus-Zell-Interaktionen, in hoher Auflösung zweiund dreidimensional darzustellen.
Bewertung
Die LSM ist heute ein Standardverfahren zur
Untersuchung von zellulären Strukturen und
strukturellen Veränderungen. Am Modell von FSMEV
-infizierten Zellen unterschiedlichen Zelltyps wurde
die LSM am Institut etabliert. Damit können nun
strukturelle Fragestellungen im Rahmen von
Infektionen durch Viren oder Rickettsien auch für
andere Med B-relevante Bioagenzien durchgeführt
und deren Pathogenese besser verstanden werden.
Zielsetzung
Das Ziel des Projekts war die Optimierung des LSMgestützten Verfahrens zur Darstellung FSMEVSubtyp-spezifischer intrazellulärer Veränderungen in
infizierten humanen neuronalen Zellen. Damit soll
eine
zellbiologisch
Charakterisierung
unterschiedlicher Subtypen des FSMEV ermöglicht
werden.
Ausblick
Die gewonnenen Erfahrungen werden auf andere
Infektionsmodelle (u.a. andere Enzephalitisviren, z.B.
Phleboviren,
Orthobunyaviren)
angewandt.
Gleichzeitig
können
nun
die
gewonnenen
strukturellen Untersuchungsergebnisse in einem
weiteren Projekt mit molekularbiologischen Methoden
zum Nachweis von virusvermittelter Apoptose,
Autophagie oder Nekrose in den verwendeten
Zellsystemen modellhaft an FSMEV-Infektionen
durchgeführt werden.
Methoden
Drei Zelllinien (humane Glio- und Neuroblastomzellen
sowie VeroB4-Zellen) wurden kultiviert und für
Infektionsversuche in vorbereitete Objektträger
überführt. Die Optimierung der Kulturbedingungen
der neuronalen Zelllinien auf den Objektträgern
erforderte
mehrmalige
Modifikationen
der
üblicherweise für die Zelllinien verwendeten
Kultursysteme.
Die
Darstellung
subzellulärer
Strukturen erfolgte durch spezifische, fluorophorgekoppelte Antikörper und deren anschließende
Visualisierung und Auswertung im LSM. Zur
Optimierung der Technologie wurden drei TubulinAntikörper und vier FSMEV-Antikörper zusammen
mit einem Aktin- und einem Zellkernfarbstoff in
unterschiedlichen Kombinationen und Konzentrationen ausgetestet, um eine hochspezifische und
interferenzfreie
LSM-gestützte
Bildgebung
zu
erhalten. Dieses optimierte Verfahren bildet die
Grundlage für weitere Untersuchungen der zellulären
Veränderungen in Abhängigkeit vom Infektionszeitpunkt durch FSMEV.
78
STAN-UNTERPROJEKT 34-2001-15 | B-Spezialdiagnostik und Hochsicherheitslabor
STAN-UNTERPROJEKT 54-2012-02 | Virologie und Rickettsiologie
Etablierung von PCR-Microarrays zur zellulä ren Charakterisierung von viralen Virulenzfaktoren am Modell FSMEV
Kontrollen (ppia, defensin) für cDNA aus humanen
und Affennierenzellen konnten etabliert werden.
Erste Versuche deuten auf eine Anwendbarkeit der
humanen Microarrays auf VeroB4-Zellen hin. Die
Arbeiten erfolgten im Rahmen einer am Institut
betreuten Masterarbeit in Zusammenarbeit mit der
Technischen Universität München.
Bearbeiter
RDir PD Dr. Eßbauer
Laufzeit
01/2013 bis 12/2015
Sachstand
FSMEV-Stämme zeigen deutliche Unterschiede im
klinischen Verlauf aber es gibt nur wenige Daten zur
Virulenz solcher Stämme. Über die Mechanismen der
Pathogenese verschiedener Stämme nach Infektion
humaner, neuronaler Zelllinien ist wenig bekannt.
Bewertung
Die erzielten Ergebnisse sind eine Basis, um ZelltodMicroarrays für die Überprüfung verschiedener
Enzephalitisviren (Flavi-, Alphaviren) einzusetzen.
Damit lassen sich Virulenzeigenschaften von
Stämmen in einem in vitro Modell untersuchen.
Zielsetzung
Ziel ist es, neuronale Zelllinien als Modell für
Untersuchungen zur Pathogenese von virulenten
FSMEV-Stämmen zu nutzen. Dabei soll die in vitro
Darstellung FSMEV-Subtyp-spezifischer Veränderungen von zellulären mRNAs – im Bereich Apoptose,
Nekrose, Autophagie – erfolgen. Weiterhin soll ein
Vergleich der Expression regulatorischer mRNAs von
verschiedenen FSMEV-Stämmen Aufschluss über
ein unterschiedliches Virulenzverhalten ergeben. Die
in vitro Daten sind mit in vivo Daten zu korrelieren,
um Marker für die Pathogenese zu ermitteln.
Ausblick
Technische
und
biologische
Replikate
von
Standardpräparationen
hochwertiger
zellulärer
mRNA aus Apoptose-Induktion, Nekrose-Induktion
und Zellen infiziert mit verschiedenen FSMEVStämmen müssen hergestellt werden. Protokolle zur
Induktion von Autophagie sind zu etablieren. Alle
Ansätze müssen in Mircoarrays getestet werden und
regulierte Gene überprüft werden.
Methoden
DAPI- und TUNEL-Färbung wurden zum Nachweis
von Apoptose etabliert. Der Nachweis von NekroseViabilitäts-ELISA wurde etabliert. Als Induktoren von
Apoptose wurde Staurosporin und für die Nekrose
Ionomycin in verschiedenen Zeit- und Konzentrationsreihen in drei Zelllinien getestet. Exemplarisch
wurden mRNAs und cDNA gewonnen. Der QiaXCEL
wurde für die Analyse von mRNA und cDNA
eingeführt. Primer für Referenzgene passend für
Affennieren und humane Zelllinien wurden in semiquantitativen PCRs getestet. Microarrays zur
Genexpressionsanalyse
des
Zelltods
wurden
exemplarisch mit Präparationen von mRNA
ausgetestet.
Ergebnisse
Es liegen Standardprotokolle zur Induktion von
Apoptose mittels Staurosporin für VeroB4- und SIMAZellen vor. Die Induktion von Nekrose mittels
Ionomycin erfolgt in VeroB4-, SIMA- und DBTRGZellen. Standardprotokolle für die Präparation von
hochwertiger mRNA und cDNA wurden etabliert.
Semi-quantitative PCRs für zwei externe qPCR
79
STAN-PROJEKT IMB-55-2012 | Virologie und Rickettsiologie
Weiterentwicklung Diagnostik viraler und
rickettsialer Erkrankungen
♦ STAN-Unterprojekt 55-2012-02
Entwicklung und Etablierung spezies-spezifischer PCRs zur Identifikation von R. slovaca, R.
helvetica und R. felis
Fragestellung
Ziele
In den letzten Jahren treten zunehmend neue und
aufgrund ihrer Infektiosität und Pathogenität z. T. auch
als
potenzielle
B-Kampfstoffe
geeignete
Krankheitserreger („emerging pathogens“) auf. Diese
gehören bekannten aber auch neuen und bisher
unbekannten Virus-Familien und Virus-Gattungen an.
Daneben
können
bestimmte
Viren
durch
Rekombination bekannter Genotypen neue Subtypen
bilden mit völlig veränderten Eigenschaften bzgl.
Infektiosität und Pathogenese. Auf dem Gebiet der
Rickettsiologie werden jährlich neue Rickettsien
entdeckt, deren Pathogenität unbekannt ist oder seit
langem bekannte, aber bisher als apathogen geltende
Rickettsien werden plötzlich als humanpathogen
charakterisiert. Neue Entwicklungen, wie z.B. neue
Plattformen bieten verbesserte Möglichkeiten der
Diagnostik viraler und rickettsialer potentieller BAgenzien. Viele dieser neuen Plattformen wurden für
konventionelle Erreger etabliert. Deren Nutzen für die
speziellen Fragestellungen des InstMikroBioBw ist
häufig weitgehend unklar und wird meist von den
Herstellerfirmen auch nicht getestet.
Ziel des STAN-Projekts ist die Weiterentwicklung der
Diagnostik und die Etablierung von geeigneten neuen
Screening- und Bestätigungsverfahren von bekannten
und neuen („emerging“) viralen und rickettsialen
Erkrankungen. Damit sollen die Sensitivität, Spezifität
und die Schnelligkeit der in der Diagnostik
verwendeten Testverfahren verbessert werden. Dazu
werden ständig Marktsichtungen durchgeführt und
neue Testverfahren mit etablierten Testen verglichen.
Daneben spielen auch Kriterien wie Durchführbarkeit
und Eignung für den Zentralbereich Diagnostik eine
ausschlaggebende Rolle. Geeignete neue Verfahren
und Testsysteme werden daher nach den
Anforderungen des Qualitäts-Managements validiert
bzw. verifiziert.
80
80
STAN-UNTERPROJEKT 34-2001-15 | B-Spezialdiagnostik und Hochsicherheitslabor
STAN-UNTERPROJEKT 55-2012-02 | Virologie und Rickettsiologie
Entwicklung und Etablierung spezies-spezi;ischer PCRs
zur Identi;ikation von R.slovaca, R.helvetica und R.felis
und Störempfindlichkeit des Echtzeit-Verfahrens.
Bearbeiter
OSA Dr. Wölfel
Ergebnisse
Vorarbeiten, wie die Datenbankrecherche und
Auswahl geeigneter Primer und Sonden sowie die
Herstellung von quantifizierten Standards wurde für
die drei geplanten PCRs durchgeführt. Die mit einer
analytischen Nachweisgrenze von 3,82 Kopien pro
Reaktion hochsensitive R. helvetica PCR wurde 2013
komplett etabliert und validiert. Die ausgewählten
Primer erfassen alle Rickettsien Arten, während
umfangreiche Testungen mit anderen Erreger zeigen
konnten,
dass
die
Sonde
hochspezifisch
ausschließlich R. helvetica erfasst. Zusätzliche
Modifikationen des PCR-Protokolls ermöglichten
zudem die Untersuchung von tierischen Proben im
Rahmen
epidemiologischer
Fragestellungen.
Analoge Validationsarbeiten für die beiden anderen
geplanten Rickettsien Arten stehen aufgrund
unvorhergesehener anderer, höher priorisierter
Arbeiten noch aus.
Laufzeit
04/2013 bis 12/2015
Sachstand
Über Vorkommen und Verbreitung von Rickettsien
gibt es in Deutschland bisher nur wenige Daten.
Aufgrund dessen ist auch nur sehr wenig über das
mögliche Gefährdungspotential durch einheimische
Rickettsiosen bei Tätigkeiten mit Risiko gegen
Exposition mit Zecken oder Flöhen bekannt. Die
Identifizierung der in aus verschiedenen Regionen
Deutschlands gesammelten oder gefangenen
Vektoren
und
Reservoirwirten
detektierten
Rickettsien dient der epidemiologischen Risikoanalyse und ist derzeit am IMB nur durch
aufwendiges Multi Locus Sequence Typing (MLST)
möglich. Die hierzu verwendeten konventionellen
PCR-Systeme sind in ihrer Sensitivität der im Institut
etablierten,
sensitiven
Pan-Rickettsien-PCR
unterlegen, so dass die Zuordnung der positiven
Testergebnisse zu einer Rickettsienspezies nicht
immer möglich ist. Im Gegensatz zur MLST stellt die
Echtzeit-PCR eine deutlich weniger aufwendige und
auch kostengünstigere Alternative dar. Auch für
mögliche diagnostische Fragestellungen ist die
Möglichkeit der eindeutigen molekularbiologischen
Identifizierung des Erregers mit einem möglichst
sensitiven Echtzeitverfahren notwendig. Speziesspezifische Rickettsien-PCRs stehen im IMB derzeit
nicht zur Verfügung.
Bewertung
Die bisher durchgeführten Arbeiten resultieren in der
Einführung einer hochsensitiven und -spezifischen
Methode zum Nachweis von R. helvetica aus
humanen und tierischen Probenmaterialien. Damit
steht für klinische Verdachtsfälle einer durch
R. helvetica bedingten Infektion sowie für
epidemiologische Untersuchungen zur Ermittlung von
Vorkommen und Häufigkeit dieser Spezies in den
heimischen
Zeckenarten
eine
verlässliche
Nachweismethode zur Verfügung.
Ausblick
Inwieweit
R.
helvetica
klinisch
relevante
Rickettsiosen auslöst, ist noch weitgehend ungeklärt.
Die Anwendung der Methode an klinischen, humanen
Proben kann hier
zur Verbesserung des
Kenntnisstandes angewandt werden.
Zielsetzung
Etablierung und Validierung spezies-spezifischerRealtime-PCRs zum Nachweis von Rickettsia
slovaca, Rickettsia helvetica und Rickettsia felis nach
Vorgaben
des
Qualitätsmanagements,
ggf.
Einführung in den Zentralbereich Diagnostik
Methoden
Für die Auswahl geeigneter Primer und Sonden
werden
Recherchen
in
Sequenzdatenbanken
durchgeführt,
die
Herstellung
quantifizierter
Standards
erfolgt
durch
einen
externen
Vertragsnehmer (Fa. AmpTec). Für die PCROptimierung werden die folgenden Parameter
geprüft: Primer-, Sonden- und Magnesium-Titration,
sowie ein Temperatur-Gradient. Danach erfolgt die
Feststellung von Sensitivität, Spezifität, Genauigkeit
81
STAN-PROJEKT IMB-56-2012 | Virologie und Rickettsiologie
Molekulare Typisierung viraler und
rickettsialer Krankheitserreger
♦ STAN-Unterprojekt 56-2012-03
Vollgenomsequenzierung von Puumalaviren
Fragestellung
Ziele
Ein Kernauftrag des Instituts ist die zweifelsfreie
Unterscheidung von absichtlich herbeigeführten und
natürlich auftretenden Ausbruchsgeschehen. Diese
Unterscheidung beruht neben phänotypologischen und
epidemiologischen Gegebenheiten u.a. auf der
molekularbiologischen Typisierung von Genfragmenten oder gesamten Genomen von Viren und
Rickettsien, die als potentielle B-Agenzien in Frage
kommen. Der Vergleich entsprechender Geninformation setzt eine möglichst große Menge von
genetischen Daten aus unterschiedlichen Regionen
der Erde voraus. Für eine Reihe von Viren und
Rickettsien existieren bisher keine standardisierten
Typisierungsverfahren.
Geeignete
Gene
oder
Genomanteile für die zweifelsfreie Biotypisierung sind
nicht in jedem Fall verfügbar. Daher müssen
Sequenzier-Verfahren für den jeweiligen Typisierungszweck ausgewählt und optimiert und für die relevanten
B-Agenzien adaptiert werden. Alle Daten müssen in
Datenbanken gesammelt und gespeichert werden,
damit sie für vergleichende Untersuchungen zur
Verfügung stehen.
Genomfragmente oder Genomregionen, die für eine
eindeutige Unterscheidung und Typisierung geeignet
sind, sollen identifiziert werden. Die verfügbaren
Typisierungsverfahren für Med B-relevante Viren und
Rickettsien sollen standardisiert
werden.
Mit
etablierten Verfahren werden die Virus- und
Rickettsienstämmen aus unterschiedlichen Regionen
der Erde, insbesondere aus den Einsatzgebieten der
Bundeswehr und benachbarten Regionen, typisiert
und mit diesen Daten die Typisierungsverfahren weiter
optimiert. Des weiteren werden Datenbanken mit allen
selbstgenerierten und über öffentliche Datenbanken
verfügbaren Gensequenzen etabliert und für die
entsprechenden
Analysezwecke
optimiert.
Zur
schnellen und zweifelsfreien Analyse neu generierter
Sequenzen mit in Datenbanken befindlichen Virusund Rickettsien-Sequenzen ist eine geeignete
Software zu implementieren.
82
82
STAN-UNTERPROJEKT 34-2001-15 | B-Spezialdiagnostik und Hochsicherheitslabor
STAN-UNTERPROJEKT 56-2012-03 | Virologie und Rickettsiologie
Vollgenomsequenzierung von Puumalaviren
Ausblick
RT-PCRs zur Amplifikation von Puumalaviren werden
weiter entwickelt. Sequenzen von PuumalavirusStämmen von weiteren Standorten werden generiert
werden, um die räumliche und zeitliche Dynamik der
Veränderung
von
Puumalavirus-Stämmen
zu
untersuchen. Virussequenzen werden mit Sequenzen
von Reservoirwirten phylogenetisch verglichen und
untersucht werden. Diese Untersuchungen sollen zur
Aufklärung der Verbreitung von endemischen
Puumalavirus-Herden beitragen.
Bearbeiter
RDir PD Dr. Eßbauer
Laufzeit
03/2013 bis 12/2014
Sachstand
Puumalavirus
(PUUV)
ist
in
Europa
das
bedeutendste Hantavirus. Bislang gibt es nur wenige
Gesamtgenom-Sequenzen
von
Hantaviren
überhaupt, allerdings gibt es keine PUUVGesamtgenomsequenzen von deutschen Stämmen.
Damit können phylogenetische Zusammenhänge der
Hantaviren nur unzureichend aufgeklärt werden.
Zielsetzung
Ziel
ist
die
Sequenzierung
des
Genoms
verschiedener Puumalaviren, um Hinweise auf ein
mögliches Reassortment dieser segmentierten RNAViren zu erhalten.
Methoden
Die Nukleinsäure von 15 Puumalaviren von
verschiedenen Standorten aus Osnabrück und
Niederbayern wurden präpariert. Es wurde versucht,
Genomenden mit einer Ringschluss RT-PCR zu
generieren. Partielle S-, M- und L-Segmente wurden
mittels Sequenzierung überlappender, konventioneller RT-PCR Produkte generiert.
Ergebnisse
Zusammen mit dem Friedrich-Löffler-Institut wurden
vom Standort Osnabrück fünf Gesamtgenome durch
Primer-Walking und RACE sequenziert. Weitere RTPCRs für die Sequenzierung von L-Segmenten von
Hantaviren wurden etabliert. Es liegen partielle S-, Mund L-Segmente von weiteren 10 PuumalavirusStämmen vor. Weitere Arbeiten konnten aus
personellen Gründen nicht durchgeführt worden
Bewertung
Die
bisherigen
Ergebnisse
zeigen
keine
Reassortanten bei den stichprobenartig untersuchten
Puumalavirus-Stämmen
aus
Deutschland.
Genetische Varianten von Puumalaviren scheinen
somit in den lokalen Herden relativ stabil zu
bestehen.
83
STAN-UNTERPROJEKT 34-2001-15 | B-Spezialdiagnostik und Hochsicherheitslabor
DRITTMITTELPROJEKT | Virologie und Rickettsiologie
Au;bau eines deutsch-kasachischen Netzwerkes zur Diagnostik
von Infektionskrankheiten verursacht durch potentielle
B-Agenzien
Bearbeiter
RDir PD Dr. Eßbauer
Delegation besuchte die Medical Biodefense
Conference in München im Oktober 2013.
Laufzeit
08/2013 bis 07/2016
Bewertung
Alle Gespräche, die mit Institutionen der
kasachischen Seite geführt wurden, sind durchweg
positiv zu bewerten. Bei Institutionen, die nicht direkt
in das Projekt eingebunden sind, besteht großes
Interesse an verschiedenen Ausbildungseinheiten
teilzunehmen. In Gesprächen mit den Direktoren des
obersten epidemiologischen Zentrums und der
Kasachischen Nationalen Medizinischen Universität
konnte die Zusammenarbeit vertieft werden.
Sachstand
Die
geographische
und
klimatische
Lage
Kasachstans begünstigt eine Vielzahl bakterieller und
viraler Infektionserkrankungen, von denen einige
durch Erreger des „dirty dozen“ verursacht werden.
Labore der Kasachischen Nationalen Medizinischen
Universität und andere Public Health Einrichtungen
wurden für die Detektion von Infektionserkrankungen
mit modernster Laboreinrichtung und Geräten
ausgestattet. Trotz guter Ausstattung gibt es kaum
Labore, die die Diagnostik von hochpathogenen
Erregern nach zuverlässigen Standardanleitungen
anbieten.
In
vielen
Regionen
Kasachstans
ist
die
epidemiologische Situation unklar. Vereinzelt wurden
in internationalen Projekten Untersuchungen zu
hochpathogenen Erregern durchgeführt.
Ausblick
Eine ausführliche Projektskizze für den Ethikantrag
für die serologische Untersuchung von Patienten mit
Fieber unklarer Genese soll erstellt werden. Es wird
versucht
zwei
kasachische
Nachwuchswissenschaftler in ein internationales Doktorandenprogramm
der
Ludwig-Maximilians-Universität
München aufzunehmen. Erste Workshops zum
Thema Biosicherheit werden in Kasachstan
abgehalten.
Zielsetzung
Ziel des Projektes ist es Kontakte zu knüpfen, um
eine Vernetzung der Institute und Organisationen zu
erreichen, die auf dem Health Sektor in Kasachstan
tätig sind. Zudem soll eine Surveillance-Studie für die
serologische Untersuchung von Patienten mit Fieber
unklarer
Genese
durchgeführt
werden,
um
Informationen über das Vorkommen und die
Verbreitung von hochpathogenen und von daher für
den Med B-Schutz relevanten Erreger in Kasachstan
zu sammeln. Es werden Workshops und Trainings
zum Thema Biosicherheit und über das Erlernen von
klinisch-mikrobiologischen,
serologischen
und
molekularbiologisch Methoden abgehalten. Eine
Vektorsurveillance-Studie wird durchgeführt, um
Vektoren wie Zecken und Nagetieren mit Kompetenz
für bestimmte hochpathogene Erreger zu monitoren.
Methoden
Bislang
wurden
durchgeführt.
keine
Laboruntersuchungen
Ergebnisse
Es fanden zwei Besuche in Kasachstan zur
Vernetzung der Projektpartner und politischen
Entscheidungsträgern statt. Eine kasachische
84
STAN-UNTERPROJEKT 34-2001-15 | B-Spezialdiagnostik und Hochsicherheitslabor
DRITTMITTELPROJEKT FK 2513 AA 0506 | Virologie und Rickettsiologie
Au;bau eines deutsch-tansanischen Netzwerks zur Diagnostik
und Epidemiologie von Infektionskrankheiten verursacht
durch potentielle B-Agenzien
Ergebnisse
Das Projekt konnte im September 2013 mit der
Einstellung des für die Projektdurchführung
notwendigen Personals gestartet werden. Ein erster
Besuch in Mbeya wurde in engen Zusammenarbeit
und Abstimmung mit dem deutschen Partner des
Projekts, der Abteilung für Infektions- und Tropenmedizin der LMU München, geplant ebenso wie die
Festlegung der Zeitlinien im Projekt.
Bearbeiter
M.Sc. Starke, MTA Nurtsch, OFA PD Dr. Dobler
Laufzeit
09/2013 bis 08/2016
Sachstand
Die geographische und klimatische Lage Tansanias
begünstigt eine Vielzahl bakterieller und viraler
Infektionserkrankungen, von denen einige durch
Erreger des „dirty dozen“ verursacht werden. Für
viele dieser Erkrankungen ist in Tansania selbst kein
Bewusstsein unter der Ärzteschaft, da bisher alle
fieberhaften Infektionen als Malaria diagnostiziert und
therapiert werden. Erste serologische Untersuchungen im Süden Tansanias legen eine starke
Zirkulation verschiedener durch Vektoren übertragener Viren, wie z.B. West Nil-Virus, Dengue-Virus,
Chikungunya-Virus oder Rift Tal-Fieber-Virus nahe.
Landesweite epidemiologische Untersuchungen oder
diagnostische Möglichkeiten zum Nachweis der
genannten Erreger sind bisher nicht in Tansania
etabliert. Die medizinische Bedeutung dieser
Erkrankungen als Ursache fieberhafter Infektionen ist
unklar.
Bewertung
Mit der Einstellung einer Biotechnologin und einer
technischen Assistentin konnte das Projekt offiziell
gestartet werden. In den Gesprächen zeigte sich von
Beginn an eine hohe Motivation bei allen drei
beteiligten Projektpartnern. Aufgrund der bereits
bestehenden Verbindungen zwischen der LMU und
Mbeya konnte auf eingespielte Strukturen zurückgegriffen und mit vorbereitenden Maßnahmen
erfolgreich begonnen werden.
Ausblick
Im Januar 2014 ist ein erster Besuch in Mbeya
geplant. Dort soll die Situation vor Ort in Bezug auf
die Zahl der in Frage kommender Patienten für die
geplante
klinische
Studie
geprüft
werden.
Administrative Dokumente für den Abschluss eines
Mittelweiterleitungsvertrags mit der LMU München
werden erstellt. Die Einreichung eines Ethikantrags
für die klinische Studie soll vorbereitet werden.
Weiterhin wird ein zweiter Besuch mit der
Durchführung eines Symposiums zum Thema
Biosicherheit in der ersten Hälfte des Jahres 2014
geplant. Noch von einem früheren Aufenthalt in
Mbeya gesammelte Zecken sollen auf potentielle BAgenzien
untersucht
werden.
Eine
mobile
Detektionsmethode (RPA) wird in der Region Mbeya
für die zu untersuchenden B-Agenzien unter lokalen
Bedingungen etabliert.
Zielsetzung
Aufbau von Kapazitäten für eine klinisch-mikrobiologische und molekularbiologische Diagnostik von
potentiellen B-Agenzien. Implementierung akkreditierter Sicherheitsstandards für Biosafety und
Biosecurity; Surveillance des Auftretens von
Erkrankungen
durch
potenzielle
B-Agenzien;
Biotypisierung der bislang in Tansania nicht
untersuchten B-relevanten Erreger.
Methoden
Abschluss eines Kooperationsvertrags mit dem
Mbeya Medical Research Center unter Einbeziehung
der tansanischen und deutschen politischen
Vertretungen;
Ausbildung
von
tansanischen
Mitarbeitern in klinischer Mikrobiologie, Serologie,
Molekularbiologie und im Umgang mit hochpathogenen Erregern (Biosecurity und Biosafety);
Durchführung einer klinischen Studie bei Patienten
mit Fieber
unbekannter Ursache in bekannten
endemischen Regionen für B-relevante Erreger;
gleichzeitige Sammlung von Vektoren für relevante B
-Agenzien; Nachweis, Isolierung und Typisierung von
B-relevanten Erregern in der Region Mbeya.
85
STAN-UNTERPROJEKT 34-2001-15 | B-Spezialdiagnostik und Hochsicherheitslabor
DRITTMITTELPROJEKT 01KI 0712 | Virologie und Rickettsiologie
Zeckenü bertragene Arboviren in Deutschland: Diagnostik,
Pathogenese und U3 berwachung im Rahmen des Netzwerks
„Zoonosen-Forschung“ des BMBF
Bearbeiter
OFA PD Dr. Dobler
und stellen damit neue FSME-Herde dar. Von allen
14 positiven Zeckenpools konnten direkt das E-Gen
und das NS2a-Gen sequenziert werden. Bis Ende
des Jahres konnten aufgrund von Engpässen in den
L3-Kapazitäten nur drei FSME-Virusstämme angezüchtet werden. Insgesamt wurden 11 Gesamtgenome von Virusisolaten aus den Jahren 2009-2012 aus
einem einzigen Fokus bestimmt. Es wurden standardisierte Wachstumskurven der FSME-Virusstämme
Hypr, AS33 (hochpathogener Westlicher Subtyp),
M14/10 (Sibirischer Subtyp) sowie des Langat-Virus
in den 3 Zelllinien ermittelt und miteinander verglichen. In Zeitreihen von 0 bis 96 h wurden die Zelllinien mit Langat-Virus und FSME-Virus Stamm Hypr
infiziert. Im Konfokalen Laserscan-Mikroskop wurden
nur minimale Veränderungen im Zytoskelett der Zelle
bis 96 h nach der Infektion nachgewiesen.
Laufzeit
07/2007 bis 11/2012
Sachstand
Die Frühsommer-Meningoenzephalitis ist die wichtigste Arbovirus-Infektion in Mitteleuropa. In Deutschland existieren bisher keine Daten über die hier zirkulierenden Virusstämme und deren pathogenetische
Eigenschaften. Weiterhin ist unklar, inwieweit die
FSME-Virusstämme in Deutschland untereinander
und mit Virusstämmen aus benachbarten Ländern
genetisch verwandt sind. Diese Daten können zum
Verständnis der Ausbreitung des Virus in Mitteleuropa und damit zu Vorhersagen eines Neuauftretens und zu einer besseren Surveillance beitragen.
Bewertung
Die Entdeckung 3 neuer Herde führte zu einer
Ausweitung der verfügbaren phylogenetischen Daten
und vervollständigt das Bild über die Ausbreitung des
FSME-Virus in Ostbayern. Die vorliegenden Daten
zeigen auch, dass es innerhalb eines Herdes über
einen Zeitraum von 4 Jahren nicht zu Veränderungen im gesamten Genom der zirkulierenden Viren
kommt. Damit können die Gesamtgenome als Marker
für phylogenetische Untersuchungen und als Basis
für bioforensische Fragestellungen verwendet werden. Die pathogenetischen Untersuchungen zeigen,
dass die Replikation des FSME-Virus in humanen
Zellen neuronalen Ursprungs nicht die direkte
Ursache für den auftretenden zytopathischen Effekt
darstellt. Hier müssen andere Faktoren (z.B. Apoptose, Autophagie) wirksam sein, die erst nach der
maximalen Replikation des Virus effektiv werden.
Zielsetzung
Die Zielsetzung des Projektes war die Isolierung,
molekularbiologische und pathogenetische Charakterisierung von durch Zecken übertragenen Arboviren,
insb. des FSME-Virus. Zecken aus verschiedenen
Teilen Süddeutschlands sollten gesammelt, mittels
molekularbiologischer Verfahren auf FSME-Virus
untersucht, und nach Isolierung der Virusstämme mit
verschiedenen molekularbiologischen, zellbiologischen und phänotypischen Verfahren weiter charakterisiert werden. Ziel ist dabei die Etablierung eines in
vitro-Testverfahrens zur Abklärung der Virulenz von
FSME-Virusstämmen und Aufklärung der Pathogenesemechanismen in humanen neuronalen Zellen.
Methoden
Es wurden Zecken in Regionen mit humanen FSMEFällen gesammelt. Die Zecken wurden gepoolt und
mittels einer RT-Echtzeit-PCR untersucht. Positive
Zecken wurden aufbereitet und in Zellkultur inokuliert.
Wachstum wurde über Auftreten eines zytopathischen Effekts oder mittels quantitativer PCR beurteilt.
Die Sequenzierung des E-Gens und des NS2a-Gens
erfolgte mittels konventioneller PCR und Sequenzierung. Die Gesamtgenom-Sequenzierung erfolgte
über Pyro-Sequenzierung in Kooperation mit PD Dr.
M. Beer, FLI, Insel Riems. Einschritt-Vermehrungskurven verschiedener FSME-Virusstämme in Kulturen menschlicher neuronaler Zelllinien (DBTRG5MG, SIMA) und Vero-Zellen wurden erstellt. Infizierte Zellen wurden zu unterschiedlichen Zeitpunkten
mittels konfokaler Laserscanning-Mikroskopie auf
Veränderungen im Zytoskelett untersucht und diese
mit dem Auftreten eines zytopathischen Effekts und
der beobachteten Virusproduktion korreliert.
Ausblick
Die vorliegenden Daten für Ostbayern zeigen, dass
das FSME-Virus mehrmals aus Tschechien und der
Slowakischen Republik nach Ostbayern eingeschleppt worden ist. Die Mechanismen der
Einschleppung sind bisher unklar. Es gibt Hinweise,
dass die FSME-Viren sich entlang der großen Flüsse
in der Region, Donau, Naab und Inn ausbreiten. Dies
muss durch weitere Isolate entlang dieser Flüsse
noch bestätigt werden. Bisher fehlen Daten über die
Verbreitung des FSME-Virus in Österreich. Diese
sollen im folgenden Jahr durch ein vom DZIF
geförderten Projekt in Kooperation mit dem Institut für
Virologie der Universität Wien erhoben werden. Es
wurde die Frage aufgeworfen, durch welche
Mechanismen die FSME-Viren die Zellen schädigen.
Nach den vorliegenden Daten scheint es kein direkter
Viruseffekt zu sein. In einem Folgeprojekt sollen
Apoptose, Nekrose und Autophagie abgeklärt werden
und der Zelltod einem dieser Mechanismen
zugeordnet werden. Dies könnte die Grundlage für
ein Verstehen und eine mögliche Therapie von FSME
-und anderen Flavivirus-Infektionen darstellen.
Ergebnisse
Es wurden 5.420 Zecken in 875 Zeckenpools mittels
Echtzeit-RT-PCR untersucht. Davon konnten 14
positive Zeckenpools nachgewiesen werden. Drei der
getesteten positiven Herde waren bisher unbekannt
86
STAN-UNTERPROJEKT 34-2001-15 | B-Spezialdiagnostik und Hochsicherheitslabor
DRITTMITTELPROJEKT | Virologie und Rickettsiologie
Phylogenie des FSME-Virus in Zentral- und Osteuropa
Bewertung
Die drei neu entdeckten Herde konnten in
Verbindung mit alten Herden erstmals eine rezente
Verschleppung eines FSME-Virus von einem Herd in
einen anderen Herd aufzeigen. Dabei ist von einer
Verschleppung durch Vögel auszugehen. Die neuen
Herde
komplettieren
die
phylogenetischen
Kenntnisse zu FSME-Viren in mit dem Virus hoch
durchseuchten Landkreisen in Ostbayern. Weitere
Informationen zur Stabilität des Virus in einem
Naturherd konnten gewonnen werden, die zeigen,
dass das Virus über Jahre genetisch stabil im
Naturherd vorhanden ist, unabhängig vom Auftreten
menschlicher Erkrankungen.
Bearbeiter
OFA PD Dr. Dobler
Laufzeit
01/2013 bis 12/2016
Sachstand
Die FSME ist die wichtigste virale ZNS-Infektion in
Mitteleuropa. Phylogenetische Daten zeigen, dass
das FSME-Virus aus dem Osten eingewandert ist.
Die genauen Wege der Einwanderung und die
Wanderungs-Vehikel sind unklar. Im Rahmen des
Forschungsprojekts sollen über umfangreiche
genetische Untersuchungen an FSME-Viren diese
Wanderungswege konstruiert werden. Damit wird die
Grundlage für eine wirksamere Überwachung der
FSME, was wiederum gezieltere Impfempfehlung
ermöglicht.
Ausblick
Die Untersuchungen werden in weiteren Herden in
Tschechien, der Slowakei und in den bekannten
Herden in Ostbayern fortgeführt. Ziel ist es auch
frühere FSME-Virusstämme vom Institut für Virologie
der Universität Wien zu akquirieren und diese in die
Analysen einzubeziehen. Durch Zeckensammeln in
neu auftretenden Naturherden in Sachsen und in
Franken sollen erstmals FSME-Gensequenz-Daten
aus diesen Regionen generiert und in die Analysen
miteinbezogen werden.
Zielsetzung
Nachweis und Isolierung von FSME-Viren aus
Zecken und ggf. Patienten aus Mittel- und Osteuropa
und Akquirierung von FSME-Viren aus virologischen
Sammlungen. Nach Sequenzierung des gesamten EGens soll ein phylogenetischer Vergleich der E-Gene
aus Mittel- und Osteuropa mit bekannten Sequenzen
aus Nord- und Südeuropa erfolgen. Nach Analyse
der Sequenzdaten mittels Bayesischer Analyse und
Neighbor-Joining-Analyse
sollen
mögliche
Wanderungswege ermittelt werden.
Methoden
Sammeln von Zecken in bekannten rezenten und
historischen
FSME-Herden
in
Deutschland,
Österreich, Tschechien, Slowakei, Polen, Ungarn
Slowenien
und
Rumänien;
Isolierung
der
Virusstämme aus PCR-positiven Zecken; Analyse
der E-Gene mittels konventioneller Sequenzierung;
Analyse der E-Gen-Sequenzen mittels Bioedit.
Ergebnisse
Im Jahr 2013 wurden insgesamt 7.250 Zecken in
Deutschland, Österreich und Rumänien aus
insgesamt 58 Naturherd-Regionen gesammelt.
Insgesamt wurden die Zecken in 2.108 Zeckenpools
mittels PCR untersucht. Dabei konnten 13
Virusstämme aus sechs verschiedenen Naturherden
isoliert und sequenziert werden.
87
Abteilung fü r Infektionsepidemiologie,
Immunologie & Risikoanalyse
Nachdem noch im Jahr 2011 umfangreiche
Validationsarbeiten für die anstehende Akkreditierung
des Zentralbereichs Diagnostik neben der Forschung
zu bewältigen waren, konnte sich ab 2012 - nach
einer Straffung des Projektportfolios - die Abteilung
TE030 wieder ihrem Kernauftrag zuwenden: STANUnterprojekte, drei Drittmittelprojekte, ein internationales und ein neues nationales Kooperationsprojekt galt
es inhaltlich mit Leben zu füllen.
Der molekularbiologische Komponente im STANProjekt Tularämie wurde erweitert: Neben der
Verbesserung
der
Echtzeit-PCR-gestützten
Typisierungsverfahren und der Durchtypisierung
nahezu der gesamten Francisella-Stammsammlung
mittels MLVA 12 konnte mit der Vollgenomsequenzierung ein weiterer, zukunftsfähiger Weg im
Jahr 2012 begonnen werden. Die hierfür durch einen
Workshop an der Uni Münster erworbenen
Kenntnisse konnten direkt für die nun auch am Institut
zur Verfügung stehende Geräteplattform IonTorrent
PGM eingesetzt werden. Damit wird es möglich,
bereits etablierte mit zukunftsweisenden Methoden
auf ihre Eignung hinsichtlich der Mikroevolution bei
klonaler Expansion in Ausbruchsgeschehen zu
vergleichen und deren forensische Tauglichkeit zu
bewerten. Erstmals wurde 2013 mit diesem Ansatz
ein geographisch eng begrenzter Ausbruchsherd von
Tularämie untersucht. Dabei wurden dynamische
88
Veränderungen im Genom erfasst und ermöglichten
eine vergleichende Untersuchungen mit bereits
bekannten Vollgenomdaten.
Ein neues Zellkulturmodell zur Testung antibakterieller Wirkstoffe gegen die Infektion mit
Francisella tularensis zeigte vielversprechende
Ergebnisse. Mit diesem Modell sollte es nun möglich
sein, synthetisch hergestellte oder natürlich
vorkommende Antibiotika hinsichtlich ihrer Toxizität
und ihres antimikrobiellen Effekts unter Bedingungen
der Schutzstufen 2 und 3 quantitativ zu beurteilen.
Dies ist ein wichtiger Schritt in Richtung
translationaler Forschung und bietet Chancen zur
intensiveren
Vernetzung
mit
universitären
Kooperationspartnern.
In
dem
im
Jahr
2012
abgeschlossenen
Drittmittelprojekt B-Pathogen-Panel wurden innovative
Lösungen für die Probennahme, Vor-Ort-Diagnostik
und den Probenversand von Erkrankungen aus dem
bakteriellen Spektrum des medizinischen B-Schutzes
aufgezeigt. Das System bietet neben der Identifikation
von Francisella tularensis, Bacillus anthracis, Yersinia
pestis, Coxiella burnetti und Brucella spp. auch noch
Informationen über gängige Resistenzmuster und
unkomplizierte Versandoptionen nach sicherer
Inaktivierung des Materials.
SimpleProbe-Sonden
– Einfache Sonden fü r komplexe Analysen
Antibiotikaresistenzmutation bei Francisella tularensis
holarctica (Makrolidresistenz) folgen (Abbildung 1).
Die sequentielle Stufendiagnostik der Tularämie
bietet unter normalen klinischen Bedingungen
eine hohe Sicherheit bei adäquatem Kostenprofil.
Erst wenn normale, diagnostische Pfade
verlassen werden, Zeit ein kritischer Faktor ist
oder ein hohes Probenaufkommen abgearbeitet
werden muss, schlägt die Stunde der Hochdurchsatzverfahren.
Es galt zunächst, die schon vorhandenen Assays auf
Kombinierbarkeit auszutesten und ggf. Designänderungen bzw. Neudesigns vorzunehmen. Für jede
einzelne PCR musste die optimale Reagenzienmischung gefunden werden, die aber gleichzeitig
unter denselben thermischen Laufbedingungen wie
die der anderen Assays verlässliche Daten liefern
sollte. Auch sollte die Sensitivität der Einzelreaktionen
nicht zu grob voneinander abweichen, damit die
Gesamtplatte weiterhin für die Anwendung auch an
klinischen Materialien mit geringer Nukleinsäurekonzentration (eben nicht nur Stamm-DNA in großer
Menge) verwendbar blieb. In der Breite der Assays
stellte dies nur geringe Anforderungen an die
Optimierungskünste der Nutzer, bei einzelnen PCRs
wurde es aber überaus schwierig. Ein Assay wurde
ganz durch einen neuen Entwurf ersetzt, bei anderen
blieb es bei graduellen Veränderungen wie Primeraustauschen. Da der Ausfall eines einzigen Tests
während der Entwicklung die Nutzbarkeit der
gesamten Platte gefährdet hätte, wurde zum Ende der
Entwicklungsphase ein immer größeres Augenmerk
auf das Gesamtsystem gelegt (Abbildungen 2 bis 4).
„Man muss die Dinge so einfach wie möglich machen.
Aber nicht noch einfacher.“ Dieses Zitat wird Albert
Einstein zugeschrieben und umreißt die Fortentwicklung der PCR-Verfahren an unserem Institut
im Jahr 2012. Als beginnend ab 2011 mit der
Verfügbarkeit des LightCycler® 480 II von Roche
erstmalig eine flexible Hochdurchsatzplattform für die
Echtzeit-PCR in der Teileinheit 030 zur Verfügung
stand, wurde in einem Projekt der Effekt der faktisch
leicht möglichen Verdreifachung der Analysenzahl pro
PCR-Durchlauf untersucht. Unterschiedliche Techniken bezüglich Sondendesign und Reaktionschemie
wurden verglichen und hinsichtlich Kosten und
technischer Nutzbarkeit gegenübergestellt. Damals
zeigte sich, dass die sogenannten Minor-GrooveBinder (MGB)-Sonden vom Kostengesichtspunkt her
knapp hinter den SimpleProbe-Sonden lagen. Einzelne Schwierigkeiten in der Auswertung bei den SimpleProbe-Sonden ließen die MGB-Sonden im kombinierten Ranking aus Kosten, Sensitivität und Einfachheit
der Nutzung zunächst auf Platz 1 aufrücken und als
geeigneten Kandidaten für eine Weiterentwicklung
erscheinen. Diese Schwierigkeiten konnten Anfang
2012 nach intensivierter Beschäftigung mit den
SimpleProbe-Sonden beseitigt werden, so dass die
Kosten für eine Einzelreaktion (ohne Personal- und
Gerätekosten) bei in etwa 2 Euro liegen.
Die ursprüngliche Idee, eine 96-Loch-PCR-Platte so
zu bestücken, dass mit einem einzigen Lauf alle
klinisch relevanten Francisella-Subspezies erfasst
werden können, rückte nun in den Fokus der
Entwicklung des Jahres 2012. Die erste PCR auf der
Platte sollte möglichst alle Francisella tularensis (incl.
novicida)-Subspezies erfassen, die folgenden PCRs
die jeweiligen Subspezies einzeln oder so kombiniert,
dass die diagnostische Sicherheit erhöht werden
konnte. Als weitere Tests sollten noch je ein Assay für
Francisella philomiragia und einer für die häufigste
Abbildung 2: Automatisierte Auswertung einer komplett
beladenen Platte während der Testung des Francisella tularensis
holarctica (Typ B)-Assays (rot: Typ B positiv, blau: Typ B negativ,
türkis: Negativkontrolle, braun: Ergebnis nicht eindeutig)
Abbildung 1: Vereinfachter Stammbaum des Genus Francisella (grün: Assays der beschriebenen Diagnostikplatte)
89
Abbildung 3: Schmelzkurvenanalyse einer Platte während der
Testung
Abbildung 4: Schmelzkurvenanalyse einer Platte während der
Testung in einer vereinfachten Darstellung (Ableitung)
Zusammenfassend benötigte die Optimierung der
zwölf verschiedenen PCRs insgesamt 2899 Einzelreaktionen an 58 Versuchstagen. Zum Ende des
Berichtsjahres 2012 steht diese Platte kurz vor der
Validation, die im Folgejahr ansteht. Der Prüfplan für
die Validation wurde im Jahr 2013 anhand von 20
Stämmen der Francisella-Stammsammlung des
Konsiliarlabors erfolgreich weitergeführt. Die Testung
von DNA weiterer Stämme aus dem Spektrum
differentialdiagnostisch relevanter Erreger und
klinischer Materialien ist noch nicht erfolgt. Prinzipiell
steht aber mit diesem System ein Reservediagnostikum für Francisella-Infektionen zur Verfügung, das hohe Sensitivität und Spezifität vereinigt.
Es ist damit prädestiniert für Situationen, in denen das
im Haus etablierte diagnostische Stufenschema
verlassen werden muss. Aufgrund seiner hohen
Grundkosten ist es aber nicht für den Routineeinsatz
gedacht.
90
U3 bertragung der Tularä mie durch Zecken:
Eine unterschä tzte Gefahr?
In Baden-Württemberg wurden über die Saison 2011
in Zusammenarbeit mit dem Landesgesundheitsamt
Baden-Württemberg in verschiedenen Landkreisen
Zecken gesammelt und auf das Vorkommen von
F. tularensis untersucht.
Heutzutage werden in ca. 10 - 20% aller humanen
Tularämiefälle Zeckenstiche als Ursache benannt.
Mittels PCR lässt sich F. tularensis in Zecken
(Ixodes
ricinus)
nachweisen.
Identische
Genotypen treten bei Zecken und Hasen als auch
bei Tularämiepatienten auf. Die Ergebnisse legen
nahe, dass I. ricinus eine wichtige Rolle in der
Ökologie des Erregers und bei der Übertragung
auf den Menschen spielt.
Grundlage für das Projekt waren die gemeldeten
Hasenfälle und die humanen Tularämiefälle aus den
Jahren 2007 bis 2010 in Baden-Württemberg
(Abbildung 3). Die Beprobungsorte wurden anhand
der Vegetation so gewählt, dass mit höherer
Präferenz I. ricinus-Zecken gefangen wurden. Das
LGA BW übernahm den Zeckenfang am Pulverdinger
Holz und in Mörsch. Hier konnten 911 Zecken
gefangen werden, von denen keine positiv getestet
wurde. Das Pulverdinger Holz war als Fang-Ort
gewählt worden, weil hier im Jahr 2008 acht
Tularämie-positive Zeckenpools gefunden worden
waren (GEHRINGER H ET AL., TICKS TICK BORNE
DIS 2012). Im Jahr 2011 wurden insgesamt 1.315
Zecken gesammelt. Zwei der aus diesen Zecken
gebildeten Pools waren positiv auf F. tularensis in der
16S-rRNA-real-time-Screening-PCR. Mittels 30 bp
Deletions-PCR, lpnA-PCR und Sequenzierung sowie
MLVA-Typisierung von 3 Markern konnten wir zeigen,
dass es sich um zwei verschiedene Stämme von
F. tularensis holarctica handelt.
Die Tularämie oder „Hasenpest“ wird durch
Francisella tularensis ausgelöst. Seit 2005 ist ein
deutlicher Anstieg der Tularämieinzidenz in Deutschland zu verzeichnen (Abbildung 1). Die Ursache ist
unbekannt. Verschiedene Beobachtungen lassen
vermuten, dass auch in Deutschland eine signifikante
Zahl von Erkrankungen auf eine Übertragung durch
Zeckenstiche zurückzuführen ist. Wissenschaftliche
Daten hierzu liegen bislang nicht vor. Seit 2012 ist
jedoch bekannt, dass F. tularensis ssp. holarctica
auch in I. ricinus-Zecken aus Deutschland nachweisbar ist. Die Ergebnisse von drei Untersuchungen des
Konsiliarlaboratoriums für Tularämie stärken die o.g.
Vermutung.
Der Nachweis einer Tularämieerkrankung ist nach § 7
IfSG meldepflichtig. Im Meldezeitraum 2001 bis Ende
2012 wurden 130 Fälle registriert. Anhand eigener
Daten aus der Konsiliartätigkeit, den Meldedaten an
das RKI und den publizierten Fällen konnte für 93
dieser Fälle die wahrscheinliche Infektionsquelle
eruiert werden (Abbildung 2). Die graphische
Darstellung zeigt, dass in knapp 20% aller Fälle
Zeckenstiche der Auslöser der Tularämie waren, in
zusätzlichen 10% gaben die Patienten „Insektenstiche“ als Ursache an. Kontakt mit Feldhasen war nur
bei 37% der Patienten Auslöser einer Tularämieinfektion.
Als weiterer Beleg für die signifikante Rolle, die
Zecken auch in Deutschland für die Übertragung von
F. tularensis spielen, kann die Analyse von
Tularämiefällen
im
Landkreis
Ludwigsburg
Abbildung 3: Kumulative Inzidenz (5-Jahres-Intervalle) der
humanen Tularämie in Deutschland. Dargestellt ist die Anzahl der
gemeldeten Fälle in einem Zeitraum von 5 Jahren in der gesamten
deutschen Bevölkerung. Für das letzte Intervall wurde aus den
vorliegenden Meldedaten (2010 bis 2012) extrapoliert.
Abbildung 4: Relative Verteilung der anamnestisch erhobenen
wahrscheinlichen Übertragungswege/Expositionsquellen bei 93
Patienten (2001 bis 2012). Insgesamt wurden in diesem Zeitraum
130 Fälle gemeldet. In 37 Fällen war der Übertragungsweg nicht
ermittelbar.
Wir selbst beprobten zwischen Mai und September
2011 insgesamt 14 Orte in Baden-Württemberg
(Abbildung 3). Insgesamt wurden 1.462 Zecken
gesammelt. 786 (54 %) der 1.462 Zecken wurden
bisher aufgearbeitet. Keine der extrahierten DNAs
wurde bislang positiv auf F. tularensis getestet.
91
dienen.Hier erkrankte im August 2012 ein 61-jähriger
Mann, der 7 Tage zuvor an der Enz bei Vaihingen von
einer Zecke gestochen worden war. Im September
2012 erkrankt ein 30-jähriger Patient ebenfalls an
einer serologisch bestätigten Tularämie nach einem
Zeckenstich. Zwischen 2010 und 2012 waren im
selben Landkreis vier Feldhasen an einer Tularämie
verendet. Die Fundorte liegen im Umkreis von ca. 10
km um das „Pulverdinger Holz“.
Die molekularbiologische Feintypisierung von drei
F. tularensis-Isolaten aus den Feldhasen, der
F. tularensis-DNA aus dem Ulkus des Vaihinger
Patienten als auch von DNA-Proben der im
Pulverdinger Holz gesammelten F. tularensispositiven
Zecken
erbrachte
eine
100%ige
Übereinstimmung der untersuchten MLVA-Marker.
Die epidemiologische Untersuchung der gemeldeten
Tularämiefälle zeigt, dass vermutlich mehr als 20%
dieser Infektionen durch Zecken übertragen worden
sind. Das endemische Vorkommen von F. tularensis
holarctica in Zecken der Spezies I. ricinus wurde
bestätigt. Die beiden nachgewiesenen Stämme
wiesen
geringfügige
Unterschiede
in
der
Genotypisierung auf, so dass an diesem Standort
(„Pulverdinger
Holz“)
mindestens
zwei
unterschiedliche F. tularensis-Stämme vorkommen.
Der Vergleich mit Daten von Isolaten aus Hasen, bzw.
DNA von einem Patienten beweist, dass zumindest
einer dieser Genotypen sowohl Infektionen bei Hasen
als auch bei Menschen verursachen kann. Alle
gefundenen Stämme gehören zum „franco-iberischen
Subklon“ dieses Erregers, der auch in Frankreich, der
Schweiz und in Italien vorherrscht.
Abbildung 3: Kartierung der Orte des Zeckenfangs im Jahr 2011. Die Fangorte des LGA BW sind in rot
eingetragen, die des IMB in grün (Kartenmaterial: mit freundlicher Genehmigung des statistischen Landesamts
Baden-Württemberg).
92
Francisella-Infektionen direkt unter der Lupe
Im Rahmen eines Forschungsprojektes soll die
Infektionsfähigkeit und Proliferation des fakultativ
intrazellulären Bakteriums Francisella untersucht
werden. Bevor der Einfluss potentieller antimikrobieller Wirkstoffe getestet werden kann, soll
zunächst ein tierversuchsfreies Infektionsmodell
etabliert werden. Dies wird hier vorgestellt und
erlaubt erste beeindruckende Bilder vom
Infektionsgeschehen.
mente, die auf einen Objektträger aufgebracht sind.
Da der Boden dieser spezielle Objektträger im
Bereich der Kompartimente äußerst dünn gefertigt
wurde (ähnlich zu Mikroskop-Deckgläschen), eignet
er sich für die Nutzung mit einem inversen
Fluoreszenzmikroskops (siehe Abbildung 1). Mit
diesem System ist es sogar möglich, das Wachstum
von Francisella während der Infektion „live“ zu
beobachten.
Das fakultativ intrazelluläre Bakterium Francisella
tularensis zählt aufgrund seiner äußerst geringen
Infektionsdosis und seiner Verwendung in ehemaligen
staatlichen Biowaffenprogrammen zu den Kategorie A
Agenzien. Die geringe Infektionsdosis gepaart mit der
hohen - allerdings subspezies-assoziierten - humanen
Pathogenität lässt noch immer Fragen offen hinsichtlich des eigentlichen Infektionsmechanismus und der
molekularbiologischen Unterschiede der einzelnen
Subspezies. Mögliche Antworten werden genutzt um
solche Zielstrukturen oder Enzymreaktionen zu
identifizieren, die für therapeutische oder prophylaktische Zwecke genutzt werden können.
Aus diesem Grund wurde im vergangenen Jahr ein
Makrophagen-Infektionsmodell für Francisella am
InstMikroBioBw etabliert, um visuell den Infektionsverlauf zu beobachten und untersuchen zu können.
Für den Aufbau des Systems wurden die beiden
Zelllinien J774 (murine Makrophagen) und THP-1
(humane monocytäre Zellen) ausgewählt.
Aufgrund infrastruktureller Maßnahmen konnte das
Projekt erst Mitte des Jahres beginnen, zeigte jedoch
bereits schon Ende des Jahres erste Ergebnisse. Die
Kulturbedingungen
beider
Zelllinien
wurden
hinsichtlich des Wachstums optimiert und ein
geeignetes Zellkulturgefäß wurde ausgewählt. Dabei
handelt es sich um für Zellkultur-nutzbare Komparti-
Nachdem eine definierte Zellzahl von Makrophagen
durch Kultivierung in diesen Zellkultur-Objektträgern
erreicht wurde, wird diese mit Bakterien infiziert. Die in
der Zellkultur befindlichen Makrophagen endozytieren
nun die Bakterien – die Infektion beginnt. Im
Anschluss werden alle nicht endozytierten Bakterien
durch Waschen entfernt, sodass von nun an nur die
aufgenommenen Bakterien den weiteren Infektionsverlauf bestimmen können. Bei Francisella beginnt
direkt nach Endozytose durch die Makrophagen der
Ablauf der Überlebensstrategie: Aus bislang
unbekanntem Grund kann das Bakterium aus dem
Phagolysosom des Makrophagen aktiv entkommen
und gelangt so ins Zytosol des Makrophagen. Dort
bleibt es für das Immunsystem des Wirtes unerkannt,
vermehrt sich dort und wird erst wieder freigesetzt,
wenn der Makrophage stirbt und „platzt“. Damit sind
die Bakterien wieder frei beweglich im Medium und
können weitere umliegende Makrophagen infizieren.
Im verwendeten Versuchsaufbau unterbricht die
Fixierung der Zellkultur diesen Infektionsablauf abrupt
und ermöglicht somit definierte Momentaufnahmen
des Geschehens. Dazu werden sowohl Zellfärbungen
also auch die spezifische Färbung der Bakterien mit
fluoreszierenden monoklonalen Antikörpern genutzt,
um unter Nutzung eines Laserscanningmikroskops
sehr die 0,2 x 0,5 µm großen Bakterien innerhalb der
Makrophagen darzustellen. Erste Bilder zeigen
anschaulich die Situation bei der Verwendung von
J774 Makrophagen (Abbildung 2).
Abbildung 1: Inverse
Fluoreszenz-Laserscanning-Mikroskopie
Die Auswertungen der ersten visuellen und digitalen
Ergebnisse unterstreichen den eben dargestellten
Infektionsverlauf zusätzlich: Im Beobachtungszeitraum nimmt die absolute Anzahl an Makrophagen
deutlich ab, während die Anzahl infizierter Makrophagen prozentual zunimmt. Ebenfalls kann eine
Zunahme von Francisella über den Beobachtungszeitraum festgestellt werden (Abbildung 3).
Im weiteren Projektverlauf wurden neben der
Etablierung quantitativer PCRs auch bereits erste
antimikrobielle Substanzen im Versuchsaufbau
getestet. Hier konnte nicht nur die Wirkung auf die
Infektion gezeigt werden, zusätzlich ermöglicht der
Versuchsablauf eine standardisierte Infektion
unter Verwendung spezieller Objektträger mit Zellkultur-funktionalenKompartimenten.
93
Abbildung 2: Immunfluoreszenzfärbung von J774 Makrophagen mit endozytierten Francisella Erregern zu verschiedenen Zeitpunkten
post infectionem (p.i.). Der Zellkern der Makrophagen wurde mittels DAPI-Färbung (blau), das Cytoskelett mit Phalloidin (rot) sichtbar gemacht. Francisella tularensis ist mit einem monoklonalen Antikörper markiert (gelb). Deutlich erkennbar ist die Zunahme des Infektionsgrades
(Anzahl der Francisellen im Makrophagen) und die Abnahme der Makrophagenanzahl über die Zeit.
intrazellulärer Organismen mit Verlaufskontrollen. Im
späteren Verlauf des Projektes soll noch die
immunologisch wichtige Methode FACS in den
Prozess inkludiert und weitere antimikrobielle
Substanzen hinsichtlich Ihrer Wirkung untersucht
werden.
Abbildung 3: Visuelle (oben) und digitale (unten) Auswertung zu
unterschiedlichen
Punkten
des
Beobachtungszeitraums.
Francisella vermehrt sich über den Zeitverlauf und infiziert immer
mehr Makrophagen. Gleichzeitig nimmt jedoch die Zahl der lebenden
Makrophagen ab, da diese bei der Freisetzung der proliferierten
Francisellen absterben.
94
STAN-PROJEKT IMB-30-2001 | Infektionsepidemiologie, Immunologie & Risikoanalyse
Diagnostik, Pathogenese, Prophylaxe und
Epidemiologie der Tularä mie
♦ STAN-Unterprojekt 30-2001-12
Entwicklung eines Echtzeit-PCR-Verfahrens zur simultanen Bestimmung aller relevanten
Francisella-Subspezies aus Kulturen und klinischem Material
♦ STAN-Unterprojekt 30-2001-13
Molekulare Epidemiologie von Francisella tularensis - Aufbau einer forensischen und phylogenetischen Datenbank
♦ STAN-Unterprojekt 30-2001-14
Anwendung GIS-basierter Methoden und Modelle zur Risikobeurteilung des Auftretens der
Tularämie
♦ STAN-Unterprojekt 30-2001-15
Rolle der Vollgenomsequenzierung bakterieller Isolate im Rahmen von Ausbruchsuntersuchungen
Fragestellung
Ziele
Francisella tularensis, der Erreger der Tularämie, ist
ein potenzieller B-Kampfstoff, der klinisch schwer
verlaufende Infektionen auslöst. Standardisierte
Verfahren für die molekulare, biochemische und
immunologische Identifizierung bzw. Typisierung von
F. tularensis und zur Früh-, Schnell- und
Spezialdiagnostik der Tularämie sind bisher nur
teilweise in die Routine eingeführt. Derzeit sind
Impfstoffe nicht erhältlich. Gesicherte Erkenntnisse
über Expositions- und Infektionsrisiken für Soldaten
bei Einsätzen in Enzootie-/Endemiegebieten der
Tularämie fehlen. Die Immunpathogenese des
Erregers ist nur teilweise bekannt.
Die Hauptziele des Projekts sind die Entwicklung,
Etablierung und Evaluierung von Verfahren zur Früh-,
Schnell- und Spezialdiagnostik der Tularämie, zur
Erregeridentifizierung und -differenzierung sowie zur
Antibiotika-Resistenzbestimmung. Daneben sollen
Erreger-Wirts-Wechselbeziehungen aufgeklärt werden und die Ermittlung und präklinische Prüfung von
Impfstoffkandidaten erfolgen. Die Aufklärung von
Krankheitsausbrüchen und enzootischen/endemischen Lagen in Deutschland und in Einsatzregionen
der Bundeswehr erfolgt im Rahmen eines TularämieFachlabors, das durch das Robert-Koch-Institut als
Konsiliarlabor anerkannt ist. Der aktuelle Schwerpunkt
des Projektes liegt auf dem Gebiet der molekularen
Typisierung von F. tularensis. Die Typisierung hat sich
in den letzten Jahren stetig fortentwickelt und hat mit
der Verfügbarkeit von Vollgenom-Analysen komplett
neue Akzente bekommen.
95
95
STAN-UNTERPROJEKT 34-2001-15 | B-Spezialdiagnostik und Hochsicherheitslabor
STAN-UNTERPROJEKT 30-2001-12 | Infektionsepidemiologie, Immunologie & Risikoanalyse
Entwicklung eines Echtzeit-PCR-Verfahrens zur simultanen
Bestimmung aller relevanten Francisella-Subspezies aus Kulturen und klinischem Material
Diagnostikbereich übergeben.
Bearbeiter
OFA Dr. Kayßer
Bewertung
Die Optimierung der zwölf verschiedenen PCRs
benötigte
2899
Einzelreaktionen
an
58
Versuchstagen. Für einige PCRs war der Aufwand
hoch, so musste ein Assay ersetzt werden, bei
anderen Testen reichte es, Primer auszutauschen.
Die gesteckten Projektziele wurden erreicht.
Laufzeit
01/2012 bis 06/2013
Sachstand
Der
aktuelle
Diagnostikalgorithmus
des
InstMikrobioBw berücksichtigt lediglich die am
häufigsten vorkommenden Subspecies Francisella
tularensis holarctica und Francisella tularensis
tularensis. Seltenere Subspecies wie F. t. novicida,
mediasiatica oder philomiragia werden nicht erfasst
und bleiben einer sequentiellen Bestätigung durch
das Konsiliarlabor für Tularämie vorbehalten. Eine
solche Bestätigung ist zeitintensiv.
Ausblick
Die Methodik ist prinzipiell im Rahmen der
erweiterten Diagnostik verwendbar. Allerdings sollte
noch DNA von weiteren Stämmen aus dem Spektrum
differentialdiagnostisch relevanter Erreger und
klinischer Materialien getestet werden. Bei erfolgreich
abgeschlossener Validation steht mit diesem System
ein Reservediagnostikum für Francisella-Infektionen
zur Verfügung, das hohe Sensitivität und Spezifität
vereinigt.
Zielsetzung
Dieses Projekt beinhaltet die Entwicklung und
Bereitstellung eines Testverfahrens zur zeitgleichen
Bestimmung der relevanten Francisella-Subspecies,
das mittels 12 parallel geschalteter, z. T. redundanter
PCR-Reaktionen in einem Minimum an Zeit eine
diagnostisch relevante Aussage in Kulturen und
klinischen Materialien ermöglicht.
Methoden
Die simultane SNP-Genotypisierung wurde im 96Lochplattenformat mittels LightCycler® 480 II und mit
SimpleProbe-Sonden getestet.
Ergebnisse 2012
10 der benötigten Assays existierten schon aus dem
Vorläuferprojekt 30-2001-05. Diese wurden auf
Kombinierbarkeit ausgetestet und notwendige
Designänderungen
bzw.
Neudesigns
wurden
vorgenommen. Die Sensitivität der Einzelrektionen
wurde orientierend bestimmt, um die Anwendung
auch an klinischen Materialien mit geringer
Nukleinsäurekonzentration sicher zu stellen. Für
jeden Einzelassay wurde der Mastermix hinsichtlich
Magnesium-, Primer- und Sondenkonzentration
titriert.
Ergebnisse 2013
Es wurde eine Testung mit einer Auswahl von
weiteren 20 Referenzstämmen durchgeführt und eine
sichere Spezies- und Subspeziesdifferenzierung
erreicht. Die Methodenplattform einschließlich der
notwendigen Dokumentation wurde an den
96
STAN-UNTERPROJEKT 34-2001-15 | B-Spezialdiagnostik und Hochsicherheitslabor
STAN-UNTERPROJEKT 30-2001-13 | Infektionsepidemiologie, Immunologie & Risikoanalyse
Molekulare Epidemiologie von Francisellatularensis- Au;bau einer forensischen und phylogenetischen Datenbank
Ausfall einzelner Assays vorzuhalten, wurden 24
dieser 65 Assays für den Typisierungsalgorithmus
ausgewählt. Mit Ablauf des Jahres 2012 konnten
Daten zu fast 90 % der verfügbaren Stämme mittels
MLVA 12 generiert werden. Zusätzlich wurde die
prinzipielle Eignung der MLVA 12 zur Untersuchung
diagnostischer Proben mit einem geringen Anteil an
genomischer Francisella-DNA nachgewiesen.
Bearbeiter
OFA Dr. Kayßer
Laufzeit
01/2012 bis 12/2013
Sachstand
In der wissenschaftlichen Literatur existieren diverse
Typisierungsverfahren für Francisella tularensis, die
sich hinsichtlich ihrer Auflösung und Eignung für
bioforensische Fragestellungen unterscheiden. Die
aktuellste und am besten auflösendste Methode
außer
der
Vollgenomsequenzierung
ist
die
Typisierung
anhand
von
Single-NucleotidePolymorphismen (SNPs). Für diese sind dem
InstMikroBioBw
Originalassays
(Melt-MAMAMethode) im Rahmen eines Kooperationsprojektes
zur Verfügung gestellt worden. Diese ermöglichen in
Kombination mit der in 2011 etablierten MLVA 12Typisierung eine Auflösung, die sehr nah an die
Vollgenomsequenzierung heranreicht.
Ergebnisse 2013
Mit Ablauf des Jahres 2013 konnten Daten zu fast
100% der verfügbaren F. tularensis Stämme mittels
MLVA 12 generiert werden. Die Genotypisierung
mittels SNP-Analyse konnte bis auf wenige
Ausnahmen (10 von 311 Stämmen) abgeschlossen
werden. Auf die genaue Untersuchung von 17
weiteren Stämmen wurde aufgrund unklarer
Herkunft, bzw. fehlerhafter Angaben („bulgarische
Stämme“) auf eine genaue Typisierung verzichtet.
Bewertung
Mit den Assays ist eine Typisierung von bis zu drei
Stämmen zeitgleich möglich. In Kombination mit der
MLVA 12 bietet sich jetzt die Option auf eine
integrierte Datengrundlage, die beide Verfahren
synergistisch nutzbar macht. Die Genotypisierung
aller F. tularensis Stämme wurde zu 93% erfolgreich
abgeschlossen. Damit konnte das Ziel, der Aufbau
einer genotypischen Datenbank für F. tularensis,
erreicht werden.
Zielsetzung
Zunächst sollten die SNP-Assays auf ihre Eignung
und praktische Verwendbarkeit auf der am
InstMikroBioBw vorhandenen Plattform LightCycler®
480 II überprüft und ggf. optimiert werden. In
Kombination mit dem System MLVA 12 sollten nach
Aufbau eines Typisierungsalgorithmus Daten zu der
gesamten Stammsammlung des Konsiliarlabors für
Tularämie erfasst und diese in eine Datenbank
überführt werden.
Ausblick
Es sollen im Rahmen der Kooperation mit der NAU
noch 40 DNA Proben geliefert werden, von diesen
sollen stichprobenartig insbesondere die Proben der
unterrepräsentierten Subspezies F. tularensis
tularensis untersucht werden. Zusätzlich könnten
noch 50 weitere DNA Proben (keine Stämme) aus
Tschechien,
der
Slowakei
und
Norwegen
genotypisiert werden. Der wissenschaftliche Wert
dieser Untersuchungen im Vergleich zu den bislang
erzielten Resultaten ist jedoch von untergeordneter
Bedeutung. Das gleiche gilt für die Einführung und
Validation von 72 weiteren Melt-MAMA-SNPGenotypisierungsassays, die von der NAU übermittelt
wurden. Es scheint im Hinblick auf die gesunkenen
Kosten der Vollgenomsequenzierung sinnvoller, alle
Stämme sukzessive komplett zu sequenzieren und
die Genotypisierung dann in silico durchzuführen.
Dieses Verfahren ist abwärts kompatibel, die bisher
aufgebaute
Datenbank
kann
weiterhin
als
Vergleichsstandard genutzt werden.
Methoden
76
unterschiedliche
Melt-MAMA-SNP-Genotypisierungsassays
wurden
auf
der
Plattform
LightCycler® 480 II mit jeweils 6 Stamm-DNAs in
insgesamt über 550 Einzelanalysen getestet,
bewertet und bei Bedarf optimiert. In Einzelfällen
wurden Testungen mit einer zweiten Plattform
(Stratagene®
MX
3000)
durchgeführt,
um
Vergleichswerte zu erhalten. Parallel hierzu wurden
257 Stämme der Stammsammlung des Konsiliarlabors für Tularämie mittels MLVA 12 typisiert.
Ergebnisse 2012
Von den 76 Melt-MAMA-Real-Time-PCR-Assays
erwiesen sich nach Optimierung 65 als geeignet zur
Typisierung auf dem LightCycler® 480 II. Um eine
zeitoptimierte
Analyse
zu
ermöglichen
und
gleichzeitig noch hinreichende Redundanz für den
97
STAN-UNTERPROJEKT 34-2001-15 | B-Spezialdiagnostik und Hochsicherheitslabor
STAN-UNTERPROJEKT 30-2001-14 | Infektionsepidemiologie, Immunologie & Risikoanalyse
Anwendung GIS-basierter Methoden und Modelle
zur Risikobeurteilung des Auftretens der Tularä mie
Hersteller durchgeführt werden. Es gelang jedoch
bereits Mitte 2012 hinreichende Fähigkeiten
hinsichtlich der Bedienung auf autodidaktischem
Wege zu erwerben, so dass im Herbst die ersten
selbst generierten Karten Eingang in eine wissenschaftliche Publikation des Konsiliarlabors fanden.
Bearbeiter
OFA Dr. Kayßer
Laufzeit
01/2012 bis 12/2013
Sachstand
Geoinformationssysteme bieten heute neben der
reinen
Kartendarstellung
von
ortsabhängigen
Informationen eine vielfältige Anbindungsmöglichkeit
von experimentellen Daten. Am InstMikroBioBw
werden seit Jahren schon bei Ausbruchsuntersuchungen oder Beprobungen neben den für
den engeren Untersuchungsanlass notwendigen
Angaben, wie z. B. Spezies, Gewebeart, Erregerlast,
biochemischem Verhalten oder Genotypen auch
Daten zur geografischen Herkunft und anderen
Umweltmerkmalen gesammelt. Erst diese Daten
ermöglichen eine sinnvolle Einordnung des
Untersuchungsergebnisses in den infektiologischen
Zusammenhang.
Ergebnisse 2013
Im Jahr 2013 fand in Zusammenarbeit mit dem
AGeoBw ein erweitertes Training für sechs Personen
statt, bei dem auch Originalversuchsdaten des
Hauses analysiert wurden. Die Typisierungsarbeiten
des
STAN-Projektes
30-2001
(Diagnostik,
Pathogenese, Prophylaxe und Epidemiologie der
Tularämie) wurden im Laufe des Jahres kombiniert
geoinformatisch
dargestellt.
Dies
ermöglichte
erstmalig eine Korrelation von verschiedenen
Typisierungsverfahren des Tularämieerregers mit der
geographischen Verbreitung der so definierten
Subpopulationen für Deutschland, Europa und die
nördliche Hemisphäre.
Darüber hinaus kann ARCGIS auch in der bislang
beschafften
Version
genutzt
werden,
um
epidemiologische Daten, die im Rahmen von F&E
Projekten des Instituts generiert werden, zu
visualisieren. Neben Prävalenzdaten aus amtlichen
Melderegistern (e.g. SurvSTAT, TSN) können dies
z.B. räumliche Zuordnungen der Seroprävalenzen zu
den Wohnorten der Probanden sein.
Zielsetzung
Im Rahmen eines Vorläuferprojektes wurde ein
Anforderungskatalog für ein Geoinformationssystem
formuliert. Dieses System sollte die Verwendung
freier Geoinformatikwerkzeuge am InstMikroBioBw
obsolet machen. Neben dem Kauf eines
Programmpaketes sollte die dafür notwendige ITAusstattung mit leistungsfähigen Einzelplatzrechnern
sichergestellt
werden.
Beschaffung
und
Mitarbeiterschulung sollten in 2012 erfolgen, damit in
der zweiten Hälfte der Projektlaufzeit konkrete
Auswertungen
der
Stammsammlung
des
Konsiliarlabors für Tularämie erfolgen können.
Bewertung
Die Projektziele wurden komplett erreicht.
Ausblick
Eine
kontinuierliche
Projektbeauftragung
und
Mitarbeiterfortbildung ist aber zur vollumfänglichen
Nutzung des Systems ARCGIS unabdingbar. Die
vorhandenen Rechner wurden bereits außerhalb
dieses Projektes von anderen Teileinheiten für
geoinformatische und epidemiologische Fragestellungen genutzt, so dass eine breite Akzeptanz im
Institut anzunehmen ist.
Methoden
Als Softwareplattform wurde ArcGIS Desktop 10.0
mit den Modulen 3D Analyst, Spatial Analyst,
Publisher,
Geostatistical
Analyst,
Data
Interoperability und SitGIS KMRG in zwei Lizenzen
inklusive der benötigten Hardware (Quad-CoreRechner mit 32 GB Hauptspeicher) im ersten Quartal
2012 beschafft. Die bereits gut georeferenzierte
Stammsammlung des Konsiliarlabors für Tularämie
diente als Startpunkt für die ersten Auswertungen.
Ergebnisse 2012
Aus Budgetgründen konnte die einführende
Mitarbeiterschulung erst im Dezember 2012 beim
98
STAN-UNTERPROJEKT 34-2001-15 | B-Spezialdiagnostik und Hochsicherheitslabor
STAN-UNTERPROJEKT 30-2001-15 | Infektionsepidemiologie, Immunologie & Risikoanalyse
Rolle der Vollgenomsequenzierung bakterieller
Isolate im Rahmen von Ausbruchsuntersuchungen
Arbeiten erfolgte in 2012 während eines
Laborworkshop an der Uni Münster, nachfolgenden
Arbeiten und Wiederholungen wurden dann in enger
Kooperation an der Uni Münster und parallel am
Institut in München durchgeführt.
Bearbeiter
OFA PD Dr. Splettstößer, ORR Dr. Antwerpen
Laufzeit
11/2012 bis 11/2013
Ergebnisse 2012
Es wurden vier genomische DNAs des Erregers
F. tularensis bearbeitet und deren Vollgenomsequenz
bestimmt. Dabei sind 30 GB qualitativ hochwertiger
Sequenzdaten generiert worden. Die Daten sind zum
Download auf dem Universitäts-Server zur Verfügung
bereitgestellt worden und werden nun weiter
bioinformatisch analysiert, damit wurden die Teilziele
in 2012 erreicht.
Sachstand
Im Rahmen von Ausbruchsuntersuchungen ist neben
der zweifelsfreien Identifizierung des auslösenden
Agens eine genaue Typisierung und Charakterisierung aller gewonnenen Bakterienstämme
notwendig, um ggf. Infektionsquellen, Übertragungswege oder Infektionsketten nachweisen zu können.
Der Med. B-Schutz erfordert Methoden zur
Unterscheidung von „natürlichen Ausbrüchen“ von
bioterroristischen Angriffen. Die meisten hochvirulenten biologischen Agenzien (z.B. B. anthracis,
Y. pestis, F. tularensis) haben eine klonale
Populationsstruktur, die eine Identifizierung selbst mit
hochauflösenden Methoden (SNP-Typing, MLVA,
MLST) auf Stammebene sehr schwierig machen.
Zunehmend
wird
daher
der
Einsatz
der
Vollgenomsequenzierung propagiert und bereits im
wissenschaftlichen Bereich eingesetzt.
Ergebnisse 2013
Im Jahr 2013 wurden die verbliebenden 11 Stämme
sequenziert. Die gewonnenen Daten aller Stämme
wurden bioinformatisch in einem Vollgenomansatz
verglichen. Es konnte gezeigt werden, dass die
verwendete Methode in der Lage war innerhalb eines
geographisch eng umfassten Ausbruchs in Verbindung mit den Kontrollstämmen vier unterschiedliche
Klone zu definieren, die bislang verwendeten
Standardmethoden der Typisierung (canSNP, MLVA)
konnten nur zwei bzw. drei Klone identifizieren.
Zielsetzung
Hauptziel des Projekts ist der Vergleich der
Vollgenomanalyse mit SNP-Typing/MLVA zur
Identifizierung von Clustern und möglichen
Infektionsketten. Als Fragestellung steht dabei die
Mikroevolution des Erregers F. tularensis holarctica
im Vordergrund. Zur Mikroevolution dieses zoonotischen Erregers während eines Ausbruchsgeschehens ist bislang nichts in der Literatur
bekannt. Mittels NGS-Sequenzierung soll die
grundsätzliche Eignung der Vollgenomsequenzierung
zur Analyse der Mikroevolution in streng klonalen
Bakterienpopulation untersucht werden.
Bewertung
Mit den Ergebnissen dieser bioinformatischen
Analyse ist es nunmehr möglich (unter Einbeziehung
weiterer Informationen sowie unter Nutzung aktueller
statistischer Verfahren) Aussagen über die Verteilung
und das Auftreten von Klonen innerhalb von
Ausbruchsgeschehen treffen zu können. Dies war mit
den bislang genutzten Methoden nicht in dieser
Detailtiefe möglich. Da dem Institut dieselbe
Technologieplattform zur Verfügung steht wie der Uni
Münster, konnten die dort erlernten Techniken direkt
umgesetzt und die im Laborseminar erhaltenen
Daten in das laufendende Forschungsprojekt
einbezogen werden. Damit konnten die neuen
Kenntnisse nachhaltig gesichert werden.
Methoden
12 Isolate von F. tularensis holarctica aus einem
definiertem Ausbruchsgeschehen und 3 weitere
Kontrollstämme wurden für eine Vollgenomsequenzierung auf der PGM-IonTorrent-Plattform ausgewählt. Nach der Präparation von genomischer DNS
erfolgte die Kontrolle mittels LabChipGX-Technologie
und Qubit-Spektrometrie. Nach Präparation einer
300bp-Library erfolgte eine emulsions-PCR mit zuvor
generierten Mikrosphären. Nach Einweisung in das
PGM-Gerät erfolgte die Sequenzierung auf 318er
Chips mit anschließendem Assembly. Der Beginn der
Ausblick
Die Datenerhebung und Auswertung des Projektes
ist abgeschlossen. Ein Manuskript für eine
wissenschaftliche Publikation ist bereits in einer
ersten Fassung erstellt und wird demnächst
eingereicht werden.
99
STAN-PROJEKT IMB-42-2003 | Infektionsepidemiologie, Immunologie & Risikoanalyse
Untersuchung der Immunpathogenese fakultativ intrazellulä rer potenzieller B-Agenzien
♦ STAN-Unterprojekt 42-2003-05
Zellkultur-basiertes Infektionsmodell zur Untersuchung antimikrobieller Hemmstoffe und Wirkmechanismen
Fragestellung
Ziele
Für bestimmte potentielle B-Agenzien, wie z. B.
Francisella
tularensis,
existieren
kaum
aussagekräftige Daten zur Pathogenese und zu
Immunmechanismen.
Die
Kenntnis
der
Immunmechanismen ist aber eine grundlegende
Voraussetzung zur Entwicklung brauchbarer Impfund Therapiestrategien. Ferner existieren über den
Tierversuch hinausgehend keine Möglichkeiten zur
Abschätzung der Erregervirulenz. Bestimmte BAgenzien verursachen schwere Infektionen, die
mangels rechtzeitiger Diagnostik oder inadäquater
Therapiemöglichkeiten
häufig
in
einer
letal
verlaufenden Sepsis münden. Die Verbesserung der
rechtzeitigen Erkennung spezifischer Infektionen und
die
Entwicklung
neuer
Therapieund
Prophylaxeansätze sind zwingend notwendig.
Ziele des Projektes sind der Aufbau eines primären
humanen ex-vivo in-vitro-Infektionsmodells und
weiterer in-vitro Modelle, sowie auch damit verbunden
die Identifizierung von Genen und/oder Proteinen
potentieller B-Agenzien, die zur Immunpathogenese
des Pathogens beitragen und als potentielle
diagnostische oder klinische Targets im Bereich
Therapie/Prophylaxe dienen können.
100
100
STAN-UNTERPROJEKT 34-2001-15 | B-Spezialdiagnostik und Hochsicherheitslabor
STAN-UNTERPROJEKT 42-2003-05 | Infektionsepidemiologie, Immunologie & Risikoanalyse
Zellkultur-basiertes Infektionsmodell zur Untersuchung
antimikrobieller Hemmstoffe und Wirkmechanismen
quantifizierend verfolgen zu können. Dies geschieht
durch digitale Auswertung von Bildern des LaserScanning-Mikroskops als auch durch Einsatz zweier
quantifizierender Echtzeit-PCRs. Die Funktionalität
des kompletten Assays wurde mittels klassischer
Antibiotika wie auch unter Verwendung des Inhibitors
Acivicin erfolgreich getestet.
Bearbeiter
ORR Dr. Antwerpen
Laufzeit
03/2012 bis 12/2014
Sachstand
In der Literatur sind einige Infektionsmodelle auf
Zellkulturbasis beschrieben, die eingesetzt werden
können, um den Einfluss antimikrobieller Wirkstoffe
und deren Wirkungsweisen auf intrazelluläre Bakterien untersuchen zu können. Am InstMikroBioBw
existiert derzeit kein funktionsfähiges MakrophagenInfektionsmodell für intrazelluläre Bakterien.
Zielsetzung
Ziel des Projektes ist es, ein MakrophagenInfektionsmodell für intrazelluläre Bakterien am
InstMikroBioBw zu implementieren und am Beispiel
von Francisella tularensis projektbezogen auf die
Funktionsfähigkeit hin zu testen. Neue antimikrobielle
Hemmstoffe sollen im Anschluss in einem in-vivo/invitro Modell bewertet werden.
Bewertung
Das Projekt liegt im geplanten Zeitrahmen, die
Ergebnisse entsprechen den Erwartungen. Da
bislang kein solches Modell zur Verfügung stand,
konnte nach Anfangsinvestitionen in Sach- und
Verbrauchsmittel der Aufbau des Assays gestartet
werden und steht nun mit der Zellinie J774 in vollem
Funktionsumfang und bei THP-1 Zellen mit
Einschränkungen für weitere Testungen im Projekt
zur Verfügung.
Ausblick
Im kommenden Jahr ist geplant, als weitere
quantifizierende Methode das FACS in den Prozess
zu etablieren und weitere antimikrobielle Substanzen
auf Ihre Wirkung zu testen.
Methoden
Zur Auswertung des Infektionsmodells stehen
mehrere Techniken zur Verfügung, die zunächst alle
angewendet werden sollen, um im späteren Verlauf
die optimalen Parameter in der Versuchsdurchführung und Auswertung zu erhalten. Im Detail
sind dies Zellkulturtechniken, konfokale Fluoreszenzmikroskopie mit digitalen Auswertungen, quantitative
Real-Time PCRs und das klassische Mikrodilutionsverfahren.
Ergebnisse 2012
Im Jahr 2012 wurde unter Verwendung von µ-Slides
ein mikroskopierfähiges Zellkultursystem aufgebaut,
das nun für Infektionsversuche zur Verfügung steht.
Die Verwendung von adhärenten J774 Makrophagen
erwies sich im Handling um einiges besser als die
Verwendung der Makrophagenlinie THP-1. Erste
Infektionen mit Francisella tularensis konnten am
Mikrokop nach Austestung von Färbungsmethoden
und unterschiedlichen Infektionszeiten festgehalten
werden.
Ergebnisse 2013
Mittlerweile wurden zwei voneinander unabhängige
Methoden etabliert, um die Infektionsverläufe
101
STAN-PROJEKT IMB-43-2003 | Infektionsepidemiologie, Immunologie & Risikoanalyse
Monitoring der humoralen und zellulä ren Immunantwort nach subklinischen B-Expositionen sowie immunprophylaktischen Maßnahmen
♦ STAN-Unterprojekt 43-2003-02
Seroepidemiologische Studien zur Prävalenz Med B-Schutz-relevanter Infektionskrankheiten
(Schwerpunkt Tularämie) bei militärischen und zivilen Populationen in Deutschland und in Einsatzgebieten der Bundeswehr (Drittmittelprojekt FKZ 1369-438 RKI-Netzwerk Zoonosen)
Fragestellung
Ziele
Zur Feststellung einer subklinischen Exposition gegen
natürlich vorkommende oder absichtlich freigesetzte
potentielle B-Agenzien in Einsatzgebieten der
Bundeswehr
existieren
gegenwärtig
keine
wissenschaftlich fundierten Richtlinien und Verfahren.
B-Agenzien können bei Exposition latente, protrahiert
verlaufende
oder
rekurrierende
Infektionen
verursachen. Zur Erkennung subklinischer Infektionen
und zum Monitoring der Immunfunktion nach
Anwendung immunprophylaktischer Maßnahmen sind
Funktionsuntersuchungen
zum
Immunstatus
notwendig. Unter B-Bedrohung müssen Einsatzkräfte
gegen seltene Krankheitserreger und potentielle BKampfstoffe durch Immunisierungen geschützt
werden. Bei den dabei eingesetzten Impfstoffen
handelt es sich zumeist um Investigational New
Drugs,
deren
Effizienz
und
Verträglichkeit
insbesondere in Verbindung mit Basisimpfungen und
Chemoprophylaxe unzureichend charakterisiert sind.
Das Projektziel ist die Entwicklung von Verfahren und
humanen in-vitro Modellen zur immunologischen
Verifizierung von B-Expositionen und zum Monitoring
der Immunantwort nach Impfung.
102
102
STAN-UNTERPROJEKT 34-2001-15 | B-Spezialdiagnostik und Hochsicherheitslabor
STAN-UNTERPROJEKT 43-2003-02 | Infektionsepidemiologie, Immunologie & Risikoanalyse
Seroepidemiologische Studien zur Prä valenz Med B-Schutz-relevanter Infektionskrankheiten (Schwerpunkt Tularä mie) bei militä rischen und zivilen Populationen in Deutschland und in Einsatzgebieten der Bundeswehr
weitere 120 Seren von Waldarbeitern aus NRW
untersucht: bei 725 Seren liegt die Seroprävalenz bei
5%.
Bearbeiter
OFA PD Dr. Splettstößer
Laufzeit
12/2011 bis 11/2013
Sachstand
Für Deutschland, die meisten europäischen Staaten
und auch für potentielle Einsatzländer liegen keine
seroepidemiologischen Daten zur Prävalenz der
Tularämie
oder
von
anderen
B-relevanten
Infektionskrankheiten vor. Die gemeldeten Zahlen zur
Inzidenz von Tularämieerkrankungen liegen in allen
Ländern deutlich unter Werten für die tatsächlich
auftretenden
Infektionen.
Damit
ist
eine
Risikobewertung für Tätigkeiten in Endemiegebieten
(Truppenübungsplätze,
Einsätze,
humanitäre
Hilfeleistungen) nicht möglich.
Zielsetzung
Es sollen zwei prospektive Studien (Risikogruppe
Waldarbeiter in Nordrhein-Westfalen; gesunde
Blutspender aus Hessen/Baden-Württemberg) zur
Ermittlung der Seroprävalenz der Tularämie
durchgeführt werden. Neben der Gesamtprävalenz
sollen die Seroprävalenzen für Subgruppen
(Regionen, Altersgruppen, Geschlechter, etc.) erfasst
und dargestellt werden.
Bewertung
Die erste Teilauswertung der Waldarbeiterstudie
liefert eine überraschend hohe Seroprävalenz, die im
Vergleich zur Normalpopulation (Wert von 2002) ca.
20fach erhöht ist. Waldarbeiter haben ein ähnliches
Risikoprofil wie Soldaten (Aufenthalt im Freien,
Exposition gegen Stechmücken, Zecken, Kontakt zu
wildlebenden
Nagern).
Im
Vergleich
zu
Untersuchungen bei Waldarbeitern in anderen
Bundesländern (z.B. Niedersachsen, Brandenburg)
ist dieser Wert aus NRW ebenfalls erhöht (2-3fach).
Ein Vergleich mit aktuellen Seroprävalenzwerten der
Normalpopulation steht noch aus.
Ausblick
Die Auswertung der erhobenen Fragebögen der
Waldarbeiterstudie und die Zuordnung zu Gruppen
mit hohem und niedrigem Risiko wird im Jahr 2013
abgeschlossen werden. Danach ist eine detailliertere
Risikoanalyse möglich. Bislang stehen noch keine
Seren aus der Blutspenderstudie zur Untersuchung
zur Verfügung. Eine endgültige Auswertung kann erst
nach Untersuchung dieser Proben erfolgen.
Methoden
In 2012 erfolgte die Ausplanung der umfangreichen
Studie mit 8.000 Seren des Blutspendedienstes des
Deutschen Roten Kreuzes in Hessen/BadenWürttemberg. Im Labor erfolgte die Untersuchung
von 605 Seren von Waldarbeitern aus NordrheinWestfalen (NRW) mittels Screening-ELISA und
mittels Immunoblot zur Bestätigung positiver Seren.
Ergebnisse 2012
Bei der Untersuchung der Waldarbeiterseren aus
verschiedenen Landkreisen des Bundeslandes NRW
waren 24 von 605 Seren positiv für Antikörper gegen
F. tularensis. Damit liegt die Seroprävalenz in dieser
Risikopopulation bei etwa 4%.
Ergebnisse 2013
Die in 2013 vorgesehene Untersuchung der Seren
gesunder Blutspender konnte nicht durchgeführt
werden, da das Probenmaterial vom Projektpartner
noch nicht bereitgestellt wurde. Es wurden noch
103
STAN-PROJEKT IMB-44-2005 | Infektionsepidemiologie, Immunologie & Risikoanalyse
Immundiagnostik potenzieller B-Kampfstoffe
und relevanter spezi;ischer Antikö rper
♦ STAN-Unterprojekt 44-2005-02
Entwicklung eines proteinbasierten Immunoblotsystems zur Serodiagnostik der Tularämie
Fragestellung
Ziele
Bestimmte potentielle B-Agenzien verursachen
zumeist schwere Erkrankungen, die mangels
rechtzeitiger Diagnostik und damit Therapie häufig
letal verlaufen. Die Verbesserung der rechtzeitigen
Erkennung
ist
zwingend
notwendig.
Zur
Gewährleistung
der
ständig
verfügbaren
Spezialdiagnostik von B-Gesundheitsstörungen sind
standardisierte, valide immunologische Verfahren
erforderlich. Derzeit sind nur für wenige potentielle BAgenzien kommerzielle Immundiagnostika erhältlich.
Auch sind diese Verfahren nicht in allen Fällen
ausreichend klinisch validiert.
Das Projekt hat die Entwicklung von Verfahren, die
Bereitstellung und Evaluierung von In-house Tests bis
zur Zertifizierung und Validierung käuflicher
Testsysteme unter Nutzung der Serum- und
Antigenbank des Instituts sowie von anderen
Probenmatrizes zum Gegenstand.
104
104
STAN-UNTERPROJEKT 34-2001-15 | B-Spezialdiagnostik und Hochsicherheitslabor
STAN-UNTERPROJEKT 44-2005-02 | Infektionsepidemiologie, Immunologie & Risikoanalyse
Entwicklung eines proteinbasierten Immunoblotsystems zur Serodiagnostik der Tularä mie
Positivseren
(50%)
von
Tularämiepatienten
nachweisen. Bei den negativen Kontrollseren zeigte
sich keine Reaktion.
Bearbeiter
OFA PD Dr. Splettstößer
Laufzeit
12/2012 bis 11/2013
Sachstand
Eine verlässliche Tularämiediagnostik ist notwendig
um eine adäquate, sicher wirksame Antibiotikatherapie einzuleiten. Der Nachweis spezifischer
Antikörper ist eine der Hauptsäulen zur Bestätigung
klinischer Verdachtsfälle. Alle bislang verwendeten
Testsysteme verwenden spezifisches LPS-Antigen
von F. tularensis, das allerdings folgende Nachteile
aufweist: Keine Redundanz/keine Bestätigung durch
alternatives Antigen; fehlende Antikörper-Produktion
gegen LPS in einigen Patienten (~ 1%), mögliche
Kreuzreaktionen mit anderen bakteriellen Infektionen
(Brucellose), Lücke bei Infektionen mit F. tularensis
novicida, F. hispaniensis oder anderen FrancisellaSpezies (hier liegt eine andere LPS Konformation
vor). Auch eine Unterscheidung von geimpften
Personen und an Tularämie erkrankten Personen ist
zurzeit nicht möglich.
Zielsetzung
Ziel des Projekts ist die Identifizierung alternativer
immunogener Antigene für die Tularämiediagnostik
(diagnostische Protein-Antigene, Epitope), die u.a.
eine
Assayentwicklung
mit
höchstmöglicher
Sensitivität und Spezifität durch Kombination
mehrerer Antigene und Umsetzung in einen LineAssay ermöglichen.
Ergebnisse 2013
Im Jahr 2013 wurden 8 weitere Proteine identifiziert,
die als Ziel der humoralen Immunantwort in der
Literatur
beschrieben
sind.
Diese
wurden
rekombinant hergestellt und auf ihre Reaktivität mit
F. tularensis positiven und negativen Seren hin
untersucht. Nur die Proteine Catalase/Peroxidase
(Spezifität: 96%; Sensitivität: 90%) und GroES
(Spezifität:
44%;
Sensitivität:
84%)
zeigten
befriedigende Ergebnisse bei der Testung mit 50
Seren je Gruppe.
Bewertung
Speziell das Protein Catalase/Peroxidase könnte die
Serodiagnostik von Francisella tularensis erweitern.
Da die Antikörperbildung gegen Proteinantigene von
Francisella tularensis variabel ist und das LPS das
immundominante Antigen darstellt, sollte der
proteinbasierte Test nur zur Bestätigung der
Ergebnisse der LPS-basierten Testergebnisse
verwendet werden. Zur Erhöhung der diagnostischen
Aussagekraft ist die Kombination mit weiteren
Proteinantigenen notwendig.
Ausblick
Zur
endgültigen
Assayentwicklung
ist
die
Identifizierung weiterer Proteinantigene notwendig,
damit durch deren Kombination die Sensitivität und
Spezifität des Assays erhöht werden kann.
Methoden
Aufgrund der geringen Laufzeit im Berichtszeitraum
2012 konnte nur ein Proteinantigen untersucht
werden. Hierbei handelte es sich um das
rekombinant hergestellte Enzym Gamma-GlutamylTranspeptidase (GGT), das von einem Kooperationspartner (TU München) zur Verfügung gestellt wurde.
Die Eignung des Enzyms wurde nach Vorversuchen
zur
optimalen
Einstellung
der
Parameter
(1) Proteinkonzentration, (2) Serumverdünnung,
(3) Konjugatverdünnung, (4) Blockbedingungen mit
jeweils 10 definierten Positiv- und NegativKontrollseren getestet.
Ergebnisse 2012
Antikörper gegen GGT ließen sich bei 5 von 10
105
STAN-UNTERPROJEKT 34-2001-15 | B-Spezialdiagnostik und Hochsicherheitslabor
DRITTMITTELPROJEKT FKZ1369-372 | Infektionsepidemiologie, Immunologie & Risikoanalyse
Verbesserung der Schnelldiagnostik fü r Infektionen mit Francisellatularensis und Bereitstellung einer interaktiven InternetPlattform zur molekularen Epidemiologie der Tularä mie
Miprolab, Deutschland) mit 23 verschiedenen
Francisella Isolaten und 10 klinisch relevanten
Bakterienspezies untersucht.
Bearbeiter
OFA PD Dr. Splettstößer
Laufzeit
01/2012 bis 12/2012
Sachstand
Durch
die
Entwicklung
und
Evaluation
unterschiedlicher
immunologischer
Verfahren
(ELISA, Western Blot, serologischer Schnellnachweis) konnten wir auch in Deutschland die
Serodiagnostik der Tularämie deutlich verbessern. In
Kooperation mit industriellen Herstellern wurden
diese Tests größtenteils zu heute kommerziell
erhältlichen CE-konformen-Testkits weiterentwickelt.
Während die klinisch-mikrobiologische Labordiagnostik mit Hilfe der o. g. Methoden in stationären
Einrichtungen zuverlässig durchgeführt werden kann,
stehen
für
Ausbruchsuntersuchungen,
bzw.
Umgebungsuntersuchungen
keine
validierten
Verfahren zur Verfügung. Publizierte Erfahrungen
aus Ausbruchsuntersuchungen in den letzten Jahren
zeigen jedoch, dass es besonders zur Einleitung
früher therapeutischer und präventiver Maßnahmen
äußerst wünschenswert ist, vor Ort anwendbare
Schnellmethoden zur Tularämiediagnostik einsetzen
zu können.
Zielsetzung
Im Rahmen der Projektlaufzeit sollen zwei
verschiedene, diagnostische Verfahren validiert und
anhand klinischer Proben aus Deutschland und der
Türkei weiter evaluiert werden. Hierbei handelt es
sich um einen serologischen Schnellnachweis
(Lateral Flow-Assay) zum Nachweis spezifischer
Antikörper gegen F. tularensis-spezifische-Antigene.
In einem zweiten, technisch vollkommen neuen
Kombinationsverfahren
soll
ergänzend
ein
Schnellverfahren
zum
immunologischen
und
molekularbiologischen Schnellnachweis von F.
tularensis entwickelt werden.
Ergebnisse
Der serologische Schnelltest erwies sich als 100%
sensitiv (25/25 Proben positiv), zeigte jedoch drei
falsch positive Ergebnisse bei 20 untersuchten
Negativseren vom Menschen (Spezifität 85%). Die
beiden Antigentests zeigten eine 100% Sensitivität
und Spezifität in Bezug auf die Identifikation von
Francisella tularensis (Typ A, Typ B, Subspezies
mediasiatica). Beide Tests waren in Bezug auf
Geschwindigkeit, Auswertbarkeit und Detektionslimit
vergleichbar.
Bewertung
Der erstmalig verfügbare, CE-gekennzeichnete
Schnelltest zur serologischen Diagnostik der
Tularämie scheint als Screening-Verfahren geeignet
zu sein. Allerdings war die getestete Probenzahl mit
25 gering. Gleiches gilt für die Spezifitätstestung, die
nur befriedigende Ergebnisse lieferte. Die beiden
angebotenen Antigenschnelltests sind für die
schnelle
Identifikation
von
humanpathogenen
Francisella tularensis-Stämmen geeignet. Ein
Direktnachweis aus klinischen Proben oder
Umweltmaterial erscheint aufgrund des unzureichenden Detektionslimit (Nachweis ab ca. 106 KBE/
ml) allerdings nur eingeschränkt möglich zu sein.
Ausblick
In einer Studie mit 1000 Humanseren aus 5
Einsendejahren an das Konsiliarlabor für Tularämie
soll der kommerzielle Schnelltest im direkten
Methodenvergleich (ELISA, Immunoblot) validiert
werden, um ggf. den Screening-ELISA aus Zeit- und
Kostengründen ersetzen zu können.
Methoden
Mit den Projektmitteln konnten kommerzielle
Schnelltestkits („Virapid Tularemia CE“, Fa. Vircell,
Spanien) in einer Pilotstudie untersucht werden.
Hierzu wurden 45 Humanserumproben und 20
Tierseren untersucht. Zusätzlich wurden 50
kommerziell erhältliche Testkits zum Direktnachweis
von F. tularensis (HHTK Tularemia BioThreat Alert®,
Fa. Tetracore, USA; HHTK Miprotect Tularemia, Fa.
106
STAN-UNTERPROJEKT 34-2001-15 | B-Spezialdiagnostik und Hochsicherheitslabor
DRITTMITTELPROJEKT 13-N-11326 | Infektionsepidemiologie, Immunologie & Risikoanalyse
Au;bau eines real-time PCR-basierten Testkits zur Point-ofCare Diagnose sicherheits-relevanter Erreger (B-PathogenPanel)
Bearbeiter
OFA PD Dr. Splettstößer
und Brucella spp. etabliert und auf der 480 LC- und
einer neuen Plattform (LC Nano) getestet.
Laufzeit
01/2011 bis 12/2012
Ergebnisse
Es wurden PCR-Protokolle für je zwei Targets pro
Organismus plus eine interne Kontrolle etabliert,
optimiert und im LC480-Format in Serum nach FDAVorgaben validiert. Es wurden PCR-Protokolle zur
Detektion einer Ciprofloxacin-Resistenz in allen
Organismen sowie einer Rifampicin-Resistenz in
Brucella etabliert. Zudem wurde ein Protokoll zur
sicheren Inaktivierung und schnellen DNA-Extraktion
aus Nasenabstrichproben entwickelt.
Sachstand
Bei Verdacht auf Ausbringen von bzw. Infektion mit
sicherheitsrelevanten Erregern, insbesondere bei
einem vermuteten Terroranschlag, sollte die
Probennahme und Diagnostik direkt vor Ort von
Sicherheits- und Rettungskräften durchgeführt
werden können. Hierbei sollte eine rasche
Inaktivierung des potentiell hochinfektiösen Materials
bei gleichzeitiger Konservierung der für die
molekularbiologischen Identifizierung benötigten DNS
-Strukturen erfolgen. Bisher fehlen dafür einfache,
sichere und ausreichend evaluierte Verfahren.
Zudem ist eine schnelle und eindeutige Identifikation
des Erregers und die Ausgabe einer gesicherten
Therapie- bzw. Prophylaxe-Empfehlung essentiell für
die Überlebenschancen der infizierten Person(en).
Da die Anwendung gentechnisch manipulierter oder
multiresistenter Bakterienstämme nicht auszuschließen ist, sollte die Diagnostik neben der
primären Identifikation zukünftig auch eine rasche
Erkennung von Antibiotikaresistenzen beinhalten.
Bewertung
Da ein Prototyp der Testplattform des industriellen
Partners (FritzBiochem) noch nicht zur Verfügung
stand, konnte diese Testplattform nicht untersucht
werden. Ersatzweise wurde ein kleines mobiles Gerät
der Fa. Roche (LC Nano) beschafft und es konnte
gezeigt werden, dass sich die Protokolle auf diese
Plattform rasch übertragen lassen.
Ausblick
Das Projekt wurde planmäßig zum Jahresende
abgeschlossen.
Zielsetzung
Ziel ist die Entwicklung einer Gesamtlösung, die die
drei
zentralen
Aspekte
„Probennahme“,
„multiparametrische
Real-time
PCR“
und
„Resistenzbestimmung“ adressiert. Bei optimalem
Projektverlauf ist eine einfache und sichere
Probennahme, ggf. mit Vordiagnose vor Ort, möglich.
Der Versand an die zuständigen Speziallabore zur
Befundbestätigung und weiteren Analytik kann bei
Raumtemperatur erfolgen und die primäre Diagnostik
liefert neben dem eingesetzten Erreger auch
genotypische Resistenzmuster für eine gesicherte
Therapie- oder Prophylaxe-Empfehlung.
Methoden
DNA-Referenzproben von je 20 Stämmen aller
Targetorganismen und 40 weiterer klinisch relevanter
Bakterien wurden nach qualitätsgeprüfter Herstellung
einem Vergleich nach Lagerung unter verschiedenen
Bedingungen (-80°C in TE-Puffer; Spotten auf FTAKarten und Lagerung bei RT) unterzogen. Mit diesem
Ausgangsmaterial wurden real-time PCR Protokolle
für F. tularensis , B. anthracis, Y. pestis, C. burnettii
107
Abteilung fü r B-Spezialdiagnostik
und Hochsicherheitslabor
Die Abteilung für B-Spezialdiagnostik und Hochsicherheitslabor ist für den gesetzeskonformen
Betrieb des BSL3-Labors incl. der Überprüfung der
Funktion zahlreicher technischer Schutzeinrichtungen,
für die Unterweisung des Personals, sowie für die
Versorgung mit persönlicher Schutzausstattung und
Einmalartikeln für den BSL3-Betrieb verantwortlich.
Von ca. 45 Zutrittsberechtigten wurden mehr als
3.000 Arbeitsstunden im BSL3-Labor geleistet.
Die anwendungsorientierte Forschung der TE040
beschäftigt sich mit Fragen der Diagnostik,
Epidemiologie und Biotypisierung von Bacillus
anthracis, Coxiella burnetii und Orthopockenviren.
Personell wurde die TE040 durch zwei Tierärztinnen
verstärkt, die im Rahmen ihrer jeweiligen
Doktorarbeiten Antibiotikaresistenzen bei B. anthracis
und Methoden der Biotypisierung von C. burnetii
untersuchten.
Aus aktuellem Anlass war im Frühjahr 2012 die
Expertise der TE040 auf dem Gebiet der
Biotypisierung von B. anthracis gefordert. Lesen Sie
im Beitrag „Milzbrand, Heroin und Bundeswehr“,
welche Fragestellungen hier zu lösen waren. Die
Arbeiten mit Sequenzdaten von Orthopockenviren
(OPV) zeigen, dass Kuhpockenviren wohl den
Vorfahren der OPV (incl. des Variolavirus) am
nächsten kommen, überraschenderweise sind sie
108
jedoch genetisch außerordentlich heterogen und
zeigen auch in vivo große Unterschiede in ihrer
Virulenz (siehe freie Berichte). Die Arbeiten zum
Schwerpunkt Coxiella burnetii/ Q-Fieber beschäftigten
sich mit einem genomischen Marker, der sowohl eine
Relevanz für die akute Erkrankungsform besitzt als
auch phylogenetisch wichtige Variationen in Form von
mikroevolutionären Prozessen zeigt. Erstmals gelang
es unserer Arbeitsgruppe diese Zusammenhänge und
die Bedeutung dieser genetischen Unterschiede
innerhalb verschiedener Coxiellenpopulationen aufzuzeigen und zu interpretieren (siehe freie Berichte).
Arbeiten der Anthrax-Gruppe im Rahmen eines
Drittmittelprojekts zeigten erstmalig die rasche
Inaktivierung von DNS-Viren, hier Affenpocken- und
Vacciniaviren, durch metallische Kupferoberflächen
(siehe Drittmittelprojekt).
Ein Sonderforschungsprojekt zum Nachweis verschiedener Erreger in Nagern, die im Camp Mazar-e
Scharif in Afghanistan gefangen wurden, wurde TEübergreifend bearbeitet. Erfahren Sie im Bericht
„Sonderforschung“, ob die Erreger „Pest & Co“
nachweisbar waren. Der wissenschaftliche Output der
Abteilung in den Jahren 2012 und 2013 spiegelt sich
in 15 (peer-reviewed) Publikationen, in 5 Buchbeiträgen sowie in 31 Vorträgen und 18 Postern auf
internationalen Fachtagungen wieder.
Kuhpockenviren zeigen ü berraschend große
Unterschiede in der Virulenz
Im Gegensatz zu anderen Orthopockenviren sind
Kuhpockenviren genetisch weitaus heterogener
als bislang angenommen. Unbekannt ist, ob die
bislang nur für den Referenzstamm Brighton
bekannten in vivo Eigenschaften repräsentativ
sind. Daher wurde die Virulenz von 5 genetisch
verschiedenen
Kuhpockenviren
in
einem
Mausmodell vergleichend untersucht. Dabei
fanden sich überraschend große Unterschiede.
Um die Frage der Heterogenität auf eine breitere
Basis zu stellen, wurden in Kooperation mit dem
WHO Referenzlabor für Pocken am CDC in Atlanta
die Genome von 10 Kuhpockenviren sequenziert.
Mittels phylogenetischer Untersuchungen konnten wir
zeigen, dass Kuhpockenviren in mindestens 2
Gruppen unterschieden werden können, die auch als
eigene Spezies definiert werden könnten (CARROLL
D ET AL., PLOSE ONE, 2011).
Kuhpockenviren kommen in Eurasien vor und sind
seit langem als Zoonoseerreger bekannt. Sie werden
taxonomisch
als
eine
Spezies
im
Genus
Orthopockenvirus (OPV) geführt. Wie man heute
weiß, sind - im Gegensatz zur Bezeichnung - Kühe
nicht das Reservoir dieser Viren, vielmehr sind Kühe,
Menschen, Katzen und Zootiere Endglieder einer
Infektkette, die ihren Ursprung in Nagern hat. Welche
Nagerspezies das sind und welche Auswirkung eine
Kuhpockenvirus-Infektion
auf
verschiedene
Nagerspezies hat, darüber ist kaum etwas bekannt.
Durch vergleichende Sequenzierung einzelner Gene
weiß man jedoch seit längerem, dass Kuhpockenviren
sehr viel heterogener sind als andere Spezies im
Genus OPV.
In Abbildung 1 sind die beiden Gruppen von
Kuhpockenviren in grau hinterlegt: eine Gruppe
(Vaccinia-like), zu der auch die Vacciniaviren gehören
und eine Gruppe (Cowpox-like), zu der nur
Kuhpockenviren gehören. Unsere Untersuchungen
verdeutlichen aber auch, dass eine weitere
Unterteilung in bis zu 5 Gruppen möglich ist. Diese
Ergebnisse stehen im Widerspruch zur bestehenden
Taxonomie,
die
alle
Spezies
im
Genus
Orthopockenvirus als monophyletisch ansieht. Die
Tatsache, dass Vacciniaviren und geographisch
definierte Kuhpockenviren in einer gemeinsamen
Gruppe
zusammengefasst
sind,
läßt
die
Schlussfolgerung zu, dass das Impfvirus nicht in
England, sondern vermutlich in Osteuropa seinen
Ursprung aus einem Kuhpockenvirus hatte.
Abbildung 1: Phylogenetische Untersuchung verschiedener Kuhpocken- und Vacciniaviren. Für das Alignment wurden die kodierenden
Bereiche zwischen dem C23L und dem B29R Gen verwendet (siehe CARROLL D ET AL., PLOSE ONE, 2011). Grau hinterlegt sind die beiden
Gruppen Vaccinia-like (zu der auch die Vacciniaviren gehören) und Cowpox-like, die nur aus Kuhpockenviren besteht. Untersucht wurden die 5
Kuhpockenvirus-Stämme CPXV-GER-1980-EP4 (cluster 1), CPXV-GER1991-3 (cluster 2), CPXV-BR (cluster 3), CPXV-FIN2000-MAN und
CPXVAUS1999-867 (cluster 5). Nicht dargestellt, aber zum cluster 5 gehörend, der hier untersuchte Vacciniavirus Stamm WR.
109
Abbildung 2A: Mortalität und Änderungen im Körpergewicht von 5
Wochen alten NMRI Mäusen, die intranasal mit 5 genetisch
verschiedenen Kuhpockenviren (CPXV) und einem Vacciniavirus
(VACV) infiziert wurden.
Abbildung 2B: Angegeben sind die Titer an vermehrungsfähigem
Virus (in pfu pro Gramm Lungengewebe), die nach 4 Tagen
(schwarze Kreise) bzw. nach 7 Tagen (offene Kreise) ermittelt
wurden.
In weiteren Untersuchungen wurden in vivo und in
vitro Eigenschaften von 5 genetisch verschiedenen
Kuhpockenviren ermittelt (DURAFFOUR S ET AL.,
PLOSE ONE, 2012). In die Untersuchungen
einbezogen war auch der Referenzstamm Brighton,
der in fast allen bisher publizierten in vivo
Experimenten verwendet wurde. Im Wachstumsverhalten in der Zellkultur waren keine Unterschiede
zwischen den 5 Viren erkennbar. Jedoch wiesen die
Viren in einem intranasalen Infektionsmodell (5
Wochen
alte
NMRI
Mäuse)
beträchtliche
Unterschiede in der Mortalität auf. Diese reichte von
0% (2 Stämme) über 20% (2 Stämme) bis hin zu
100% beim Stamm Brighton und auch bei einem
bekannt Maus-pathogenen Vacciniavirus (siehe
Abbildung 2A).
Nagerspezies spezialisiert? Ist dann die Spezies
Maus gar nicht das Reservoirtier für den Stamm
Brighton? Muß man folgern, dass ein Kuhpockenvirus
in „seiner“ jeweiligen Nagerspezies nur eine geringe,
in einer anderen Nagerspezies aber sehr wohl eine
deutlich höhere Virulenz zeigen könnte? Hierzu sind
weitere
Untersuchungen,
insbesondere
mit
Kuhpockenviren aus Nagern, erforderlich.
Abbildung 3: Hautläsionen verursacht durch Infektion mit Kuhpockenvirus
Die Schwere der Erkrankung korrelierte mit einer
Abnahme des Körpergewichts, der Anzahl an viralen
Genomen in verschiedenen Organen (mittels
quantitativer PCR ermittelt; Daten nicht gezeigt) und
dem Virustiter (pfu) in der Lunge (siehe Abbildung
2B). Hier konnten bei den schweren Verläufen Titer
von 10*6 ermittelt werden, im Fall von GER 91-3
wurde jedoch auch nach 7 Tagen kein
vermehrungsfähiges Virus gefunden.
Unsere
Untersuchungen
beweisen,
dass
Kuhpockenviren nicht nur genetisch unterschiedlich
sind, sondern auch beträchtliche Unterschiede in ihrer
Virulenz aufweisen. Ob der vor über 80 Jahren
isolierte und über viele Passagen vermehrte Stamm
Brighton mit seiner hohen Virulenz die Spezies
Kuhpockenvirus repräsentiert, ist daher fraglich. Denn
welchen evolutionären Sinn macht es, ein potenzielles
Reservoirtier rasch sterben zu lassen? Oder haben
sich einzelne Kuhpockenviren im Laufe der Zeit –
ähnlich wie Hantaviren - auf verschiedene
110
Danksagung: Mein Dank gilt den amerikanischen
und belgischen Kooperationspartnern, allen voran
Sophie Duraffour vom Rega Institute in Leuwen,
Belgien (Leitung Robert Snoeck) sowie Darin Carroll
vom WHO Reference Center for Smallpox, Atlanta,
USA (Leitung von Inger Damon). Ohne die tatkräftige
Unterstützung könnte ich diese Daten nicht
präsentieren.
Milzbrand, Heroin und Bundeswehr:
Genetische Untersuchungen zu einem neuen Ausbruch von Injektionsmilzbrand in Heroinkonsumenten
Wie bereits vor zwei Jahren in England und
Deutschland kam es im Jahr 2012 erneut zu
Milzbranderkrankungen bei Heroinkonsumenten
in Europa, ausgelöst vermutlich durch Injektion
von Heroin, das mit Bacillus anthracis-Sporen
kontaminiert
war.
Molekulargenetisch-bioforensische Untersuchungen zweier bayerischer
Stämme des aktuellen Ausbruchsgeschehens
zeigten, dass diese sehr nahe mit dem
Ausbruchsstamm aus den Jahren 2009/10
verwandt sind.
Der Milzbranderreger Bacillus anthracis ist weltweit
verbreitet und löst eine meist tödliche Zoonose bei
Huftieren und Menschen aus. In Industrienationen tritt
Milzbrand selten auf, der Erreger hat aber große
Bedeutung in Bezug auf Biokriminalität und
Bioterrorismus. In den Jahren 2009/10 wurde über
den bis dato unbekannten „Injektionsmilzbrand“
berichtet; er wird bei Drogenkonsumenten durch
Heroin ausgelöst, das vermutlich mit B. anthracisSporen kontaminiert ist. Insgesamt hatten sich in
England und im Raum Aachen 89 Heroinkonsumenten infiziert, 19 davon verstarben. Am
Injektionsort entwickelte sich eine entzündliche
Weichteilinfektion
mit
stark
ausgeprägter
Ödembildung
und
nekrotisierender
Fasziitis.
Problematisch war die differenzialdiagnostische
Abgrenzung zu anderen Haut- oder Weichteilinfektionen.
Unklar war damals, ob das Heroin absichtlich
verunreinigt worden war, oder ob es eine andere,
natürliche
Erklärung
gibt.
Typisierungsuntersuchungen in England und den USA ergaben,
dass es sich weder um bekannte noch um in BWaffenprogrammen verwendete Stämme handelte.
Abbildung
1:
Klinischer
Injektionsmilzbrand.
Vielmehr ist es ein neuer genetischer Typ, dessen
nächste natürliche Verwandte in der Türkei
vorkommen. Da in Afghanistan 90% des weltweit
gehandelten Heroins produziert wird, vermutet man,
dass es beim Schmuggel in Kontakt mit Sporenhaltigen Materialien kam. Heroin wird häufig mit
Knochenmehl „gestreckt“ oder Tierhäute werden zum
Schmuggeln benutzt.
Fälle von Injektionsmilzbrand waren beginnend in
Dezember 2009
bis Oktober 2010 beobachtet
worden. Überraschend kam es von Juni-Dezember
2012 erneut zu zehn Fällen (5 verstarben) in
Deutschland, Dänemark, Frankreich und England. In
einer Regensburger Klinik wurden kurz nacheinander
zwei Drogenkonsumenten aufgenommen, von denen
der erste an einer Milzbrand-Sepsis verstarb. Die
zweite Patientin überlebte dank einer hoch-dosierten
Antibiotikabehandlung kombiniert mit operativem
Entfernen von Weichteilregionen an Bein und Körper
(siehe Abbildung 1). Blutkulturen zeigten Wachstum
von Gram-positiven Stäbchen, die Kollegen der
Universität Regensburg als B. anthracis identifizierten.
Am InstMikroBioBw war die isolierte DNA im PCRNachweis positiv für den chromosomalen B. anthracis
-spezifischen Marker dhp61 und die Plasmidspezifischen Virulenz-Marker pagA sowie capC. Das
genotypische Profil der B. anthracis-Stämme wurde
identifiziert (Grunow R., et al., Dtsch Arztebl Internat.,
2012; Holzmann T et al., Euro Surveill., 2012). Neben
der Analyse 31 hochvariabler Marker wurden auch 25
hochspezifische
Einzelnukleotid-Polymorphismen
(SNPs) aufgeklärt (siehe Abbildung 2,3) und die
Gesamtgenomsequenz eines Stammes bestimmt
(Rückert C et al., J Bacteriol., 2012). Der bayerische
Stamm weist ein sehr ähnliches genotypisches
Phlegmonöser
Weichteilbefund mit ausgedehnten Nekrosen und Blasenbildung im
Bereich des linken Oberschenkels bei einer 40-Jährigen nach
Injektion von wahrscheinlich mit Milzbrandsporen verunreinigtem
Heroin.
111
Abbildung 2: SNP-Typisierung
von B. anthracis aus
Injektionsmilzbrandpatienten.
Typisierungsschema,
das
kanonische SNPs zur Einteilung von B. anthracis-Stämmen in
Gruppen entsprechend ihrer genetischen Verwandtschaft nutzt. Die
rote Linie folgt einer immer feiner werdenden Einteilung der
Injektionsmilzbrandstämme bis zum A.Br.008/011-Genotyp.
Abbildung 3: Bioforensische SNP-Typisierung zur Trace-BackAnalyse. Ausgehend von den Ergebnissen aus Abb. 2 erfolgte eine
SNP-Feintypisierung der Injektionsmilzbrandstämme, zunächst im
Vergleich zu Stämmen aus der Türkei, dann im Vergleich zu den
Stämmen des 2009/10er Ausbruchs. Der Stern deutet an, dass alle
Ausbruchsstämme identisch in diesen SNPs sind, während andere
Stämme von der „SNP“-Linie abzweigen.
Muster auf wie ein 2009/10 in England isolierter
Stamm (siehe Abbildung 3). Damit erscheint eine
absichtliche Ausbringung unwahrscheinlich. Offen ist
die Frage, ob es zu einem wiederholten Eintrag
dieses Erregerstammes in die Drogenkette kam oder
ob es sich um alte Heroin-Vorräte handelt, die erst
jetzt wieder in Umlauf gebracht wurden (siehe
Abbildung 4).
Aktuell laufen Arbeiten mit dem Robert Koch-Institut
(Berlin) und der Northern Arizona University (USA)
112
Abbildung 4: Möglicher Ursprung des kontaminierten Heroins
und Auftreten von Injektionsmilzbrand in Europa. Vermutlich
gelangten Sporen von B. anthracis auf dem Weg vom
Hauptheroinproduzenten
Afghanistan
(blau)
zu
den
Drogenkonsumenten (Biohazard-Zeichen) auf der Schmuggelroute
(gestrichelt) in Vorderasien in das Heroin. In den rotgefärbten
Ländern kommen nah verwandte Genotypen der Injektionsmilzbrandstämme natürlich vor.
zur
Epidemiologie
und
Injektionsmilzbrandstämmen
Verwandten.
Mikroevolution
von
und ihrer nächsten
Danksagung: Dank gilt U. Reischl, T. Holzmann, W.
Schneider-Brachert und A. Niederbichler (Uni
Regensburg) für die Überlassung der zwei
bayerischen Milzbrandstämme und für Abbildung 1,
sowie allen Mitarbeitern des InstMikroBioBw, die dazu
beigetragen haben, eine leistungsfähige Genotypisierung des Milzbranderregers aufzubauen.
Variationen im adaA-Gen von Coxiellaburnetii
liefern Hinweise auf mikroevolutionä re Vorgä nge
Genomische Marker zur Unterscheidung der
akuten und chronischen Verlaufsform des QFiebers existieren nicht. Seit kurzem wird das
adaA-Gen als möglicher Akutmarker angesehen.
Mit unseren Untersuchungen zeigen wir, dass
dieses Gen keine eindeutige Zuordnung zum
akuten Q-Fieberverlauf erlaubt. Variationen und
Deletionen im Gen lassen jedoch Rückschlüsse
auf phylogenetische Vorgänge des Erregers zu.
Coxiella burnetii, der Erreger des Q-Fiebers beim
Menschen, tritt in zwei klinischen Verlaufsformen auf.
Dabei herrscht die akute Erkrankung mit über 98%
der beobachteten Infektionen eindeutig vor. Die
Symptome reichen dabei von subklinischen Verläufen
über grippale Zeichen bis hin zu atypischen
Pneumonien und Hepatitiden. Die Prognose ist
grundsätzlich sehr gut, da auch ohne antibiotische
Behandlung,
Spontanheilungsverläufe
häufig
nachgewiesen werden können. Die chronische
Verlaufsform hingegen, die meist als schwere
Endokarditis auftritt, hat aufgrund der sehr
schwierigen und anspruchsvollen Therapie eine
schlechte Prognose. Bis zu 50% der Betroffenen
versterben trotz jahrelanger Behandlung an den
Folgen der Erkrankung. Um prognostisch bessere
Aussagen und Therapieformen zu ermöglichen, ist die
Suche nach erregerspezifischen Eigenschaften für
diese so unterschiedlichen Verläufe seit Jahren ein
Schwerpunkt der Forschung. Im Jahr 2004 gelang es
Zhang et al. ein Gen zu identifizieren, welches nur in
Isolaten von akuten Verläufen nachweisbar war und
daher acute disease antigen A (adaA) genannt wurde.
In unserer Untersuchung etablierten wir zunächst
Stamm
Herkunft
CS-L35
Slowakei, 1954
CS-Florian
Slowakei, 1956
Henzerling
Italien, 1945
Herzberg
Gewebe
einen schnellen und hochspezifischen Echtzeit-PCRNachweis für dieses Gen und prüften das
Vorhandensein bei den Stämmen der institutseigenen
Sammlung. Bei den 23 humanen und 86 tierischen
Stämmen stellte sich relativ schnell heraus, dass der
Marker nicht nur auch bei chronischen Verläufen
vorkommt, sondern z. T. bei akuten Erkrankungen
negativ war (Tabelle 1). Zur Bestätigung der PCRErgebnisse wurde die gesamte Genregion in allen
untersuchten Stämmen sequenziert; dabei traten
unerwartet Variationen auf. Neben der natürlichen
Wildtypvariante wurde in etwa der Hälfte der Fälle ein
sogenannter Einzelnukleotid-Polymorphismus (SNP)
an Position 431 gefunden. Dieser kam – bis auf eine
Ausnahme – bei allen Isolaten von akuten
Q-Fieberfällen vor. Interessanterweise war dies auch
die vorherrschende Variante bei den Coxiellenstämmen aus Schafbeständen. Da diese Tierart sehr
häufig die Quelle für humane Q-Fieberausbrüche ist,
erscheint eine solche Verteilung plausibel. In sehr
seltenen Fällen wurde sogar eine direkte Verdopplung
einer 226 Basenpaar (bp) Sequenz, ein sogenanntes
Tandemrepeat festgestellt. Dieses wurde bei einem
chronischen Q-Fieberstamm, bei zwei Ziegenisolaten
sowie bei einem Schafisolat nachgewiesen. Ebenso
unerwartet war eine vollständige Korrelation des adaA
-Nachweises mit dem Plasmidtyp QpH1 von
C. burnetii.
Beide
Regionen
weisen
keine
Ähnlichkeiten in der Basenabfolge auf, die eine solche
Gleichsinnigkeit erklären könnte. Noch komplexere
Resultate wurden jedoch bei der Analyse der adaAnegativen Coxiellenstämme festgestellt. Hier konnten
nach sehr aufwändigen molekularbiologischen
Sequenzanalysen insgesamt drei Deletionstypen in
Krankheitsbild
Plasmid
adaA Genotyp
akut
QpH1
adaA
Blut
akut
QpH1
adaASNP
Blut
akut
QpH1
adaASNP
Griechenland
akut
QpH1
adaASNP
Balaceanu
Rumänien
Pneumonie
QpH1
adaASNP
Brasov
Rumänien
Pneumonie
QpH1
adaASNP
Geier
Rumänien
Pneumonie
QpH1
adaASNP
Stanica
Rumänien
Pneumonie
QpH1
adaASNP
Utvinis
Rumänien
Pneumonie
QpH1
adaASNP
290/03
Deutschland, 2003
Lunge
Pneumonie
QpH1
adaASNP
F2
Frankreich, 1991
Blut
akute Hepatitis
QpDV
Q154-del, B1
F9
Frankreich, 1992
Blut
akute Hepatitis
QpDV
Q154-del, B1
RT-Schperling
Kirgisistan, 1955
Blut
akut
QpDV
Q154-del, B1
RT 1140
Krim, Ukraine, 1954
Blut
Pneumonie
QpDV
Q154-del, B1
F1
Frankreich, 1992
Herzklappe
Endokarditis
QpRS
Q154-del, B1
F3
Frankreich, 1991
Herzklappe
Endokarditis
QpRS
Q154-del, A
F7
Frankreich, 1992
Herzklappe
Endokarditis
QpRS
Q154-del, A
Z416/96
Saudi-Arabien, 1996
Blut
Endokarditis
QpRS
Q154-del, A
F4
Frankreich, 1992
Blut
Endokarditis
QpDV
Q154-del, B1
Scurry Q217
USA, 1981
Leber
chronische Hepatitis
plasmidlos
Q212-del
F5
Frankreich, 1991
Blut
Endokarditis
QpH1
adaA
F10
Frankreich, 1992
Herzklappe
Endokarditis
QpH1
adaArep
99/3
Deutschland, 1999
Plazenta
Endokarditis, Abort
QpH1
adaASNP
113
Tabelle 1: AdaAGenotypen in Coxiella
burnetii Isolaten von
Menschen mit akuten
bzw. chronischen Verläufen.
Abbildung 1: Polymorphismus der
adaA-Genregion von C. burnetii
anhand von sieben Referenzgenomen.
Drei Deletionsereignisse resultieren
in zwei Haupttypen (Q154 und
Q212). Drei adaA-Varianten (adaA,
adaASNP und adaArep) sind
aufgrund
von
unabhängigen
Mutations-ereignissen entstanden.
Ausgehend vom Isolat Dugway sind
die Vorgänge dargestellt, die zu
diesen verschiedenen Subtypen
führen.
Zur Erstellung der Abbildung wurde
das Statistikprogramm R mit dem
Paket genoPlotR verwendet.
der adaA-Genregion identifiziert werden (s. Abbildung
1), die sich in zwei Haupttypen (Q154 und Q212Gruppe) und in eine weitere Untergruppe der Q154Variante aufgliedern lassen. Eine Zuordnung zu
akuten bzw. chronischen Stämmen ließ sich nicht
feststellen. Eine Analyse der phylogenetischen
Zusammenhänge der adaA-Varianten (s. Abbildung
2), zeigte, dass der Stamm Dugway (isoliert Anfang
der 50-er Jahre in den USA) als Vorläufer aller
untersuchten Isolate angesehen werden kann. Dies
bestätigt die Untersuchungen anderer Arbeitsgruppen, die einen solchen Zusammenhang ebenfalls
Abbildung 2: Phylogenetischer Baum mit geringstem evolutionären
Wandel (maximum parsimony) der untersuchten Stämme
einschließlich sieben publizierter Gesamtgenome. Die Länge der
einzelnen Äste korreliert mit der Anzahl der vorhandenen Mutationen.
Die Darstellung erfolgte mit R und dem APE-Paket.
114
vermutet hatten. Weiterhin lassen sich Untergruppen
bilden, die sich auch verschiedenen Plasmidtypen
(QpH1, QpRS, QpDV, QpDG und chromosmal
integriert) und sog. genomischen Gruppen (I bis VIII)
zuordnen lassen. Ergänzend lieferten unsere
Analysen Hinweise auf eine neue genomische
Gruppe IX.
Die hohe Konkordanz der drei adaA-Varianten und
die ebenfalls erstmals identifizierten Deletionsformen
der Genregion mit bereits bekannten genomischen
Gruppen sind Hinweise, dass mikroevolutionäre
Prozesse im Genom gleichartig ablaufen können.
Diese für C. burnetii neuen Erkenntnisse sind wichtig
in der weiteren Erforschung der Evolution und der
Interaktion des Erregers mit seiner Umwelt
einschließlich der tierischen Reservoire und des
Menschen. Die genotypischen Varianten lassen sich
zur bioforensischen Differenzierung des Erregers
nutzen.
Danksagung: Mein Dank gilt besonders unserer
Mitarbeiterin Frau Claudia Kahlhofer, die in geduldiger
und unermüdlicher Arbeit molekularbiologische
Analysen für das erfolgreiche Gelingen dieser Studie
geleistet hat. Herrn Prof. Dr. med Knobloch von der
Universität Lübeck danke ich herzlich für seine als
Reservist bei uns geleistete Labor-, Analyse- und
Interpretationsarbeit. Ebenfalls möchte ich mich bei
dem Bundesministerium für Bildung und Forschung
(BMBF) bedanken, das durch die Förderprojekte
01KI0731 und 01KI1001, dieses Projekt unterstützt
hat. Die kompletten Ergebnisse dieser Arbeit sind
unter http://dx.doi.org/10.1371/journal.pone.0053440
frei zugänglich publiziert.
STAN-PROJEKT IMB-31-2001 | B-Spezialdiagnostik und Hochsicherheitslabor
Diagnostik, Prophylaxe und Epidemiologie der
Orthopockenviren
♦ STAN-Unterprojekt 31-2001-05
Schnell-Genomsequenzierung von Orthopockenviren nach Extraktion von Virus-haltigem
Material zur Gewinnung viraler DNS
♦ STAN-Unterprojekt 31-2001-13
Etablierung eines PCR-basierten, feldtauglichen OPV-Nachweises sowie eines Affenpockenvirus-spezifischen Nachweises
♦ STAN-Unterprojekt 31-2001-14
Typisierung von Affenpockenvirus
♦ STAN-Unterprojekt 31-2001-15
Eignung von whole genome amplification (WGA) und/oder next generation sequencing (NGS)
zum Erregernachweis direkt aus Probenmaterial
♦ STAN-Unterprojekt 31-2001-16
Screening von DNS aus Lungengewebe von Nagern aus Südafrika auf Vorliegen von Pockenviren
Fragestellung
Ziele
Die humanpathogenen Orthopockenvirus (OPV)Spezies Variolavirus und Affenpockenvirus gelten als
potenzielle B-Kampfstoffe, die oft tödlich verlaufende
Infektionen verursachen können. Immunologisch
lassen sich Variola- und Affenpockenviren nicht
unterscheiden, dies gelingt nur mittels molekularbiologischen Verfahren, die allerdings - aufgrund der
hohen Sequenzhomologie der OPV untereinander verschiedene Genombereiche abdecken sollten. Die
Methode der Gesamtgenomsequenzierung von
Isolaten oder direkt aus klinischen Materialien zur
Lösung forensischer Fragen (auch unter Berücksichtigung von gentechnisch veränderten OPV) wird
derzeit bearbeitet, bedarf aber bioinformatischen
Know-hows. Feldmäßig einsetzbare Verfahren zur
Schnelldiagnostik sind generell verfügbar und werden
derzeit zum Nachweis von OPV umgesetzt.
Unbekannt sind die Strukturen, die das Variolavirus
humanpathogen und das Vacciniavirus apathogen
machen. Ein Ersatz für das Vaccinia-Immunglobulin
(mit einer erweiterten Indikation zur passiven PostExpositionsprophylaxe) ist nicht verfügbar, allerdings
gibt es in den USA Bemühungen, ein vielversprechendes OPV-spezifisches Virostatikum zuzulassen.
Gesicherte Erkenntnisse über die Expositions- und
Infektionsrisiken von Soldaten gegen Orthopockenviren im Auslandseinsatz werden benötigt.
Ein Ziel dieses Projektes ist die Entwicklung,
Etablierung, Evaluierung und Validierung von
Verfahren zur Früh-, Schnell- und Spezialdiagnostik
der
Orthopockenviren
sowie
zur
sicheren
Identifizierung und Differenzierung bis hin zur
forensisch verwertbaren Biotypisierung. Geeignete
antivirale Mittel und Impfstoffe sollen geprüft und
Krankheitsausbrüche und enzootisch/endemische
Lagen in Deutschland und in Einsatzregionen der
Bundeswehr aufgeklärt werden. Zudem soll das
Orthopockenvirus-Fachlabor für die Bundeswehr
betrieben werden.
115
115
STAN-UNTERPROJEKT 34-2001-15 | B-Spezialdiagnostik und Hochsicherheitslabor
STAN-UNTERPROJEKT 31-2001-05 | B-Spezialdiagnostik und Hochsicherheitslabor
Schnell-Genomsequenzierung von Orthopockenviren
nach Extraktion von Virus-haltigem Material zur
Gewinnung viraler DNS
Bearbeiter
OTV Prof. Dr. H. Meyer
Laufzeit
06/2009 bis 06/2012
Sachstand
Aufgrund der rasanten Fortschritte auf dem Gebiet
der Genomsequenzierung ist die Beherrschung
dieser Technik für eine zukünftige Diagnostik und
insbesondere Biotypisierung von Erregern essentiell.
Nur mit molekularbiologischen Methoden lassen sich
die
außerordentlich
eng
verwandten
Orthopockenviren unterscheiden.
Zielsetzung
Methodische Schwierigkeiten ergeben sich durch die
zelluläre DNS, die die Auswertung der viralen
Sequenzdaten erheblich erschwert. Daher ist
entweder eine Konzentrierung der viralen DNS bzw.
eine Abreicherung der zellulären DNS notwendig.
Beide Verfahren sollen etabliert und auf ihre
Brauchbarkeit zur Genomsequenzierung überprüft
werden.
Methoden
In 2012 wurde dieses Unterprojekt nicht bearbeitet.
Ergebnisse
In 2012 wurde dieses Unterprojekt nicht bearbeitet.
116
STAN-UNTERPROJEKT 34-2001-15 | B-Spezialdiagnostik und Hochsicherheitslabor
STAN-UNTERPROJEKT 31-2001-13 | B-Spezialdiagnostik und Hochsicherheitslabor
Etablierung eines PCR-basierten, feldtauglichen OPVNachweises sowie eines Affenpockenvirus-spezi;ischen
Nachweises
wurde daher in 2012 nicht weiter verfolgt.
Bearbeiter
OTV Prof. Dr. H. Meyer
Laufzeit
06/2009 bis 06/2012
Sachstand
Nur mit einer raschen, auf einer Echtzeit-PCR
beruhenden Diagnostik kann unmittelbar vor Ort eine
verlässliche Diagnose gestellt werden. Derzeit wird
dazu aber eine Kühl-/Gefrierkette benötigt, um die
benötigten Diagnostika zu transportieren. Daher
sollen lyophilisierte PCR-Reagenzien zum Einsatz
kommen, die es für eine Identifizierung und
Differenzierung
der
Orthopockenviren
(OPV)
allerdings noch nicht gibt. Auch ist eine
Affenpockenvirus-spezifische PCR am Institut noch
nicht etabliert.
Ausblick
In einem neuen Projekt soll zusammen mit der
TE050 und deren Sachverständnis zur Herstellung
von lyophilisierten PCR-Testen eine Nachhaltigkeit in
der Versorgung mit in house produzierten „IMB
Mixen“ für die Orthopockenvirus-Diagnostik vor Ort
erreicht werden.
Zielsetzung
Zunächst soll eine Affenpockenvirus-spezifische PCR
etabliert und anschließend validiert werden, um den
Untersuchungsgang „Orthopockenvirus-Infektion“ im
ZBD zu komplettieren. Weiterhin sollen eine
generische OPV- und eine Variolavirus-spezifische
PCR für den Einsatz vor Ort etabliert werden. Dann
soll überprüft werden, ob diese Teste auch mit
lyophilisierten Reagenzien funktionieren.
Methoden
Nach Auswahl eines Affenpockenvirus-spezifischen
PCR-Testes wurde in 2012 die bereits im Vorjahr
begonnene Validierung gemäß der QM-Vorgaben
durchgeführt.
Ergebnisse
Die im Rahmen der Validierung geforderten
Untersuchungen wurden für den Affenpockenvirusspezifischen
PCR-Test
„G2R“
erfolgreich
abgeschlossen, alle notwendigen QM-Dokumente
wurden erstellt und der Test wurde dem ZBD
übergeben.
Bewertung
Mit dem Vorliegen des Affenpockenvirus-spezifischen
PCR-Tests
konnte
eine
Fähigkeitslücke
im
Untersuchungsgang OPV geschlossen werden. Nach
wie vor unbefriedigend ist die Situation bei der
Konfektionierung von lyophilisierten OPV-PCRTesten (ready mix) durch eine Firma. Dieser Ansatz
117
STAN-UNTERPROJEKT 34-2001-15 | B-Spezialdiagnostik und Hochsicherheitslabor
STAN-UNTERPROJEKT 31-2001-14 | B-Spezialdiagnostik und Hochsicherheitslabor
Typisierung von Affenpockenvirus
Ausnahmen zeigte sich, dass die Anzahl der Repeats
für die 32 Homogenate und die daraus gewonnenen
Isolate identisch war.
Bearbeiter
OTV Prof. Dr. H. Meyer
Laufzeit
06/2011 bis 12/2012
Sachstand
Die humanpathogenen Orthopockenvirus-Spezies
Variolavirus und Affenpockenvirus gelten als
potentielle B-Kampfstoffe. Derzeit gibt es - außer der
Gesamtgenomsequenzierung - keine Methode, um
die
außerordentlich
eng
verwandten
Affenpockenviren
zu
unterscheiden.
Durch
bioinformatische Untersuchung von 7 publizierten
Gesamtgenomen wurden zwei Bereiche ermittelt, in
denen sich Sequenzunterschiede zeigen. Diese
Unterschiede sind durch eine unterschiedlich hohe
Anzahl an Repeats bedingt (zwischen 10 und 48
Repeats). Diese Bereiche sind somit für eine
mögliche Differenzierung von Affenpockenviren
untereinander interessant. Daher wurden sie mit
Isolaten aus der Stammsammlung des Instituts und
mit klinischem Material näher untersucht.
Bewertung
Mit der doppelten Bestimmung der Repeats aus
Probenmaterial und daraus angezüchteten Viren
sollte die Stabilität der Repeat-Marker überprüft
werden. Es sollte ausgeschlossen werden, dass es
schon bei der Virusanzucht zu Variationen durch
fehlerhafte Aktivität der DNS-Polymerase kommt.
Dies ist offenbar nicht der Fall, da die in beiden
Untersuchungen ermittelten Repeat-Anzahlen zwar
nicht perfekt, aber doch gut übereinstimmen.
Ausblick
Mit der hier beschriebenen Methode steht ein
Verfahren zur Differenzierung der eng verwandten
Affenpockenviren zur Verfügung. Ob hiermit auch
eine geographische Zuordnung möglich ist, kann nur
durch Einbeziehung epidemiologischer Daten geklärt
werden. Eine Publikation ist in Vorbereitung.
Zielsetzung
Etablieren
einer
auf
repetitiven
Elementen
basierenden Methode zur Differenzierung der eng
verwandten
Affenpockenviren,
um
damit
epidemiologische Fragestellungen aufklären zu
können.
Methoden
Mit Primern, die die repeat-Bereiche flankieren,
wurden Amplifikate gewonnen. Nach Sequenzierung
der Amplifikate konnte über die Sequenz die Anzahl
an Repeats (ATTAG bzw. ATC) bestimmt werden.
Diese Untersuchung erfolgte mit 43 Isolaten, die von
Menschen mit Affenpockenvirus-Infektion aus
verschiedenen Provinzen der Demokratischen
Republik Kongo stammten. Zur Bestätigung wurde
die Anzahl der Repeats direkt aus der DNS des
Probenmaterials
(Vesikelflüssigkeit
bzw.
homogenisierte Hautkrusten) bestimmt.
Ergebnisse
Bei den 43 Isolaten variierte die Anzahl der Repeats
von 13 bis 71 für den ersten variablen Bereich bzw.
von 19 bis 38 für den zweiten Bereich. Für 32 der 43
Pockenfälle wurden die Repeat-Anzahlen aus
Originalmaterial
bestimmt.
Bis
auf
wenige
118
STAN-UNTERPROJEKT 34-2001-15 | B-Spezialdiagnostik und Hochsicherheitslabor
STAN-UNTERPROJEKT 31-2001-15 | B-Spezialdiagnostik und Hochsicherheitslabor
Eignung von whole genome ampli;ication (WGA) und/oder next
generation sequencing (NGS) zum Erregernachweis direkt aus
Probenmaterial
Bearbeiter
OTV Prof. Dr. H. Meyer
Laufzeit
01/2012 bis 12/2013
Sachstand
Mittels einer Erreger-spezifischen Diagnostik werden
nur die Erreger erfasst, die exakt über die bekannten
Nachweisstrukturen verfügen. Bekannte Erreger mit
Mutationen/Deletionen oder gar „neu“ auftretende
Erreger werden nicht nachgewiesen. Daher haben
ungezielte diagnostische Verfahren, wie die
Elektronenmikroskopie und die Erregeranzucht nach
wie vor Bedeutung. Oftmals liegt aber nur wenig
Untersuchungsmaterial vor, um alle erforderlichen
Untersuchungen durchführen zu können. Abhilfe
könnte hier eine ungezielte Nukleinsäureamplifikation
(whole genome amplification) schaffen, die so hohe
DNS-Mengen aus Probenmaterial generiert, dass
damit
eine
Gesamtgenomsequenzierung
durchführbar ist. Der Abgleich der erhaltenen
Sequenzdaten mit Datenbanken lässt dann eine
Erregeridentifizierung zu. Dieses Verfahren ist am
Institut derzeit nicht etabliert.
Zielsetzung
Etablieren eines Verfahrens, um direkt aus
Probenmaterial die Nukleinsäure so anzureichern,
dass eine nachfolgende Gesamtgenomsequenzierung möglich und damit eine Diagnostik
gewährleistet wird.
Methoden
Vor 10 Jahren war klinisches Material (Krusten und
Vesikel) aus dem Kongo im Institut auf Affenpocken
und Windpocken mittels PCR untersucht worden. Es
sollten nun die Proben nachuntersucht werden, die
sich in beiden Testen als negativ erwiesen hatten.
Nach Bestimmung der Qualität und Quantität der
DNS wurden aus 12 Proben zwei Pools gebildet.
Diese wurden am RKI nach Erstellung einer DNSBibliothek
mittels
Illumina-Next
Generation
Sequencing untersucht.
zur Verfügung, die sich auch qualitativ als nur wenig
geeignet erwies. Daher wurde der Ansatz der
Genomamplifikation, der sehr hochwertige DNS
erfordert, nicht weiter verfolgt. Stattdessen wurden
nach Absprache mit dem RKI zwei DNS-pools
gebildet und daraus DNS-Bibliotheken erstellt. Nur
eine erwies sich qualitativ als mäßig geeignet.
Dennoch wurde damit ein NGS-Lauf durchgeführt,
der – bei insgesamt sehr niedriger Ausbeute –
vorwiegend humane DNS, aber auch wenige Reads
von bakteriellen Hautkeimen (Kokken) ergab.
Bewertung
Aus klinischem Probenmaterial mittels Proteinase K/
SDS-Verdau hergestellte DNS genügt zwar für einen
spezifischen Erregernachweis mittels PCR, ist aber
qualitativ
für
anspruchsvollere
Amplifikationstechniken (Whole genome sequencing und/oder
NGS) nicht oder wenig geeignet. Daher muss bei
geplanter Anwendung dieser Techniken schon bei
der Aufbereitung des klinischen Materials Wert auf
qualitativ hochwertige DNS gelegt werden.
Ausblick
Die Qualität der DNS der am Institut vorliegenden
Affenpocken- und Windpocken-negativen Materialien
ist
zu
schlecht,
um
mittels
moderner
Amplifikationstechniken
Aufschluss
über
das
Vorliegen ggf. anderer Erreger zu erhalten.
Originalmaterial liegt allerdings nicht mehr vor, mit
dem man die Untersuchung hätte wiederholen
können. Für zukünftige Untersuchungen ermöglicht
der rasante technische Fortschritt die Generierung
von Millionen von Reads (deep sequencing); damit
wird diese NGS-Technik die Methode der whole
genome
amplification
mit
nachfolgender
Sequenzierung ablösen.
Ergebnisse 2012
Im Jahr 2012 wurde das Projekt nicht bearbeitet.
Ergebnisse 2013
Von den ca. 50 Proben stand nur sehr wenig DNS
119
STAN-UNTERPROJEKT 34-2001-15 | B-Spezialdiagnostik und Hochsicherheitslabor
STAN-UNTERPROJEKT 31-2001-16 | B-Spezialdiagnostik und Hochsicherheitslabor
Screening von DNS aus Lungengewebe von Nagern aus Sü dafrika auf Vorliegen von Pockenviren
Bearbeiter
OTV Prof. Dr. Meyer
Laufzeit
05/2012 bis 09/2012
Sachstand
Die humanpathogenen Orthopockenvirus-Spezies
Variolavirus und Affenpockenvirus gelten als
potentielle B-Kampfstoffe, die oft tödlich verlaufende
Pockenvirusinfektionen verursachen. Eine eindeutige
Identifizierung dieser beiden Spezies ist für die
beiden Erreger sichergestellt. Der Nachweis von
anderen, „neuen“ Pockenviren ist damit aber nicht
möglich. Unlängst wurden in Zusammenarbeit mit
dem CDC, Atlanta, USA, zwei PCR-Teste publiziert,
mit denen generisch alle Genera der Pockenviren
nachgewiesen werden können. Diese Teste erfassen
auch das erst in 2011 beschriebene Yoka Poxvirus,
das in Zentralafrika vorkommt. Damit steht ein
Verfahren zur Verfügung, mit dem neben den
bekannten OPV-Spezies auch andere, „unbekannte“
Pockenviren nachgewiesen werden könnten.
Zielsetzung
Mit den beiden generischen Allpox-PCRs soll
überprüft werden, ob in Nagergeweben aus Südafrika
bekannte OPV-Spezies (Affenpockenvirus bzw.
Tateravirus) vorkommen oder ob mit diesen PCRs
neue Pockenviren, wie z. B. das Yoka Poxvirus,
erfasst werden können.
Hamsterratte,
Weißbauch-Nacktsohlenrennmaus,
Südliche Vielzitzenmaus und Spitzmaus in geringen
Anzahlen vertreten. Die Nager waren an insgesamt
17 verschiedenen Stellen in Südafrika gefangen
worden. Alle Proben erwiesen sich jedoch in den
PCR-Testen als negativ. Bei einer Vielzahl von
Proben traten jedoch Amplifikate auf, die allerdings in
der Größe nicht dem erwarteten Amplifikat
entsprachen und von daher als negativ anzusehen
sind.
Bewertung
Die Untersuchungen zeigen, dass in der Afrikanische
Striemen-Grasmaus offenbar keine Pockenviren im
Lungengewebe nachzuweisen sind. Hier wurde eine
hinreichend große Zahl an Nagern untersucht (478
von insgesamt 550 Nagern). Für die anderen
Nagerspezies kann das so nicht bestätigt werden, da
z.T. nur wenige Tiere einer Spezies untersucht
wurden.
Ausblick
Die Untersuchungen sind abgeschlossen. Südafrika
bleibt ein weißer Fleck auf der Landkarte der
Pockenvirus-Verteilung,
da
bekannte
Orthopockenvirus-Spezies, wie Affenpocken- und
Tateravirus, nicht gefunden wurden. In Südafrika
kommt aber auch das erst kürzlich beschrieben Yoka
Poxvirus nicht vor.
Methoden
Die Untersuchungen wurden in Zusammenarbeit mit
der
Stellenbosch
University
in
Südafrika
durchgeführt, die die Feldexpeditionen mit Nagerfang
und Speziesbestimmung, die Sektion und DNSExtraktion übernommen hatten. Am InstMikroBioBw
wurde extrahierte DNS aus Lungengewebe von 550
Nagern mit den beiden All-Pox PCR-Testen
untersucht. Die Überprüfung einer möglichen
Amplifikation erfolgte mittels Agarosegelen, ein
mitgeführter
Standard
erlaubte
eine
Größenabschätzung von Banden.
Ergebnisse
Bei den 550 untersuchten Nagern handelte es sich
überwiegend (87%) um die Afrikanische StriemenGrasmaus. Des Weiteren waren Hausmaus,
Hausratte,
Südafrikanische
Zwergrennmaus,
120
STAN-PROJEKT IMB-34-2001 | B-Spezialdiagnostik und Hochsicherheitslabor
Spezialdiagnostik, Prophylaxe und
Epidemiologie von Anthrax
♦ STAN-Unterprojekt 34-2001-15
Phänotypische und genotypische Antibiotika-Resistenztestung von Bacillus anthracis
♦ STAN-Unterprojekt 34-2001-16
Aufbau und Erweiterung einer Datenbank zur Typisierung von Bacillus anthracis
♦ STAN-Unterprojekt 34-2001-17
Aufbau eines B. anthracis-Mutagenesesystems
♦ STAN-Unterprojekt 34-2001-18
Genomvollsequenzierungen ausgewählter Bacillus-Stämme mittels in-house Ion Torrent
Technologie zur Untersuchung der genetischen Diversität
♦ STAN-Unterprojekt 34-2001-19
Untersuchung von Bodenproben aus dem Milzbrand-Hyperendemiegebiet Bangladesch
Fragestellung
Ziele
Sporen von Bacillus anthracis sind ein potenzieller BKampfstoff, der akute lebensbedrohliche Infektionen
(Inhalations- und Darmmilzbrand, Anthraxsepsis)
verursacht. Diagnostika zur Früh-, Schnell- und
Spezialdiagnostik des Milzbrands sind als validierte in
house Verfahren am Institut verfügbar. Dagegen
bedarf es noch erheblicher Entwicklungsarbeit, um
Verfahren
zum
schnellen
Nachweis
einer
Kontamination mit Anthraxsporen, zur zweifelsfreien
molekularen, biochemischen und immunologischen
Identifizierung bzw. Typisierung von B. anthracis und
zur
Bestimmung der
Antibiotikaresistenz
zu
entwickeln. Bioinformatische Methoden zur Analyse
von Vollgenomsequenzen zur Lösung forensischer
Fragen sind z. Z. im Aufbau. Impfstoffe sind in
Deutschland nicht verfügbar. Darüber hinaus werden
gesicherte Erkenntnisse über mögliche Expositionsund Infektionsrisiken für Soldaten bei Einsätzen in
Milzbrand-Enzootie/-Endemiegebieten benötigt.
Das Projekt hat die Entwicklung, Etablierung und
Evaluierung von Verfahren zur Früh-, Schnell- und
Spezialdiagnostik des Milzbrands, zur sicheren
Identifizierung und Differenzierung von Bacillus
anthracis
inklusive
bioforensisch
verwertbarer
Biotypisierung
sowie
AntibiotikaResistenzbestimmung zum Gegenstand. Daneben
sollen die präklinische Prüfung von Kandidaten für die
Immunprophylaxe/-therapie erfolgen. Die Aufklärung
von Expositionsrisiken, Krankheitsausbrüchen und
enzootisch/endemischen Lagen in Einsatzregionen
der Bundeswehr, sowie das Betreiben des AnthraxFachlabors für die Bundeswehr stellen einen weiteren
Schwerpunkt des Projekts dar.
121
121
STAN-UNTERPROJEKT 34-2001-15 | B-Spezialdiagnostik und Hochsicherheitslabor
STAN-UNTERPROJEKT 34-2001-15 | B-Spezialdiagnostik und Hochsicherheitslabor
Phä notypische und genotypische AntibiotikaResistenztestung von B.anthracis
Assays in seiner Zusammensetzung optimiert.
Bearbeiter
RDir PD Dr. Grass, OSV Dr. Hanczaruk
Laufzeit
01/2012 bis 12/2013
Sachstand
Für eine erfolgreiche Milzbrand-Therapie ist es
essentiell, schnell zu wissen, gegenüber welchen
Antibiotika der Keim empfindlich ist. In der Literatur
sind
Antibiotikaresistenzen
in
B.
anthracis
beschrieben, jedoch auf molekularer Ebene nur
wenig untersucht. Bisher gibt es keinen molekularen
Antibiotikaresistenz-Test, der jedoch für eine schnelle
Therapieempfehlung von hoher Relevanz wäre.
Zielsetzung
Ziel
ist
die
phänound
genotypische
Resistenztestung
aller
323
Stämme
der
Stammsammlung des Instituts und die Entwicklung
molekularer Schnelltests (PCR) zur Identifizierung
von Mutationen, die zur Resistenz führen.
Methoden
Zur Generierung von Positivkontrollen wurden
Antibiotikaresistenzen
in
B.
cereus
über
Passagierung
auf
Antibiotika-haltigen
Medien
induziert und die Resistenzgenorte dieser Mutanten
sequenziert. Basierend auf publizierten und eigenen
Ergebnissen wurden Primer- und Sondensequenzen
zur Etablierung von PCR-Nachweisen ausgewählt
und getestet. Ein publizierter Cefinasetest wurde
getestet und optimiert.
Ergebnisse 2012
2012 wurden alle B. anthracis Stämme des Instituts
auf Ciprofloxacin (CIP) Resistenz getestet. Da alle
Stämme sensitiv gegen CIP waren, wurde in
mehreren, unabhängigen Subklonen von B. cereus
ATCC10897 Resistenzen gegenüber CIP bis zu einer
Konzentration von 16 µg/ml induziert. Bei der
Sequenzierung
Resistenz-bestimmender
Genregionen wurde ein SNP identifiziert. Gegen
diesen und weitere SNPs, die aus der Literatur
bekannt sind, wurden Real-time PCR-Assays
entwickelt.
Der Cefinase-Test zur Verifizierung von PenicillinResistenzen in B. anthracis über den Nachweis von
ß-Lactamasen wurde erfolgreich getestet und der
Testpuffer zur Verbesserung der Sensitivität des
Ergebnisse 2013
Im Berichtsjahr wurden mehrere unabhängige
Mutanten aus 2012 weiter evolviert. Alle neun
Mutanten, die anschließend charakterisiert wurden,
hatten Minimale Inhibitor-Konzentrationen (MHK)
gegen Ciprofloxacin (CIP) von 32-256 µg/ml. Parallel
dazu wurden drei neue Mutanten auf Nalidixinsäure
(NAL)-Resistenz evolviert (MHK > 320 µg/ml).
Sequenzierung der Gene gyrA, gyrB, parC und parE
der CIP-Resistenten Mutanten ergab, dass nur eine
Mutante im gyrA-Gen an Position 254 (CàT) mutiert
war. Die genetischen Veränderungen in den anderen
Klonen sind unbekannt. In den NAL-Resistenten
erfolgten Änderungen (SNPs) in gyrA (254, CàT),
gyrB (1313, CàT) bzw. an unbekannter Stelle. Gegen
diese SNPs und solche in B. anthracis, die aus der
Literatur bekannt sind, CIP-Resistenz zu vermitteln,
wurden Real-time PCR-Assays entwickelt. Da am
InstMikroBioBw keine CIP-Resistenten B. anthracisStämme vorliegen, wurden als Templates lange
Primer mit SNP-Allelen verwendet.
Bewertung
Da
weitaus
weniger
SNPs
in
Resistenzbestimmenden Genregionen identifiziert wurden als
erwartet, konnte durch den Einsatz synthetisch
hergestellter
einzelsträngiger
DNA-Primer
als
Positivkontrollen die DURC-Problematik (Dual Use
Research of Concern, hier: Generierung CIPresistenter B. anthracis) umgangen und weitere Realtime PCR-Assays entwickelt werden. Da jedoch in
vielen der evolvierten B. cereus-Mutanten die
mutmaßlichen Änderungen außerhalb der bekannten
resistenzbestimmender Regionen erfolgten, sind die
PCR-Assays für die Diagnostik unbrauchbar.
Ausblick
Der Einsatz synthetisch hergestellter einzelsträngiger
DNA-Primer als Positivkontrollen für die Real-time
PCR hat sich zur Assay-Entwicklung bewährt und
stellt eine günstige Alternative zu Gensynthese oder
Stammerwerb dar und vermeidet DURC-Aspekte.
122
STAN-UNTERPROJEKT 34-2001-15 | B-Spezialdiagnostik und Hochsicherheitslabor
STAN-UNTERPROJEKT 34-2001-16 | B-Spezialdiagnostik und Hochsicherheitslabor
Au;bau und Erweiterung einer Datenbank zur
Typisierung von Bacillusanthracis
verwandtschaftlichen
Beziehungen
des
„Heroinmilzbrandstamms“ aufgeklärt (vgl. Highlight).
Zusätzlich wurden zwei diagnostische PCRs (pagA
und capC) für den ZBD validiert und übergeben.
Bearbeiter
RDir PD Dr. Grass, OSV Dr. Hanczaruk
Laufzeit
01/2012 bis 12/2014
Ergebnisse 2013
Sachstand
Zur Abgrenzung natürlich vorkommender MilzbrandFälle von Infektionen, die durch absichtlich
ausgebrachte Erreger ausgelöst wurden, ist eine
molekulargenetische
bioforensische
Analyse
notwendig.
Die
ständige
Erweiterung
der
Stammsammlung und die genaue Typisierung aller
Stämme bilden dafür die Grundlage für weitere
Forschung.
2013 konnte die Stammsammlung mittels der
GABRI-Methode zur Isolierung von B. anthracis um
insgesamt 13 Stämme aus Bodenproben aus
Bangladesch und Italien erweitert werden. Die
Zuordnung zu den kanonischen SNP-Gruppen sowie
die Typisierungsergebnisse für MLVA31 wurden in
die umfangreiche Datenbank mit aufgenommen, und
können nun für weitere Vergleichsanalysen genutzt
werden.
Bewertung
Zielsetzung
Ziel ist die Etablierung neuer molekularer
Nachweissysteme, die dem aktuellen Stand der
Technik genügen. In einer bioinformatischen
Datenbank sollen genotypische Daten verwaltet, zur
Identifizierung
verwendet
und
mit
Kooperationspartnern ausgetauscht werden. Für eine
umfassende bioforensische Datenbank ist auch die
Zusammenarbeit mit anderen Nationen erforderlich.
Die im Fachlabor Milzbrand erfolgreich etablierte
Melt-MAMA-Technik wird auch bei weiteren SNPUntersuchungen eingesetzt werden. Die Stämme mit
neuen Genotypen stellen interessante Kandidaten für
Gesamtgenomsequenzierungen dar. Mit der GABRIMethode ist es endlich möglich, B. anthracis auch in
Anwesenheit nahe verwandter Bacillus-Begleitflora
aus Matrizes wie Erdboden oder Stuhl zu isolieren.
Ausblick:
Methoden
Nach Etablierung der Melt-MAMA-Technik zur
Bestimmung von 19 SNPs sollen alle 323 Stämme
der
Stammsammlung
mit
dieser
Methode
durchgetestet und komplett mittels MLVA31 typisiert
werden. Durch Kooperationen auf internationaler
Ebene (EU, USA), Literaturrecherche und durch
Eigentypisierung erhaltene Daten wurden für die
Datenbank
(Bionumerics)
bioinformatisch
aufgearbeitet und eingepflegt. Die von Dr. Fasanella
entwickelte
GABRI-Methode
zum
kulturellen
Nachweis von B. anthracis aus Boden wurde am
Institut für Mikrobiologie etabliert.
Die Datenbank wird kontinuierlich bearbeitet und
erweitert werden. Die Harmonisierung der MLVAMarker mit anderen Forschungsgruppen aus dem Inund Ausland stellt dabei die größte Herausforderung
dar.
Ergebnisse 2012
Im Berichtsjahr wurden alle 310 Stämme einer der 12
Gruppen der kanonischen SNPs zugeordnet. Sowohl
bei der canSNP- als auch bei der MLVA31Typisierung wurden viele, bisher nicht bekannte
Genotypen gefunden. Mit Assays, die auf weiteren
publizierten SNPs basieren, wurden u.a. die
123
STAN-UNTERPROJEKT 34-2001-15 | B-Spezialdiagnostik und Hochsicherheitslabor
STAN-UNTERPROJEKT 34-2001-17 | B-Spezialdiagnostik und Hochsicherheitslabor
Au;bau eines B.anthracis-Mutagenesesystems
Bearbeiter
RDir PD Dr. Grass, OSV Dr. Hanczaruk
Laufzeit
01/2012 bis 12/2013
Sachstand
Untersuchungen
zur
Charakterisierung
von
Virulenzfaktoren aus B. anthracis finden z.Z. nicht
statt, was unter anderem daran liegt, dass gerichtete
Mutagenese
(Gen-Deletionen)-Techniken
am
InstMikroBioBw nicht etabliert sind. MutageneseTechniken sind allerdings für zukünftige Forschungen
mit B. anthracis relevant. Dies stellt eine
Fähigkeitslücke am Institut dar.
Zielsetzung
Ziel ist die Entwicklung eines gentechnikfreien
Gendeletionssystems für B. anthracis. Dafür wird auf
die Verwendung eines Antibiotikamarkers zugunsten
einer Selektion mittels Uracil-Auxotrophie und pyrFKomplementation verzichtet. Durch Konstruktion von
∆bshA-mutierten (Bacillithiol-Synthese-negativen) B.
anthracis-Stämmen
soll
dieser
potenzielle
Virulenzfaktor genauer charakterisiert werden.
Ergebnisse 2013
Nach der Herabstufung von vier B. anthracisStämmen auf Sicherheitsstufe BSL-2 im Januar 2013
(Beschluss 08/2012 des ABAS) wurde versucht, 5Fluoroorotat (FOA)-resistente und damit Uracilauxotrophe Mutanten zu erzeugen. Die Anzucht auf
den Selektivmedien lieferte allerdings keine
eindeutige Inhibierung des Wildtyps: bei niedrigeren
FOA-Konzentrationen
blieb
das
Wachstum
unbeeinflusst, bei höheren Konzentrationen blieb es
gänzlich aus; Mutanten entstanden nicht.
Bewertung
Da es nicht gelang, Uracil-auxothrophe Mutanten zu
generieren, war die Grundvoraussetzung für alle
weiteren, darauf aufbauenden Experimente zur
Erreichung der Projektziele nicht gegeben.
Ausblick:
Das Projekt wurde ab Mitte 2013 nicht weiter
bearbeitet, da ein Abbruchkriterium erreicht wurde.
Methoden
Zuerst wird eine 5-Fluoroorotat-resistente und damit
Uracil-auxotrophe Mutante mit Mutation im pyrF-Gen
selektiert.
Ein
lineares
PCR-Produkt
mit
randständigen, homologen Sequenzen zu einem
Zielgen (bshA) und internen Wildtyp pyrF wird durch
Cryotransformation in B. anthracis eingebracht und
auf Uracil-Prototrophie getestet. Abschließend wird
die bshA-Mutante auf Oxidative-Stress-Resistenz
getestet.
Ergebnisse 2012
Im Berichtsjahr wurden verschiedene Minimalmedium-Rezepte für B. anthracis getestet. Ein
Medium, das gutes Wachstum des Erregers erlaubt,
wurde identifiziert. Aufgrund der sich abzeichnenden
Herabstufung von vier B. anthracis-Stämmen auf
Sicherheitsstufe BSL-2 gegen Ende 2012 wurden
weitere Arbeiten am Projekt zurückgestellt, bis diese
Stämme für erleichterte Arbeiten unter BSL-2Bedingungen am InstMikroBioBw zur Verfügung
stehen (Feb. 2013).
124
STAN-UNTERPROJEKT 34-2001-15 | B-Spezialdiagnostik und Hochsicherheitslabor
STAN-UNTERPROJEKT 34-2001-18 | B-Spezialdiagnostik und Hochsicherheitslabor
Genomvollsequenzierungen ausgewä hlter Bacillus-Stä mme
mittels in-houseIon Torrent Technologie zur Untersuchung der
genetischen Diversitä t
Bearbeiter
RDir PD Dr. Grass, OSV Dr. Hanczaruk
Laufzeit
07/2013 bis 12/2015
Sachstand
Der Erreger des Milzbrands, Bacillus anthracis, und
andere hochpathogene bakterielle Erreger haben
eine klonale Populationsstruktur. Die über eine
Typisierung
weniger
Marker
hinausgehende
genomische
Charakterisierung
durch
Gesamtgenomanalyse wird in Zukunft eine
Standardmethode
werden.
In-house
Gesamtgenomsequenzierungen von B. anthracis und
verwandter Organismen finden bisher nicht statt.
Dies stellt eine Fähigkeitslücke für genaue
Rückverfolgungsund
Zuordnungsanalysen
(Attribution) solcher Erreger bei ungewöhnlichen
Ausbruchsgeschehen dar.
Zielsetzung
Neben der grundsätzlichen Etablierung der
Gesamtgenomsequenzierung für Bazillen mittels des
in-house
Ion
Torrent
Geräts
ist
die
molekulargenetische Untersuchung ungewöhnlicher
Bacillus-Stämme aus der Institutsstammsammlung
das Hauptziel dieses Projektes. Solche Stämme
besitzen z.B. sich-widersprechende genetische
Marker, verursachen milzbrandähnliche Symptome in
Patienten oder zeigen erhöhte Antibiotikaresistenz.
Ferner soll die Mikroevolution innerhalb von B.
anthracis-Stämmen
aus
Ausbruchsgeschehen
untersucht werden.
Ergebnisse
Die Gewinnung von DNA aus B. anthracis-Zellen,
deren Menge und Qualität (Fragmentlängen) über
das für PCR benötigte Maß hinausgehen, stellte eine
Herausforderung für die Genomsequenzierung dar,
da B. anthracis nicht einfach durch Ethanol inaktiviert
werden kann und Hitze die DNA hochgradig
fragmentiert. Eine Aufarbeitung unter BSL-3Bedingungen im Handschuhkasten war möglich, aber
sehr aufwändig. Die DNAs einer Reihe von BacillusStämmen der Stammsammlung wurden aus mit
Peressigsäure inaktivierten Zellen präpariert und
sollen
im
nächsten
Jahr
durch
Gesamtgenomsequenzierung charakterisiert werden.
Bisher wurden die Genome des B. anthracisTypstammes ATCC14578 (Vollum) und eines
Lysinibacillus BF-4 aus einer Kuh, die nach einem
Milzbrand-ähnlichen
Krankheitsbild
verendete,
erfolgreich sequenziert.
Bewertung
Die Verwendung von Peressigsäure (Terralin) hat
sich als geeignete Methode zur Inaktivierung von
Bacillus-Zellen und -Endosporen herausgestellt und
ist kompatibel mit einer anschließenden DNAAufreinigung mittels Affinitätssäulenchromatographie
sowie Genomsequenzierung.
Ausblick
Nachdem eine geeignete Methode für die DNAGewinnung aus Bacillus-Zellen etabliert wurde,
können im nächsten Jahr die Genomsequenzierung
wie geplant weiter durchgeführt werden.
Methoden
Für die Gewinnung größerer, qualitativ hochwertiger
DNA-Mengen aus Bacillus anthracis oder seiner
nahen Verwandten werden vegetative Zellen und
immer auch vorhandene Endosporen mittels
Peressigsäure (Terralin) inaktiviert und über
Affinitätssäulenchromatographie aufgearbeitet. Die
qualitätsüberprüfte
DNA
wird
der
in-house
Gesamtgenomsequenzierung auf einem Ion-Torrent
Gerät unterworfen und die gewonnenen Daten
bioinformatisch in Zusammenarbeit mit der
Fachgruppe
Mikrobielle
Genomik
(FMG)
ausgewertet.
125
STAN-UNTERPROJEKT 34-2001-15 | B-Spezialdiagnostik und Hochsicherheitslabor
STAN-UNTERPROJEKT 34-2001-19 | B-Spezialdiagnostik und Hochsicherheitslabor
Untersuchung von Bodenproben aus dem
Milzbrand-Hyperendemiegebiet Bangladesch
Bearbeiter
OSV Dr. Hanczaruk, RDir PD Dr. Grass
Laufzeit
11/2013 bis 05/2014
Sachstand
Prof. Ahsan vom Department für Mikrobiologie der
Universität Dhaka bat das Institut, bei der
Untersuchung
von
Milzbrandausbrüchen
im
Hyperendemiegebiet Bangladesch behilflich zu sein.
Als Hauptursache der Milzbrandfälle wurde von
Fasanella et al. (2013) der Eintrag des Erregers über
Futtermittel aus China postuliert und publiziert.
Zielsetzung
Es ist bisher noch unklar, welche Rolle der
heimische, im Boden auftretende (autochthone)
Milzbrand in den einzelnen Ausbruchsgeschehen
spielt. Nur eine zweifelsfreie Analyse potentieller
Eintragsmaterialen und der Materialen erkrankter
bzw. verendeter Tieren können Rückschlüsse auf die
wirkliche Ursache der Ausbrüche liefern.
Bewertung
Die im Fachlabor Milzbrand erfolgreich etablierte und
weiterentwickelte GABRI-Technik wird nun auch bei
weiteren Untersuchungen eingesetzt werden. Das
Institut hat damit auch einen direkten Zugang zu
aktuellen Milzbrandstämmen aus einem Hyperendemiegebiet. Gesamtgenomsequenzierungen und
weitere Untersuchungen werden einen wichtigen
Beitrag zur Mikroevolution des Erregers liefern.
Ausblick
Die Auswertung der Gesamtgenomsequenzierungen
und eine Harmonisierung der Auswertung von MLVAMarkern stellen eine Herausforderung dar. Ziel der
Harmonisierung ist es, die gewonnenen Daten mit
Angaben aus der Literatur besser vergleichen zu
können, nur so ist eine korrekte Zuordnung von
Stämmen möglich.
Methoden
Aus Umweltproben (Erde, Wasser, Futtermittel)
werden mittels der im Institut bereits etablierten und
weiterentwickelten GABRI-Methode B. anthracisStämme isoliert und mittels der klassischen
Methoden MLVA31 und canSNP molekulargenetisch
typisiert. Die Ergebnisse werden mit der Datenbank
des Instituts und mit den publizierten Daten
verglichen.
Ergebnisse
Im Rahmen einer Dienstreise konnten 50
Umweltproben aus den beiden Regionen Tangail und
Sirajganj an das Institut überführt werden. Die
Proben wurden vorwiegend an Stellen genommen,
an denen die Kadaver der an Milzbrand verendeten
Tiere entsorgt wurden. Bisher konnten aus 10
Bodenproben 6 Isolate gewonnen werden, die der
kanonischen SNP-Gruppe A.Br.001/002 zugeordnet
werden können. Diese Daten stimmen mit den 2013
von Fasanella publizierten Ergebnissen überein.
Zusätzliche Typisierungsmethoden sollen nun
weitere Hinweise auf den potentiellen Ursprung des
Erregers liefern.
126
STAN-PROJEKT IMB-35-2003 | B-Spezialdiagnostik und Hochsicherheitslabor
Diagnostik, Prophylaxe und Epidemiologie des
Q-Fiebers
♦ STAN-Unterprojekt 35-2003-16
Etablierung eines Multi-Spacer basierten Typisierungssystems (MST) für Coxiellen
♦ STAN-Unterprojekt 35-2003-17
Erweiterung des IS1111-basierten Typisierungssystems für Coxiellen
♦ STAN-Unterprojekt 35-2003-18
Entwicklung neuer genomischer Typisierungsverfahren (z.B. SNP) und Erweiterung
vorhandener Methoden um neue Marker (insb. MLVA)
♦ STAN-Unterprojekt 35-2003-20
Koordination des EDA-Panels für Coxiella burnetii
♦ STAN-Unterprojekt 35-2003-22
Aufbau, Evaluierung und Einführung elektronenoptischer Untersuchungsverfahren
für B-Agenzien
♦ STAN-Unterprojekt 35-2003-23
Anwendungsevaluation der whole genome amplification für Coxiella burnetii
♦ STAN-Unterprojekt 35-2003-24
Evaluation der zellfreien Anzucht für Coxiella burnetii und deren Eignung für Typisierungsund Sequenzierungsmethoden
Fragestellung
Ziele
Coxiella burnetii, der Erreger des Q-Fiebers, ist ein
potenzieller B-Kampfstoff. Standardisierte Verfahren
und validierte Diagnostika für die molekulare und
immunologische Identifizierung bzw. Typisierung von
C. burnetii und zur Früh-, Schnell- und
Spezialdiagnostik des Q-Fiebers sind, bis auf
kommerzielle,
CE-zertifizierte
Kits
für
den
Antikörpernachweis,
nicht
verfügbar.
Derzeit
existierende Impfstoffe sind nur begrenzt erhältlich,
nur eingeschränkt einsetzbar und verfügen über keine
gesicherten Erkenntnisse über die Dauer einer
schützenden Immunität. Gesicherte Erkenntnisse
über mögliche Expositions- und Infektionsrisiken für
Soldaten
bei
Einsätzen
in
Enzootie-/
Endemiegebieten des Q-Fiebers fehlen.
Das Projekt hat die Entwicklung, Etablierung und
Evaluierung von Verfahren zur Früh-, Schnell- und
Spezialdiagnostik des Q-Fiebers, zur Erregeridentifizierung und -differenzierung, die AntibiotikaResistenzbestimmung sowie die Aufklärung der
Erreger-Wirts-Wechselbeziehungen zum Gegenstand.
Daneben soll die präklinische Prüfung von
Impfstoffkandidaten erfolgen. Die Aufklärung von
Krankheitsausbrüchen und enzootisch/endemischen
Lagen in Deutschland und in Einsatzregionen der
Bundeswehr sowie das Betreiben eines Q-FieberFachlabors für die Bundeswehr stellen einen weiteren
Schwerpunkt des Projekts dar.
127
127
STAN-UNTERPROJEKT 34-2001-15 | B-Spezialdiagnostik und Hochsicherheitslabor
STAN-UNTERPROJEKT 35-2003-16 | B-Spezialdiagnostik und Hochsicherheitslabor
Etablierung eines Multi-Spacer basierten
Typisierungssystems (MST) fü r Coxiellen
vorhandenen Typisierungsverfahren für Coxiella
burnetii
am
Institut
und
erweitert
die
Beurteilungsfähigkeit im Schwerpunkt Q-Fieber auf
nationaler und internationaler Ebene.
Bearbeiter
OFA Dr. Frangoulidis
Laufzeit
01/2010 bis 12/2012
Sachstand
Die genotypische Beschreibung von Coxiella burnetii
ist
ein
wichtiges
Forschungsgebiet
zur
Charakterisierung und Ursachenaufklärung von
Infektionen. Die 2005 erstmals beschriebene MSTMethode eignet sich neben der Anwendung zur
Unterscheidung verschiedener Stämme auch für
epidemiologische Fragestellungen.
Ausblick
In Kooperation mit anderer Einrichtungen können
zukünftig klinische Materialien von Mensch und Tier
auf die Verteilung von ST-Genotypen untersucht
werden. Damit lassen sich epidemiologische
Zusammenhänge
des
Q-Fiebers
weiter
charakterisieren.
Zielsetzung
Etablierung der MST-Genotypisierung als Ergänzung
zu
den
bisherigen
Verfahren,
wie
Plasmiddifferenzierung,
MLVA
und
IS1111Verteilung, sowie Analyse der institutseigenen
Stammsammlung und Überprüfung des Verfahrens
an klinischen Probenmaterialien.
Methoden
9 klinische Probenpräparationen (5 vom Schaf und 4
vom Rind) wurden mit 10 MST-Markern typisiert.
Ergebnisse
Es wurde der Genotyp 18 (Sequenztyp = ST) bei den
Schafproben und der ST-Typ 20 bei den
Rinderproben gefunden. Von den insgesamt 36
verschiedenen ST-Genotypen, die bisher weltweit
nachgewiesen wurden, sind diese beiden Formen mit
am häufigsten anzutreffen. Auch die hier beobachtete
Zuordnung zur jeweiligen Tierart ist regelmäßig
anzutreffen. Der Genotyp 20 wurde darüber hinaus
fast ausschließlich auch in Rindermilchproben aus
ganz Europa gefunden.
Bewertung
Die
Arbeiten
zur
Etablierung
dieser
Typisierungsmethode
mit
Anwendung
an
Stammmaterial und klinisch gewonnenen Proben
wurden abgeschlossen. Aufgrund der Verwendung
einer PCR mit anschließender Sequenzierung bietet
dieses Verfahren auf der einen Seite eine sehr gute
Vergleichbarkeit der Ergebnisse mit anderen
Laboren, beinhaltet aber auch einen erhöhten
Arbeits- und Zeitaufwand um die Ergebnisse zu
erzielen. Diese Methode ergänzt damit die bereits
128
STAN-UNTERPROJEKT 34-2001-15 | B-Spezialdiagnostik und Hochsicherheitslabor
STAN-UNTERPROJEKT 35-2003-17 | B-Spezialdiagnostik und Hochsicherheitslabor
Erweiterung des IS1111-basierten
Typisierungssystems fü r Coxiellen
Bearbeiter
OSV Dr. Hanczaruk, M.Sc. Pauline Bleichert, OFA
Dr. Frangoulidis
Laufzeit
01/2010 bis 12/2012
Ausblick
Die Arbeiten sind abgeschlossen, die IS1111Datenbank
wird
vergleichend
mit
anderen
genotypischen Parametern für epidemiologische
Fragestellungen verwendet.
Sachstand
Die genotypische Beschreibung von Coxiella burnetii
ist
ein
wichtiges
Forschungsgebiet
zur
Charakterisierung und Ursachenaufklärung von
Infektionen. Die 2007 erstmals beschriebene
Methode
zum
Nachweis
von
IS1111Verteilungsmustern stellt ein robustes und gut zu
etablierendes Verfahren dar.
Zielsetzung
Ziel war die Erweiterung der Methode mit derzeit fünf
Markern um weitere Marker, um die Auflösungsstärke
und Aussagefähigkeit zu verbessern. Aufgrund des
PCR-basierten Verfahrens wurde eine hohe Stabilität
und Reproduzierbarkeit der Ergebnisse erwartet. Im
Anschluss sollte die Untersuchung und genotypische
Charakterisierung aller Stämme der gesamten
Institutssammlung erfolgen.
Methoden
Zum Nachweis und zur Bestimmung einer Vielzahl
von
IS1111-Elementen
mittels
PCR
sind
verschiedenste Primer auszuwählen, PCR-Teste zu
etablieren und aus Gründen der Zeitersparnis zu
Multiplex-Ansätzen zusammenzufassen.
Ergebnisse
Alle C. burnetii-Isolate wurden mittels IS1111 typisiert
und die Ergebnisse in einer gemeinsamen
Datenbank mit anderen Typisierungsmethoden
(MST, MLVA) zusammengefasst.
Bewertung
Die erfolgreiche Erweiterung auf 32 Marker konnte
eindrucksvoll durch Frau Pauline Bleichert im
Rahmen ihrer vergleichenden Arbeit mit der MSTMethode gezeigt werden (Masterarbeit). Durch die
Erfassung aller am Institut vorhandenen Isolate in
einer Typisierungsdatenbank ist eine wichtige
Ressource zur bioforensischen Bewertung von
Coxiella burnetii aufgebaut worden.
129
STAN-UNTERPROJEKT 34-2001-15 | B-Spezialdiagnostik und Hochsicherheitslabor
STAN-UNTERPROJEKT 35-2003-18 | B-Spezialdiagnostik und Hochsicherheitslabor
Entwicklung neuer genomischer Typisierungsverfahren
(z.B. SNP) und Erweiterung vorhandener Methoden um neue
Marker (insb. MLVA)
Bearbeiter
M.Sc. Mathias Walter, OFA Dr. Frangoulidis
Laufzeit
05/2010 bis 04/2013
Sachstand
Die genotypische Beschreibung von Coxiella burnetii
ist
ein
wichtiges
Forschungsgebiet
zur
Charakterisierung und Ursachenaufklärung von
Infektionen. 2011 wurde erstmals die Anwendung der
Single Nukleotid-Polymorphismus (SNP)-Methode
bei Coxiellen beschrieben. Erste Ergebnisse lassen
eine vergleichbare Leistungsfähigkeit wie die bereits
bekannte
Multispacer-Sequence-Typing-(MST)
Methode erwarten.
Mikrotiterplattenformat zu schaffen, die in einem
Arbeitsgang sowohl eine zweifelsfreie Identifizierung
als auch eine hochauflösende Diskriminierung von
C.burnetii ermöglicht, wurde nicht mit allen Markern
erreicht. Trotzdem zeigte die Etablierung der neuen
SNP-Marker bereits eine hohe Diskriminierungsstärke der untersuchten Stammisolate (32 von 60)
mit einem guten Verhältnis von Aufwand, Zeit und
Genauigkeit im Vergleich zu bestehenden Verfahren
wie z.B. MLVA und IS1111.
Ausblick
Ein Teil der erzielten Ergebnisse wurden in einem
gemeinsamen Artikel mit dem schwedischen
Kooperationspartner zur Publikation eingereicht.
Zielsetzung
Ziel des Projekts ist die Entwicklung, Bewertung und
Evaluation neuer genotypischer Verfahren für
C. burnetii zur Verbesserung des Auflösungsgrads
bei bioforensischen Analysen und zur weiteren
molekularepidemiologischen Charakterisierung des
Erregers.
Methoden
In Kooperation mit dem schwedischen Partnerinstitut
in Umea wurden insgesamt elf Gesamtgenome von
C. burnetii auf verwertbare SNPs in-silico untersucht.
Die SNP-Nachweise wurden in einer Mikrotiterplatte
konfektioniert und mit sechs Referenzstämmen auf
ihre Zuverlässigkeit und Robustheit untersucht. Im
Anschluss wurden 60 Stämme der institutseigenen
Stammsammlung zum Nachweis von neuen SNPVerteilungsmustern getestet.
Ergebnisse
Es
gelang
84
SNP-Nachweise
auf
eine
Mikrotiterplatte zu positionieren und Wildtypvarianten
der einzelnen Genabschnitte mittels der SimpleProbe
-Methode darzustellen. Die Untersuchung von 60
Stämmen ergab 32 neue Genotypen. Bei fünf
Markern wurden jedoch u.a. konzentrationsabhängige Abweichungen in den ermittelten
Schmelzkurventemperaturen festgestellt, die eine
genaue SNP-Statuszuordnung erschwerten bzw.
nicht zuließen.
Bewertung
Das Ziel, eine SNP-basierte Typisierungsplattform im
130
STAN-UNTERPROJEKT 34-2001-15 | B-Spezialdiagnostik und Hochsicherheitslabor
STAN-UNTERPROJEKT 35-2003-20 | B-Spezialdiagnostik und Hochsicherheitslabor
Koordination des EDA-Panels fü r Coxiellaburnetii
Bearbeiter
OFA Dr. Frangoulidis
Laufzeit
05/2010 bis 12/2013
Sachstand
Im Bereich der europäischen Union gibt es nur in
wenigen Mitgliedsstaaten Institute/Labore, die sich
mit
dem
Q-Fiebererreger
Coxiella
burnetii,
beschäftigen.
Zielsetzung
Es soll Diagnostik-, Forschungs- und Fachexpertise
in den Mitgliedsstaaten des EDA (European Defence
Agency)-Netzwerkes auf dem Gebiet Coxiella burnetii
aufgebaut und etabliert werden.
Netzwerk konnte die Expertise auf dem Gebiet der
Diagnostik und Typisierung von C. burnetii in Europa
erfolgreich
gestärkt
und
eine
gemeinsame
Bearbeitung von wissenschaftlichen Fragestellungen
initiiert werden. Das Konsortium ist als Grundlage für
weitere gemeinsame Projekte ein wichtiger und
zukunftsfähiger Baustein, der auch außerhalb der
EDA anwendbar ist.
Ausblick
Die
Kooperation
auf
dem
Gebiet
der
Gesamtgenomsequenzierung wird fortgesetzt und
eine Veröffentlichung der gewonnenen Daten ist
ebenfalls geplant. Die in diesem Netzwerk erzielte
Fachexpertise auf dem Gebiet des Q-Fiebererregers
C. burnetii kann als Modell für andere EDA-Partner
dienen, um die Auskunfts- und Beurteilungsfähigkeit
auf dem Gebiet des Medizinischen B-Schutzes zu
erweitern.
Methoden
Es wurde ein Panel von 20 Referenzstämmen mit
verschiedenen
phänound
genotypischen
Eigenschaften zusammengestellt und in Teilen an
zwei Partnerlabore versandt. Anhand dieser
Materialien werden verschiedene Diagnostik- und
Typisierungsverfahren etabliert und evaluiert.
Ergebnisse 2012
Der
Austausch
des
Stammmaterials
ist
abgeschlossen, molekularbiologische Nachweisverfahren und auch die kulturelle Anzucht wurden in
einem Institut etabliert. Neben der Durchführung der
MLVA-Methode wurde auch ein SNP-basiertes
Typisierungsverfahren entwickelt. Darüber hinaus
wurde ein gemeinsames Projekt zur Gesamtgenomsequenzierung von bis zu 10 Stämmen initiiert.
Ergebnisse 2013
Acht C. burnetii-Stämme wurden mittels NGSTechniken
(Illumina
HiSeq/MiSeq)
beim
schwedischen Kooperationspartner sequenziert und
mittels bioinformatischer Nachbearbeitung zur
Publikationsreife
gebracht.
Es
wurde
eine
gemeinsame Initiative ins Leben gerufen (Coxiella
Genome Sequencing Consortium = CGSC), die
internet-basiert, als Qualitätsforum für Gesamtgenome dienen soll (www.coxiella.net).
Bewertung
Durch die Kooperation und die Aktivitäten im EDA-
131
STAN-UNTERPROJEKT 34-2001-15 | B-Spezialdiagnostik und Hochsicherheitslabor
STAN-UNTERPROJEKT 35-2003-22 | B-Spezialdiagnostik und Hochsicherheitslabor
Au;bau, Evaluierung und Einfü hrung elektronenoptischer Untersuchungsverfahren fü r B-Agenzien
Bearbeiter
OFA Dr. Frangoulidis
Laufzeit
09/2009 bis 12/2012
Sachstand
Elektronenoptische Untersuchungsverfahren, wie die
sog. Negativkontrastierung, sind eine wichtige
Methode beim Erregerschnellnachweis. Neben dem
Nachweis von Viren lassen sich damit auch andere
Mikroorganismen aus verschiedensten klinischen und
z.T. auch Umweltmaterialien nachweisen.
Zielsetzung
Die Methode des Erregerschnellnachweises mittels
Negativkontrastierung soll am Institut etabliert
werden. In Ergänzung dazu sollen auch die
Voraussetzungen für die Einbettungsmethodik von
Proben zur anschließenden Untersuchung am
Transmissions-Elektronenmikroskop geschaffen bzw.
erarbeitet werden.
Bewertung
Eine routinemäßiger Einsatz der kompletten
Präparationstechnik ist z.Z. noch nicht möglich, da
eine Ultrazentrifugationsanreicherung noch nicht
durchführbar ist. Die Auswertungen, Beurteilungen
und
Dokumentation
von
Präparaten
am
Transmissions-Elektronenmikroskop ist möglich und
umgesetzt.
Ausblick
Nach
technischer
Etablierung
der
Ultrazentrifugationsanreicherung wird die komplette
Methodik der Erregerschnellidentifizierung eingeführt.
In einem neuen STAN-Unterprojekt werden dann
verschiedene
Einbettungsprotokolle
auf
ihre
Anwendbarkeit für B-Pathogene untersucht und
eingeführt. Mit den Netzwerkpartnern und dem
Robert Koch-Institut werden weitere Schulungen und
Workshoptreffen für die Mitarbeiter durchgeführt.
Methoden
Es sind regelmäßige Teilnahmen am Arbeitskreis
Elektronenmikroskopische
Erregerdiagnostik
(AKEMED) vorgesehen, sowie interne und externe
Schulungen von Mitarbeitern. Die Umsetzung von
Präparationsprotokollen
soll
zunächst
an
ausgewählten Erregermaterialien (Orthopocken und
Milzbrand) durchgeführt werden.
Ergebnisse
Die Kontaktaufnahme und Einbindung in das
AKEMED-Netzwerk
ist
erfolgt
und
ein
Informationsaustausch wurde erfolgreich initiiert.
Zwei Hospitationen und zwei Schulungen/Workshops
wurden mit zwei bzw. drei Mitarbeitern durchgeführt.
Das Präparationslabor wurde in einem neuen Labor
aufgebaut
und
ist
teilweise
betriebsbereit.
Infrastrukturelle
Einschränkungen
(Druckluft,
Stromversorgung) bestehen aber weiterhin. Erste
eigene (Bacillus spec., Orthopockenviren) und
mehrere
externe
Präparationen
(Technische
Universität München, Ludwig-Maximillians-Universität
München) mit Helicobacter pylori und Listerien
konnten erfolgreich am TEM bearbeitet und
ausgewertet werden.
132
STAN-UNTERPROJEKT 34-2001-15 | B-Spezialdiagnostik und Hochsicherheitslabor
STAN-UNTERPROJEKT 35-2003-23 | B-Spezialdiagnostik und Hochsicherheitslabor
Anwendungsevaluation der whole genome
ampli;ication fü r Coxiellaburnetii Bearbeiter
OFA Dr. Frangoulidis
Laufzeit
06/2012 bis 12/2013
Sachstand
In humanen klinischen Untersuchungsproben liegen
bei der Q-Fiebererkrankung nur sehr geringe DNAMengen vor. Häufig stößt die PCR-Diagnostik daher
an
die Grenze der Nachweisbarkeit. Die
Nachweisbarkeit von spezifischen Antikörpern gelingt
frühestens 10-21 Tage nach Infektion. Daher ist der
schnelle PCR-Nachweis ein wichtiges Element in der
Akut- bzw. Frühdiagnostik. In diesen Fällen kann fast
nie ein Isolat angezüchtet werden und damit ist eine
forensische Untersuchung mittels Typisierungsmethoden bisher nicht möglich. Whole Genome
Amplification (WGA) Verfahren wurden in den letzten
Jahren vermehrt eingesetzt, um geringe DNAProbenmengen
auf
eine
untersuchbare
Größenordnung anzureichern. Typisierungsverfahren
waren grundsätzlich danach an den amplifizierten
Proben anwendbar.
Zielsetzung
Ziel des Projekts ist die Etablierung eines Verfahrens,
das es ermöglicht direkt aus klinischen Probenmaterialien die Nukleinsäure so anzureichern, dass
die Sensitivität der PCR-Schnelldiagnostik des
Q-Fiebers verbessert wird. Zusätzlich soll damit
geklärt werden, ob mit diesem angereicherten
Material eine exakte Typisierung möglich ist.
Methoden
Drei kommerziell erhältliche WGA-Verfahren werden
an
definierten
Referenzstämmen
hinsichtlich
Sensitivität, Spezifität, Qualität und Quantität
einschließlich der Anwendbarkeit und Robustheit der
Methode hin untersucht. Die Überprüfung findet
durch Bestimmung von sog. "house-keeping" Genen
für C. burnetii mittels PCR und zusätzlicher
Sequenzierung
statt.
Anhand
von
zwei
Typisierungsverfahren (MLVA und IS1111) wird die
Eignung für eine Typisierung nach Anwendung von
WGA überprüft.
geführt werden. Alle "house-keeping" Gene wurden
bei einer Ausgangs-DNA-Konzentration von 102 bis
103 Kopien/µl sicher nachgewiesen, unabhängig
davon welches Kit verwendet wurde. Hierbei gelang
es jeweils die Konzentration der Ausgangs-DNA um
etwa 3 log10-Stufen zu erhöhen. Bei der
eingesetzten 14 Marker MLVA-Methode traten bei 3
Markern
starke,
konzentrationsabhängige
Schwankungen auf. Bei der IS1111-Typisierungsmethode wurden z.T. mehrere zusätzlich Banden in
der Gelelektrophorese beobachtet, die eine sichere
Auswertung z.T. deutlich erschweren.
Ergebnisse 2013
Der Einfluss der präanalytischen Methodik - DNAAufreinigungsverfahren
und
Aufreinigung
der
amplifizierten Produkte vor der Weiterverarbeitung in
Typisierungsuntersuchungen - wurde am Referenzstamm
NineMile
untersucht.
Dabei
konnte
konzentrationsabhängig (103 u. 104 Kopien/µl
Ausgangsmenge) beim MDA (Multi-DisplacementAmplification)-Verfahren
eine
Reduktion
von
unspezifischen Nebenbanden in der IS1111Typisierung nachgewiesen werden.
Bewertung
Fasst man die bisherigen Ergebnisse zusammen,
dann benötigen alle WGA-Verfahren mindestens
etwa 100 Genomkopien um eine akzeptable DNAVermehrung für die spätere PCR-Diagnostik zu
ermöglichen. Dies stellt eine Verbesserung für die
sichere Identifizierung von positiven Proben dar,
obwohl die Sensitivität der derzeit verwendeten
Diagnostikverfahren z.T. bei 10 Genomkopien liegt.
In
dieser
Größenordnung
ist
zwar
eine
identifizierende Diagnostik möglich, weiterführende
Typisierungen benötigen aber deutlich höhere
Kopienzahlen. Mittels WGA kann so aber die Menge
an DNA angereichert werden. Eine bioforensische
Bewertung ist mittels MLVA nach WGA bei
Ausgangskonzentrationen ab 104 Kopien/µl möglich.
Die IS1111-Methode ist nur eingeschränkt bewertbar
nach WGA-Anwendung.
Ausblick
Der Einfluss von WGA auf das Gesamtgenom soll an
Stämmen
mit
publizierten
Gesamtgenom
vergleichend untersucht werden.
Ergebnisse 2012
Bei der Etablierung der Methoden mussten mehrere
Anpassungsschritte im Temperaturprotokoll durch-
133
STAN-UNTERPROJEKT 34-2001-15 | B-Spezialdiagnostik und Hochsicherheitslabor
STAN-UNTERPROJEKT 35-2003-24 | B-Spezialdiagnostik und Hochsicherheitslabor
Evaluation der zellfreien Anzucht fü r Coxiellaburnetiiund
deren Eignung fü r Typisierungs- und Sequenzierungsmethoden
Bearbeiter
OFA Dr. Frangoulidis
Laufzeit
03/2013 bis 03/2016
Sachstand
Coxiella burnetii, der Erreger der Zoonose Q-Fieber,
galt bis vor wenigen Jahren als strikt intrazellulärer
Erreger. Seit 2009 gibt es Hinweise, dass Coxiellen
unter bestimmten Nährstoff- und Wachstumsbedingungen auch axenisch vermehrbar sind. Solche
Präparationen sind frei von zellulärer DNS, das
vereinfacht genotypische Typisierungsverfahren,
insbesondere Gesamtgenomsequenzierungen.
Zielsetzung
Nach Etablierung der zellfreien Anzucht sollen
anschließend
die
angereicherten
Materialien
genotypisch typisiert und sequenziert werden.
Methoden
Zunächst
müssen
die
technischen
und
infrastrukturellen Voraussetzungen für mikroaerophile
Wachstumsbedingungen im L2 und im L3Arbeitsbereich geschaffen werden. Danach erfolgt
die Herstellung und Testung des spezifischen
Anreicherungsmediums mit ausgewählten Referenzstämmen. Zusätzlich werden Extraktions- und
Aufbereitungsmethoden
evaluiert.
Anschließend
erfolgt die qualitative Überprüfung durch die
Bestimmung von sog. "House-Keeping"-Genen,
Plasmidtyp, MLVA-, SNP-, MST- und IS1111Markern. Abschließend wird eine Re-Sequenzierung
von zwei bekannten Referenzstämmen mittels
moderner NGS- (Next Generation Sequencing)
Technik (z.B. Illumina, PacBio) durchgeführt.
Bewertung
Durch die erfolgreiche Schaffung der technischen
und infrastrukturellen Voraussetzungen ist erstmals
die
Möglichkeit
gegeben
eine
axenische
Erregeranzucht
durchzuführen
und
damit
genomisches Material zu gewinnen, das frei von
zellulären Hintergrundeigenschaften ist. Auch die
primäre Anzucht aus klinischen Materialien ist somit
in Zukunft möglich.
Ausblick
Es sollen mehrere Referenzstämme unter L3Bedingungen
angezüchtet
werden
und
die
Sensitivität und Anreicherungskapazität der Methode
zu
evaluieren.
Eine
Gesamtgenom-(re-)sequenzierung von zwei Referenzstämmen soll
durchgeführt werden. Dabei werden optimale
Extraktions- und Aufreinigungsverfahren getestet und
anschließend die technischen und bioinformatischen
Methoden zur Gewinnung einer Gesamtgenomsequenz bestimmt. Anschließend wird diese mit
bereits
publizierten
C.
burnetii
Genomen
verglichen.
Ergebnisse
Die technischen und infrastrukturellen Voraussetzungen wurden im L2- und L3-Bereich geschaffen.
Parallel dazu wurden erste Erfahrungen in der
zellfreien Anzucht durch die Kooperation mit einem
Netzwerkpartner in Jena gewonnen. Dabei wurde
auch erstmals in Deutschland ein Isolat aus einer
infizierten Herzklappe gewonnen. Die durchgeführten
Typisierungsergebnisse waren valide und zeigten
einen neuen MLVA-Genotypen, der aber nah
verwandt zu bekannten deutschen Varianten ist.
134
STAN-UNTERPROJEKT 34-2001-15 | B-Spezialdiagnostik und Hochsicherheitslabor
SONDERFORSCHUNG 22Z1-S-851112 | B-Spezialdiagnostik und Hochsicherheitslabor
Nagetiere als U3 berträ ger von Zoonosen in Afghanistan:
explorative und kon;irmatorische Untersuchungen
Bearbeiter
OTV Prof. Dr. Meyer, OFA Dr. Dobler, RDir Dr.
Essbauer, OFA Dr. Kayßer, RDir PD Dr. Scholz, OFA
Dr. Wölfel
Laufzeit
01/2011 bis 02/2013
Sachstand
Wildlebende
Nagetiere
stellen
bedeutsame
Überträger und Reservoirwirte von zoonotischen
Krankheitserregern wie Viren, Bakterien und
Parasiten dar. Im militärischen Bereich haben
Infektionserkrankungen im Verlauf von Einsätzen seit
langem große Bedeutung. Für Afghanistan gibt es
bislang nur begrenzte Informationen über das
Artenspektrum und die Durchseuchung der dort
heimischen Nagetierpopulationen.
Zielsetzung
Die Untersuchungen sollen Aussagen über die im
Norden
Afghanistans
(Mazar-i-Sharif)
im
Lagerbereich der Bundeswehr (ISAF) zu erwartende
Wildnagetierarten sowie über das Vorkommen
bestimmter Pathogenen bei diesen Tieren erbringen.
InstMikroBioBw
übernimmt
in
diesem
Forschungsverbund mit anderen Bundeswehr Dienststellen die Untersuchung der Nagetiere auf für
den Med B-Schutz relevante Erreger.
Methoden
In
2012
erhielt
InstMikroBioBw
die
noch
ausstehenden 240 aus Lebergewebe extrahierten
DNS-Proben sowie 439 ebenfalls aus Lebergewebe
extrahierten RNA-Präparationen. Die DNA aus
Leberproben wurde auf Vorliegen von Francisella
und Brucella spp., Coxiella burnetii, Y. pestis und
Orthopockenviren, die RNS auf Vorliegen von KrimKongo-Hämorrhagisches-Fieber - Virus (CCHF)
untersucht. Zur Kontrolle einer möglichen Inhibition
wurde die HLA-PCR eingesetzt. 438 Transsudate
aus dem Bauchraum wurden auf das Vorliegen von
Antikörpern gegen Orthopockenviren (in Pools zu
fünf Proben), Rickettsien und Flaviviren (jeweils als
Einzelprobe) mittels Immunfluoreszenz untersucht.
Inhibierende
Substanzen
konnten
nicht
nachgewiesen werden, da regelmäßig der Nachweis
von 200 Kopien HLA-Gensequenzen gelang. Somit
ist das Vorliegen von falsch-negativen Reaktionen
unwahrscheinlich. Alle 439 RNS-Präparationen
waren in der CCHF-Virus RT-PCR negativ. In den
Transsudaten konnten keine Orthopockenvirusspezifische Antikörper nachgewiesen werden.
Flavivirus-spezifische Antikörper wurden in 16 und
Rickettsien-spezifische
Antikörper
in
51
Transsudaten ermittelt. Durch Austitration ließen sich
die Antikörper verschiedenen Flaviviren und
Rickettsien-Gruppen zuordnen. Der Versuch, vier in
der Rickettsien-screening-PCR positiven Proben
weiter molekular zu charakterisieren, gelang
aufgrund der sehr geringen Kopienzahl nicht.
Bewertung
Die
in
2012
erhaltenen
Ergebnisse
zum
Erregerdirektnachweis bestätigen die Ergebnisse aus
2011: Bei dem hohen Anteil an Hausmäusen im
gesammelten Nagerkollektiv überrascht nicht, dass B
-Schutz-relevante Erreger nicht gefunden wurden.
Serologisch lässt sich jedoch für das Vorkommen von
Rickettsien und Flaviviren ableiten, dass hier
Nagetiere offenbar eine Rolle als Reservoir spielen.
Inwieweit humanpathogene Arten bzw. Spezies eine
Rolle
spielen,
müssen
weiterführende
Untersuchungen zeigen.
Ausblick
Das Projekt wurde abgeschlossen.
Ergebnisse
Auch die 240 in 2012 untersuchten Proben erwiesen
sich in den PCRs als negativ für Francisella, Brucella,
Coxiella, Yersinia pestis und Orthopockenviren.
135
STAN-UNTERPROJEKT 34-2001-15 | B-Spezialdiagnostik und Hochsicherheitslabor
DRITTMITTELPROJEKT 01 KI 1001 | B-Spezialdiagnostik und Hochsicherheitslabor
Funktioneller Genom- und Proteomvergleich von C.burnetiizur Diagnostik und Therapieentwicklung des Q-Fiebers einschließlich Untersuchung der Wechselwirkung
der „Host-Pathogen“ Interaktion auf der Ebene der RNA Transkripte beim Menschen
zugeordnet werden. Weiterhin wurden 193 neue
Gene identifziert, die zur Hälfte spezifisch für
einzelne Isolate sind und sich somit für eine bessere
Genotyp-Phänotyp-Zuordnung eignen.
Bearbeiter
M.Sc. Mathias Walter, OFA Dr. Frangoulidis
Laufzeit
10/2010 bis 12/2014
Sachstand
Moderne Genomanalysen werden ständig auf die
funktionellen Zusammenhänge innerhalb aber auch
zwischen verschiedenen Spezies erweitert. Es gibt
Hinweise,
dass
die
zwei
klinischen
Hauptverlaufsformen des Q-Fiebers (akut, chronisch)
auch auf wirtsspezifischen Faktoren der gezielten
und ungerichteten Immunabwehr basieren können.
Zielsetzung
Durch
den
funktionellen
Genomund
Proteomvergleich einschließlich des Einflusses von
Wirtsfaktoren soll das Verständnis der Pathogenese
und Virulenz dieser Erkrankung verbessert werden.
Dadurch wird es möglich, neue Ansätze für
Diagnostik,
Therapie
und
Prophylaxe
zu
identifizieren.
Methoden
Zur Vorbereitung der RNA-Transkriptversuche wurde
eine in-silico Analyse aller bisher publizierten
coxiellenspezifischen Gesamtgenom-, Protein- und
RNA-Transkriptdaten durchgeführt. Dafür wurde eine
semi-automatische Annotationsplatform entwickelt,
die mehrere Genvorhersageprogramme kombiniert
und auf Basis von Konservierungsinformationen der
orthologen Gene den korrekten Genstart bestimmt.
Die Annotationsplatform wurde um ein Modul für
Data Mining erweitert, um in Daten von Expressionsund Proteomexperimenten Evidenzen für den
korrekten Genstart sowie neu identifizierte Gene zu
finden.
Ergebnisse 2012
In allen publizierten Gesamtgenomdaten wurden
umfangreiche Annotationsanomalien festgestellt, die
relevante Auswirkungen sowohl auf die Zuordnung
von
Genen
und
Pseudogenen
als
auch
Aminosäurenstruktur und damit Proteindefinitionen
zeigten. Es wurde daher begonnen alle Datensätze
nach
einheitlichen
Analyseund
Bewertungsalgorithmen neu zu bewerten. Dabei
konnten bisher 118 Pseudogene in echte Gene und
382 Proteine mit unbekannter Funktion verifiziert/neu
Ergebnisse 2013
Etablierung der zellfreien Anzucht mit dem
Netzwerkpartner in Jena. Evaluation von DNA
Extraktionskits zur Gewinnung hochmolekularer und
hochreiner DNA (nötig für Sequenzierung mit
Geräten
der
3.
Generation
(PacBio).
Resequenzierung von Nine Mile mit PacBio und
anschließender
Korrektur
der
Gesamtgenomsequenz. RNA-Sequenzierung von
vier
verschiedenen
cDNA-Bibliotheken
(5',
strangspezifisch, short non-coding 30-150 bp und
150-450 bp) zur Bestimmung des Transkriptoms
unter der Bedingung des zellfreien Wachstums.
Entwicklung einer bioinformatischen Methode zur
Assemblierung von Gesamtgenom-amplifizierter
Daten und Scaffolding des Strains Namibia. Die
Daten aus weiteren Proteomexperimenten anderer
Arbeitsgruppen wurden integriert und die Annotation
verifiziert bzw. verbessert.
Bewertung
Nach der Entwicklung und Evaluation eines neuen
Gesamtgenomauswertungssystems und Schaffung
einer internet-basierten Plattform, wurden zwei
Genome über dieses System erfolgreich erstellt und
bearbeitet.
Zusätzlich
wurden
durch
die
Untersuchungen der zellfreien Anzucht von Coxiellen
wichtige Grundlagen
für die
Analyse auf
Transkriptomebene geschaffen und z.T. begonnen.
Ausblick
Fortführung der vergleichenden Transkriptomuntersuchungen an phänotpyisch verschiedenen
Isolaten und weitere (Re-) Sequenzierungen von
ausgewählten Stämmen zur Etablierung des neuen
Genomstandards in internationalen Datenbanken.
Weiterer Ausbau der eigenen Analyseplattform für
alle
neu
generierten
Daten,
die
der
wissenschaftlichen Gemeinschaft zur Verfügung
gestellt wird.
136
STAN-UNTERPROJEKT 34-2001-15 | B-Spezialdiagnostik und Hochsicherheitslabor
DRITTMITTELPROJEKT TEK-1014 | B-Spezialdiagnostik und Hochsicherheitslabor
Inaktivierung potenzieller bakterieller und viraler
B-Kampfstoffe durch metallische Kupferober;lä chen
Bearbeiter
M. Sc. Bleichert, ORR Dr. Gregor Grass
Laufzeit
07/2011 bis 08/2013
Sachstand
Verfahren zur Dekontamination oder Verringerung
der Übertragungsraten potenzieller bakterieller und
viraler B-Kampfstoffe über Oberflächen erfordern
einen hohen hygienischen Aufwand. Der Einsatz
selbstdesinfizierender
Oberflächen
ist
daher
vielversprechend. Für B-Kampfstoffe wurde noch
nicht gezeigt, dass Kupferoberflächen solche
Organismen rasch und zuverlässig abtöten können.
Zielsetzung
Die schnelle und vollständige Inaktivierung
bakterieller und viraler B-Kampfstoffe durch
metallische Kupferoberflächen soll nachgewiesen
werden.
Inaktivierungsexperimenten etabliert. Vacciniavirus
wird innerhalb von 5 min durch Kupfer bzw. innerhalb
von 20 min durch eine Kupfer-Nickel-Legierung (Cu
65 %) inaktiviert, ebenso wie auch Affenpockenviren.
In Zusammenarbeit mit Kollegen der Martin-LutherUniversität Halle-Wittenberg, den Universitäten
Bielefeld und Coimbra (Portugal) wurden über
adaptive Evolution, d.h. wiederholte und immer
stringentere Selektion von überlebendenden Zellen
nach Exposition auf Kupferoberflächen, Mutanten
von Escherichia coli und MRSA generiert, die 60
bzw. 10 mal toleranter hinsichtlich der unschädlichen
Expositionsdauer gegenüber Kupferoberflächenstress waren als ihre Wildtyp-Eltern. Diese Mutanten
wurden
phänotypisch
und
physiologisch
charakterisiert. Zurzeit erfolgt die GesamtgenomResequenzierung und Transkriptomsequenzierung
dieser Mutanten, mit dem Ziel, Unterschiede zu den
Wildtyp-Eltern aufzudecken, die für die beobachtete
Toleranz verantwortlich sein könnten.
Ergebnisse 2012
Im Gegensatz zu allen anderen getesteten Bakterien,
die innerhalb von Minuten auf Kupfer abgetötet
werden konnten, wurde B. anthracis selbst nach 24
Std. Inkubationszeit nicht vollständig inaktiviert.
Sporen von B. anthracis sind maßgebend für die
resistenten Eigenschaften gegenüber Kupfer. Für alle
untersuchten Bakterien konnte zudem durch
spezifische Zellfärbungen gezeigt werden, dass
metallisches Kupfer die Zellmembran zerstört.
Bewertung
Erstmalig
konnte
für
biosicherheitsrelevante
hochpathogene bakterielle und virale Erreger (BSL-3)
eine komplette, nicht jedoch für Endosporen
zutreffende Inaktivierung innerhalb von wenigen
Minuten durch Kupferoberflächen gezeigt werden.
Heutzutage
entwickeln
mehr
und
mehr
Mikroorganismen auch aufgrund des übermäßigen
Einsatzes für prophylaktische und therapeutische
Zwecke Resistenzen gegen Antibiotika. Als
Konsequenz
sollte
die
Infektionsprävention
genausoviel Aufmerksamkeit wie die Therapie
erhalten. Dies gilt insbesondere für Krankheiten wie
z.B. Ebola, für die derzeit keine ursächliche Heilung
erreicht werden kann. Hier könnten antimikrobielle
Kupferoberflächen einen sinnvollen Beitrag zum
Beispiel im Barrier-Nursing leisten. Es ist möglich,
dass medizinische Auslandseinsätze mit stationärer
oder mobiler Patientenisoliereinheiten von der
Verwendung von Kupferflächen profitieren könnten,
um so die Ausbreitung von B-Agenzien zu
vermindern. Hierbei ist jedoch zu bedenken, dass
metallisches Kupfer nur als Ergänzung zu etablierten
Regimen
wie
strenger
Handund
Oberflächenhygiene, aber nicht als deren Ersatz
funktionieren kann.
Ergebnisse 2013
Vor den Untersuchungen mit Affenpockenviren (BSL3) wurde zunächst für Vacciniavirus im BSL-2
Bereich die zellkulturbasierte Anzucht nach den
Ausblick
Die experimentellen Arbeiten wurden mit dem Jahr
2013 abgeschlossen. Für das Jahr 2014 sind sechs
Publikationen in Vorbereitung.
Methoden
Die Inaktivierung verschiedener hochpathogener
Bakterien
und
von
Orthopockenviren
auf
Kupferoberflächen
wurde
zeitabhängig
durch
Plattierung als Kolonie- bzw. Plaque-bildendeEinheiten quantifiziert. Die Untersuchung von
Sporenbildnern benötigte eine Anpassung der bereits
im Vorjahr etablierten Methoden, ebenso die
Experimente mit Orthopockenviren. Zudem wurde die
Membranschädigung durch metallisches Kupfer an B.
melitensis, B. mallei, B. pseudomallei, F. tularensis
und Y. pestis nachgewiesen.
137
Abteilung fü r Medizinische
B-Au;klä rung und Veri;ikation
Die Hauptaufgabe der Abteilung für Medizinische BAufklärung und Verifikation ist es, das am Institut für
Mikrobiologie der Bundeswehr vorhandene Fachwissen für die Bundeswehr weltweit und schnell
operativ verfügbar zu machen.
Aufbauend auf den bereits in den letzten Jahren
erreichten Fähigkeiten zur Laboruntersuchung unter
einfachen Feldbedingungen standen auch 2012 und
2013 die weitere Umsetzung von feldtauglichen
Methoden und die Erprobungen in Einsätzen und
Übungen im Zentrum der Aktivitäten der Teileinheit.
Weiterhin wurden mehrere Studien mit Partnern im
Ausland durchgeführt und ein neues Drittmittelprojekt
im Auftrag der Europäischen Union zum Aufbau
mobiler Laborteams für Ausbruchsuntersuchungen in
Afrika begonnen.
Im Bereich des schnell verlegbaren B-Labors konnte
durch die Entwicklung und Einführung eines
neuartigen, zusammenfaltbaren Handschuhkastens
die Leistungsfähigkeit und die Sicherheit bei der
Bearbeitung potentiell gefährlicher Untersuchungsproben weiter gesteigert werden. Außerdem wurde
das Diagnostikspektrum durch zusätzliche neue
Testverfahren, unter anderem zum Nachweis von
Botulinumtoxinen und Mykotoxinen, verbessert.
Sowohl die B-Aufklärungstrupps als auch das schnellverlegbare B-Labor wurden 2012 und 2013 jeweils in
138
der NATO-Übung „Precise Response“ und bei der
Vektordruckuntersuchung „Heuberg“ mit großem
Erfolg eingesetzt. Neben einer Verbesserung der
Ausbildung und Erfahrung des eingesetzten
Personals konnten dabei auch Erkenntnisse über
Robustheit und Störsicherheit der verwendeten
Ausrüstung und des Einsatzkonzeptes unter
Feldbedingungen gesammelt werden.
Die
laborgestützten
Forschungsprojekte
der
Teileinheit erstreckten sich auch in diesen beiden
Jahren
über
das
gesamte
Spektrum
des
medizinischen B-Schutzes: Neben der Fortsetzung
der Arbeiten zur Herstellung gefriergetrockneter PCRReagenzien wurde mit der Entwicklung eines
lyophilisierten, internen Kontrollsystems für quantitative, reverse-Transkription-PCR-Tests begonnen. In
Zusammenarbeit mit anderen Teileinheiten des
Instituts wurden Seroprävalenz-Studien in Georgien
und Aserbaidschan durchgeführt.
Im Rahmen der militärfachlichen Betreuung von
externen
Forschungsvorhaben
begleitete
das
Personal der Teileinheit zwei Vertragsforschungsvorhaben auf den Gebieten der virologischen
Typisierung sowie der Schnelldiagnostik viraler
hämorrhagischer Fieber und wirkte in Expertengruppen der NATO, der WHO und der EUKommission zu Fragen des B-Schutzes mit.
Das „European Mobile Lab“ Projekt - Au;bau schnellverlegbarer Laboreinheiten zur Felddiagnostik
gefä hrlicher Krankheitserreger in Afrika
Die Untersuchung von vermuteten Ausbrüchen
hochgefährlicher Infektionskrankheiten stellt insbesondere in Afrika das Gesundheitswesen immer
wieder vor große technische und personelle
Herausforderungen. Ein europäisches Projekt hat
daher den Aufbau und das Training schnellverlegbarer Laborteams in Afrika und Europa zum
Ziel.
das Problem, dass das klinische Erscheinungsbild
einer Vielzahl anderer Krankheiten gleicht und daher
eine schnelle, optimaler Weise feldbasierte,
molekulare Diagnostik zur einwandfreien Bestätigung
der Krankheitsursache benötigt wird. Aufgrund dieser
Situation besteht zurzeit eine akute Notwendigkeit die
jeweiligen nationalen und regionalen Kapazitäten
bezüglich feldbasierter Ausbruchsdetektion, Bestätigung und Reaktion zu stärken.
Krankheiten mit Epidemie-Potenzial stellen in vielen
Ländern der Welt nach wie vor eine große Bedrohung
für die öffentliche Gesundheit dar. Zudem wächst
durch den zunehmenden internationalen Tourismus
und den globalisierten Handel das Risiko einer
internationalen Ausbreitung solcher Epidemien.
Bakterielle und virale Krankheitserreger der Risikogruppen 3 und 4 stellen dabei aufgrund der durch sie
verursachten schweren Krankheitsbilder, Ebola- oder
Lassafieber, sowie ihrer hohen Kontagiösität die
größte Bedrohung dar. Ausbrüche durch diese
Erreger kommen regelmäßig besonders auf dem
afrikanischen Kontinent in den Gebieten der SubSahara vor. Obwohl in vielen afrikanischen Ländern in
den letzten Jahren beachtliche Fortschritte in der
Diagnostik und Bekämpfung solcher Ausbrüche erzielt
wurden, bestehen dort auf diesem Gebiet nach wie
vor große Fähigkeitslücken bei der raschen
Diagnostik. So verfügen viele dieser Länder weder
über die logistischen noch die nötigen wissenschaftlichen Kapazitäten, um angemessen auf gefährliche
Krankheitsausbrüche zu reagieren und sind daher in
solchen Ausbruchsszenarien derzeit immer noch auf
internationale Unterstützung angewiesen. Zudem
besteht gerade bei viralen hämorrhagischen Fiebern
Vor diesem Hintergrund wurde durch das EuropAid
Office (DevCo) der europäischen Kommission das
Projekt “Establishment of Mobile Laboratories up to
Risk Group 4 in Combination with CBRN Capacity
Building in sub-Saharan Africa“ (EMLab project, 20122015) mit einem Budget von 3.5 Millionen Euro
initiiert. Ziel des Projektes ist die Etablierung schnellverlegbarer
Laboreinheiten
zur
feldbasierten
Diagnostik von gefährlichen Krankheitserregern in
Afrika, sowie die Schulung von europäischem und
afrikanischem Personal in der Handhabung dieser
Labore.
Abbildung 1: Logo des europäischen mobilen Labors mit Logos
aller Partner
Abbildung 2: Die gesamte Laborausrüstung des europäischen
mobilen Labors befindet sich in gehärteten, rollbaren Kisten.
139
Das
EMLab-Konsortium besteht, neben der
Teileinheit Med. B-Aufklärung und Verifikation des
Instituts für Mikrobiologie der Bundeswehr, aus
mehreren europäischen Forschungseinrichtungen mit
Hochsicherheitslaboren der Schutzstufe 4, sowie
weiteren assoziierten Partnern. Die Leitung des
Konsortiums erfolgt durch das Bernhard-Nocht-Institut
in Hamburg. Aufgabe der Teileinheit Med. BAufklärung und Verifikation ist es, basierend auf dem
existierenden schnell-verlegbaren B-Labor und der
vorhandenen Expertise in der Felddiagnostik, drei
identische zivile Versionen des bereits am Institut
Abbildung 3: Beispielhafte Darstellung eines schnell verlegbaren Laborteams samt Ausrüstung
Im Juni 2013 wurden zunächst drei nigerianische Wissenschaftler des Irrua-Specialist-Teaching-Hospitals in
einem einwöchigen Intensivkurs in die Geräte und
grundlegenden Abläufe des European Mobile Labs
eingewiesen. Im September 2013 fand dann das erste
Training mit 24 europäischen Teilnehmern statt.
Besonderer Schwerpunkt dieses Trainings lag auf der
Szenar-basierten Ausbildung,
in welcher
die
Trainingsteilnehmer mit
Situationen aus früheren
Ausbruchsmissionen konfrontiert wurden und unter
Anleitung eigene Lösungsansätze entwickeln mussten.
Darüber hinaus erhielten die Teilnehmer Einweisungen
in die persönliche Schutzausrüstung, Anleitungen zur
Reparatur und technischen Wartung verschiedener
Laborbestandteile und Ausrüstungsgegenstände sowie
in Satellitentelefon– und Funkkommunikation.
existierenden militärischen B-Labors aufzubauen,
sowie einen Pool europäischer und afrikanischer
Wissenschaftler durch Workshops und Feldtrainings
in der Handhabung dieser schnell-verlegbaren
Laboreinheiten auszubilden. Jeweils eine der so
entstandenen Laboreinheiten soll dann in Nigeria und
Tansania stationiert werden, während die dritte
Laboreinheit am Institut für Mikrobiologie der
Bundeswehr stationiert wird, um im Ausbruchsfall von
München aus unter der Leitung der Weltgesundheitsorganisation WHO zusammen mit einem multinationalen europäischen Wissenschaftlerteam in das
jeweilige Operationsgebiet verlegt zu werden.
Im Januar 2013 fand ein erster Ausbildungsworkshop
am Institut für Mikrobiologie der Bundeswehr statt. Im
Rahmen dieses Workshops wurde das grundlegende
Konzept des Mobilen Labors 29 Teilnehmern aus
verschiedenen europäischen Forschungsinstituten,
sowie Vertretern der WHO und MSF (Ärzte ohne
Grenzen) vorgestellt. Zudem wurden wichtige
logistische und diagnostische Konzepte der schnell
verlegbaren Labordiagnostikfähigkeit erörtert. Zudem
wurde ein Anforderungsprofil für geeignete Ausbruchsmissions-Teilnehmer erstellt und alle Projektbeteiligten Institute aufgefordert jeweils vier diesem
Profil entsprechende Kandidaten für die Trainings und
Ausbildungsmaßnahmen zu identifizieren. Aus
diesem Pool europäischer und afrikanischer Wissenschaftler wurden dann die Trainingsteilnehmer
ausgewählt.
Basierend auf den langjährigen Erfahrungen am
Institut für Mikrobiologie der Bundeswehr wurde ein
Ausbildungscurriculum für potentielle Teilnehmer an
EMLab Missionen erstellt. Dieses Trainingsprogramm
umfasst alle Missionsrelevanten Aspekte, inklusive
Laborverlegung, -aufbau, Betrieb und Rückverlegung.
Abbildung 4: Stationierungsorte der
Laboreinheiten in Europa und Afrika
140
schnell
verlegbaren
Entwicklung und Erprobung eines Schutzsystems
zur Au;bereitung potenziell infektiö ser Proben im Feld
Unter den Bedingungen eines Feldlabors stellt der
Umgang mit Probenmaterialien, die gefährliche
Krankheitserreger enthalten können, besondere
Anforderungen an den Schutz des eingesetzten
Laborpersonals. Die Suche nach geeigneten
Schutzsystemen für die Anwendung unter
Feldbedingungen ist Teil der angewandten mikrobiologischen Forschung am IMB.
Zum Auftrag der Abteilung Med. B-Aufklärung und
Verifikation gehört es, unklare Krankheitsfälle und
Krankheitsausbrüche auf deren Ursache und einen
möglichen Zusammenhang mit der Freisetzung
biologischer Kampfstoffe zu untersuchen. Dazu ist es
notwendig, Materialien menschlichen, tierischen oder
sonstigen Ursprungs mit mikrobiologischen Methoden
auch im Ausland unter einfachen Umgebungsbedingungen aufzubereiten. Feste Laboreinrichtungen
stehen dafür oft nicht zur Verfügung, sodass mikrobiologische Arbeiten z. B. in Zelten oder sonst anderweitig genutzten Gebäuden durchgeführt werden
müssen. Die dafür verwendete Laborausrüstung muss
möglichst leicht, robust und platzsparend transportierbar sein.
Bei den durchzuführenden Laborarbeiten handelt es
sich zumeist um sogenannte „nicht gezielte
Tätigkeiten“ gemäß der Biostoffverordnung. Zum
Schutz des Laborpersonals vor Gefährdungen, z. B.
durch Krankheitserreger, Toxine oder giftige Chemikalien, sind dabei technische Schutzmaßnahmen so
zu gestalten, dass biologische Arbeitsstoffe am
Arbeitsplatz nicht frei werden.
Ein Verfahren zum Schutz des Laborpersonals ist es,
die Arbeiten mit dem potentiell gefährlichen
Probenmaterial in einem Arbeitsraum auszuführen,
der gegenüber der Laborumgebung hermetisch
Abbildung 1: Konstruktionszeichnungen der faltbaren Glovebox
141
abgeschlossen ist. Eine Umsetzung ist dabei die
Benutzung eines Handschuhkastens. Produkte für
derartige Zwecke werden von mehreren Herstellern
kommerziell angeboten. Allerdings haben alle derzeit
marktverfügbaren Lösungen Nachteile, die einer
Verwendung als Teil einer schnell-verlegbaren BLaborausrüstung entgegenstehen.
Eine kommerziell verfügbare Lösung ist z.B. ein
kuppelzeltartig aufgebauter, flexibler Handschuhkasten. Es handelt sich dabei um eine aus
durchsichtiger PVC-Folie zusammengeschweißte
Konstruktion, die an zwei bogenförmigen Zeltstangen
eingehakt wird. Dieses „Handschuhzelt“ ist klein,
leicht und äußerst kompakt transportierbar. Allerdings
ist es aufgrund des Aufbaus aus flexibler PVC-Folie
nur sehr begrenzt druckfest. Bereits bei einem
Unterdruck von wenigen Pascal kommt es zum
Zusammenfallen der Zeltwände. Außerdem bietet das
verwendete PVC-Material zwar einen guten Schutz
gegen biologische Substanzen, jedoch keinen gegen
eine Vielzahl chemischer Gifte.
Als weiteres marktverfügbares Produkt ist ein kleiner,
transportabler, starrer Handschuhkasten mit geregeltem Unterdruckgebläse verfügbar. Dieser bietet durch
die Möglichkeit im Inneren einen Unterdruck von bis
zu 200 Pascal einzustellen ein hohes Maß an
Sicherheit für das Laborpersonal. Jedoch verfügt
dieses System nur über eine sehr begrenzte
Arbeitsfläche, sodass Laborarbeiten zur sicheren
Inaktivierung des Untersuchungsmaterials nicht
kontaminationsfrei ausführbar sind.
Vor dem Hintergrund dieser Ausgangslage war es das
Ziel des STAN-Forschungsprojektes 48-2009-05 ein
Verfahren zu entwickeln, das die Möglichkeit zum
Arbeiten mit potentiell gefährlichen biologischen oder
chemischen Materialien in einer nach außen herme-
tisch abgeschlossenen und zur Umgebung in
Unterdruck befindlichen Umgebung bietet. Die Lösung
soll dabei klein, leicht und transportabel sein.
In Zusammenarbeit mit zwei mittelständischen
Unternehmen aus Deutschland und Österreich gelang
es, einen halbstarren Handschuhkasten aus
Werkstoffen zu konstruieren, die gegen chemische
und biologische Substanzen über längere Zeit dicht
sind. Der Handschuhkasten kann durch seine
Konstruktion einfach zusammengefaltet und leicht
transportiert werden. Materialschleusen erlauben ein
Ein- und Ausschleusen von Material bzw. Abfall.
Aufgrund eines gasdicht zugeführten Stromanschlusses können Geräte im Handschuhkasten betrieben
werden. Durch die Filterung der Luft mittels handelsüblicher Atemschutzmaskenfilter werden biologische
oder chemische Gefahrstoffe im Innern des
Handschuhkastens zurückgehalten.
Aufgrund
der
Konstruktion
und
technischen
Ausführung kann der Handschuhkasten in Zukunft zu
einem System weiterentwickelt werden, dass einen
geregelten Unterdruck im Inneren aufrechterhält und
somit auch die technischen Anforderungen, z. B. an
Handschuhkästen der Biologischen Schutzstufe 3,
erfüllt.
Ein erster Prototyp des Handschuhkastens wurde
2012 bei mehreren Feldübungen erfolgreich erprobt.
Das Entwicklungsergebnis des Forschungsprojektes
wurde durch das Bundesamt für Ausrüstung,
Informationstechnik und Nutzung der Bundeswehr
(BAAINBw) als Diensterfindung gemeinschaftlich mit
den beiden beteiligten Unternehmen anerkannt.
Abbildung 2: Einsatzerprobung der faltbaren Glovebox während der NATO-Übung Precise Response in Kanada
142
Entwicklung gefriergetrockneter
Reagenzienmischungen fü r die Echtzeit-RT-PCR
Das Ziel des Forschungsvorhabens war es,
erstmals nachhaltig verfügbare gefriergetrocknete
Reagenzienmischungen für die quantitative Echtzeit-RT-PCR (RT-qPCR) zu entwickeln. In Zusammenarbeit mit industriellen Partnern wurden
dazu verschiedene Varianten einer am Institut
hergestellten, lyophilisierten RT-qPCR Chemie mit
lyophilisierten PCR-Reagenzien eines kommerziellen Anbieters verglichen.
Eine der wesentlichen Herausforderungen am Institut
für Mikrobiologie der Bundeswehr ist die schnelle und
verlässliche Detektion biologischer Agenzien mittels
qPCR und RT-qPCR. Besonders wichtig hierbei ist
die Adaptation der PCR-Technik an zum Teil
restringierte Feldbedingungen. Um hier eine
erfolgreiche Anwendung zu gewährleisten, müssen
qPCR und RT-qPCR Assays in einem stabilen und
leicht zu transportierenden Format zusammengestellt
werden. Die Einzelreagenzien und Reagenzienmischungen müssen im Idealfall ohne Kühlkette
transportiert und gelagert werden können. Daher sind
lyophilisierte Produkte zu bevorzugen, da diese
aufgrund größerer Robustheit und Unempfindlichkeit
gegenüber Temperaturschwankungen einen deutlichen Vorteil gegenüber flüssigen PCR-Reagenzien
bieten. Zudem bestehen Unterschiede in der Stabilität
und Empfindlichkeit eingesetzter PCR Enzyme
(Polymerasen). Neben der Taq Polymerase zur
Amplifikation von DNS-Doppelsträngen stellt auch die
Reverse Transkriptase, die bei RNS Nachweisen zur
Umschreibung der RNS in cDNS eingesetzt werden
muss, ein besonders störanfälliges Enzym mit
raschem Aktivitätsverlust bei ungekühlter Lagerung
dar.
Ziel des Projektes war die Entwicklung und eigene
Herstellung kompletter lyophilisierter RT-qPCRReagenzienmischungen für den Nachweis von RNSErregern. Für eine erfolgreiche Lyophilisierung
Abbildung
1:
Anwendung
der
molekularbiologischen
Nachweismethode Echtzeit-PCR (qPCR: DNS Erreger, RT-qPCR:
RNS Erreger) unter Feldbedingungen.
143
wurden Glycerol- und Detergenzien-freie Enzymformulierungen benötigt. Da Produktion, Stabilität,
Versendung und Langzeitlagerung der Enzyme ohne
diese Zusätze erschwert ist, sind derartige RohReagenzien bisher kaum kommerziell verfügbar. Es
gelang jedoch im Rahmen dieses Projektes, die
entsprechenden Enzympräparationen in Zusammenarbeit mit einem mittelständischen deutschen
Unternehmen verfügbar zu machen. Die benötigten
Enzyme wurden rekombinant in einem E.coli-System
exprimiert und speziell aufgereinigt. Die Formulierung
der Enzyme kann dabei universell verändert und an
verschiedene Bedingungen angepasst werden. Nach
Prüfung verschiedener RT-Enzym-Varianten und
unterschiedlicher
Taq-Polymerase-Varianten
in
verschiedenen Formulierungen und Konzentrationen
wurde eine geeignete Kombination aus Reverser
Transkriptase und Taq-Polymerase identifiziert.
Vollständige PCR-Reagenzienmischungen konnten
anschließend unter Nutzung verschiedener Schutzund Hilfsstoffe erfolgreich lyophilisiert werden. Die
Mixe wurden einer optischen Prüfung auf Integrität
und Kompaktheit unterzogen und funktionell in drei
unterschiedlichen RT-qPCR-Systemen getestet. Zur
Etablierung der RT-qPCR Mixe erfolgte die Testung
mit RNS aus Krim Kongo Hämorrhagischem
Fiebervirus (CCHF „in- vitro“ Transkript; ivt). Zur
nachfolgenden Optimierung und zum direkten
Vergleich wurde RNS aus MS2-Phagen und RNS aus
einem synthetisch hergestellten Kontrollsystem
(„Random Internal Control“ = RaIC) eingesetzt. Die
analytische Sensitivität (Limit of Detection = LOD)
wurde
anhand
von
RNS-Verdünnungsreihen
bestimmt. Die dabei mit in-house lyophilisierten
Reagenzienmischungen erreichten LODs wurden mit
dem bereits fertig lyophilisierten Produkt eines
kommerziellen Anbieters verglichen.
Abbildung 2: Übersicht der Komponenten für funktionelle
Reagenzienmischungen. Die kompletten Reagenzienmischungen
werden lyophilisiert und auf der SmartCycler Echtzeit-PCR-Plattform
(Fa. Cepheid) getestet.
Im Laufe des Projektes konnte gezeigt werden, dass
die in-house etablierten lyophilisierten RT-qPCR
Reagenzienmischungen sehr gut funktionierten. Für
das RaIC-System lag die Nachweisgrenze mit beiden
Produkten (in-house/kommerziell) bei 100 Genomkopien pro Reaktionsansatz. Für den Nachweis von
RNS, isoliert aus MS2-Phagen, konnten sogar 10
Genomkopien pro Reaktionsansatz mit kommerzieller
Fertigchemie und 1 Genomkopie pro Reaktionsansatz
mit komplett lyophilisierten RT-qPCR in-house Mixen
nachgewiesen werden. Zusammenfassend konnte mit
den am InstMikroBioBw selbst hergestellten RT-qPCR
-Reagenzienmischungen eine gleichwertige, teils
sogar bessere, Nachweisleistung erreicht werden, als
mit einem kommerziell verfügbaren lyophilisierten
Fertigreagenz.
Abbildung 3: Funktionelle Testung in-house
lyophilisierter RT-qPCR Reagenziensätze
zum Nachweis von RNS isoliert aus MS2
Phagen. Dargestellt sind der Nachweis von bis
zu 1 Kopie RNS (A) in Echtzeit sowie (B) in der
Gelelektrophorese.
Abbildung
4:
Verwendung
kommerziell
erworbener
lyophilisierter
RT-qPCR
Reagenziensätze zum Nachweis von RNS
isoliert aus MS2 Phagen (Vergleich zu in-house
lyophilisierter RT-qPCR Chemie). Dargestellt
sind der Nachweis von bis zu 10 Kopie RNS (A)
in Echtzeit sowie (B) in der Gelelektrophorese
144
STAN-PROJEKT IMB-46-2009 | Medizinische B-Aufklärung und Verifikation
Felduntersuchungen zur Au;klä rung natü rlicher Ausbreitungsgebiete von potenziellen biologischen Kampfstoffen und anderen hochkontagiö sen humanpathogenen Krankheitserregern
♦ STAN-Unterprojekt 46-2009-01
Zusammenarbeit mit dem Sanitätsdienst der mongolischen Streitkräfte
♦ STAN-Unterprojekt 46-2009-05
Seroprävalenzstudie zur Charakterisierung von akut fieberhaften Erkrankungen unklarer
Ursache in Georgien
♦ STAN-Unterprojekt 46-2009-06
Studie zur Seroprävalenz bestimmter Infektionskrankheiten in den Streitkräften Aserbaidschans
♦ STAN-Unterprojekt 46-2009-07
Vektordruckbestimmung Truppenübungsplatz Heuberg 2012/2013
Fragestellung
Ziele
Zahlreiche als potenzielle biologische Kampfstoffe
eingestufte Krankheitserreger sind weltweit in
Naturherden enzootisch oder auch endemisch
verbreitet. Dabei korreliert das Auftreten menschlicher
Krankheitsfälle mit der geographischen Verteilung und
Häufigkeit der natürlichen Reservoire und Überträger.
Bei ungewöhnlichen Krankheitsausbrüchen ist daher
zur Unterscheidung natürlicher Ursachen von
gezielten Freisetzungen die genaue Kenntnis der
infektionsepidemiologischen Ausgangssituation sowie
die Identifizierung und ggf. Typisierung der
natürlicherweise
auftretenden
Krankheitserreger
notwendig. Neben der spezialisierten (veterinär-)
medizinischen und biologischen Probensammlung
sind dabei regelmäßig auch zeitnahe Laboruntersuchungen unter einfachen Bedingungen vor Ort
erforderlich.
Ergebnisse
derartiger
Naturherduntersuchungen bilden eine wesentliche Grundlage
für die Durchführung von Ausbruchsuntersuchungen
und Verifikationsmaßnahmen.
Ein Ziel des Projektes ist die Planung und
Durchführung
von
pround
retrospektiven
infektionsepidemiologischen, -epizootologischen und
biologischen Naturherduntersuchungen, einschließlich
Datenerhebung, biomedizinischer Probennahme und
Probentransport sowie Laboranalysen unter Feldbedingungen. Damit soll eine mögliche Gefährdung
durch potentielle biologische Kampfstoffe oder andere
hochkontagiöse Krankheitserreger in Einsatzräumen
der Bundeswehr im Vorfeld erkannt und bewertet
werden. Dies schließt insbesondere auch die
Zusammenarbeit mit Forschungseinrichtungen und
Programmen in Ländern ein, in denen die
entsprechenden Krankheiten auch heute noch
endemisch vorkommen. Im Rahmen der Unterprojekte kann eine Aus-, Fort- und Weiterbildung von
Personal des InstMikroBioBw in den erforderlichen
Techniken und Einsatzkonzepten sichergestellt
werden.
145
145
STAN-UNTERPROJEKT 34-2001-15 | B-Spezialdiagnostik und Hochsicherheitslabor
STAN-UNTERPROJEKT 46-2009-01 | Medizinische B-Aufklärung und Verifikation
Zusammenarbeit mit dem Sanitä tsdienst der
mongolischen Streitkrä fte
mongolischen Verteidigungsminister erfolgte. Im
September
2012
erfolgte
eine
einwöchige
Einweisung des mongolischen Laborpersonals durch
die Abteilung Med. B-Aufklärung und Verifikation.
Bearbeiter
OSV Dr. Moßbrugger
Laufzeit
07/2009 bis 09/2012
Sachstand
Im Rahmen des mongolisch-deutschen bilateralen
Jahresprogrammes führt das Institut für Mikrobiologie
der Bundeswehr gemeinsam mit dem Sanitätsdienst
der mongolischen Streitkräfte seit 2007 Studien zur
Untersuchung von Infektionskrankheiten in der
Mongolei durch. Unter anderem konnten so
virologische und bakteriologische Materialien für das
Institut gewonnen werden. Weiterhin wurden
epidemiologische Daten erhoben und mongolische
Mikrobiologen und Laborassistenten ausgebildet.
Allerdings
zeigten
sich
im
Rahmen
der
Zusammenarbeit immer wieder erhebliche Defizite
bei
der
technischen
Laborausstattung
des
mongolischen Zentralkrankenhauses in Ulan Bator.
Dies schränkte auch die Kooperationsmöglichkeiten
in der deutsch-mongolischen Zusammenarbeit immer
wieder ein.
Zielsetzung
Ziel war es, die technische Ausstattung des Labors
im Zentralkrankenhaus der mongolischen Streitkräfte
soweit zu verbessern, dass eine sinnvolle Arbeit des
in Deutschland ausgebildeten Laborpersonals in Ulan
Bator ermöglicht wird. Die Laborausstattung sollte
auch als Ausgangsbasis für weitere gemeinsame
Forschungsprojekte in der Mongolei dienen. Das
Vorhaben wurde als Maßnahme MNG-J-008-12 in
das bilaterale mongolisch-deutsche Jahresprogramm
aufgenommen.
Bewertung
Die
übergebene
Laborausstattung
ermöglicht
erstmals eine breite infektiologische Diagnostik im
Zentralkrankenhaus der mongolischen Streitkräfte.
Die seit vielen Jahren in Deutschland durchgeführte
Ausbildung von mongolischem Fachpersonal wird
dadurch nachhaltig nutzbar. Durch die Versorgbarkeit
des Labors mit Reagenzien aus chinesischer
Produktion wird auch ein eigenständiger Betrieb in
Ulan Bator ermöglicht. Weitere Studien zum
Vorkommen und zur Verbreitung gefährlicher
Infektionskrankheiten wie Pest, Milzbrand oder
Fleckfiebern könnten mit den nun in der Mongolei
vorhandenen Geräten durchgeführt werden.
Ausblick
Eine Fortsetzung der Zusammenarbeit zwischen dem
mongolischen
Sanitätsdienst
und
dem
InstMikroBioBw
ist
seitens
des
Zentralen
Sanitätsdienstes der Bundeswehr derzeit nicht
vorgesehen. Die Laborgeräteausstattung wird
momentan
im
Rahmen
eines
mongolischamerikanischen Forschungsprojektes in der Mongolei
genutzt. Im Jahr 2013 erfolgen keine weiteren
Aktivitäten in der Mongolei seitens der Abteilung für
Medizinische B-Aufklärung und Verifikation.
Ergebnisse
Aus Haushaltsmitteln des Bundesministeriums für
Gesundheit konnte Anfang 2012 eine BasisLaborausstattung zur Durchführung einfacher
serologischer und molekularbiologischer Untersuchungen beschafft werden. Ein mongolischer
Laborassistent wurde im Rahmen der militärischen
Ausbildungshilfe bis Mitte 2012 in München in die
Gerätebedienung
eingewiesen.
Anschließend
erfolgte der Transport der Ausrüstung in die
Mongolei. Eine vorgesehene technische Übergabe
vor Ort war nicht unmittelbar realisierbar, sodass im
April 2012 in Ulan Bator zunächst nur eine formelle
Übergabe durch den Deutschen Botschafter an den
146
STAN-UNTERPROJEKT 34-2001-15 | B-Spezialdiagnostik und Hochsicherheitslabor
STAN-UNTERPROJEKT 46-2009-05 | Medizinische B-Aufklärung und Verifikation
Seroprä valenzstudie zur Charakterisierung von akut
;ieberhaften Erkrankungen unklarer Ursache in Georgien
Bearbeiter
OFA Dr. Wölfel
Laufzeit
07/2011 bis 06/2012
Sachstand
Die öffentliche Gesundheits-Surveillance in Georgien
stützt sich zurzeit im Wesentlichen auf die passive
Meldung von Krankheitsfällen durch die Anbieter von
Gesundheitsleistungen.
Die
Verbreitung
von
Infektionskrankheiten, wie u.a. dem durch Hantaviren
ausgelösten Hämorrhagischen Fieber mit renalem
Syndrom oder dem Krim-Kongo-HämorrhagischenFieber (CCHF) wurde bisher noch nicht in größerem
Umfang untersucht.
Zielsetzung
Im Rahmen einer gemeinsamen Studie mit dem
United States Army Medical Research Institute for
Infectious
Diseases
(USAMRIID)
und
dem
georgischen National Center for Disease Control and
Public Health wurden zwischen November 2007 und
Dezember
2011
in
mehreren
georgischen
Krankenhäusern Blutproben von Patienten mit einer
akuten fieberhaften Erkrankung unklarer Ursache
entnommen und epidemiologische Daten erfasst. Die
Proben wurden durch die Abteilung Med. BAufklärung und Verifikation und die Abteilung
Virologie und Rickettsiologie auf Antikörper gegen
Krim-Kongo-Hämorrhagischen-Fiebervirus,
Hantaviren und Sandfliegenfieberviren getestet. Weitere
serologische und molekularbiologische Untersuchungen auf andere Krankheiten (u.a. Q-Fieber,
Brucellose und Fleckfieber) werden durch andere
Projektpartner in den USA durchgeführt.
Methoden
Für die Durchführung der Untersuchungen wurden
Erreger-spezifische immunologische Verfahren im
Sinne einer Stufendiagnostik angewandt: Nach
initialen IgM und IgG Suchtestungen mittels ELISA
wurden spezifische Immunfluoreszenztests und
Western-Blot-Assays zur Bestätigung durchgeführt.
es im weiteren Verlauf zum Auftreten eines
lebensbedrohlichen septischen Krankheitsbildes. Aus
den Serumproben von drei dieser Patienten wurden
im weiteren Verlauf IgM- und IgG-Antikörper gegen
Krim-Kongo-Hämorrhagisches-Fiebervirus nachgewiesen. Material zum direkten Nachweis des
Krankheitserregers stand im Rahmen der Studie
nicht zur Verfügung. Alle drei Patienten stammten
aus einem Distrikt in West-Georgien, nahe der
Grenze zur Türkei, einem Land mit einer seit
mehreren Jahren bekannten CCHF-Endemie. Bei
zwei weiteren Patienten aus dem Raum Tiflis konnte
serologisch eine akute Hantavirus-Infektion mit
renalem Syndrom diagnostiziert werden.
Bewertung
Gemeinsame Studien mit Gesundheitseinrichtungen
in Ländern wie Georgien bieten dem InstMikroBioBw
die Möglichkeit seine Untersuchungsverfahren für in
Deutschland seltene, gefährliche Infektionserreger an
klinischen Materialien einzusetzen und zu erproben.
Weiterhin können so Erkenntnisse über die
Verbreitung von Krankheitserregern in diesen
Ländern gesammelt werden. Die Ergebnisse dieses
Projektes zeigen allerdings, dass Infektionen durch
Krim-Kongo-Hämorrhagischen-Fiebervirus,
Hantaviren oder Sandfliegenfieberviren derzeit nur eine
geringe Häufigkeit und Bedeutung in Georgien
haben.
Ausblick
Die georgischen Projektpartner zeigen großes
Interesse an einer weiteren Kooperation zur
Verbesserung
der
Diagnostik
gefährlicher
Infektionskrankheiten in Georgien. Eine Fortsetzung
der Zusammenarbeit zwischen dem georgischen
National Center for Disease Control and Public
Health und dem InstMikroBioBw ist jedoch seitens
des Zentralen Sanitätsdienstes der Bundeswehr
derzeit nicht vorgesehen.
Ergebnisse
Während des Studienzeitraums wurden Proben von
insgesamt 703 Patienten mit einem bei Aufnahme im
Krankenhaus bestehendem Fieber unklarer Ursache
(FUO) gesammelt. Bei vierzehn dieser Patienten kam
147
STAN-UNTERPROJEKT 34-2001-15 | B-Spezialdiagnostik und Hochsicherheitslabor
STAN-UNTERPROJEKT 46-2009-06 | Medizinische B-Aufklärung und Verifikation
Studie zur Seroprä valenz bestimmter Infektionskrankheiten in den Streitkrä ften Aserbaidschans
InstMikroBioBw
für
die
entsprechenden
Infektionskrankheiten
entwickelten
Diagnostikalgorithmen.
Bearbeiter
OFA Dr. Wölfel
Laufzeit
12/2011 bis 11/2012
Sachstand
Gefährliche Infektionskrankheiten wie das KrimKongo-Hämorrhagische Fieber (CCHF), Tularämie,
FSME und Hantaviren sind auf dem Gebiet der
ehemaligen Sowjetunion weit verbreitet. Allerdings
sind genaue Daten insbesondere zum Vorkommen
dieser Krankheiten in ehemaligen Sowjetrepubliken,
wie u.a. Aserbaidschan im Westen nicht verfügbar.
Aufgrund dieser fehlenden Datenlage und auch
fehlender Kontakte zu Gesundheitseinrichtungen in
Endemiegebieten war es dem InstMikroBioBw in der
Vergangenheit nicht möglich, Kontrollmaterial für die
Überprüfung von Diagnostikverfahren zu erhalten.
Zielsetzung
Im Rahmen einer gemeinsamen Studie mit dem
Walter Reed Army Institute of Research (WRAIR)
und dem Sanitätsdienst der aserbaidschanischen
Streitkräfte wurden zwischen April 2010 und April
2012 Blutproben von 948 aserbaidschanischen
Soldaten entnommen. Die Proben wurden u.a. durch
das InstMikroBioBw auf Antikörper gegen Tularämie,
FSME-, CCHF-, WNV und Hantaviren getestet.
Weitere serologische Untersuchungen auf andere
Krankheiten (u.a. Q-Fieber, Brucellose, Typhus und
Fleckfieber) werden durch andere Studienpartner in
den USA durchgeführt. Die Untersuchungen am
InstMikroBioBw
wurden
mit
personeller
Unterstützung aus den Teileinheiten 020 und 030
durchgeführt. Die Studie wurde als Maßnahme AZE-J
-015-12 in das bilaterale aserbaidschanisch-deutsche
Jahresprogramm aufgenommen.
Methoden
Für die Durchführung der Untersuchungen wurden
verschiedene
immunologische
Verfahren
als
Stufendiagnostik
angewandt:
Nach
initialen
Suchtestungen mittels ELISA wurden Immunfluoreszenztests und Western-Blot-Assays zur
Bestätigung durchgeführt. Alle Untersuchungen
wurden innerhalb von zwei Wochen in Zusammenarbeit mit Militärwissenschaftlern des aserbaidschanischen Sanitätsdienstes in München durchgeführt.
Damit verbunden war gleichzeitig eine Schulung der
aserbaidschanischen
Partner
in
die
am
Ergebnisse
Für die im Rahmen der Studie untersuchten Antikörper gegen Tularämie, FSME-, CCHF-, WNV und
Hantaviren wurden Seroprävalenzraten zwischen
0,1% und 6% gefunden. Aufgrund der im Rahmen
der Probennahme zusätzlich erhobenen epidemiologischen Parameter konnten Rückschlüsse auf
regional erhöhte Expositionsrisiken in Aserbaidschan
gezogen
werden.
Sämtliche
Untersuchungsergebnisse wurden dem aserbaidschanischen
Sanitätsdienst zur Verfügung gestellt.
Bewertung
Die Durchführung der gemeinsamen Untersuchungen
gestaltete sich komplikationslos, insbesondere da
einer der aserbaidschanischen Ärzte bereits zuvor im
Rahmen der militärischen Ausbildungshilfe in
Deutschland ausgebildet worden war. Allerdings bat
nach einer ersten Bewertung der Studienergebnisse
der aserbaidschanische Sanitätsdienst darum, bis
zum Abschluss einer ausführlichen Bewertung von
einer detaillierten wissenschaftlichen Veröffentlichung
der
Studienergebnisse
abzusehen.
Das
InstMikroBioBw
und
die
amerikanischen
Studienpartner stehen derzeit im Dialog mit der
aserbaidschanischen Seite um eine rasche Freigabe
der Daten zur Publikation zu erreichen.
Ausblick
Die studienbezogene Zusammenarbeit mit dem
InstMikroBioBw und insbesondere die durchgeführten
Ausbildungsmaßnahmen
wurden
durch
die
aserbaidschanischen Projektpartner als sehr positiv
bewertet. Eine Fortsetzung der Zusammenarbeit
zwischen dem aserbaidschanischen Sanitätsdienstes
und dem InstMikroBioBw ist allerdings seitens des
Zentralen Sanitätsdienstes der Bundeswehr derzeit
nicht vorgesehen.
148
STAN-UNTERPROJEKT 34-2001-15 | B-Spezialdiagnostik und Hochsicherheitslabor
STAN-UNTERPROJEKT 46-2009-07 | Medizinische B-Aufklärung und Verifikation
Vektordruckbestimmung Truppenü bungsplatz
Heuberg 2012/2013
Vergleich zum Vorjahr wieder signifikant an. Mit 10%
im gesamten Untersuchungsgebiet liegt die PuumalaVirus Prävalenz weiterhin allerdings deutlich unter
dem 2007 beobachteten Wert von 25%.
Bearbeiter
OSV Dr. Moßbrugger
Laufzeit
03/2012 bis 08/2013
Sachstand
Seit 2007 untersucht die Abteilung Med. BAufklärung und Verifikation im Rahmen einer
jährlichen Vektordruckuntersuchung die Durchseuchung der Wildmäusepopulation mit Hantaviren
auf dem Truppenübungsplatz (TrÜbPl) Heuberg. Die
dabei
angewandten
Einsatzverfahren
wurden
kontinuierlich weiterentwickelt und verbessert. Auf
Grundlage der Ergebnisse werden Empfehlungen zur
Prävention von Infektionen bei Soldaten gegeben.
Zielsetzung
Das Ziel des seit sechs Jahren regelmäßig
durchgeführten Vorhabens ist die Erprobung neuer
Verfahren und Materialien zur Med. B-Aufklärung und
die Schulung des militärischen Personals in Verbindung mit einer regelmäßigen epizootischen Felduntersuchung in einem bekannten Hantavirus-Naturherd. Hierzu sollen durch Lebendfang von Kleinnagern mit anschl. Sektion und Unter-suchung der
gewonnenen Proben auf Hantaviren im schnell-verlegbaren B-Labor Erkenntnisse über die Belastbarkeit
von Einsatzverfahren gewonnen werden. Die Ergebnisse der Untersuchung werden dem zuständigen
Wehrbereichshygieniker zur Erstellung einer jährlich
aktuellen Risiko-Analyse zur Verfügung gestellt .
Methoden
Wildmäuse wurden mittels 250 Sherman-Lebendfallen an vier Fangorten über fünf Tage gefangen.
Nach tierschutzgerechter Tötung erfolgte die Organpräparation und Blutentnahme zur Untersuchung auf
Hantaviren. Mittels eines eigens für diesen Zweck
entwickelten Echtzeit-RT-PCR-Verfahrens wurden
die gefangenen Wildmäuse auf eine Infektion mit
einem Virus des Genus Hantavirus untersucht.
Ergebnisse 2012
Seit der letzten Untersuchung im Jahr 2011 kam es
im Jahr 2012 wieder zu einem leichten Anstieg der
Wildmäusepopulation auf dem TrÜbPl Heuberg.
Während bei Vergleichsuntersuchungen 2011 nur
insgesamt 54 Mäuse gefangen wurden, konnte 2012
mit insgesamt 82 gefangenen Mäusen wieder ein
leichter Anstieg in der Mäusepopulation verzeichnet
werden. Auffallend war, dass in Bereichen, an denen,
aufgrund von Empfehlungen in den Vorjahren,
Biotoppflegemaßnahmen
durchgeführt
wurden,
deutlich weniger Mäuse gefangen wurden als in den
Vorjahren. Der Anteil der mit dem für Menschen
pathogenen Puumala-Virus infizierten Mäuse stieg im
Ergebnisse 2013
Seit der letzten Untersuchung im Vorjahr ist es zu
einem starken Rückgang der Wildmäusepopulation in
den untersuchten Bereichen des TrÜbPl HEUBERG
gekommen. Während bei der Vergleichsuntersuchung im Jahr 2012 noch 82 Wildmäuse gefangen
wurden, konnten in diesem Jahr bei gleichem Vorgehen nur insgesamt 7 Wildmäuse gefangen werden.
Ursachen für diese stark reduzierte Mäusepopulation
kann unter anderem die bereits im Jahr 2012
festgestellte vorbildliche Umsetzung der empfohlenen
Biotop-Pflegemaßnahmen an der unterschiedlichen
Fangorten sein. Weitere Einflussfaktoren könnten
sowohl die lange Kälteperiode im Winter 2012/2013,
sowie starke natürliche Schwankungen in der
Mäusepopulation, wie sie auch schon in den Jahren
2007 (70 Mäuse) und 2008 (7 Mäuse) aufgetreten
sind, sein. Bei keiner der gefangenen Lang- und
Kurzschwanzmäuse wurden Hantaviren nachgewiesen. Aufgrund der geringen Anzahl an gefangenen Mäusen konnte deshalb keine statistisch verlässliche Aussage über die Durchseuchungsrate der
Mäusepopulation mit Hantaviren getroffen werden.
Bewertung
Felderprobungen
stellen
eine
unverzichtbare
Überprüfungsmöglichkeit für die Einsatzkonzepte der
Med. B-Aufklärung dar. Erst durch die Anwendung in
einer Umgebung mit eingeschränkten Ressourcen
kann die Tauglichkeit neuer Untersuchungsverfahren tatsächlich bewertet werden. Die Untersuchung der Wildmäusepopulation auf dem TrÜbPl
Heuberg stellt hier eine ideale Möglichkeit - auch für
die Zukunft - dar. Sofern die Wildmäusepopulation
wieder anwächst und die nächste Winterperiode
übersteht, ist für 2014 eine Gefährdungszunahme für
Soldaten nicht auszuschließen. Aufgrund der
2012/13 gemachten Beobachtungen zur Wildmäusepopulation ist davon auszugehen, dass das Risiko
einer Hantavirus-Infektion auf dem TrÜbPl Heuberg
derzeit auf niedrigem Niveau stagniert.
Ausblick
Die Erprobung von Einsatzverfahren der Med. B-Aufklärung in Verbindung mit einer epizootologischen
Untersuchung sollte jährlich fortgesetzt werden. Die
dabei gewonnen Ergebnisse können direkt für die
Weiterentwicklung der Ausrüstung und die Ausbildung der Soldaten der Teileinheit 050 genutzt
werden. Durch die Übung der Felduntersuchung
einer Nagetier-population werden auch Erkenntnisse
zur Bewertung ähnlicher Szenarien in Einsatzgebieten der Bundeswehr gesammelt.
149
STAN-PROJEKT IMB-47-2009 | Medizinische B-Aufklärung und Verifikation
Weiterentwicklung und Bereitstellung von Verfahren und
Konzepten zur Veri;ikation von B-Kampfstoffeinsä tzen und
zur Untersuchung bioterroristischer Bedrohungsszenarien
♦ STAN-Unterprojekt 47-2009-02
Herstellung von inaktivierten Präparationen biologischer Substanzen als B-Darstellungsmittel
und Kontrollmaterial
♦ STAN-Unterprojekt 47-2009-04
NATO Übung PRECISE RESPONSE 2012 in Kanada
Fragestellung
Ziele
Die Abteilung Medizinische B-Aufklärung und
Verifikation des InstMikroBioBw hat als Teil der Task
Force Med. ABC-Schutz den Auftrag, bei
Bedrohungen durch ABC-Kampfstoffe bzw. durch
vergleichbare Gefahrstoffe eine rasche Aufklärung der
Ursachen
ungewöhnlicher
Erkrankungen
und
Todesfälle durch den schnell-verlegbaren und
weltweiten Einsatz von Fachpersonal vor Ort in
Einsatzgebieten der Bundeswehr und anderen
Ländern sicherzustellen. Auf dem Gebiet des
Medizinischen B-Schutzes zählen hierzu die
Untersuchung Erkrankter und Verstorbener sowie
kranker und toter Tiere, die Beratung und
Unterstützung behandelnder Ärzte und Tierärzte
sowie
die
qualifizierte,
biomedizinische
BProbennahme
und
Labordiagnostik. Weiterhin
umfasst der Auftrag die Erstellung von Beiträgen zur
forensischen Untersuchung und Beweissicherung bei
einer vermuteten Freisetzung von B-Kampfstoffen
oder ähnlichen Noxen mit dem Ziel der Verifikation.
Auftrags- und lageabhängig wird Personal des
InstMikroBioBw der Task Force Med. ABC-Schutz als
Medizinische B-Aufklärungs- und Diagnostik-Gruppe
unterstellt.
Die Abteilung Medizinische B-Aufklärung und
Verifikation sichert durch ständige Weiterentwicklung
vorhandener
Verfahren
die
Bereitstellung
mikrobiologischer und infektionsepidemiologischer
Fachberatung vor Ort sowie die wissenschaftliche
Leitung der biomedizinischen Probennahme und
Beweissicherung bei Menschen, Tieren, Leichen,
Kadavern
und
Überträgertieren
entsprechend
internationaler Übereinkommen. Ebenso werden
diagnostische und forensische Verfahren im Med. BSchutz unter Berücksichtigung aktueller Bedrohungsanalysen und neu verfügbarer Nachweistechnologien
weiterentwickelt. Wesentliche Bestandteile des
Projektes sind die Konzeption, Planung und
Durchführung von diagnostischen Untersuchungen
zur Identifizierung potenzieller B-Kampfstoffe und
anderer
hochkontagiöser
humanpathogener
Krankheitserreger
entsprechend
internationaler
Übereinkommen
unter
Einsatz
von
schnellverlegbarer Laborausrüstung. Die Aus-, Fort- und
Weiterbildung von Personal des InstMikroBioBw und
der Task Force Med. ABC-Schutz in den
erforderlichen Techniken und Einsatzkonzepten kann
im Rahmen des Projektes ebenfalls gezielt
sichergestellt werden.
150
150
STAN-UNTERPROJEKT 34-2001-15 | B-Spezialdiagnostik und Hochsicherheitslabor
STAN-UNTERPROJEKT 47-2009-02 | Medizinische B-Aufklärung und Verifikation
Herstellung von inaktivierten Prä parationen biologischer
Substanzen als B-Darstellungsmittel und Kontrollmaterial
Bearbeiter
OFA Dr. Wölfel
Laufzeit
01/2012 bis 12/2013
Sachstand
Die Abteilung Med. B-Aufklärung und Verifikation
entwickelt Verfahren für die B-Probennahme und den
Nachweis biologischer Kampfstoffe mit Hilfe schnellverlegbarer Laborausrüstung. Zur Überprüfung der
Wirksamkeit der Verfahren in der Entwicklungsphase,
bei Ausbildungsmaßnahmen und Übungen und zur
Qualitätssicherung im laufenden Laborbetrieb sind
ungefährliche Kontrollmaterialen erforderlich. Der
Einsatz von Simili-Substanzen oder aufgestockten
Probenmaterialien ermöglicht allerdings nicht die
lückenlose Überprüfung des Prozesses von der
Probennahme bis hin zum Untersuchungsergebnis
unter Nutzung der tatsächlich vorgehaltenen
Verfahren.
Zielsetzung
Für die realitätsnahe Schulung, Ausbildung und
Testvalidation werden daher sicher inaktivierte
Präparationen realer B-Agenzien benötigt, die
gefahrlos (auch außerhalb von Sicherheitslaboreinrichtungen) gehandhabt werden können und
sowohl in molekularbiologischen als auch in
immunologischen Verfahren noch reaktiv sind. Ziel
des Projektes ist, handhabungssichere und
ungefährliche Präparationen der Erreger Yersinia
pestis, Francisella tularensis, Brucella abortus,
Bacillus anthracis und mindestens einer Orthopocken
-Virusspezies herzustellen. Der Herstellungs- und
Inaktivierungsprozess erfolgt qualitätsdokumentiert
nach GLP-Standards.
Ergebnisse
2012 und 2013 wurden mittels Gammabestrahlung
inaktivierte Standardpräparationen der Bakterienstämme Yersinia pestis EV76, Francisella tularensis
LVS, Bacillus anthracis Sterne sowie eines
Kuhpockenvirus hergestellt. Alle Materialien waren
nach der Bestrahlung vollständig abgetötet bzw.
inaktiviert und dennoch weiterhin mit immunologischen und molekularbiologischen Nachweisverfahren detektierbar. Im Rahmen von Ausbildungsmaßnahmen und Übungen wurden diese inaktivierten
Erregerpräparationen in verschiedenen Matrices
eingesetzt und zur Kontrolle der eingesetzten
Probennahme- und Nachweisverfahren erfolgreich
verwendet.
Bewertung
Die
Eigenherstellung
und
Nutzung
der
strahleninaktivierten Erregerpräparationen hat sich
bereits in der Vergangenheit bei der Entwicklung
neuer Probennahme- und Nachweisverfahren für die
Med. B-Aufklärung bewährt. Sie bietet insbesondere
Vorteile bei der Ausbildung von Personal, da eine
kontinuierliche Ergebniskontrolle des gesamten
Prozesses von der Probennahme, Verpackung,
Transport, Aufbereitung bis zum abschließenden
Erregernachweis ermöglicht wird. Auch für die
Testentwicklung bietet der Einsatz der strahleninaktivierten Kontrollmaterialen erhebliche Vorteile,
da
so
erregerbezogene
Matrixeffekte
und
Interaktionen, z.B. bei der Probenextraktion oder dem
Einsatz interner Kontrollsysteme, realitätsnah geprüft
werden können.
Ausblick
Die
Herstellung
weiterer
strahleninaktivierten
Erregerpräparationen sollte auch in den folgenden
Jahren standardisiert fortgesetzt werden.
Methoden
Die Erreger werden zunächst auf Kulturplatten oder
in Flüssigkulturen, bzw. in Zellkulturmedien
angezüchtet.
Anschließend
erfolgt
eine
standardisierte Hochdosis-Gammabestrahlung. Der
Erfolg dieses Inaktivierungsschrittes wird durch eine
Anreicherungskultur mit Rückkultivierung überprüft.
Alle Herstellungs- und Überprüfungsschritte erfolgen
bis zum sicheren Nachweis der Inaktivierung in der
für den jeweiligen Erreger erforderlichen Sicherheitslaborumgebung. Das inaktivierte Erregermaterial wird
auf erhaltene Reaktivität in immunologischen und
molekularbiologischen Systemen geprüft und zur
Verbesserung der Lagerbarkeit gefriergetrocknet.
151
STAN-UNTERPROJEKT 34-2001-15 | B-Spezialdiagnostik und Hochsicherheitslabor
STAN-UNTERPROJEKT 47-2009-04 | Medizinische B-Aufklärung und Verifikation
NATO U3 bung PRECISE RESPONSE 2012
in Kanada
Reagenzien eingesetzt und erprobt. Alle Einsätze
und Laborarbeiten wurden durch wissenschaftliches
Personal der kanadischen Seite beobachtet und
bewertet.
Bearbeiter
OFA Dr. Wölfel
Laufzeit
01/2012 bis 10/2012
Sachstand
Die Abteilung Med. B-Aufklärung und Verifikation des
InstMikroBioBw nimmt als Element der Task Force
Med. ABC-Schutz seit 2009 an der multinationalen
NATO Übung Precise Response auf einem
Übungsgelände in Suffield, Kanada teil. Im Rahmen
dieser Übungsteilnahme werden eigene BAufklärungskräfte des InstMikroBioBw, sowie das
schnell-verlegbare B-Labor und B-Fachberater nach
Kanada verlegt und dort während der dreiwöchigen
internationalen Übungsphase eingesetzt.
Zielsetzung
Ziele der Übungsteilnahme sind die Erprobung von
Einsatzkonzepten und Diagnostikverfahren, sowie die
Verbesserung der operativen Zusammenarbeit im
multinationalen Einsatzverbund. Durch die Bereitstellung von Laborleistungen für alle teilnehmenden
Nationen und gemeinsame B-Aufklärungseinsätze
wird das eingesetzte Personal unter realitätsnahen
Bedingungen trainiert. Eigene Erfahrungen und
Vorgehensweisen können mit verbündeten Streitkräften und ebenfalls teilnehmenden deutschen ABCAbwehr-Kräften ausgetauscht werden.
Methoden
Zu Beginn der Übung wurden B-Szenarien
eigenständig durch Med. B-Schutzkräfte aufgeklärt.
Dabei
bestand
auch
die
Möglichkeit
zur
Durchführung
einer
Tierkadaversektion
unter
Feldbedingungen. Im weiteren Verlauf wurden die BAufklärungstrupps zur Expertenberatung multinationalen NATO-Führungselementen unterstellt. Es
wurden die Aufklärungsergebnisse anderer Nationen
bewertet, sowie situative Probennahme- und
Aufklärungsunterstützung für andere Nationen
geleistet. Das schnell-verlegbare B-Labor untersuchte während der gesamten Übung B-Proben aller
teilnehmenden Nationen. 2012 erfolgte erstmals die
Verlegung der gesamten Laborausrüstung per
Luftfracht. Das schnell-verlegbare B-Labor wurde in
Kanada in zwei luftgestützten Zeltsystemen frei
aufgebaut und betrieben. Der Prototyp einer neu
entwickelten Handschuhbox wurde ebenso wie am
InstMikroBioBw entwickelte gefriergetrocknete PCR-
Ergebnisse
Die Med. B-Aufklärungstrupps des InstMikroBioBw
verfügen mittlerweile über eine umfangreiche
Ausbildung zur Untersuchung und Fachberatung in
beliebigen B-Lagen. Das standardisierte Vorgehen
zur B-Aufklärung und Probennahme wurde in allen
Fällen korrekt an die jeweilige Einsatzsituation
angepasst und umgesetzt. Im schnell-verlegbaren BLabor wurden während der Übung insgesamt 95
Proben von 11 verschiedenen Teams untersucht.
Dabei
wurden
die
Ergebnisse
von
547
Einzeltestungen innerhalb von 24 Stunden nach
Probeneingang dem Einsender in einem schriftlichen
Befund
berichtet.
Durch
die
kanadische
Übungsleitung wurden im Verlauf zunehmend
kompliziertere Probenmatrices und geringere BAgenzien-Konzentrationen eingespielt. Trotz dieser
zusätzlichen Herausforderungen gelang es alle
ausgebrachten B-Agenzien, selbst in niedrigsten
Konzentrationen, korrekt zu identifizieren.
Bewertung
Aufgrund der vergleichenden Beobachtung aller
Teilnehmer an der Übung Precise Response 2012
liegt
die
Leistungsfähigkeit
der
Med.
BAufklärungstrupps und des schnell-verlegbaren BLabors derzeit im NATO-Vergleich bezüglich
Spektrum, Effektivität, Effizienz und Geschwindigkeit
deutlich an der Spitze. Wesentlich sind hierbei
insbesondere der Einsatz von hoch qualifizierten und
speziell trainierten militärischen Fachkräften in allen
Funktionen, sowie die flexible Einsatztaktik der
Teams.
Ausblick
Die Teilnahme an multinationalen Übungen wie
Precise Response ist unerlässlich für die Prüfung und
Verbesserung von Einsatzabläufen innerhalb der
Task Force Med. ABC-Schutz, sowie für den
internationalen
Erfahrungsaustausch
über
Ausrüstung und Probenahmeverfahren. Geeignete
Übungsmöglichkeiten sollten daher auch in Zukunft
wahrgenommen werden.
152
STAN-PROJEKT IMB-48-2009 | Medizinische B-Aufklärung und Verifikation
Weiterentwicklung und Erprobung von Ausrü stung und Verfahren zur biomedizinischen Probennahme und zur Identi;izierung biologischer Kampfstoffe sowie
anderer kontagiö ser menschlicher Krankheitserreger unter Feldbedingungen
♦ STAN-Unterprojekt 48-2009-05
Entwicklung und Erprobung eines Schutzsystems für die Aufbereitung potentiell infektiösen
Untersuchungsmaterials unter einfachen Laborbedingungen im Feld (siehe separater Bericht)
♦ STAN-Unterprojekt 48-2009-10
Entwicklung und Herstellung gefriergetrockneter qPCR-Reagenzien (IMB Mix) für die Anwendung unter Feldbedingungen
♦ STAN-Unterprojekt 48-2009-11
LCD-Array zur Identifizierung von Hantavirus-Spezies unter einfachen Laborbedingungen
♦ STAN-Unterprojekt 48-2009-12
Entwicklung eines variabel anpassbaren und stabilen internen Kontrollsystems für RT-qPCR
Anwendungen
♦ STAN-Unterprojekt 48-2009-13
Molekularbiologischer Nachweis von Botulinum-Toxin-Genen unter Feldbedingungen
♦ STAN-Unterprojekt 48-2009-15
Etablierung einer Methode zur Kultivierung von Rickettsien im Hühnerei
♦ STAN-Unterprojekt 48-2009-17
Etablierung einer Methode
Fragestellung
Ziele
Methoden
zum
Nachweis
von
biologischen
Kampfstoffen
und
anderen
hochkontagiösen
Krankheitserregern unterliegen einem ständigen
technischen Weiterentwicklungsprozess. Gleiches gilt
für die Ausrüstung zum Schutz für medizinisches
Personal bei der Probennahme und bei der
Durchführung von Laboruntersuchungen. Allerdings
werden die spezifischen Anforderungen an die
militärische Einsetzbarkeit unter Feldbedingungen
typischerweise von den Anbietern nicht berücksichtigt.
Neue Geräte, Reagenzien und Verfahren müssen
daher zunächst bezüglich ihrer Anwendbarkeit für die
Med.
B-Aufklärung
und
Diagnostik
unter
Einsatzbedingungen erprobt und bewertet werden.
Sofern technische Lösungen für die Anwendung unter
einfachen Laborbedingungen nicht marktverfügbar
sind, müssen diese selbst entwickelt werden.
Im Rahmen dieses Projektes soll die Erprobung von
Ausrüstung, Geräten und Verfahren auf die
sanitätsdienstliche Anwendbarkeit im Rahmen des
Med. B-Schutzes bei Probennahme, Probentransport
und Diagnostik unter Feldbedingungen und einfachen
Laborbedingungen erfolgen. Gleichermaßen sollen
die Verfahren zur Probennahme, Diagnostik und zu
biologischen Schutzmaßnahmen auf der Basis
kommerziell verfügbarer Lösungen für die Anwendung
unter Feldbedingungen und unter einfachen Laborbedingungen weiterentwickelt werden. Ergebnisse
aus diesen Arbeiten sollen den übrigen Abteilungen
des InstMikroBioBw und anderen Dienststellen der
Bundeswehr zur Nutzung und für weitere
Entwicklungsarbeiten zur Verfügung gestellt werden.
153
153
STAN-UNTERPROJEKT 34-2001-15 | B-Spezialdiagnostik und Hochsicherheitslabor
STAN-UNTERPROJEKT 48-2009-10 | Medizinische B-Aufklärung und Verifikation
Entwicklung und Herstellung gefriergetrockneter
qPCR-Reagenzien (IMB Mix) fü r die Anwendung unter
Feldbedingungen
war Gegenstand weiterer Optimierungsarbeiten.
Bearbeiter
M Dr. Felder
Laufzeit
03/2012 bis 11/2013
Sachstand
Gefriergetrocknete PCR-Reagenzien zum Nachweis
von DNS- und RNS-Erregern sind aufgrund ihrer Vorteile bei Lagerung und Handhabung unter einfachen
Laborbedingungen von besonderer Bedeutung für
den Einsatz des schnell-verlegbaren B-Labors des
InstMikroBioBw.
Zielsetzung
Ziel des Projektes „IMB-Mix“ war die eigene
Herstellung
gefriergetrockneter
ReagenzienMischungen für die Echtzeit-PCR-Diagnostik auf der
SmartCycler-Plattform der Firma Cepheid. Zunächst
sollten dabei Nachweissysteme für Y. pestis, F.
tularensis, B. abortus, B. mallei, B. anthracis, sowie
für die Gene, die für die Toxine Rizin und Abrin
kodieren, hergestellt werden. Alle Assays sollten als
Duplexassays mit einer spezifischen internen
Kontrolle aus dem Genom des Bakteriums Pantoea
agglomerans lyophilisiert werden.
Methoden
Zur Herstellung geeigneter qPCR ReagenzienMischungen für die Lyophilisierung wurden zunächst
am Beispiel des Erregers Y. pestis die Grundbedingungen in Bezug auf Menge und Konzentration
eingesetzter Puffer, Enzyme, Primer und Sonden
festgelegt und getestet. Es folgte die Auswahl und
Festlegung mehrerer Assays aus dem Genom von
Pantoea agglomerans (GAPDH, 16S, PantocinA,
ATP-Synthase β-Untereinheit) und deren Einbeziehung in die laufenden Erregerassays. Ziel war die
Prüfung auf mögliche Kreuzreaktionen mit dem
eigentlichen Erreger-Nachweissystem.
Ergebnisse 2012
Für alle in den Projektzielen definierten Erreger und
Toxine konnten lyophilisierte IMB-Mixe hergestellt
werden. Bei der weiteren Testung der Mixe zeigte
sich, dass drei der internen Kontrollassays (GAPDH,
16S, PantocinA) nicht geeignet waren, da bei diesen
eine Beeinflussung des Haupttargets zu erkennen
war oder unspezifische Nebenbanden auftraten. Es
folgte die Festlegung auf den internen Kontrollassay
„ATP Synthase β-Untereinheit“. Eine Probit-Analyse
zur Sensitivität dieses Kontrollassays erbrachte eine
95%-Nachweisgrenze von 2 Kopien pro Reaktion. Es
folgte die Sensitivitätstestung als Duplex Assay unter
Einbezug des Erregers Y. pestis. Der Duplexassay
zeigte zunächst keine ausreichende Sensitivität und
Ergebnisse 2013
Für die Weiterentwicklung der IMB-Mixe wurden
zusätzliche Optimierungsschritte durchgeführt. Dabei
wurden die Assays als Hot-Start Assays konzipiert.
Durch den Einsatz eines glycerolfreien anti-Taq
Antikörpers
gelang
bereits
eine
deutliche
Verbesserung der Sensitivität der lyophilisierten
Mixe. Durch den weiteren Einsatz einer AptamerKopplung der Taq Polymerase konnte die Sensitivität
der IMB-Mixe nochmals um ein Hundertfaches
verbessert werden. Das Aptamer besitzt gegenüber
dem Antikörper den Vorteil bei hohen Temperaturen
nicht irreversibel zu denaturieren und steht somit
während der gesamten PCR Reaktion zur Verfügung.
Die Spezifität der PCR kann dadurch deutlich
verbessert werden. Die verbesserten lyophilisierten
Reagenzienmischungen
wurden
sowohl
als
erregerspezifische Assays für den Nachweis oben
genannter Erreger, als auch als universell
anwendbare „Blank assays“ (ohne Primer und
Sonden) konzipiert. Es wurde jeweils eine definierte
Menge
an
interner
Kontroll-DNS
(Pantoea
agglomerans) festgelegt, die mit einem definierten ctWert von 30 (±1) detektiert werden muss.
Bewertung
Bis zum Projektende 2013 konnten die Duplexassays
auf der Basis weiterer methodischer Verbesserungen
und alternativer Ausgangsreagenzien für alle in den
Projektzielen genannten Erreger umgesetzt und ihre
Nachweisgrenzen deutlich verbessert werden. Es
zeigte sich, dass bei dem ausgewählten internen
Kontrollassay aus dem Genom von Pantoea
agglomerans für jeden einzelnen erregerspezifischen
IMB-Mix Assay eine individuelle Auswahl an
eingesetzter Kopienzahl getroffen werden muss, um
den festgelegten ct-Wert von 30 (±1) zu erreichen.
Ausblick
Die IMB Mixe sollen nachfolgend auch als RT-qPCR
Mixe konzipiert werden, um zudem virale Erreger
detektieren zu können. Hier ist eine Zusammenarbeit
mit der Firma Altona geplant, die glycerolfreie,
rekombinante und somit für Lyophilisierung geeignete
Reverse Transkriptase zur Verfügung stellen kann.
Dabei muss zunächst eine Testung verschiedener
RT-Mutanten in Zusammenspiel mit der bisher
eingesetzten Apta Taq Polymerase, sowie der
verwendeten Puffersysteme der einzelnen Enzyme
erfolgen. Dies soll zunächst Erreger-unabhängig an
einem künstlichen Kontrollsystem (Random Internal
Control Sequenz) durchgeführt werden. Erfolgversprechende Varianten werden an Realproben
(Hantavirus oder CCHFV) untersucht.
154
STAN-UNTERPROJEKT 34-2001-15 | B-Spezialdiagnostik und Hochsicherheitslabor
STAN-UNTERPROJEKT 48-2009-11 | Medizinische B-Aufklärung und Verifikation
LCD-Array zur Identi;izierung von HantavirusSpezies unter einfachen Laborbedingungen
Bearbeiter
M Dr. Felder, OFA Dr. Wölfel
Laufzeit
03/2012 bis 12/2013
Sachstand
Für den Nachweis von Hantavirus-Infektionen in
Nagetierproben bei Felduntersuchungen wurde im
Rahmen des Projektes IMB-STAN 48-2009-08 eine
EvaGreen-basierte Pan-Hantavirus Echtzeit-RT-PCR
(RT-qPCR) entwickelt. Diese ermöglicht zwar den
Nachweis von Hantaviren auf Genus-Ebene, jedoch
erlaubt sie nicht die eindeutige Unterscheidung
zwischen unterschiedlich pathogenen HantavirusSpezies. Zur Speziesidentifizierung ist derzeit daher
immer noch eine Sequenzierung des RT-PCRProduktes erforderlich. Dies kann jedoch nicht
zeitnah unter Feldbedingungen erfolgen. Ein Verfahren zur raschen Identifizierung humanmedizinisch
relevanter Hantavirus-Spezies unter einfachen Laborbedingungen steht derzeit damit nicht zur Verfügung.
Zielsetzung
Ziele des Projektes war die Entwicklung eines
feldtauglichen, chip-basierten Verfahrens (low-costand-density;
LCD)
zur
speziesspezifischen
Hybridisierung von zuvor generierten HantavirusGenabschnitten.
Methoden
Die Entwicklung der dem Hybridisierungschip
zugrunde liegenden Pan-Hanta Echtzeit RT-PCR
basierte auf einem aktuellen Vergleich aller
bekannten Hantavirus L-Segment-Genomsequenzen.
Das durch die Pan-Hanta RT-PCR amplifizierte
Segment wurde als Ausgangsbasis für das Design
der speziesspezifischen Sonden des Hybridisierungschips herangezogen. Insgesamt wurden so 36
verschiedene Gensonden entworfen. Zur Testung
von einigen derzeit am InstMikroBioBw nicht
verfügbaren Hantavirus-Spezies wurden entsprechende DNA-Genfragmente synthetisch hergestellt und
durch in-vitro Transkription in RNS umgeschrieben.
Ergebnisse
Die Anpassung des Pan-Hanta RT-PCR Protokolls
auf die für die Sondenhybridisierung erforderlichen
asymmetrischen Amplifikationsbedingungen gelang
zunächst
problemlos.
Für
die
ersten
Hybridisierungsversuche auf dem LCD-Chip wurden
nicht-stringente Reaktionsbedingungen gewählt.
Dabei zeigte sich wie erwartet für die einzelnen
Hantavirus-Spezies ein breites Hybridisierungsmuster an verschiedenen Gensonden. Unter
stationären Laborbedingungen konnten insbesondere
die auf dem Chip abgebildeten humanpathogenen
Hantaviren klar voneinander unterschieden werden.
Im Rahmen einer Felduntersuchung wurde der ChipPrototyp dann auch unter einfachen Laborbedingungen getestet: Während dabei der bei 37°C
durchzuführende Hybridisierungsschritt im Feld
sicher in einem Kleininkubator durchgeführt werden
konnte, ergaben sich methodische Schwierigkeiten
bei Wasch- und Färbeschritten. Diese sind
grundsätzlich
bei
Raumtemperatur
(18-22°C)
durchzuführen. Es zeigte sich jedoch, dass dieses
Temperaturfenster in der Feldanwendung (z. B. in
Zelten oder Barracken) typischerweise nicht sicher
eingehalten werden kann. Unspezifische und nicht
sicher reproduzierbare Hybridisierungsergebnisse
waren daher die Folge. Trotz mehrerer weiterer
Anpassungen des Versuchsprotokolls gelang es
außerhalb stationärer Laborbedingungen nicht
gleichbleibende Muster bei der Chip-Hybridisierung
für verschiedene Hantavirus-Spezies zu erhalten. Im
Gegensatz zur mit einem Kleininkubator konstant
erzielbaren Hybridisierungstemperatur von 37°C
standen bis zum Ende 2013 keine unter
Feldbedingungen betreibbaren Inkubatoren für den
Temperaturbereich 18-22°C zur Verfügung.
Bewertung
Die Umsetzung eines chipbasierten Hybridisierungsverfahrens zur Identifikation von Hantavirus-Spezies
mit der bereits entwickelten Pan-Hantavirus RT-PCR
ist grundsätzlich möglich. Das auf den ersten ChipPrototypen verwendete Gensonden-Profil war bereits
für die meisten Hantavirus-Spezies geeignet und
bedarf nur noch minimaler Anpassungen für einzelne
Arten. Da eine technisch gleichförmige Durchführung
der Raumtemperatur-abhängigen Reaktionsschritte
im Feld jedoch nicht erzielt werden konnte, erscheint
das bei der Identifizierung anderer RNS-Viren zwar
bewährte LCD-Array-System für die HantavirusDifferenzierung unter einfachen Laborbedingungen
nicht geeignet.
Ausblick
Aufgrund
der
unter
Feldbedingungen
nicht
reproduzierbaren
Ergebnisse
der
HantavirusChiphybridisierung wurde das Projekt 2013 beendet.
Die Erkenntnisse aus den abgeschlossenen
Entwicklungsphasen lassen die Technik des LCDArray zur Differenzierung von Hantavirus-Spezies
allerdings für die Anwendung unter stationären
Laborbedingungen
als
geeignet
erscheinen.
Entsprechende weitere Untersuchungen sollten
durch die Abteilung Virologie & Rickettsiologie
durchgeführt werden. Dabei sollte als technische
Varianten zur temperaturkonstanten Inkubation
alternativ auch eine Wasserbadinkubation geprüft
werden.
155
STAN-UNTERPROJEKT 34-2001-15 | B-Spezialdiagnostik und Hochsicherheitslabor
STAN-UNTERPROJEKT 48-2009-12 | Medizinische B-Aufklärung und Verifikation
Entwicklung eines variabel anpassbaren und stabilen
internen Kontrollsystems fü r RT-qPCR Anwendungen
Bearbeiter
M Dr. Felder
Laufzeit
04/2012 bis 08/2013
Sachstand
Die quantitative Echtzeit-PCR (qPCR oder RT-qPCR)
ist mittlerweile eine Routinemethode in der mikrobiologischen Diagnostik von Infektionskrankheiten.
Unerlässlich für RT-qPCR sind quantifizierte DNS
oder RNS Standardpräparationen (z.B. als interne
Kontrolle), die die Assayleistung auch bei Abwesenheit des Targets in der untersuchten Probe belegen.
In der RT-qPCR wird dafür häufig „ungeschützte
RNS“ (z.B. in-vitro Transkript) eingesetzt, die sehr
störanfällig gegenüber äußeren Einflüssen und
RNasen ist. Besonders für den Einsatz in einem
schnell-verlegbaren B-Labor besteht daher der
Bedarf an robusten RNS Kontrollen und Standards,
die sich mit allen gängigen Methoden und Technologien viraler Assays vereinbaren lassen. Sinnvoll ist
die Verwendung kompetitiver Systeme, die eine
Unterscheidung von Target und interner Kontrolle
über Sondenmarkierung und Produktgröße erlauben.
Zielsetzung
Ziel des Projektes war die Entwicklung eines
Systems zur Herstellung einer durch Verpackung
geschützten universellen, kompetitiven internen RNS
Kontrolle. Einfache Bakteriophagen wie MS2 Phagen
stellen die Grundlage für ein solches System zur
Verpackung von RNS Molekülen dar. Hier wird der
Selbstzusammenbau-Mechanismus der MS2 Phagen
genutzt, der schon mit Hilfe lediglich zweier Proteine
aus dem Phagengenom umgesetzt werden kann.
Methoden
Auf der Basis der MS2 Phagen Hüll- und Reifungsproteine wurde ein Ausgangskonstrukt synthetisiert,
welches Sequenz-optimierte, Phagen-spezifische
Verpackungsstellen sowie eine multiple Klonierungsstelle zur Insertion verschiedener Zielsequenzen
enthält. Die Klonierungsstelle wurde zur Herstellung
zweier kompetitiver, interner Kontrollsysteme zum
Nachweis von Hantavirus und
Krim-Kongo
Hämorrhagischem-Fieber-Virus (CCHFV) genutzt.
Die synthetisch hergestellten Konstrukte wurden in
ein
Arabinose-abhängiges
Expressionssystem
kloniert und führen bei Induktion zur Entstehung nicht
-lytischer Virus-ähnlicher Partikel (VLPs) mit verpackter Ziel-RNS. Die RNS kann mit Hilfe gängiger
Nukleinsäure-Aufreinigungsverfahren gewonnen und
als interne Kontrolle für RT-qPCR eingesetzt werden.
Ergebnisse 2012
Die Herstellung von VLPs konnte für die zwei
genannten Systeme (Hantavirus, CCHFV) erfolgreich
gezeigt werden. Der Nachweis der Hantavirusinternen-Kontrolle erfolgte über einen Interkalationsfarbstoff, während der CCHFV-Kontrollnachweis über
spezifische Sondendetektion umgesetzt wurde. In
beiden Fällen wurden die jeweiligen VLPs als lyophilisierte Aufreinigungskontrolle zusammen mit dem
zu analysierenden Probenmaterial eingesetzt. Die
Amplifikate wurden in Echtzeit und über AgaroseGelelektrophorese getestet und erlaubten eine spezifische Unterscheidung vom jeweiligen Haupttarget
über Produktgröße sowie entweder Schmelzkurvenanalyse oder Sondenmarkierung. Durch die Ermittlung der Detektionslimits für jeden Assay konnte gezeigt werden, dass durch die interne Kontrolle keine
negative Beeinflussung des Hauptassays erfolgt.
Ergebnisse 2013
Im Projekt sollte weiterführend eine universelle
interne Kontrolle für mehrere virale hämorrhagische
Fieberviren in einem Konstrukt entwickelt werden. Als
Targets wurden Arenavirus, Denguevirus, Hantavirus
und CCHFV definiert und geeignete Primerbindungsstellen aus den jeweiligen zur Verfügung stehenden
Erreger Assays ausgewählt. Das entsprechende 4fach Konstrukt wurde nach oben genannten Maßgaben konzipiert und kloniert. Die VLPs wurden im
genannten Expressionssystem hergestellt. Drei der
vier Erreger konnten in kompetitiven Assays erfolgreich getestet werden. Durch die Ermittlung der
Detektionslimits für jeden Assay konnte gezeigt
werden, dass auch hier durch die interne Kontrolle
keine negative Beeinflussung des HaupttargetAssays erfolgte. Da der Assay für den Nachweis von
Denguevirus zwischenzeitlich intern geändert wurde,
konnte er nicht in die Testung einbezogen werden.
Bewertung
Im Projekt konnte eine stabile Verpackung
verschiedener interner RNS-Kontrollsequenzen unter
Verwendung eines Basis-Expressionskonstruktes
gezeigt werden. Aufgrund seiner Gestaltung mit
multiplen Klonierungsstellen erlaubt das System die
Anpassung an nahezu jede Gensequenz und stellt
damit ein flexibles System zur breiten Anwendung in
der RT-qPCR-Entwicklung dar. Aufgrund der einfachen Handhabung des Systems und der hohen
Nachhaltigkeit durch in-house Herstellung kann auf
kommerzielle Anbieter verzichtet werden. VLPs sind
robust und lassen sich gut lyophilisieren. Das System
ist somit auch für Feldanwendungen gut geeignet.
Ausblick
Das System soll auf weitere Erreger angepasst
werden. Hier ist im Besonderen ein Konstrukt für
Filoviren (Ebolavirus, Marburgvirus) im Fokus.
Zudem könnte ein Konstrukt für die am Institut neu
etablierte Denguevirus PCR generiert werden.
156
STAN-UNTERPROJEKT 34-2001-15 | B-Spezialdiagnostik und Hochsicherheitslabor
STAN-UNTERPROJEKT 48-2009-13 | Medizinische B-Aufklärung und Verifikation
Molekularbiologischer Nachweis von
Botulinum-Toxin-Genen unter Feldbedingungen
bindungsverstärkte Gensonden erreicht.
Bearbeiter
OFA Dr. Wölfel
Laufzeit
03/2012 bis 01/2013
Sachstand
Botulinum-Neurotoxine
(BoNT)
werden
von
verschiedenen Stämmen der Bakterienspezies
Clostridium botulinum, C. butyricum, C. baratii sowie
C. argentinens ausgeschieden und gelten als potentielle biologische Kampfstoffe. Für den Nachweis von
BoNT stehen in der schnell-verlegbaren Laborausstattung des InstMikroBioBw bisher nur immunologische Testverfahren zur Verfügung. Ein molekularbiologisches Verfahren zum Nachweis der ToxinGene
aus
Clostridium-Kulturen
oder
wenig
aufgereinigten
Toxinpräparationen
unter
den
Bedingungen des schnell-verlegbaren B-Labor ist
nicht vorhanden. Damit fehlt ein, vom immunologischen Nachweis unabhängiges, molekularbiologisches Zweitverfahren zur Bestätigung von BoNT in
Kulturen,
Lebensmitteln,
Mageninhalt
oder
Umweltproben.
Zielsetzung
Ziele des Projektes ist die Auswahl geeigneter
Echtzeit-PCR-Methoden für den Nachweis von
BoNT-Gensequenzen und deren Anpassung an die
molekularbiologischen Verfahren des schnellverlegbaren B-Labors der Teileinheit Med. BAufklärung und Verifikation.
Methoden
Botulinum-Neurotoxine
stellen
eine
äußerst
heterogene Gruppe bakterieller Toxine dar, die
zunächst ausschließlich aufgrund der Fähigkeit in
Säugetieren das Krankheitsbild des Botulismus zu
erzeugen, charakterisiert wurden. Tatsächlich handelt
es sich allerdings um mindestens sieben
verschiedene Toxin-Typen mit unterschiedlichem
Molekularaufbau.
Der
molekularbiologische
Nachweis muss daher mehrere Zielgensequenzen
umfassen. Als Ausgangsbasis hierfür wurde in
diesem Projekt eine von Kirchner et al. 2010
beschriebene BoNT-Pentaplex-qPCR verwendet.
Diese umfasst Primersätze zur Detektion der
humanpathogenen Botulinumtoxin-Typen A, B, E und
F, sowie eine interne Kontrollreaktion. Der simultane
Toxinnachweis wird durch vier mit locked-nucleicacid (LNA) oder minor-grove-binder (MGB)
Ergebnisse
Die von Kirschner beschriebene qPCR-Methode
konnte zunächst nicht erfolgreich auf die Geräte- und
Reagenziensysteme des schnell-verlegbaren BLabors übertragen werden. Insbesondere der gleichzeitige Einsatz von vier Primersätzen und den LNA-/
MGB-Gensonden zusammen mit gefriergetrockneten
qPCR-Reagenzien
zeigte
trotz
verschiedener
Anpassungen
keine
stabilen
Amplifikationsergebnisse. Um eine gleichzeitige Suchdiagnostik für
alle vier BoNT-Typen (A, B, E, F) dennoch zu
ermöglichen wurde die Methode daher auf den
Interkalationsfarbstoff EvaGreen umgestellt. Mit
diesem Verfahren konnte eine Nachweisempfindlichkeit für die vier BoNT zwischen 12 und 125
Genomkopien pro Reaktion erzielt werden. Im
Rahmen der NATO Übung Precise Response 2012
wurde das angepasste BoNT-qPCR-Verfahren
erfolgreich unter Feldbedingungen zur BoNTGendetektion angewandt.
Bewertung
Im Rahmen des Projektes konnte das von Kirchner et
al.
beschriebene
qPCR-System
für
den
(undifferenzierten) Nachweis aller vier BoNT unter
einfachen Laborbedingungen optimiert werden. Die
Bestätigung eines BoNT-spezifischen Amplifikationsprodukts erfolgt dabei im Feld zunächst durch eine
Schmelzkurvenanalyse, sowie ggf. durch den Einsatz
der Gelelektrophorese im Feld. In einem weiteren
Untersuchungsschritt kann dann durch den getrennten Einsatz der BoNT-typenspezifischen Primersätze
eine gezielte BoNT Identifikation erfolgen.
Ausblick
Der molekularbiologische Nachweis von BoNTbildenden Clostridienspezies ist eine wichtige
Fähigkeit für das schnell-verlegbare B-Labor des
InstMikroBioBw. Ergänzend zu dem beschriebenen
Nachweissystem für BoNT-Gensequenzen soll daher
in einem Folgeprojekt noch eine ergänzende qPCRMethode zur Detektion der (genetisch stabileren)
nontoxic-nonhemagglutinin (NTNH) Proteinkomponente für die Feldanwendung entwickelt werden.
157
STAN-UNTERPROJEKT 34-2001-15 | B-Spezialdiagnostik und Hochsicherheitslabor
STAN-UNTERPROJEKT 48-2009-15 | Medizinische B-Aufklärung und Verifikation
Etablierung einer Methode zur Kultivierung
von Rickettsien im Hü hnerei
Bearbeiter
OSV Dr. Moßbrugger
Laufzeit
05/2013 bis 12/2014
Sachstand
Rickettsien können als obligat intrazelluläre Erreger
nur in lebenden Zellen vermehrt werden. Das dafür
typischerweise angewandte Verfahren ist die Anzucht
in permanenten Zellkulturlinien. Insbesondere bei
Isolationsversuchen
aus
menschlichem
oder
tierischem Probenmaterial wird der Anzuchterfolg
dabei jedoch immer wieder durch bakterielle
Kontaminationen gefährdet. Auch ist die Gewinnung
größerer Mengen von Rickettsien, wie sie zum
Beispiel für die Entwicklung bestimmter Antigentest
benötigt werden, durch das langsame Wachstum
einiger Rickettsien-Spezies in der Zellkultur
erschwert. Das embryonierte Hühnerei bietet eine
weitere Möglichkeit zur intrazellulären Vermehrung
von Rickettsien. Mit Hilfe der Immunabwehr des
Hühnerembryos können Anzuchterfolge sogar bei
geringfügen Mengen bakterieller Kontaminanten im
Probenmaterial noch erzielt werden.
Zielsetzung
Ziel des Projektes war es eine Methode zur Anzucht
von Rickettsien im Hühnerei zu etablieren mit
anschließender Aufreinigung der Rickettsien aus dem
Dottersackmaterial. Durch die Aufreinigung werden
ausreichende
Erregerbzw.
Antigenmengen
generiert, die für die weitere Entwicklung neuer
Diagnostikverfahren, wie ELISA- oder Western-Blot
Tests, genutzt werden können.
Zellkultur
überprüft.
Die
gewonnenen
Dottersackzellen wurden bei -80°C eingefroren. Teile
des Materials wurden im STAN-Unterprojekt 48-2009
-17 für die FISH Hybridisierung verwendet.
Im Rahmen des Projekts wurde eine Arbeitsanweisung geschrieben, so dass die Methode, mit
nur wenigen Anpassungen, auch sehr gut für die
Anzucht anderer Erreger im Hühnerei anwendbar ist.
Im Rahmen der Versuche konnten auch wichtige
Erkenntnisse über das Wachstumsverhalten der
verschiedenen Rickettsien-Spezies im Hühnerei
gewonnen werden, wie z. B. das Temperaturoptimum
für die Anzucht.
Bewertung
Die Methode Anzucht im Hühnerei konnte erfolgreich
etabliert werden. Es war bereits in relativ kurzer Zeit
möglich zwei Rickettsien-Arten im Hühnerei zu
vermehren und Material für eine zukünftige
Aufreinigung zu gewinnen.
Ausblick
Die zukünftigen Versuche haben das Ziel sämtliche
Rickettsien-Isolate
des
InstMikroBioBw
im
embryonierten Hühnerei anzuziehen. Dadurch soll
die Generierung von genügend Material für die
weitere Entwicklung neuer Diagnostikverfahren wie
ELISA- oder Western-Blot Tests sichergestellt
werden.
Methoden
Die Methode zur Anzucht von Rickettsien im
Hühnerei
wurde
bereits
in
mehreren
Veröffentlichungen beschrieben und musste durch
mehrere Vorversuche den Gegebenheiten am Institut
angepasst werden.
Ergebnisse
Im Jahr 2013 wurde die Methode zur Anzucht von
Rickettsien etabliert, so dass bis Ende des Jahres
bereits zwei Rickettsien-Spezies (R. monacensis und
R. honei) auf dem Hühnerei angezogen werden
konnten. Der Erfolg des Wachstums wurde mittels
Real-Time PCR und weiterer Passagierung auf
158
STAN-UNTERPROJEKT 34-2001-15 | B-Spezialdiagnostik und Hochsicherheitslabor
DRITTMITTELPROJEKT FKZ 2513AA0421 | Medizinische B-Aufklärung und Verifikation
Deutsches Partnerschaftsprogramm fü r biologische Sicherheit und
Gesundheitssicherstellung: Au;bau eines Netzwerkes fü r Biologische Sicherheit und Diagnostik gefä hrlicher Infektionskrankheiten
Bearbeiter
Dr. Strehle, OFA Dr. Wölfel
Laufzeit
11/2013 bis 10/2016
Zielsetzung
Für die Erkennung gefährlicher Infektionskrankheiten
war in Georgien seit Beginn der 50er Jahre des
letzten Jahrhunderts ein Labornetzwerk aus
sogenannten „Anti-Pest Stationen“ zuständig. Die
Aufgaben dieser Stationen lagen allerdings nur in der
Eindämmung bestimmter Infektionen, wie z. B. der
Pest.
Andere,
seltene
Krankheiten
wurden
hauptsächlich zentral durch Laboreinrichtungen in
Moskau untersucht. Nach der Unabhängigkeit
Georgiens konnte das Land den Aufgaben einer
nationalen
Versorgung
des
öffentlichen
Gesundheitswesens deshalb nur unzureichend
nachkommen. Ebenso kam es durch die Aus- oder
Abwanderung von fachlich geschultem Personal zu
einem deutlichen Fähigkeitsverlust, der sich in
Georgien bis heute auch in einem Mangel an
wissenschaftlichem Nachwuchs bemerkbar macht.
in relevanten Themenfeldern des deutschen
Biosicherheitsprogramms identifiziert. Diese werden
nun in mehreren gemeinsamen Projekten durch
georgische
Jungwissenschaftlern
bearbeitet.
Schwerpunkte
sind
dabei
das
Erlernen
molekularbiologischer Diagnostikverfahren für die
Frühsommer-Meningoenzephalitis (FSME), Orthopockenvirus-Infektionen und die Leptospirose.
Ausblick
Durch die Integration in ein Doktorandenprogramm
sollen die georgischen Jungwissenschaftler weiter an
ihre Heimat gebunden werden und intensiv in
Sicherheitsaspekten, guter wissenschaftlicher Praxis
sowie in der Bekämpfung von gefährlichen
Krankheiten ausgebildet werden. Über das bereits
am Institut für Mikrobiologie der Bundeswehr
bestehende
Kooperationsnetzwerk
wird
eine
Integration der georgischen Partner in europäische
Wissenschaftsnetzwerke erfolgen. Alle Aktivitäten
des Deutschen Biosicherheitsprojektes in Georgien
werden fortlaufend mit den Projekten anderer
internationaler Partner aus den USA und der
europäischen Union abgestimmt.
Das Institut für Mikrobiologie der Bundeswehr trägt
im Rahmen des vom Auswärtigen Amt initiierten
Deutschen Partnerschaftsprogramms für biologische
Sicherheit und Gesundheitssicherstellung dazu bei,
medizinisch-wissenschaftliches Laborpersonal in
Georgien
auszubilden
sowie
den
weiteren,
internationalen wissenschaftlichen Austausch und
damit einen sicheren Umgang mit Krankheitserregern
in der Region Armenien-Azerbaidschan-Georgien
sicherzustellen.
Partner ist dabei das georgische National Center for
Disease Control and Public Health (NCDC). Diese
unmittelbar
dem
georgischen
Gesundheitsministerium unterstellte Einrichtung stellt die
labordiagnostische Versorgung und Krankheitsüberwachung für zahlreiche Infektionskrankheiten in
Georgien bereit. Sie ist als WHO-Partnerlabor für
Polio und Influenza benannt und dient als
Referenzeinrichtung für die gesamte Region des
Südkaukasus.
Ergebnisse
Mit dem Projekt wurde im November 2013 begonnen.
Zusammen mit dem georgischen Partner NCDC
wurden zunächst bedeutsame diagnostische Lücken
159
STAN-UNTERPROJEKT 34-2001-15 | B-Spezialdiagnostik und Hochsicherheitslabor
DRITTMITTELPROJEKT TTU 01.801 | Medizinische B-Aufklärung und Verifikation
Early pathogen identi;ication and outbreak management A molecular toolkit for deployable rapid detection of
emerging and re-emerging pathogens in outbreak situations
Bearbeiter
M Dr. Felder, OFA Dr. Wölfel
Laufzeit
01/2013 bis 12/2015
Sachstand
In den vergangen Jahrzehnten hat die quantitative
Echtzeit-PCR (qPCR) zahlreiche neue Möglichkeiten
für den schnellen, empfindlichen und spezifischen
Nachweis von neuartigen und neu auftretenden
Krankheitserregern eröffnet. Allerdings wird der
ausgedehnte Einsatz der qPCR zum Nachweis von
Krankheitserregern, insbesondere in den Ländern mit
häufigen Ausbrüchen neuer Krankheitserreger,
immer wieder dadurch begrenzt, dass die meisten für
die qPCR erforderlichen Reagenzien gekühlt oder
gefroren transportiert und gelagert werden müssen.
Diese Kühlkette zu garantieren ist insbesondere in
tropischen
Ländern
und
bei
Ausbruchsuntersuchungen unter Feldbedingungen zumeist nur
begrenzt möglich.
Zielsetzung
Ziel dieses Projektes ist es daher, am Beispiel eines
Sonden-basierten Echtzeit-PCR-Nachweisverfahrens
zur
Unterscheidung
von
Affenpockenund
Variolavirus, eine gefriergetrocknete ReagenzienMischung zu entwickeln, auf Lagerungsstabilität zu
prüfen und an Referenzmaterial aus
der
umfangreichen Orthopockenvirus-Stammsammlung
des Instituts für Mikrobiologie der Bundeswehr zu
validieren.
Methoden
Zunächst sollte die Vortestung verschiedener qPCRReagenzien-Komponenten und unterschiedlicher
Protokolle zur Gefriertrocknung der einzelnen
Bestandteile erfolgen. Unter Einbezug eines
Sequenz-Alignments mit mehr als 130 Sequenzen
verschiedener
Orthopockenviren
sollte
eine
geeignete Genregion ausgewählt werden. Nach
Auswahl einer geeigneten Genregion aus dem
Zielgen sollte ein spezifisches qPCR-Verfahren zum
Nachweis von Affenpocken Virus und der Sondenbasierten Unterscheidung zu Variolavirus entwickelt
werden. Der Assay sollte nachfolgend für die
Umsetzung als gefriergetrocknete ReagenzienMischung optimiert werden.
Ergebnisse
Als Zielgen für die Assayentwicklung wurde das crmb
Gen ausgewählt, welches für einen löslichen
TNFalpha Rezeptor kodiert. Nach Identifizierung
einer geeigneten Genregion aus dem crmb-Gen
wurde ein spezifisches qPCR-Verfahren zum
Nachweis von Affenpockenvirus und der Sondenbasierten Unterscheidung zu Variolavirus entwickelt.
Der Assay wurde für die Umsetzung als
gefriergetrocknete
PCR-Reagenzien-Mischung
optimiert. Eine Festlegung der qPCR ReagenzienKomponenten
und
des
Protokolls
zur
Gefriertrocknung der einzelnen Bestandteile konnte
erfolgen. Vorversuche mit flüssiger PCR Chemie
wurden erfolgreich durchgeführt und zeigen gute
Nachweise verschiedener Orthopocken-Spezies.
Bewertung
Der Assay scheint gut geeignet, um die
Anforderungen des Sonden-basierten Nachweises
und der Unterscheidung von Affenpockenvirus und
Variolavirus zu erfüllen. Alle Einzelkomponenten
lassen sich gut lyophilisieren, ausreichende
Erfahrungen bezüglich optimaler Umsetzung zu
stabilen, funktionsfähigen Lyophilisaten sind zudem
vorhanden.
Ausblick
Geplant ist die Herstellung einer Prototypencharge
der
gefriergetrockneten
qPCR-ReagenzienMischung. Der Assay soll dann bezüglich
analytischer Sensitivität und Spezifität, Linearität,
Robustheit sowie Intra- und Interassay-Varianz
validiert werden; zudem werden Lagerungsversuche
mit beschleunigter Alterung nach ASTM Standards
unter unterschiedlichen Umgebungsbedingungen
(Temperaturen von 37°C bis 56°C) zur Simulation
von Umwelteinflüssen bei Lagerung und Transport
durchgeführt.
160
Verö ffentlichungen 2012
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4;12:242. doi: 10.1186/1471-2334-12-242.
38. Scholz HC, Margos G, Derschum H, Speck S,
Tserennorov D, Erdenebat N, Undraa B, Enkhtuja
M, Battsetseg J, Otgonchimeg C, Otgonsuren G,
Nymadulam B, Römer A, Thomas A, Essbauer S,
Wölfel R, Kiefer D, Zöller L, Otgonbaatar D,
Fingerle V. High prevalence of genetically diverse
Borrelia bavariensis-like strains in Ixodes
persulcatus from Selenge Aimag, Mongolia. Ticks
Tick Borne Dis. 2012;Oct 16. doi:pii: S1877-959X
(12)00080-5. 10.1016/j.ttbdis.2012.08.004. [Epub
ahead of print]
39. Sonnleitner ST, Simeoni J, Lang S, Dobler G,
Speck S, Zelger R, Schennach H, Lass-Flörl C,
Walder G. Spotted Fever Group - Rickettsiae in
the Tyrols: Evidence by Seroepidemiology and
PCR. Zoonoses Public Health. 2012;[Epub ahead
of print]
40. Speck S, Derschum H, Damdindorj T, Dashdavaa
O, Jiang J, Kaysser P, Jigjav B, Nyamdorj E,
Baatar U, Munkhbat E, Choijilsuren O,
Gerelchuluun O, Römer A, Richards A L, Kiefer D,
Scholz H, Wölfel R, Zöller L, Dobler G, Essbauer
S. Rickettsia raoultii, the predominant Rickettsia
found in Mongolian Dermacentor nuttalli. Ticks
Tick Borne Dis. 2012;3(4): 227-231.
41. Stefanoff P, Pfeffer M, Hellenbrand W, Rogalska
J, Rühe F, Makówka A, Michalik J, Wodecka B,
Rymaszewska A, Kiewra D, Baumann-Popczyk A,
Dobler G. Virus Detection in Questing Ticks is not
a Sensitive Indicator for Risk Assessment of TickBorne Encephalitis in Humans. Zoonoses Public
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42. Tappe D, Nemecek A, Zipp F, Emmerich P,
Gabriel M, Günther S, Dobler G, SchmidtChanasit J, Stich A. Two laboratory-confirmed
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Germany by travelers returning from southeast
Asia. J Clin Virol. 2012;54(3):282-285.
43. Vanhomwegen J, Alves MJ, Zupanc TA, Bino S,
Chinikar S, Karlberg H, Korukluoğlu G, Korva M,
Mardani M, Mirazimi A, Mousavi M, Papa A,
Saksida A, Sharifi-Mood B, Sidira P, Tsergouli K,
Wölfel R, Zeller H, Dubois P. Diagnostic assays
for Crimean-Congo Hemorrhagic Fever. Emerg
Infect Dis. 2012;18(12):1958-1965.
44. Wittwer M, Lasch P, Drevinek M, Schmoldt S,
Indra A, Jacob D, Grunow R. First Report:
Application of MALDI-TOF MS within an External
Quality Assurance Exercise for the Discrimination
of Highly Pathogenic Bacteria from Contaminant
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Sonstige Veröffentlichungen
(nicht „peer-reviewed“)
1. Borde JP, Ruhnke M, Offensperger WB, Schmoldt
S, Wolf T. Murines Fleckfieber: Importierte
Infektion nach Kretaaufenthalt. Epidemiologisches
Bulletin. 2012;49.
2. Brenner B, Endrich A, Pawlitzki B, Trani M,
Tuschak C, Schneider C, Daniels H, Osterberg A,
Eßbauer S, Herr C. Infektionsgefährdung durch
Hantavirus
und
Leptospiren
beim
Styroporrecycling. Arbeitsmedizin-SozialmedizinUmweltmedizin. 2012;47(8):441-446.
3. Dobler
G,
Rieg
S.
Zecken-übertragene
Infektionen. Der Hygieneinspektor. 2012;1:21-25.
4. Dobler G. Auf und davon. Je mobiler die
Menschen, desto wichtiger werden Reiseberatung
und Reisimpfungen. Der Hausarzt. 2012;7(2):2-5.
5. Dobler G. Neues und Bekanntes zur Frühsommer
-Meningoenzephalitis. Ärztliches Journal Reise &
Medizin. 2012;2:32-33.
6. Dobler G. Reiseimpfungen: Immer auch an
Masern denken. Ärztliches Journal Reise &
Medizin 2012, 6:32-33.
7. Dobler G. Zecken überleben 40°C mühelos.
Münch Med Wochenschr. 2012;154:10.
8. Dobler G. Zecken überleben 40°C mühelos.
Pädiatrie hautnah 2012,;24(4):278-279.
9. Dobler G. Zehn Mythen zum Thema Zecken.
Patientenjournal Reise & Gesundheit. 2012;1:1819.
10. Dobler G, Essbauer S. Zeitliche und örtliche
Phylogenie-Analysen zur Verifikation von BAgenzien am Beispiel des Frühsommer-Meningo-
163
enzephalitis-Virus. Jahresbericht
schaftl. Forschung. 2012;94-95.
Wehrwissen-
11. Essbauer S, Marié J L, Cochez C, Thoma BR,
Heyman P. Epidemiology and Driving Factors of
Hantavirus Infections in Western Europe.
International Review of the Armed Forces Medical
Services. (IRAFMS) 2012;85(4):25-45.
12. Essbauer S, Daniels H, Schneider D, Endrich A,
Trani M, Osterberg A, Pfeffer M, Ulrich R.
Gefahren für den Schädlingsbekämpfer durch
Nagetier-übertragene Krankheitserreger.
Der
praktische Schädlingsbekämpfer (DPS). 2012;4:812.
13. Essbauer S, Speck S, Thoma B, Osterberg A,
Bleichert P, Schex S, Dobler G, Bässler C, Müller
J. Nagetier-übertragene Zoonosen entlang eines
Klimagradienten im Nationalpark Bayerischer
Wald. Wehrmed. Monatsschrift. 2012;56(4):1-7.
14. Frangoulidis
D.
Einsatz
molekularer
Typisierungsmethoden zur Untersuchung von QFieberausbrüchen.
Wehrmed.
Monatsschrift.
2012;56, 90-95.
15. Götz M, Ehrle M, Splettstößer WD. „Schneller der
Tularämie auf der Spur“: Entwicklung von
Feldtests zum Antikörpern gegen Francisella
tularensis. Wehrmed. Monatsschrift. 2012;56, 8085.
16. Grass G, Rensing C. Die Entzauberung des
mutmaßlichen Arsenbakteriums. Biospektrum.
2012;18: 796-797.
17. Hanczaruk M, Grass G. Antibiotikaresistenzen
beim
Milzbranderreger
Bacillus
anthracis:
Untersuchung einer umfangreichen Stammsammlung. Wehrwissenschaftliche Forschung.
Jahresbericht. 2012,92-93.
18. Hanczaruk M, Reischl U, Holzmann T,
Niederbichler A, Schneider-Brachert W, Grass G.
Information
zu
Milzbrandinfektionen
bei
Heroinkonsumenten. Wehrmed. Monatsschrift.
2012;56:260-262.
19. Meyer H. Immer wieder in den Schlagzeilen:
Affenpockenviren.
Wehrmed.
Monatsschrift.
2012;56, 201-203.
20. Schlegel M, Baumann K, Breithaupt A, Binder A,
Schotte U, Ruhl S, Krohmann C, Eßbauer S,
Frangoulidis D, Kayßer P, Meyer H, Riehm J,
Faulde M, Lewitzki J, Sauer S, Ulrich RG, Teifke
JP. Spielen Nagetiere als Überträger von
Zoonoseerregern
im
Einsatzgebiet
der
Bundeswehr
in Afghanistan eine Rolle?
Wehrmed. Monatsschrift. 2012;56, 203-207.
21. Schmoldt S, Zöller L. Wissenschaftsbasierte
diagnostische Dienstleistungen im Medizinischen
B-Schutz am Institut für Mikrobiologie der
Bundeswehr. Wehrmed. Monatsschrift. 2012;56.
22. Silaghi C, Baessler C, Baum U, Beierkuhnlein C,
Bleichert P, Bogdan C, Bozem P, Brenauer J,
Fingerle V, Fischer D, Häberlein S, Hautmann W,
Klier C, Klinc C, Liebl B, Lüpke M, Müller J,
Osterberg A, Pfister K, Poljak S, Praßler T, Rinder
H, Schex S, Sing A, Teußer L, Thoma B, Thomas
S, Wildner M, Essbauer S. Vektorübertragene
zoonotische Erkrankungen in Zeiten des
Klimawandels. Der bayerische Forschungsverbund VICCI stellt sich vor. Tierärzteblatt.
2012;3:350-359.
Buchbeiträge
1. Antwerpen M, Pilo P, Wattiau P, Butaye P, Frey J,
and Frangoulidis D. „Bacillus anthracis: Anthrax“.
In: BSL3 and BSL4 Agents, Ed. M. Elschner, S.
Cutler, M. Weidmann and P. Butaye, WileyBlackwell, Weinheim.
2. Berner R Ed, Splettstoesser W, Scholz HC. DGPIHandbuch, 6. Auflage. II 102 Tularämie.
3. Dobler G, Pfeffer M. Spotted fever rickettsiae and
rickettsioses in Germany. In: Mehlhorn H (ed.):
Arthropods as Vectors of Emerging Diseases;
Parasitology Research Monographs Vol 3. Berlin,
Springer Verlag, 361-376.
4. Finke EJ, Gottschalk R, Frangoulidis D. „BGefahren“, in Notfallmedizin, Ed. J. Scholz, P.
Sefrin, B.W. Böttiger, V. Dörges, V. Wenzel, 3.
Auflage, Thieme, Stuttgart, New York.
5. Frangoulidis D. „Biologische Bedrohung“, in
Taktische Medizin, Ed. Neitzel & Ladehof,
Springer, Berlin-Heidelberg.
6. Hanczaruk M, Cutler SJ, Toman R, Frangoulidis
D. „Coxiella burnetii: Q Fever“. In: BSL3 and BSL4
Agents, Ed. M. Elschner, S. Cutler, M. Weidmann
and P. Butaye, Wiley-Blackwell, Weinheim.
7. Lange M. Meine Tätigkeit am Institut für Mikrobiologie der Bundeswehr. In: Der Sanitätsdienst
der Bundeswehr 2010 - Kompendium für den
Sanitätsdienst., Ed. D. Möllmann, Beta, Bonn, pp.
257-259.
8. Maina AN, Speck S, Spitalska E, Toman R,
Dobler G, Cutler SJ: Rickettsia Species:
Rickettsioses. In: BSL3 and BSL4 Agents:
Epidemiology,
Microbiology,
and
Practical
Guidelines. Elschner M, Cutler S, Weidmann M,
Butaye P (eds), Wiley-VCH, Weinheim,
164
Verö ffentlichungen 2012
9. Najdenski H, Speck S: Yersinia Infections. In:
Infectious Diseases of Wild Mammals and Birds in
Europe. 1st edition. Gavier-Widen D, Meredith A,
J P Duff (eds), Wiley-Blackwell, Oxford, pp. 293302.
10. Nitsche A, Meyer H. Variola: smallpox. In: BSL3
and BSL4 Agents: Epidemiology, Microbiology,
and Practical Guidelines. Elschner M, Cutler S,
Weidmann M, Butaye P (eds), Wiley-VCH,
Weinheim, pp. 201-210.
11. Scholz HC, Kämpfer P, Cloeckaert A. Brucella:
Relationship to Other Alphaproteobacteria Current
Taxonomy and the Emergence of New Species
In: Brucella: Molecular Microbiology and
Genomics, Caister Academic Press, eds: Ignacio
López-Goñi and David O'Callaghan. Feb. 2012
ISBN: 978-1-904455-93-6
12. Speck S: Actinobacillus Infections. In: Infectious
Diseases of Wild Mammals and Birds in Europe.
1st edition. Gavier-Widen D, Meredith A, J P Duff
(eds), Wiley-Blackwell, Oxford, pp. 445-446.
13. Speck S: Actinomyces Infections. In: Infectious
Diseases of Wild Mammals and Birds in Europe.
1st edition. Gavier-Widen D, Meredith A, J P Duff
(eds), Wiley-Blackwell, Oxford, pp. 442-443.
14. Speck S: Arcanobacterium Infections. In:
Infectious Diseases of Wild Mammals and Birds in
Europe. 1st edition. Gavier-Widen D, Meredith A,
J P Duff (eds), Wiley-Blackwell, Oxford, pp. 443444.
15. Speck S: Campylobacter Infections. In: Infectious
Diseases of Wild Mammals and Birds in Europe.
1st edition. Gavier-Widen D, Meredith A, J P Duff
(eds), Wiley-Blackwell, Oxford, pp. 398-401.
16. Speck S: Corynebacterium Infections. In:
Infectious Diseases of Wild Mammals and Birds in
Europe. 1st edition. Gavier-Widen D, Meredith A,
J P Duff (eds), Wiley-Blackwell, Oxford, p. 438.
17. Speck S: Dermatophilus Infections. In: Infectious
Diseases of Wild Mammals and Birds in Europe.
1st edition. Gavier-Widen D, Meredith A, J P Duff
(eds), Wiley-Blackwell, Oxford, pp. 439-440.
18. Speck S: Escherichia Infections. In: Infectious
Diseases of Wild Mammals and Birds in Europe.
1st edition. Gavier-Widen D, Meredith A, J P Duff
(eds), Wiley-Blackwell, Oxford, pp. 381-385.
19. Speck S: Haemophilus Infections. In: Infectious
Diseases of Wild Mammals and Birds in Europe.
1st edition. Gavier-Widen D, Meredith A, J P Duff
(eds), Wiley-Blackwell, Oxford, p. 446.
20. Speck S: Helicobacter Infections. In: Infectious
Diseases of Wild Mammals and Birds in Europe.
1st edition. Gavier-Widen D, Meredith A, J P Duff
(eds), Wiley-Blackwell, Oxford, pp. 430-431.
21. Speck S: Moraxella Infections. Infectious bovine
keratoconjunctivitis
and
Infectious
keratokonjunctivitis. In: Infectious Diseases of
Wild Mammals and Birds in Europe. 1st edition.
Gavier-Widen D, Meredith A, J P Duff (eds), Wiley
-Blackwell, Oxford, pp. 446-447.
22. Speck S: Rhodococcus equi Infection. In:
Infectious Diseases of Wild Mammals and Birds in
Europe. 1st edition. Gavier-Widen D, Meredith A,
J P Duff (eds), Wiley-Blackwell, Oxford, p. 438.
23. Speck S: Staphylococcus Infections. In: Infectious
Diseases of Wild Mammals and Birds in Europe.
1st edition. Gavier-Widen D, Meredith A, J P Duff
(eds), Wiley-Blackwell, Oxford, pp. 434-435.
24. Speck S: Streptococcus Infections. In: Infectious
Diseases of Wild Mammals and Birds in Europe.
1st edition. Gavier-Widen D, Meredith A, J P Duff
(eds), Wiley-Blackwell, Oxford, pp. 435-438.
25. Speck S: Tyzzer’s Disease. In: Infectious
Diseases of Wild Mammals and Birds in Europe.
1st edition. Gavier-Widen D, Meredith A, J P Duff
(eds), Wiley-Blackwell, Oxford, pp. 423-424.
26. Speck S, Duff JP: Chlamydiaceae Infections. In:
Infectious Diseases of Wild Mammals and Birds in
Europe. 1st edition. Gavier-Widen D, Meredith A,
J P Duff (eds), Wiley-Blackwell, Oxford, 336-344.
27. Zöller L. Das Institut für Mikrobiologie der
Bundeswehr.
In:
Der
Sanitätsdienst
der
Bundeswehr 2010 - Kompendium für den
Sanitätsdienst., Ed. D. Möllmann, Beta, Bonn, pp.
229-234.
Vorträge (* Vortragender)
1. Böttcher* J, Frangoulidis D, Schumacher M,
Janowetz B, Gangl A, Alex M. Diagnostische
Aussagekraft einer phasen-spezifischen Q-FieberMilchserologie.
DVG-Fachgruppentagung
"Bakteriologie und Mykologie“, 27.-29.06.2012,
Leipzig.
2. Dobler* G, Essbauer S, Frey S, Pfeffer M, Hufert
F, Weidmann M. Phylegeography of TBE virus in
Central Europe. Conference on Tick-borne
encephalitis and other Tick-borne Diseases
dedicated to the 75th Anniversary of the Tickborne Encephalitis
Virus
Discovery.
2528.06.2012, Irkutsk, Russland.
165
3. Dobler* G. Die FSME-Impfung – tägliche
Herausforderung in der Praxis. Süddeutsches
Zeckensymposium, 21.-22.03.2012, Stuttgart.
4. Dobler* G. Epidemiology of tick-borne encephalitis
in Europe. Infektions-Symposium. Maastricht
Allgemeines Krankenhaus, 7.06.2012, Maastricht,
Niederlande.
5. Dobler* G. Moderne Vaccine-Technologien. CHISymposium, 03.03.2012. München.
6. Dobler* G. Neues zur Japan-Enzephalitis.
Reisemedizin Symposium, 10.03.2012, Berlin.
7. Dobler* G. Phylogenie des FSME-Virus. InstitutsSeminar, Institut für Mikrobiologie der Universität
Regensburg, 13.09.2012, Regensburg.
8. Dobler* G. Spread of TBE virus in Central Europe.
Institutskolloquium Institut für virology, Public
Health Institute, 02.05.2012, Sofia, Bulgarien.
9. Dobler*
G.
Tropische
Virusinfektionen:
Epidemiologie, Pathogenese und Diagnostik. CHI
Kurs, Tropenmedizin München. 05.12.2012,
München.
10. Dobler* G. Von Bayern bis nach Japan: FSME
und
Japan-Enzephalitis.
ReisemedizinSymposium der Bayerischen Gesellschaft für
Immun-Tropenmedizin
und
Impfwesen,
29.09.2012, München.
11. Dobler* G. Weltweite Bedeutung Zeckenübertragener Krankheitserreger. Süddeutsches
Zeckensymposium Stuttgart, 21.-22.03.2012,
Stuttgart.
12. Dobler* G. Zecken-übertragene Infektionen - ein
Überblick. Internationales Zecken-Symposium des
Bundesamtes für Umwelt und Natur. 22.02.2012,
Speyer.
13. Dobler* G, Essbauer S, Frey S, Pfeffer M, Hufert
F, Weidmann M. Phylogeography of TBE virus in
Central Europe. American Committee on
Arboviruses
(ACAV),
Subcomittee
on
Interrelationships
among
Arboviruses
in
Catalogued Arboviruses (SIRACA) im Rahmen
der Annual Conference of the American Society
for Tropical Medicine and Hygiene. 11.15.11.2012, Atlanta, USA.
14. Dobler* G, Heinrich N, Hoelscher M, Speck S.
Investigations on tick-borne rickettsiae in Southwestern Tanzania. 25th Meeting of American
Society for Rickettsiology, 28-31.07.2012, Park
City, USA.
15. Essbauer*
S.
Hochwertige
Nukleinsäureextraktion bei Infektionen - Methodenvergleich
Molekulardiagnostik.
22.06.2012, Mainz.
DELAB
–
Fachtagung,
16. Essbauer* S. Neues zu Hantaviren und FSME /
2012 – ein Hantavirus-Hochjahr in Deutschland.
4. Symposium Arbeits-, Reise- und Impfmedizin,
14. 11.2012, München.
17. Essbauer* S. Umsicht beim Nagetierfang? Aktuelles zu Nagetier-übertragenen Erregern.
Eurocido; 15.12.2012, Düsseldorf.
18. Essbauer* S, Mohr F, Hannemann L, Kiefer D,
Kiefer M, Bleichert P, Schex S, Bässler C, Müller
J, Speck S. Rickettsien in Kleinsäugern und ihren
assoziierten Ektoparasiten – Studien entlang
eines
Höhengradienten
im
Nationalpark
Bayerischer Wald. Nagetierworkshop, 22.11.2012,
München.
19. Essbauer* S. 2012 - wieder ein HantavirusHochjahr? VICCI-Symposium im Rahmen der
Bayerischen Klimawoche: Klimawandel und
Infektionskrankheiten:
Von
Menschen
und
Mäusen, Zecken und Stechfliegen, 20.06.2012,
München.
20. Essbauer* S. Rodent-associated infectious agents
along an altitude-climate gradient in the Bavarian
Forest National Park. Charite, Institut für Virologie,
03.05.2012, Berlin.
21. Frangoulidis* D, Walter MC. Analysis of the 16S
and 23S rRNA region of Coxiella burnetii reveals
polymorphisms useful in genomic typing. 25. ASR
-Tagung, 29.-31.7.2012, Park City, USA.
22. Frangoulidis* D. Drugs and `Thrax`- a sad story
continues. 30th BioMedAC, 05.-08.11.2012,
Brüssel, Belgien.
23. Frangoulidis* D, Walter MC. Coxiella burnetii
typing based on variations of the 16S and 23S
rRNA region. 64. DGHM-Tagung, 30.09.03.10.2012, Hamburg.
24. Grass* G Debunking and incapacitating your
bacterial enemy: bioforensic reconnaissance in a
drug-related anthrax outbreak and antimicrobial
defense using copper surfaces. Institutsseminar
Uni Bielefeld, 26.11.2012, Bielefeld.
25. Grass* G. How metallic copper surfaces rapidly
kill
bacteria.
8th
International
Biometals
Symposium. 17.07.2012, Brüssel, Belgium.
26. Grass* G. Medizinische B-Aufklärung durch das
Institut für Mikrobiologie der Bundeswehr,
Nationale Kontaktstelle Sicherheitsforschung,
26.06.2012, Bonn.
27. Hanczaruk* M. CSI München - den Bakterien auf
der Spur. Jahrestagung der Deutschen Gesell-
166
Verö ffentlichungen 2012
schaft für Wehrmedizin und Wehrpharmazie, 11.13.10.2012, Kassel.
Untersuchungen. AVID, 26.09.-28.09.2012, Bad
Staffelstein.
28. Kratzmann* N, Guenther S, Mayer-Scholl A, Klotz
C, Wieler LH, Aebischer T, Nöckler K, Essbauer
S, Ulrich RG. Nagetiere – eine Erregerschleuder?
3. Workshop für Nagetier-übertragene Pathogene,
21.-23.11.2012, München.
38. Schmoldt* S. TED-Fall. 64. Jahrestagung der
Deutschen Gesellschaft für Hygiene und
Mikrobiologie, 30.09.-03.10.2012, Hamburg.
29. Meyer* H. Poxviruses. Tagung der “Associazione
Medici Clinici Italiani” (AMCLI), 11.-15.11.2012,
Rimini, Italien.
30. Meyer*
H.
Drei
Herausforderungen
im
Medizinischen B-Schutz. Institutsseminar am
Institut
für
Mikrobiologie
der
Universität
Regensburg, 11.10.2012, Regensburg.
31. Meyer* H. Herausforderungen im Medizin-ischen
B-Schutz. 2. Veterinärmedizinisches Symposium
der Bundeswehr, 22.03.2012, München.
32. Meyer* H, Frangoulidis* D. Das Institut für
Mikrobiologie der Bundeswehr stellt sich vor:
Neuigkeiten zur Typisierung von Affenpockenviren
und angewandte Biosicherheitspraktiken im BSL3
-Labor. Institutsseminar FLI Riems, 02.07.2012,
Insel Riems
33. Mohr F, Kiefer M, Speck S, Kiefer D, Essbauer* S.
Establishment of molecular methods to detect
autochthonous flea species on small mammals
and investigation of their associated pathogens.
Nationale Plattform für Zoonoseforschung, 11.10.12.10.012, Berlin.
34. Riehm* JM. Die großen Seuchen – eine
Vortragsreihe am HZI. Die Pest – Der Schwarze
Tod in Geschichte und Gegenwart. HelmholtzZentrum für Infektionsforschung, 13.10.2012,
Braunschweig.
35. Riehm* JM. Wir lagen vor Madagaskar…..
Deutsche Gesellschaft für Wehrmedizin und
Wehrpharmazie e.V., Vereinigung deutscher
Sanitätsoffiziere, 12.10.2012, Kassel.
36. Rosenfeld* UM, Sheikh AH, Hofmann J, Ettinger
J, Faber M, Drewes S, Wanka K, Reil D, Schmidt
S, Jacob J, Schmidt-Chanasit J, Krüger DH,
Heckel G, Essbauer S, Schlegel M, Ulrich RG.
Geografische
Verbreitung
und
genetische
Divergenz von Puumalavirus in Deutschland. 3.
Workshop für Nagetier-übertragene Pathogene,
21.-23.11.2012, München.
37. Schlegel* M, Ulrich R G, Baumann K, Breithaupt
A, Binder A, Schotte U,,Ruhl S, Krohmann C,
Essbauer S, Frangoulidis D, Kayßer P, Meyer H,
Riehm J, Faulde M, Lewitzki J, Sauer S, Teifke
JP. Nagetiere als Überträger von Zoonosen in
Afghanistan: explorative und konfirmatorische
39. Schmoldt* S. Unklare Hautläsionen nach einer
Kasachstan-Reise.
1.
Veranstaltung
des
Zentrums für Infektionsmedizin München (ZIMM):
„Münchener
Infektionsmedizin
im
Dialog“,
10.11.2012, München.
40. Schmoldt* S. Antimicrobial Susceptibility Group,
QUANDHIP NIB & NIV Meeting, 03.-05.12.2012,
Rom, Italien.
41. Scholz* HC. Diagnostic and molecular typing of
Brucella. NCZD, 8.10.2012, Ulan Bator, Mongolei.
42. Sheikh Ali* H, Rosenfeld UM, Drewes S, Wanka
K, Freise J, Mertens M, Schmidt-Chanasit J,
Kindler E, Groschup MH, Heckel G, Essbauer S,
Schlegel M, Ulrich RG. Molecular evolution of
Puumala hantavirus in an endemic region in
Lower Saxony. 3. Workshop für Nagetierübertragene
Pathogene,
21.-23.11.2012,
München.
43. Speck* S, Schex S, Bleichert P, Dobler G, Bässler
C, Müller J, Essbauer S. Prevalence and
characterization of Rickettsia organisms in wild
rodents along an altitude gradient at National Park
Bohemian Forest, 25th Meeting of American
Society for Rickettsiology, 28.-31.07.2012, Park
City, USA.
44. Splettstoesser* W D, Zeman E, Seibold E.
Molecular epidemiologiy of macrolides resistance
in the highly infectious and virulent zoonotic
pathogen Francisella tularensis. 7th International
Conference on Tularemia. 16.09. – 20.09.2012,
Breckenridge, Colorado, USA.
45. Splettstoesser*
WD.
“Von
Mäusen
und
Menschen“: Neues zur Rolle von Nagern bei der
Übertragung der Tularämie. 3. Workshop des
Netzwerks Nagetier-übertragene Pathogene. 21.23.11.2012, München.
46. Thoma* BR. B-Diagnostik am Institut
Mikrobiologie der Bundeswehr, München.
Kongress.
Deutsche
Gesellschaft
Wehrmedizin & Wehrpharmazie e.V. (VdSO),
13.10.2012, Kassel.
für
43.
für.
11.-
47. Ulrich* RG, Kratzmann N, Schmidt S, Rosenfeld
UM, Nöckler K, Mayer-Scholl A, Guenther S, Klotz
C, Aebischer T, Essbauer S. Multiple pathogen
infections in rodents during a monitoring study in
Germany.
Nationales
Symposium
für
Zoonosenfoschung, 11.-12.10.2012, Berlin.
167
48. Ulrich* R, Schlegel M, Baumann K, Breithaupt A,
Binder A, Schotte U, Ruhl S, Krohmann S,
Edssbauer S, Frangoulidis D, Kayßer P, Meyer H,
Riehm J, Faulde M, Lewitzki, Sauer S, Teifke JP.
Searching for zoonotic pathogens in small
mammals from Afghanistan. 86. Tagung der
Deutschen Gesellschaft für Säugetierkunde,
04.08.-08.08.2012, Frankfurt.
49. Walter* MC, Münsterkötter M, Frangoulidis D.
Comparative and consistent re-annotation of the 7
Coxiella burnetii reference genomes – towards a
gold standard annotation. 25. ASR-Tagung, 29.31.7.2012, Park City, USA.
50. Walter* MC, Münsterkötter M, Frangoulidis D.
Consistent genome re-annotation of the 7 Coxiella
burnetii reference genomes reveals new genomic
features. 64. DGHM-Tagung, 30.09.–03.10.2012,
Hamburg.
51. Woll* D, Karnath C, Schex S, Essbauer S, Silaghi
C, Pfeffer M. Untersuchungen zum Vorkommen
von Leptospiren in Kleinsäugern in verschiedenen
Regionen Deutschlands. 3. Workshop für Nagetier
-übertragene
Pathogene,
21.-23.11.2012,
München.
52. Wölfel R. Scenario-based Training for Bio
Reconnaissance Teams, 2nd International
Symposium on Development of CBRN Defence
Capabilities, 23.10.2012, Berlin.
53. Wölfel R. Forensic Aspects in Medical Bio
Reconnaissance, 2nd International Symposium on
Development of CBRN Defence Capabilities,
23.10.2012, Berlin.
54. Wölfel R. Forensische Probennahme – Praxis in
der militärischen B-Aufklärung, 6. Fachtagung
Infektiöse Materialien, 15.10.2012, Berlin.
55. Wölfel R. Outbreak – What shall we do? Annual
Meeting of the German Society for Military
Medicine and Pharmacology, 12.10.2012, Kassel.
56. Wölfel R. The Bundeswehr Rapidly Deployable
Bio Recon & Lab Concept - A starting point for
NATO RDOIT implementation? NATO Biomedical
Advisory Committee, 22.05.2012, Warschau,
Polen.
57. Zöller L. Milzbrand, Heroin und Bundeswehr. 2.
Infektiologisches Symposium, 9.11.2012, Fürth.
Poster
1. Antwerpen M, Kaysser P, Zeman E, Knoche A,
Splettstoesser WD. Resistant or not? – MAMA
holds the answer. 64. Jahrestagung der
Deutschen Gesellschaft für Hygiene
Mikrobiologie, 30.09.-03.10.2012, Hamburg.
und
2. Antwerpen M, Grass G, Hanczaruk M, Georgi E,
Wölfel R, and Scholz HC. Bioforensics A
Biological Defense Challenge for the 21st
Century”. 64. Jahrestagung der Deutschen
Gesellschaft für Hygiene und Mikrobiologie,
30.09.-03.10.2012, Hamburg.
3. Bleichert P, Espirito Santo C, and Grass G.
Metallic copper surfaces efficiently inactivate
bacterial biothreat agents. 64. Jahrestagung der
Deutschen Gesellschaft für Hygiene und
Mikrobiologie, 30.09.-03.10.2012, Hamburg.
4. Bleichert P, Espirito Santo C, Grass G. Killing of
biothreat agents on metallic copper surfaces. 8th
International
Biometals
Symposium,
15.19.7.2012, Brussels, Belgium.
5. Bleichert P, Espirito Santo C, and Grass G. Killing
of Biothreat agents on metallic copper surfaces.
VAAM
Jahrestagung,
18.03.-21.03.2012,
Tübingen.
6. Carroll D S, Emerson G, Li Y, Sammons S, Olson
V, Frace M, Nakazawa Y, Czerny C P, Tryland M,
Kolodziejek T, Nowotny N, Olsen-Rasmussen M,
Khristova M, Govil D, Karem K, Damon I and
Meyer H. Chasing Jenner´s vaccine: Revisiting
Cowpox
Virus
Classification.
International
Poxvirus Meeting. 24.-28.06.2012, Salamanca,
Spanien.
7. Chan, Koch D, Grass G, Nies DH, and Murphy
MEP. Two homologous periplasmic iron transport
proteins and their modes of metal binding. 8th
International
Biometals
Symposium.
15.19.7.2012, Brussels, Belgium.
8. Dobler G, Heinrich N, Hölscher M, Speck S.
Investigations on tick-borne rickettsiae in
Southwestern Tanzania, Africa. 64. Jahrestagung
der Deutschen Gesellschaft für Hygiene und
Mikrobiologie, 30.09.-03.10.2012, Hamburg.
9. Espírito Santo C, Quaranta D, Grass G.
Inactivation mechanism
of staphylococcus
haemolyticus on metallic copper surfaces. 8th
International Biometals Symposium. 15.07.19.7.2012, Brussels, Belgium.
10. Felder E., Wölfel R. Development Of User-defined
Assays For The Genexpert Platform, ASM
Biodefence and Emerging Diseases Research
Meeting, 26.-29.02.2012, Washington DC, USA.
11. Frey S, Essbauer S, Dobler G. New aspects in
epidemiology and molecular characterization of
Tick-Borne Encephalitis Viruses in Bavaria.
National Symposium on Zoonoses Research, 11.-
168
Verö ffentlichungen 2012
of Orthopoxvirus Species by PCR/ElectrosprayIonization Mass Spectrometry. International
Poxvirus Meeting. 24.06.-28.06.2012, Salamanca,
Spanien.
12.10.2012, Berlin.
12. Frey S, Essbauer S, Zöller G, Dobler G.
Epidemiology and molecular characterization of
Tick-Borne Encephalitis Viruses in Bavaria. 22nd
Annual Meeting of the Society for Virology, 14.17.03.2012, Essen.
13. Gehringer H, Öhme R, Zigann K, Splettstoesser
WD. Francisella-like endosymbionts in Dermacentor ticks from Southern Germany. Nationales
Symposium für Zoonoseforschung, Berlin, 10.12.10.2012
14. Genzel GH, Georgi E, Vente A, Kaysser P,
Splettstoesser WD. In-vitro activity of finafloxacin
against Francisella tularensis. 64. Jahrestagung
der Deutschen Gesellschaft für Hygiene und
Mikrobiologie, 30.09.-03.10.2012, Hamburg.
15. Georgi E, Genzel GH, Kaysser P, Splettstoesser
WD, Rodloff AC. Methods of antimicrobial
susceptibility testing – Comparative analysis
applied to different Francisella species and
subspecies. 64. Jahrestagung der Deutschen
Gesellschaft für Hygiene und Mikrobiologie,
30.09.-03.10.2012, Hamburg.
16. Hanczaruk M, Bleichert P, Grass G. Occurrence
of resistance against antibiotics in natural isolates
of Bacillus anthracis. 64. Jahrestagung der
Deutschen Gesellschaft für Hygiene und
Mikrobiologie, 30.09.-03.10.2012, Hamburg.
17. Karlsson E, Macellaro A, Frangoulidis D,
Rotterdam van B, Janse I, Sjödin A, Byström M,
Forsman M, Svensson K. Eight new genome
sequences provide robust and reproducible SNP
typing of Coxiella burnetii cell cultures and tissue
samples. International Q fever Symposium
07.06.2012, Amsterdam, Niederlande.
18. Kaysser P, Zeman E, Birdsell DN, Wagner DM,
Keim PS, Splettstoesser WD. Comparison of
different SNP assays for clinical samples in
tularemia
diagnostics.
7th
International
Conference on Tularemia, 17.-20.09.2012,
Breckenridge, Colorado, USA.
19. Kuchuloria T, Akhvlediani T, Makhviladze M,
Kanashvili M, Wölfel R, Farrell M, Clark D,
Bautista C, Rivard RG, Hepburn MJ, House B.
Results
of
a
Hospital-based
Laboratory
Surveillance
for
Infectious
Etiologies
of
Undifferentiated Febrile Illnesses in Georgia,
Annual Meeting of the American Society of
Tropical Medicine and Hygiene, November 2012,
Atlanta, USA.
20. Meyer H, Dobrzykowski L, Knoop D, Hartmann A,
Thoma B, Tiemann C, Schmoldt S. Differentiation
21. Nies DH, Chan ACK, Koch D, Grass G, Murphy
MEP. Iron-handling by the periplasmic FETP
protein from the uropathogenic Escherichia coli
strain
F11.
8th
International
Biometals
Symposium 15.-19.7.2012, Brussels, Belgium.
22. Schweizer H, Schmoldt S, Held J, Wagner D.
Diffuse lung infiltration and an extraordinary
cutaneous manifestation in a 79 year old man. 11.
Kongress
für
Infektionskrankheiten
und
Tropenmedizin (KIT), 25.-28.04.2012, Gürzenich
Köln.
23. Sheikh Ali H, Rosenfeld UM, Drewes S, Wanka K,
Freise J, Mertens M, Schmidt-Chanasit J, Kindler
E, Groschup M-H, Heckel G, Essbauer S,
Schlegel M, Ulrich RG Molecular evolution of
Puumala hantavirus in an endemic region in
Lower Saxony. Nationales Symposium für
Zoonosenfoschung, 11.-12.10.2012, Berlin.
24. Speck S, Dilcher M, Wehner S, Riege K, Marz M,
Essbauer S, Dobler G. Comparative genomics of
Rickettsia helvetica AS819. Poster presentation at
25th Meeting of American Society for
Rickettsiology, 28.-31.07.2012, Park City, USA.
25. Speck S, Dilcher M, Wehner S, Riege K, Marz M,
Hufert F, Essbauer S, Dobler G. Comparative
genomics of Rickettsia helvetica AS819. 64.
Jahrestagung der Deutschen Gesellschaft für
Hygiene und Mikrobiologie, 30.09.-03.10.2012,
Hamburg.
26. Speck S, Weber H, Essbauer S, Dobler G. Plaque
assay for Rickettsiae in mammalian cell lines.
Nationales Symposium für Zoonosenfoschung,
11.-12.10.2012, Berlin.
27. Splettstoesser. WD. “An update on tularemia in
Germany:” Real increase in incidence or
consequence of a raised awareness in public
health and diagnostic microbiology? 7th
International Conference on Tularemia, 16.20.09.2012, Breckenridge, Colorado, USA.
28. Thoma B, Hanczaruk M, Schmoldt S, Antwerpen
M, Tiemann C, Knoop D, Hartmann A, Zöller L,
Grass G. Evaluation of analytical sensitivity and
specificity of the biothreat assay for clinical
Bacillus anthracis diagnostics by the PLEX-ID™
System. VAAM Jahrestagung, 18.-21.03.2012,
Tübingen.
29. Thoma B R, Knoop D, Hartmann A, Tiemann C,
Zöller L, Hinz C, Jacob D, Grunow R, Schmoldt S.
169
Comparison of PCR and electrospray-ionization
mass spectrometry (ESI-MS) with species-specific
diagnostic algorithms during a biodefense external
quality assurance exercise. 64. Jahrestagung der
Deutschen Gesellschaft für Hygiene und
Mikrobiologie, 30.09.-03.10.2012, Hamburg.
30. Thoma BR, Müller J, Bässler C, Bottomley C,
Schex S, Osterberg A, Essbauer S. Biometric,
climatic, and environmental risk factors driving
Puumala hantavirus epidemics in Southeast
Germany. 64. Jahrestagung der Deutschen
Gesellschaft für Hygiene und Mikrobiologie,
30.09.-03.10.2012, Hamburg.
31. Vollmar P, S. Frey, S. Speck, S. Essbauer, G.
Dobler. Human Cell Cultures as an in vitro model
for the Neuropathogenicity of TBE-Viruses. 22nd
Annual Meeting of the Society for Virology, 14.17.03.12, Essen.
32. Woll D, Karnath C, Pfeffer M, Schex S, Essbauer
S. Investigations on Leptospira in small mammals
at National Park Bohemian Forest, Germany.
Nationales Symposium für Zoonosenfoschung,
11.-12.10.2012, Berlin.
33. Wölfel S, Mertens M, Speck S, Essbauer S, Ulrich
R, Wölfel R, and Dobler G. Seroprevalence of IgG
against rickettsiae of the spotted fever group in
forestry workers in State Brandenburg, Eastern
Germany. 25th Meeting of American Society for
Rickettsiology, 28.-31.07.2012, Park City, USA.
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in
Deutschland.
Rundschau
für
Fleischhygiene und Lebensmittelüberwachung
7/2013, 261-264.
8. Reischl U, Straube E, Maaß M, Jacobs E,
Schneider W, Fingerle V, Busch U, Frangoulidis
D, Splettstösser W, Grass G, Reiter-Owona I.
Bakterien- und Pilzgenom-Nachweis PCR/NAT:
Auswertung des Ringversuchs Mai 2013 von
INSTAND e.V. zur externen Qualitätskontrolle
molekularbiologischer Nachweisverfahren in der
bakteriologischen Diagnostik. GMS Z Forder
Qualitaetssich Med Lab 2013;4:Doc03.
9. Riehm JM, Georgi E, Scholz HC. Neue Methode
zur molekulargenetischen Typisierung von
Clostridium botulinum Stämmen mittels Multilocus
12. Schmoldt S.. Wissenschaftsbasierte Diagnostik
hochpathogener Erreger. Management & Krankenhaus. Ausgabe 10/2013 Supplement, S10.
13. Seifert L, Wiechmann I, Gruppe G, Thomas A,
Riehm JM, Scholz HC, Harbeck M. Das Rätsel
der Justinianischen Pest: Nachweis von Yersinia
pestis
in
Individuen
aus
Aschheim.
Archäologische Informationen 2013.
14. Ulrich RG, Essbauer SS, Krüger DH, Pfeffer M,
Nöckler K. Nagetier-übertragene Zoonoseerreger
in Deutschland. Internistische Praxis 2013; 53
(1):207-232.
15. Ulrich RG, Imholt C, Krüger DH, Krautkrämer E,
Scheibe T, Essbauer SS, Pfeffer M. Hantaviren in
Deutschland: Gefahren für Zoo-, Heim-, Hausund Nutztier? Berl Münch Tierärztl Wochenschr
2013,126:514–526.
Buchbeiträge
1. Dobler G, Heininger U, Löscher T, Müller T.
Tollwut. In: DGPI Handbuch Infektionen bei
Kindern und Jugendlichen. 6. Aufl. 2013. pp. 532537. Thieme-Verlag, Stuttgart.
2. Dobler G, Hufert H. Kyasanur forest disease. In:
Singh SK, Ruzek D (eds.). Viral Hemorrhagic
Fevers. pp 525-539. CRC Press, Boca Raton.
3. Kämpfer P, Scholz HC. The Genus Brucella. In:
„The Prokaryotes”, 4th ed. Springer Verlag, in
press.
4. Splettstoesser W, Scholz D: Tularämie. In:
„Handbuch
Infektionen
bei
Kindern
und
Jugendlichen (DGPI)“. Thieme, Stuttgart; Auflage:
6., vollständig überarbeitete Auflage (18.
September 2013).
5. Thiermann H, Kehe K, Riehm J, Zöller L:
Chemical and Biological Weapons. In: „Regulatory
Toxicology“. Springer Verlag 2013.
173
tagung der Deutschen Veterinärmedizinischen
Gesellschaft, Arbeitsgruppe Tierseuchen. 28.29.05.2013, Berlin.
Vorträge (* Vortragender)
1. Antwerpen* MH. New Insights into Metagenomics;
Biological threats an new insights of wholegenome sequences: from metagenomics to postgenomic era bei Centro Studi e Recerche di
Sanita’e Veterinaria il Reparto, Rom, Italien.
2. Antwerpen* MH, Prior K, Höppner S, Harmsen D,
Splettstößer WD. Bacterial Whole Genome
Sequencing and Core Genome MLST Analysis –
The Next Step towards a Standardized Typing
Method for Francisella tularensis; Medical
Biodefense
Conference,
22.-25.10.2013,
München.
12. Dobler* G. Phylogeny of TBE virus in Central
Europe.
Symposium
Zecken-übertragener
Erkrankungen.
Friedrich-Löffler-Institut,
20.08.2013, Jena.
13. Dobler* G. Risk of introduction and spread of
flaviviruses other than Dengue, West Nile and
Usutu virus. 09.-10.05.2013, Brescia, Italien.
14. Dobler* G. Tick-borne encephalitis: Etiology –
Pathogenesis – Diagnosis – Prevention. DAADKurs Veterinärmedizin, 02.12.2013, München.
3. Bleichert* P. Antimikrobielle Wirkung von
Kupferoberflächen auf bakterielle und virale BAgenzien,
10.
Ulmer
Symposium
Krankenhausinfektionen, 19.-22.03.2013, Ulm.
15. Dobler* G. TTU „Emerging Infections“: Ausbreitung
Zecken-übertragener
Virusinfektionen.
Treffen der TTU Emerging Infections. 28.08.2013,
Marburg.
4. Bleichert* P. Inaktivierung bakterieller und viraler
B-Kampfstofferreger durch metallische Kupferoberflächen, 44. Kongress der Deutschen
Gesellschaft für Wehrmedizin und Wehrpharmazie, 10.-12.10.2013, Rostock-Warnemünde.
16. Dobler* G. TTU „Emerging Infections“: Ausbreitung
Zecken-übertragener
Virusinfektionen.
Treffen des DZIF München, 25.06.2013,
München.
5. Bleichert* P, Grass G. Kill ‘em All - Biothreat
Agents Succumb to Metallic Copper Surfaces.
Medical Biodefense Conference, 22.-25.10.2013,
München.
6. Bryan TR, Müller J, Bässler C, Essbauer* S.
Puumala virus in the Bohemian Forest National
Park: Epidemiology and search for risk factors.
23rd Annual Meeting of the Society for Virology
2013, 06.-09.03.2013, Kiel.
7. Bryan* TR, Müller J, Bässler C, Osterberg A,
Schex S, Bottomley C, Georgi E, Essbauer S.
Predicting the risk for hantavirus disease in a
montane forest environment. Medical Biodefense
Conference, 22.-25.10.2013, München.
8. Dieckmann* S, Thoma BR, Steiner F, Vollmar P,
Barreto-Miranda I, Schmoldt S. A Case of
Peripheral
Lymphadenopathy.
Medical
Biodefense
Conference,
22.-25.10.2013,
München.
9. Dobler* G. Flavivirus Update 2013. Symposium
der Bayerischen Gesellschaft für Immun-,
Tropenmedizin und Impfwesen, 28.09.2013,
München.
10. Dobler* G. Frühsommer-Meningoenzephalitis
(FSME):
Neues
über
eine „altbekannte“
Erkrankung. Münchner Impftag, 05.12.2013,
München.
11. Dobler* G. Monitoring von Zecken auf exotische
Tierseuchenerreger/Zoonoseerreger.
Jahres-
17. Dobler* G. Zoonosen in der Arbeitsmedizin.
Symposium für Arbeits- und Reisemedizin,
03.12.2013, München.
18. Dobler* G, Chitimia L. Canine vector-borne
diseases in Romania. 8th Canive Vector-borne
Diseases Symposioum, 15.-17.04.2013. St.
Petersburg, Russland.
19. Dobler* G, Essbauer S, Frey S, Hufert FT,
Zanotto PM, Cernanska D, Vögele M, Ruzek D,
Klempa B, Krivanec K, Pfeffer M, Weidmann M.
Biogeography of TBE virus in Eastern Bavaria. XII
International Jena Symposium on Tick-borne
Diseases, 21.-23.03.2013, Weimar.
20. Dobler* G, Essbauer S, Frey S, Hufert FT,
Zanotto PM, Cernanska D, Vögele M, Ruzek D,
Klempa B, Krivanec K, Pfeffer M, Weidmann M.
Biogeography of TBE virus in Eastern Bavaria.
15th ISW-TBE 2013, 31.01.-01.02.2013, Wien,
Österreich.
21. Dobler* G, Frey S, Essbauer S. Risk of
introduction of pathogenic Flaviviruses. Workshop
Epizone ERG 2013, 09.-10.05.2013, Brescia,
Italien.
22. Dobler* G. Frey S, Eßbauer S, Pfeffer M, Hufert F,
Weidmann M. Phylogeny and geographical
spread of TBE virus in Central Europe.
International Scientific Working Group on Tickborne Encephalitis, 30.01.-01.02.2013, Wien,
Österreich
174
Verö ffentlichungen 2013
23. Dobler* G, Frey S, Eßbauer S, Pfeffer M, Hufert F,
Weidmann M. Phylogeny of TBE virus in Central
Europe.
SNÄFF-Tagung,
13.-15.05.2013,
Söderköpings, Schweden.
24. Dobler* G, Frey S, Eßbauer S, Pfeffer M, Hufert F,
Weidmann M. Phylogeny and geographical
spread of TBE virus in Central Europe. 12th
International Jena Symposium on Tick-borne
Diseases, 21.-23.03. 2013, Weimar.
25. Dresler J*, Riehm JM, P Pajer, H Martin, J
Klimentova, A Fucikova, J Matejkova, HC Scholz,
L Pisa. Detection and Differentiation of BoNT by
Mass
Spectrometry.
Medical
Biodefense
Conference, 22.-25.10.2013, München.
Assays. Medical Biodefense Conference 2013,
22.-25.10.2013, München.
34. Frangoulidis* D. Genetische Vielfalt von Coxiella
burnetii in Deutschland. Tagung der DVGFachgruppe Krankheiten kleiner Wiederkäuer, 06.
-07.11.2013, Berlin.
35. Frangoulidis* D. Isolation units for highly
contagious patients in Germany. 31th BioMedAC,
21.-24.05.2013, Winterbourne Gunner, UK.
36. Frangoulidis* D. Typing of Coxiella burnetii status quo and way ahead. 11th International
Symposium on Protection against Chemical and
Biological Warfare Agents, 03.-05.06.2013,
Stockholm, Schweden.
26. Duraffour* S, Zöller G, Lorenzo MM, Hruby DE,
Topalis D, Grosenbach DW, Andrei G, Snoeck R,
Blasco R, Meyer H. Lessons from In vitro
Selection and Characterization of Orthopoxviruses
Resistant to ST-246: ST-246 is the Key and F13L
the Lock. Medical Biodefense Conference, 22.25.10.2013, München.
37. Frey* S, Dobler G. Gesamtgenomsequenzierung
von RSSE-Virusisolaten aus Sibirien und dem
Fernen Osten Russlands: ein Beitrag zur
Forensischen Virologie. Forschungskonferenz des
Sanitätsdienstes der Bundeswehr, 24.06.2013,
München.
27. Essbauer* S. Auszüge aus einer ungewöhnlichen
Biologenkarriere - Motivationsvortrag als Senior
Scientist. Junior Scientists Meeting der Nationalen
Zoonosenplattform, 04.06.2013, Leipzig.
38. Frey* S, Höper D, Beer M, Dobler G, Eßbauer S.
Next generation sequencing of a longitudinal tickborne encephalitis virus study in a micro-focus in
Central Europe. Medical Biodefense Conference,
22.-25.10.2013, München.
28. Essbauer* S. Felduntersuchungen zu Hantaviren
und resultierende mögliche Empfehlungen für den
Public Health Bereich "Workshop zu Hantavirus
Infektionen in Risikogebieten", EDEN next
Hantavirus-Workshop,
08.07.2013,
Landesgesundheitsamt Stuttgart.
39. Frey* S, Höper D, Beer M, Dobler G, Eßbauer S.
Next generation sequencing of a longitudinal tickborne encephalitis virus study in a micro-focus in
Central Europe. National Symposium on
Zoonoses Research, 19.-20.09.2013, Berlin.
29. Essbauer* S. Neues zu Nagetier-assoziierten
Erregern.
VFOES
Schadnager-Seminar,
26.01.2013, Kempten.
30. Essbauer* S. Recent TBEV research. NATO HFM
RTG-230, 3rd MEETING, 30.09.- 05.10.2013,
Ljubliana, Slowenien.
31. Essbauer* S, Frey S, Brauer K, Vollmar P, Höper
D, Beer M, Dobler G. Genetic and cell-biological
studies on different TBEV strains. 22nd meeting of
the European Network for Diagnostics of
"Imported" Viral Diseases (ENIVD), 04.06.11.2013, Venedig, Italien.
32. Ettinger* J, Hofmann J, Enders M, Essbauer S,
Ulrich R, Klempa B, Kruger DH. The molecular
signature of patient-derived PUUV strains allows
their assignment to particular outbreak regions.
Abstr. IX International Conference on HFRS, HPS
& Hantaviruses, Beijing, China, June 5-7, 2013, p.
67.
33. Felder* E, Wölfel R. Development of a Versatile
and Stable Internal Control System for RT- qPCR
40. Gentile* B, Ciammaruconi A, Hilss K, Haumacher
R, Pittiglio V, Antwerpen MH, Grass G, Hanczaruk
M, Lista F, Beyer W. Towards a Unified Bacillus
anthracis MLVA Typing System: Characterization
of Repeat Number and Consensus Sequences of
MLVA31 loci. Medical Biodefense Conference, 22.
-25.10.2013, München.
41. Genzel* GH, Georgi E, Vente A, Schmoldt S,
Schaumann R, Scholz HC. Yes, S I R!
Susceptibility Testing of a New Substance
Requires Strict Rules. Medical Biodefense
Conference 2013, 22.-25.10.2013, München.
42. Gerhard* M, Antwerpen MH. Francisella vor dem
„Tantalos“-Dilemma ? Festvortrag anlässlich der
Unterzeichnung Kooperationsvertrag TU München
– InstMikroBioBw, 21.02.2013, München.
43. Grass* G. Antimicrobial copper vs. nosocomial
infections. Microbiology Seminar, 11.11.2013,
University of Coimbra, Portugal.
44. Grass* G. Bioforensic molecular genetic reconnaissance in a drug-related anthrax outbreak.
175
Comprehensive Infectious
01.03.2013, Tübingen.
Graduate Course Microbiology Section Seminar,
09.09.2013, University of Nebraska-Lincoln, USA.
45. Grass* G. Kupfer in der Infektionsprävention –
Übersicht biomedizinisch relevanter Forschung.
Medica, 20.11.2013, Düsseldorf.
46. Grass* G. Massive metallische Kupferlegierungen
als Teil des Multi-Barriere-Systems gegen
pathogene Mikroorganismen im Krankenhaus. 12.
Bad Kissinger Akademiekongress HygieneWunde-Pflege, 07.11.2013, Bad Kissingen.
47. Grass* G, Klee SR, Beyer W, Wagner DM,
Pearson T, Grunow R, Reischl U, Hanczaruk M,
Keim P. Genotyping and Trace-Back-Analysis of
Bacillus anthracis Isolates Related to Injectional
Anthrax. 11th Annual ASM Biodefense and
Emerging Diseases Research Meeting, 25-27.02.
2013, Washington (DC), USA.
48. Grass* G, Klee SR, Beyer W, Wagner DM,
Pearson T, Grunow R, Reischl U, Hanczaruk M,
Keim P. Thirteen Years of Injectional Anthrax in
Drug Consumers - Genotyping of Bacillus
anthracis Strains from an Ongoing Outbreak.
Bacillus
ACT-Conference,
01.-05.09.2013,
Victoria, Kanada.
49. Grass* G, Klee SR, Beyer W, Wagner DM,
Pearson T, Reischl U, Sandven P, Kjerulf A,
Hanczaruk M, Keim P, Grunow R. Genotyping of
Bacillus anthracis Strains from an Extended
Outbreak of Injectional Anthrax in Drug
Consumers. Medical Biodefense Conference, 22.25.10.2013, München.
50. Kling* C, Kratzmann N, Schmidt S, Rosenfeld UM,
Reil D, Jacob J, Ulrich RG, Essbauer S.
NaÜPaNet: Untersuchung zu Rickettsien in
Kleinsäugern in Deutschland. AK Wirbeltier,
Mäuse Workshop, 21.11.2013, Freising.
51. Meyer* H. The Dirty Dozen – are we aware and
well prepared? Viertes Regensburger Meeting für
Molekulare
Diagnostik
(REMMDI).
21.03.23.03.2013, Regensburg.
52. Pfeffer M, Dobler* G. Rickettsiae: Classification
and Pathogenesis. DAAD-Kurs Veterinärmedizin,
02.12.2013, München.
53. Reis S, Walter M, Kahlhofer C, Frangoulidis D*.
Whole Genome Amplification (WGA) in Coxiella
diagnostics and typing. 65. Tagung der Deutschen
Gesellschaft für Hygiene und Mikrobiologie, 22.25.09.2013, Rostock.
54. Riehm* JM. Pest – State of the Art 2013. 11.
Symposium Infektionsmedizin in Tübingen: Neue
Entwicklungen
in
der
Infektionsmedizin,
Disease
Center,
55. Riehm* JM, Rajerison M, Projahn M, Hall CM,
Andersen G, Lummis M, Walker J, Nottingham R,
Vogler AJ, Keim P, Wagner DM, Scholz HC.
Typing of Yersinia pestis from Clinical Plague
Specimens from Madagascar. Medical Biodefense
Conference, 22.-25.10.2013, München
56. Riehm* JM, Seifert L, Hänsch S, Wagner DM,
Birdsell D, Parise KL, Wiechmann I, Grupe G,
Thomas A, Keim P, Zöller L, Bramanti B, Harbeck
M, Scholz HC. Yersinia pestis DNA from Skeletal
Remains from the 6th Century AD Reveals
Insights into Justinianic Plague. 66. Jahrestagung
der Deutschen Gesellschaft für Hygiene und
Mikrobiologie, 22.-25.09.2013, Rostock.
57. Schlegel* M, Baumann K, Breithaupt A, Binder A,
Schotte U, Ruhl S, Krohmann C, Essbauer SS,
Frangoulidis D, Kayßer P, Meyer H, Riehm JM,
Wölfel R, Faulde M, Lewitzki J, Sauer S, Teifke
JP, Ulrich RG. Are Rodents Carriers of Zoonotic
Pathogens in Military Camps in Afghanistan?
Medical Biodefense Conference, 22.-25.10.2013,
München.
58. Schmoldt* S. Fallberichte. 11. Symposium des
CIDIC - "Neue Entwicklungen in der Infektionsmedizin", 01.-02.03.2013, Tübingen.
59. Scholz HC*, Seifert L, Hänsch S, Wagner DM,
Birdsell D, Parise KL, Wiechmann I, Grupe G,
Thomas A, Keim P, Zöller L, Bramanti B, Riehm
JM, Harbeck M. Yersinia pestis DNA from skeletal
remains from the 6th century AD reveals insights
into Justinianic Plague. 11th International
Symposium on Yersinia, June 2013, Suzhou,
China.
60. Scholz HC*, Seifert L, Hänsch S, Wagner DM,
Birdsell D, Parise KL, Wiechmann I, Grupe G,
Thomas A, Keim P, Zöller L, Bramanti B, Riehm
JM, Harbeck M. Yersinia pestis DNA from Skeletal
Remains from the 6th Century AD Reveals
Insights into Justinianic Plague; Medical
Biodefense
Conference,
22.-25.10.2013,
München.
61. Splettstoesser* W. 100 Jahre Tularämie:
Epidemiologie, Diagnostik und Klinik. 11.
Symposium des CIDIC - "Neue Entwicklungen in
der Infektionsmedizin", 01.-02.03.2013, Tübingen.
62. Splettstoesser* W. Microbiological characteristics
and genetic structure of Francisella tularensis.
International Symposium on Francisella tularensis
and Tularemia, 19.06.-22.06.2013, Nevsehir,
Turkey.
176
Verö ffentlichungen 2013
63. Splettstoesser* W. PCR: A milestone in the
laboratory diagnosis of tularemia. International
Symposium on Francisella tularensis and
Tularemia, 19.06.-22.06.2013, Nevsehir, Turkey.
64. Splettstoesser* W, Ehrle M, Kühn R, Schmoldt S.
Evaluation of a new commercially available
immunochromatographic
test
for
the
serodiagnosis of human tularemia, 65. Tagung
der Deutschen Gesellschaft für Hygiene und
Mikrobiologie, 22.-25.09.2013, Rostock.
65. Splettstoesser* WD, Kaysser P, Antwerpen MH.
PCR: A milestone in the laboratory diagnosis of
tularemia. 65. Tagung der Deutschen Gesellschaft
für Hygiene und Mikrobiologie, 22.-25.09.2013,
Rostock.
66. Stoecker* K, Gabriel M, Fleischmann E, SchmidtChanasit J, Dicaro A, Meschi S, lppolito G,
Günther S, Wölfel R. Establishment of Mobile
Laboratories up to Risk Group 4 in Combination
with CBRN Capacity Building in Sub-Saharan
Africa. Medical Biodefense Conference 2013, 22.25.10.2013, München.
67. Thoma* BR, Müller J, Bässler C, Osterberg A,
Schex S, Bottomley C, Georgi E, Essbauer SS.
Predicting the Risk for Hantavirus Disease in a
Montane Forest Environment. Medical Biodefense
Conference 2013, 22.-25.10.2013, München.
68. Ulrich* RG & network “Rodent-borne pathogens”.
Pathogen hunting in Germany: The network
“Rodent-borne pathogens”. Medical Biodefense
Conference, 22.-25.10.2013, München.
69. Wagner DM*, Hall CM, Riehm JM, Kiefer D,
Damdindorj T, Dashdavaa O, Dalantai G, Sahl J,
Nottingham R, Vogler AJ, Keim P, Scholz HC.
Diverse Lineages of Yersinia pestis are present in
Mongolia; Medical Biodefense Conference, 22.25.10.2013, München
70. Wagner DM*, Hall CM, Riehm JM, Kiefer D,
Damdindorj T, Dashdavaa O, Dalantai G, Sahl J,
Nottingham R, Vogler AJ, Keim P, Scholz HC.
Diverse lineages of Y. pestis in Mongolia. 11th
International Symposium on Yersinia, June 2013,
Suzhou, China.
71. Walter* M, Frangoulidis D. The Art of (Coxiella)
Genome Sequencing. 65. Tagung der Deutschen
Gesellschaft für Hygiene und Mikrobiologie, 22.25.09.2013, Rostock.
72. Wölfel* R. A Southwest-Asian network for
biosecurity and diagnosis of dangerous infectious
diseases, National Center for Disease Control and
Public Health of Georgia, 10.12.2013, Tbilisi,
Georgia.
73. Wölfel* R. Bioforensics and Medical Bio Defense,
31th NATO BioMedAC, 22.05.2013, Winterbourne
Gunner, UK.
74. Wölfel* R. Biological Reconnaissance - Team
Approach, United Nations Office for Disarmament
Affairs,
UNSGM
Workshop,
28.05.2013,
Copenhagen, Dänemark.
75. Wölfel* R. Biologische Kampfstoffe – Eine dunkle
Seite der Mikrobiologie, Vorlesungsreihe, 17.27.07.2013, Universitätsklinikum Leipzig.
76. Wölfel* R. Biosecurity – Biosafety, NATO Bio
Warfare Defence Awareness Course, 03.10.2013,
NATO School Oberammergau.
77. Wölfel*
R.
Bundeswehr
Medical
Bio
Reconnaissance
Capabilities,
Concepts
&
Experience, NATO Bio Warfare Defence
Awareness Course, 03.10.2013, NATO School
Oberammergau.
78. Wölfel* R. Dangerous Infectious Diseases and
Biological Warfare Agents, 2nd Tactical Combat
Casualty
Care
Symposium,
12.06.2013,
Pfuhlendorf.
79. Wölfel* R. Deutsches Partnerschaftsprogramm für
biologische
Sicherheit
und
Gesundheitssicherstellung,
Projekte
des
Instituts
für
Mikrobiologie der Bundeswehr, 14.10.2013,
Auswärtiges Amt, Berlin.
80. Wölfel* R. Forensische Aspekte in der BAufklärung, Fachtagung Biologische Kampfstoffe,
05.03.2013, Berlin.
81. Wölfel* R. Medical Biodefense in Germany,
MARCE CHHS Public Health Preparedness
Conference, University of Maryland, 28.01.2013,
Ellicott City, USA.
82. Wölfel* R. Medical Countermeasures against
Biological Attacks, NATO Bio Warfare Defence
Awareness Course, 03.10.2013, NATO School
Oberammergau.
83. Wölfel* R. RDOIT - Eine Fähigkeit des Med. BSchutzes, Konsiliargruppentagung Labormedizin/
Mikrobiologie, 15.02.2013, München.
84. Wölfel* R. The Bundeswehr Institute of
Microbiology - Applied Research on Emerging
Infectious Diseases, DZIF Autumn School,
26.09.2013, Bad Malente.
85. Wölfel* S, Schaper SR, Dobler G, Speck S, Wölfel
R. Development of a Rickettsia helvetica specific
real-time polymerase chain reaction assay.
Medical Biodefense Conference, 22.-25.10.2013,
München.
177
National Symposium on Zoonoses Research, 19.20.09.2013, Berlin.
Poster
1. Antwerpen MH, Georgi E, Zimmermann P,
Hörmansdorfer S, Meyer H, Grass G. Genome
Sequence of a Novel Lysinibacillus-like Bacillus
Strain (BF-4) Isolated During an Anthrax Outbreak
2009
in
Germany.
Medical
Biodefense
Conference, 22.-25.10.2013, München.
2. Bleichert P, Hanczaruk M, Meyer H, Grass G.
Inactivation of orthopoxviruses via contact to
metallic copper surfaces. VAAM Congress, 10.13.3.2013, Bremen.
11. Frey S, Höper D, Beer M, Dobler G, Essbauer S.
Next generation sequencing of a longitudinal tickborne encephalitis virus study in a micro-focus in
Central Europe. 23rd Annual Meeting of the
Society for Virology, 06.-09.03.2013, Kiel, sowie
5th European Congress of Virology, 11.14.09.2013, Lyon, Frankreich.
3. Bleichert P, Hanczaruk M, Meyer H, Grass G.
Metallic copper surfaces kill bacterial and viral
biothreat
agents.
FEMS
Congress,
21.25.07.2013, Leipzig.
12. Gentile B, Ciammaruconi A, Hilss K, Haumacher
R, Pittiglio V, Antwerpen M, Grass G, Hanczaruk
M, Lista F, Beyer W. Towards a Unified Bacillus
anthracis MLVA-Typing System: Characterization
of Repeat Number and Consensus Sequences of
MLVA31 loci. Medical Biodefense Conference, 22.
-25.10.2013, München.
4. Borde JP, Ruhnke M, Offensperger W-B,
Schmoldt S, Kern WV. A rare case of imported
murine typhus to Germany from Crete – Rickettsia
typhi infection. ECCMID 2013, 27.-29.04.2013,
Berlin.
13. Genzel GH, Georgi E, Vente A, Schaumann R,
Scholz HC. In vitro Antimicrobial Activity of
Finafloxacin against Yersinia spp. Medical
Biodefense
Conference,
22.-25.10.2013,
München.
5. Brauer K., Vollmar P., Frey S. Dobler G.,
Essbauer S. Establishment of PCR microarrays
for the investigation of cell death in different cell
lines infected with tick-borne encephalitis virus.
Medical Biodefense Conference, 22.-25.10.2013,
München.
14. Georgi E, Stock RN, Genzel GH, Schmoldt S,
Scholz HC. A Hierarchical Approach to MALDITOF Mass Spectra Analysis is Resolving Strains
of a Glanders Outbreak beyond the Species
Level. Medical Biodefense Conference, 22.25.10.2013, München.
6. Chitimia L, Speck S, Nicolae S, Essbauer S,
Dobler G. First detection of rickettsiae in ticks
from Romania. XII. International Jena Symposium
on Tick-borne Diseases, 21.-23.03.2013, Weimar.
15. Hanczaruk M, Hübner A, Grass G. Rapid
Detection of Resistance against Ciprofloxacin in
Bacillus anthracis via Real Time PCR Assays.
Medical Biodefense Conference, 22.-25.10.2013,
München.
7. Dobler G, Frey S, Essbauer S. Periodicity of tickborne encephalitis virus: are we looking in the
right host? XII. International Jena Symposium on
Tick-borne Diseases, 21.-23.03.2013, Weimar.
8. Duraffour S, Andrei G, Zöller G, Rector A, Hruby
DE, Grosenbach D, Snoeck R, Meyer H.
Mutations associated with ST-246 resistance are
not found as inter-strain polymorphisms among a
total of 164 orthopoxviruses. International
conference for Antiviral research (ICAR), 11.05.15.05.2013, San Francisco, USA.
9. Essbauer S, Dmitrovsky AM, Frey S, Dobler G,
Yegemberdiyeva RA, Shapiyeva Z. Establishment
of a German/Kazakhstan Network for the
Diagnostic of Infectious Diseases Caused by
Potential
B-Agents.
Medical
Biodefense
Conference, 22.-25.10.2013, München.
10. Essbauer S, Dobler G, Frey S. Installation of a
German/Kazakhstan network to the diagnostic of
infectious diseases caused by potential B-Agents.
16. Herzberg M, Bauer L, Bleichert P, Grass G,
Riemschneider S, Dobritzsch D, Nies DH. Cellular
Biometal Contents of Highly Pathogenic Biothreat
Agents Do Not Differ from Non-Pathogenic
Organisms. Medical Biodefense Conference, 22.25.10.2013, München.
17. Keeren K, Panning M, Derakshani N, HermannPietsch M, Elschner M, Eiden M, SchmidtChanasit J, Eickmann M, Monazahian M,
Hülseweh B, Schmoldt S, Hörmansdorfer S,
Oehme R, Nitsche A. Establishment of a National
Laboratory Network to ensure diagnostics of
bioterrorism-relevant agents (NaLaDiBA). 65.
Tagung der Deutschen Gesellschaft für Hygiene
und Mikrobiologie, 22.-25.09.2013, Rostock,
sowie Medical Biodefense Conference, 22.10.25.10.2013, München.
18. Kratzmann N, Schmidt S, Rosenfeld UM, Nöckler
K, Reil D, Jacob J, Groschup MH, Mayer-Scholl A,
Kling C, Essbauer S, Ulrich RG. Molecular
detection detection of Leptospira and Rickettsia
178
Verö ffentlichungen 2013
infections in rodents during a monitoring study in
Germany 2010-2012. National Symposium on
Zoonoses Research, 19.-20. September 2013,
Berlin, sowie Medical Biodefense Conference, 22.
-25.10.2013, München.
19. Maksyutov RA, Gavrilova EV, Meyer H,
Shchelkunov SN. Updated Real-Time PCR Assay
for Specific Detection of Cowpox Virus. Medical
Biodefense
Conference,
22.-25.10.2013,
München.
20. Pajer P, Dresler J, Kabíčková H, Vítězslav K,
Velemínský P, Klimentova J, Stulík J, Pejchal J,
Elleder D, Beneš V, Meyer H, Dundr P, Hubálek
M, Píša L. Variola Virus in Historical Samples
from the National Museum of Prague. Medical
Biodefense
Conference,
22.-25.10.2013,
München.
21. Reis S, Walter M, Kahlhofer C, Frangoulidis D.
Whole Genome Amplification (WGA) in Coxiella
diagnostics and typing. Medical Biodefense
Conference, 22.-25.10.2013, München.
22. Sahavi-Ouriaghi Z, Bolz C, Meyer H, Antwerpen
MH, Splettstößer WD, Gerhard M (2013) GammaGlutamyl Transpeptidase of Francisella tularensis
as Drug Target for the Development of a New
Class of Anti-Infectives. Medical Biodefense
Conference, 22.-25.10.2013, München.
27. Vollmar P, Fieser N, Riehm J, Schmoldt S, Zöller
L, Thoma BR. Time-bomb melioidosis: relapse six
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27.-29.04.2013, Berlin.
28. Vollmar P, Scholz H, Heesemann J, von
Loewenich F, Zöller L, Schmoldt S. Cross-reactive
antibodies as a cause of false-positive results in
Brucella serodiagnosis in non-endemic regions.
65. Tagung der Deutschen Gesellschaft für
Hygiene und Mikrobiologie, 22.-25.09.2013,
Rostock.
29. Wölfel S, Vollmar P, Schmoldt S, Dobler G,
Poluda D, Löscher T. First report of acute
Chikungunya Fever imported from Bali to
Germany. Medical Biodefense Conference, 22.10.
-25.10.2013, München.
Diensterfindung
1. Dienst N, Haager V, Wölfel R (2013). RCK 03 Rapid
Containment
Kit
03,
faltbarer
Handschuhkasten zur Bearbeitung biologischer
Proben. Unbeschränkte Inanspruchnahme durch
die Bundesrepublik Deutschland, Bundesamt für
Ausrüstung, Informationstechnik und Nutzung der
Bundeswehr, Januar 2013.
23. Sheikh Ali H, Wanka K, Drewes S, Freise J,
Mertens M, Schmidt-Chanasit J, Groschup MH,
Heckel G, Essbauer SS, Schlegel M, Ulrich RG.
Molecular evolution of Puumala hantavirus in an
endemic region in Lower Saxony. IX International
conference on HFRS, HPS and Hantaviruses, 05.07.06.2013, Peking, China.
24. Splettstoesser W, Ehrle M. Humoral immune
response to recombinant proteins of the zoonotic
pathogen Francisella tularensis. 65. Tagung der
Deutschen Gesellschaft für Hygiene und
Mikrobiologie, 22.-25.09.2013, Rostock.
25. Vollmar P, Borde J, Ruhnke M, Thoma BR, Wölfel
S, Schmoldt S. Reactivation of IgM Antibodies
against Yellow Fever Virus in a Vaccinated
Traveler Following Secondary Dengue Virus
Infection. Medical Biodefense Conference 2013,
22.10.-25.10.2013, München.
26. Vollmar P, Fieser N, Mendel N, Riehm JM,
Schmoldt S, Zöller L, Thoma BR. Time Bomb
Melioidosis: Relapse Six Years after Pulmonary
Infection. Medical Biodefense Conference 2013,
22.10.-25.10.2013, München.
179
Impressum
HERAUSGEBER
Institut für Mikrobiologie der Bundeswehr
Neuherbergstraße 11
80937 München
GESTALTUNG UND REALISIERUNG
Dr. Matthias Hanczaruk
STAND
April 2015
FOTOS
Institut für Mikrobiologie der Bundeswehr
Sanitätsakademie der Bundeswehr, München
Lehrgruppe Ausbildung / Fachmedienzentrum

Druckansicht ( PDF)

BMA HF Mikrobiologie (100%)

Vorstellung von Herrn Junge .

Inhalt Impressum - Mittler Report Verlag

3. mikrobiologietage

Essenanmeldung

Treffen der Verteidigungsminister des „Weimarer Dreiecks

Im Vorgriff auf die detaillierte Ausschreibung werden die

Bestzeit gs VM 2015

Die Zukunft der Medien - an der Universität der Bundeswehr München