Der plasmamembranassoziierte Transportregulator RS1
bindet Ubiquitin und gelangt in den Zellkern
Dissertation zur Erlangung des
naturwissenschaftlichen Doktorgrades der
Bayerischen Julius-Maximilians-Universität
Würzburg
vorgelegt von
Thomas Kühlkamp
aus
Münster
Würzburg 2001
Eingereicht am:
29.05.2001
Mitglieder der Promotionskommission:
Vorsitzender: Prof. Dr. Goebel
Gutachter:
Prof. Dr. H. Koepsell
Gutachter:
Prof. Dr. U. Scheer
Tag des Promotionskolloquiums:
Doktorurkunde ausgehändigt:
Inhaltsverzeichnis
1. INHALTSVERZEICHNIS
SUMMARY......................................................................................................... 1
1. ZUSAMMENFASSUNG............................................................................. 2
2.
EINLEITUNG.............................................................................................3
2.1 Der Na+-D-Glucose Kotransporter SGLT1 und seine Regulation................................ ....3
2.1.1 SGLT1 im Darm......................................................................................................4
2.1.2 SGLT1 in LLC-PK1 Zellen......................................................................................4
2.1.3 Heterologe Expression von SGLT1 in Xenopus Oocyten.......................................5
2.2 Das RS1-Protein................................................................................................................6
2.3 Die funktionellen Seiten des RS1................................................................... ..................7
2.4 Die ersten Hinweise zur Wirkungsweise des RS1.......................................................... ..8
2.5 Aufgabenstellung......................................................................................................... .....9
3. MATERIAL und METHODEN...............................................................10
3.1 Mikroorganismen............................................................................................................. 10
3.2 Kulturbedingungen...........................................................................................................10
3.2.1 Bakterienmedien..................................................................................................... 10
3.2.2 Vorkulturen............................................................................................... ..............11
3.2.3 Hauptkulturen............................................................................................... ..........11
3.3 Kompetente E.coli Zellen für die Elektroporation...........................................................11
3.3.1 Herstellung kompetenter Zellen..............................................................................11
3.3.2 Elektroporation und Selektion................................................................................ 12
3.4 DNA-Präzipitation...................................................................................................... .....12
3.5 Alkalische Lyse ............................................................................................................... 13
3.6 Präperative Plasmidisolierung..........................................................................................13
3.7 Phenol-Chloroform-Extraktion ........................................................................................14
3.8 Konzentrationsbestimmung von Nukleinsäuren.............................................................. 14
3.9 Modifikation von Nukleinsäuren..................................................................................... 14
3.9.1 Restriktion von DNA.............................................................................................. 14
3.9.2 Auffüllen der Enden mit dem Klenow-Fragment .................................................. 15
3.9.3 DNA-Ligation ........................................................................................................ 15
3.9.4 Radioaktive Markierung .........................................................................................15
3.10 Auftrennung von DNA im Agarosegel........................................................................... 16
3.11 DNA-Extraktion aus Agarosegelen................................................................................ 16
3.12 Ligation des pRS1-Gens in den pRc/CMV-Vektor........................................................ 17
3.13 Trunkierungen des pRS1-Gens .......................................................................................17
3.14 Expression des rekombinanten pRS1 in E.coli................................................................18
3.15 RNA aus Zellkulturen .................................................................................................... 18
3.16 Poly(A)+-RNA.................................................................................................................19
3.17 Gelelektrophorese von RNA......................................................................................... ..20
3.18 Northern-Transfer......................................................................................................... ..20
3.19 Northern-Hybridisierung.................................................................................................21
3.20 Aufreinigung des rekombinanten pRS1.......................................................................... 22
3.21 Antigene......................................................................................................................... .23
3.22 Gewinnung polyklonaler Antiseren................................................................................ 24
I
Inhaltsverzeichnis
3.23 Titerbestimmung............................................................................................................. 25
3.24 Affinitätsreinigung der Antiseren......................................................................... ..........26
3.25 Proteinbestimmung......................................................................................................... 27
3.26 SDS-PAGE ................................................................................................. ...................28
3.27 Silber-Färbung von PAA-Gelen......................................................................... ............29
3.28 Westernblot........................................................................................................... ..........30
3.29 Zellfraktionierung........................................................................................................... 32
3.30 In vitro Phosphorylierung.............................................................................................. .35
3.31 Ubiquitin-Affinitätschromatographie............................................................................. 36
3.32 Zellkultur......................................................................................................................... 37
3.32a Passage................................................................................................................. 37
3.32b Kryokultur........................................................................................................... .37
3.33 In vivo Phosphorylierung................................................................................................ 38
3.34 Transfektionen von Zellen.............................................................................................. 38
3.34a Transiente Expression........................................................................................... 38
3.34b Stabile Expression.................................................................................................39
3.35 Fluoreszenzmikroskopie................................................................................................. 39
3.35a Grün fluoreszierendes Protein............................................................................... .40
3.35b RH 414 .................................................................................................................. 40
3.35 AMG-Aufnahme von LLC-PK1 Zellen ..........................................................................40
4. ERGEBNISSE............................................................................................42
4.1 Nachweis von RS1 bei verschiedenen Zellen im Westernblot........................................ 42
4.1.1 Optimierung der RS1-Detektion.............................................................................. 42
4.1.2 Nachweis des RS1 in Dünndarmzellen vom Schwein............................................. 43
4.1.3 Nachweis von RS1 in Dünndarmzellen aus diabetischen Ratten.............................44
4.1.4 Nachweis von RS1 in Dünndarmzellen vom Schaf............................................... ..45
4.1.5 Nachweis und subzelluläre Verteilung von RS1 in LLC-PK1-Zellen................... ..46
4.2 Lokalisierung des pRS1 mittels GFP-Fusion...................................................................48
4.3 pRS1 Trunkierungen und GFP-Fusion................................................................. ...........51
4.4 Die UBA-Domäne im C-Terminus des pRS1-Proteins.................................................. .57
4.5 Herstellung und Charakterisierung einer Zelllinie, die pRS1 stabil überexprimiert....... 62
4.6 RS1 und Endocytose........................................................................................................ 66
4.7 Phosphorylierung des pRS1-Proteins..................................................................... .........67
5. DISKUSSION.............................................................................................72
5.1
5.2
5.3
5.4
5.5
5.6
pRS1-Detektion im Westernblot................................................................................... ...72
RS1 an der Plasmamembran........................................................................................... .73
RS1 im Zellkern............................................................................................................... 74
RS1 im Zytoplasma..........................................................................................................75
Der C-Terminus des pRS1............................................................................................. ..76
Die möglichen physiologischen Funktionen des RS1................................................... ..78
5.6a Wirkung an der Plasmamembran............................................................................ .78
5.6b Funktion im Zellkern............................................................................................. ..80
5.7 Ist RS1 ein Signaltransduktionsprotein........................................................................... .81
5.8 Ein hypothetisches Modell zum Wirkmechanismus des RS1..........................................82
5.9 Die möglichen Regulationen der RS1-Aktivität............................................................. .84
5.9a Der Einfluss der Kinasen........................................................................................ .84
5.9b Proteolyse................................................................................................................. 85
II
Inhaltsverzeichnis
5.10 Experimenteller Ausblick...............................................................................................85
6. LITERATURVERZEICHNIS..................................................................87
7. ANHANG....................................................................................................98
7.1 Quantifizierung der pRS1-Konzentration in den BBM-Vesikeln aus der Niere..............98
7.2 Kontrolle zur Trennung bei der Zellfraktionierung...................................................... ..99
7.3 Stabilität der Kernfluoreszenz bei GFP-pRS1 Zellen nach Behandlung mit Triton.... .100
7.4 Beobachtungen zur Regulation der Kernlokalisierung des GFP-pRS1(AS 1-582)...... 100
7.5 Expression des pRS1 (AS 1-512) in HEK Zellen......................................................... 101
7.6 In vivo Phosphorylierung des GFP-pRS1-Proteins....................................................... 102
7.7 Anti-RS1 Seren..................................................................................................... ........103
7.8 Die RS1 knock-out Maus............................................................................................. .104
7.9 Abkürzungsverzeichnis................................................................................................ .106
7.10 Lebenslauf..................................................................................................................... 108
III
Summary
SUMMARY
This work discribes investigations about the subcellular distribution and function of the
plasma membrane-associated protein RS1, an regulator of plasma membrane transporters like
the Na+-D-glucose cotransporter SGLT1 or the organic cation transporter OCT2 (Vehyl et al.,
1993; Reinhardt et al., 1999; Valentin et al., 2000).
The green fluorescent protein (GFP) was fused to RS1 from pig (pRS1) and expressed in
LLC-PK1 cells. The GFP-pRS1 protein could be detected at the plasma membrane, in the
cytoplasma and in the nucleus. Expression of various truncated forms of GFP-pRS1 showed
that the N-terminal half of pRS1 (amino acids 1-328) is not necessary for the migration of
pRS1 into the nucleus. In contrast, truncations of the C-terminus inhibited translocation into
the nucleus.
The C-terminus of pRS1 contains a conserved ubiquitin associated domain (UBA) at amino
acids 579 to 616. Affinity chromatography with ubiquitin-conjungated Sepharose beads
showed a noncovalent binding of pRS1 to immobilized ubiquitin, which was abolished in the
presence of an excess of free ubiquitin. Further analysis schowed that the C-terminal 111
amino acids were indispensable for ubiquitin binding.
A conserved di-leucine signal (pRS1 336/337) is a well known endocytosis motif and points
to an involvement of pRS1 in the internalisation of plasma membrane proteins. This
hypothesis was supported by the finding of an increased uptake of the intercalating membrane
dye RH 414 in a pRS1-overexpressing LLC-PK1 cell line.
Based on this findings together with previous data, a model for the physiological role of RS1
was proposed. In this model, RS1 serves as an adaptor which links ubiquitinated plasma
membrane transporters such as SGLT1 to the endocytosis machinery. Moreover RS1 migrates
into the nucleus and is involved in the transcriptional suppression of SGLT1.
1
Zusammenfassung
1. ZUSAMMENFASSUNG
Die vorliegende Arbeit liefert wichtige Erkenntnisse über die subzelluläre Verteilung und die
Funktion des RS1-Proteins vom Schwein (pRS1), einem Regulator von Plasmamembrantransportern. Das grün fluoreszierende Protein (GFP) wurde mit pRS1 fusioniert und in LLCPK1 Zellen exprimiert. Das GFP-pRS1 Fusionsprodukt (96 kD) konnte an der
Plasmamembran, im Zytosol und im Zellkern entdeckt werden. Bei GFP-Fusion mit
trunkierten pRS1-Proteinen zeigte sich, dass der C-Terminus die Kernlokalisierung
beeinflusst. Dagegen wurde die Kernlokalisierung durch eine Trunkierung des N-Terminus
nicht gestört.
Im C-Terminus des pRS1 konnte von AS 579 bis 616 eine Ubiquitin associated domain
(UBA) identifiziert werden, die auch in den anderen bisher bekannten RS1-Proteinen aus
Mensch, Kaninchen und Maus konserviert vorliegt. Eine Ubiquitin-Affinitätschromatographie
zeigte, dass das pRS1-Protein Ubiquitin auf nicht kovalente Weise bindet. Nach der
Trunkierung der UBA-Domäne war keine Wechselwirkung des pRS1-Proteins mit Ubiquitin
mehr feststellbar.
Ein konserviertes Di-Leucin-Endozytose-Motiv (pRS1 AS 366/67) deutet eine Funktion des
pRS1-Proteins bei der Internalisierung von Plasmamembranproteinen an. Deshalb wurde das
Endozytoseverhalten von pRS1 überexprimierenden LLC-PK1 Zellen untersucht, wobei sich
zeigte, dass diese Zellen eine deutlich höhere Aufnahme des Endozytosefarbstoffes RH 414
aufwiesen als Zellen, die pRS1 nicht überexprimierten.
Die in dieser Arbeit gesammelten Daten zum RS1-Protein wurden zusammen mit früher
erhobenen Ergebnissen zum RS1-Protein im Rahmen eines Modells zusammengefasst. In
diesem hypothetischen Modell wird angenommen, dass RS1 ein Adapterprotein ist, welches
die ubiquitinabhängige Endozytose von Plasmamembrantransportern vermittelt und als
Signalmolekül in den Zellkern gelangen kann, wo es an der Transcriptionsrepression des
SGLT1 beteiligt ist.
2
Einleitung
2. EINLEITUNG
Zu den wichtigsten Voraussetzungen für die Entstehung von Leben gehörte die Bildung eines
diffusionsbegrenzten Reaktionsraumes. Bei den Zellen wird diese wichtige Aufgabe von der
Plasmamembran erfüllt. Weil zur Aufrechterhaltung der Lebensfunktionen gleichzeitig ein
gezielter Stoffaustausch und eine Energieaufnahme notwendig sind, funktioniert die
Plasmamembran wie ein selektiver Filter. Die Plasmamembran besteht aus Lipid- und
Proteinmolekülen, die hauptsächlich durch nicht kovalente Bindungen zusammengehalten
werden. Hydrophobe Moleküle wie z.B. O2, N2 und Benzol oder kleine ungeladene, polare
Moleküle wie CO2, H2O, Harnstoff und Glycerin können leicht durch eine Lipiddoppelschicht
diffundieren. Große ungeladene, polare Moleküle wie Glucose und Saccharose oder Ionen wie
Na+, K+, Ca2+, Cl- und Mg2+ hingegen sind zum Überwinden der Plasmamembran auf
bestimmte Transmembranproteine angewiesen.
Für den Transport von Glucose durch die Plasmamembran werden zwei wichtige Klassen von
Transportern voneinander unterschieden. Die GLUT-Transporter (Glucose-Transporter; zur
Übersicht Gould und Holman, 1993) erlauben durch eine erleichterte Diffusion die passive
Aufnahme bzw. Abgabe von Glucose entlang eines Glucosegradienten. Der Na+-abhängigeD-Glucose-Kotransporter SGLT1 (zur Übersicht Turk and Wright, 1997) ermöglicht dagegen
die aktive Aufnahme von Glucose. Die wechselnden extrazellulären Konzentrationen von
Glucose erfordern von den Zellen eine dauernde Adaption der Aktivität der GlucoseTransportproteine.
2.1 Der Na+-D-Glucose Kotransporter SGLT1 und seine Regulation
SGLT1 ist ein sekundär aktiver Glucosesymporter, welcher unter Ausnutzung des
zelleinwärts gerichteten Na+-Gradienten Glucose aktiv in Zellen transportiert und so die
Aufnahme von Glucose auch gegen einen Glucose-Konzentrationsgradienten ermöglicht.
SGLT1 wird am stärksten in den luminalen Bürstensaummembranen der DünndarmEpithelzellen (Takata et al., 1992) und im S3 Segment des proximalen Nierentubulus
exprimiert (zur Übersicht Hediger and Rhoads, 1994; Koepsell and Spannenberg, 1994).
Auch im Gehirn scheint der SGLT1 eine wichtige Rolle zu spielen (Poppe et al., 1997).
Die Regulation der Aktivität des SGLT1 erfolgt auf verschiedenen Ebenen, wie Transcription,
mRNA-Stabilität oder Endo-, Exozytose. Zu verschiedenen Zellen wurden bisher
unterschiedliche Regulationsmechanismen beschrieben.
3
Einleitung
2.1.1 SGLT1 im Darm
Die Aktivität vom SGLT1 im Dünndarm wird durch die Glucosekonzentration im
Darmlumen reguliert. Mit zunehmendem Glucosegehalt steigt die Transportaktivität des
SGLT1. Beim Schaf sind die Auswirkungen der Glucose auf den SGLT1 besonders gründlich
untersucht worden. Nach dem Abstillen der Lämmer kommt es zu einer natürlichen
Reduzierung des Glucoseangebotes im Darmlumen, was parallel zu einer drastischen
Verminderung der SGLT1-Aktivtät führt (Shirazi-Beechey et al., 1991). Beim adulten Schaf
steigt die Aktivität des SGLT1 erst nach einer glucosereichen Ernährung über eine
Darmsonde wieder deutlich an. Dabei erhöht sich die Anzahl der SGLT1-Proteine in den
Bürstensaummembranen proportional zur Aktivitätszunahme des SGLT1. Während die
Anzahl der SGLT1-Proteine um das mehrfache steigt, kann für die SGLT1-mRNA nur ein
Anstieg bis zum zweifachen festgestellt werden (Lescale-Matys et al., 1993). Somit ist der
Einfluss der Glucose auf den SGLT1 größtenteils auf posttranscriptionale Prozesse
zurückzuführen.
Auch Krankheiten beeinflussen die Aktivität des SGLT1 im Darm. So verursacht ein akuter
unbehandelter Diabetes einen Anstieg der SGLT1-Proteine in den Bürstensaummembranen,
ohne dass sich die Konzentration der SGLT1-mRNA verändert. Erst bei einer Behandlung mit
Insulin sinkt die Konzentration der SGLT1-Moleküle wieder auf Normalmass, ohne die
mRNA Konzentration des SGLT1 zu verändern (Kurokawa et al., 1995). Somit scheint auch
Insulin posttranscriptional auf die Aktivität des SGLT1 zu wirken.
Chronische Entzündungen des Dünndarms führen zur einer Verminderung der SGLT1Proteine in den Bürstensaummembranen. Bei Behandlung mit Glucocorticoiden wird die
Anzahl der SGLT1-Moleküle auf bisher noch unbekannte Weise wieder erhöht. Bei gesunden
Kaninchen verändert die intramuskuläre Injektion von Glucocorticoiden die Transportaktivität
des SGLT1 hingegen nicht (Sunadaram et al., 1999).
2.1.2 SGLT1 in LLC-PK1 Zellen
In der Niere spielt SGLT1 bei der aktiven Rückresorption von Glucose aus dem Primärharn
eine wichtige Rolle. Aus dem S3-Segment des proximalen Nierentubulus vom Schwein
konnte die epitheliale Zelllinie LLC-PK1 gewonnen werden, die den SGLT1 endogen
exprimiert (Hull et al., 1976). In den LLC-PK1 Zellen wird die physiologische Aktivität des
SGLT1 von den Faktoren Glucoseangebot und Zelldichte beeinflusst.
Im Gegensatz zu der Wirkung der Glucosekonzentrationen im Darm (2.1.1) verursachen DGlucose-Konzentrationen von mehr als 5 mM im Nährmedium eine drastische Reduzierung
4
Einleitung
der Transportaktivität des SGLT1 (Moran et al., 1983). Die hohen Glucosekonzentrationen
führen auf noch unbekannte Weise zu einer Abnahme der SGLT1- mRNA (Ohta et al., 1990).
Es bleibt bisher ungeklärt, ob die dabei festgestellte verringerte Konzentration an SGLT1mRNA die Folge einer Reduzierung der Transcriptionsrate oder einer Destabilisierung der
SGLT1-mRNA ist.
Auch die Zelldichte wirkt auf noch relativ ungeklärte Weise auf die Konzentration der
SGLT1-mRNA. Die LLC-PK1 Zellen sind Epithelzellen und bilden beim Wachstum einen
Monolayer aus. Die Differenzierung zu einer polarisierten Zellstruktur erfolgt erst im
geschlossenen Zellverband mit ausgebildeten Zell-Zellkontakten. Erst dann ist eine deutliche
Konzentration an SGLT1-mRNA feststellbar (Yet et al., 1994; Shioda et al., 1994). Nach
Zerstörung der Zell-Zellkontakte nimmt die SGLT1-Aktivität durch die Reduzierung der
SGLT1-mRNA schnell wieder ab (Van den Bosch et al., 1991). Die Proteinkinase C (PKC)
scheint an dieser schnellen Abnahme der SGLT1-mRNA beteiligt zu sein, denn bei
Inhibierung der PKC-Aktivität konnte die SGLT1-mRNA trotz Zerstörung der ZellZellkontakte stabilisiert werden (Shioda et al., 1994). Bei Aktivierung der Proteinkinase C
durch Phorbolester in differenzierten LLC-PK1 Zellen ist eine schnelle Abnahme der SGLT1mRNA feststellbar. Hingegen bewirkt die Aktivierung der cAMP-abhängigen Protein Kinase
A (PKA) eine Stabilisierung der SGLT1-mRNA (Peng and Lever, 1995). Erst kürzlich konnte
gezeigt werden, das eine uridinreiche Sequenz (URE) im 3`-Bereich der untranslatierten
Region der SGLT1-mRNA für die Destabilisierung verantwortlich ist. Bei Störung der
Interaktion dieser URE mit einem nukleo-zytoplasmatischen 38 kD Protein wurde die durch
cAMP-vermittelte Stabilisierung der SGLT1 mRNA aufgehoben (Lee et al., 2000). Es
scheint, als ob die Wirkung der PKA auf die SGLT1-mRNA durch dieses noch unbekannte 38
kD Protein verursacht wird.
2.1.3 Heterologe Expression von SGLT1 in Xenopus Oocyten
Die Expression von klonierten SGLT1-Proteinen in Oocyten des Xenopus laevis ermöglicht
eine gute Charakterisierung der Transportaktivitäten dieses Proteins. In diesem System kann
die Regulation des SGLT1 unabhängig von den transcriptionellen Einflüssen des natürlichen
Promotors untersucht werden. Dabei wurden wichtige Erkenntnisse über die Wirkungen der
Proteinkinasen auf die Aktivität des SGLT1 gesammelt. Nach Stimulation der Proteinkinasen
verändern sich die maximalen Transportraten deutlich. Wenige Minuten nach Aktivierung der
PKA mit zyklischem 8-Bromo-Adenosin 3`,5`-Monophosphat (8-Br-cAMP) kann ein Anstieg
der Transportraten für die SGLT1-Proteine aus Kaninchen, Ratte und Mensch beobachtet
5
Einleitung
werden. Bei Stimulation der PKC mit sn-1,2-Dioctanoylglycerol (DOG) ist die Wirkung auf
die Aktivität der verschiedenen SGLT1-Proteine unterschiedlich. Während die Transportraten
für den SGLT1 aus Ratte und Kaninchen sinken, kann für den menschlichen SGLT1 eine
Steigerung gemessen werden (Hirsch et al., 1996; Wright et al., 1997). Die Ursachen für die
uneinheitliche Wirkung der PKC auf die verschiedenen SGLT1-Moleküle sind noch nicht
geklärt, werden aber im Zusammenhang mit den Sequenzunterschieden vermutet.
Für eine schnelle Veränderung der Transportleistung des SGLT1 kann entweder eine
Veränderung in der Anzahl der Transporter in der Plasmamembran oder eine direkte
Beeinflussung der Aktivität des Transporters in Betracht gezogen werden. So wird z.B. die
Aktivität des Glutamat-Kotransporter im Gehirn durch eine spezifische Phosphorylierung
direkt reguliert (Casado et al., 1993). In der Sequenz des SGLT1 aus Mensch, Ratte und
Kaninchen sind vier konservierte potentielle Phosphorylierungssequenzen für die PKC
vorhanden. Für die PKA existiert eine konservierte potentielle Phosphorylierungsstelle, die
aber im Ratten SGLT1 nicht vorhanden ist (Turk et al., 1996). Trotzdem konnte für den
Ratten-SGLT1 eine direkte PKA abhängige Phosphorylierung demonstriert werden (Ishikawa
et al., 1997). Eine PKC abhängige Phosphorylierung konnte für noch kein SGLT1-Molekül
gezeigt werden.
Die Stimulation der Proteinkinasen in den Xenopus Oocyten führen zu einer Veränderung der
Anzahl der SGLT1-Moleküle in der Plasmamembran, die mit einer entsprechenden
Veränderung der Membranoberfläche korreliert. Unabhängig von der Frage einer direkten
Phosphorylierung der SGLT1-Protein scheint die Wirkung der Kinasen auf Veränderungen
beim Ein- und Ausbau des SGLT1 in die Plasmamembran zu zielen (Hirsch et al., 1996;
Wright et al., 1997).
Eine weitere Möglichkeit die Transportaktivität von SGLT1 zu verändern, besteht in einer
direkten oder indirekten Beeinflussung durch andere Proteine. So kann der Transport des
SGLT1 in Oocyten durch Koexpession des RS1-Proteins, welches in der Arbeitsgruppe von
Prof. Koepsell kloniert wurde, verändert werden (Veyhl et al., 1993).
2.2 Das RS1-Protein
Die
Entdeckung
des
RS1-Proteins
geht
auf
Versuche
zurück,
den
Na+-D-
Glucosekotransporter (SGLT1) aus dem Schwein zu charakterisieren. Beim Immunscreening
einer c-DNA-Expressionsbank der Schweineniere wurde ein intronloses Gen entdeckt,
welches ein 623 AS langes Polypeptid kodiert (Veyhl et al., 1993). Nach Expression des RS16
Einleitung
Proteins aus dem Schwein (pRS1) in Xenopus Oocyten kann das pRS1-Protein in der
Plasmamembranfraktion detektiert werden. Das pRS1-Protein ist nur mit einem lipidlöslichen
Biotinderivat markierbar, was die intrazelluläre Orientierung des pRS1 verdeutlicht (Valentin
et al., 2000).
RS1-Proteine sind bisher aus dem Schwein (pRS1), dem Menschen (hRS1), dem Kaninchen
(rbRS1) und der Maus (mRS1) kloniert worden (Veyhl et al., 1993; Lambotte et al., 1996;
Reinhardt et al., 1999; Baumgarten, 1999) und sie stammen von einem intronlosen „Single
copy Gen“ (Lambotte et al., 1996; Reinhard et al., 1999). Die RS1-Proteine besitzen je nach
Spezies eine Länge von 582 bis 623 Aminosäuren. Ihre Homologie liegt durchschnittlich bei
70 %. Die konservierten Aminosäuren beschränken sich größtenteils auf sehr kurze
Abschnitte über die gesamte Sequenz. Der auffallend größte zu 100 % konservierte Abschnitt
liegt im C-Terminus und umfasst 35 Aminosäuren. Von den letzten 15 Aminosäuren haben 13
Aminosäuren hydrophobe Reste.
Alle RS1-Proteine besitzen 2 konservierte potentielle Phosphorylierungsstellen für die
Proteinkinase C (PKC) und 3 für die Caseinkinase II (CaK II) (Baumgarten, 1999).
2.3 Die funktionellen Seiten des RS1
Aufgrund der Vorstellung, dass es sich bei RS1 um eine spezifische regulatorische
Untereinheit des SGLT1 handelt (Koepsell and Spannenberg, 1994), konzentrierten sich die
Untersuchungen in der Arbeitsgruppe zunächst auf die Charakterisierung der Beeinflussung
des SGLT1. Dazu wurde RS1 gemeinsam mit SGLT1 in Oocyten des südafrikanischen
Krallenfrosches Xenopus laevis exprimiert. Durch Vergleich der kinetischen Daten des
SGLT1 mit und ohne Koexpression des RS1 wurden wichtige Informationen über die
Eigenschaften des RS1 gewonnen. So kann bei der Koexpression des menschlichen RS1
(hRS1) mit dem menschlichen SGLT1 (hSGLT1) eine Reduzierung des Vmax-Wertes für den
SGLT1-abhängigen Transport beobachtet werden (Lambotte et al., 1996). Später zeigte sich,
dass sich die Wirkung des RS1 nicht auf den SGLT1 beschränkt. Bei Koexpression des RS1
aus Kaninchen (rbRS1) mit dem Organischen Kationentransporter vom Menschen (hOCT2)
wurde auch eine inhibierende Eigenschaft des RS1 auf die Transportaktivität des OCT2
beobachtet, die ebenfalls zu einer Reduzierung des Vmax-Wertes führt (Reinhardt et al., 1999).
RS1 wirkt somit in ähnlicher Weise auf zwei Transporter, die zu unterschiedlichen
Proteinfamilien gehören.
7
Einleitung
Nachdem gezeigt werden konnte, dass die LLC-PK1 Zellen auch RS1 endogen transcribieren
(Veyhl et al., 1993), ergab sich die Möglichkeit, RS1 in einem natürlichen System gezielter zu
untersuchen. Man entschied sich, die physiologischen Auswirkungen einer Reduzierung der
endogenen pRS1-Expression in den LLC-PK1 Zellen zu analysieren. Durch die stabile
Transfektion mit einem pRc/CMV-RS1 anti-sense Konstrukt konnte die endogene Translation
des pRS1 vermindert werden. Diese LLC-PK1 Zellen zeigen eine deutliche Stimulation der
endogenen
SGLT1-Transportaktivität.
Die
Menge
der
SGLT1-Proteine
in
der
Plasmamembran und auch die Konzentration der SGLT1-mRNA steigt ca. um den Faktor 10
(Korn, 1999). Während die Ergebnisse zum RS1 bei Expression in Xenpous Oocyten
transcriptionsunabhängig sind, kann nun in den RS1 anti-sense LLC-PK1 Zellen ein Einfluss
des RS1 auf die SGLT1- und OCT2-mRNA beobachtet werden. Die bis dahin gesammelten
Erkenntnisse zum RS1 wurden in einem Modell zusammengefasst.
Abb.2-1: Hypothetisches Modell zur Wirkungsweise des RS1 (Korn, Dissertation 1999)
Die Interaktion des RS1 mit verschiedenen Plasmamembrantransportern vollzieht sich auf der
zytosolischen Seite über postulierte Adapter-Proteine. Als Folge dieser Interaktion kommt es
letztlich auf noch unbekannte Weise zur Beeinflussung der Transcription dieser
Plasmamembrantransporter.
2.4 Die ersten Hinweise zur Wirkungsweise des RS1
Das Modell zur Wirkungsweise des RS1 [Abb. 2-1] deutet zwar eine Funktion des RS1 als
Signaltransduktionsmolekül zwischen der Plasmamembran und dem Zellkern an, enthält aber
weder eine Erklärung für die transcriptionsunabhängige Beeinflussung der SGLT1- und
OCT2-Transportaktivitäten in Xenopus Oocyten, noch für die Veränderung der mRNAKonzentrationen des SGLT1 und OCT2 in LLC-PK1 Zellen.
Die transcriptionsunabhängige Hemmung der SGLT1-Aktivität durch RS1 in Oocyten konnte
durch Untersuchungen von Marc Valentin genauer beschrieben werden. Es zeigte sich
8
Einleitung
nämlich, dass sich die Konzentration der SGLT1-Moleküle in der Plasmamembran bei
Koexpression mit RS1 reduziert (Valentin et al., 2000). Die Reduzierung der SGLT1-Proteine
in der Plasmamembran korreliert dabei mit dem Rückgang der SGLT1-Transportleistung. So
konnte erkannt werden, dass RS1 die Präsenz des SGLT1 in der Plasmamembran beeinflusst,
was die Abnahme der maximalen Transportraten erklärt.
2.5 Aufgabenstellung
In der vorliegenden Dissertation sollte weiter untersucht werden, wie RS1 einerseits die
Konzentration des SGLT1 in der Plasmamembran transcriptionsunabhängig beeinflusst und
wie sich anderseits die Wirkung des RS1 auf die mRNA-Konzentration des SGLT1 erklärt.
Dazu sollte die subzelluläre Verteilung des RS1 in LLC-PK1 Zellen analysiert werden. Um
die Wirkungsweise des RS1 auf die Expression des SGLT1 besser zu verstehen, sollten RS1
stabil überexprimierende Zellen geschaffen und untersucht werden.
9
Material und Methoden
3. MATERIAL und METHODEN
Für alle molekular- und zellbiologischen Arbeitsschritte wurden ausschließlich sterilisierte
Materialien eingesetzt. Die Sterilisation der Lösungen und Kunststoffartikel wurde durch
Autoklavierung erreicht (20 min, 121°C, 2.1 bar). Thermolabile Lösungen konnten durch
Sterilfiltration entkeimt werden. Glas- und Metallwaren wurden mit Hilfe trockener Hitze bei
180°C für 1h sterilisiert. Um die Gefahr mikrobiologischer Kontaminationen zu minimieren,
wurden die Arbeitsflächen mit UV-Licht und/oder 70%igem Ethanol entkeimt. Nach
Möglichkeit wurden alle kontaminationsgefährdeten Arbeitsschritte unter der Sterilbank
durchgeführt.
3.1 Mikroorganismen
Folgende E.coli Stämme kamen zum Einsatz:
DH10B (Grant et al., 1990)
Dieser Stamm diente zur Selektion und Amplifizierung von Plasmid-DNA.
BL21[DE3] (Studier and Moffert, 1986)
Dieser Stamm wurde zur Proteinexpression eingesetzt.
3.2 Kulturbedingungen
Die Lagerung und Sicherung der Bakterienstämme erfolgten in Form von Kryokulturen.
Die Bakterienkulturen, welche eine OD600 von 0.6 erreicht hatten, wurden mit sterilfiltriertem
Glycerin auf eine Endkonzentration von 15 % (v/v) eingestellt und konnten anschließend bei
- 70°C gelagert werden.
3.2.1 Bakterienmedien
LB-Medium: 2 % Bacto-Tryptone (w/v), 0.5 % Hefeextrakt (w/v), 170 mM NaCl, pH 7.0
SOB-Medium: 2 % Bacto-Tryptone (w/v), 0.5 % Hefeextrakt (w/v), 10 mM NaCl,
2.5 mM KCl, 10 mM MgCl2, pH 7.0
SOC-Medium: SOB-Medium, 10 mM MgSo4, 20 mM Glucose
Um feste Nährmedien zu erhalten, wurde zusätzlich 1.5 % (w/v) Agar vor dem Autoklavieren
zugefügt.
10
Material und Methoden
Die hitzeempfindlichen und deshalb sterilfiltrierten Antibiotika durften erst nach Abkühlung
der Nährmedien unter 60°C zugesetzt werden. Folgende Antibiotika wurden zur Selektion
verschiedener Vektoren eingesetzt:
-
für den pRc/CMV-(Invitrogen, Leek, Niederlande), pET22b(+)- und pBluescriptSKII(-)
(Stratagene, Heidelberg, Deutschland)-Vektor 100 µg Ampicillin pro ml
Nährmedium
-
für den pEGFP-Vektor (Clontech, Heidelberg, Deutschland) 30 µg Kanamycin pro ml
Nährmedium
3.2.2 Vorkulturen
10 µl einer aufgetauten Kryokultur wurden auf einer Agarplatte ausgestrichen und über Nacht
im Brutschank bei 37 °C kultiviert. Einzelne sichtbare Kolonien dienten zur Animpfung eines
Nährmediums von 2 bis 5 ml. Bei 37°C und 300 rpm auf einem Rotationsschüttler konnten
sich die Bakterien adaptierten und vermehren.
3.2.3 Hauptkulturen
Für die Hauptkulturen wurden autoklavierte 1000 ml Erlenmeyerkolben mit Schikanen
verwendet, die 125 ml Nährmedium enthielten. Die Hauptkulturen wurden 1 zu 100 mit der
Vorkultur inokuliert. Die Inkubation erfolgte ebenfalls bei 37°C und 300 rpm
3.3 Kompetente E.coli Zellen für die Elektroporation
3.3.1 Herstellung kompetenter Zellen
Vier 250 ml SOB-Medium ohne Magnesiumsalz wurden mit je 1ml Vorkultur aus E.coli
[DH10B] angeimpft. Die Verwendung von 1000 ml Erlenmeyerkolben mit Schikanen
ermöglichte eine optimale Vermehrung. Bei 37 °C wuchsen die Zellen auf einem
Rotationsschüttler bis zu einer OD600 von 1.0. Anschließend wurden die Kulturgefäße in
Eiswasser abgekühlt. Nach Zentrifugation mit 2.000 g bei 4 °C wurden die sedimentierten
Bakterien in 500 ml 10 %igem (v/v) Glycerin resuspendiert. Nach einem zweiten
Zentrifugationsschritt wurden die Bakterien in soviel Glycerinlösung aufgenommen, dass sich
eine OD600 von 2.0 einstellte. Bis zu ihrer Verwendung wurden die elektrokompetenten
Bakterien bei – 70°C gelagert.
11
Material und Methoden
3.3.2 Elektroporation und Selektion
20 µl elektrokompetenter Bakterien (3.2) wurden mit 1 µl der Plasmid-DNA gemischt und in
eine eisgekühlte Elektroporationsküvette pipettiert. Nach einem Spannungsstoß (1.6 kV, 5
msec, Biojet MI) wurden die Bakterien in 1 ml SOC-Medium suspendiert und 1 h im
Wärmeschrank bei 37°C inkubiert. 100 bis 400 µl des Transformationsansatzes wurden auf
Agar-Nährmedium mit entsprechendem Antibiotikum großflächig ausgestrichen. Nach 16 h bei
37 °C waren die transformierten Bakterien zu sichtbaren Kolonien herangewachsen.
Von den gewonnenen Klonen wurden Vorkulturen (3.2.2) angeimpft und außerdem wurden die
Klone zur vorläufigen Sicherung auf eine neue Agarplatte ausgestrichen, die nach 16 h bei
37°C bei 4°C für ca. 14 Tage gelagert werden konnte.
3.4 DNA-Präzipitation
Für die Fällung von DNA wurden je nach Anforderung verschiedene Methoden eingesetzt.
Welche Methode jeweils zum Einsatz kam, wird in den weiteren Beschreibungen aufgeführt.
Fällung mit Natriumacetat und Ethanol:
Nach Zugabe von 1/10 Volumen 3 M Natriumacetatlösung (pH 5.3) und 2.5 Volumen 96%iger
Ethanollösung zur DNA-Lösung fiel die DNA bei – 20 °C ( > 2 h) aus. Als Präzipitierhilfe
konnte auch 2.5 µg Polyacrylamid zugegeben werden, was eine sofortige Zentrifugation
ermöglichte.
Fällung mit Natriumacetat und Isopropanol:
Nach Zugabe von 1/10 Volumen 3 M Natrriumacetatlösung (pH 5.3) und 0.8 Volumen
Isopropanol wurde die DNA-Lösung sofort zentrifugiert.
Der Überstand (30 min, 14.000 g) wurde verworfen und das DNA-Sediment wurde mit
70%igem Ethanol überschichtet und erneut zentrifugiert. Die präzipitierte DNA wurde nach
Abnahme des Überstandes und Lufttrocknung in einem angemessenen Volumen Puffer bzw.
Wasser gelöst. Die Lagerung erfolgte bei – 20 °C.
12
Material und Methoden
3.5 Alkalische Lyse
(Birnboim und Doly, 1979)
Die alkalische Lyse diente der Isolierung von Plasmid-DNA aus E.coli. Durch eine
starke Alkalisierung und SDS-Behandlung wurden die Bakterienzellen aufgeschlossen. Dabei
denaturierten sowohl die Proteine als auch die DNA. Bei Neutralisierung des pH-Wertes
konnte sich die Plasmid-DNA aufgrund ihrer geringen Größe in Gegensatz zur genomischen
DNA renaturieren.
3 ml Vorkulturen (3.2.2), die über Nacht gewachsen waren, wurden 3 min bei 1.500 g
sedimentiert und in 0.3 ml Puffer 1 resuspendiert. Nach 5 min Inkubation bei RT wurden die
Zellen durch die Zugabe von 0.3 ml Puffer 2 aufgeschlossen und mussten anschließend 3 bis 4
min auf Eis inkubieren. Es folgte unmittelbar eine Zugabe von 0.3 ml Puffer 3. Nach einer 15
minütigen Zentrifugation bei 12.000 g konnten die genomische DNA und viele Proteine
sedimentiert werden. Die Plasmid-DNA wurde mit Isopropanol (3.4) aus dem Überstand
gefällt, kurz getrocknet und in 10 bis 20 µl Wasser gelöst.
Puffer 1: 10 mM EDTA, 50 mM Tris / HCl pH 8.0 und 100 µg RNAse/ml
Puffer 2: 200 mM NaOH und 1 % (w/v) SDS
Puffer 3: 3 M Kaliumacetat pH 5.3
3.6 Präperative Plasmidisolierung
Bei der Reinigung von Plasmid-DNA aus Bakterien-Hauptkulturen mit mehr als 25 ml wurde
ein Qiagenfilter Plasmid Kit (Hilden, Deutschland) eingesetzt. Es wurde das Protokoll des
Herstellers befolgt (Qiagen Plasmid Purification Handbook, July 99).
Die Reinigung der Plasmide arbeitete nach dem Prinzip der alkalischen Lyse (3.5) und
Anreicherung der Plasmid-DNA über einen Anionenaustauscher. Nach der Neutralisierung des
pH-Wertes wurde das Lysat mittels einer Filtration geklärt. Bei Bedarf wurde dem Lysat
Endotoxin-Removal-Puffer (EndofreeTM Plasmid Maxi Kit, Qiagen) zugegeben, um enthaltene
Endotoxine im nächsten Reinigungsschritt nicht an den DEAE-Anionenaustauscher binden zu
lassen. Nach dem Waschen der Säulenmatrix wurde die Plasmid-DNA mit einem Puffer, der
1.25 M NaCl enthielt, eluiert. Die DNA konnte mit Isopropanol (3.4) gefällt und in Wasser
bzw. Puffer gelöst werden.
13
Material und Methoden
3.7 Phenol-Chloroform-Extraktion
Zur Ankonzentrierung von DNA und Entfernung von Proteinen und Salzen aus DNALösungen wurde häufig eine Phenol-Chloroform-Extraktion durchgeführt. Zuerst wurde die
Lösung mit dem gleichen Volumen einer Chloroform-Phenol (1:1)-Lösung ausgeschüttelt. Es
folgte eine Zentrifugation von 7 min bei 9.000 g, wobei sich die DNA in der oberen wässrigen
Phase sammelte. Nach der Extraktion der wässrigen Phase mit dem gleichen Volumen einer
Chloroform-Isoamylalkohol-Lösung (49:1 v/v) und einer erneuten Zentrifugation konnten
weitere Verunreinigungen entfernt werden.
3.8 Konzentrationsbestimmung von Nukleinsäuren
Die Extinktion (Ex.) der Probe bei 260 nm diente der Abschätzung der DNA bzw. RNAKonzentration. Ein Wert von 1.0 entspricht 50 µg bei doppelsträngige DNA / ml bzw. 40 µg
bei RNA/ml.
dsDNA [µg/ml] = Ex.260 / 50
RNA [µg/ml] = Ex.260 / 40
Die Kontamination der Nukleinsäureprobe mit Protein konnte durch die Berechnung des
Extinktionsquotienten aus 260 und 280 nm bestimmt werden.
reine ds DNA = Ex.260 / Ex.280 = 1.8
reine RNA = Ex.260 / Ex.280 = 2.0
3.9 Modifikation von Nukleinsäuren
3.9.1 Restriktion von DNA
Das spezifische Schneiden von DNA erfolgte mit Restriktionsendonukleasen des Typs II, um
innerhalb einer charakteristischen doppelsträngigen Nukleotidsequenz gezielt Phosphodiesterbindung in beiden Strängen zu hydrolysieren. Die Restriktion erfolgte nach Angaben des
Herstellers. Dabei wurde die Beimengung der Enzymlösung unter 10 % (v/v) des
Gesamtvolumens gehalten, um die Reaktion nicht durch das enthaltene Glycerol zu stören. Die
Reaktion konnte durch eine Denaturierung des Restriktionsenzyms bei 70°C für 10 min bzw.
durch eine sofortige Phenol-Chloroform-Extraktion (3.7) gestoppt werden.
14
Material und Methoden
3.9.2. Auffüllen der Enden mit dem Klenow-Fragment
Mit Hilfe des Klenow-Fragmentes konnte bei dsDNA Strängen ein zurückversetztes 3´-Ende
mit Nukleotiden aufgefüllt werden. Die Reaktion wurde in Gegenwart von 9 U Klenow
Fragment (GibcoBRL), 60 µM dNTPs in 30 µl durchgeführt. Nach 30 min bei 37°C in einem
Puffer aus 50 mM Tris/HCl pH 7.5, 10 mM MgCl2, 1 mM DTT und 50 µg/ml BSA konnte die
Reaktion durch die Inkubation für 10 min bei 70°C beendet werden.
3.9.3 DNA-Ligation
(Dower et al., 1988)
Mit der T4-DNA-Ligase (4 U/µl) (Stratagene, Heidelberg) konnten Phosphodiesterbrücken
zwischen zwei DNA-Molekülen mit einer 3`Hydroxy- und einer 5´Phosphatgruppe gebildet
werden. Es empfahl sich bei der Ligation eines DNA-Fragmentes in ein Plasmid ein molares
Verhältnis von ca. 3:1 zu wählen. Die Ligationsreaktion erfolgte in 20 µl mit Ligationspuffer
16 h bei 14°C im Wasserbad.
Vor einer anschließenden Elektroporation (3.3.2) musste der Ligationansatz entsalzt werden.
Dazu wurde eine Phenol-Choroform-Extraktion (3.7) durchgeführt und die DNA wurde mit
Hilfe von Polyacrylamid und Natriumacetat (3.4) gefällt. Die getrocknete DNA wurde in
Wasser aufgenommen.
Ligationspuffer: 5 mM MgCl2, 10 mM DTT, 1 mM ATP, 66 mM Tris/HCl (pH 7.5)
3.9.4 Radioaktive Markierung
Für die radioaktive Markierung von DNA mit
32
P zum Einsatz als Sonde für die Northern-
Hybridisierung wurde das RADPrime DNA Labeling System benutzt (GibcoBRL10555808).
Die Anweisungen des Herstellers wurden befolgt. Dabei wurden die DNA-Sonden mit Hilfe
des Klenow-Fragmentes mit a-32P-dATP markiert. Zuvor mussten 1-5 µg der DNA für 5 min
bei 100 °C denaturiert und anschließend 5 min auf Eis abgekühlt werden. Die denaturierte
(einzelsträngige) DNA wurde nun nach Anweisung des Herstellers mit Hilfe des KlenowFragmentes, a-32P-dATP, dCTP, dGTP und dTTP in vitro transkribiert. Durch die Zugabe von
EDTA nach 30 min bei 37°C wurde die Reaktion gestoppt. Nach 5 min Denaturierung bei 100°
C und anschließend sofortiger Abkühlung auf Eis war die Sonden-Lösung direkt einsatzbereit
für die Northern-Hybridisierung (3.19).
15
Material und Methoden
3.10 Auftrennung von DNA im Agarosegel
Die negativ geladenen Nukleinsäuren bewegen sich in einem elektrischen Feld auf die
Anode zu. Die linearisierten Nukleinsäuremoleküle trennen sich dabei im Gel nach ihrer
Größe und Konformation auf.
Es wurden 1%ige Agarosegele in 1 x TAE-Puffer (50 ml) verwendet, die 0,1 µg
Ethidiumbromid / ml enthielten. Ethidiumbromid interkalierte in die Nukleinsäuren und
fluoreszierte nach UV-Lichtanregung. Nukleinsäuren konnten so auf einem Transsilluminator
(UVP.INC, San Gabriel, USA) im Gel sichtbar gemacht werden. Die DNA-Proben wurden zu
Beginn mit Probenpuffer versetzt. Die Elektrophorese erfolgte bei 5 bis 8 V/cm in TAE-Puffer.
Als DNA-Längenmarker wurden 500 ng einer 1 kb-Leiter (GibcoBRL, Karlsruhe,
Deutschland) verwendet.
TAE-Puffer: 40 mM Tris / Acetat, 1 mM EDTA, pH 8.0
Probenpuffer (5 x): 30 % (v/v) Glycerin, 0.25 % (w/v) Bromphenolblau,
0.25 % (w/v) Xylencyanol in TAE-Puffer
3.11 DNA-Extraktion aus Agarosegelen
Zur Isolierung bestimmter DNA-Fragmente bekannter Basenlänge aus einem Gemisch
verschiedener DNA-Stränge wurde die Probe elektrophoretisch in einem Agarosegel
aufgetrennt (3.10). Unter UV-Licht-Anregung auf einem Transilluminator wurde die
gewünschte DNA-Bande knapp ausgeschnitten. Für die Extraktion der DNA aus dem
Agaroseblock wurde das DNA Purifikation Kit „Easy Pure“ (Biozym Diagnostic GmbH,
Oldendorf) verwendet. Das Protokoll und die Lösungen des Herstellers wurden verwendet. Die
Gelbande wurde in 3 Volumen SALT-Lösung bei 55°C gelöst. Durch die Zugabe der BINDLösung (5 µl plus je 1 µl pro erwartete 1 µg DNA-Ausbeute) wurde die DNA an die Partikel
der BIND-Suspension gebunden. Nach 5 min wurde die gebundene DNA herunter zentrifugiert
und der Überstand verworfen. Das Sediment wurde in 1 ml WASH-Lösung resuspendiert.
Nach wiederholter Zentrifugation wurde das Sediment in 10 µl Wasser resuspendiert. Dabei
ging die DNA in Lösung und konnte mit dem Überstand abgenommen werden.
16
Material und Methoden
3.12 Ligation des pRS1-Gens in den pRc/CMV-Vektor
Für die Expression des pRS1-Proteins in Eukaryontenzellen musste das pRS1-Gen aus dem
Plasmid pBS/pRS1 (Spangenberg, 1993) in den pRc/CMV Vektor (Invitrogen, Leek,
Niederlande) kloniert werden. Durch die Restriktion mit Bgl II und Hind III konnte ein ca. 2,2
kb großes Fragment erhalten werden, welches den gesamten Leseraster des pRS1 enthielt. Mit
dem Klenow-Fragment (3.9.2) wurden die überstehenden Enden aufgefüllt, so dass
anschließend eine Ligation (3.9.3) mit BstX I Adaptoren durchgeführt werden konnte. Das
isolierte 2,2 kb Fragment wurde anschließend mit dem restringierten pRc/CMV/BstX I- Vektor
ligiert (3.9.3). Die richtige Orientierung wurde durch eine Restriktionsanalyse überprüft und
die Erhaltung des Leserasters wurde durch die Sequenzierung des gereinigten Plasmids
bestätigt.
3.13 Trunkierungen des pRS1-Gens
pEGFP-C1/pRS1(AS 1-364)
Das Plasmid pBS/pRS1 (Spangenberg,1993) diente als Ausgangsvektor zur Synthese des um
259 AS am C-Terminus verkürzten pRS1. Nach Restriktion mit Bgl II und BspH I konnte ein
1.1 kb pRS1 Gen-Fragment isoliert werden, welches mit Nco I / Hind III Adaptoren ligiert
wurde. Nach Restriktion des Ligationsproduktes mit Bgl II und Hind III konnte das pRS1Genfragment in den ebenso geschnittenen pEGFP-C1 Vektor (Clontech) ligiert werden. Das
GFP-pRS1 Fusionsprotein enthält die ersten 364 AS des pRS1.
pEGFP-C1/pRS1(AS 1-581)
Aus dem Plasmid pBS/pRS1D100% (Baumgarten, 1999) wurde das Gen des am C-Terminus
um 42 AS verkürzten pRS1 durch Restriktion mit Sac I und Kpn I gewonnen und in den
ebenso restringierten pEGFP-C1 ligiert. Das GFP-pRS1 Fusionsprodukt beinhaltet das 581 AS
lange pRS1.
pEGFP-C1/pRS1(AS 1-523)
Aus dem Plasmid pEGFP-C1/pRS1 (Baumgarten, 1999) wurde durch Xcm I und Sma I Verdau
ein C-terminales 0.3 kb Fragment entfernt. Nach Religation konnte ein GFP-pRS1 Protein
gewonnen werden, welchem am C-Terminus 100 AS fehlen.
17
Material und Methoden
pEGFP-C1/pRS1(AS 329-623)
Der Vektor pBS/pRS1 diente zur Herstellung eines N-terminal verkürzten pRS1, welchem die
ersten 328 AS fehlten. Dazu wurde nach Sau3A Restriktion ein 1.2 kb DNA-Fragment des
pRS1 Gens isoliert und mit pUCI9/Bam/CIP ligiert. pUCI9/RS1(AS 329-623) konnte nun mit
EcoR I und Sal I restringiert werden, wobei anschließend ein 1.2 kb Fragment isoliert werden
musste, welches in den ebenso geschnittenen pEGFP-C1 Vektor ligiert wurde.
Der Erfolg der Ligationen und die Erhaltung des Leserasters wurden durch Sequenzierung der
Plasmid-DNAs überprüft.
3.14 Expression des rekombinanten pRS1 in E.coli
Der E.coli Stamm BL21[DE3], der das Plasmid pET22b(+)pRS1 enthält, diente zur Expression
des rekombinanten pRS1, welches am C-Terminus 6 zusätzliche Histidinreste trägt (Valentin et
al., 2000). Eine Vorkultur (3.2.2) wurde in LB-Medium mit 100 µg Ampicillin pro ml über
Nacht angezogen. Vier 1000 ml Erlenmeierkolben mit Schikanen wurden mit der Vorkultur 1
zu 100 inokuliert. Bei Erreichen einer OD600 von 0.6 wurde Isopropyl-b-D-thiogalactosid
(IPTG) in einer Endkonzentration von 0.4 mM zugegeben. IPTG ist ein nicht metabolisierbares
Lactoseanalogon, welches die Synthese der T7-RNA-Polymerase unter der Kontrolle des lacPromotors aktiviert. Die T7-RNA-Polymerase transkribiert das pRS1 Gen, womit die
Proteinsynthese des rekombinanten RS1 eingeleitet werden konnte. Nach vier Stunden wurden
die Zellen abzentrifugiert (2.000 g, 10 min, 4°C) und zur Aufreinigung des rekombinanten
pRS1 eingesetzt (3.20).
3.15 RNA aus Zellkulturen
(Chomczynski et al., 1987)
RNA-Lösungen wurden stets mit Diethylpyrocarbonat (DEPC)-behandeltem Wasser angesetzt.
Durch die Behandlung von Wasser mit 1/1000 Vol DEPC bei 37°C für 16 h wurden eventuell
vorhandene RNAsen inaktiviert. Während der anschließenden Autoklavierung zersetzte sich
das restliche DEPC.
Zur Isolierung von mRNA musste zuerst Gesamt-RNA aus den Zellen gewonnen werden. Für
eine geplante Northern-Hybridisierung wurden mindestens 300 cm2 konfluent gewachsene
LLC-PK1-Zellen benötigt. Nach Abnahme des Nährmediums wurden die Zellen in 1 ml
18
Material und Methoden
Denaturierungslösung pro 107 Zellen gelöst. Die denaturierten Zellen wurden in ein Corex
Schraubgefäß überführt und mit einem 1/10 Volumen Natriumacetat (2 M, pH 4.0), plus 1
Volumen Phenol (wassergesättigt), plus 1/5 Volumen Chloroform/Isoamylalkohol (49:1, v/v)
ausgeschüttelt. Nach 15 min Inkubation auf Eis wurde zur Phasentrennung eine Zentrifugation
von 20 min bei 10.000 g und 4 °C (Sorvall, SS34, Bad Homburg) durchgeführt. Die wässrige
Phase (oben) enthielt die RNA und wurde nach Abnahme zur Präzipitation mit 1 Volumen
Isopropanol versetzt. Nach 16 h bei - 20°C konnte die ausgefallene RNA bei 4°C und 10000 g
nach 10 min als Sediment erhalten werden, welches in 1 ml Denaturierungslösung gelöst und
in ein 2 ml silanisiertes Eppendorf-Reaktionsgefäßen überführt wurde. Nach der Zugabe von 1
Volumen Isopropanol und 2 h bei –20°C konnte durch Zentrifugation (s.o) ein RNA-Pellet
erhalten werden. Die RNA wurde mit 75 %igem Ethanol (v/v) gewaschen und erneut 10 min
zentrifugiert (s.o.). Nach Abnahme des Überstandes und Trocknung des RNA-Pellets wurde
die RNA in DEPC-Wasser gelöst und bei –70 °C gelagert.
Denaturierungslsg.: 4 M Guanidiniumthiocyanat, 25 mM Na-Zitrat, 0.1 M b-Mercaptoethanol
(frisch zugegeben), 0.5 % N-Laurosylsarcosin, pH 7.0
3.16 Poly(A)+-RNA
Es wurde das Oligotex mRNA Midikit (700 42) der Firma Qiagen verwendet und das SpinColumn Protokoll des Herstellers zur Gewinnung von mRNA aus Gesamt-RNA (3.15) befolgt.
Das Oligotex-Produkt der Firma Qiagen besteht aus Polystyren-Latex Partikeln (1.1 µM
Durchmesser) mit einer dT30 Oligonukleotidoberfläche, welche die Poly(A)+Ketten der
mRNAs spezifisch bindet.
Nach Zugabe des Bindungs-Puffers und der Oligotexsuspension wurde 3 min bei 70°C
inkubiert, um die Sekundärstruktur der RNA aufzuheben. 10 min bei RT ermöglichten die
Hybridisierung der Poly(A)+Bereiche der mRNAs mit den Oligotex-Partikeln. Nach
Zentrifugation wurde der Überstand entfernt und die Oligotex-Partikel mit Wasch-Puffer
gevortext. Mit Hilfe einer durch Zentrifugation unterstützen Filtration konnte der Wasch-Puffer
entfernt werden. Nach einem zweiten Waschschritt mit Wasch-Puffer wurde die mRNA mit
Elutions-Puffer (70°C) eluiert. Die RNA Konzentration konnte photometrisch bestimmt
werden (3.8).
19
Material und Methoden
3.17 Gelelektrophorese von RNA
(Gründemann und Koepsell, 1994)
Um eine genaue Auftrennung der RNA-Moleküle nach ihrer Größe zu ermöglichen, musste die
Ausbildung von Sekundärstrukturen verhindert werden. Deshalb wurde die RNA-Probe mit 3
Volumen RNA-Denaturierungslösung versetzt und 1 h bei 50 °C inkubiert. Dabei wurden die
Guanidinreste mit Glyoxal so modifiziert, dass eine Renaturierung nicht mehr möglich war.
Zur Inhibierung von RNAse-Aktivitäten wurde dem BES-gepufferten Agarosegel (3.11) 1 mg
Jodacetat / ml zugefügt. Die Elektrophoresekammer wurde über Nacht mit einer H2O2-Lösung
(3 %, v/v) inkubiert, um eventuelle RNAsen zu inaktivieren. Die Auftrennung von je 5 µg
mRNA pro Spur erfolgte bei 6 V / cm in BES-Puffer.
Bei Verwendung der Gele für einen Northern-Blot (3.18) wurde dem Gel kein Ethidiumbromid
zugefügt. Der Mitlauf von 1.5 µg eines mit Ethidium-Bromid versetzten RNAGrößenstandards (GibcoBRL, Karlsruhe) ermöglichte, die Größe und Menge der RNA-Banden
abzuschätzen.
BES-Puffer: 10 mM BES, 100 µM EDTA, pH 6.7
RNA-Denaturierungslösung: BES-Puffer, 66.6 % (v / v) DMSO, 1.33 M deionisiertes Glyoxal,
3.18 Northern-Transfer
Beim Northern-Transfer wurde mRNA, die zuvor in einem Agarosegel aufgetrennt worden war
(3.17), auf eine Nylonmembran (Hybond-N, Amersham Buchler, Braunschweig) übertragen.
Nach der Elektrophorese wurde das Agarosegel 45 min auf einen Taumelschüttler in 10 x SSC
gewaschen. Die Überführung der RNA auf die Membran erfolgte nach dem Prinzip des
Kapillarblottings. Durch den aufsteigenden 2 x SSC Puffer wurde die RNA vom Gel auf die
Membran transferiert. Die Schichtung beim Blot war wie folgt:
----------Gewicht 500 g----------------------------------------------------------- Stapel aus ------------------- saugfähigem Papier---------------------------------------------3 Lagen
Whatman 3M Papier
--------------------------------------Membran von Parafilm umhüllt
--------------------------------------Agarose-Gel
---------------------------------------3 Lagen
Whatman 3M Papier
---------------------------------------Reservoir mit 2 x SSC
20
Material und Methoden
Der Transfer war nach 16 h beendet. Anschließend wurde die Blotmembran luftgetrocknet.
Eine Bestrahlung mit UV-Licht (Stratalinker, Stratagene, Lajolla, USA) führte zur kovalenten
Bindung der RNA an die Membran. Nach 2 h trockener Hitze bei 80°C zur Enfernung des
Glyoxals war die Membran für eine Northern-Hybridisierung (3.19) einsatzbereit.
20 x SSC: 3 M NaCl, 300 mM Natrium-Zitrat (pH 7.0)
3.19 Northern-Hybridisierung
Die Northern Hybridisierung diente zum Nachweis und Quantifizierung von spez. mRNAs.
Dazu wurden komplementäre DNA-Sequenzen, sogenannte DNA-Sonden, eingesetzt, die
zuvor radioaktiv markiert worden waren (3.9.4).
Vor der eigentlichen Hybridisierung mit den DNA-Sonden wurde eine Prähybridisierung der
Blotmembran mit Heringssperm-DNA für 4 h bei 42 °C durchgeführt, um eine Absättigung
unspezifischer Bindungsstellen auf der Blotmembran zu erreichen. Der Einsatz eines
Hybridisierungsofens ermöglichte eine exakte Temperierung und gleichmäßige Benetzung der
Membran mit der Hybridisierungslösung.
20 x SSPE: 3.6 M NaCl, 200 mM NaH2PO4, 20 mM EDTA, pH 8.0
50 x Denhard: 1 % (w/v) BSA, 1 % Ficoll, 1 % (w/v) Polyinylpyrrolidon
Prä-Hybridisierungslsg.: 5 x SSPE, 50 % Formamid, 5 x Denhardt, 0.5 % (w/v) SDS,
20 µg frisch denaturierte Heringssperma-DNA / ml
(5 min bei 95°C und anschließend auf Eis)
Anschließend wurde die jeweils gewünschte markierte DNA-Sonde (3.9.4) 5 min bei 95°C
denaturiert, auf Eis abgekühlt, anschließend der Prähyridisierungslösung zugefügt und weitere
16 h bei 42 °C inkubiert.
Folgende DNA-Sonden wurden verwendet:
-
Humane GPDH-Sonde: 1.1 kb Fragment (Clontech, Heidelberg)
-
pSGLT1-Sonde: Nukleotide 1546 – 1818 (Ohta et al., 1990)
-
pVasopressin Rezeptor-Sonde: Nukleotide 1 - 1494 (Gorboulev et al., 1993)
21
Material und Methoden
Waschen der Membran nach der Hybridisierung:
1) in 2 x SSPE / 0.1 % SDS, 15 min bei 42°C
2) in 1 x SSPE / 0.1 % SDS, 15 min bei 42°C
3) in 0.25 x SSPE / 0.1 % SDS, 15 min bei 50°C
Die gewaschene Membran wurde in Saran-Folie eingeschlagen und einem Röntgenfilm
aufgelegt. Je nach Signalintensität konnte nach wenigen Stunden bis einigen Tagen ein Signal
durch die markierte hybridisierte Sonde erzielt werden.
Mit Hilfe der Dehybridisierungslösung konnte nach 2 Waschschritten für je 1 h bei 65°C die
hybridisierte Sonde wieder abgewaschen werden, so dass die Blotmembran für eine weitere
Northern-Hybridisierungen zur Verfügung stand.
Dehybridisierungslösung: 5 mM Tris/HCl, 2 mM EDTA, 0.1 x Denhardt, pH 8.0
3.20 Aufreinigung des rekombinanten pRS1-Proteins
Die pelletierten E.coli Zellen (3.14) lagerten das überexprimierte rekombinanten pRS1 in Form
von „Inclusion bodies“ in den Zellen ab.
Die Bakterienzellen wurden in 100 ml Beschallungspuffer suspendiert und bei –70°C
eingefroren. Nach dem Auftauen wurde die Zellsuspension 5 min 400 Watt Ultraschall
(Labsonic 1510, Braun, Hanau) ausgesetzt, wodurch sich die Viskosität der Zellsuspension
deutlich reduzierte. Die ungelösten „Inclusion bodies“ wurden bei 10000 g für 10 min bei 4°C
sedimentiert. Nach Resuspension in 100 ml IB-Waschpuffer folgte ein weiterer
Zentrifugationsschritt mit 20000 g für 10 min bei 4°C. Die sedimentierten „Inclusion bodies“
konnten nun in 40 ml IB-Aufschlusspuffer 1 h bei RT gelöst werden. Ungelöste Proteine
wurden mit 25000g für 15 min bei 8°C abgetrennt.
Beschallungspuffer: 50 mM Natriumphosphat, 300 mM NaCl, pH 7.8
IB-Waschpuffer: 2 M Harnstoff, 0.1 Tris/HCl, pH 8.0
IB-Aufschlusspuffer: 8 M Harnstoff, 0.1 M b-Mercaptoethanol, 0.1 M Tris/HCl pH 8.0
22
Material und Methoden
Die sechs Histidinreste am C-Terminus des rekombinanten pRS1 ermöglichten die
Aufreinigung über eine Ni2+-NTA-Affinitätsmatrix (Qiagen, Hilden)
Abb. 3.1: Interaktion zwischen 6xHis Tag und Ni-NTA Rest (aus Qiagenhandbuch 1992)
10 ml der Ni2+-NTA-Agarose wurden mit Bindungspuffer äquilibriert und mit 40 mg Protein
der gelösten „Inclusion bodies“ 16 h bei 4°C auf einem Taumelschüttler inkubiert.
Die Nickelagarose wurde anschließend in eine Säule gegossen (Durchmesser 3 cm) und mit
200 ml Bindungspuffer gespült (1 ml/min). Nach Durchlauf von 10 ml Waschpuffer (0.1
ml/min) konnte das rekombinante pRS1 mit 30 ml Elutionspuffer (0.1 ml/min) eluiert werden.
Bindungspuffer: 3 M Harnstoff, 5 mM b-Mercaptoethanol, 0.1 M Tris/HCl, pH 8.0
Waschpuffer: Bindungspuffer plus 0.8 mM Imidazol
Elutionspuffer: Bindungspuffer plus 60 mM Imidazol
Die aufgefangenen 0.5 ml Fraktionen wurden auf ihren Proteingehalt anhand der Extinktion bei
280 nm analysiert. Fraktionen mit einer Extinktion größer als 0.5 wurden vereinigt und der
exakte Proteingehalt konnte mit einer Proteinbestimmung nach Lowry (3.25) festgestellt
werden.
Der Erfolg der Aufreinigung des rekombinanten pRS1 wurde abschließend im SDS-PAGE
überprüft (3.26/27).
3.21 Antigene
Es wurden Antiseren gegen das rekombinante pRS1 und gegen eine Peptidsequenz (AS 518 –
535) aus dem pSGLT1 gewonnen (Ohta et al., 1990).
23
Material und Methoden
Das aus E.coli gewonnene rekombinante pRS1 (3.20) konnte aufgrund seiner Größe direkt für
die Immunisierung eingesetzt werden.
Das Peptid aus dem pSGLT1 [EAPEETIEIEVPEEKKGC] (Synthese Prof. Palm, UniversitätWürzburg) wurde zur Steigerung der Immunogenität an Ovalbumin (Sigma) gekoppelt.
Für die Kopplung wurden 9 mg Ovalbumin (1 mg/ml) in 50 mM Natriumphosphatpuffer (pH
8.0) gelöst. Sehr langsam wurde 1 ml einer MBS-Lösung zugetropft, wobei keine Trübung
durch ausgefallenes Protein auftreten durfte. Die Lösung musste 30 min bei RT gerührt
werden. Mit einer Gelfiltration über Sephadex G 25 (PG 10, Biorad) konnte nicht reagiertes
MBS abgetrennt werden. Dabei wurde die Lösung in 50 mM Natriumphosphatpuffer (pH 6.0)
umgepuffert. Das Peptid (1 mg/ml) wurde zwischenzeitlich in PBS (pH 7.2–7.4) gelöst und mit
der Ovalbumin/MBS Lösung (unmittelbar vor dem Einsatz mit NAOH auf pH 7.5 eingestellt)
in gleichen Proteingewichtsanteilen gemischt. Nach 3 h bei RT war die Kopplung des Peptids
über MBS an Ovalbumin beendet (Hartow and Lane, Antibodies, 1988).
MBS-Lsg: m-Maleimidobenzoyl-N-Hydroxysuccimidester (M 8759, Sigma)
10 mg MBS/ml Dimethylformamid (DMF)
3.22 Gewinnung polyklonaler Antiseren
Für die Immunisierung wurden ca. 6 Monate alte Kaninchen eingesetzt, denen vor Beginn des
Immunisierungszyklus aus der Ohrarterie Blut zur Gewinnung von Präimmunseren
abgenommen wurde. Das Antigen (3.21) wurde in PBS gelöst und im Volumenverhältnis 4:1
mit PAO gründlich emulgiert. Bei der Erstimmunisierung wurde zusätzlich 100 µg Adjuvant
Peptid (Muramyldipeptid, Sigma A9519) eingesetzt. Bei der ersten Immunisierung wurden 500
µg und für die 3 nachfolgenden Immunisierungen im Abstand von 21 Tagen wurden jeweils
250 µg des Antigens benötigt. Die Injektionen erfolgten subskapulär. 7 bis 10 Tage nach der
letzten Boosterimmunisierung wurden dem Tier aus der Ohrarterie 20 ml Blut entnommen. Das
Blut wurde nach 3 h bei RT und 16 h bei 4°C zentrifugiert (10.000 g, 10 min, 4°C) und als
Überstand konnte das Antiserum erhalten werden. Das Serum wurde fraktioniert und gelagert
bei –70°C und –196°C.
PAO: 4 ml Poly Alpha Olefine, 0.9 ml Tween-81, 0.3 ml Tween-80
24
Material und Methoden
3.23 Titerbestimmung
Die Bestimmung diente zur Beurteilung der Reaktivität des Antiserums gegen das Antigen.
Die Verdünnung des Antiserums, bei der eine halbmaximale Reaktionsstärke im ELISA erzielt
werden konnte, wurde als Titer definiert.
1) Das Antigen (10 µg/ml) wurde in Natriumcarbonatpuffer (pH 9.5) gelöst und je 150 µl
pro Vertiefung wurden zur Beschichtung einer 96Loch-Mikrotiterplatte (NuncImmunoTM Plate, MaxiSorpTM Surface, Dänemark) für 16 h bei 4°C eingesetzt.
2) Nach Entfernung des Beschichtungspuffers wurde die Mikrotiter-Platte mit 0,5 %
BSA-Blockpuffer 2 h bei RT inkubiert.
3) Nun wurde die gesamte Platte drei mal für je 5 min in Waschpuffer inkubiert.
4) Eine Verdünnungsreihe des Serums in Blockpuffer wurde angelegt (empfehlenswert:
von 1:400 bis 1: 204.800) und je 100 µl pro Verteifung pipettiert. Inkubations:16 h bei
4°C.
5) Waschen (siehe Punkt 3)
6) Ziege-anti-Kaninchen–F(ab`)2-alkalische-Phosphatase-Konjugat
(Sigma,
A-3937)
wurde 1:250 im Blockpuffer verdünnt und davon je 100 µl pro Loch pipettiert.
Inkubation: 4 h bei RT
7) Waschen (siehe Punkt 3)
8) Pro Vertiefung wurden 100 µl Äquilibrierungspuffer benötigt. Inkubation: 5 min bei
RT
9) Der Äquilibrierungspuffer wurde durch je 100 µl Substratpuffer ersetzt.
10) Die Reaktion wurde durch die Zugabe von 100 µl EDTA-Lösung (100 mM, pH 8.0)
gestoppt.
Blockpuffer: 200 mM NaCl, 0.5 % BSA, 0.1% Natriumazid in PBS (pH 7.4)
Waschpuffer: 200 mM NaCl, 0.05 % Tween-20 in PBS (pH 7.4)
Substratpuffer: 100 mM NaCl, 5 mM MgCl2 (frisch zugeben), 100 mM Tris/HCl pH 9.8
1 mg/ml Sigma 104 Substrat (Para-Nitrophenylphosphat)
Mit dem ELISA-Reader (Multiskan Plus, Titertek) wurden die Extinktionswerte bei 405 nm
um die Extinktionen bei 450 nm korrigiert. Aus dem Abfall der Extinktionswerte bei Zunahme
der Verdünnungsstufe konnte der Titer des Serums bestimmt werden.
25
Material und Methoden
3.24 Affinitätsreinigung der Antiseren
Die Reinigung der Antiseren an ihrem Antigen ermöglichte die Selektion der gewünschten
Antikörper. Zwei unterschiedliche Verfahren wurden eingesetzt, die sich in der Präsentation
des Antigens unterschieden. Das rekombinante pRS1 wurde an der Oberfläche von PolystyrenMirotiterplatten immobilisiert, während die Peptide an Sepharose gekoppelt wurden.
Antikörper gegen das gesamte rekombinante pRS1:
1) Das rekombinante pRS1 (3.20) wurde in Natriumcarbonatpuffer (pH 9.5) [100 µg/ml]
gelöst und je 200 µl pro Vertiefung in Reihe 1, 5 und 9 einer 96Loch-Mikrotiterplatte
(Nunc-ImmunoTM Plate, MaxiSorpTM Surface, Dänemark) pipettiert. Inkubation: 16 h
bei 4°C
2) Nach dem Entleeren der Platte wurden alle Vertiefungen mit je 200 µl Block-Lösung
gefüllt. Inkubation: 1 h bei RT
3) 4 mal mit je 200 µl TBST-Puffer waschen
4) In Reihe 1, 5 und 9 werden pro Vertiefung 200 µl des 1:20 in Blocklösung verdünnten
Vollserums zugegeben. Inkubation: 2 h bei RT
5) Nach Entfernung der Serumlösung wurden die Reihen 1, 5 und 9 gewaschen (Punkt 3)
6) In Reihe 2, 6 und 10 wurden pro Vertiefung je 200 µl Shiftpuffer (pH 8.8) vorgelegt.
7) Für 3 min wurde pro Loch in Reihe 1, 5 und 9 je 200 µl Elutionspuffer (pH 2.5)
pipettiert und anschließend wurden die eluierten Antikörper im Elutionspuffer mit einer
Mehrkanalpipette schnell in die Reihe 2, 6 und 10 zur Neutralisierung des pH-Wertes
überführt.
8) Die Fraktionen wurden vereinigt, mit 0,02 % Thimerozal konserviert und bei 4°C
gelagert.
TBST-Puffer: 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 0.05 % (v/v) Tween-20, 50 mM Tris/HCl pH 8.0
Blocklösung: 0.5 % BSA in TBST-Puffer
Shiftpuffer: 50 % der Blocklösung und 50 % Tris/HCl pH 8.8
Elutionspuffer: 0.1 M Zitronensäure, 500 mM NaCl, 0.05 % Tween-20, pH 2.5
Die Affinitätsreinigung des anti-RS1 Serum in den Mikrotiterplatten verursachte einen ca.
70%igen Verlust im Vergleich zum Titer des Vollserums.
26
Material und Methoden
Peptid-Antikörper:
Antikörper gegen die Peptidsequenzen aus mSGLT1 [KDTIEIDTEAPQKKKGC] und
pSGLT1 (AS 518-535) wurden durch Affintätsreinigung an peptidgekoppelte Sepharose
gewonnen.
1) 200 mg Epoxy-Sepharose (E6754, Sigma) wurde 30 min in 20 ml PBS gequollen und
anschließend auf einer Glasfritte mit Wasser gewaschen.
2) Die Sepharose wurde in 5 ml 0,2 M Natriumcarbonat (pH 10.5) aufgenommen und 100
µg des Peptids wurden zugefügt. Inkubation: 16 h bei 37°C auf einer Schüttelmaschine
3) Durch die Zugabe von 10 ml 0,1 M Ethanolamin/HCl (pH 10.0) wurden die noch freien
Oxirangruppen abgesättigt. Inkubation: 16 h bei 37°C auf einer Schüttelmaschine
4) Die peptidgekoppelte Sepharose wurde nun mit Blockpuffer auf einer Glasfritte
gewaschen und in 4,5 ml Blockpuffer aufgenommen. Es folgte eine Zugabe von 450 µl
des Vollserums. Inkubation: 16 h bei 4°C auf einem Schüttler
5) Die gekoppelte Sepharose wurde in eine kleine Säule (z.B. mit Glaswolle gestopfte
Pasteurpipette) überführt und mit 50 ml PBS gewaschen.
6) Nach Zugabe von 2 ml Elutionspuffer (pH 2.5) wurde das Eluat in Fraktionen von ca.
200 µl aufgefangen, wobei das Eluat direkt in 160 µl Shiftpuffer (pH 8.8) tropfte.
Blockpuffer: 100 mM NaCl, 100 mM Tris/HCl pH 7.5, 1% BSA, 0.1 % (v/v) Tween-20
Shiftpuffer: ½ Vol Blocklösung und ½ Vol 1.5 M Tris/HCl, pH 8.8
Elutionspuffer: 100 mM NaCl, 100 mM Zitronensäure, pH 2.5
Die gewonnenen Fraktionen wurden im ELISA (3.23) auf ihren Gehalt an spezifischen
Antikörpern getestet. Der Titer verringerte sich im Vergleich zum Vollserum meist nur sehr
geringfügig.
3.25 Proteinbestimmung
Die Bestimmung der Proteinkonzentration einer Lösung erfolgte je nach Anforderung nach
Bradford
(1976)
oder
Lowry (1951).
Als
Verdünnungsreihe verwendet.
27
Vergleichsstandard
wurde
eine
BSA-
Material und Methoden
Bradford (1976):
Die Blaufärbung der Nachweislösung durch Proteine basiert auf der Reaktion des Coomasie
Brilliant Blue G-250 mit basischen und aromatischen Aminosäuren. Die Bestimmung der
Proteinkonzentration nach Bradford wurde aufgrund der einfachen Handhabung bevorzugt
eingesetzt.
100 µl der Proteinlösung (bis ~0,1 µg/µl) wurden mit 1000 µl Bradford-Reagenz (Biorad,
München) versetzt und 5 bis 30 min bei RT inkubiert. Anschließend wurde die Extinktion bei
595 nm gemessen und um den Extinktionswert des Leerwertes (Puffer-Lösung) korrigiert.
Lowry et al. (1951):
Die Entwicklung einer Gelbfärbung beim Proteinnachweis basiert auf der Biuret-Reaktion, bei
der Cu2+ unter alkalischen Bedingungen mit Peptidbindungen und Tyrosinresten komplexiert
und der anschließenden Reduktion eines Folin Phenol Reagenzes. Aufgrund der
Empfindlichkeit des Nachweises gegenüber vielen Puffersubstanzen wird zu Beginn eine
Proteinfällung durchgeführt.
1) Der Proteinlösung (50 µl) wurde 1 ml einer 10 % (w/v) Trichloracetatlösung (TCA)
zugegeben. Nach 30 min auf Eis konnte das ausgefallene Protein bei 10.000 g nach 10
min als Sediment erhalten werden.
2) Das Proteinsediment wurde in 100 µl 1M NaOH, 1% (w/v) SDS gelöst. Inkubation:
10 min bei 37°C
3) Zugabe von 1 ml Biuret-Reagenz [0,04 % (w/v) Na+-K+-Tartrat; 0,02% (w/v) CuSO4 in
2,5%igem (w/v) NaCO3]. Inkubation: 10 min bei RT
4) Zugabe von 100 µl Folin-Ciocalteu-Phenol-Lösung (Merck, Darmstadt) und mischen
5) Nach 30 min bei 37°C konnte die Extinktion der Probe bei 750 nm gemessen werden.
3.26 SDS-PAGE
(Laemmli, 1970)
Eine wichtige Vorraussetzung für die elektrophoretische Trennung von Proteinen nach ihrem
Molekulargewicht im Polyacrylamidgel (PAA-Gel) ist die Denaturierung und gleichmäßige
Solubilisierung der Proteine mit Sodiumdodecylsulfat (SDS).
28
Material und Methoden
Denaturierung der Proben:
Die Proben wurden im Volumenverhältnis 1:1 mit Probenpuffer (2x) bei 37°C für 45-60 min
inkubiert. Durch die Verwendung eines Phosphatpuffers anstelle eines Tris-Puffers konnte die
Gefahr einer Spaltung von Asp-Pro-Peptidbindungen während der Denaturierung unterbunden
werden (Kowit and Maloney, 1982)
Probenpuffer (2x): 0.5 M b-Mercaptoethanol, 2 % (w/v) SDS, 10 % (v/v) Glycerol,
0.001 % (w/v) Bromphenolblau, 0.1 M Natriumphosphat, pH 6.8
Die Reduktion der Proteine durch b-Mercaptoethanol konnte durch eine anschließende
Alkylierung irreversibel gemacht werden. Dazu wurde 1/10 Volumen einer Jodacetamidlösung
(20 % w/v) der Proteinprobe nach der Denaturierung im Probenpuffer (pH 8.0) zugefügt und
weitere 20 min bei 37°C inkubiert (Westermeier, 1997).
Elektrophorese:
Die Verwendung eines diskontinuierlichen Gelsystems mit einem Fokussierungs- (pH 6.8) und
einem Trenngel (pH 8.8) erlaubte eine optimale Trennschärfe der Proteine im PAA-Gel.
Es wurde eine vertikale Elektophorese-Kammer (Biometra) verwendet mit einer Gelgröße von
80 x 85 x 0,8 mm. Die Spannung für die Fokussierung betrug 80 V und für die Trennung
120 V.
Trenngel: 8 % PAA, 0.1 % (w/v) SDS, 375 mM Tris/HCl pH 8.8
Fokussierungsgel: 5 % PAA, 0.1 % (w/v) SDS, 125 mM Tris/HCl pH 6.8
Die Polymerisierung der Gele wurde durch die Zugabe von 50 µl Ammoniumpersulfat 10 %
(w/v) und 5 µl Tetramethylethylendiamin gestartet.
Elektrophoresepuffer: 24.8 mM Tris/HCl, 192 mM Glycin, 0.1 % (w/v) SDS
3.27 Silber-Färbung von PAA-Gelen
(Nesterenko et al., 1994)
Diese Schnellfärbe-Methode von Proteinen im PAA-Gel besitzt eine Proteinnachweisgrenze
von 0,02 µg pro Bande und kann in 30 min durchgeführt werden.
29
Material und Methoden
1) Fixierung:
60 ml 50%ige (w/v) Acetonlsg. + 1,5 ml TCA-Lsg. (50 % w/v)
+ 25 µl 37 %ige (w/v) Formaldehydlsg.
5 min
2) Spülen:
60 ml H2O
3 x 5 sec
3) Waschen:
60 ml H2O
5 min
4) Spülen:
60 ml H2O
3 x 5 sec
5 )Vorbehandlung:
6) Vorbehandlung:
60 ml 50%ige (w/v) Acetonlsg.
100 µl 10 %ige (w/v) Na2S203-Lsg. + 60 ml H2O
7) Spülen:
60 ml H2O
8) Imprägnieren:
5 min
1 min
3 x 5 sec
0,8 ml 20 %ige (w/v) Silbernitratlsg.
+ 0,6 ml 37 %ige (w/v) Formaldehydlsg.
ad 60 ml H2O
9) Spülen:
10) Entwickeln:
60 ml H2O
8 min
2 x 5 sec
1,2 g Na2CO2 + 25 µl 37 %ige (w/v) Formaldehydlsg.
ad 60 ml H2O
11) Stoppen:
60 ml 1%ige (v/v) Essigsäure
45– 60 sec
3 min
Das gefärbte PAA-Gel konnte getrocknet oder für 3 bis 6 Monate in Wasser gelagert werden.
3.28 Westernblot
Eine Detektion von bestimmten Proteinen mit Antiseren ist im PAA-Gel nicht direkt möglich.
Deshalb mussten die Proteine zuerst aus dem PAA-Gel elektrophoretisch auf eine
proteinbindene Membran übertragen werden.
Semi-dry Blot:
(Kyhse and Anderson,1984)
Es wurde eine horizontale Blot-Apparatur (Novablot, Pharmacia, Freiburg) mit zwei
Graphitplatten verwendet. Beim Anlegen einer Spannung wandern die Proteine in Richtung der
Anode und werden dabei von der Nitrozellulosemembran gebunden und immobilisiert. Die
Schichtung zwischen den Graphit-Elektroden war wie folgt:
Kathode (-)
Graphitplatte
3 Lagen Whatman Papier (3M)
PAA-Trenngel
Membran aus Nitrozellulose
3 Lagen Whatman Papier (3M)
Graphitplatte
Anode (+)
30
Material und Methoden
Die Blotmembran (Hybond ECL, Amersham, Freiburg) und die Whatman-Papiere wurden
zuvor in Transferpuffer (25 mM Tris, 192 mM Glycin, 10 % (v/v) Methanol, pH 8.3) getränkt,
um einen Stromfluss zu ermöglichen. Der Blot konnte bei einer konstanten Stromstärke von
1.3 mA/cm2 nach 120 min beendet werden.
Ponceau-S-Färbung:
(Salinovich and Montelaro, 1986)
Die Übertragung der Proteine vom PAA-Gel auf die Nitrozellulose-Membran konnte durch
eine Proteinfärbung kontrolliert und beurteilt werden.
Dazu wurde die Membran für 3 min in einer Ponceau-S-Lösung [1 % (w/v) Ponceau-S, 3 %
(v/v) TCA] geschwenkt. Anschließend konnte die Membran durch Waschen mit H2O bis zum
Erkennen der Proteinbanden entfärbt werden. Bei weiterem Waschen mit H2O wurden auch die
Proteinbanden auf der Membran wieder entfärbt.
Proteindetektion mit Antiseren:
Alle Inkubationsschritte wurden auf einem Rotationsschüttler durchgeführt.
1) Blockierung der Membran mit 2% (w/v) Magermilchpulver (Fluka) in TBST Puffer.
Inkubation: 1 h bei RT
2) Austausch der Blocklsg. gegen die 1. Antikörperlsg. in Blocklsg. Inkubation: 16 h, 4°C
3) Waschen der Membran in Blocklsg. Inkubation: 3 x 15 min bei RT
4) Der sek. Antikörper (Ziege anti-Kaninchen-IgG-POX-Konjugat, Sigma A-0545) wurde
1:5.000 in Blocklsg. verdünnt und mit der Blotmembran inkubiert: 1 h bei 4°C.
5) Waschen der Membran in Blocklsg. Inkubation: 3 x 15 min bei RT
6) Inkubation der Blotmembran mit 2 ml Enhanced chemoluminesscence-Reagenz
(Amersham) für 1 min bei RT
7) Nach dem Abtropfen der Membran wurde die Membran in Saran-Folie eingeschlagen
und einem Röntgenfilm aufgelegt (bis 30 min).
8) Entwicklung des Röntgenfilms
TBST-Puffer: 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 0.05 % (v/v) Tween-20, 50 mM Tris/HCl pH 8.0
31
Material und Methoden
3.29 Zellfraktionierung
Die Degradierung von Proteinen durch Proteasen während der Aufarbeitung konnte durch die
anfängliche Zugabe von Protease-Inhibitoren und die Durchführung bei 4°C bzw. Lagerung
auf Eis eingeschränkt werden.
Zur Inhibition von Proteasen:
Protease-Inhibitor Stammlsg.(100x): 5 µg/ml Aprotinin, 5 µg/ml Leupeptin, 1mM Benzamidin
und 100 mM Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF)-Lösung (100x)
Gewebe:
(Rickwood, 1984)
Die in flüssigem N2 schockgefrorenen Nieren von Mäuse wurden mit dem Mörser fein
zerrieben und in 1 ml Saccharose-Puffer (inklusive Protease-Inhibitormix und PMSF) pro 100
mg Gewebe aufgenommen und anschließend mit einem Potter homogenisiert.
Bei einer Zentrifugation (150 g, 10 min, 4°C) konnten die noch nicht homogenisierten Zellen
pelletiert werden. Aus dem Überstand konnten bei 2.000g für 10 min bei 4°C die Zellkerne und
Mitochondrien sedimentiert werden. Eine Zentrifugation mit 40.000 g für 60 min ergab im
Sediment eine mit Plasmamembranen angereicherte Fraktion.
Die erhaltenen Membranen wurden in einem angemessenen Volumen Saccharose-Puffer
suspendiert und bei –70°C gelagert.
Saccharose-Puffer: 280 mM Saccharose, 5 mM EGTA, 5 mM MgSO4, 20 mM Tris/HCl pH 7.5
Bürstensaummembranvesikel aus der Schweineniere:
(Koepsell und Seibicke, 1990)
Aus den längshalbierten Nieren wurden die Rinde und die äußere Schicht der Medulla
gewonnen und anschließend in 9 ml Homogenisierungspuffer pro g im Messerhomogenisator 5
min fein zerkleinert. Nach tropfenweiser Zugabe von 1M CaCl2-Lösung bis zu einer
Endkonzentration von 10 mM musste die Suspension 15 min inkubieren.
Bei 1.750 g für 12 min (4°C) wurden die Zelltrümmer sedimentiert und aus dem Überstand
konnten bei 8.000 g nach 12 min (4°C) die Zellmembranen pelletiert werden, die in 1/10 ihres
Ausgangsvolumen in Homogenisierungspuffer resuspendiert wurden. Nach wiederholter
Anhebung der Kalziumkonzentration auf 10 mM und 15 min Inkubation wurde zentrifugiert
32
Material und Methoden
(3.500 g, 12 min, 4°C). Der Überstand wurde zentrifugiert bei 20.000 g für 12 min (4°). Die
sedimentierten Membranen wurden in 1/100 des Ausgangsvolumen in Tra-Puffer
aufgenommen. Nach 20 min bei 48.000 g für 20 min (4°C) konnten die BürstensaummembranVesikel (BBM-V) als Sediment erhalten werden. Die BBM-Vesikel wurden in wenig TraPuffer suspendiert und in flüssigem Stickstoff schockgefroren.
Alle Puffer enthielten den Proteaseinhibitormix (1x) und 0,1 mM Diisopropylfluorphosphat
Homogenisierungspuffer: 10 mM Mannit, 2 mM Tris/HCl pH 7.1
Tra-Puffer: 10 mM Triethanolamin/HCl, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA,
10 % (v/v) Glycerol, pH 7.4
Bürstensaummembranvesikel aus dem Duodenum:
(Shirazi-Beechey et al., 1988)
Zur Isolierung von BBM-Vesikeln wurden 20 bis 30 cm des Darms (beginnend vom Magen
an) abgetrennt und in Ringerlösung (4°C) gewaschen. Nachdem der Darm der Länge nach
aufgetrennt worden war, wurde die Mucosa mit einem Objektträger abgeschabt und in
flüssigem Stickstoff eingefroren. Die schockgefrorene Mucosa wurde in 10 ml 100 mM
Mannitol, 1 mM HEPES, pH 7.1 pro g Mucosa in einem Messerhomogenisator für 30 sec
homogenisiert. Durch die tropfenweise Zugabe von 1 M MgCl2 wurde die MagnesiumKonzentration auf 10 mM eingestellt. Nach 10 min Rühren wurde für 15 min bei 3.000 g und
4°C zentrifugiert und aus dem Überstand wurden die Membranen sedimentiert bei 30.000 g für
30 min bei 4°C. Das Pellet wurde in 100 mM Manitol, 1 mM HEPES-Tris pH 7.4 suspendiert.
Nach erneuter Zentrifugation (s.o.) wurden die Bürstensaummembranvesikel pelletiert. Die
Vesikel wurden in 300 mM Mannitol, 1 mM MgSO4, 20 mM HEPES-Tris pH 7.4
homogenisiert, portioniert und in flüssigem Stickstoff schockgefroren.
Ringerlösung.: 146 mM NaCl, 5.4 mM CaCl2, 4 mM KCl
Alle
verwendeten
Puffer
enthielten
den
Proteaseinhibitormix
Diisopropylfluorphosphat (DFP)
33
(1x)
und 0.1 mM
Material und Methoden
Zellkultur:
(modifizierte Methode nach Salehzada et al., 1991)
Für die Zellfraktionierung wurden etwa 5 Schalen (15 cm Durchmesser) konfluent
gewachsener Zellkulturen verwendet.
1) Die Zellen wurden in der Kulturschale 2 mal mit PBS-Puffer (4°C) vorsichtig
überspült.
2) Nach Zugabe von 3 ml des Puffers A (4°C) [inklusive der Protease-Inhibitoren] pro
Schale (auf Eis) wurden die Zellen abgeschabt und die Zellsuspension musste für ca. 30
min im hypotonen Medium des Puffers A bei 4°C inkubieren.
3) Nach dem Schwellen wurden die Zellen 3 mal in flüssigem N2 eingefroren und wieder
aufgetaut.
4) Der Zellaufschluss wurde durch das wiederholte Scheren der Zellen beim Aufziehen
und Ausdrücken durch eine feine Injektionskanüle und ein abschließendes Pottern
beendete.
5) Nach Zentrifugation mit 1.200 g (5 min, 4°C) konnten im Sediment die Zellkerne
angereichert werden.
6) Das Zellkernsediment wurde in Puffer A mit 0.5 % (v/v) Igepal (früher als Nonidet
P-40 bezeichnet, Sigma) resuspendiert und 5 min auf Eis inkubiert. Nach dem
Verdünnen der Igepalkonzentration mit Puffer A auf 0.1 % (v/v) konnte durch einen
Zentrifugationsschritt mit 1.200 g (5 min, 4°C) eine angereicherte Fraktion von
gewaschenen Zellkernen als Pellet erhalten werden.
7) Der Überstand (Punkt 5) wurde erneut zentrifugiert bei 40.000 g (1 h, 4°C). Das
Sediment wurde zweimal mit Puffer A gewaschen (1.200 g) und abschließend konnte
mit 40.000 g eine angereicherte Fraktion von Plasmamembranen sedimentiert werden.
8) Der erste 40.000 g Überstand (Punkt 7) konnte durch eine Ultrazentrifugation bei
200.000 g (2 h, 4°C) in eine angereicherte Zytoplasmafraktion (Überstand) und eine
angereicherte Endomembranfraktion (Pellet) getrennt werden.
Puffer A: 10 mM Kaliumacetat, 15 mM Mg-Acetat, 1mM DTT, 20 mM HEPES pH 7.5
34
Material und Methoden
3.30 In vitro Phosphorylierung
Das rekombinante pRS1-Protein (3.20) wurde über Centricon-30 (Amicon) in Kinase-Puffer
umgepuffert, um den enthaltenen Harnstoff und b-Mercaptoethanol (vom NTA-Elutionspuffer)
zu entfernen und anschließend ca. 2 h bei 4°C inkubiert.
Kinase-Puffer: 50 mM Tris/HCL pH 6.8, 10 mM MgCl2, 1 mM EDTA, 1mM DTT
Phosphorylierung mit Proteinkinase A (PKA):
Der Phosphorylierungsansatz (200 µl) enthielt:
-
rekombinantes pRS1 bzw. dephosphoryliertes Casein (0,5 mg/ml)
-
PKA (40 µg/ml) [aus Rinderherz, Sigma]
-
50 µM ATP
-
30 µCi g-32P ATP (1000 Ci/ mmol)
-
10 µM cAMP
-
Kinase-Puffer
Die PKA wurde durch 10 µM cAMP aktiviert. Außerdem wurde eine Kontrollreaktion ohne
cAMP durchgeführt.
Phosphorylierung mit Proteinkinase C (PKC):
Der Phosphorylierungsansatz (200 µl) enthielt:
-
rekombinantes pRS1 bzw. Histon H1 (0.5 mg/ml)
-
PKC (0,175 Units) [aus Rattenhirn, Calbiochem]
-
50 µM ATP
-
30 µCi g-32P ATP (1000 Ci/mmol)
-
2 mM CaCl2
-
33.5 µg/ml Phosphatidylserin
-
Kinase-Puffer
Die PKC wurde durch die Zugabe von CaCl2 und Phosphatidylserin aktiviert. Als
Negativkontrolle wurde ein Ansatz ohne CaCl2 und Phosphatidylserin aber mit 150 µM EGTA
durchgeführt.
35
Material und Methoden
Die Phosphorylierungsreaktionen wurden jeweils nach 30 min bei 30°C im Wasserbad durch
die Zugabe von 0,075 Volumen einer 100 % (w/v) TCA-Lösung gestoppt und zur Fällung 30
min auf Eis inkubiert.
Das Proteinpellet (10.000 g, 3 min) wurde in SDS-PAGE Probenpuffer aufgenommen und 5
min bei 100°C denaturiert. Nach der Auftrennung im SDS-PAGE wurde das Gel getrocknet
und einem Röntgenfilm (Kodak, X-OMAT DS) exponiert.
3.31 Ubiquitin-Affinitätschromatographie
1) Die Zellen bzw. die BBM-Vesikel wurden in Lysispuffer (25 mM Tris/HCL pH 7.5,
100 mM NaCl, 1% (v/v) Igepal, 1 mM PMSF, 1x Proteaseinhibitormix) bei 4°C 15 min
solubilisiert und anschließend zentrifugiert ( 6.000 g, 10 min, 4°C).
2) Der Überstand wurde für 1 h mit äquilibrierten Anionenaustauscher DEAE52
(Whatman) bei 4°C auf einem Rotationsschüttler inkubiert.
3) Nach der Sedimentation des Anionenaustauschers (DEAE52) wurde der Überstand
entfernt und der Anionenaustauscher 3 mal mit 3 Vol Wasch-Puffer (25 mM Tris/HCl
pH 7.5, 100 mM NaCl) kurz inkubiert.
4) Der Anionenaustauscher wurde in Elutionspuffer (25 mM Tris/HCl, pH 7.5, 500 mM
KCl) suspendiert. Inkubation: 10 min 4°C
5) Nach dem Absetzen des Anionenaustauschers wurde der Überstand (DE52-Eluat) mit
Tris-Puffer (25 mM Tris/HCl, pH 7.5) im Volumenverhältnis 1:4 verdünnt und
anschließend mit äquilibrierter Ubiquitin-Agarose (Calbiochem) inkubiert: 2 h bei 4°C
auf einem Rotationsschüttler
6) Nach der Sedimentation der Ubiquitin-Agarose (4.000 g, 20 sec) konnte der Überstand
abgenommen werden. Die Agarose wurde anschließend 3 mal in 10 Vol Wasch-Puffer
(25 mM Tris/HCl, pH 7.5, 100 mM NaCl) suspendiert.
7) Die Elution von der Ubiquitin-Agarose erfolgte durch die Zugabe von LaemmliProben-Puffer (3.26). Denaturierung: 45-60 min bei 37°C
Zur Überprüfung der Spezifität der Interaktion mit der Ubiquitin-Agarose wurde dem
DEAE25-Eluat bei Schritt 5 lösliches bovines Ubiquitin (Sigma) in einer Endkonzentration
von 250 µM zugefügt.
36
Material und Methoden
3.32 Zellkultur
LLC-PK1- und HEK-Zellen wurden unter den gleichen Bedingungen kultiviert. Als
Nährmedium diente Dulbecco`s modified Eagle`s medium [DMEM, Sigma] mit 4 mM LGlutamin (Sigma), 10 % (v/v) fetales Rinderserum (FCS, Sigma, Deisenhofen) und 100 U
Penicillin/ml + 0,1 mg Streptomycin/ml. Das Medium wurde jeden 3. bzw. 4. Tag erneuert.
Die Zellen wuchsen bei 37°C in einer H2O gesättigten Atmosphäre mit 5 % (v/v) CO2.
3.32a Passage
Für eine schnelle Vermehrung wuchsen die Zellen bis zur Ausbildung eines zu 80 %
geschlossenen Monolayers und wurden dann auf neue Kulturschalen verteilt. Die adhärenten
HEK-Zellen ließen sich durch den leichten Druck des Pipettenstrahles vom Untergrund ablösen
und gleichzeitig beim pipettieren vereinzeln. Die LLC-PK1-Zellen lösten sich nach ca. 30 min
Wirkung einer EDTA-Lösung (Kimmich et. al., 1994) vom Schalenboden. Nach vorsichtiger
Suspension der Zellen mit einer Pipette wurden die Zellen sedimentiert (250 g, 10 min). Die
Zellen wurden dann in Nährmedium resuspendiert und etwa im Verhältnis 1 zu 4 zum
Ausgangsvolumen verdünnt.
EDTA-Lsg.: D-PBS (Sigma), 28 mM NaHCO3, 0.02% (w/v) EDTA, 10 mM HEPES pH 7.4
3.32b Kryokultur
Zur Sicherung und Langzeitlagerung von Zelllinien wurde eine subkonfluente Zellkultur
benötigt. Die abgelösten und sedimentierten Zellen (3.32a) wurden in einer Dichte von 106
Zellen pro ml Kryomedium resuspendiert und sofort bei –20°C eingefroren. Nach 16 bis 24 h
wurden die Zellen bei –70°C gelagert. Nach weiteren 24 h wurden die Zellen dann in –196°C
(Stickstoff) überführt.
Kryomedium: DMEM-Komplettmedium mit 20% (v/v) FCS und 10% (v/v) Dimethylsulfoxid
Bei
der
Wiederaktivierung
der
Zellen
musste die zellschädigende Wirkung des
Dimethysulfoxids (DMSO) möglichst gering gehalten werden. Deshalb wurde die Kryokultur
bei 37°C im Wasserbad rasch aufgetaut, dann in 5 Volumen DMEM-Komplettmedium
resuspendiert und sofort wieder sedimentiert (250 g, 10 min). Die Zellen wurden wiederum in
DMEM-Komplettmedium resuspendiert und in einer Kulturschale ausgesät. Nach dem
Anheften der Zellen (etwa 16 h) wurde der erste Medienwechsel vorgenommen, um die letzten
Spuren des DMSO zu entfernen.
37
Material und Methoden
3.33 In vivo Phosphorylierung
1) Die GFP-pRS1 stabil exprimierenden Zellen (Klon 4, Baumgarten 1999) erhielten nach
Erreichen der Konfluenz (Petrischale: 10 cm Durchmesser) für 16 h 1 mCi 32Phosphat.
2) Nach Abnahme und Entsorgung des radioaktiven Mediums wurden die Zellen 3 mal
mit 5 ml kaltem PBS vorsichtig überspült.
3) Die Zellen wurden in 3 ml Lysis-Puffer (HMC-Puffer plus 50 mM NaF, 1 % (v/v)
CHAPS, Proteasen-Inhibitor-Mix und 1mM PMSF) aufgenommen, gelöst und 20 min
auf Eis inkubiert.
4) Nach einer Zentrifugation bei 12.000 g für 5 min wurde der Überstand mit 100 µl einer
10 % Staphylococcus aureus Zelltrümmersuspension (Pansorbin Cells, Calbiochem,
Bad Soden) 30 min bei 4°C inkubiert.
5) Der Überstand einer Zentrifugation mit 18.000 g für 1 min wurde mit 5 µl des
polyklonalen anti-GFP Serums (IgG Fraction, 8363-1, Clontech, Heidelberg) versetzt
und 2 h bei 4°C inkubiert.
6) Nach Zugabe von 40 µl in HMC-Puffer äquilibrierte Protein A CL-4B Sepharose
(Pharmacia) wurde weiter für 16 h bei 4°C inkubiert.
7) Bei 1.000 g (1 min) wurde die Protein A Sepharose sedimentiert und anschließend 3
mal in 1 ml Lysispuffer gewaschen.
8) Nach Abnahme der Waschlösung wurde die Protein A Sepharose in 50 µl SDS-PAGE
Probenpuffer suspendiert und 45-60 min bei 37°C inkubiert.
9) Der Überstand einer Zentrifugation nach 18.000 g (1 min) wurde im SDS-PAGE
aufgetrennt und das getrocknete Polyacrylamid-Gel wurde autoradiographisch
analysiert.
HMC-Puffer: 100 mM HEPES, 30 mM Mannitol, 10 mM CaCl2, pH 7.4
3.34 Transfektionen von Zellen
Die Einschleusung von Fremd-DNA (3.12/13) in LLC-PK1 bzw. HEK Zellen diente der
Expression, Lokalisierung und Funktionsanalyse des RS1-Proteins.
3.34a Transiente Expression
Zu 290 µl serumfreiem DMEM wurden 9 µl FuGeneTM6 Transfektionsreagenz (Roche,
Mannheim)
gemischt
und
5
min
bei
RT
38
inkubiert.
Anschließend
wurde
die
Material und Methoden
Transfektionslösung vorsichtig zu 6 µg der DNA Lösung (ca. 1 µg/µl) pipettiert und 15 min
bei RT inkubiert. Direkt nach dem Austausch des Nährmediums von subkonfluenten Zellen (in
Petrischale mit 10 cm Durchmesser) konnte die Transfektionslösung zupipettiert werden. Nach
24 bis 48 h wurde die Expression überprüft.
3.34b Stabile Expression
Nach der Transfektion wurden durch den Einsatz eines Antibiotikums (G-418) die erfolgreich
transfizierten Zellen anhand der Resistenz (neoR-Gen: Aminoglycosid-Acetytransferase)
selektiert und später vereinzelt.
10 µl des Lipofektinamin-Reagenzes (GibcoBRL, Karlsruhe) wurden mit 230 µl serumfreien
DMEM gemischt. Gleichzeitig wurden 230 µl serumfreies DMEM mit 5 µg der Plasmid-DNA
versetzt. Beide Lösungen wurden nun vorsichtig zusammenpipettiert und 15 min bei RT
inkubiert. Dabei konnte sich der gewünschte Lipid-DNA-Komplex für die Fusion mit den
Zellen bilden. Nach dem Auffüllen mit serumfreiem DMEM auf 5 ml konnten die zu 50 %
konfluenten Zellen (Petrischalen-Durchmesser: 10 cm) mit der Lösung bedeckt werden.
a) Nach
16
h
im
Brutschrank
wurde
die
Transfektionslösung
durch
Komplettmedium ausgetauscht.
b) Nach 2 weiteren Tagen begann die Selektion durch den Einsatz von 0,2 g
Geneticin [G 418] (Calbiochem, Bad Soden) pro ml Komplettmedium.
c) Nach 8 weiteren Tagen wurde die Geneticinkonzentration auf 0,4 g/ml erhöht.
d) Nach weiteren 8 Tagen wurde die Geneticinkonzentration auf 0,8 g/ml erhöht.
e) Innerhalb der nächsten 2 bis 4 Wochen traten kleinere alleinstehende Zellinseln
auf, die einzeln isoliert und bei 0,6 g Geneticin /ml vermehrt wurden.
f) Die gewonnenen Zellklone wurden in Form von Kryokulturen (3.32b) gesichert.
3.35 Fluoreszenzmikroskopie
Die Fluoreszenzmikroskopie (Axiophot 2, Zeiss, Jena) wurde zur Lokalisierung der GFP-pRS1
Fusionsproteine und zur Analyse der Aufnahme des Endozytosefarbstoffes RH 414 eingesetzt.
Als Filmmaterial wurde ein SW-Film (Kodak, Tmax-400 professional) verwendet.
39
Material und Methoden
3.35a Grün fluoreszierendes Protein
Für die Fluoreszenzmikroskopie wurden die LLC-PK1 Zellen auf einen 8-Loch-Objektträger
passagiert und bei Erreichen einer 50%igen Konfluenz mit den pEGFP-pRS1 Vektoren (3.13)
transient transfiziert (3.34a).
24 bis 48 h nach der Transfektion wurde der Objektträger mit den Zellen kurz in PBS Puffer
geschwenkt und nach Auflegen eines Deckglases sofort betrachtet.
Zur Konservierung der Fluoreszenz wurden die Zellen zuvor für 20 min in 4 % (w/v) paraFormaldehyd in PBS (pH 7.0) bei RT inkubiert und anschließend mit PBS-Puffer gespült.
Nach dem Eindeckeln der Zellen mit Aquatex (Merck) konnten die Objektträger bei 4°C im
Dunklen gelagert werden.
3.35b RH 414
Der Endozytosefarbstoff RH 414 (Molecular Probes) wurde 1:1.000 in DMEM verdünnt und
diese Lösung wurde auf die LLC-PK1 Zellen pipettiert. Nach 20 min im Brutschrank wurde die
Färbelösung abgeschüttet und die Zellen wurden 5 mal für 5 min mit eisgekühltem PBS-Puffer
vorsichtig auf einem Taumelschüttler gewaschen bis die Waschlösung farblos blieb und die
Zellen nach mikroskopischer Kontrolle nicht weiter entfärbt werden konnten. Die Zellen
wurden anschließend sofort mikroskopiert und fotografiert.
3.35 AMG-Aufnahme von LLC-PK1 Zellen
(Kimmich et al., 1994)
Die SGLT1 Aktivität in den LLC-PK1 Zellen wurde anhand der Aufnahmeraten von aMethylglucose [AMG] bestimmt. Durch die kompetetive Hemmung des SGLT1 mit Phlorizin
konnte der Anteil des SGLT1 an der gesamten AMG-Aufnahme bestimmt werden.
Die LLC-PK1 Zellen wurden zu Beginn suspendiert, pelletiert (3.32a) und anschließend in
soviel PBS-Puffer aufgenommen, dass sich eine Proteinkonzentration von 5 bis 10 mg/ml
ergab. Aus dieser bei 37°C aufbewahrten Zellsuspension wurden Proben von je 50 µl für die
Transportmessungen entnommen. Die Substratlösung aus DPBS-Puffer enthielt die
gewünschte AMG-Konzentration einschließlich 1 µCi
14
C-AMG (Amersham)/ ml. Die
Reaktion wurde durch die Zugabe von 50 µl Zellsuspension zu 200 µl Substratlösung gestartet.
Parallel wurde ein Ansatz mit zusätzlich 100 µM Phlorizin (Sigma) durchgeführt. Nach 2.5
40
Material und Methoden
min bei 37°C im Schüttelwasserbad wurden 200 µl des Reaktionsansatzes entnommen und in 1
ml eiskaltem DPBS-Puffer mit 1 mM Phlorizin (Stopplösung) überführt. Nach der
Sedimentation der Zellen (8.000 g, 1 min) wurde der Überstand* entfernt und die Zellen in 1
ml Stopplösung gewaschen und wieder zentrifugiert. Das Zellsediment wurde auf einem
Rotationsschüttler 30 min in 100 µl 0.05 % (v/v) Triton-100 solubilisiert und anschließend mit
1 ml Szintillationsflüssigkeit (LumasafeTMPlus, Packard) gemischt.
Im Szintillationszähler (Packard, 1600CA, USA) konnte die Strahlung gegen einen Leerwert
aus Zellen mit 0 min Inkubationszeit gemessen werden.
*Als Referenzwert wurden 10 µl des Überstandes ebenfalls mit 100 µl 0.05 % (v/v) Triton100 und 1 ml Szintillationsflüssigkeit versetzt und im Szintillationszähler ausgewertet.
41
Ergebnisse
4. ERGEBNISSE
Der Ergebnisteil lässt sich in zwei Abschnitte gliedern. Der erste Teil beschäftigt sich mit der
Expression und Lokalisierung des pRS1-Proteins in verschiedenen Zellen. Eine wichtige
Vorraussetzung hierzu war die Verbesserung der bisher nur unbefriedigenden Signalstärke
des RS1 im Westernblot. Des weiteren wird die subzelluläre Verteilung des vollständigen
RS1-Proteins und verkürzter RS1-Proteine mit Hilfe von GFP-Fusionen betrachtet. Im
zweiten Abschnitt des Ergebnisteils werden Versuche zur funktionellen Seite des RS1
dargestellt. Hierzu wurde ein gefundenes Motiv (UBA-Domäne) untersucht und es wurden
die Auswirkungen der RS1-Überexpression beschrieben.
4.1 Nachweis von RS1 bei verschiedenen Zellen im Westernblot
Um das RS1-Protein untersuchen zu können, wurde ein spezifisches Antiserum gegen RS1
gebraucht. Dazu hatte Marc Valentin ein anti-RS1 Serum, welches gegen die gesamte
Sequenz des pRS1-Proteins (Serum 33IV) gerichtet ist, geschaffen (Valentin et al., 2000).
4.1.1 Optimierung der RS1-Detektion
Für den Nachweis des pRS1-Proteins mit dem anti-RS1 Serum 33 im Westernblot war eine
vorherige Reduktion des Proteins mit b-Mercaptoethanol unverzichtbar (Valentin, 1998). Um
die Reduktion irreversibel zu machen, wurden die Proteinproben zusätzlich mit Jodacetamid
behandelt, um eine Alkylierung der Cysteinreste zu erzielen. Die Abb. 4-1 zeigt einen
Westernblot, der mit dem Antiserum 33 gegen RS1 entwickelt wurde. Die beiden Spuren
unterschieden sich in der Vorbehandlung der Proteine.
A
B
MW
118k 85k Abb. 4-1 Verstärkung der Detektion des pRS1 im Westernblot
Im SDS-PAGE wurden je 10 µg BBM aus der Schweineniere aufgetrennt. Der Proteinprobe B wurde
nach der Denaturierung im Laemmli-Puffer zusätzlich noch Jodactamid zugefügt. Die Detektion im
Westernblot erfolgte mit affinitätsgereinigtem anti-RS1 Serum 33IV.
A: Proteinprobe ohne Jodacetamid; B: Vorbehandlung der Proteinprobe mit 100 mM Jodacetamid
Durch die Behandlung der Proteinprobe aus den Nieren-BBMs mit Jodacetamid wurde die
Empfindlichkeit beim Nachweis von pRS1 [Abb. 4-1] mit dem anti-RS1 Serum 33 erhöht.
42
Ergebnisse
4.1.2 Nachweis des RS1-Proteins in Dünndarmzellen vom Schwein
Nach Optimierung der Detektionsbedingungen für das pRS1-Protein (4.1.1) wurde die
Expression in den Zellen des Dünndarms überprüft [Abb. 4-2]. Das pRS1-Protein konnte
nämlich bisher nicht im Dünndarm nachgewiesen werden, obwohl die Transcription des pRS1
im Dünndarm vom Schwein und Kaninchen in Northernblots eindeutig gezeigt worden war
(Spangenberg et al., 1993, Reinhardt et al., 1998).
MW
Niere Darm Darm Leber
PM
BBM BBM PM
Muskel Hirn
PM
PM
120 kD –
87 kD –
64 kD –
52 kD –
38kD –
Abb. 4-2 Westernblot: Nachweis des pRS1-Proteins in der Niere und dem
Dünndarm vom Schwein
Die BBM-Vesikel konnten aus frischem Gewebe nach schrittweiser Zugabe von CaCl2 und
wiederholter Zentrifugation als 48.000 g Pellet gewonnen werden (siehe 3.29). Die Fraktionen der
angereicherten Plasmamembranen (PM) wurden nach differenzieller Zentrifugation als 40.000 g
Sediment erhalten (siehe 3.29). Die Proteinproben wurden im Laemmli-Puffer denaturiert und
anschließend mit Jodacetamid inkubiert. Nach SDS-PAGE und Transfer auf eine
Nitrozellulosemembran wurde für den Nachweis des pRS1-Proteins das affinitätsgereinigte anti-RS1
Serum 33IV eingesetzt.
Mit den BBM-Vesikeln der Niere konnte die stärkste Reaktion erzielt werden. Das pRS1Protein bildete eine Bande bei 100 kD im SDS-PAGE, obwohl sich nach Addition der
Aminosäuren in der Primärsequenz ein rechnerisches Molekulargewicht von 68 kD ergibt
(Valentin et al., 2000).
In den Proteinproben des Dünndarms konnte pRS1 ebenfalls detektiert werden. Die
Expression in den BBM-Vesikeln des Dünndarms war allerdings deutlich stärker war als in
der Fraktion der angereicherten Plasmamembranen. Zusätzlich war in den Proben des
Dünndarms eine gleichstarke Bande bei etwa 65 kD vorhanden, die ein Fragment des pRS1Proteins sein könnte. In den Membranproben der Leber, des Skelettmuskels und des
Großhirns war kein pRS1-Protein nachweisbar. Dieser Befund deckt sich mit der nur sehr
geringen Konzentration der pRS1-mRNA, die im Großhirn und der Leber im Northernblot
nachgewiesen werden konnte (Spangenberg et al., 1993; Reinhardt et al., 1999). Im
Skelettmuskel war RS1 nur mit einer RT-PCR nachweisbar (Reinhardt et al., 1999).
43
Ergebnisse
4.1.3 Nachweis von RS1 in Dünndarmzellen aus diabetischen Ratten
Im Westernblot [Abb. 4-3] wurde versucht, RS1 aus der Ratte (rRS1) in Dünndarm-BBMs
nachzuweisen. Die Membranen wurden von Prof. George Kellett (York, England) zur
Verfügung gestellt. Die Arbeitsgruppe von Prof. Kellett beschäftigt sich u.a. mit dem Einfluss
des Diabetes auf den SGLT1. Durch die Behandlung mit Streptozotozin können die
Symptome des Diabetes im Tierexperiment hervorgerufen werden. So ist bekannt, dass sich
die Menge des SGLT1-Proteins in Dünndarmzellen von streptozotozin-diabetischen Ratten
erhöht (Burant et al., 1993; Kurokawa et al. 1995). Deshalb wurden DünndarmBürstensaummembranen (BBM) aus streptozotozin-diabetischen Ratten auch auf eventuelle
Veränderungen ihres RS1-Gehaltes hin überprüft [Abb. 4-3].
MW
1 µg
2 µg
C ST C
3 µg
1 µg
ST C ST
2 µg
3 µg
C ST C ST C ST
182 kD –
115 kD –
84 kD62 kD –
51 kD –
38 kD –
anti-RS1
anti-SGLT1
Abb. 4-3 Westernblot: Einfluss von Streptozotozin auf Rattendünndarm-BBMs
Die BBM-Proteine wurden in Laemmli-Puffer denaturiert und im SDS-PAGE aufgetrennt. Der Blot
wurde mit affinitätsgereinigtem anti-RS1 Serum 33IV und affinitätsgereinigtem anti-SGLT1 Serum
187VI analysiert. C: Kontrolle aus unbehandelten Tieren; ST: Streptozotozin-diabetische Tiere
Der Ratten-RS1 (rRS1) konnte im Westernblot mit dem anti-RS1 Serum 33IV bei 100 kD mit
einer zusätzlichen etwas schwächeren Bande bei etwa 80 kD detektiert werden. Somit war das
rRS1-Protein auf der exakt gleichen Laufhöhe wie das pRS1-Protein nachzuweisen (nicht
abgebildet). Das RS1-Protein aus der Ratte ist bisher noch nicht kloniert worden, aber die
Erkennung durch das anti-RS1 Serum 33 deutet eine hohe Homologie zum pRS1-Protein an.
Die Heraufregulierung der rSGLT1-Proteine bei diabetischen Ratten konnte, wie schon von
anderen Arbeitsgruppen berichtet (s.o.), reproduziert werden. Das SGLT1-Protein bildet eine
breite Bande bei 70 kD. Während die rSGLT1-Konzentration im Dünndarm durch die
Streptozotozinbehandlung anstieg, reduzierte sich gleichzeitig die rRS1-Konzentration in den
BBMs. Somit verhielt sich beim Diabetes die Konzentrationsveränderung des rRS1-Proteins
umgekehrt zur Konzentrationsveränderung des rSGLT1-Proteins.
44
Ergebnisse
4.1.4 Nachweis von RS1 in Dünndarmzellen vom Schaf
Eine Kooperation mit Prof. Shirazi-Beechey (Aberystwyth, England) ergab die Möglichkeit,
das RS1-Protein auch in Dünndarmzellen vom Schaf (sRS1) nachzuweisen. sRS1 ist noch
nicht kloniert worden, aber die hohe Homologie der bisher bekannten RS1-Proteine aus
Schwein, Mensch, Kaninchen und Maus ließ auch für sRS1 eine Erkennung durch das antiRS1 Serum 33 vermuten. Das sRS1-Protein konnte im anti-RS1 Westernblot als Bande bei
100 kD erkannt werden [Abb. 4-4].
In der Arbeitsgruppe von Prof. Shirazi-Beechey wurden viele wichtige Erkenntnisse über den
Einfluss von Glucose auf die Expression des SGLT1-Proteins gewonnen. So wird die
Expression des Schaf-SGLT1 (sSGLT1) durch die Glucose-Konzentration im Darmlumen
stark reguliert. Nach dem Abstillen der Lämmer sinkt die Konzentration der sSGLT1-Proteine
in den Dünndarm-BBMs und kann beim adulten Tier erst durch die Reinfusion mit Glucose
wieder drastisch gesteigert werden (Shirazi-Beechey et al. 1991, Lescale-Myts et al., 1993).
Es stellte sich die Frage, ob auch die Konzentration des sRS1 in den Dünndarm-BBMs durch
Glucose beeinflusst wird.
Lamm Schaf Schaf
(Glucose
MW
173 kD –
Schwein
infundiert)
111 kD –
80 kD –
61 kD –
Abb. 4-4 Westernblot: Steigerung der RS1-Konzentration in Dünndarm-BBMs durch Glucose
Dünndarm-BBMs wurden aus Lämmern, die mit Milch ernährt wurden, aus adulten Schafen, die mit
Gras gefüttert wurden und aus adulten Schafen, die über eine Darm-Sonde mit Glucose versorgt
wurden, gewonnen. Je 20 µg der BBM-Proteine wurden in Laemmli-Puffer denaturiert und im SDSPAGE aufgetrennt. Der Blot wurde mit affinitätsgereinigtem anti-RS1 Serum 75I entwickelt.
Die Konzentrationen des sRS1-Proteins in den Dünndarm-BBMs waren deutlich verschieden
[Abb. 4-4]. Beim Lamm war das sRS1-Protein am stärksten exprimiert. Beim adulten Tier
war die Menge des sRS1-Proteins hingegen drastisch reduziert. Erst nach direkter GlucoseInfusion über eine Sonde in den Dünndarm konnte ein Anstieg der Expression des sRS1Proteins in den BBMs beobachtet werden. Somit veränderte sich die sRS1-Konzentration in
gleicher Weise wie die des sSGLT1-Proteins als Antwort auf die Versorgung mit Glucose.
45
Ergebnisse
4.1.5 Nachweis und subzelluläre Verteilung von RS1 in LLC-PK1-Zellen
Die LLC-PK1 Zellen sind eine Zelllinie, welche von Epithelzellen des proximalen
Nierentubulus aus dem Schwein stammen (Hull et al., 1976). Die mRNA des pRS1 in den
LLC-PK1 Zellen wurde schon 1993 nachgewiesen (Veyhl et al., 1993). Ebenso ist die
endogene Expression des SGLT1-Proteins in diesen Zellen bekannt (Moran et al., 1982),
welche komplex reguliert wird. Somit sind die LLC-PK1 Zellen ein gutes Modellsystem, um
die Wechselwirkung von RS1 mit SGLT1 zu untersuchen. Die Expression des SGLT1 setzt
erst mit der Ausdifferenzierung der Zellen ein, die durch Zell-Zellkontakte induziert wird und
somit erst im konfluenten Zustand von allen Zellen erreicht wird (Shioda et al., 1994).
Weiterhin wird die Expression des SGLT1 durch das Glucoseangebot beeinflusst. Bei
Erhöhung der Glucose-Konzentration von 5 auf 25 mM ist die Expression von SGLT1 stark
vermindert (Ohta et al., 1990). Deshalb wurden die Zellen bei 5 und 25 mM GlucoseKonzentration kultiviert und vor und nach Erreichen der Konfluenz mittels differenzieller
Zentrifugation subzellulär fraktioniert. Die gewonnenen Fraktionen wurden mit anti-RS1
Serum im Westernblot untersucht [Abb. 4-5].
Das vollständige pRS1 Protein (100 kD) konnte nur in den Fraktionen der angereicherten
Plasmamembranen detektiert werden. In den subkonfluenten Zellen (Spur 1 und 2) waren die
pRS1-Banden deutlich zu erkennen. Neben der 100 kD Bande war zusätzlich bei 63 kD ein
pRS1-Fragment in der Plasmamembranfraktion zu erkennen. Ein RS1-Fragment ähnlicher
Größe war auch bei der Detektion des pRS1 in Dünndarmzellen vorhanden [Abb. 4-2].
In der Fraktion der Plasmamembranen nach Konfluenz (Spur 3 und 4) konnte das pRS1
Protein nicht detektiert werden. In Westernblots mit höheren Proteinkonzentrationen (nicht
abgebildet) konnte das pRS1-Protein auch nach Konfluenz in der Plasmamembranfraktion
detektiert werden. Die Abb. 4-5 zeigt, dass die Glucose-Konzentration des Zellkulturmediums
keinen signifikanten Einfluss auf die pRS1-Menge in der Plasmamembranfraktion besitzt.
In den Fraktionen des Zytoplasmas (5 bis 8) und der Endomembranen (9 bis 12) war
unabhängig vom Differenzierungsgrad der Zellen und dem Glucosegehalt des Mediums kein
pRS1-Protein detektierbar.
In den Zellkernfraktionen hingegen wurde bei 40 kD ein Signal erhalten, welches bei den
subkonfluenten Zellen (13 und 14) wesentlich schwächer als bei den konfluenten Zellen (15
und 16) war. Somit verhielt sich das 40 kD-Signal vor und nach Konfluenz genau umgekehrt
zum Auftreten des pRS1-Protens in der Plasmamembranfraktion. Die Veränderung der
Glucose-Konzentration wirkte sich nicht auf das 40 kD-Zellkernsignal aus.
46
Ergebnisse
- Angereicherte Zellfraktionen Plasmamembr. Zytoplasma
subkon kon.
subkon. kon.
MW
L H L
1 2 3
H
4
L
5
H
6
L
7
Endomembran
subkon kon.
H L H L H
8 9 10 11 12
Zellkerne
subkon. kon.
L H L H
13 14 15 16
116 kD –
84 kD –
62 kD –
51 kD –
38 kD –
Abb. 4-5 Westernblot: RS1-Nachweis in fraktionierten LLC-PK1 Zellen
Die Zellen wurden in 5 und 25 mM Glucosemedium kultiviert und jeweils vor und nach Erreichen der
Konfluenz geerntet, homogenisiert und anschließen mittels differenzieller Zentrifugation fraktioniert.
Die Zellkernfraktion (1.200 g Sediment) wurde zusätzlich mit 0,5% Igepal gewaschen.Die gewonnenen
Zellfraktionen wurden in Laemmli-Puffer denaturiert, mit Jodacetamid alkyliert und im Westernblot
mit affinitätsgereinigtem anti-RS1 Serum 33IV untersucht.(Zellfraktionierung und Proteinbestimmung
in Zusammenarbeit mit K. Baumgarten). Die Bande bei 110 kD in Spur 3 war ein Artefakt und konnte
in anderen Blots (nicht abgebildet) mit Plasmamembranen differenzierter Zellen nicht beobachtetet
werden. L: 5 mM Glucose, H: 25 mM Glucose, subkon.: 50%ige Konfluenz, kon.: 5 Tage konfluent
Weil das RS1-Antiserum 33 gegen die gesamte pRS1-Sequenz gerichtet war (Valentin et al.,
2000), konnten verschiedene Bereiche vom pRS1 detektiert werden. Es fällt auf, dass das 63
kD große Fragment in der Plasmamembranfraktion mit dem 40 kD großen Zellkernsignal
rechnerisch wieder das vollständige pRS1 (100 kD) ergibt. Demnach hätte sich das RS1
Protein an der Plasmamembran in zwei Fragmente geteilt, wobei ein etwa 60 kD Fragment an
der Plasmamembran verbliebe und ein ca. 40 kD Fragment in den Zellkern wandert. Es kann
aber nicht ausgeschlossen werden, dass trotz der Affinitätsreinigung des RS1-Antiserums das
40 kD Signal im Zellkern die Folge einer Kreuzreaktion des Antiserums mit einem anderen
Protein war.
Um festzustellen, ob RS1 in den Zellkern wandern kann, wurde ein Fusionsprotein aus pRS1
und dem grün fluoreszierenden Protein (GFP) von Katharina Baumgarten hergestellt und in
LLC-PK1 Zellen stabil exprimiert (Baumgarten, 1999). Die subzelluläre Verteilung wurde
anschließend genauer in dieser Arbeit im Fluoreszenzmikroskop und im Westernblot
untersucht (4.2).
47
Ergebnisse
4.2 Lokalisierung des pRS1 mittels GFP-Fusion
Die Fusion des grün fluoreszierenden Proteins (GFP) an den N-Terminus von pRS1 (GFPpRS1) und Expression in LLC-PK1 Zellen ermöglichte eine fluoreszenzmikroskopische
subzelluläre Lokalisierung an lebenden Zellen [Abb. 4-6]. Durch Vergleich der subzellulären
Fluoreszenz mit Zellen, die nur GFP exprimieren, konnten Rückschlüsse über die Wirkung
von RS1 auf die subzelluläre Verteilung des GFP-RS1 gewonnen werden.
GFP (27 kD)
GFP-pRS1 (96 kD)
Abb. 4-6 Konfokale Laserscan–Mikroskopie: GFP und GFP-pRS1 stabil exprimierende
LLC-PK1-Zellen bei Blaulichtanregung
Die auf Deckgläschen gewachsenen Zellen waren stabil mit dem pEGFP-C1 oder mit pEGFP-C1pRS1 Vektor transfiziert (Baumgarten, 1999). Die Zellen wurden mit PBS gewaschen und auf einem
Objektträger aufgebracht. Unter Blaulichtanregung konnte die Verteilung der grünen Fluoreszenz der
GFP-Moleküle beobachtet werden (Aufnahme: Dr. R. Hock).
LLC-PK1 Zellen, die zur Kontrolle nur das GFP-Molekül exprimierten, fluoreszierten
gleichmäßig im Zyto- und Nukleoplasma [Abb. 4-6, linkes Bild]. In den Zellkernen blieben
die Nukleoli fluoreszenzfrei.
LLC-PK1 Zellen, die GFP-pRS1 exprimierten, fielen durch eine akkumulierte grüne
Fluoreszenz in den Zellkernen auf [Abb. 4-6, rechtes Bild]. Dabei zeigten die Nukleoli
ebenfalls keine Fluoreszenz. Bei den meisten Zellen fluoreszierte auch das Zytoplasma. Die
Intensität der Fluoreszenz im Zytoplasma war aber immer deutlich geringer als die in den
Zellkernen. Wegen der relativ starken zytoplasmatischen Expression des GFP-pRS1 konnte
an der Plasmamembran eine Fluoreszenz nicht eindeutig erkannt werden. Es war aber
festzustellen, dass nach längerer Konfluenz die zytoplasmatische Fluoreszenz zurückging.
Unter diesen Bedingungen konnte dann eine Fluoreszenz an der Plasmamembran erkannt
werden [Abb. 4-7]
48
Ergebnisse
A
B
Abb. 4-7: Mikroskopische Aufnahmen der stabil GFP-pRS1 exprimierenden LLC-PK1 Zellen
Die GFP-pRS1 stabil exprimierenden Zellen wuchsen auf Deckgläschen und wurden nach Waschen
mit PBS mit dem Fluoreszenzmikroskop betrachtet. Die Zellen befanden sich seit 14 Tagen im
konfluenten Zustand. A: Fluoreszenzbild bei Blaulichtanregung; B: Phasenkontrastaufnahme
Das GFP-pRS1-Fusionsprotein hat eine errechnete Molmasse von 96 kD und kann als intaktes
Protein nicht durch Diffusion in den Zellkern gelangen (Peters, 1986; Doye et al., 1997). Um
auszuschließen, dass die Fluoreszenz im Zellkern bei den GFP-pRS1 exprimierenden Zellen
auf passive Diffusion von GFP-pRS1-Spaltprodukte beruht, wurde in Westernblots
untersucht, ob GFP-pRS1 im Zellkern vollständig war. Dafür wurde die GFP und GFP-pRS1
exprimierenden Zellen fraktioniert und im Westernblot mit anti-GFP Serum analysiert
Der Westernblot mit den GFP exprimierenden Zellen [Abb. 4-8] zeigte, dass das GFPMolekül nur in der Zytosolfraktion zu finden war. Die detektierte Bande bei 30 kD entsprach
dem Molekulargewicht des GFPs von 27 kD. Obwohl im Fluoreszenzbild auch die Zellkerne
eine Fluoreszenz aufwiesen [Abb. 4-6], zeigte der anti-GFP Westernblot in den Zellkernen
kein GFP an. Dieser Befund war nicht verwunderlich, weil die Größe des GFPs mit 27 kD
deutlich unter 60 kD lag und somit das GFP frei in den Zellkern diffundieren konnte. Beim
Waschen der Zellkerne während der Zellkernpräparation wurde das GFP allerdings wieder
aus den Zellkernen gespült.
Bei den GFP-pRS1 Zellen [Abb. 4-8] konnte mit dem anti-GFP Serum bei 125 kD eine Bande
in der Zytoplasma-, Kern- und Plasmamembranfraktion detektiert werden, die zum erwarteten
Molekulargewicht des GFP-pRS1 Fusionsprodukt passte, welches sich aus dem im SDSPolyacrylamidgel bei 100 kD laufenden pRS1 und dem 27 kD großen GFP zusammensetzte.
Somit konnte gezeigt werden, dass das vollständige GFP-pRS1 für die Fluoreszenz in den
Zellkernen der GFP-pRS1 exprimierenden Zellen ursächlich war.
49
Ergebnisse
MW
Zyto.
EM
Kern PM
Zyto. EM
Kern PM
184 kD –
116 kD –
84 kD –
62 kD –
51 kD –
38 kD –
25 kD –
GFP
GFP-pRS1
Abb. 4-8 Westernblot: Zellfraktionen der GFP und GFP-pRS1 exprimierenden Zellen
Die LLC-PK1 Zellen wurden mittels differenzieller Zentrifugation fraktioniert. Die Zellkernfraktion
(1.200 g Sediment) wurde zusätzlich mit 0,5% Igepal gewaschen. Je 10 µg Protein der Fraktionen
wurden pro Spur aufgetragen. Der Westernblot wurde mit anti-GFP Serum (Clontech) analysiert.
Zyto:Zytoplasma, EM:Endomembranen, Kern:Zellkerne, PM: angereicherte Plasmamembranfraktion
In der Zytoplasmafraktion war zusätzlich ein ca. 52 kD großes Fragment enthalten. Weil sich
das GFP am N-Terminus des pRS1 befand, musste dieses Fragment folglich auch vom NTerminus des GFP-pRS1 Proteins stammen, denn der Westernblot war mit anti-GFP Serum
durchgeführt worden.
Der anti-GFP Westernblot in Abb. 4-8 verdeutlichte, dass das pRS1-Protein das GFP-Signal
in den Zellkern und an die Plasmamembran dirigieren konnte, während das alleinige GFP nur
im Zytosol zu finden war.
Um die Daten mit einem weiteren Antikörper zu untermauern, wurden die Zellfraktionen der
GFP-pRS1 Zellen im Westernblot auch mit anti-RS1 Serum entwickelt. Der Blot [Abb. 4-9]
enthielt wie der anti-GFP Blot [Abb. 4-8] je 10 µg Protein pro Spur. Die hohe Reaktivität des
anti-RS1 Serums 33 gegen das pRS1 Protein führten bei den GFP-pRS1 exprimierenden
Zellen zu sehr starken Reaktionen in den Fraktionen des Zytoplasmas, der Zellkerne und der
angereicherten Plasmamembranen. In der Fraktion der Endomembranen gab es im Vergleich
zu den anderen Zellfraktionen nur eine sehr schwache Reaktion. Somit konnten die
Ergebnisse zur subzellulären Verteilung des GFP-pRS1 nach Analyse mit dem anti-GFP
Serum [Abb. 4-8] bestätigt werden. Gleichzeitig bewies der anti-RS1 Blot die korrekte
Translation und Überexpression des pRS1-Proteinanteils am GFP-pRS1 Fusionsprotein.
50
Ergebnisse
Zyto. EM
Kern PM
MW
184 kD –
116 kD –
84 kD –
62 kD –
51 kD –
38 kD –
25 kD –
Abb. 4-9: Westernblot: Zellfraktionen der GFP-pRS1 stabil exprimierenden LLC-PK1 Zellen
Die Zellen wurden mittels differenzieller Zentrifugation fraktioniert. Die Zellkernfraktion (1.200 g
Sediment) wurde zusätzlich mit 0,5% Igepal gewaschen. Je 10 µg Protein der Fraktionen wurden pro
Spur aufgetragen. Der Westernblot wurde mit affinitätsgereinigtem anti-RS1 Serum 33IV analysiert.
Zyto:Zytoplasma, EM:Endomembranen, Kern: Zellkerne, PM: angereichertePlasmamembranfraktion
Das überexprimierte GFP-pRS1 Fusionsprodukt konnte in vollständiger Größe im Zellkern
entdeckt werden. Es musste deshalb noch geklärt werden, warum bei den nativen LLC-PK1
Zellen im Westernblot nur ein 40 kD Signal in der Zellkernfraktion detektiert werden konnte
[Abb. 4-5]. Um Hinweise für das mögliche Auftreten eines pRS1-Fragmentes im Zellkern zu
sammeln, wurde unter anderem untersucht, ob und welche trunkierten pRS1-Proteine in den
Zellkern gelangen können (4.3).
4.3 pRS1 Trunkierungen und GFP-Fusion
In der Aminosäuresequenz des pRS1 konnten keine „Nuclear localisation signals“ (NLS)
bestehend aus einer Anhäufung basischer Aminosäuren erkannt werden. Deshalb stellte sich
auch zusätzlich die Frage, welche Bereiche bzw. Domänen im pRS1-Protein den Kernimport
beeinflussen könnten. Auch um dieser Frage weiter nachzugehen, wurden verkürzte GFPpRS1 Varianten hergestellt. Mit diesen Konstrukten wurden LLC-PK1 Zellen transfiziert und
anschließend im Fluoreszenz- und zusätzlich im konfokalen Laserscan-Mikroskop untersucht.
Die Aufnahmen mit dem konfokalen Laserscan-Mikroskop sind am Ende des Kapitels in
Abb. 4-19 zusammengefasst worden
Um die transiente mit der stabilen Transfektion zu vergleichen, wurden zunächst die Zellen
transient mit dem pEGFP-C1 Vektor transfiziert. Bezüglich der Verteilung der Fluoreszenz
wurde im Fluoreszenzmikroskop kein Unterscheid im Vergleich zur stabilen Expression von
51
Ergebnisse
GFP festgestellt [Abb. 4-6]. Sowohl im Zytoplasma als auch in den Zellkernen konnte eine
gleichmäßig verteilte grüne Fluoreszenz erkannt werden [Abb. 4–10], wobei sich die
Fluoreszenz in den Zellkernen von der des Zytoplasmas in der Intensität nicht unterschied.
GFP (27 kD)
Abb. 4-10:Die Verteilung des grün fluoreszierenden Proteins GFP nach transienter Transfektion
Die LLC-PK1 Zellen wurden 24 h nach Transfektion mit pEGFP-C1 (Clontech) in PBS-Puffer
überführt und lebend bei Blaulichtanregung mit dem Fluoreszenzmikroskop betrachtet.
links: Fluoreszenzbild; rechts: Phasenkontrastaufnahme
Vor der Herstellung von verkürzten pRS1-Varianten wurde untersucht, ob die Verteilung
unterschiedlich ist, wenn GFP mit dem N-Terminus oder dem C-Terminus von pRS1
fusioniert wird [Abb. 4-11].
N`
C`
Abb. 4-11: Die GFP-Fusionsprodukte nach N- und C-terminaler Fusion mit dem pRS1 Protein
Das Fusionsprodukt 1 konnte nach Ligation des pRS1-Gens in den pEGFP-C1 Vektor (Clontech)
erhalten werden. Für das Fusionsprotein 2 ist der pEGFP-N3Vektor (Clontech) verwendet worden.
1: GFP-pRS1; 2: pRS1-GFP
Die subzelluläre Verteilung des GFP-pRS1 nach stabiler Expression wurde bereits oben
beschrieben (4.2). Das transient exprimierte GFP-pRS1 zeigte die gleiche Verteilung in der
Zelle wie das stabil exprimierte GFP-pRS1 und war im Zytoplasma und akkumuliert in den
Zellkernen zu erkennen [Abb. 4-12]. Bei Zellen mit einer schwachen Expression
fluoreszierten nur die Zellkerne, wie z.B. an der rechten unteren Zelle in Abb. 4-12 zu
erkennen ist.
52
Ergebnisse
GFP-pRS1(AS 1-623)
96 kD
Abb. 4-12: Die Verteilung des GFP-pRS1 nach transienter Transfektion
Die LLC-PK1 Zellen wurden 24 h nach Transfektion mit pEGFP-C1-pRS1 in PBS-Puffer überführt
und lebend bei Blaulichtanregung mit dem Fluoreszenzmikroskop betrachtet. links: Fluoreszenzbild;
rechts: Phasenkontrastaufnahme
Bei der transienten Expression des pRS1-GFPs, bei dem GFP an den C-Terminus von pRS1
fusioniert worden war, zeigte sich eine etwas andere Verteilung [Abb. 4-13]. In einigen Zellen
konnte zwar ebenfalls eine akkumulierte Kernlokalisierung beobachtet werden, aber in vielen
schwächer exprimierenden Zellen verteilte sich die grüne Fluoreszenz gleichmäßig zwischen
dem Zytoplasma und den Zellkernen [siehe auch Abb. 4-20].
pRS1(AS 1 – 623)-GFP
96 kD
Abb. 4-13: Die Verteilung des pRS1-GFPs nach transienter Transfektion
Die LLC-PK1 Zellen wurden 24 h nach Transfektion mit pEGFP-N3-pRS1 in PBS-Puffer überführt
und lebend bei Blaulichtanregung mit dem Fluoreszenzmikroskop betrachtet. links: Fluoreszenzbild;
rechts: Phasenkontrastaufnahme
Zusammenfassend kann man sagen, dass durch die Fusion von GFP an den C-Terminus des
pRS1 die Kernlokalisierung des pRS1 beeinflusst wurde. Da die Verteilung des pRS1-GFP
inhomogen war und wahrscheinlich zusätzlich von noch unbekannten Faktoren abhängig war,
wurde für die weiteren Untersuchungen zur subzellulären Verteilung die N-terminale Fusion
des GFPs für die folgenden verkürzten pRS1-Varianten gewählt.
53
Ergebnisse
Die in Abb.4-14 gezeigten Trunkierungen sollten Anhaltspunkte für den Einfluss der N- bzw.
der C-terminalen Hälfte des pRS1 auf die subzelluläre Verteilung liefern. Um eine passive
Diffusion der GFP-Fusionsproteine in den Nukleus zu verhindern, waren die Verkürzungen
des pRS1 waren so gewählt, dass die GFP-Fusionsproteine eine Größe von 60 kD nicht
unterschritten.
1
2
N´
C´
Abb. 4-14: GFP-Fusionen mit C- und N-terminal trunkierten pRS1-Proteinen
Die abgebildeten Fusionsproteine 1 und 2 konnten nach Ligation von zwei trunkierten pRS1-Genen
in den pEGFP-C1 Vektor (Clontech) erhalten werden. 1: GFP-pRS1(AS 1-364); 2: pRS1-GFP(AS
329-623). Das vollständige pRS1 mit 623 AS ist nach Fusion mit GFP 96 kD groß.
Nach der Entfernung von 259 Aminosäuren am C-Terminus des pRS1 konnte ein
gravierender Einfluss auf die intrazelluläre Verteilung festgestellt werden. Dieses Konstrukt
wurde nicht mehr im Zellkern angereichert [Abb. 4-15]. Außerdem war die Fluoreszenz im
Zytosol nicht mehr gleichmäßig verteilt, sondern erschien punktiert. Die konfokalen
Laserscan-Aufnahmen zeigten, dass die punktierte Fluoreszenz dieses Konstruktes
gleichmäßig über die gesamte Zelle verteilt war [Abb. 4-20]. Dabei fiel auf, dass sich die
Fluoreszenz im Bereich der Plasmamembran konzentrierte.
GFP-RS1 (AS 1-364)
67 kD
Abb. 4-15:Die Verteilung des GFP-pRS1 (AS 1-364) nach transienter Transfektion
Die LLC-PK1 Zellen wurden 24 h nach Transfektion mit pEGFP-C1-pRS1(AS 1-364) in PBS-Puffer
überführt und lebend bei Blaulichtanregung mit dem Fluoreszenzmikroskop betrachtet.
links: Fluoreszenzbild; rechts: Phasenkontrastaufnahme
54
Ergebnisse
Nach Trunkierung der ersten N-terminalen 328 Aminosäuren konnte die gleiche
fluoreszenzmikroskopische Verteilung wie beim vollständigen GFP-pRS1 beobachtet werden
[Abb. 4-16]. Im Zellkern war eine akkumulierte Fluoreszenz zu erkennen, wobei die Nukleoli
ebenfalls fluoreszenzfrei blieben und das Zytoplasma schwächer fluoreszierte als die
Zellkerne. Das bedeutete, dass die N-terminale Hälfte des pRS1 (AS 1-328) für den
Kernimport und die Verteilung im Zytosol vollständig entbehrlich war.
GFP-pRS1 (AS 329-623)
60 kD
Abb. 4-16:Verteilung des GFP-pRS1(AS 329-623) nach transienter Transfektion
Die LLC-PK1 Zellen wurden 24 h nach Transfektion mit pEGFP-C1-pRS1(AS 329-623) in PBS-Puffer
überführt und lebend bei Blaulichtanregung mit dem Fluoreszenzmikroskop betrachtet. links:
Fluoreszenzbild; rechts: Phasenkontrastaufnahme
Da die ersten Trunkierungsversuche nahe legten, dass die für die Kernlokalisierung
verantwortliche „Proteindomäne“ sich in der C-terminalen Hälfte befindet, wurden zwei
weitere Trunkierungen am C-Terminus von pRS1 hergestellt [Abb. 4-17].
1
2
N´
C´
Abb. 4-17: Die C-terminalen Trunkierungen am GFP-pRS1 Fusionsprotein
Die abgebildeten Fusionsproteine 1 und 2 konnten nach Ligation von zwei trunkierten pRS1-Gene in
den pEGFP-C1 Vektor (Clontech) erhalten werden. 1: GFP-pRS1 (AS 1-523); 2: pRS1-GFP (AS 1581). Das vollständige pRS1 mit 623 AS ist nach Fusion mit GFP 96 kD groß.
Ohne die 100 C-terminalen Aminosäuren des pRS1 blieben die Zellkerne weitgehend
fluoreszenzfrei [Abb. 4-18]. Im Zytoplasma konnte die kräftige Expression des GFP-pRS1
55
Ergebnisse
(AS 1-523) erkannt werden. Nur bei sehr wenigen Zellen (< 5 %) konnte auch im Zellkern
eine schwache Fluoreszenz erkannt werden.
GFP-pRS1 (AS 1–523)
85 kD
Abb. 4-18: Die Verteilung des GFP-pRS1(AS 1-523) nach transienter Transfektion
Die LLC-PK1 Zellen wurden 24 h nach Transfektion mit pEGFP-C1-pRS1(AS 329-623) in PBS-Puffer
überführt und lebend bei Blaulichtanregung mit dem Fluoreszenzmikroskop betrachtet.
links: Fluoreszenzbild; rechts: Phasenkontrastaufnahme
In Abb. 4-19 ist die Fluoreszenzverteilung nach Transfektion der LLC-PK1 Zellen mit GFPpRS1 (AS 1-582) dargestellt. Die Fluoreszenz verteilte sich auf das Zytoplasma und teilweise
auch auf die Zellkerne. Allerdings war wie beim dem pRS1-GFP Fusionsprodukt [Abb. 4-13]
die Kernfluoreszenz im Vergleich zum Zytosol weniger intensiv [siehe auch Abb. 4-20]. Eine
deutliche Akkumulation der Fluoreszenz im Zellkern wie beim vollständigem GFP-pRS1 (AS
1-623) [Abb. 4-12] oder beim N-trunkierten GFP-pRS1 (AS 329-623) [Abb. 4-16] war nicht
mehr feststellbar. Es waren Zellen mit schwacher Kern-Fluoreszenz (~30 %) und Zellen, die
nur im Zytoplasma grün fluoreszierten, vorhanden. Die Kernlokalisierung des GFP-pRS1 (AS
1- 582) war ohne die letzten 42 C-terminalen Aminosäuren deutlich eingeschränkt, aber nicht
vollständig aufgehoben worden.
GFP-RS1 (AS 1-581)
91 kD
Abb. 4-19: Die Verteilung des GFP-pRS1(AS 1-581) nach transienter Transfektion
Die LLC-PK1 Zellen wurden 24 h nach Transfektion mit pEGFP-C1-pRS1(AS 1-581) in PBS-Puffer
überführt und lebend bei Blaulichtanregung mit dem Fluoreszenzmikroskop betrachtet.
links: Fluoreszenzbild; rechts: Phasenkontrastaufnahme
56
Ergebnisse
In Abb. 4-19 sind die Fluoreszenzverteilungen der verschiedenen GFP-pRS1 Varianten bei
Betrachtung
mit
dem
konfokalen
Laserscan-Mikroskop
zum
besseren
Vergleich
nebeneinander abgebildet worden.
GFP-pRS1 (AS 1-623)
pRS1 (AS 1-623)-GFP
GFP-pRS1 (AS 329-623)
GFP-pRS1 (AS 1-523)
GFP-pRS1 (AS 1-364)
GFP-pRS1 (AS 1-581)
Abb. 4-20: Verteilung verschiedener pRS1-Varianten in LLC-PK1 Zellen nach GFP-Fusion
Die Zellen wurden 24 h nach Transfektion mit 4% [w/v] Paraformaldehyd in PBS-Puffer fixiert und
am konfokalen Laserscan-Mikroskop betrachtet. (Aufnahmen: Dr. R. Hock)
Zusammenfassend kann man sagen, dass der Kernimport durch die Verkürzung des pRS1 um
100 Aminosäuren am C-Terminus am stärksten behindert worden war. Die Trunkierung um
42 Aminosäure behinderte die Kernlokalisierung weniger deutlich und macht klar, dass die 42
C-terminalen Aminosäuren die Kernlokalisierung nicht alleine kontrollieren.
Bei allen Varianten war im Zytosol eine Fluoreszenz zu beobachten, wobei die N-terminale
Sequenz des pRS1 (AS 1-364) eine punktierte Fluoreszenz innerhalb der Zelle verursachte,
die an eine vesikuläre Verteilung erinnert.
4.4 Die UBA-Domäne im C-Terminus des pRS1-Proteins
Die Ergebnisse zur Lokalisierung trunkierter pRS1-Proteine (4.3) zeigten eine Bedeutung des
C-Terminus für die subzelluläre Verteilung des pRS1-Proteins auf. Die Analyse der RS1
Aminosäurensequenz mit SMART (Simple Modular Architecture Research Tool; V 3,0) des
57
Ergebnisse
EMBL Heidelberg, Deutschland (http://coot.embl-heidelberg.de/smart) ergab im C-Terminus
von AS 579 bis 616 eine deutlich sichtbare UBA-Domäne (Ubiquitin associated domain).
Dieses Motiv befindet sich in dem am höchsten konservierten Abschnitt der RS1-Proteine
(pRS1 AS 578-623; zu 94 % konserviert). Die UBA-Domäne ist ein Sequenzmotiv, welches
in verschiedenen Enzymen des Ubiquitinierungsweges, DNA-Reperaturproteinen und
wichtigen Proteinkinasen vorkommt (Hofmann and Bucher, 1996; Dieckmann et al., 1998).
Über die spezifische Funktion dieser Domäne ist bisher sehr wenig bekannt. Die UBADomäne scheint eine Proteininteraktionsdomäne zu sein. Für die UBA-Domäne des p62
Proteins, einem Phosphotyrosin-abhängigen Liganden des p561cK, konnte gezeigt werden,
dass die UBA-Domäne in diesem Protein eine nicht-kovalente Bindung in vitro mit Ubiquitin
ermöglicht (Ratna et al., 1996). Eine Affinitätschromatographie sollte klären, ob pRS1
ebenfalls tatsächlich in der Lage ist, Ubiquitin zu binden.
Als erstes wurde getestet, ob das in E.coli exprimierte rekombinante pRS1-Protein Ubiquitin
binden konnte. Nach der Reinigung des rekombinanten pRS1 unter denaturierenden
Bedingungen (3 M Harnstoff, 5 mM b-Mercaptoethanol) über Nickel-Agarose wurde das
rekombinante pRS1-Protein über Centricons-30 (Amicon Inc., Beverly, USA) in 25 mM
Tris/HCL pH 7.5, 100 mM NaCl umgepuffert, um die denaturierenden Reagenzien wie
Harnstoff und b-Mercaptoethanol zu entfernen. Das so umgepufferte rekombinante pRS1Protein wurde dann mit äquilibrierter Ubiquitin-Agarose (Calbiochem, Bad Soden) inkubiert.
Danach wurde die Ubiquitin-Agarose gründlich im gleichen Puffer gewaschen und
anschließend wurde eventuell gebundenes Protein mit Hilfe von SDS eluiert. Abb. 4-21 zeigt,
dass das rekombinante pRS1 nach Inkubation mit Ubiquitin-Agrose im Eluat gefunden wurde.
Wenn die Inkubation des rekombinanten pRS1 in Gegenwart von 250 µM löslichem
Ubiquitin durchgeführt wurde, so konnte im Eluat kein pRS1 gefunden werden.
0 µM
250 µM
Ubiquitin
Ubiquitin
ÜST ELUAT ÜST ELUAT
MW
94 kD 67 kD Abb.4-21 Silbergefärbtes PAA-Gel: Interaktion des rekombinanten pRS1 mit Ubiquitin-Agarose
9 µg rekombinantes pRS1 in 90 µl Tris-Puffer (100 mM NaCl, pH 7.5) wurde 2 h bei 4°C mit 25 µl
Ubiquitin-Agarose ohne und mit löslichem Ubiquitin inkubiert. Anschließend wurde die UbiquitinAgarose 3 mal mit 250 µl Tris-Puffer (100 mM NaCl, pH 7,4) gewaschen und in Laemmli-Puffer
denaturiert. (ÜST: Überstand)[2 mal reproduziert]
58
Ergebnisse
Um abzuschätzen, ob die Affinitätsreinigung des RS1 auf unspezifischen Proteininteraktionen
mit der Ubiquitin-Agarose beruhen konnte, wurde ein analoger Versuch mit Serumalbumin
vom Rind durchgeführt. Dabei konnte keine Interaktion des BSA mit der Ubiquitin-Agarose
erkannt werden [Daten nicht gezeigt].
Im nächstem Schritt wurde versucht, natives pRS1 aus einer LLC-PK1 Zelllinie, die pRS1
überexprimiert, mittels Ubiquitinaffinitätschromatographie anzureichern. Um die Interaktion
des pRS1 mit der Ubiquitin-Agarose zu begünstigen, wurde das Zellhomogenat zuvor mit
einem Anionenaustauscher (DEAE 52, Whatman) nach einer Methode von Ciechanover und
Mitarbeitern (1978) vom zellinternen Ubiquitin befreit. Dazu wurden die pRS1
überexprimierenden
LLC-PK1 Zellen mit 1 % Igepal lysiert und die Zellkerne und
Zelltrümmer durch eine niedertourige Zentrifugation entfernt. Das überstehende Lysat wurde
mit DEAE-Agarose bei pH 7,5 inkubiert. Nach gründlichem Waschen der DEAE Agarose
konnte mit 0.5 M KCl das ubiquitinfreie Zellhomogenat eluiert werden. Eine typische
Proteinbilanz bei der Deubiquitinierung mit DEAE 52 ist in Abb. 4-22 aufgeführt.
Volumen
[µl]
Protein
[µg]
Anteil
[%]
400
640
100
650
227
35
400
230
36
Zellhomogenat
DEAE 52
0.5 M KCL
ELUAT
DEAE 52
Überstand
Abb. 4-22:Proteinbilanz bei Auftrennung des LLC-PK1 -Zellhomogenates über DEAE 52
Das DEAE 52 Eluat wurde mit Puffer verdünnt, um die KCl-Konzentration zu senken und
anschließend mit Ubiquitin-Agarose inkubiert. Die interagierenden Proteine wurden mit
Laemmli-Puffer eluiert und im Westernblot mit anti-pRS1 Serum und im silbergefärbten
PAA-Gel analysiert. In der Spur 2 des anti-RS1 Westernblots [Abb. 4-23] war die deutliche
Expression des pRS1-Proteins im Zellhomogenat der pRS1 überexprimierenden Zellen als
Bande bei 100 kD zu erkennen. Nach der Inkubation mit Ubiquitin-Agarose konnte pRS1 im
Eluat
(Westernblot,
Spur
3)
wiederentdeckt
werden.
Im
parallel durchgeführten
silbergefärbtem PAA-Gel enthielt das Eluat der Ubiquitin-Agarose keine anfärbbaren
Proteinbanden mehr, was die erfolgreiche Abtrennung anderer Homogenatproteine und damit
die Anreicherung des pRS1 demonstriert.
59
Ergebnisse
MW
1
2
3
1
2
3
187 kD –
118 kD –
85 kD –
61 kD –
50 kD –
38 kD –
Westernblot
(anti-pRS1 Serum33IV)
Silberfärbung
Spur 1: BBM der Schweineniere; Positivkontrolle (30 µg)
Spur 2: Homogenat der pRS1 überexprimierenden LLC-PK1 Zellen (20 µg)
Spur 3: 10 µl Eluat der Ubiquitin-Agarose
Abb. 4-23: Analyse der Interaktion des pRS1 mit Ubiquitin-Agarose
Die pRS1 stabil überexprimierenden LLC-PK1 Zellen (Klon3) wurden lysiert in 25 mM Tris/HCL pH
7.5, 100 mM NaCl mit 1% [v/v] Igepal.. Die Zellkerne und unlysierte Zelltrümmer wurden
sedimentiert bei 1.200 g. 37 µg des Überstandes (Homogenat) wurde 1 h bei 4°C mit DEAE 52
inkubiert. Das 0.5 M KCL–Eluat wurde 1:4 mit Tris-Puffer (25 mM Tris/HCL pH 7.5, 100 mM NaCl )
verdünnt und mit 25 µl Ubiquitin-Agarose 2 h bei 4°C inkubiert. Im Überstand der Ubiquitin-Agarose
konnten 32 µg Protein erhalten werden. Nach 3 mal Waschen der Ubiquitin-Agarose mit Tris-Puffer
(25 mM Tris/HCL pH 7.5, 100 mM NaCl) erfolgte die Elution mit 20 µl Laemmli Puffer. Je 10 µl des
Elutes wurden im anti-RS1 Westernblot und im proteingefärbtem PAA-Gel analysiert.[2 mal
reproduziert]
In Anwesenheit von 30 µM löslichem Ubiquitin war die Interaktion des pRS1 aus den
überexprimierenden LLC-PK1 Zellen mit der Ubiquitin-Agarose sichtbar reduziert [Abb. 424]. Das Ergebnis zeigt, dass pRS1 Ubiquitin spezifisch bindet.
Ubiquitin [µM]
0
30
30
Abb. 4-24: Störung der Interaktion des pRS1 mit Ubi-Agarose durch lösliches Ubiquitin
Je 40 µg des verdünnten DEAE 52-Eluates [siehe auch Beschreibung Abb. 4.22] wurden mit je 25 µl
Ubiquitin-Agarose (Calbiochem) ohne (1x) und mit löslichem Ubiquitin (Sigma) in einer
Endkonzentration von 30 µM inkubiert (2x). Nach dem Waschen der Ubiquitin-Agarose mit TrisPuffer (25 mM Tris/HCL pH 7.5, 100 mM NaCl) erfolgte die Elution mit je 30 µl Laemmli-Puffer und
je 15 µl der Eluate wurden mit affinitätsgereinigtem anti-RS1 Serum 33IV im Westernblot analysiert.
60
Ergebnisse
Als nächstes wurde versucht, das pRS1-Protein aus Bürstensaummembranen (BBM) der
Schweineniere mittels Ubiquitin-Affinitätschromatographie anzureichern. Die Nieren-BBMs
stellen die reichste natürliche Quelle für natives pRS1-Protein dar. Die BBM-Vesikel wurden
in 1% [v/v] Igepal solubilisiert und über DEAE 52 vom internen Ubiquitin und vom Igepal
(Detergenz) befreit. Nach Inkubation mit Ubiquitin-Agarose wurde das Eluat im Westernblot
und silbergefärbtem Polyacrylamid-Gel analysiert. Nach der Silberfärbung des Polyacrylamid-Gels konnte im Eluat der Ubiquitin-Agarose eine Doppelbande angefärbt werden,
dessen obere Bande der exakten Laufhöhe des pRS1 bei 100 kD entsprach [Abb. 4-25,
Silbergel]. Im Westernblot mit anti-pRS1 Serum zeigte sich, dass es sich dabei um pRS1
handelte [Abb. 4-25, Westernblot].
MW
--Ubiquitin-Agarose -BBM Eluat Eluat Eluat Eluat
30 µg 20 µl 10 µl 5µl 2 µl
BBM Eluat
30 µg 0,5µl
187 kD –
118 kD –
85 kD –
61 kD –
50 kD –
38 kD –
26 kD –
Silbergefärbtes PAA
Westernblot
(anti-pRS1 33IV)
Abb. 4-25: Reinigung des pRS1-Proteins aus Schweinenieren-BBM-Vesikeln
Nieren-BBMs (7,2 mg Protein) wurden in 1% Igepal solubilisiert und mit DEAE 52 inkubiert. Nach
Elution mit 0.5 M KCL wurden 900 µl Eluat (2,7 mg Protein) 1:4 mit Tris-Puffer (25 mM Tris/HCl pH
7.5) verdünnt und mit 50 µl Ubiquitin-Agarose (Calbiochem) 2 h bei 4°C inkubiert. Die Elution
erfolgte mit 50 µl Laemmli-Puffer bei 37°C.
Um zu belegen, dass die Interaktion von pRS1 mit Ubiquitin über die C-terminale UBADomäne (AS 579-616) erfolgt, wurden weitere Affinitätsreinigungen mit vollständigem (AS
1-623) und C-terminal trunkiertem pRS1 (AS 1-512) durchgeführt. Bei diesen Versuchen
wurde pRS1 bzw. das trunkierte pRS1 transient in HEK-Zellen exprimiert. Der Erfolg der
Expression konnte im Westernblot mit anti-pRS1 Serum bestätigt werden [Abb. 4-26, Spur
H]. Das vollständige pRS1 des Zellhomogenats lief wie das pRS1 aus den Nieren-BBMs bei
100 kD, während das trunkierte pRS1 (111 AS weniger) bei etwa 80 kD im SDS PAA-Gel
lag.
61
Ergebnisse
Das pRS1-Protein wie auch das trunkierte pRS1-Protein konnten im Eluat des
Anionenaustauschers DEAE 52 detektiert werden [Abb. 4-26, Spur DE52]. Somit war die
Interaktion des trunkierten pRS1 (AS 1-512) mit dem Anionenaustauscher durch die Cterminale Trunkierung nicht beeinflusst worden Während das vollständige pRS1 mit der
Ubiquitin-Agarose interagierte und im Eluat auftauchte (Spur Ubi, links), war das trunkierte
pRS1-Protein im Eluat der Ubiquitin-Agarose nicht nachweisbar [Abb. 4-26, Spur Ubi,
rechts].
BBM H
ELUATE
20µg 10µg DE52 Ubi
BBM H ELUATE
20µg 10µg
DE52 Ubi
pRS1 (AS 1-623)
pRS1 (AS 1-512)
MW
173 kD –
111 kD –
80 kD –
61 kD –
49 kD –
36 kD –
25 kD –
Abb. 4-26 Westernblot: Aufhebung der Interaktion des pRS1 mit Ubiquitin-Agarose nach
Trunkierung des C-Terminus um 111 AS
HEK Zellen wurden mit pRC/CMV-pRS1 und pRC/CMV-pRS1(AS 1-512)-Vektoren transient
transfiziert und nach 48 h mit 1% [v/v] Igepal lysiert. Nach der Deubiquitinierung mit DEAE 52
wurde das Eluat mit Ubiquitin-Agarose inkubiert. BBM: Bürstensaummembran aus der
Schweineniere (Positivkontrolle); H: Zellhomogenat; DE52:Eluat des Anionenaustauschers; Ubi:
Eluat der Ubi-Agarose
Dieses Ergebnis legt nahe, dass der Verlust der UBA-Domäne (AS 579-616) die Ursache für
die fehlende Interaktion des trunkierten pRS1(AS 1-512)-Proteins mit der Ubiquitin-Agarose
bildet.
4.5 Herstellung und Charakterisierung einer Zelllinie, die pRS1 stabil überexprimiert
LLC-PK1 Zellen exprimieren das RS1-Protein (4.1.5) und wichtige Plasmamembrantransporter wie den Na+-D-Glucosekotransporter SGLT1. Leider ist die Menge des endogen
exprimierten RS1 sehr gering (Valentin et al., 2000), was die proteinchemische Untersuchung
des nativen RS1-Proteins erschwerte. Um die physiologische Rolle des pRS1 zu studieren und
natives pRS1-Protein zu gewinnen (4.4), wurden pRS1 stabil überexprimierende LLC-PK1
Zellen hergestellt. Nach Transfektion der LLC-PK1-Zellen mit dem pRc/CMV-pRS1 Vektor
wurden die transfizierten Zellen mit dem Antibiotikum Geneticin selektiert. Von den
resistenten Zellkolonien wurden pRS1 überexprimierende Zellklone [pRS1(+)]gewonnen.
62
Ergebnisse
4 Klone wurden auf die Überexpression des pRS1 im Westernblot hin überprüft.
In den Homogenaten der pRS1(+)-Klone 1, 2, 4 und 9 konnte das pRS1-Protein als Bande bei
100 kD detektiert werden [Abb. 4-27], während in den Kontrollzellen (pRc/CMV-Leervektor)
das pRS1-Protein im Homogenat nicht nachweisbar war.
BBM
Niere
(20µg)
pRS1(+)-Klone (5 µg) pRc/
pRc/CMV-pRS1
CMV
3
1
2
4
9
MW
118 kD –
85 kD –
61 kD –
50 kD –
Abb. 4-27 Westernblot: Überexpression von pRS1 in den LLC-PK1-Zellklonen 1, 2, 4 und 9
Je 5 µg der Zellhomogenate von verschiedenen pRc/CMV-pRS1(+)-Klonen und eines pRc/CMVKontroll-Klones 3 wurden im SDS-PAGE aufgetrennt und mit affinitätsgereinigtem anti-RS1
Serum33IV im Westernblot analysiert.
Von pRS1 anti-sense LLC-PK1–Zellen ist bekannt, dass bei Reduzierung der endogenen
Translation des pRS1-Proteins mittels einer anti-sense-Strategie die Zellen eine drastisch
erhöhte Aktivität des SGLT1 aufweisen (Korn, 1999). Um die physiologischen Auswirkungen
der pRS1-Überexpression auf die Aktivität des endogenen SGLT1 ebenfalls zu prüfen, wurde
die SGLT1-abhängige AMG-Aufnahme der pRS1(+)-Zellen gemessen [Abb. 4-28]. Die
Transportleistungen der pRS1(+)-Klone 1, 4 und 9 betrug nur durchschnittlich ca. 10 % der
Kontrollzellen. Der Transfektion mit dem pRc/CMV-Leervektor wirkte sich auf die AMGAufnahme im Vergleich zu den nativen LLC-PK1 Zellen nicht signifikant aus.
Phlorizin-hemmbare
AMG-Aufnahme [%]
LLC-PK1 1
2
4
9
pRc/CMV-Leervektor
(nativ)
---Rc/CMV-pRS1-Klone--Klon 3
Abb. 4-28: Reduktion der AMG-Aufnahme bei den pRS1(+)-LLC-PK1-Klonen
63
Ergebnisse
5 Tage nach Erreichen der Konfluenz (Medium 5mM Glucose) wurden die Zellen suspendiert und 2.5
min in 10 µM 14C-AMG-inkubiert. Aus den Werten der Aufnahmerate wurde der phlorizinhemmbare
Anteil (SGLT1 spezifisch) bestimmt. (Messung:Irina Schatz)
Mit dem pRS1(+)-Klon 2 wurde die Substratabhängigkeit der AMG-Aufnahme bestimmt, um
festzustellen, ob bei den überexprimierenden Zellen die Maximalgeschwindigkeit des
Transportes oder die Affinität verändert war.
Die Kinetik der AMG-Aufnahme des pRS1(+)-Klon 2 ergab nach der Michaelis-Menten
Gleichung einen Vmax-Wert von 166 pmol mg-1 min-1 und einen KM-Wert von 361 +/-72 µM
[Abb. 4-29]. Bei nativen LLC-PK1-Zellen konnte ein Vmax-Wert von 2030 +/- 50 pmol / mg
und ein KM -Wert von 790 +/-40 µM ermittelt werden (Korn, 1999). Damit erreichte die
maximale Transportrate des pRS1(+)-Klons 2 nur ca. 8 % der nativen LLC-PK1 Zellen
während der KM-Wert sich halbierte. Der geringe KM-Wert der Zelllinie 2 ist aller
Wahrscheinlichkeit nach eine Folge der verringerten Transportrate dieser Zellen. Denn bei der
AMG-Aufnahmemessung verändert sich das Membranpotential der Zellen in Abhängigkeit
vom Na+-Glucosekotransport. Da gezeigt worden ist, dass der KM-Wert mit ansteigendem
Membranpotential abnimmt (Kimmich et al., 1994), ist zu erwarten, dass in Zellen mit hohen
Transportraten auch höhere KM-Werte gemessen werden.
Phlorizin-hemmbare
AMG-Aufnahme
[nmol / mg x min]
AMG [mM]
Abb. 4-29: AMG-Substratkinetik des LLC-PK1-pRS1(+)-Klons 2
Nachdem die Zellen (5 mM Glucose Medium) 5 Tage konfluent waren, wurde die 14C-AMG-Aufnahme
nach 2,5 min mit suspendierten Zellen ermittelt. Die gemessenen Transportraten wurden um den nicht
mit Phlorizin hemmbaren Anteil korrigiert. (Messung:Irina Schatz)
Als nächstes sollte untersucht werden, ob die Verringerung des Vmax-Wertes auf einer
Reduktion des SGLT1 in der Plasmamembran beruhte. Im Westernblot [Abb. 4-30] konnte
das SGLT1-Protein bei den Kontrollzellen (pRc/CMV-Leervektor) als Bande bei 70 kD
64
Ergebnisse
detektiert werden. Bei den pRS1(+)Zellen (Klon 2 und 4) reichte die Expression des pSGLT1Proteins in der Plasmamembran für eine Detektion im Westernblot nicht aus.
pRcCMV pRc/CMV-pRS1
Klon 3
Klon 2 Klon 4
MW
80 kD –
61 kD –
Abb. 4-30 Westernblot: Reduktion des pSGLT1 in der Plasmamembran der pRS1(+)-Klone
Am 5. konfluenten Tag wurden die LLC-PK1 Zellen mittels differentieller Zentrifugation fraktioniert
und je 20 µg der Plasmamembranfraktionen (40.000 g Sediment) wurden im Westernblot mit
affinitätsgereinigtem anti-pSGLT1-Serum 63I analysiert.
Mit einem Northernblot sollte geklärt werden, ob die Erniedrigung der Proteinmenge des
pSGLT1 in der Plasmamembran nach Überexpression von pRS1 auf eine Verringerung der
SGLT1-mRNA beruhte. Hierzu wurde aus den pRS1(+)-Klonen 2 und 4 die Gesamt-RNA
und daraus die mRNA isoliert und im Northernblot mit einer spezifischen pSGLT1-cDNA
Sonden (Nukleotide 1546-1818) hybridisiert. Als Kontrolle für eine gleichmäßige Beladung
mit mRNA wurde der Blot auch mit einer Glycerinaldehydphosphat-Dehydrogenase (GPDH)cDNA Sonde (Clontech, Heidelberg) hybridisiert. Zusätzlich wurde der Blot auch mit einer
Vassopressin Rezeptor (V2R)-cDNA Sonde analysiert (Gorboulev et al., 1993), um die
Auswirkungen der Überexpression des pRS1-Proteins neben dem SGLT1 auch auf ein
weiteres Plasmamembranprotein des LLC-PK1 Zellen zu untersuchen [Abb. 4-31].
Die Hybridisierung mit der pSGLT1-Sonde führte im Northernblot zu Banden bei 3,9 und 2,2
kB, wie schon von Ohta und Mitarbeitern (1990) gezeigt wurde. In den Kontrollzellen mit
dem pRc/CMV-Leervektor konnte eine deutlich höhere Konzentration an SGLT1-mRNA als
in den pRS1(+)-Zellklonen 2 und 4 nachgewiesen werden. Die SGLT1-mRNA war in den
RS1(+)-Zellen kaum noch zu detektieren. Die Hybridisierung mit der GPDH-Sonde führte bei
allen Zellen zu einer gleichstarken Reaktion bei 1,3 kB, womit die gleichmäßige Beladung
des Blots mit mRNA gezeigt werden konnte. Als ein beispielhaftes weiteres Membranprotein
wurde die Hybridisierung mit einer V2R-Sonde gewählt, wobei sich keine signifikanten
Konzentrationsveränderungen der V2R-mRNA zeigten.
Während bei den pRS1 anti-sense LLC-PK1 Zellen eine drastische Erhöhung der SGLT1mRNA festgestellt werden konnte (Korn, 1999), hatte die Überexpression des pRS1 in den
65
Ergebnisse
LLC-PK1 Zellen eine genau gegenteilige Wirkung und führte zur deutlichen Reduzierung der
SGLT1-mRNA.
pRcCMV
kB
Klon 3
pRc/CMV-pRS1
Klon 2
Klon 4
3,9
2,2
1,3
1,5
Abb. 4-31 Autoradiographie: Reduzierung der SGLT1- mRNA nach Überexpression von pRS1
in LLC-PK1 Zellen
Nach 5 Tagen im konfluenten Zustand wurde die Gesamt-RNA aus den Zellen gefällt, um daraus die
mRNA zu gewinnen. Nach photometrischer Quantifizierung wurden je 5 µg der mRNAs im Agarosegel
aufgetrennt und auf eine Nylonmembran geblottet und mit SGLT1-, GlycerinaldehydphosphatDehydrogenase- (GPDH) und Vasopressin-Rezeptor (V2R)-cDNA Sonden hybridisiert.
Diese Daten zeigen, dass die Überexpression von RS1 in konfluenten LLC-PK1 Zellen zu
einer Erniedrigung der mRNA-Menge des Na+-D-Glucosekotransorters SGLT1 führt.
4.6 RS1 und Endocytose
Die Expression des hRS1 in Xenopus Oocyten führt zu einer Verringerung der
Oocytenoberfläche um annähernd 40 % (Valentin et al., 2000). Weil bei der Expression in
Xenopus
Oocyten
die
Transcription
keine
Rolle
spielt,
musste
dieser
Effekt
posttranscriptional verursacht worden sein. Eine mögliche Erklärung würden Veränderung der
endo- bzw. exozytotischen Vorgänge an der Plasmamembran liefern.
Bei der Analyse der RS1 AS-Sequenzen fiel ein konserviertes Di-Leucin Signal (pRS1: AS
366/67) auf, welches ein bekanntes Endozytose Motiv für z.B. den Insulin- und b-adrenergen
-Rezeptor darstellt (Haft et al., 1998). In einem orientierenden Versuch sollte getestet werden,
ob RS1 an endozytotischen Vorgängen beteiligt ist und die Aufnahme des hydrophoben
Farbstoffes RH 414 (Molecular Probes, Beaverton, OR) in LLC-PK1 Zellen bei
Überexpression von pRS1 verändert ist. Der rot fluoreszierende Farbstoff RH 414 besitzt
66
Ergebnisse
die Eigenschaft, sich in die Plasmamembranen einzulagern, ohne durch die Membran
diffundieren zu können. Weil RH414 nur durch Endozytose ins Zellinnere gelangen kann,
wird er häufig zum Nachweis der Endozytose eingesetzt (Niles and Malik, 1999).
Es fiel auf, dass die pRS1 überexprimierenden Zellen die stärksten Anfärbungen nach 20 min
Inkubation mit RH 414 zeigten [Abb. 4-32, rechts]. Deutlich konnte eine breite Rotfärbung im
Bereich der Zellperipherien erkannt werden, welche bei den Kontrollzellen mit dem
pRc/CMV-Leervektor (Mitte) und bei den pRS1 anti-sense Zellen (Korn, 1999) nicht
vorhanden war.
Auch innerhalb der Zellen und besonders im Bereich um die Zellkerne konnte eine vesikuläre
Verteilung des Farbstoffs erkannt werden, welche von den pRS1 antisense über die
pRC/CMV-Zellen zu den RS1(+)-Zellen ebenfalls zunahm.
pRS1 anti-sense (K8)
pRc/CMV (K3)
pRc/CMV-pRS1 (K2)
Abb. 4-32 Konfokales-Laserscan-Bild: Färbung mit dem Endozytose-Farbstoffs RH 414
Die stabil transfizierten LLC-PK1-Zellen wurden 20 min bei 37°C mit RH 414 in DMEM inkubiert.
Anschließend wurden die Zellen mit 4°C kaltem PBS-Puffer 5 mal für 5 min auf einem
Taumelschüttler gewaschen, um die Endozytose zu stoppen und den extrazellulären Farbstoff zu
entfernen. Danach wurden die Zellen sofort im Fluoreszenzmikroskop betrachtet.
Die Ergebnisse zu diesem Versuch deuten an, dass RS1 endozytotische Vorgänge an der
Plasmamembran fördert.
4.7 Phosphorylierung des pRS1-Proteins
Die bisher klonierten RS1-Proteine aus dem Schwein, Menschen, Kaninchen und Maus
weisen 2 konservierte Konsensussequenzen für eine Phosphorylierung durch die
Proteinkinase C (PKC) und 3 für die Caseinkinase II (CK II) auf (Baumgarten, 1999).
Daneben sind zusätzliche Konsensussequenzen für die Phosphorylierung durch die
Proteinkinase A (PKA) vorhanden.
67
Ergebnisse
Die Proteinphosphorylierung stellt eine bedeutende posttranslationale Modifikation dar, über
welche die Funktion des RS1-Proteins und dessen Translokationen innerhalb der Zelle
gesteuert werden könnte. Es war deshalb wichtig zu wissen, ob RS1 tatsächlich
phosphoryliert werden kann. Für die Untersuchung einer Phosphorylierung in vivo ist die
Aufreinigung des pRS1-Proteins z.B. durch eine Immunpräzipitation erforderlich. Weil mit
dem anti-RS1 Serum keine quantitative Präzipitation des RS1-Proteins gelang, wurden
Phosphorylierungsversuche mit dem rekombinanten in E.coli exprimierten RS1-Protein
durchgeführt.
Die cAMP-abhängige Proteinkinase A ist ein Proteinkomplex aus katalytischen und
regulatorischen Untereinheiten. Die Bindung von cAMP an die regulatorische Untereinheit
induziert eine Konformationsveränderung und Dissoziation des Kinase A Proteinkomplexes,
wodurch die katalytische Untereinheit aktiviert wird.
Abb. 4-33 zeigt die Ergebnisse zur Phosphorylierung des rekombinanten pRS1 und des als
Positivkontrolle eingesetzten dephosphorylierten Caseins durch die PKA. Im Versuch wurde
die PKA durch die Zugabe von cAMP aktiviert. Die autophosphorylierenden Eigenschaft der
PKA konnte anhand der autoradiographischen Signale der katalytischen und regulatorischen
Untereinheiten bei 38 und 49 kD erkannt werden. Nach Aktivierung der PKA durch cAMP
war eine deutliche Phosphorylierung des rekombinanten pRS1 zu beobachten. Das mit
32
P
phosphorylierte pRS1 Protein bildete eine autoradiographische Bande bei 100 kD. Ohne
cAMP war eine Phosphorylierung des rekombinanten pRS1 nicht zu erkennen.
pRS1 (2µg)
cAMP --
Casein (2 µg)
cAMP --
120 kD –
87 kD –
52 kD –
39 kD 26 kD –
15 kD –
9 kD Abb. 4-33 Autoradiographie: Phosphorylierung von RS1 und Casein durch Proteinkinase A
Rekombinantes pRS1 (rek. pRS1) und dephosphoryliertes Casein wurden bei 30°C 20 min mit
Proteinkinase A und y32P-ATP inkubiert. Nach Zugabe von cAMP wurde die PKA aktiviert. Die
Reaktion wurde durch die Zugabe von Trichloracetat gestoppt. Die auf Eis gefällten Proteine wurden
68
Ergebnisse
bei 10.000 g sedimentiert, in Laemmli-Puffer denaturiert und im SDS-PAGE aufgetrennt. Das Gel
wurde fixiert, vakuumgetrocknet und einem Röntgenfilm aufgelegt.
Als Positivkontrolle wurde dephosphoryliertes Casein eingesetzt. Nach cAMP-Aktivierung
konnte die Phosphorylierung des a,b und g Caseins ebenfalls beobachtete werden. Obwohl
Casein ein gängiges Testsubstrat für die PKA ist, konnte für Casein kein stärkeres
autoradiographisches Signal als für das rekombinante pRS1-Protein erzielt werden.
Der Versuch zeigte eindeutig, dass eine PKA-abhängige Phosphorylierung des rekombinanten
pRS1 in vitro möglich war.
Die Aktivität der Proteinkinase C (PKC) ist ebenfalls streng reguliert. Zur in vitro
Aktivierung der PKC war die Zugabe von Phosphatidylserin (PS) und CaCl2 notwendig. Mit
EGTA hingegen konnte die Aktivität der PKC gehemmt werden.
pRS1
(2µg)
Ca2+
PS
Histon H1
(2 µg)
EGTA Ca2+ EGTA
PS
MW
120 kD –
87 kD –
64 kD –
39 kD –
26 kD –
Abb. 4-34 Autoradiographie: Phosphorylierung von RS1 und Histon H1 durch Proteinkinase C
Rekombinantes pRS1 und Histon 1 wurden bei 30°C für 20 min mit Proteinkinase C und y32P-ATP
inkubiert. Durch die Zugabe von Phosphatidylserin (PS) und Ca2+ wurde die PKC aktiviert. Die
Reaktion wurde durch die Zugabe von TCA gestoppt. Nach 30 min Inkubation auf Eis wurden die
gefällten Proteine sedimentiert (10.000 g) und im SDS-PAGE aufgetrennt. Das Gel wurde fixiert,
vakuumgetrocknet und mit einem Röntgenfilm analysiert.
Die autophosphorylierenden Eigenschaft der Proteinkinase C (aus Rattenhirn enthält a, b1, b2
und g PKC-Isoformen, Calbiochem) war an den autoradiographischen Signalen bei 90 und 45
kD zu erkennen [Abb.4-34]. Nach Aktivierung der PKC mit Phosphatidylserin und CaCl2
konnte die Phosphorylierung des rekombinanten pRS1 (100 kD) und des Histons H1 [als
Positivkontrolle] (30 kD) beobachtet werden. Bei Zugabe von EGTA ohne Phosphatidylserin
und CaCl2 war eine wesentlich schwächere Phosphorylierung des rekombinanten pRS1 und
Histons H1 im Autoradiogramm festzustellen. Die Präzipitation der Proteine im Histon69
Ergebnisse
Phosphorylierungsansatz
war
nur
unvollständig,
wie
man
an
den
fehlenden
autoradiographischen Signalen des PKC erkennen konnte. Dieses änderte aber nichts an der
Aussage, dass eine PKC abhängige in vitro Phosphorylierung des rekombinanten pRS1
möglich war.
Abb. 4-35 zeigt einen Versuch, bei welchem eine in vitro Phosphorylierung des
rekombinanten pRS1 durch Caseinkinase II (CaK II, Human, Rekombinant, aus E.coli,
Calbiochem) überprüft wurde. Die CaK II ist ein Tetramer (a2b2) aus zwei a (44 kD) und
zwei b (26 kD) Untereinheiten.
MW
pRS1
(1 µg)
pRS1
(1µg)
+CK II
220 kD –
96 kD –
66 kD –
45 kD –
30 kD –
21 kD –
Abb. 4-35 Autoradiographie: Phosphorylierung des RS1 durch Caseinkinase II
Rekombinantes pRS1 (rek.pRS1) alleine und rek.pRS1 gemeinsam mit Caseinkinase II (CaK II)
wurden bei 30°C für 20 min in Anwesenheit von y32P-ATP inkubiert. Die Reaktion wurde durch die
Zugabe Laemmli-Puffer gestoppt und im SDS-PAGE aufgetrennt. Das Gel wurde fixiert,
vakuumgetrocknet und mit einem Röntgenfilm analysiert.
Das rekombinante pRS1 wurde durch die CaK II erfolgreich phosphoryliert und bildete bei
100 kD eine Bande [Abb. 4-35,
rechte Spur]. Wie es auch schon bei den
Phosphorylierungsansätzen mit der PKA und PKC gesehen worden war, konnte auch für die
CaK II eine Autophosphorylierung ihrer Untereinheiten (44 und 26 kD) festgestellt werden.
Als Kontrolle auch für die bisherigen in vitro Phosphorylierungen wurde das rekombinante
RS1 alleine mit y32P-ATP ohne die Anwesenheit einer Kinase inkubiert. Dabei wurde kein
autoradiographisches Signal und damit keine autophosphorylierende Eigenschaft des
rekombinanten
pRS1
erkannt
[Abb.
4-35,
linke
Spur].
Das
bewies,
dass
die
autoradiographischen Signale des rekombinanten pRS1 nur die Folge einer Wechselwirkung
mit der PKA, PKC und CK II sein konnten.
70
Ergebnisse
In Zusammenarbeit mit Dr. Christoph Weber (Institut für Strahlenkunde, Würzburg, AK Prof.
Rapp, SFB 471) wurde ein eventueller Zusammenhang des RS1 mit dem MAP-KinasenSignalweg untersucht. Das rekombinante pRS1 wurde als potentielles Substrat der Raf-Kinase
und der MEK-Kinase in vitro getestet. Die aktive Raf-Kinase phosphoryliert die MEK-Kinase
an zwei Serinresten, was zur Aktivierung der MEK-Kinase führt (Avruch et al., 1994). Im
Versuch wurde überprüft, ob RS1 durch die Raf- oder die aktivierte MEK-Kinase
phosphoryliert werden kann [Abb. 4-36].
RafRafRafKinase Kinase Kinase
+RS1 +MEK +MEK
+RS1
MW
220 kD –
96 kD –
66 kD –
45 kD –
30 kD –
Abb. 4-36 Autoradiographie: Test von RS1 als Substrat der Raf- und MEK-Kinase
Rek. pRS1 wurde mit der Raf-Kinase (links) und der Raf-aktivierten-MEK-Kinase (rechts) bei 30°C für
20 min in Anwesenheit von y32P-ATP inkubiert. Die Reaktion wurde durch die Zugabe Laemmli-Puffer
gestoppt und im SDS-PAGE aufgetrennt. Das Gel wurde fixiert, vakuumgetrocknet und einem
Röntgenfilm exponiert.
Das rekombinante pRS1 wurde von der aktiven Raf-Kinase nicht phosphoryliert, wie man an
dem fehlenden autoradiographischen Signal erkennen kann [Abb. 4-36, linke Spur]. Die
Aktivität der Raf-Kinase konnte durch die erfolgreiche Phosphorylierung von MEK (47 kD)
demonstriert werden [Abb. 4-36, Mitte]. Aber auch die phosphorylierte und damit aktive
MEK phosphorylierte RS1 nicht (Spur 3).
Der Versuch der in vitro Phosphorylierung des rekombinanten pRS1 mit MEK und der RafKinase, für welche in der RS1 AS-Sequenz keine potentiellen Phosphorylierungssequenzen
enthalten sind, zeigte, dass eine Phosphorylierung des rekombinanten pRS1 nicht durch jede
Serin/Threonin-Kinase erfolgen konnte.
71
Diskussion
5. DISKUSSION
Der Diskussionsteil beginnt mit den Ergebnissen zum Vorkommen des RS1-Proteins in
verschiedenen Zellen und Zellkompartimenten wie Plasmamembran, Zellkern und
Zytoplasma. Anschließend konzentriert sich die Diskussion auf die Besonderheiten des
konservierten C-Terminus der RS1-Proteine (UBA-Domäne). Nach Abhandlung dieser mehr
allgemeinen Charakteristika des RS1 werden die möglichen Funktionen des RS1-Proteins
unter Einbezug der subzellulären Verteilung erörtert. Hierbei eröffnet sich die Vorstellung
von RS1 als Signalmolekül zwischen Plasmamembran und Zellkern. Abschließend werden
die gesammelten Daten in einem hypothetischen Modell zusammengefasst, welches viele
Ansätze für weitere prüfende Experimente zum RS1 liefert.
5.1 pRS1-Detektion im Westernblot
Für den Nachweis des pRS1-Proteins im Westernblot mit dem anti-RS1 Serum 33 ist es
wichtig, dass die Proteine bei der Denaturierung für den SDS-PAGE mit b-Mercaptoethanol
bzw. Dithiothreitol reduziert werden (Valentin et al., 2000). Dieser Hinweis wurde für die
Optimierung der RS1-Detektion im Westernblot aufgegriffen und dahin weiter entwickelt,
dass die Reduktion durch eine Alkylierung beständig blieb. Die Erhöhung der
Empfindlichkeit beim RS1-Nachweis im Westernblot ist aller Wahrscheinlichkeit auf die
Konformation der reduzierten pRS1-Proteine zurückzuführen. Es ist vorstellbar, dass die
Zugänglichkeit von internen Epitopen für das anti-RS1 Serum 33IV, welches gegen die
gesamte RS1-Sequenz gerichtet ist, dabei begünstigt wird. Ob bei der Alkylierung die
Reoxidation einer endogenen Disulfidbrücke, oder von unspezifischen und eventuell
vorhandenen intermolekularen Disulfidbrücken verhindert wird, bleibt unbekannt. Zwar sind
in den bekannten RS1-Proteinen aus dem Schwein, Menschen, Kaninchen und der Maus 3
konservierte Cysteine enthalten [Abb. 5-1], die sogar das Vorhandensein einer
intramolekularen konservierten Disulfidbrücke vorstellbar machen, allerdings spricht die
intrazelluläre Orientierung des RS1-Proteins und damit die reduzierenden Bedingungen im
Zytosol gegen die Ausbildung einer internen Disulfidbrücke.
Abb. 5-1: Homologievergleich der RS1 Proteine aus Schwein, Mensch, Kaninchen und Maus
Rot: identische AS Grün: ähnliche AS
72
Diskussion
5.2 RS1 an der Plasmamembran
RS1 wurde als Plasmamembranprotein entdeckt (Veyhl et al., 1993) und seine Assoziation
mit der Innenseite der Plasmamembran war durch Biotin-Markierungsexperimente an
Xenopus Oocyten von Mark Valentin (1998) gezeigt worden. Das native pRS1-Protein kann
am stärksten in den BBM-Vesikeln aus der Niere nachgewiesen werden. Auch bei den Zellen
aus dem Dünndarm zeigte sich, dass das RS1-Protein in den BBM-Vesikeln stärker als in der
Fraktion der angereicherten Plasmamembranen exprimiert ist [Abb. 4-2]. Aufgrund bisher
fehlender
geeigneter
RS1-Antikörper
bzw.
deren
fehlender
Optimierung
für
die
Immunhistochemie konnte die Lokalisierung an der Plasmamembran mikroskopisch noch
nicht demonstriert werden. Erst nach Expression eines GFP-pRS1 Fusionsproteins in LLCPK1 Zellen war eine fluoreszenzmikroskopische Lokalisierung an der Plasmamembran zu
erkennen [Abb. 4-7]. Der dazugehörige Westernblot mit anti-GFP Serum zeigte eindeutig,
dass das RS1-Protein für die Detektion des GFP-pRS1-Proteins in der Plasmamembranfraktion verantwortlich ist [Abb. 4-8].
Über die Art der Interaktion des RS1-Proteins mit der Plasmamembran ist noch nichts
bekannt. Es ist eher unwahrscheinlich, dass RS1 über das Endoplasmatische Retikulum (ER)
und den Golgi-Apparat an die Plasmamembran gelangt, da keine N-terminale Signalsequenz
in der RS1-Amminosäuresequenz für einen Eintritt ins ER enthalten ist. Alternativ könnte
RS1 aus dem Zytoplasma an die Zellmembran gelangt sein. Für eine Interaktion mit der
Plasmamembran ist dann die Wechselwirkung mit einem anderen Membranprotein oder die
kovalente Anheftung einer Fettsäure wie Myristin- oder Palmitinsäure vorstellbar. In der ASSequenz befindet sich von AS 24 bis 29 eine konservierte potentielle N-Myristylierungsstelle.
Für eine erfolgreiche Myristilierung des RS1-Proteins stören allerdings die ersten 23 AS.
Denn für den Transfer müsste der N-Terminus des Glycin (AS 24) zur Ausbildung einer
Amidbindung mit der Myristinsäure frei sein. Somit wäre eine Myristilierung erst nach
Abspaltung der 23 N-terminalen AS möglich.
Bei Analyse der RS1-Proteine in den BBM-Fraktionen aus Dünndarm-Epithelzellen von
Ratte, Schaf und in den angereicherten Plasmamembranfraktionen der LLC-PK1 Zellen fiel
auf,
dass
Faktoren
wie
Diabetes,
Glucosekonzentration
im
Darmlumen
und
Zelldifferenzierungsgrad die Menge des RS1-Proteins an der Plasmamembran beeinflussen
[Abb. 4-3, -4 und -5]. Bei einem vergleichenden Blick auf die Menge der SGLT1-Proteine in
der Plasmamembran war kein einheitliches Verhalten feststellbar, denn es konnte sowohl eine
ähnliche Wirkung, wie im Fall der Glucosewirkung im Schafsmodell, als auch ein reziprokes
Auftreten von RS1 und SGLT1, wie beim Diabetes der Ratte oder Einfluss der
73
Diskussion
Zelldifferenzierung bei den LLC-PK1 Zellen, beobachtet werden. Somit scheint auch die
Vorstellung einer alleinigen Interaktion des RS1-Proteins mit der Plasmamembran über das
SGLT-Molekül eher unwahrscheinlich.
5.3 RS1 im Zellkern
Die ersten Hinweise, dass RS1 auch ein Protein des Zellkerns sein könnte, wurde bei
Expression des Kaninchen-RS1 (rbRS1) in Xenopus Oocyten erhalten. 24 h nach Injektion der
rbRS1-cRNA konnte Katharina Baumgarten in den Zellkernen ein 67 kD Fragment des
rbRS1-Proteins entdecken (1999). Hingegen blieb das vollständige rbRS1-Protein in den
Zellkernen nicht nachweisbar. Auch bei den nativen LLC-PK1 Zellen konnte das vollständige
pRS1-Protein nicht in den Zellkernen gefunden werden, aber es war ein 40 kD Signal mit dem
affinitätsgereinigtem anti-RS1 Serum in der Zellkernfraktion detektierbar [Abb. 4-5].
Kontrollen zeigten, dass das 40 kD Signal nicht vom sekundären Antikörper stammte.
Trotzdem kann nicht vollständig ausgeschlossen werden, dass das Kernsignal die Folge einer
Kreuzreaktion mit einem anderen Kernprotein war, denn es muss berücksichtigt werden, dass
das verwendete anti-RS1 Serum gegen die gesamte Sequenz des RS1 gerichtet war und dass
so vielleicht auch Proteine mit ähnlichen Sequenzen bzw. Domänen (z.B. UBA Domäne
anderer Kernproteine wie RAD23) ebenfalls mit detektiert wurden.
Die Kernlokalisierung des pRS1 war letztlich eindeutig nach Fusion mit GFP und
anschließender Untersuchung im Westernblot und Fluoreszenzmikroskop demonstriert
worden [Abb. 4-6, -7, -8 und -9]. Im Vergleich zu den nativen LLC-PK1 Zellen war jedoch
das vollständige GFP-pRS1 im Zellkern vorhanden. Hierfür sind verschiedene Gründe
vorstellbar. Eventuell ermöglichte erst die Überexpression den Nachweis des vollständigen
GFP-pRS1 im Zellkern oder die Fusion mit GFP hemmte sterisch eine proteolytische
Spaltung des pRS1-Proteins. Leider bleibt die Frage offen, ob bei den nativen LLC-PK1
Zellen das vollständige pRS1 in den Zellkern gelangt und dort schnell degradiert, oder ob nur
ein Fragment des pRS1 in den Zellkern wandert.
Eine Sequenz aus einer Anhäufung basischer AS, welche als Kernlokalisierungssignal (NLS)
gedeutet werden könnte (Kalderon et al., 1984), ist in der pRS1-AS-Sequenz nicht enthalten.
Es ist deshalb möglich, dass pRS1 durch eine Interaktion mit einem NLS-tragenden Protein
nach einem Huckepack Mechanismus trotzdem in den Zellkern gelangt (Dingwall et al., 1982;
Zhao et Padmanabhan, 1988). Trunkierungsexperimente sollten klären helfen, ob überhaupt
ein RS1-Fragment in den Zellkern gelangen kann und welche Bereiche im RS1 für die
74
Diskussion
Kernlokalisierung wichtig sind. Ein erster Hinweis für die geringere Bedeutung des NTerminus für die Kernlokalisierung ergab sich daraus, dass ein 52 kD GFP-pRS1 Fragment
im Zytoplasma auftauchte, das aber nicht im Zellkern akkumuliert wurde [Abb. 4-8]. Dieses
Fragment enthielt rechnerisch ca. 25 kD vom N-Terminus des pRS1 (52 kD minus 27 kD des
N-terminalen GFPs). Somit scheinen die ersten 25 kD (~230 AS) nicht für den Kernimport
verantwortlich zu sein. Auch bei der Expression des GFP-pRS1 (AS 329-623) [Abb. 4-16,
-20], welches wie das vollständige RS1 im Zellkern akkumuliert wird, zeigte sich, dass auf
die N-terminale Hälfte (AS 1-328) für den Kernimport verzichtet werden kann.
Die Bedeutung des C-Terminus für den Kernimport deutete sich zuerst durch die verminderte
Kernfluoreszenz bei Fusion des GFPs an den C-Terminus von pRS1 an [Abb. 4-13, -20]. Die
Trunkierungen des pRS1(AS 1-623) um 42 AS am C-Terminus (AS 1-581) beeinträchtigte
die Kernlokalisierung und es konnten vermehrt fluoreszenzfreie Zellkerne beobachtet werden
[Abb. 4-19, -20]. Bei Trunkierung um 100 AS am C-Terminus war der Effekt auf die
Kernlokalisierung noch deutlicher und es dominierten Zellen mit fluoreszenzfreien Zellkernen
[Abb. 4-18, -20]. Das Auftreten noch vereinzelter Zellen mit Kernfluoreszenz könnte ein
Zeichen dafür sein, dass ein unspezifischer Kernimport aufgrund der Überexpression nicht
vollständig ausgeschlossen werden kann, oder dass noch andere Faktoren wie z.B. Zellzyklus
oder Zelldifferenzierungsgrad die Kernlokalisierung beeinflussen. Bei der Betrachtung der
AS-Sequenz fällt auf, dass bei der C-terminalen Trunkierung um 42 AS die UBA-Domäne
[AS 579-616] bis auf die ersten 3 AS verloren gegangen war. (Die mögliche Beteiligung der
UBA-Domäne an der Kernlokalisierung wird gesondert unter Punkt 5.5 „Der C-Terminus des
pRS1“ diskutiert.) Warum die Kernlokalisierung durch die weitere Trunkierung um 58 AS
noch stärker gehemmt wurde, bleibt bisher unklar. Diese weitere Verkürzung fällt nämlich in
einen Bereich der RS1-Sequenz, die eher durch eine geringe Homologie auffällt [Abb. 5-1].
Vielleicht liegt die Ursache weniger in dem Verlust der UBA-Domäne, als in der
Veränderung der Gesamtkonformation des pRS1-Proteins, in dessen Folge die Interaktion mit
Proteinen, die den Kernimport des pRS1 ermöglichen, erschwert wird.
5.4 RS1 im Zytoplasma
Bei den nativen LLC-PK1 Zellen konnte das pRS1-Protein nicht im Zytoplasma detektiert
werden [Abb. 4-5]. Weil pRS1 aber an der Plasmamembran und auch im Zellkern vorkommt,
muss davon ausgegangen werden, dass zumindest geringe Mengen des pRS1-Proteins auch
im Zytosol vorhanden sind. Es zeigte sich, das bei Expression des pRS1 oder rbRS1 in
75
Diskussion
Xenopus Oocyten ein Großteil des RS1-Pools in der Zytoplasmafraktion auftauchte (Valentin,
1998) und auch bei Überexpression des GFP-pRS1 in LLC-PK1 Zellen wurde das Protein
vermehrt im Zytoplasma gefunden [Abb. 4-6, -8 und -9]. Über die Gründe für die starke
Expression im Zytosol kann bisher nur spekuliert werden. Vielleicht ist die Anzahl der
Möglichkeiten zur Verankerung des pRS1 an der Plasmamembran und im Zellkern so
limitiert, so dass die restlichen pRS1-Proteine verstärkt im Zytosol verbleiben müssen. Oder
für die Membran- und Kernlokalisierung ist eine wichtige posttranslationale Modifikation wie
Phosphorylierung oder Myristilierung notwendig, die aber aufgrund der Überexpression nicht
bei allen Proteine durchgeführt werden kann.
5.5 Der C-Terminus des pRS1
Beim Vergleich der RS1 Proteine untereinander fällt der C-Terminus durch die höchste
Homologie auf [Abb. 5-1]. Die letzten 35 AS (pRS1: AS 588 bis 623) sind zu 100 %
konserviert und deuten die Wichtigkeit dieser Region für die RS1 Proteine an.
Mit dem SMART Programm konnte das Motiv für eine UBA-Domäne in der AS-Sequenz
des pRS1 von AS 579 bis 616 im C-Terminus entdeckt werden (Schultz et al., 1998).
Aufgrund der hohen Homologie des C-Terminus ist die UBA-Domäne in allen RS1-Proteinen
zu finden.
Die dreidimensionale Struktur der 2. UBA Domäne des humanen RAD23 Homologs
HHR23A wurde mittels NMR Spektroskopie aufgeklärt. Die Domäne bildet eine sehr
kompakte Struktur aus drei a-Helices [Abb. 5-2].
Helix II
Helix III
Helix I
Abb. 5-2: Struktur der UBA Domäne aus HHR23A (aus Dieckmann et al., 1998)
Für die UBA-Domäne des humanen DNA Reparaturproteins HHR23A konnte gezeigt
werden, dass die Konformation primär durch konservierte Helix-Helix Interaktionen bestimmt
wird. Dabei spielen die hintereinander liegenden AS Glycin, Phenylalanin und Prolin (beim
76
Diskussion
RS1 Threonin) eine zentrale Rolle. Sie bilden einen Loop zwischen a-Helix 1 und 2. Die
hydrophobe Seitenkette des Phenylalanins ermöglicht dabei eine Interaktion mit der 3. aHelix, indem der Phe-Rest von den Methylgruppen zweier Leucinreste umgeben wird
(Dieckmann et al., 1998). Diese konformationsentscheidenen Charakteristika sind konserviert
im C-Terminus der bisher bekannten RS1-Proteine aus Schwein, Mensch, Kaninchen und
Maus ebenfalls enthalten (Schultz et al., 1998).
AS 579 [-------------------------------- UBA Domäne------------------------------]
AS 622
pRS1...
FPA A D
I DRI L R A GFTLQEALGALHRVGGNADLALLVLLAKNIVVP
hRS1....
FPA T D I DRI L R AGFTLQEALGALHRVGGNADLALLVLLAKNIVVP
rRS1....
FPA A D I DRI L R AGFTLQEALGALHRVGGNADLALLVLLAKNIVVP
mRS1..
FPA A D V DRI L G AGFTLQEALGALHRVGGNADLALLVLLAKNIVVP
HHR23A QEK E A I ERL K A LGFPE SLVI QAYFAC EKNENLAANFLLSQNFDDE
[---a-Helix I--]
[---a-Helix II---]
[---- a-Helix III---]
Abb. 5-3: Vergleich der UBA-Domäne aus den RS1-AS-Sequenzen mit der 2. UBA aus HHR23A
Die angegebenen Positionen der a-Helices wurden aus dem Sequenzvergleich mit der bekannten
Konformation der UBA-Domäne aus HHR23A abgeleitet (Dieckmann et al., 1998.). Vergleich mit
HHR23A-Sequenz: rot: identische AS; blau: ähnliche AS
Bei der C-terminalen Trunkierung um 42 AS wurde die UBA-Domäne bis auf die ersten 3 AS
entfernt. Diese Trunkierung behinderte die Kernlokalisierung des GFP-pRS1 (AS 1-581), bei
70 % der Zellen deutlich, konnte aber die Kernlokalisierung nicht vollständig aufheben. Da
die Kernlokalisierung des pRS1 durch die Trunkierung der UBA-Domäne nicht komplett
aufgehoben werden konnte, könnte es sein, dass die UBA-Domäne für den Kernimport nicht
alleine zuständig ist. Vielleicht wirkt die UBA-Domäne nur indirekt auf den Kernimport, so
dass z.B. ohne die UBA-Domäne eine posttranslationale Modifikation, die den Kernimport
steuern könnte, nicht mehr möglich ist.
UBA-Domänen konnten in bisher 116 verschiedenen Proteinen entdeckt werden, wobei 40
Beispiele aus Säugern stammen (Schulz et al., 1998). Unter diesen Proteinen sind auch
Kernproteine wie die RAD23-Homologen. Das RAD23 aus Saccharomyces cerevisae ist ein
DNA-Reparatur-Protein, welches durch DNA-schädigende Reagenzien reguliert wird
(Watkins et al., 1993). Eine Bedeutung dieses Motivs für den Kernimport ist bisher noch nicht
beschrieben worden. Es ist aber vorstellbar, weil das pRS1-Protein mit Ubiquitin interagieren
kann, dass RS1 durch Interaktion mit einem ubiquitinierten Kernprotein, wie einem
Transcriptionsfaktor oder einem Chromatinprotein in den Zellkern gelangt.
77
Diskussion
Eine andere Möglichkeit den Einfluss des C-Terminus auf den Kernimport zu erklären, bildet
die Existenz einer konservierten potentiellen Phosphorylierungssequenz im C-Terminus
(pRS1: AS 592) für die Caseinkinase II (Baumgarten, 1999). Eine Caseinkinase II abhängige
Phosphorylierung des rekombinanten pRS1 konnte in vitro demonstriert werden [Abb. 4-35].
So ist z.B. bekannt, dass die Caseinkinase II abhängige Phosphorylierung des SV40-T-ag
(simian virus 40 large tumor antigen) und des Nukleoplasmins aus Xenopus den Kernimport
beschleunigt (Rihs und Peters, 1989; Vacurova et al., 1995).
5.6 Die möglichen physiologischen Funktionen des RS1
5.6a Wirkung an der Plasmamembran
Die ersten funktionellen Hinweise ergaben sich aus der Koexpression des RS1 gemeinsam mit
dem SGLT1 in Xenopus Oocyten (Spangenberg et al, 199; Veyhl et al., 1993; Lambotte et al.,
1996). Später konnte bei Koexpression auch für den hOCT2 eine Veränderung des Vmax –
Wertes gemessen werden (Reinhardt et al., 1998). Somit ist der Effekt des RS1 nicht für den
SGLT1 spezifisch. Die Ursache für die Hemmung des Transportes in Xenopus Oocyten kann
aufgrund der Injektion von cRNA als transkriptionsunabhängig angesehen werden, was durch
zusätzliche Versuche mit dem Transcriptionshemmer Actinomycin D bestätigt werden konnte
(Veyhl, persönliche Mitteilung 1999).
In Xenopus Oocyten wurde gezeigt, das sich die Menge des hSGLT1 in der Plasmamembran
nach Koexpression mit dem hRS1 proportional zur Abnahme der Transportleistung
verringert. Gleichzeitig konnte eine Abnahme der Membrankapazität gemessen werden, die
sich elektronenmikroskopisch durch eine Verringerung der Oocytenoberfläche erklären ließ
(Valentin et al., 2000). Eine mögliche Erklärung für die durch RS1 induzierten
Veränderungen der Plasmamembranoberfläche könnten Einflüsse auf die Endo- bzw.
Exozytoseraten sein. Hierzu wurden Versuche mit dem Membran-Farbstoff RH 414
durchgeführt, welcher nur durch die Internalisierung von Plasmamembran ins Zellinnere
gelangen kann. Die erhöhte Aufnahme des RH 414 von den pRS1 stabil überexprimierenden
Zellen lässt eine Wirkung des pRS1 auf die Endocytose als Ursache vermuten [Abb. 4-32].
Die Endozytose von Plasmamembranproteinen wird durch kurze AS-Sequenzen im
zytoplasmatischen Anteil dieser Membranproteine vermittelt, die mit einer Translokation der
Membranproteine in die sogenannten Coated pits beginnt. Ein wichtiges Endozytose-Signal
stellt das Di-Leucin Motiv dar, welches z.B. beim Insulin-Rezeptor (Haft et al. 1998) und im
Glut 4 (Garippa et al. 1996) eine Translokation in die Coated pits verursacht. So ein Di78
Diskussion
Leucin Motiv kommt auch im RS1 (pRS1 AS 366/67) vor und zwar befindet es sich in einer
zu 100% konservierten Sequenz aus 10 AS (pRS1 AS 359-668).
AS 357
pRS1
hRS1
rbRS1
mRS1
AS 371
S I TAALKELHELLV I SS
S I TAALKELHELLV V SS
S I TAALKELHELLV I SS
SV TAALKELHELLV I SS
Abb. 5-4: Di-Leucin Motiv im RS1
Auch das Tyrosin-based YxxÄ Motiv (Ä: AS mit einem großen hydrophoben Rest) ist ein
bekanntes Endozytose-Motiv und ermöglicht z.B. die Internalisierung des LDL- (Chen et al.
1990) und des Transferrin-Rezeptors (Colloawn et al., 1990). Dieses Motiv kommt in der ASSequenz des RS1 allerdings nicht vor. Das Tyrosin-based sowie das Di-Leucin Motiv
ermöglichen beide eine Interaktion mit dem Clathrin-Adapter Komplex AP-2, welcher eine
Translokation in die Clathrin-umkleideten Coated pits bewirkt (Marks et al., 1997;
Trowbridge, 1991).
Auch die Ubiquitinierung von Plasmamembranproteinen kann als Endozytose-Signal dienen
(Straus and Goivers, 1999; Hicke, 1999). Während die Bildung von Polyubiquitinketten zur
Erkennung und Degradation durch das Proteasom führt, kann die Monoubiquitinierung eines
Membranproteins dagegen die Internalisierung initiieren (Terrell et al., 1998; Shih et al.,
2000; Lucero et al., 2000). Wie wichtig die Ubiquitinierung für die Endozytose eines
Membranproteins sein kann, konnte an einer Mutation im epithelialen Na+-Kanal (ENaC)
erkannt werden. Eine Mutation im PPxY-Motiv verhindert eine Interaktion mit der WWDomäne der membranassoziierten Ubiquitin-Ligase Nedd4 (Staub et al., 1997), so dass in
Folge der ENaC nicht ubiquitiniert wird. Die fehlende Ubiquitinierung verursacht eine
verstärkte Präsenz des ENaCs (Schild et al., 1996; Shimkets et al., 1997) und damit eine
erhöhte Aktivität des ENaC. Das dadurch verursachte erbliche Krankheitsbild ist unter dem
Namen Liddle`s Syndrom bekannt und führt zu einem arteriellen Überdruck, denn der ENaC
ist beteiligt an der Resorption von Salz und Flüssigkeit aus dem distalen Nephron, Dickdarm
und Lungenepithel.
Wie die Ubiquitinierung eines Plasmamembranproteins die Internalisierung initiiert, ist noch
unverstanden. Die einfachste Erklärung wäre, wenn ein Protein-Adapter eine Verbindung
zwischen den ubiquitinierten Plasmamembranproteinen und der Endozytose-Maschinerie
herstellen könnte (Hicke, 1999; Strous and Govers, 1999; Rotin et al., 2000; Shih et al.,
79
Diskussion
2000). Dieser Adapter würde eine wichtige Rolle für die ubiquitinabhängige Endocytose
spielen. RS1 könnte ein Kandidat für die Funktion dieses gesuchten Protein-Adapters in der
ubiquitinabhängige Endozytose sein, denn:
1. pRS1 ist ein membranassoziiertes Protein (Valentin et. al., 2000)
2. pRS1 besitzt eine aktive UBA-Domäne, welche eine nicht kovalente Interaktion mit
Mono-Ubiquitin ermöglicht (4.4)
3. RS1 besitzt ein konserviertes Di-Leucin Endozytose Motiv (pRS1 AS 366/67)
4. pRS1 scheint endozytotische Vorgänge zu fördern (4.6 und Valentin et al., 2000)
5. RS1 wirkt auf verschiedene Transporter wie den SGLT1 und den OCT2 (Reinhardt et al.,
1999)
5.6b Funktion im Zellkern
Bei Reduzierung der Translation des endogenen pRS1 mittels einer stabilen anti-sense
Strategie in LLC-PK1 Zellen wurde eine drastische Erhöhung der Transcription des SGLT1
gemessen (Korn, 1999; Track, persönl. Mitteilung, 2000). Bei der Überexpression des pRS1
in LLC-PK1 Zellen konnte genau der gegenteilige Effekt und zwar die Reduzierung der
SGLT1-mRNA beobachtet werden [Abb. 4-31]. Dieser Befund verdeutlicht, dass RS1
repressorisch auf die Transcription des SGLT1 in LLC-PK1 Zellen wirkt.
Da gezeigt werden konnte, dass RS1 in den Zellkern gelangen kann, ist es wahrscheinlich,
dass RS1 seine Wirkung auf die Transcription im Zellkern entfaltet. Im Kern interagiert RS1
wahrscheinlich nicht direkt mit der DNA, denn es konnten keine bekannten DNAInteraktionsmotive in der Sequenz von RS1 nachgewiesen werden. Deshalb ist anzunehmen,
dass RS1 indirekt durch Interaktion mit anderen Transcriptionsfaktoren auf das SGLT1-Gen
wirkt. Dabei wäre auch eine Beteiligung der UBA-Domäne vorstellbar, auch wenn eine
direkte transcriptionsregulierende Rolle einer UBA Domäne bisher noch nicht beschrieben
worden ist. Theoretisch ist möglich, dass das RS1-Protein über eine Interaktion mit z.B.
einem ubiquitinierten Transcriptionsfaktor oder einem ubiquitinierten Chromatinprotein
indirekt auf die Transcription des SGLT1 wirkt. Welche DNA-Proteine direkt die
Transcription des SGLT1 reprimieren, ist bisher kaum untersucht worden. Wood und
Mitarbeiter (1999) konnten aber zeigen, dass es in der Promotorregion des sSGLT1 ein oder
vielleicht auch zwei Bereiche für eine transkriptionelle Suppression gibt. Die transcriptionelle
Regulation des SGLT1 ist bei weitem noch nicht verstanden und lässt viel Spielraum für noch
unbekannte Regulationsmechanismen, an denen eventuell RS1 beteiligt sein könnte.
80
Diskussion
Bei der Transcriptionskontrolle des SGLT1 in den LLC-PK1 Zellen ist zu beachten, dass die
Transcription des endogenen SGLT1 auf noch unbekannte Weise auch durch die Ausbildung
der Zell-Zellkontakte reguliert wird. Erst bei konfluenten Zellen kommt es zur Transcription
des SGLT1 (Shioda et al., 1994; Suzuki et al.; 1996). Bei Störung dieser Zell-Zellkontakte
wird die SGLT1-Transkription schnell wieder reduziert (Van der Bosch et al., 1991). Es muss
also in den LLC-PK1 Zellen ein Signalweg von der Plasmamembran in den Zellkern
existieren. Sollte RS1 diesen Signalweg z.B. durch Beeinflussung der Zellkontakte (Tight
junctions) beeinflussen oder an einer anderen Stelle in diesen Signalweg eingreifen, so wäre
ein transcriptioneller Einfluss des RS1 sogar ohne eine direkte Kernlokalisierung des RS1
vorstellbar.
5.7 Ist RS1 ein Signaltransduktionsprotein?
Die Verteilung des pRS1 an der Plasmamembran und im Nukleus erinnert an das Verhalten
eines Signaltransduktionsproteins, welches ähnlich wie z.B. das b-Catenin bei der
Zelldifferenzierung ein Signal von der Plasmamembran in den Zellkern trägt. Auch b-Catenin
wurde zuerst als reines membranständiges Protein beschrieben, welches die ZellZelladhäsionsproteine Cadherine mit dem Aktin-Zytoskelett der Zelle verbindet (Peifer,
1995). Ähnlich dem pRS1 konnte b-Catenin erst nach Überexpression im Zytoplasma und im
Zellkern entdeckt werden (Hinck et al., 1994). Im Zellkern wirkt b-Catenin auf die
Transcription durch eine Interaktion mit den Transcriptionsfaktoren der LEF/TCF Familie
(Molenaar et al., 1996; Behrens et al., 1996).
Der konfluenzabhängige Nachweis des RS1-Proteins an der Plasmamembran der LLC-PK1
Zellen [Abb. 4-5] lässt Parallelen zum Verhalten des Zonula occludens-1 Proteins (ZO-1)
erkennen, welches zur Familie der membranassoziierten Guanylat-Kinasen (MAGUK) gehört
(Gottardi et al., 1996). ZO-1 verhält sich allerdings umgekehrt zum pRS1. Es ist nämlich vor
Erreichen der Konfluenz im Zellkern und interagiert nach Erreichen der Konfluenz u.a. mit
dem Transmembranprotein Occludin (Fanning et al., 1998).
Die Reduzierung der pRS1-Proteinmenge in der Plasmamembranfraktion der differenzierten
LLC-PK1 Zellen war nicht auf einen Rückgang der pRS1-mRNA zurückzuführen (Korn,
2000). Entweder ist die Translation des pRS1 nach Konfluenz negativ reguliert, oder, und
dafür sprach das Auftreten des Kernsignals, es fand wie beim ZO-1 eine Umverteilung statt.
Dabei ist vorstellbar, dass pRS1 entweder nach Translation direkt in den Zellkern gelangt,
oder dass eine vorherige Membranassoziation notwendig ist. Das Auftreten eines 60 kD
81
Diskussion
Fragmentes in der Plasmamembran und anschließend eines 40 kD Fragmentes im Zellkern
deuten eher einen Weg von der Plasmamembran in den Zellkern an [Abb. 4-5]. Die
Minderung des RS1 an der Plasmamembran nach Konfluenz könnte dann mit einer
Regulation durch Degradation erklärt werden. Ob die detektierten Fragmente Produkte einer
physiologischen Spaltung sind, die mit dem Mechanismus des RS1 verbunden sind, konnte
nicht eindeutig geklärt werden. Das Entstehen eines etwa 60 kD Fragmentes konnte aber auch
bei den Duodenummembranen [Abb. 4-2] und bei der in vitro Expression des pRS1 in
Reticulocyten-Lysat gesehen werden [Lambotte e al., 1996].
Theoretisch befindet sich eine trypsinsensitive Schnittstelle im 2. großen konservierten
Abschnitt [Abb. 5-1; AS 359–368]. Eine Proteolyse in diesem Bereich würde das Protein in
ein 3/5 und 2/5 Fragment teilen, was nach dem Laufverhalten im SDS-PAA-Gel ein 60 und
40 kD Fragment ergäbe.
5.8 Ein hypothetisches Modell zum Wirkmechanismus des RS1
Die subzellulären Lokalisierungsergebnisse des pRS1 und die funktionellen Hinweise zur
Endozytose und transcriptionellen Repression des SGLT1 sind in einem hypothetischen
Modell zusammengefasst worden. Die Hinweise zur physiologischen Spaltung des pRS1Proteins erscheinen noch zu spekulativ und sind aus diesem Grund nicht verarbeitet worden.
Das Modell lehnt sich an ein früheres Modell an (Korn, 1999), in welchem die Wirkung des
RS1 auf verschiedene Transportproteine durch die Einführung eines noch unbekannten
Adapter-Proteins erklärt wurde [Abb. 2-1]. Auch die Vorstellung von RS1 als Signalmolekül,
welches ein Signal von der Plasmamembran in den Zellkern trägt, wurde mit einbezogen.
Im Modell [Abb. 5-5] ermöglicht die UBA-Domäne des RS1 die Erkennung eines
ubiquitinierten Plasmamembranproteins, wie z.B. des SGLT1. Aufgrund des Di-Leucin
Motivs im RS1 kommt es zur Erkennung und Interaktion mit dem AP-2 Clathrin-AdapterKomplex (Trowbridge et al., 1991). Die Wechselwirkung mit AP-2 führt letztlich zur
Lokalisierung des Proteinkomplexes in einem Clathrin umkleideten Coated pit.
Die Clathrin abhängige Abschnürung leitet die Internalisierung des ubiquitinierten
Membranproteins ein. Nach dem Verlust der Clathrinhülle kann das Membranvesikel durch
Membranfusionen in die frühen Endosomen und weiter ins periphere und dann ins
perinukleare Lysosom zur letztlichen Degradierung gelangen. Dieser Weg bis ins zellkern-
82
Diskussion
nahe Lysosom konnte bei der Aufnahme des Endocytosefarbstoff RH 414 gut beobachtet
werden [Abb. 4-32].
Ein Teil der internalisierten Vesikel verbleibt zu einem frühen Zeitpunkt auch als
Speicherpool im plasmamembrannahen Bereich und kann durch Fusion auch wieder an die
Plasmamembran zurückgelangen. Dieser kurze Kreislauf an und direkt unter der
Plasmamembran ermöglicht eine schnelle Rekrutierung und würde eine Erklärung für die
intensive Anfärbung im Bereich der Zellperipherie mit RH 414 bei der pRS1 Überexpression
liefern.
PLASMAMEMBRAN
Abb. 5-5: Hypothese zur Funktion des RS1
Günes Oval: SGLT1; blauer Kreis: Ubiquitin; rotes Fünfeck: Clathrin-Adapter Komplex AP-2; rotes
Viereck: Protein mit NLS-Sequenz für Kernimport; farblose Y-Form: RS1; PKC: Proteinkinase C
Für den Kernimport des RS1 muss die Hilfe eines anderen Proteins vermutet werden, da RS1
selber keine NLS besitzt. Im Zellkern wirkt RS1 dann auf unbekannte Weise negativ
regulierend auf die Transcription des SGLT1 (5.6b).
Eine mit der Endozytose von Plasmamembranproteinen verbundene Transcriptionshemmung
von Plasmamembranproteinen erscheint physiologisch sinnvoll. RS1 wäre somit im Modell
auch ein Signaltransduktionsprotein, welches eine mittelfristigen Regulation durch
83
Diskussion
Endozytose mit einer längerfristigen Regulation durch Transcriptionshemmung koppeln
würde.
Ein zentraler Punkt und auch Voraussetzung für dieses Modell ist die Ubiquitinierung des
SGLT1 an der Plasmamembran. Diese Ubiquitinierung des SGLT1 ist bisher noch nicht
bedacht und deshalb noch nicht gezielt untersucht worden. Alle SGLT1 Proteine besitzen aber
6 konservierte Lysinreste auf der zytoplasmatischen Seite (nach dem Topologiemodell von
Turk et al., 1996), an denen eine Ubiquitinierung möglich wäre. Die Ubiquitinierung von
Plasmamembrantransportern könnte z.B. durch die membranassoziierte Ubiquitin-Ligase
Nedd4 erfolgen, welche mit PPxY Motiven interagiert (Rotin et al., 2000). Vielleicht
ermöglicht die konservierte MPEY Sequenz auf der zytosolischen Seite zwischen der
Transmembranhelix 3 und 4 im SGLT1 auch eine Interaktion mit Nedd4, so dass eine
Ubiquitinierung des SGLT1 stattfinden könnte.
5.9 Die möglichen Regulationen der RS1-Aktivität
Um die postulierten unterschiedlichen Funktionen von RS1 im Modell (5.8) an der
Plasmamembran und im Zellkern erfüllen zu können, müssten wechselnde Affinitäten des
RS1-Proteins
zu
unterschiedlichen
Interaktionspartnern
verlangt
werden.
Diese
Anforderungen könnten durch posttranslationale Modifikationen erfüllt werden.
5.9a Der Einfluss der Kinasen
Der Erfolg einer in vitro Phosphorylierungen hängt entscheidend von der Möglichkeit einer
konformationsabhängigen Interaktion zwischen der Kinase und dem Testsubstrat und von der
Zugänglichkeit der Phosphorylierungssequenz im Testsubstrat ab. Im Fall des rekombinanten
pRS1-Proteins konnten diese beiden Bedingungen bei Inkubation mit der PKA, PKC und
CaK II erfüllt werden (4.7).
Es fällt auf, dass sich die konservierten Phosphorylierungsstellen in unmittelbarer Nähe zur
UBA-Domäne und dem Di-Leucin Motiv befinden [Abb. 5-1]. Somit ergibt sich Möglichkeit,
dass eine Phosphorylierung im Bereich dieser Sequenzen die Aktivität dieser Motive
regulieren könnte.
Die 3 konservierten potentiellen Phosphorylierungssequenzen für die Casein Kinase II
befinden sich dabei im N-Terminus (AS 130) in der Mitte (AS 348) und im C-Terminus (AS
592) des pRS1 und scheinen so die Konformation des RS1 in allen Bereiche beeinflussen zu
können. Besonders interessant ist dabei die Möglichkeit einer Regulation der Aktivität der
84
Diskussion
UBA-Domäne für eine Interaktion mit Ubiquitin durch die CaKII. Auch das Di-Leucin
Endozytose-Motiv könnte durch eine Casein Kinase II abhängige Phosphorylierung reguliert
werden. So ist z.B. bekannt, dass die Aktivität der Caseinkinase II die Endozytose des
Transferrin-Rezeptors reguliert. (Cotlin et al., 1999). Ebenso könnte die Caseinkinase II
abhängige Phosphorylierung auch für den Kernimport des RS1-Proteins wichtig sein, wie es
z.B. für Nukleoplasmin aus Xenopus beschrieben ist (Vacurova et al., 1995).
Die Protein Kinase C abhängigen Konsensussequenzen befinden sich mehr in der Mitte der
RS1-Sequenz (pRS1, AS 370 und 400) und könnten die Aktivität des Di-Leucin Endozytose
Motivs (AS: 366/67) beeinflussen. Es ist bekannt, dass die PKC das Trafficking und
Recycling des SGLT1 zwischen der Plasmamembran und dem intrazellulären SGLT1Speichervesikel-Pool entscheidend mitreguliert, ohne dass eine direkte Phosphorylierung des
SGLT1 involviert zu sein scheint (Wright et al., 1997; Hirsch et al., 1996; Delezay et al.,
1994). Hier ergibt sich die Möglichkeit, dass dieser Vorgang durch die Phosphorylierung
eines anderen für die Endozytose wichtigen Proteins wie vielleicht des RS1 vermittelt wird.
5.9b Proteolyse
Eine weitere Möglichkeit die Aktivität von RS1 zu beeinflussen, könnten die gesammelten
Hinweise zur Proteolyse des RS1 in ein 40 und 60 kD Fragment liefern [Abb. 4-5]. Eine
Spaltung im Bereich des zweiten großen konservierten Bereiches [pRS1: AS 359-368] würde
vielleicht die Präsentation des Di-Leucin Motivs beeinflussen und somit die Internalisierung
auslösen. Es ist aber bisher unklar, ob die RS1-Spaltprodukte die Folge einer gezielten
physiologischen Degradation sind und ob die Spaltprodukte dann aktive Effektoren sind.
Es gibt Beispiele verschiedener wichtiger Signalmoleküle, die durch eine Degradation
reguliert werden, wie z.B. b-Catenin, NF-KB und IKB Proteine (Aberle et al., 1997; Fan and
Maniatis, 1991; Chen et al., 1995).
5.10 Experimenteller Ausblick
Viele Arbeiten zur Regulation des Plasmamembrantransporters SGLT1 beschränken sich bei
der Ursachenforschung aufgrund der Komplexität auf allgemeine Einflüsse bei der
Transcriptonskontrolle oder nennen posttranscriptionale bzw. posttranslationale Ursachen,
ohne Vorschläge für konkrete Mechanismen zu liefern. So sind viele Wirkungen wie z.B. der
Proteinkinasen auch so vielfältig, dass ein genauer mechanistischer Vorgang bisher nicht
vollständig nachvollzogen werden kann.
85
Diskussion
Für SGLT1 und RS1 ist nun ein Modell entwickelt worden, welches aufgrund der gefundenen
Motive einem konkreten mechanistischen Vorschlag liefert. Diese Punkte müssten allerdings
experimentell noch weiter erhärtet werden.
So ist ein zentraler Punkt und auch Vorraussetzung für das Modell zur Wirkungsweise des
RS1 (5.8) die Ubiquitinierung des SGLT1. Mit dem geschaffenen anti-pSGLT1 Serum 75
könnte eine Immunpräzipitation des SGLT1 versucht werden, um das Präzipitat dann auf
Ubiquitin zu untersucht. Hierfür würde die pRS1 anti-sense Zelllinie (Korn, 1999) aufgrund
ihrer hohen SGLT1-Expression ein gutes Untersuchungsobjekt abgeben. Ein erster Hinweis
würde sich aus dem Zuwachs des Molekulargewichtes des SGLT1-Proteins um 8.5 kD (MW
des Ubiquitins) ergeben.
Zur Funktionsanalyse der UBA-Domäne sollte die physiologische Wirkung eines C-terminal
trunkierten pRS1 auf die Endozytose und die SGLT1-Transcription untersucht werden.
Anstelle einer Trunkierung könnte auch Phenylalanin (AS 591) in der UBA-Domäne in eine
Aminosäure mit einem geladenen Rest, wie z.B. in Aspartat mutiert werden.
Die Funktion des C-Terminus für die Kernlokalisierung könnte durch dessen Fusion mit GFP
oder durch Fusion des C-Terminus mit einem zytosolischen Protein wie der Pyruvat-Kinase
untersucht werden.
Ebenso sollte auch die Wirksamkeit des Di-Leucin Motivs (366/67) für die Funktion des
pRS1 durch Mutation in diesem Motiv betrachtet werden.
Die Anreicherung bzw. Aufreinigung des endogenen pRS1 über eine Ubiquitin-Agarose
liefert nun erstmals auch die Möglichkeit zur Klärung der Frage nach einer in vivo
Phosphorylierung des RS1-Proteins. Die Auswirkungen der Phosphorylierung auf die
Funktion und Lokalisierung des RS1 sollten dann weiter durch Mutationen in den
konservierten Phosphorylierungsstellen erforscht werden.
86
Literatur
6. Literaturverzeichnis
Aberle H., Bauer A., Stappert J., Kispert A., Kemler R. 1997. b-catenin is a target for the
ubiquitin-proteasom pathway, EMBO 16: 3797-04
Amsler K., and Cook J.S. 1982. Developmental Na-dependent hexose transport in a cultured
line of porcine kidney cells. Am. J. Physiol. 242: C94-C 101
Amsler K., Ghatani S. and Hemmings B.A. 1991. cAMP-dependent protein kinase
regulated renal epithelial cell properties. Am. J. Physiol. 260: C1290-C1299
Avruch J., Zhang X.F. Kyriakis J.M.1994. Raf meets Ras: completing the framework of a
signal transduction pathway. Trends Biochem. Sci. 19.279-283
Baumgarten K. 1999. Untersuchungen zu RS1, einem Regulator von Plasmamembrantransportern, Dissertation, Universität-Würzburg
Behrens J., Kries J.P., Kuhl M., Bruhn L., Wedlich D., Grosschedl R., Birchmeier W.
1996. Functional interaction of beta-catenin with the transcription factor LEF-1, Nature. 383:
638-42
Ben-Ze‘ev A., Geiger B. 1998. Differential molecular interactions of b-Catenin and
plaktobilin in adhesion, signaling and cancer. Curr. Opin. Cell. Biol. 10: 629-639
Biber J., and Hauser H. 1979. The role of SH-groups in the concentrative transport of Dglucose into brush border membrane vesicles. FEBS Letters 108: 451-456
Birnboim H.C. and Doly J. 1979. A rapid alkaline extraction procedure for recombinant
plasmid DNA. Nucl. Acids Res. 7:1513-1523
Bonifacino JS, 1998. Ubiquitin and the control of protein fate in the secretory and endocytic
pathways. Annu. Rev. Cell Dev. Biol., 14: 19-57
Bradbury N.A. and Bridges R.J. 1994. Role of membrane trafficking in plasma membrane
solute transport. Am. Physiol. Soc. 267: C1-C24
Bradford M.M. 1976, A rapid and sensitive method for the quantification of microgram
quantities of protein utilizing the principle of protein-dye-binding. Anal. Biochem. 72: 248254
Burant C.F., Flink S., DePaoli A.M., Chen J., Lee W.S., Hediger M.A., Buse J.B. and
Chang E.B. 1993, Small Intestine Hexose Transport in Experimental Diabetes. J. Clin.
Invest. 93: 578-585
Chatterjee S. and Stochaji U. 1998, Diffusion of Proteins across the nuclear envelope of
HeLa cells, BioTechniques, 24: 668-674
Chen W.-J., Goldstein J.L., and Brown M.S. 1990. NPXY, a sequence often found in
cytoplasmic tails is required for coated pit-mediated internaliation of LDL receptor. J. Biol.
Chem. 265: 3116-23
87
Literatur
Chen Z., Hagler J., Palombello V., Melandri F., Scherer D., Maniatis T. 1995. Signal
induced site-specific phosphorylation targets IKBa to the ubiquitin-proteasom pathway. Genes
Dev. 9: 1586-97
Chomczynski P. and Sacchi N. 1987. Single-step method of RNA isolation by acid
guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal. Biochem. 162:1 56-159
Chow C.W., Khurana S., Woodside M., Grinstein S., Orlowski 1999, The Epithelial
Na+/H+ Exchanger, NHE3, Is Internalized through a Clathrin-mediated Pathway, J. Biol.
Chem., 53: 37551-58
Chung B.M., Wong J.K., Hardin J.A., Gall D.G. 1999, Role of Actin in EGF-induced
alterations enterocyte SGLT1 expression, Am. Phyiol. Soc., G463-69
Ciechanover A., Hod Y., and Hershko A. 1978. Biochem. Biophys. Res. Commun. 81:
1100-05
Clague M.J. 1998. Molecular aspects of the endocytic pathway. Biochem. J. 336: 271-282
Collawan J.F., Stangel M., Kuhn L.A., Esekogwu V., Jing S. Q. Trowbridge I.S. and
Tainer J.A. 1990. Transferinreceptor internalisation sequence YXRF implicates a tight turn
as the structural recognitation motif for endocytosis. Cell 63: 1061-72
Cotlin L.F., Siddiqui M.A., Simpson F., Collawan J.F. 1999, Casein Kinase II Activity Is
Required for Transferrin Receptor Endocytosis, J. Biol. Chem., 274: 30550-56
Creighton, T.E. 1988. Disulphide bonds and protein stability. Bioessays, 8: 57-63
Delezay O., Baghdiguian S., Fantini J. 1993, The Development of Na+-dependent Glucose
Transport during of an Intestinal Epithelial Cell Clone Is Regulated by Protein Kinase C, J.
Biol. Chem., 270: 12536-12541
Diekmann T., Withers-Ward E.S., Jarosinski M.A., Liu C.F.,Chen I.S. Feigon J. 1998.
Structure of a human DNA repair protein UBA domain that interacts with HIV-1 Vpr. Nat.
Struc. Biol., 5: 1042-7
Dingwall C. and Lasky R.A. Nuclear targeting sequences - a consensus? Trends Biochem.
Sci. 16: 478-481
Doctor R.B., Dahl R.H., Salter K.D., Fouassier, Chen J., Fitz J.G. 2000, ATP Depletion in
Rat Cholangiocytes Leads to Marked Internalisation of Membrane Proteins, Hepatology, 5:
1045-54
Doye V., Hurt E. 1997, From nucleoporins to nuclear pore complexes, Curr. Opin. Cell
Biol., 9: 401-411
Dyer J., Barker P.J. and Shirazy-Beechey S.P. 1997. Nutrient intestinal Na+/glucose cotransporter (SGLT1) gene expression. Biochem.Biophys. Res. Comm. 230: 624-629
Dower W.J., Miller J.F., and Ragsdale C.W. 1988. High efficiency transformation of E.
coli by high voltage electroporation. Nucleic Acids Res. 16: 6127-6145
88
Literatur
Fan C.M. and Maniatis T. 1991. Generation of p50 subunit of NF-KB by processing of p105
through an ATP-dependet pathway. Nature 354: 395-98
Fanning A.S., Jameson B.J., Jesaitis L.A. and Anderson J.M. 1998, The Tight junction
ZO-1 establishes a link between the transmembrane protein occludin and the actin
cytoskelton, J. Biol. Chem., 273: 29745-53
Ferrari S.L., Behar V., Chorev M., Rosenblatt M., Bisello A. 1999, Endocytosis of
Ligand-Human Parathyoid Hormone Receptor 1 Compelexes Is Protein Kinase C-dependent
and involves b-Arrestin2, J. Biol. J., 274: 29968-29975
Ferraris R.P., and Diamond J.F. 1989. Specific regulation of intestinal nutrient transporters
by their dietary substrates. Annu. Rev. Physiol. 51: 125-141
Ferraris R.P. and Diamond J.F. 1997. Regulation of intestinal sugar transport.
Physiological Rev. 77: 257-302
Frasch W., Frohnert P.P., Bode F., Baumann K. and Kinne R. 1970. Competitive
inhibition of phlorizin binding by D-glucose and the influence of sodium: A study on isolated
brush border membrane of rat kidney. Pflugers Arch. 320: 265-84
Garcia-Bustos J., Heitman J. and Hall M.N. 1991. Nuclear protein localization. Biochem.
Biophys. Acta 1071: 83-101
Garippa R.J., Judge T.W., James D.E. and McGraw T.E. 1994. The amino terminus of
GLUT4 functions as an internalisation motif but not an intracellular retention signal when
substituted for the transferrin receptor cytoplasmatic domain. J. Cell Biol. 124: 705-715
Gitan R.S., Eide D.J. 2000, Zinc-regulated ubiquitin conjugation signals endocytosis of the
yeast ZRT1 zinc transporter, Biochem J., 346(2): 329-336
Girogino F., de Robertis O., Laviola L., Montrone C., Perrini S., McCoween K.C., Smith
R.J. 2000, The sentrin-conjungating enzyme UBC9 interacts with Glut4 and Glut1 glucose
transporters and regulates transporter levels in skeletal muskel cells. J. Biol. Chem. 97 (3)
1125-30
Gould G.W., Holman G.D. 1993. The glucose transporter family: structure, function and
tissue-specific eypression. Biochem. J., 295: 329-41
Gorboulev V., Büchner H., Akhoundova A., Fahrenholz F. 1993. Molecular cloning and
functional characterisation of V2 [8-lysine] vasopressin and oxctocin receptors from pig
kidney cell line. Eur. J. Biochem., 215: 1-7
Gottardi C.J., Arpin M., Fanning A.S., Louvard D. 1996, The junction-associated protein,
zonula occuludens-1, localizes to the nucleus before the maturation and during the remodeling
of cell-cell contacts, C. Biol. 93: 10779-84
Govers R., van Kerkhof P., Schwartz A.L., Strous G.J. 1997, Linkage of the ubiquitinconjugating system and the endocytic pathway in ligand-induced internalisation of the growth
hormone receptor. EMBO J. 16: 4851-4858
89
Literatur
Govers R., ten Broeke T., van Kerkhof P., Schwartz A.L., Strous G.J. 1999, Identification
of a novel ubiquitin conjugation motif, required for ligand-induced internalisation of growth
hormone receptor, EMBO J., 18(1): 28-36
Gründemann D. and Koepsell H. 1994. Ethidium bromide staining during denaturation with
glyoxal for sensitive detection of RNA in agarose gel electrophoresis. Analyt. Biochem. 216:
459-461
Haase W. and Koepsell H. 1989. Electron microscopic immunhistochemical localisation of
components of Na+-cotransporter along the rat nephron. Eur. J. Cell Biol. 48: 360-74
Haase W., Heitmann K., Friese W., Ohg D. and Koepsell H. 1990.Characterization and
histochemical localization of the rat intestinal Na(+)-Dglucose cotransporter by monoclonal
antibodies. Eur. J. Cell Biol. 52: 297-309
Haft C.R., Sierra N.D.L. Hamer I., Carpentier J.I. and Taylor I. 1998. Analysis of the
juxtamembrane dileucine motif in the insulin receptor. Endocrinology. 139: 1618-1629
Hardin J., Kroeker K., Chung B., Gall D. 2000, Effekt of proinflammatory interleukins on
jejunal nutrient transport, Gut, 47: 184-191
Harvey K.F., Kumar S.. 1999. Nedd4-like proteins: an emerging family of ubiquitin-protein
ligases implicated in diverse cellular function. Trends Cell Biol. 9(5): 166-9
Hazzard C.E. and Ahearn G.A. 1992. Rapid stimulation of intestinal D-glucose transport in
teleosts by 17 a-methy1testosterone. Am. J Physiol. 262: R412-R418
Hediger M., Coady T.S. Ikeda and Wright E.M. 1987: Expression cloning and cDNA
sequencing of the Na+/glucose co-transporter. Nature. 330: 379-81
Hediger M., and Rhoads D.B. 1994. Molecular physiology of sodium-glucose
cotransporters. Physiol. Rev. 74: 993-1026
Hemlin M., Huang X. 1997, Na+/glucose cotransport in the colonic adenocarcinoma cell line
HT29 cl.19A: effect of cAMP, Acta Physiol. Scand., 160: 185-194
Hink L., Nelson W.J., Papkoff J. 1994, Wnt-1 modulates cell-cell adhesion in mammalian
cells by stabilisation beta binding to the cell adhesion protein cadherin, J. Cell Biol. 124: 729741
Hicke L. 1999: Gettin`down with ubiquitin: turning of cell-surface receptors, transporters and
channels. Trends Cell Biol. 9(3): 107-12
Hirst J., Robinson M.S., 1998. Clathrin and adaptors, Biochim.Biophys. Acta, 1404: 173-193
Hirsch J., Loo D.D.F., Wright E.M. 1996. Regulation of Na+/glucose cotransporter
expression by protein kinases in Xenopus laevis oocytes. J. Bio!. Chem. 271:14740-14746
Hofmann K., Bucher P. 1996. The UBA domain: a sequence motif present in multiple
enzyme classes of the Ubiquitination pathway. Trends Biochem Sci. 5: 172-3
90
Literatur
Hull R.N., Cherry W.R. and Weaver G.W. 1976. The origin and characteristics of a pig
kidney cell strain, LLC-PK1. In Vitro 12: 670-677
Iantomasi T., Favilli F., Marraccini P., und Vincenzini M.T. 1998, Glutathione
involvement on the intestinal Na+-dependent D-glucose transporter. Mol. Cell. Biochem. 178:
387-392
Ishikawa Y., Eguchi T., Ishida H. 1997, Mechanism of b-adrenergic agonist-induces
transmural transport of glucose in rat small intestine Regulation of phosphorylation of SGLT1
controls the function, Biochem. Biophys. Acta, 1357: 306-318
Jacobson A. 1987. Purification and fractionation of poly(A)+RNA. In: Methods in
enzymology: guide to molecular cloning techniques. Orlando Academic Press. 152: 254-261
James D.E., Piper R.C. and Slot J.W. 1994. Insulin stimulation of GLUT4 translocation: A
model for regulated recycling. Trends Gell Biol. 4:120-126
Kalderon D.B., Roberts B.L., Richardson W.D. and Smith A.E. 1984. A short amino acid
sequence able to specify nuclear localization. Cell. 39: 499-509
Kimmich G.A., Randles J. and Wilson J. 1994. Na+-coupled alanine transport in LLC-PK1
cells. Am. J. Physiol. 267: C1119-C1129
Koepsell H., H. Menuhr, I. Ducis and T.F. Wissmuller. 1983. Partial purification and
reconstitution of the Na+-D-glucose cotransporter from pig renal proximal tubules.
J.Biol.Cem. 258: 1888-94
Koepsell H. and Spangenberg J. 1994. Function and presumed molecular structure of Na+D-glucose cotransport systems. J. Memb. Biol. 138: 1-11
Korn T. 1999. Ein neues Regulationsprinzip von Plasmamembrantransportern in der
Schweinenierenepithelzelline LLC-PK1 unter besonderer Berücksichtigung des Na+/Glukose
Cotransporters SGLT1, Dissertation Universität-Würzburg
Kurokawa T., Hashida F., Kawabata S., Ishibashi S., 1995, Evidence for the regulation of
small intestinal Na+/glucose cotransporter by insulin, Biochem. Mol. Biol. Int., 37: 33-8
Kyhse Andersen J. 1984. Electroblotting of multiple gels: A simple apparatus without buffer
tank for rapid transfer of proteins from polyacryl to nitrocellulose. J. Biochem. Biophys
Methods. 10: 203-9
Laemmli U.K. 1970. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of
bacteriophage T4. Nature 277: 680-685
Lambotte S., Veyhl M., Köhler M., Morrison-shetlar A.I., Kinne R.K.H., Schmid M. and
Koepsell H. 1996. The human gene of a protein that modifies Na+-D-g1ucose cotransport.
DNA and Cell Biology 15: 769-777
Lanford R.E. and Butel J.S. 1984. Construction and characterization of an SV4O mutant
defective in nuclear transport of T-antigen. Cell. 37: 801-813
91
Literatur
Laroche E. 1998, Thyroid hormone regulation of the Na+/glucose cotransporter SGLT1 in
Caco-2 cells, Biochem., 334: 633-40
Lee W.-S., Kanai Y., Wells R. and Hediger M. 1994. The high affinity Na+/glucose
cotransporter. J. Biol. Chem. 269: 12032-12039
Lescale-Matys L., Dyer J., Scott D., Freeman T.C., Wright E.M. and Shirazy-Beechey
S.P. 1993. Regulation of the ovine intestinal Na+/g1ucose cotransporter (SGLT1) is
dissociated from mRNA abundance. Biochem J. 291: 435-440
Liakopoulos D., Doenges G., Matuschewski K., Jentsch S, 1998, A novel protein
modificatio pathway related to the ubiquitin system, Embo J., 17 (8) 2208-2214
Lin J.T., Szwarc K., Kinne R. and Jung C.Y. 1984. Structural state of the Na+/D-glucose
cotransporter in calf kidney brush-border membranes. Target size analysis of Na+-dependent
phlorizin binding an Na+-dependent D-glucose transport. Biochem Biophys Acta. 777: 201-8
Lock M., Greenberg M.E., Iafrate A.J., Swigut T., Muench J., Kirchhoff F., Shohdy N.
Skowronski J. 1999, Two elements target SIV Nef to the AP-2 clathrin adaptor complex, but
only one is required for the induction of CD4 endocytosis, EMBO J. 18: 2722-33
Loghman-Adham M. 1991 Characterization of essential sylfydryl groups of rat renal Na~-Pi
cotransporter. Am. J Physioi. 260: F874-F882
Lowry O.H., Rosebrough N.J., Farr A.L., Randall R.L. 1951. Protein measurement with
the folin phenol reagent. J. Biol. Chem. 193: 265-275
Lucero P., Penalver E., and Lagunas R. 2000. Monoubiquitin is sufficient to signal
internalisation of the maltose transporter in Saccharomyces cerevisiae. J. Bacteriol. 182: 24143
Mahraoui L., Rodolosse A., Barbat A., Dussaulx E., Zweibaum A., Rousset M. and BrotLaroche E. 1994. Presence and differentiell expression of SGLT1,GLUT1, GLUT2, GLUT3
and GLUT5 hexose-transporter mRNAs in Caco-2 cell clones in relation to cell growth and
glucose consumption. Biochem J. 298: 629-633
Marks M.S., Ohno H., Kirchhausen T. and Bonifacino. 1997. Protein sorting by tyrosinebased signals: adapting to the Ys and wherefores. Trends Cell Biol. 7: 124-128
Martin M.G., Wang J., Solorzano-Vargas R.S., Lam J.T. Turk E., Wright E.M. 2000,
Regulation of the human Na+-glucose cotransporter gene SGLT1, by HNF1 and Sp1, Am. J.
Physiol. Gastrointest. Liver Physiol., 278: G591-603
Massague J. 1998. TGF-b Signal Transduction, Annu. Rev. Biochem. 67: 753-91
Matosin-Matekalo M., Mesonero J.E., Delezay O., Poiree J.C., Ilundain A.A., BrotMauer H.R. 1971. Disc electrophoresis and related techniques of polyacrylamid gel
electrophoresis. De Gruyter, Berlin.
McCrea P.D. 1991, Science, 254: 1359-1361
92
Literatur
Medintz I., Jiang H., Michels C. 1998, The Role of Ubiquitin Conjugation in Glucoseinduced Proteolysis of Saccharomyces Maltose Permease, J. Biol. Chem., 51: 34454-62
Miller J.H., and Heath L.N. 1989. Growth, enzyme activity, sugar transport, and hormone
supplemetit responses in cells cloned from a pig kidney cell line LLC-PK1. J. Cell. Physiol.
139: 538-549
Misteli L., Spector D.L. 1997. Applications of the green fluorescent protein in cell biology
and biotechnology. Nature Biotechno!ogy 15: 96 1-964
Mitchell P.J., Wang C. and Tjian R. 1987. Positive and negative regulation of transkription
in vitro: enhancer-binding protein AP-2 is inhibited by SV40 T antigen. Cell 50: 847-861
Molenaar M., et al. 1996 Cell 86: 391-399
Moran A.R., Turner J. and Handler J.S. 1983. Regulation of sodium-coupled glucose
transport by glucose in a cultured epithelium. J. Bio1. Chem. 258: 15087-15090
Mullin J.M., Weibel J. and Kleinzeller A. 1980. Sugar transport in the LLC-PK1 renal
epithelial cell line similar to mammalian kidney and the influence of cell density. J. Cell.
Physiol. 104: 375-389
Nesterenko M.V., Tilley M., Upton S.J. 1994, A simple modification of Blum`s silver stain
method allows for 30 minute detection of proteins in polyacrylamide gels. J. Biochem
Biophys Methods. 28: 239-42
Niles W.D., Malik A.B. 1999, Endocytosis and Exocytosis Events Regulate Vesicle Traffic
in Endothelial Cells, J. Membrane Biol., 167: 85-101
Ohta T.K, Isselbacher J., and Rhoads D.B. 1990. Regulation of glucose transporters in
LLC-PK.1 cells: effects of D-glucose and monosaccharides. Mol. Cell. Biol. 10: 6491-6499
Peifer M. 1995. Trends Cell. Biol. 5: 224-229
Penalver E., Lucero P., Moreno E., Lagunas R. 1999, Clathrin and Two Componts of the
COPII Complex, Sec23p and Sec24p, Could be Involved in Endocytosis of the
Saccharomyces Cerrevsiae Maltose Transporter, J. Bact. 4: 2555-2563
Peng H. and Lever J.E. 1995. Post-transcriptional regulation of Na+/glucose cotransporter
(SGLT1) gene expression in LLC-PK1 cells. Biol. Chem. 270: 20536-20542
Peng H. and Lever J.E. 1995. Regulation of Na+-coupled transport in LLC-PK1 cells. J. Biol.
Chem. 270: 23996-24003
Pessin J.E., Thurmond D.C. Elmendorf J.S., Cocker K.J. and Okada S. 1999, Molecular
basis of insulin stimulated GLUT4 vesicle Trafficking. J. Biol. Chem.274: 2593-96
Peters, R. 1986. Fluorescence microphotolysis to measure nucleocytoplasmic transport and
intracellular mobility. Biochem. Biophys. Acta 864: 305-359
Pines J. 1995. GFP in mammalian cells. Trends Genet. 11: 326-327
93
Literatur
Poppe R., Karbacb U., Gambaryan S., Wiesinger II., Lutzenburg M., Kraemer M.,
Witte O.W. and Koepsell H. 1997. Expression of the Na+-D-glucose cotransporter SGLT1 in
neurons. J Neurochem. 69: 84-94
Rachubinski R.A., Marcus S.L., Capone JP. 1999, The p56lck-interacting Protein p62
Stimulates Transkription via the SV40 Enhancer, J. Biol. Chem., 274 (26): 18278-18284
Ratna K., Valdlamundi, Insil Joung, Jack L. Strominger, and Jaekyoon Shin. 1996
p 62, a Phosphotyrosin independent Ligand of the SH2 Domain of p56 , Belongs to a New
Class of Ubiquitin-binding Proteins. J. Biol. Chem. 271: 20235-37
Reed K.C., and Mann D.A. 1985. Rapid transfer of DNA from agarose gels to nylon
membranes. Nucl. Acids Res. 13: 7207-7221
Reinhardt J. 1996. Klonierung und Charakterisierung eines Membran-assozierten Proteins
aus dem Kaninchendünndarm mit modifizierenden Eigenschaften auf den Na+-abhängigen DGlucosecotransporter. Dissertation, Universität-Frankfurt
Reinhardt J., Veyhl M., Wagner K., Gambaryan S., Dekel C., Akhoundova A., Korn T.
and Koepsell H. 1999. Cloning and characterization of the transport modifier RS 1 from
rabbit which was previously assumed to be specific for Na+-Dglucose cotransport. Biochim
Biophys. Acta 1417: 13 1-143
Rickwood, D. 1984. Centrifugation. A practical approach. 2nd ed. IRL Press, Oxford
Rihs H.-P., and Peters R. 1989. Nuclear transport kinetics depend on phosphorylation-sitecontaining sequences flanking the karyophilic signal of the Simian virus 40 T-antigen. EMBO
J. 8:1479-1484
Rihs H.-P., Jans D.A., Fan H. and Peters R. 1991. The rate of cytoplasmic protein transport
is determined by a casein kinase II flanking the nuclear localization sequence of the SV4O Tantigen. Embo J. 10: 633-639
Roberts B., Richardson W.D., Smith A.E. 1987. The effect of protein context on nuclear
location signal function. Gell 50: 465-475
Roberts B. 1989. Nuclear location signal-mediated protein transport. Biochim. Biophys. Acta
1008: 263-280
Rosorius O., Heger P., Stelz G., Hirschmann N., Hauber J., Stauber R.H. 1999, Direkt
Observation of Nucleocytoplasmic Transport by Microinjektion of GFP-Tagged Proteins in
Living Cells, BioTechniques 27: 350-355
Roth A.F, Davis N.G. 1999, Ubiquitination of the PEST-like Endocytosis Signal of the Yeast
a-Factor Receptor, J. Biol. Chem., 11: 8143-53
Rotin D., Staub O., Haguenauer-Tsapis R. 2000. Uiquitination of Plasma Membrane
Proteins: Role of Nedd4/Rsp5p Family of Ubiquitin-Protein Ligases. J. Membr Biol. 176(1):
1-17
94
Literatur
Roy S., Sala R., Caglieo E., Lorenzi M. 1990, Overexpression of fibronectin induced by
diabetes or high glucose: Phenomenon with a memory, Proc. Natl. Acad. Sci. 87: 404-8
Rudolph R. 1990. Renaturation of recombinant, disulfide-bonded proteins from inclusion
bodies. In: Modem methods in protein chemistry. H. Tesche. de Gruyter, Berlin
Salinovich O. and Montelaro R.C. 1986. Reversible staining and peptide mapping of
proteins transferred to nitrocellulose after separation by sodium dodecylsulfatepolyacrylamide gel electrophoresis. Anal. Biochem. 156: 341-347
Salehzada I., Silhol M., Lebleu B. and Bisbal C. 1991. Polyclonal antibodies against RNase
L. .J Biol. Chem. 266: 5808-58 13
Schild L., Lu Y., Gautschi I., Schneeberger E., Lifton R.P. and Rossier B.C.
Identification of a PY motif in the epithelial Na channel subunits as a traget sequence for
mutations causing channel activation found in Liddle syndrome. EMBO J. 15: 2381-2387
Schultz J., Milpetz F., Brok P., Pointing CP. 1998, „SMART, a simple modular
architecture research tool: Identification of signalling domains, Proc. Natl. Acad. Sci., USA
95: 5857-64
Shih S.C., Sloper-Mould K.E., Hicke L. 2000. Monoubiquitin carries a novel internalization
siganl that is appended to activated receptors. EMBO J., 19 (29): 187-198
Shimkets R.A., Lifton R.P. and Canessa C.M. 1997. The activity of the epithelial sodium
channel is regulated by clathrin-mediated endocytosis. J. Biol. Chem. 272: 25537-25541
Shioda T., Ohta T., Isselbacher K.J., Rhoads D.B. 1994. Differentiation dependent
expression of the Na+/glucose cotransporter (SGLT1) in LLC-PK1 cells: role of protein
kinase C activation and ongoing transcription. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 11919-11923
Shirazy-Beechey S.P., Hirayama B.A., Wang Y., Scott D., Smith M.W., and Wright E.M.
1991. Qntogenetic developrnent of lamb intestinal sodium-glucose co-transporter is regulated
by diet. J. Physiol. 437: 699-708
Spangenberg J., Veyhl M., Poppe R., Koepsell H. 1993. Characterisation of the regulatory
subunit of the Na+-D-glucose cotransporter. Biol. Chem. Hoppe-seyler 374:157
Stang E., Jhannessen L.E., Knardal S.L., Madshus I.H. 2000, Polyubiquitiniation of
Epidermal Growth Factor Receptor Occurs at the Plasma Membrane upon Ligand-induced
Activation, J. Biol. Chem., 18: 13940-47
Staub O., Dho S., Henry P.C. Correa J. Ishikawa T. McGlade J. and Torin D. 1996. WW
domains of Nedd4 bind to proline-rich PY motifs in the epithelial Na channel deleted Liddle`s
syndrome. EMBO J. 15: 2371-80
Staub O., Gautschi I., Ishikawa T., Breitschopf K., Ciechanover A., Schild L. and Rotin
D. 1997. Regulation of stability and function of the epithelial Na channel (ENaC) by
ubiquitination. EMBO J. 16: 6325-6336
95
Literatur
Staub O., Abriel H., Plant P., Ishikawa T., Kanelis V., Saleki R., Horisberger J.D.,
Schild L., Rotin D. 2000. Regulation of the epithelial Na+ channel by Nedd4 and
ubiquitination. Kidney Int. 57 (3): 809-15
Strous G.J., Govers R. 1999. The ubiquitin-proteasome system and endocytosis. J. Cell Sci.
112: 1417-1423
Stümpel F., Scholtka B., Jungermann K. 1998, Impaired glucose sensing by intrahepatic,
muscarinic nerves for an insulin-stimulated hepatic glucose uptake in streptozotocin-diaetic
rats. FEBS Letters 436: 185-188
Sundaram U., Coon S., Wisel S., West A.B. 1999, Corticosteroids reverse the inhibition of
Na+/glucose cotransport in the chronically inflamed rabbit ileum, Am. Physiol. Soc., G221218
Suzuki T., Fujikura K., Takata K. 1996, Na+-dependent glucose transporter SGLT1 is
localized in the apicalplasma membrane upon completion of tight junction formation in
MDCK cells, Histochem. Cell Biol., 106: 529-533
Terrel J., Shih S., Dunn R. and Hicke L. A function for monoubiquitination in the
internalization of a G protein-coupled receptor. Mol. Cell 1: 193-202
Thevenod F., Friedmann J. 1999, Cadmium-mediated oxidative stress in kidney proximal
tubule cells induces degradation of Na+/K+-ATPase through proteasomal and endo/lysosomal proteolytic pathways, FASEB J. 13: 1751-61
Thrower J.S., Hoffmann L., Rechsteiner M., Pickart C.M. 2000, Recognition of the
polyubiquitin proteolytic signal, EMBO J., 19 (1) 94-102
Trowbridge I.S.,1991. Endocytosis and signals for internalisation. Curr. Opin. Cell Biol. 3:
634-641
Turk E., Kerner C.J., Lostao M.P. and Wright E.M. 1996. Membrane topology of the
human Na+/g1ucose cotransporter SGLT1. J. Biol. Chem. 271: 1925-1934
Turk E., Wright E.M. 1997, Membrane Topology Motifs in the SGLT Cotransporter
Family, J. Biol. Chem. 159: 1-20
Vacurova 1., Paine T.M., Lou W., and Paine P.L. 1995. Nucleoplasmnin associates with
and is phosphorylated by casein kinase II. J Cell Sci. 108: 779-787
Valentin M. 1998. Untersuchungen zur Funktion des Na+-D-G1ucose Kotransporters
SGLT1: Lokalisation in der Leber und Charakterisierung des regulierenden Proteins RS1.
Dissertation. Universität-Würzburg
Valentin M., Kühlkamp T., Wagner K., Krohne G., Arndt P., Baumgarten K., Weber
W.-M., Segal A., Veyhl M. and Koepsell H. 2000. The transport modifier RS1 is localized
at the inner side of plasma membrane and changes membrane capacitance. Biochim. Biophys.
Acta. 1468: 367-80
96
Literatur
Veyhl M., Spangenberg J., Püschel B., Poppe R., Deckel C., Fritzsch G., Haase W.,
Koepsell H., 1993, Cloning of a membrane-asociated protein which modifies activity and
properties of the Na+-D-glucose cotransporter, J. Biol. Chem., 268: 25041-25053
Van den Bosch L., de Smedt H., and Borghgraef R. 1991. Influence of PMA and a low
extracellular Ca2+ concentration on the development of the Na+dependent hexose carrier in
LLC-PK1 cells. Biochim. Biophys. Acta 1091: 244-250
Vayro S., Sivermann M., 1999, PKC regulates turnover rate of rabbit intestinal Na+-glucose
transporter expresssed in Coss-7 cells, Am. J. Physiol., 276: C1053-60
You G., Lee W-S., Barros J.G., Kanai Y., Huo T-L., Khawaja S., Wells R.G., Nigam
S.K., Hediger M.A., 1995. Molcular Characteristics of Na+-coupled Glucose Transporters in
Adult and Embryonic Rat Kidney, J. Biol. Chem., 270: 29365-71
Watkins J.F., Sung P., Prakash L. and Prakash S. 1993. The Saccharomyces cerevisiae
DNA repair gene RAD23 encodes a nuclear contain a ubiquitin-like domain required for
biological function. Mol. Cell. Biol. 13: 7757-65
Westermeier R. 1997. Electrophoresis in Practice, Second Edition. VCH
Wood I.S., Allison G.G., Shirazi-Beechey S.P., 1999, Isolation and characterisation of a
genomic region upstream from the ovine Na+/glucose cotransporter (SGLT1) cDNA,
Biochem. Biophys Res. Commun., 257: 533-7
Wright E.M., Hirsch J.R., Loo D.D.F., 1997. Regulation of Na+/glucose cotransporters. J.
Exp. Biol., 200: 287-293
Wright E.M., Loo D.D., Panayotova-Heiermann M., Rayama B.A., Turk E., Eskandari
S., Lamm J.T., 1998, Structure and function of the Na+/glucose Cotransporter, A. Physio.
Scand., 163: 257-64
Yet S., Kong C., Peng H., Lever J., 1994. Regulation of Na+/glucose cotransporter (SGLT1)
mRNA in LLC-PK1 cells. J. Cell. Physiol. 158: 506-512
97
Anhang
7. ANHANG
Die im Anhang aufgenommenen Daten zum RS1 beinhalten Versuche und Vorversuche, die
wichtige Hinweise zum RS1 liefern, aber teilweise noch weiterer Klärung bedürfen.
7.1 Quantifizierung der pRS1-Konzentration in den BBM-Vesikeln aus der Niere
Nach der Optimierung der Detektionsbedingungen für das pRS1-Protein aus den BBMVesikeln der Schweineniere mit dem anti-RS1 Serum 33IV im Westernblot (4.1) wurde die
Menge des pRS1-Proteins in den BBM-Vesikeln durch Vergleich der Signalstärken mit
verschiedenen Konzentrationen des rekombinanten pRS1 abgeschätzt.
BBM-Vesikel [µg]
Niere
2
2
2
Rekombinantes pRS1 [pg]
12,5
25
50
100
relative
Signalintensität
Rekombinantes pRS1 [pg]
Abb. 7-1: Quantifizierung der pRS1-Konzentration in BBMVs aus der Schweineniere
Drei mal je 2 µg Nieren-BBMs und 12.5, 25, 50 und 100 pg des rekombinanten pRS1 wurden in
Laemmli-Puffer denaturiert, mit Jodacetamid alkyliert und anschließend im SDS-PAGE aufgetrennt
und geblottet. Der Blot wurde mit affinitätsgereinigtem anti-RS1 Serum 33IV analysiert. Die RS1Banden wurden densiometrisch nach Subtraktion des Hintergrundes mit Sigmascan (Sigma, Germany)
ausgewertet. geschlossenes Symbol: rek. pRS1; offenes Symbol :3 mal je 2 µg BBMV (Niere)
Die Auswertung der drei pRS1-Banden aus je 2 µg Nieren-BBMs ergab eine gemittelte
densiometrische Intensität von 0,42 und entsprachen damit der Signalintensität von 40 pg des
rekombinanten pRS1. In 1 mg BBM-Vesikeln ergaben sich somit 20 ng pRS1 (MW 68 kD),
was 0,3 pmol pRS1 pro 1 mg Nieren BBMs entsprach. Für den SGLT1 konnte durch
Phlorizinbindungsstudien mit BBMVs der Niere ein SGLT1-Gehalt von 50 bis 250 pmol pro
98
Anhang
1 mg BBM-Nierenprotein bestimmt werden (Kinne, 1976; Koepsell et al. 1983). Somit lässt
sich ein Verhältnis vom pSGLT1 zum pRS1 von ca. 1 : 150 bis 1 : 800 abschätzen. Damit
musste eine frühere Quantifizierung (Valentin, 1998) mit einem postulierten Verhältnis von
1 : 3.000 um ca. den Faktor 10 korrigiert werden.
7.2 Kontrolle zur Trennung bei der Zellfraktionierung
Weil bei der Zellfraktionierung der LLC-PK1 Zellen RS1-Signale auch in den
Zellkernfraktionen [Abb. 4-5, -8 und -9] zu detektieren waren, war es wichtig auszuschließen,
dass bei der Zellfraktionierung mittels differentieller Zentrifugation die gewonnene
Zellkernfraktion mit Plasmamembranen kontaminiert war. Deshalb wurden die Kern- und
Plasmamembranfraktionen im Westernblot mit einem anti-SGLT1 Serum analysiert [Abb. 72]. SGLT1 diente als Markerprotein für die Plasmamembran und sollte deshalb in der
Kernfraktion nicht vorhanden sein.
MW
182 kD -
A
B
C
115 kD 84 kD –
62 kD –
51 kD 38 kD 26 kD A: BBM Schweineniere
B: Kernfraktion
C: Plasmamembranfraktion
Abb. 7-2 Westernblot: Überprüfung der Trennung von Kern-und Plasmamembranfraktionen
Die LLC-PK1-Zellen wurden 5 Tage nach Erreichen der Konfluenz mittels differenzieller
Zentrifugation nach einer Methode von Salehzada et al. (1991) fraktioniert. Es wurden je 20 µg Kern(1.200 g Sediment, gewaschen mit 0,5 % Igepal), 20 µg Plasmamembranfraktion (40.000 g Sediment)
und als Positivkontrolle 20 µg BBM aus der Schweineniere aufgetragen und im Westernblot mit antiSGLT Serum (SG11-A, Alpha Diagnostic, San Antonio, USA) analysiert.
Im Westernblot [Abb. 7-2] war das SGLT1 Protein als Bande bei 75 kD in der Probe der
BBM-Vesikeln aus der Schweineniere (Spur A) und in der Plasmamembranfraktion der LLCPK1 Zellen (Spur C) zu erkennen. In der Proteinprobe der Kernfraktion der LLC-PK1 Zellen
(Spur B) war keine Reaktion mit dem anti-SGLT1 Serum feststellbar. Somit konnte eine
stärkere Kontamination der Zellkernfraktion mit Plasmamembranen ausgeschlossen werden.
99
Anhang
7.3 Stabilität der Kernfluoreszenz bei GFP-pRS1 Zellen nach Behandlung mit Triton
Die Stabilität der subzellulären Verteilung des GFP-pRS1 Proteins in den LLC-PK1 Zellen
wurde durch die Inkubation mit einem Detergenz überprüft. Auf diese Weise sollten
Informationen über die Art und Stärke der Interaktion des GFP-pRS1 Proteins in der Zelle
gewonnen werden.
Dazu wurden die Zellen 4 min bei 4°C in PBS mit 0,1 % Triton-100 auf einem
Taumelschüttler inkubiert und anschließend in PBS umgepuffert.
0 % Triton-100
0,1 % Triton-100
Abb. 7-3 Fluoreszenzbild: Stabilität der Kernfluoreszenz der pEGFP-RS1 LLC-PK1 Zellen nach
Inkubation in 0,1 % [v/v] Triton-100
Die GFP-pRS1 stabil exprimierenden Zellen wuchsen auf Deckgläschen und wurden bei 4°C 4 min
mit 0,1 % [v/v] Triton-100 in PBS auf einem Taumelschüttler inkubiert und anschließend in PBS
umgepuffert und sofort mikroskopiert.
Nach der Inkubation in 0,1 % Triton-100 war die vorher deutlich sichtbare zytoplasmatische
Lokalisierung des GFP-pRS1 verschwunden [Abb. 7-3]. Das Kernsignal des GFP-pRS1
hingegen blieb auch nach der Triton-100 Behandlung unverändert und konnte nicht aus den
Zellkernen extrahiert werden. Dieser Befund verdeutlichte die Unterschiede bei der
Interaktionen des GFP-pRS1 im Zytosol und im Zellkern. Während die Tritonbehandlung die
zytosolische Lokalisierung aufhob, eventuell durch ein Ausfließen des löslichen GFP-pRS1 in
Folge der Zerstörung der Plasmamembran, deutete die resistente Kernlokalisierung auf eine
stärkere Interaktion des GFP-pRS1 mit Bestandteilen im Kerninneren hin.
7.4 Beobachtungen zur Regulation der Kernlokalisierung des GFP-pRS1(AS 1-581)
Nach der Trunkierung des pRS1 um 42 AS am C-Terminus und Fusion mit GFP waren
Zellen mit und ohne Kernfluoreszenz zu beobachten (4.3). Die Ursache hierfür könnte
vielleicht im Zellzyklus verborgen liegen.
100
Anhang
Abb. 7-4 Konfokale Laserscan-Aufnahmen: GFP-RS1 (AS 1-581) exprimierende Zellen
Die LLC-PK1 Zellen wurden 24 h nach Transfektion mit pEGFP-pRS1(AS 1-581) mit 4% [v/v]
Paraformaldehyd in PBS-Puffer fixiert und mit dem konfokalen Laserscan-Mikroskop bei
Blaulichtanregung betrachtet.
Bei Zellen, die sich augenscheinlich unmittelbar nach einer Zellteilung befanden, blieben die
Zellkerne fluoreszenzfrei [Abb. 7-4]. Es ist somit vorstellbar, dass die Kernlokalisierung des
pRS1 von der Zellzyklus abhängigen Expression bzw. Aktivität noch unbekannter Faktoren
mit beeinflusst wird.
7.5 Expression des pRS1 (AS 1-512) in HEK Zellen
Um auszuschließen, dass die fehlende Kernlokalisierung des trunkierten GFP-pRS1 (AS 1523) durch die Fusion mit GFP beeinflusst wurde [Abb. 4-17, -19], wurde ein C-terminal
trunkiertes pRS1-Protein transient exprimiert und die Kernlokalisierung im anti-RS1
Westernblot untersucht. Dazu wurde das vollständige und ein trunkiertes pRS1-Gen (kodierte
AS 1–512) in den pRc/CMV Vektor ligiert. Vorversuche zeigten, dass die transiente
Expression in HEK Zellen größer als in LLC-PK1 Zellen war.
Das pRS1-Protein ließ sich nach Transfektion in HEK-Zellen exprimieren und konnte im
Zellhomogenat bei 100 kD auf der Höhe des pRS1-Proteins aus Nieren-BBMs detektiert
werden [Abb. 7-5, Spur 1 und 2]. In der Zellkernfraktion (Spur 3) war das vollständige pRS1
(100 kD) und verschiedene Abbauprodukte in geringerer Konzentration ebenfalls vorhanden.
Das trunkierte pRS1 (AS 1-512) konnte nach Transfektion im HEK-Zellhomogenat als Bande
bei 80 kD erkannt werden [Abb. 7-5, Spur 4]. In der Zellkernfraktion war das trunkierte
pRS1-Protein hingegen nicht feststellbar (Spur 5).
Somit konnte gezeigt werden, dass die Trunkierung des pRS1 am C-Terminus um 111 AS die
Kernlokalisierung auch unabhängig von der GFP-Fusion behinderte.
101
Anhang
MW
111 kD –
1
2
3
4
5
80 kD –
61 kD –
49 kD –
36 kD –
Spur 1: 20 µg Schweinenieren BBM (Positivkontrolle)
Spur 2: 20 µg HEK-Zellhomogenat mit exprimiertem pRS1 (vollständig)
Spur 3: 20 µg Zellkerne aus HEK-Zellen von Spur 2
Spur 4: 20 µg HEK-Zellhomogenat mit exprimiertem pRS1 (AS 1-512)
Spur 5: 20 µg Zellkerne aus HEK-Zellen von Spur 4
Abb. 7-5 Störung der Kernlokalisierung des pRS1 nach C-terminaler Trunkierung um 111 AS
HEK-Zellen wurden mit pRc/CMV-pRS1(AS 1-623) bzw. pRC/CMV-pRS1 (AS 1-512) transfiziert und
nach 48 h lysiert und anschließend mittels differenzieller Zentrifugation fraktioniert. Die
Zellkernfraktion (1.200 g Sediment) wurde in 0,5 % [v/v] Igepal gewaschen. Der Westernblot wurde
mit affinitätsgereinigtem anti-RS1 Serum 33IV analysiert.
7.6 In vivo Phosphorylierung des GFP-pRS1-Proteins
Die Frage nach einer möglichen in vivo Phosphorylierung des pRS1 war aufgrund bis dato
fehlender Aufreinigungsmöglichkeiten des pRS1 schwierig. Weil mit dem polyklonalen antiGFP Serum (Clontech) eine Immunpräzipitation (IP) des GFP-pRS1 möglich war [Abb. 7-6,
Spur 2] wurde die Phosphorylierung in den GFP-pRS1 exprimierenden Zellen untersucht.
M 1 2
3
MW
94 kD –
67 kD –
43 kD –
20 kD –
M: Größen-Marker
Spur 1: Zellhomogenat vor IP (8 µg)
Spur 2: Immunpräzipitat (IP)
Spur 3: Zellhomogenat nach IP (8 µg)
Abb. 7-6 Silbergefärbtes PAA-Gel: Immunpräzipitation des GFP-pRS1 Proteins
LLC-PK1 Zellen, die GFP-pRS1 stabil exprimierten, wurden lysiert und nach 5 min bei 1.200 g wurde
der Überstand (Homogenat) mit anti-GFP Serum (Clontech) inkubiert und mit Protein A-Sepharose
präzipitiert. Das Präzipitat wurde gewaschen und in Laemmli-Puffer denaturiert.
102
Anhang
Das Immunpräzipitat aus dem Zellhomogenat der GFP-pRS1 exprimierenden LLC-PK1
Zellen enthielt das GFP-pRS1 Protein, welches entsprechend seinem Molekulargewicht bei
130 kD lief [Abb. 7-6, Spur 2].
Nach Inkubation der GFP-pRS1 exprimierenden Zellen für 16 h mit
32
Phosphat und
anschließender Immunpräzipitation aus dem Zellhomogenat mit dem anti-GFP Serum konnte
jedoch kein autoradiographisches Signal des GFP-pRS1 im SDS-PAGE erkannt werden [ohne
Abb.].
7.7 Anti-RS1 Seren
Für die Nachproduktion von weiteren anti-RS1 Seren wurden die Kaninchen Nr. 74 und 75
mit aufgereinigtem rekombinanten pRS1-Protein durch subskapuläre Injektionen immunisiert.
Vom Serum der ersten Blutentnahme nach Beendigung des Immunisierungszyklus wurde der
Titer gegen das rekombinante pRS1-Protein im ELISA bestimmt
Tier 74
Tier 75
Verdünnung
Verdünnung
Offenes Symbol: Nullserum geschlossenes Symbol: 1. Blutung
Abb. 7-7 ELISA: Titerbestimmung der Seren 74I und 75I gegen das rekombinante pRS1-Protein
Eine Mikrotiterplatte wurde mit dem rekombinanten pRS1-Protein beschichtet und mit einer
Verdünnungsreihe der entsprechenden Seren inkubiert. Nach Zugabe von anti-Rabbit IgG-Alkalische
Phosphatase und Para-Nitrophenylphosphat entwickelte sich eine Gelbfärbung, die im ELISA-Reader
gemessen werden konnte.
Die Nullseren der Tiere 74 und 75 zeigten im ELISA [Abb. 7-7] nur eine sehr schwache
Reaktion. Die Seren der ersten Blutabnahme hingegen reagierten heftig. Beim Serum 74I
konnte bei einer Verdünnung des Serums von 1 : 28.000 und beim Serum 75I bei Verdünnung
von 1 : 25.000 die halbmaximale Extinktion im ELISA nach 20 min gemessen werden.
103
Anhang
Nach der Affintätsreinigung am rekombinanten pRS1 wurde das Serum 75I im Westernblot
getestet. Als Positivkontrolle wurden Schweinenieren-BBMs [Abb. 7-8] eingesetzt.
Schweinenieren
BBM (µg)
20
10
5
MW
rek. pRS1
(pg)
90 180 360
118 kD 85 kD 61 kD Abb. 7-8 Westernblot: Test des Serums 75I
Die Proteine wurden im Laemmli-Puffer denaturiert und im SDS-PAGE aufgetrennt. Der Blot wurde
mit affinitätsgereinigtem anti-RS1 Serum 75I analysiert.
Das affinitätsgereinigte anti-pRS1 Serum 75I reagierte im Westernblot bei 100 kD [Abb. 7-8]
sowohl mit dem pRS1-Protein aus den Nieren-BBMs als auch mit dem rekombinanten pRS1Protein.
7.8 Die RS1 knock-out Maus
Zur Klärung der physiologischen Bedeutung des RS1 war eine RS1 knock-out Maus
geschaffen worden (Baumgarten, 1999). Diese Maus wird zur Zeit von Christina Track
untersucht. In Anlehnung an die Ergebnisse der pRS1 anti-sense Strategie in LLC-PK1 Zellen,
die zur Steigerung des SGLT1-Expression führten (Korn, 1999), wurde auch in den RS1
knock-out Mäusen die Expression des SGLT1-Proteins überprüft. Im Westernblot [Abb. 7-9]
konnte jedoch kein signifikanter Unterschied in der Expressionsstärke der SGLT1-Proteine
zwischen Wildtyp und RS1 knock-out Maus erkannt werden.
Die breiten SGLT1-Banden bei 60 kD waren im Wildtyp und der RS1 knock-out Maus
sowohl beim Auftrag von 15, 10 und 5 µg Nierenmembranen jeweils gleich stark. Im
Gegensatz zu den Erwartungen aus den pRS1 anti-sense LLC-PK1 Zellklonen war bei der
RS1 knock-out Maus keine Steigerung der SGLT1-Konzentration in den Nierenmembranen
feststellbar.
104
Anhang
15 µg
10 µg
5 µg
WT KO WT KO WT KO
182 kD –
115 kD –
84 kD –
62 kD –
51 kD –
38 kD –
26 kD –
WT: Wildtyp
KO: RS1 knock-out
Abb. 7-9 Westernblot: Vergleich der SGLT1-Konzentrationen in der Niere
der Wildtyp- und RS1 knock-out Maus
Nieren aus jeweils gleichgeschlechtlichen und gleichalten Tieren wurden homogenisiert und mittels
differenzieller Zentrifugation wurde eine Fraktion angereicherter Plasmamembranen (40.000 g)
gewonnen. Der Westernblot wurde mit affinitätsgereinigtem anti-SGLT1 Serum 187VI analysiert.
105
Anhang
7.9
Abkürzungsverzeichnis
AMG
alpha-Methyl-D-Glucopyranosid
APS
Ammoniumpersulfat
AS
Aminosäure
ATP
Adenosin-5 ‘-triphosphat
BBMV
Bürstensaummembranvesikel
BES
N,N-Bis-(2-hydroxyethyl)-2-amnino-ethansulfonsäure
bp
Basenpaare
BSA
Rinderserumalbumin
cAMP
zyklisches Adenosion-monophosphat
DEPC
Diethylpyrocarbonat
DMEM
Dulbecco`s modified Eagle`s medium
DMSO
Dimethylsulfoxid
DNA
Desoxyribonukleinsäure
DPBS
Dulbeccos PBS
ds
doppelsträngig
ECL
Enhanced chemoluminescence
EDTA
Ethylen-N‘ ‚N‘, N‘ ‚N‘ -tetraessigsäure
EGTA
Ethylglykol-bis-(2-aminoethyl)-tetraessigsäure
ELISA
enzyme linked immunosorbent assay
FCS
Fetales Kälberserum
g
Erdbeschleunigung oder Gramm
GPDH
Gycerinaldehydphosphat-Dehydrogenase
GFP
Green fluorescent protein
GTP
Guanosin-5‘ -triphosphat
HEPES
4-(2-Hydroxyethyl)-piperazin- 1 –ethansulfonsäure
IPTG
Isopropyl-ß-D-l -thiogalactopyranosid
kb
Kilobasen
kD
Kilodalton
ko
knock-out
Km
Michaelis Menten Konstante
kRS1
Kaninchen RS1
kSGLT1
Kaninchen SGLT1
Lsg.
Lösung
M
Molar
mRNA
Messanger Ribonukleinsäure
mRS1
Maus RS1
mSGLT1
Maus SGLT1
OD
Optische Dichte
PAA
Polyacrylamid
106
Anhang
PAGE
Polyacrylamid-Gelelektrophorese
PBS
Phosphate buffered saline
PCR
Polymerase chain reaction
PMSF
Phenylmethylsulfonylfluorid
POX
Meerettichperoxidase
pRS1
Schwein RS1
pSGLT1
Schwein SGLT1
RNA
Ribonukleinsäure
RNase
Ribonuklease
rpm
Umdrehungen pro Minute
rRS1
Ratten RS1
rSGLT1
Ratten SGLT1
RS1
Regulatory Subunit 1
RT
Raumtemperatur
RT-PCR
Reverse transcriptase Polymerase chain reaction
SDS
Sodiumdodecylsulphate
SGLT1
Sodium-Glucose Kotransporter 1
spez.
speziell
sRS1
Schaf RS1
sSGLT1
Schaf SGLT1
SSC
Salines Sodiumcitrate
TCA
Trichloressigsäure
TEMED
Tetramethylethylendiamin
Tris
Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan
tRNA
Transfer-Ribonukleinsäure
TTP
Thymidin-5 ‘-phosphat
UE
Untereinheit
UTP
Uridin-5 ‘-phosphat
Vmax
Maximale Reaktionsgeschwindigkeit
Vol
Volumen
v/v
Volumen pro Volumen
w/v
Gewicht pro Volumen
WT
Wildtyp
z.B.
zum Beispiel
107
Anhang
7.10 Lebenslauf
NAME:
GEBURTSDATUM:
GEBURTSORT:
NATIONALITÄT:
Thomas Kühlkamp
24.02.1967
Münster
deutsch
seit 6.2001
wissenschaftlicher Angestellter der Universität Düsseldorf
bei Prof. Häussinger
SFB 575 Experimentelle Hepatologie
7.1997 bis 10.2000
wissenschaftlicher Mitarbeiter und Doktorand am Anatomischen Institut I
der Universität Würzburg bei Prof. Dr. H. Koepsell
10.1991 bis 3.1997
Biologie-Studium an der Universität Münster (Westf.)
Vordiplom: 22.09.93
Diplomarbeit am Mikrobiologischen Institut
bei Prof. Dr. H. Pape
Thema: Stoffwechsel von Maltooligosacchariden in Actinoplanes
Diplom: 27.03.1997
8.1988 bis 1.1991
Ausbildung zum Bankkaufmann bei der Stadtsparkasse Münster
Lehrbrief: 21.01.1991
1.07.1987 bis 30.07.1988
Grundwehrdienst bei der Luftwaffe in Goslar und Delmenhorst
1977–1987
Gymnasium Kinderhaus in Münster
Abitur: 26.05.1987
1973-1977
Grundschule Kinderhaus
108
Danksagung
Verschiedene Personen haben mit zum Gelingen dieser Arbeit beigetragen, deren Hilfe ich an
dieser Stelle würdigen möchte.
An erster Stelle danke ich Prof. Dr. H. Koepsell für sein Vertrauen, das Thema und die
Möglichkeit, verschiedenste Methoden der modernen biomedizinischen Forschung zu
erlernen. Sein hohes Engagement, die intensive Betreuung und die kritischen Durchleutungen
waren für mich ein steter Ansporn.
Prof. Dr. U. Scheer hat sich dankenswerter Weise bereit erklärt, die Arbeit zu begutachten.
Die Zusammenarbeit mit Dr. Robert Hock ermöglichte mir die Nutzung des konfokalen
Laserscan-Mikroskops. Für sein Interesse und die konstruktiven Vorschläge möchte ich Herrn
Hock besonderes danken.
Der praktische Einstieg in das Thema wurde mir besonders von Dr. Ulrich Karbach
erleichtert, der mir ein aufmerksamer und kritischer Ratgeber war.
Die Zusammenarbeit mit Katharina Baumgarten war besonders erkenntnisreich und bildete
einen wichtigen Grundstock für meine weiterführenden Experimente.
Christina Track lernte ich aufgrund ihrer praktischen Kompetenz und Hilfsbereitschaft
besonders schätzen.
Zur Klärung molekularbiologischer Fragestellungen war Dr. Valentin Gorboulev für mich
eine große Hilfe.
Für die vielen Tipps und Ratschläge nicht nur in wissenschaftlicher Hinsicht bin ich Irina
Schatz und Dr. Aida Akhundova besonders dankbar. Herr Michael Christoph danke ich für
seine Geduld bei der Lösung vieler Probleme am Computer und seine umgängliche Art.
Mein Laborkollege Marco Elfeber bewies mir mit Humor, dass Spaß an der Arbeit und Erfolg
in der Forschung gut zusammenpassen.
Auch wenn ich nur kurz die Gelegenheit hatte, Dr. Andreas Schmidlin kennenzulernen, so
war er ein Kollege, den ich mir schon eher gewünscht hätte. Sein unerwarteter Tod hat mich
sehr nachdenklich gemacht.
Zum Schluss möchte ich mich bei allen Anderen der Arbeitsgruppe bedanken, die mir alle
gute Kollegen waren und so dazu beigetragen haben, dass ich mich gerne an die Zeit am
Anatomischen Institut in Würzburg erinnern werde. Vielen Dank!
109
Erklärungen
Hiermit erkläre ich, dass ich die Dissertation selbstständig angefertigt habe und keine anderen
als die von mir angegebenen Quellen und Hilfsmittel benutzt habe.
Weiter erkläre ich, dass ich die Dissertation weder in gleicher noch in ähnlicher Form bereits
in einem anderen Prüfungsverfahren vorgelegt habe.
Ich habe früher keine akademischen Grade erworben oder zu erwerben versucht.
110
111

Rechnen mit Notizen 60 min / 20 Punkte

PDF downloaden

5.2 Eindampfung und Verdampfung

PDF downloaden

finden Sie weitere Informationen!!!

TEU 411, TEU 411-Ex Vierleiter-Messumformer für - Abb

Informationsabend - Energieheilpraxis

Reparatur EMCO compact5 CNC

Benutzerhandbuch - faesser

PDF downloaden