1 T i t l e 2 O s t e o g e n e s i so fc r y o p r e s e r v e do s t e o g e n i cm a t r i xc e l ls h e e t s 3 4 Authors 5 1,S 剖 1 ) , ManabuAkahane2,l TomoyukiUeha1 ,l AkiraKidol h o h e iOmokawa , ) 1Yasunori TakamasaS h i m i 6 1 l l K o b a t a , ) 1K e i i c h iM u r a t a , Ke 吋iKawate3 , Y a s u h i t oT a n a k a1 ) . 7 8 A f f i l i a t i o n s 9 1 )D e p a r t m e n to f O r t h o p e d i cS u r g e r y , NaraM e d i c a lU n i v e r s i t y , K a s h i h a r a/N a r a6 3 4・8 5 2 2, J 叩a n . 10 2 )Dep ぽ 出l e n to fP u b l i cH e a l t h ,HealthManagementandPolicy ,NaraMedicalU n i v e r s i t yS c h o o lo f 11 M e d i c i n e , K a s h i h a r a/Na r a6 348 5 2 1, J a p a n . 12 3 )Depぽ 出l e n to fA r t i f i c i a lJ o i n ta n dR e g e n e r a t i v eM e d i c i n e ,NaraMedicalU n i v e r s i t y ,Kashihara/Na r a 13 6 3 4 8 5 2 2, J a p a n . ・ 14 15 C o r r e s p o n d i n ga u t h o r ; 16 TakamasaS h i m i z u , M.D. 17 Depぽ 加l e n to fO r t h o p a e d i cS u r g e r y , NaraM e d i c a lU n i v e r s i t y 18 8 4 0S h i j o・c h o, K a s h i h a r a , Nara6 3 4 ・・8 5 2 2, J a p姐 19 T e l :+ 8 1・7 4 4・22・3 0 5 1 ;F a x :+8ト7 44 ・2 5・6 4 4 9 20 E m a i l :t ks h i m i( a ) ,n a r a m e d u . a c .i n 園 21 1 22 I n t r o d u c t i o n 23 i d e l yu s e df o rb o n e Bonem a r r o w d e r i v e dmesenchymals t e mc e l l s(BMSCs)h a v ebe巴nw 24 t i s s u er e g e n e r ぽi o n .Wi 也 r a p i da d v a n c e m e n t si nt i s s u ee n g i n e e r i n g( T E ),s k e l e t a ld i s e a s e si n c l u d i n g 25 a r 仕r r i t i s ,bon巴 tumorsando s t e o n e c r o s i s,h a v eb e e ns u c c e s s f u l l yt r e a t e du s i n gt i s s u ee n g i n e巴r e db o n e 26 3A (TEB)c o m b i n e dw i t hBMSCS.I tp r e s e n t , p r e p a r a t i o no fTEBw i t hBMSCsr e q u i r 巴ss e v e r a lweeksf o r 27 c u l t i v a t i o nt op e r m i tBMSCe x p a n s i o nandc o l o n i z a t i o ni n t os c a f f o l d s, s u c ha sh y d r o x y a p a t i t e( H A ) . 4 9I n 28 m組 yc a s e s, p r o l o n g e dTEBp r e p a r a t i o nt i m e sl i k e l ya f f e c ts u r g e r yp l a n n i n gowingt ot 加l i n gd i f f i c u l t i e s . 29 ,i nsomec a s e smaking Evenp l a n n e de l e c t i v es u r g e r i e sa r eo f t e np o s t p o n e db e c a u s eo fp a t i e n th e a l t h 30 p r e p r e p a r e dTEBu n u s a b l e .Con 仕o l l e dt i m i n gf o rc r e a t i o no fTEBi s也e r e f o r eo fc r i t i c a li m p o r t a n c ef o r 31 i t sl a r g e s c a l ec l i n i c a lu s e . 32 Asc r y o p r e s e r v a t i o nt e c h n o l o g yh a sa d v a n c e d , 1 0 , 1 1c r y o p r e s e r v e dc e l l sa r ee x p e c t e dt obecome 33 ap r o m i s i n gc e l ls o 町 c ei nr e g e n e r a t i v em e d i c i n e .S u c c e s s f u lc r y o p r e s e r v a t i o no fBMSCs p r i o rt o 34 5, i m p l a n t a t i o ni sw e l ldocumentedb o t hp r e c l i n i c a l l y l 2 1 4a n di nt h ec l i n i cI 1 6 .I nf a c t , t h ec r y o p r e s e r v a t i o n 35 a n dt h a w i n gp r o c e s si sr e p o r t e dt or e s u l ti nl e s sdamageonb o t hp r o l i f e r a t i o na n dd i f f e r e n t i a t i o no f 36 0 BMSCscomparedw i t hn o n c r y o p r e s e r v e dBMCSS.1 , 1 5,1 6D e s p i t et h e s er e p o 巾, i ti ss t i l luncommont o 37 si s白a tBMSCsa r eu n a b l et od i f f e r e n t i a t e c r e a t eTEBu s i n gc r y o p r e s e r v e dBMSCs.Oner e a s o nf o r白i 38 s p o n t a n e o u s l yi n t oo s t e o b l a s t swhenc u l t u r e di nb a s i cc u l t u r emediai nv i t f ・ 0 ; 1 6,1 7t h e r e f o r e, c r y o p r e s e r v e d 39 6 BMSCsr e q u i r ea d d i t i o n a lf a c t o r sd u r i n gc u l t i v a t i o na 武e rt h a w i n g .1 40 Wep r e v i o u s l yd e v e l o p e dan o v e lc e l l回 n s p l a n t a t i o nt e c h n i q u ef o rbonef o r m a t i o nu s i n g 41 8, BMSCsi na b s e n c eo fas c a f f o l d .1 1 9BMSCsw e r ec u l t u r e di nmediumc o n t a i n i n gd e x a m e t h a s o n e(D巴x ) 42 a n da s c o r b i ca c i dp h o s p h a t e( A s c P ), a n dw巴r el i f t e da ss i n g l ec e l ls h e e t s( d e s i g n a t e do s t e o g e 凶 cm a t r i x 43 c e l ls h e e t s :OMCSs)w i t hh i g ho s t e o g e n i cp o t e n t i a . lOMCSscombinedw i t hHAr e s u l t 巴di ne x t e n s i v e 44 bonef o r m a t i o ni nV i V O , 1 8,1 9s u p p o r t i n gt h eu s eo ft h i smethodf o rh a r dt i s s u er e c o n s t r u c t i o n .T h i ss t u d y 45 a i m e dt od e t e r m i n ew h e t h e rc r y o p r e s e r v e dOMCSscombinedw i t hHAc o n s 仕u c t s,m a i n t a i ns u f f i c i e n t 46 o s t e o g e n i cp o t e n t i a la f t e ri nv i v o凶 n s p l a n t a t i o n ,whichcoulds i g n i f i c a n t l yi m p a c tonr e d u c e dTEB 47 p r e p a r a t i o nt i m e si n也ec l i n i c . 48 49 M a t e r i a l sandmethods 50 Bonemarrowc e I Ip r e p a r a t i o n 2 51 Themethodo fb o n em創 TOWc e l lp r e p a r a t i o nh a sb e e nr e p o r t e dp r e v i o u s l y . 戸 町 民 19B r i e f l y , b o n e 52 marrowc e l l sw e r eo b t a i n e d企omt h ef e m u rs h a f t sof7w e e k o l dm a l eF i s c h e r3 4 4r a t s .B o t he n d so f t h e 53 i f 巴m urw e r ec u taway企omt h ee p i p h y s i sa n d也eb o n em紅 TOWwasf l u s h e do u tu s i n g1 0mlo fs t a n d a r d 54 c u l t u r emediume x p e l l e d企omas y r i n g et h r o u g ha2 1・g a u g en e e d l e .S t a n d a r dc u l t u r emediumc o n s i s t e d 55 o f m i n i m a le s s e n t i a lmedium(ME M;N a c a l a iT e s q u e, K y o t o, J a p a n )c o n t a i n i n g15%f e t a lb o v i n es e r u m 56 (FBS,凪H B i o s c i e n c eI n c .,Lenexa ,KS ,USA)a n da n t i b i o t i c s( 1 0 0U/mlp e n i c i 1 1 i na n d100μg 泊1 57 s t r e p t o m y c i n , Na c a l a iT,田 q u e ) . 58 H a r v e s t e dc e l l sw e r e仕 組s f e r r e di n t ot w oT・7 5f l a s k s(BDF a l c o n ;BDB i o s c i e n c e s, F r a n k l i n 59 L a k e s, NJ , USA)c o n t a i n i n g1 5mlo fs t a n d a r dc u 1 t u r em巴d i u m .C e l lc u l t u r e sw e r em a i n t a i n e di na95% 60 h u m i d i f i e da t m o s p h e r ew i t h5%CO2 a t3 70C .A f t e rr e a c h i n gc o n f l u e n c e,c u 1 t u r e dc e l l sw e r er e l e a s e d 61 企omt h ec u l t u r es u b s t r a t u mu s i n g仕ypsinlEDTA( G i b c o ,I n v i t r o g e n ,C a r l s b a d ,CA , USA). 62 63 C e l ls h e e tp r e p a r a t i o nandc r y o p r e s e r v a t i o n 64 Thec e l ls h e e tp r e p a r a t i o nme 出o dh a sb e e np r e v i o u s l yr e p o r t e d .18,19B r i e f l y , BMSCsr e l e a s e d 65 2i u s i n g甘ypsinlEDTA ,weres e e d e da t1 x 1 04 c e l l s / c m n1 0cmd i s h e s( 1 0 0x2 0mm;BDF a l c o n )f o r 66 s u b c u l t u r ei ns t a n d a r dc u l t u r emediumc o n t a i n i n g1 0凶1:Dex( S i g m a ,S t .L o u i s,M O,USA)a n d82μg/ml 67 幽出c o r b i ca c i dp h o s p h a t emagnesiums a l tn h y d r a t , 巴 WakoP u r eC h e m i c a lI n d u s 仕i 巴s ,K y o t o, AscP( L 68 J a p a n )u n t i lc o n f l u e n tOMCSsw e r ef o r m e d( a p p r o x i m a t e l yd a y1 4 ) .C e l l sw e r er i n s e dt w i c ew i t h 69 p h o s p h a t e b u f f e r e ds a l i n e( p BS;G i b c o )佃 dt h eOMCSsw e r el i f t e du s i n gas c r a p e r . OMCSsw e r e 70 d i v i d e di n t o3 g r o u p sa c c o r d i n gt os t o r a g ep e r i o do fc r y o p r e s e r v a t i o n ;企e s hg r o u p( 企e s h ) ,4・week 71 c r y o p r e s e r v a t i o n( 4 ・w e e k )佃 d 1 2・weekc r y o p r e s e r v a t i o n( 1 2・w e e k )g r o u p s .F o rc r y o p r e s e r v a t i o n , 72 OMCSsw e r ep i c k e dupu s i n gt w e e z e r s,由e np l a c e di n t o企e e z i n gt u b e s( 1OMCS/tube,2mlc r y o g e n i c 73 ⑧ ,J 吋iF i e l d ,I n c .,Tokyo,J a p a n ) . v i a l ;BDF a l c o n )c o n t a i n i n g500μ1o fc e l lf r e e z emedium( C e l lB a n k e r1 74 The企e e z emediumwass o u r c e dc o m m e r c i a l l y ,t h e r e f o r et h ec r y o p r o t e c t i v ea g e n t(CPA)c o n c e n 仕a t i o n 75 Iandco凶 … n叫 c l o s e d ,偲郎吋 c 印 叫 吋 叩 戸 p 巴 吋 叩 t 巾 帥 刑 仙 巾 州 仰 お r 巾 伽 叩 判 叫 担 即 叫 山伽 c 凶 l 凶 l 仙 u 田 叫 s s 76 T u b e swe 釘r e也e 叩n仕 叩s f 島 i e 町e 吋 d t ω oa企 f r e e z e r 川 ( 同8 別O O C )w i t h o u tp r o g r a r n m e d企e 巴 z i n g s 針t 巴 叩 p s阻 ds 坑t o ぽr 巴 吋 d 77 瓜 a t幽 必 8 00Cf o r牛 4 醐o 町r1 2w e e k s .C r 巧 y 羽 o 戸 p r e 白s 巴 ぽ rvedO お MCSsw e r er a p i d l yt h a w e da troomt e m p e r a 旬r ea n dr i n s e d 78 t w i c ew i t hPBSp r i o rt os u b s e q u e n te x p e r i m e n t a t i o n .T e m p e r a t u r ec h a n g e so fc e l l企e e z emediumi n 79 f r e e z i n gt u b ew e r em e a s u r e dw i t hat h e r m o m e t e rs e n s o r(CENTER3 7 0RTDt h e r m o m e t e r ;C e n t e r ロ 園 3 80 T e c h n o l o g yGroup, T a i w a n ) .Thes e n s o rwasi n s e r t e dt oc r y o p r e s e r v a t i o nmedium白r o u g hah o l emade 81 ont h ec r y o v i a lc a p, t h e n血et e m p e r a 加r ec h a n g ewasr e c o r d e dd 町加gt h ec r y o p r e s e r v e da n dt h a w i n g 82 p r o c e s s . 83 84 H i s t o l o g i cE x a m i n a t i o n(OMCS) 85 F o l l o w i n ga d d i t i o n a lc u l t u r ef o r24h o u r si n1 0cmd i s h e sc o n t a i n i n g1 0mlo fs t a n d a r dc u l ω r e 86 medium ,t h r e eOMCSsw e r ef i x e di n 10%f o r m a l i nn e u t r a lb u f f e r e ds o l u t i o n(WakoP u r eC h e m i c a l 87 I n d u s 仕i e s, L t d ., Osaka , J a p a n )f o r2d a y sa n dembeddedi np a r a f f i na n dc u tp a r a l l e la tt h emid d 1 ep r i o rt o 88 s t a i n i n gw i t hh e m a t o x y l i na n de o s i n伺 &E)f o r1 i 位tm i c r o s c o p i co b s e r v a t i o n . 89 90 C e l lV i a b i l i t yA s s a y 91 Toi n v e s t i g a t et h ev i a b i 1 i t yo ft h eOMCSsb e f o r ea n da f t e r企e e z i n g ,amethodb a s e do n 92 t e t r a z o l i u mr e d u c t a s ea c t i v i t y( C e l lC o u n t i n gK i t 8 @ ; WST-8,D o j i n d o,Kumamoto,J a p a n )w a s 93 e m p l o y e d ? OB r i e f l y ,OMCSsw巴r ec u 1 t u r e dw i t h6 ,・ 1 2 ,・ 24・and48w e l lp l a t e s( F a l c o n ;n=6p e rp l a t e ) 94 n w e r eu s e dt og e n e r a t eas t a n d a r d .Thed i f f e r e n ts i z e so fOMCSsw e r eh a r v e s t e dw i t has c r a p e ra n d白e 95 i n c u b a t e di na95%h u m i d i f i e da 伽lOs p h e r ew i t h5%CO2a t3 70Cf o r24h o u r s .Thes a m p l e sw e r ep l a c e d 96 i nWST-8s o l u t i o n( 1 0 0 μ 1i n1mlo fc u l t u r e dmedium)i nt h ec u l t u r ew e l l s .A丘町 3h o u r so fi n c u b a t i o n , 97 t h es o l u t i o no b t a i n e d企ome a c hc u l t u r ew e l lwasm e a s u r e dbyas p即 位o p h o t o m e t 巴r ( 4 5 0n m ) .Fromt h 巴 98 r e s u l t so ft h e s es t a n d a r d i z a t i o ne x p e r i m e n t s,al i n e a rr e l a t i o n s h i pwaso b t a i n 巴db e t w e e n也 巴 a v e r a g e d 99 o p t i c a ld e n s i t y(OD)a n ds e e d e dc e l lnumberpぽ c u l t u r e dmedium( c e l l / m l )( c o r r e l a t i o nR2=0 . 9 7 5 1 ) . 100 u 1 t u r e di nふw e l lp l a t ew e r ea l s oc r y o p r e s e r v e du s i n gt h esamep r o t o c o lf o r4w巴e k s( n = 6 ; OMCSsc 101 4 w e e kg r o u p )組 d1 2w e e k s( n = 6 ;1 2・weekg r o u p )g r o u p s .U s i n g白i ss t a n d a r d ,t h enumbero fv i a b l e 102 e z i n ga n da f t e rt h a w i n g .Thenumbero f v i a b l ec e l l s c e l l sofOMCSsi ne a c hg r o u pwasa n a l y z e db e f o r e企e 103 食e rt h a w i n gwasc a l c u l a t e da s仕l ep e r c e n t a g eo f t h a tb e f o r e企e e z i n g .F o ra l ls p e c i m e n s,出ec e l l 24h o u r sa 104 v i a bi 1 i t yo fs a m p l e swasm e a s u r e da t24h o u r sa f t e ri n i t i a t i o no ft h et h a w i n gp r o c e s s .百l em e a s u r e m e n t 105 f o rt h ec e l lv i a b i l i t ywas血es a m ea sa p p l i e df o rt h es t a n d a r d i z a t i o n . 圃 106 eOMCSswasa l s oa s s e s s e d( n = 1pぽ g r o u p )u s i n g A t t a c h m e n ta n ds u r v i v a lo fc e l l sw i t h i n吐l 107 l i g h tm i c r o s c o p ya n dc o n f o c a l l a s e rm i c r o s c o p y(CLM , Z e i s sLSMAxiov 出 2 00, C a r lZ e i s s, G e r m a n y ) . 108 F o l l o w i n ga d d i t i o n a lc u l t u r ef o r24h o u r si n1 0cmd i s h e s( 1 0 0x2 0mm;BDF a l c o n )c o n t a i n i n g1 0mlo f 4 109 s t a n d a r dc u 1 t u r emedium , v i a b 1 ec e 1 1 sw e r es t a i n e dw i t hg r e e nf l u o r 巴s c e n tCa I c e i nA Md y ea n dd e a dc e 1 1 s 110 w i t hr e df l u o r e s c e n tE t h i d i u m homodimer 寸 d y e(LIVE/DEAD@ V i a b i l i t y / C y t o t o x i c i t yA s s a yK i t , 111 I n v i 甘o g e n )f o 1 1 o w i n gt h em a n u f a c t u r e r ' sp r o t o c o . l 112 113 I m p l a n t a t i o nofHAc o n s t r u c t scombinedw i t hc e l ls h e e t s 114 P o r o u sHAc e r a m i c s(50%a v e r a g ev o i dv 0 1 u m e, 5mmd i a m e t 巴r by2mmt h i c k ,C e 1 1 y a r dHA 115 ,P e n t a xCo,To 防0,J a p a n )w e r eu s e d .B o t hs o l i da n dp o r o u sc o m p o n e n t so f吐l es c a 妊o 1 d s c a f f 0 1 d 116 m i c r o s t r u c 旬r ew e r ei n t e r c o n n e c t e d . OMCSsf r o me a c hg r o u p( f r e s h ,4・ 姐d12-weekg r o u p s )w e r e 117 c o m b i n e dw i t ht h eHAc e r a m i c sj u s ta f t e rs c r a p i n go f fo r也a w i n gt omaket h eHAl OMCSc o n s 甘u c t s . 118 C o n t r 0 1HAc o n s t r u c t sw i t h o u tOMCSsw e r ea 1 s oi n c l u d e d .Eachg r o u pc o m p r i s巴ds i xc o n s 甘u c t s, w h i c h 119 w e r ei m p 1 a n t e ds u b c u t a n e o u s 1 yi n t ot h eb a c ko fr e c i p i e n tr a t s( n = 6HAd i s k sp e rr a t )t oa s s e s st h e 120 凶cp o t e n t i a 1o fc r y o p r e s e r v e dOMCSs. o s t e o g e 121 122 123 R a d i o g r a p h i candh i s t o l o g i c a la n a l y s i so fh a r v e s t e dc o n s t r u c t s F o u rw e e k sa 食 巴ri m p 1 a n t a t i o n ,a 1 1s a m p 1 e sw e r eh a r v e s t e dt oe v a 1 u a t eo s t e o g e n e s i s . τ' w od i s k s 124 企ome a c hg r o u pw e r ef i x e di n10%f o r m a 1 i nneu 回 1b u f f e r e ds 0 1 u t i o n(WakoP u r eC h e m i c a lI n d u s 廿i e s, 125 L t d .,O s a k a ,J a p a n )f o r2d a y sanda n a 1 y z e dr a d i o g r a p h i c a 1 1 y .A f t e rX r a yi m a g e sw e r eo b t a i n e d ,t h e 126 s a m p 1 e sw e r ed e c a 1 c i f i e dw i t hK CXs 0 1 u t i o nσa 1 m aC o ., To 防0 ,J a p a n ), embeddedi np a r a f f ma n dc u t 127 p a r a 1 1 e 1a t也巴 m i d d l ep r i o rt os t a i n i n gw i t hH& E .T her e m a i n i n gd i s k sw e r es t o r e da t・8 00Cu n t i 1a l k a 1 i n e 128 p h o s p h a t a s e(ALP)a c t i v i t ya n do s t e o c a 1 c i n(OC)c o 凶e ntwerem 巴 田 町e d . 圃 開 129 130 B i o c h e m i c a la n a l y s i s 131 A s s a y sf o rALPa c t i v i t ya n dOCc o n t e n tw e r ec a r r i e do u ta c c o r d i n gt oamethodd 巴s c r i b e d 132 p r e v i o u s 1 y . 9B r i e f l y ,eachHAd i s kwasc r u s h e d ,homogenizedi n1m1o f0. 2%N o n i d e tP 4 0 / 5 0m M 133 吐 Tr i 包 s 召C α 1bu 貸b 討r ( 句 pH7 . め 后 め 6 )c o n t a i n i n g1m MMgCαh, a n dc e 阻n t 仕 凶 r i f 白 i 1 伊 9 e d低 a t1 3, 0 OO中 mf お o r1 0m i n u t e s抗 a t40C . 134 Sup 巴ma 幻t a n t ω swer 問 巴 a s s a y e df o rALP邸 a c t i 吋 v i 句 勿' u s i n gp幽引 n 凶i t 仕 r 叩 o p h e n y 1 p h o s p h a t e( p NPP)s u b s 仕a t e .Ana l i q u o t 135 ( 10 μ1)o f也巴 s u p e m a t a n twasa d d e dt o1m10f5 0m MpNPPc o n t a i n i n g1m MMgCba n d白em i x t u r e 136 wasi n c u b a t e df o r30m i n u t e sa t370C .百l e n2m1o f0 . 2NNaOHwasa d d e dt os t o pt h ee n 勾 岨a t i cr e a c t i o n 137 a n d世l ea b s o r p t i o na t410nmwasm e a s u r e dbys p e c t r o p h o t o m e 佐y .ALPa c t i v i t ywasr e p r e s e n t e da s ∞ ∞ “ 5 138 p n i t r o p h e n o lr e l e a s e( I l m o l )p e rHAd i s ka f t e r3 0m i n u t e so fi n c u b a t i o na t37D C . 139 OC担 t h eHAd i s kwase x t r a c t e df r o mt h es e d i m e n to ft h eN o n i d e tP 4 0e x 仕a c tw i t h3mlo f 140 20%f o r m i ca c i df o ra p p r o x 並l a t e l y2weeksa t4D C .Ana l i q u o to f t h ef o r m i ca c i de x t r a c twasa p p l i e dt oa 141 p r e p a c k e dS e p h a d e xG 2 5 column(N AP-25 c o l u m n ; Anl e r s h a mP h a r m a c i aB i o t e c hAB,U p p s a l a , 142 S w e d e n )a n de l u t e dw i t h10%f o r m i ca c i d .Thee l u t e dp r o t e i n企a c t i o n sw e r ec o l l e c t 巴d ,lyophi 1 i z e da n d 143 s u b j巴c t e dt oe n 勾 岨 かl i n k e dimmunoassay( R a to s t e o c a l c i nELISAk i tDS;DSPharmaB i o m a t e r i a lC o ., 144 L t d ., O s a k a , J a p a n )f o rr a tOC.A l le x p e r i m e n t si nt h ep r e s e n ts 印d yw e r ep e r f o r m e di nd u p l i c a t e . 園 145 146 S t a t i s t i c a Ia n a l y s i s ALPa c t i v i t ya n dOCc o n t e n tva 1 u e swer 巴r e p r e s e n t e da sm巴a n土 s t a n d a r dd e v i a t i o n( S D )f o r 147 148 e a c hHAd i s k .S t a t i s t i c a l l ys i g n i f i c a n td i f f e r e n c巴sb e t w e e ne x p e r i m e n t a lg r o u p sw e r ee v a l u a t e du s i n gt h 巴 149 Kru s k a l W a l l i st e s tf o l l o w e dbyap o s thoct e s tw i t hS c h e f f e ' sp r o c e d u r e .V a l u e so fp<0.05 w巴r e 150 c o n s i d e r e ds t ほi s t i c a l l ys i g n i f i c a n t . 151 152 R e s u l t s 153 Temperaturec h a n g e so fc η T o p r e s e r v a t i o n / t h a w i n gp r o c e s s 154 F i g u r e1s h o w st h et e m p e r a 同胞 c h a n g e so f企e e z i n gOMCSw i t hc r y o p r e s e v a t i o nmediumi n 155 企e e z i n gt u b e .I tt o o ka p p r o x i m a t e l y5m i n u t e sf o rc r y o p r e s e v a t i o n企omODCt o・1 5D C( F i g u r el A )a n d 156 a p p r o x i m a t e l y2 . 5m i n u t e sf o rt h a w i n g( F i g u r e1 B ) . 157 158 M a c r o s c o p i ca p p e a r a n c e sandH i s t o l o g i cE x a m i n a t i o n(OMCS) 159 M a c r o s c o p i ca p p e a r a n c eo f由 et h r e eOMCSg r o u p sa f t e r血aw 泊g( f r e s h ,4・week,l2-week 160 g r o u p s ) .The4 -a n d1 2哨 e e kc r y o p r e s e r v e dOMCSsa p p e 紅巳 dl a r g e ri ns i z ecomp紅 e dw i t ht h e企e s h 161 OMCSs( F i g u r e2A ,B,C ) .H i s t o l o g yo fOMCSr e v e a l e dt h a tt h e企e s hOMCSi sf o l d e do v e ra n do v e r 162 r e s u l t si nt h i c ks t r u c 印r eo ft h ec e l ll a y e r .( F i g u r e2 a ) .Ont h eo t h e rhand ,t h es 仕u c 旬r eo fc e l ll a y e r 163 b巴c o m e s白i nw i t ht h ei n c r e a s e dc r y o p r e s e r v a t i o np e r i o da n dt h es h e e ts 仕u c 印r ewasn e a r l ym o n o l a y e ri n 164 血 巴 1 2weekc r y o p r e s e r v e dOMCSg r o u p s( F i g u r e2ba n dc ) . ・ 165 166 Ce I lViabi I i t yAssay 6 167 C e l lv i a b i l i t i e so fOMCSsc r y o p r e s e r v e df o r4・ a n d1 2w e e k sc o m p a r e dt o企e s hg r o u pw e r e 168 61 .0土 9 . 8% a n d5 0 . 5土 7 . 8% ,r e s p e c t i v e l y .F i g u r e3s h o w sr e p r e s e n t a t i v ei m a g e so ft h et h r e eOMCS 169 h ,4・week,1 2weekg r o u p s ) .A l t h o u g has m a l la m o u n to fr e d g r o u p sa f t e rLIVEIDEADs t a i n i n g(合巴s 170 s t a i n i n gwaso b s e r v e d ,r e p r e s e n t i n gd e a dc e l l s, 企e s hOMCSsw e r ep r e d o m i n a n t l yf i l l e dw i t hc l u s t e r so f 171 g r e e nf l u o r e s c e n tv i a b l ec e l l s( F i g u r e3 A :f r e s hg r o u p ) .Numberso fr e ds t a i n e dc e l l si n c r e a s e da f t e rt h e 172 社l a w i n gi nb o t ht h e4・ a n d1 2明 173 1 2weekg r o u p ) .Av e η s i m i l a rc e l ls t a i n i n gpa 仕e r nwaso b s e r v e df o rOMCSsi na l lt h r e eg r o u p s( F i g 町e 174 , B, a n dC ) . 3A 同 e e kc r y o p r e s e r v e dOMCSg r o u p s( F i g u r e3 B :4・weekg r o u pa n d3 C : 圃 175 176 R a d i o g r a p h i candh i s t o l o g i c a la n a l y s i so fh a r v e s t e dc o n s t r u c t s 177 F i g u r e4 s h o w s Xr a yp h o t o g r a p h yo ft h eh a r v e s t e d HA d i s k s .O b v i o u sc a l c i f i c a t i o n 178 s u r r o u n d i n gt h ed i s k swaso b s e r v e di na l le x p e r i m e n t a lg r o u p s( F i g u r e4A ,B,C ) , e x c e p t也ec o n 仕0 1 179 g r o u p( F i g u r 巴4 D ) .TheOMCSt r a n s p l a n t e di nc o n j u n c t i o nwi 血t h eHAd i s k sh a da 1 r e a d yt u r n e dt oah a r d 180 t i s s u ea n dnol o n g e re x i s t e di nt h ef o r mo fas o f ts h e e twhent h eHAd i s k sw e r eh a r v e s t e d . 圃 181 F i g u r e5s h o w sr e p r e s e n t a t i v eh i s t o l o g i c a ls e c t i o n so ft h eh a r v e s t e dc o n s 仕u c t ss t a i n e dw i f u 182 o r e sa n donf u es u r f a c e H&E.Lowa n dh i g hm a g n i f i c a t i o ni m a g e sshowa b u n d a n tb o n ef o r m a t i o ni n也ep 183 o f仕l eHAd i s k si na l le x p e r 加l e n t a lg r o u p s, e x c巴p tt h ec o n 仕0 1g r o u p .O s t e o c y t e sa n do s t e o b l a s t sw e r e 184 o b s e r v e di n仕l eb o n et i s s u ea th i g hm a g n i f i c a t i o n .As i m i l a rb o n ef o r m a t i o npa 伽 r nwaso b s e r v e dおra l l 185 白r e ee x p e r i m e n t a lgroupsσigure5 A / a ,B/ b , 186 s u r f a c eo f f u ec o n 仕0 1g r o u p( F i g u r e5 D / d ) . C / c ) .Nob o n et i s s u ewaso b s e r v e di nt h ep o r e so ra t吐l e 187 188 B i o c h e m i c a la n a l y s i s 189 F i g u r e6s h o w sALPa c t i v i t ya n dOCc o n t e n tf o re a c hg r o u p( F i g u r e6A ,B ) .ALPa c t i v i t yo f 190 吐l e也氏eg r o u p s( 企e s h ,4・week ,1 2哨 e e kg r o u p s )wass i g n i f i c a n t l yh i g h e rf u a nt h ec o n t r o lg r o u p, 191 i n d i c a t i n gah i g hl e v e lo fo s t e o b l a s ta c t i v i t y4w e e k sa 丘 町 田n s p l a n t a t i o n .T h e r ewasnos i g n i f i c a n t 192 4 w e e ka n d1 2weekg r o u p s .OCc o n t e n to f f u et h r e eg r o u p s d i f f e r e n c ei nALPa c t i v i t yb e t w e e nt h e丘町h, 193 wass i g n i f i c a n t l yh i g h e rc o m p a r e dw i f uf u ec o n t r o lg r o u p .However ,OCc o n t e n twasd e c r e a s e dw i t h 194 i n c r e a s e dc r y o p r e s e r v a t i o np e r i o d( P < 0 . 0 5f o r企e s hv s1 2・weekg r o u p ;NSf o rf r e s hv s4 w e e kg r o u pa n d 195 4 w e e kv s1 2 w e e kg r o u p ) . ・ 7 196 197 Di s c u s s i o n 198 Th i ss t u d y demons 仕a t e s 血a tt h 巴 S 仕u c ω r a 1 加t e g r i t yo f OMCSs i sm a i n t a i n e dd u r i n g 199 c r y o p r e s e r v a t i o na n dt h a w i n ga n d由eTEB p r o d u c 巴du s i n gc r y o p r e s e r v e dOMCS s h o w se x t e n s i v e 200 o s t 巴o g e n i ca b i 1 i t y .C r y o p r e s e r v ed / t h a w e dOMCSsw e r ec a p a b l eo f p r o d u c i n gam i n e r a l i z e dma 仕ixonHA 201 s c a f f o l d s .C e l l s1 i k e l ym i g r a t ef r o mt h eOMCSs ,whicha r ei n i t i a l l ywrappeda r o u n dt h eHAs c a f f o l d s, 202 i n t o也巴 s c a f f o l dp o r e swheret h e yb e g i nt oformb o n e .I ti sc l e a rt h a tt h ebonef o r m a t i o ni n仕leHAp o r e s 203 i sd e r i v e d企om也eOMCSd u et ot h ef a c tt h a tnob o n ef o r m a t i o nwaso b s e r v e di ncon 仕0 1g r o u p .Our 204 p r e v i o u ss t u d i e su s i n gS r yg e n ea l s od e m o n s t r a t e dt h en e o n a t a lb o n ef o r m a t i o nw e r ed e r i v e d企om 205 OMCSS.19T h e r e f o r e , t h es i m p l yc r y o p r e s e r v e dOMCSsc o u l db ea p p l i e di nh a r dt i s s u er e c o n s t r u c t i o nt o 206 m i n i m i z ec e l lp r e p a r a t i o nr e q u i r e m e n t sp r i o rt o吐l et i m eo fu s e . 207 Thea p p l i c a t i o no fTEBt oh a r dt i s s u er e c o n s t r u c t i o nc u r r e n t l yr e q u i r e sas t e p w i s ep r o c e s s, 208 i n c l u d i n gc e l li s o l a t i o nandc u l t u r ee x p a n s i o n , s c a f f o l dp r e p a r a t i o n , c e l ls e e d i n go n t o也es c a f f o l dt of o r m 209 ac el l /s c a f f o l dc o n s 仕u c tandi m p l a n t a t i o no ft h ec o n s t r u c ti n t ot h eb o n ed e f e c t .4-9 Manyh a r dt i s s u e 210 r e c o n s t r u c t i o ne l e c t i v es u r g e r i e sr e q u i r ep r e c i s et i m i n gf o rt h ec e l lp r e p a r a t i o nt oc o i n c i d ew i t h仕l e 211 巴r e f o r e ,s h o r t e n i n gt h ec e l lp r e p a r a t i o nt i m ei sc u r r e n t l ya nunmetc l i n i c a ln e e d .A l t h o u g h o p e r a t i o n ;t h 212 p r i o rBMSCc r y o p r e s e r v a t i o ni so n et e c h n i q u et os h o r t e nt h ep r o c e s s, 自 . r r t h e rc u l t i v a t i o nt i m ef o r仕l e 213 t h a w e dBMSCst omaket h ec e l l / s c a f f o l dc o n s 佐u c ti ss t i l lr e q u i r e db e f o r e加 p l a n t a t i o n .12, 1 6C o n s e q u e n t l y , 214 c r y o p r e s e r v e dTEBi saf a v o r a b l es o l u t i o n , 1 3, 2 1 2 4t oe n a b l er a p i dp r e p a r a t i o na n di n l m e d i a t ea p p l i c a t i o no f 215 TEB担 S 町 g e r y .P r e v i o u ss t u d i e sh a v er e p o r t e da na p p r o x i m a t e50%d e t e r i o r a t i o ni nc e l lv i a b i l i t ya f t e r 216 c r y o p r e s e r v a t i o no fTEB.5, 2 1C r y o p r e s e r v a t i o nu s i n gt r a d i t i o n a lm e t h o d smayr e s u l ti n1 0 s so ft i s s u e 217 f u n c t i o na n dv i a bi 1 i t yc a u s e dbys e v e r a lf a c t o r s, o fw h i c hi c ec r y s t a lf o r m a t i o ni nt h ec e l l so rc o n s t r u c t si s 218 也em o s ts i g n i f i c a n t .A d d i t i o n a l l y ,as e c r e t e dex 回 c e l l u l a rma 仕i xm可 p r e v e 凶 t h eCPA企omd i f f u s i n g 219 u n i f o r m 1 yi n t ot h ec e l l s, r e s u l t i n gi ne x p o s u r eo fs u r f a c ec e l l st ot o x i cCPAl e v e l s .21 A d h e s i o nb e t w 巴e n 220 c e l l sa n dc o n s t r u c t si sa l s oc h a l l e n g e dd 旧i n gc r y o p r e s e r v a t i o nb e c a u s eo fm巴c h a n i c a l世 間s , e x t r a c e l l u l a r 221 i c ef o r m a t i o na n dd i f f e r e n c e si nt h e r m a 1c o n t r a c t i o nb e t w e e nt h ec e l la n ds u b s 回t 巴. 2 3V i t r i f i c a t i o ni sa 222 methodr e p o r t e dt op r e v e n t也ef o r m a t i o no fi c ec r y s t a 1 sd 山 gc o 0 1 i n g 姐 dwarming 4, 24 a n dh a s 223 s u p e r i o r i t yo v e ro t h e rc o n v 巴n t i o n a l企e e z i n gm e t h o d s, z 2H owever , TEBh a sa3 d i m e n t i o n a l( 3 D )s 仕u c 印r e 224 w i t hal a r g e rv o l u m e ;t h e r e f o r e, c o m p 1 e t ei n l m e r s i o ni n t o企e e z emediam i g h tcompromises u c c e s so f t h i s 8 225 p r o c e s s,b o t hl o g i s t i c a l l ya n db i o l o g i c a l l y ,l e a d i n gt od e t e r i o r a t i o ni nc e l lv i a b i l i t y ? 5,2 6Thep r e f i 巴町巴d 226 methodf o rc r y o p r e s巴r v i n gTEBi ss t i l ld e b a t a b l e .D i f f e r e n to u t c o m e sc a nb ee x p e c t e dd e p e n d i n go nc e l l 227 b i o m a t e r i a lt y p e, c e l l ! bi o m a t e r i a li n t e r a c t i o na n ds i z eo f t h ec o n s 廿u c t , t onameaf e w . t y p e, 228 B a s e dont h i s, n o v e lt e c h n i q u e st os h o r t e nt h ec e l lp r e p a r a t i o np e r i o do rp r e p a r a t i o nt e c h n i q u e 229 o fTEBj u s tb e f o r ei t sa p p l i c a t i o na r er e q u i r e d ,a n dweb e l i 巴v ec r y o p r 巴s e r v 巴d O お1 CSsa r eas o l u t i o n . 230 P r o t e c t i o n by t h ef r e e z i n gm e d i ai so fc r i t i c a li m p o r t a n c et op r e v e n tc e l l damag 巴 d u r i n gt h e 231 c r y o p r e s巴r v a t i o n J t h a w i n gp r o c e s s .U n l i k eTEB,i nw h i c ht h es t r u c t u r ei s3D,OMCSsa r es u i t a b l ef o r 232 c r y o p r e s e r v a t i o nb e c a u s et h e yc o m p r i s eal a y e r e dc e l ls h e e ts t r u c t u r e,s o仕切z i n gmediae l i c i t sl e s s 233 damage a n de n a b l e sm a i n t e n a n c eo fo s t e o b l a s t i ca b i l i t y .T h i ss t u d ys h o w sc r y o p r e s e r v e d OMCSs 234 m a i n t a i n e do s t 巴o g e n i ca b i l i t y ,and t h e r e f o r ep o s e as o l u t i o nt os h o r t 巴nt h 巳 t i m en e e d e dt o make 235 巴e r 巴dH A/BMSCsc o n s t r u c t s .Somes t u d i e sh a v er 巴p o r t e dt h eo s t e o g e n i ca b i l i t yo f o s t e o g e n i ct i s s u ee n g i n 236 c r y o p r 巴s e r v e dT E B s ; 1 3,2 1 2 3t h e r e f o r e,a ne x p e r i m e n t a ls t u d yt oc o m p a r et h eo s t e o g e n i ca b i l i t yb e t w巴巴n 237 巴dT EBa n dc r γ o p r e s e r v e dOMCSi sn巴C巴s s a r yi nt h ef u 印r e . c r γ o p r e s e r v 238 巴v i o u ss t u d i e shav 巴r e p o r t e dt h a tt h ec r y o p r e s e r v a t i o n J t h a w i n gp r o c巴s sf o rhumanMSCsh a s P r 239 0 noe f f e c tont h e i rg r o w t ho ro s t e o g e n i cd i f f e r e n t i a t i o n .1 , 1 5,1 6Wh i l s to t h e rs t u d i e sh a v edemons 廿a t e dt h e 240 巴d i n t oo t h e rc e l lt y p e s i n c l u d i n gc a r d i a c a b i l i t yo fc r y o p r e s e r v e d / t h a w e d MSCs t od i f f e r e n t i a t 241 9a 0I 2 7v a s c u l a re n d o t h e l i a lc e l l s, 2 8h e p a t o c y t e s2 n dn e u r a lc e l l s .3 th a sb e e nr e p o r t e dt h a tDMSO m y o b l a s t s, 242 1o u ta l s oi n d u c e sd i f f e r e n t i a t i o no fMSCs i n t on e u r o n l i k ec e l l s3 rc a r d i a c i sn o to n l yc y t o t o x i c,b 243 myocyt 巴S 3 2whena d d e dt oc u l t u r emediuma f t e rt h a w i n g .T h e r e f o r 巴 , DMSOi n企e e z emediummay 244 巴p r e s巴n ts t u d ys h o w st h a tf r e s ha n d d e c r e a s et h eo s t e o b l a s t i cd i f f e r e n t i a t i o np o t e n t i a lo fBMSCs.Th 245 r o u p sh a v eas i m i l a rALPa c t i v i t ya n dOCc o n t e n ti n d i c a t i n gt h a tc r y o p r e s e r v a t i o no f 4・weekOMCSg 246 OMCSs d o e sn o ta f f e c tt h e i ra b i l i t yt ou n d e r g oo s t e o b l a s td i f f e r e n t i a t i o na f t e rt r a n s p l a n t a t i o n . The 247 m a j o r i t yo fc e l l si nt h e OMCSsh a v ea l r e a d yu n d e r g o n eo s t e o b l a s td i f f e r e n t i a t i o nd u r i n gt h es h e e t 248 h u st h en e g a t i v ei n f l u 巴n c eo fDMSOw i l lb em i n i m a l企omt h i sr e s p e c t .Att h i sp o i n t , c r e a t i o np r o c e s s,t 249 f u r t h e rs t u d i e st oa s s e s sd i f f e r e n t i a t i o no fMSCc e l ls h e e t si n t oo t h e rc e l lt y p e sa r en e e d e dt oo p t i m i z 巴t h e 250 c r y o p r e s e r v a t i o np r o t o c o. l ラ ラ 251 , c o n s i s t i n go fr a p i d l yf r e e z i n ga t必 OOC, i sv e r ys i m p l ec o m p a r e d Ourc r y o p r e s e r v a t i o np r o t o c o l 252 3, w i t hp r e v i o u sm e t h o d s1 2 1 2 3a n dc o u l dm a i n t a i nOMCSo s t e o g e n i ca b i l i t yf o ra tl e a s t4w e e k s .T h e r e f o r e, 253 web e l i e v eOMCSsc r y o p r 巴s e r v e du s i n go u rs i r n p l ep r o t o c o la r ea no p t i o nf o rh a r dt i s s u er e c o n s t r u c t i o n , 9 254 a n dt h e i ra d v a n t 昭e si n c l u d er e d u c e dp r o c e s s i n gs t e p sa n dc r y o p r e s e r v a t i o nc o s t s . However , 255 c r y o p r e s e r v a t i o na t・800C mayc a u s ec h e m i c a lr e a c t i o n sa st h e r m a le n e r g yandu n f r o z e nw a t e r 戸I n吐l e 256 p r e s e n ts 同d y ,OCc o n t e n tt e n d e dt od e c r e a s ew i t hi n c r e a s e dc r y o p r e s e r v a t i o np e r i o du n t i l1 2weeks, 257 i n d i c a t i n gt h a to s t e o g e n i ca b i l i t yo fc r y o p r e s e r v e dOMCSsd e t e r i o r a t e dd u r i n gc r y o p r e s e r v a t i o n .K i t oe t 258 仕a t e dt h a tt h ecomeale p i t h e l i a lc e l ls h e e t ss t o r e da t1 9 60Cshowedah i g h e rc e l ls u r v i v a l a l .20 d巴mons 259 r a t e由 組 曲o s ea t 800C .百l e r e f o r e ,ana l t e m a t i v emethod ,s u c ha sl i q u i dn i t r o g e nc r y o p r e s e r v a t i o na t 260 ・1 9 60C 261 s i g n i f i c a n t l yr e d u c e da n d出e r m a l l yd r i v e nr e a c t i o n sa r en e g l i g i b l eo v e rt i m e .I nc a s e sw h e r et h ep a t i e n t s 262 t h r e a t e nd巴l a y e do rn o n u n i o no ft h e企a c t u r ed u et od e t e r i o r a t e do s t e o g e n i ca b i l i t y , s ぽg eonc o u l dh a r v e s t 263 t h e i r MSCs a t 也e i n i t i a lo p e r a t i o nf o r 企a c 旬r et r e a t m e n ta n dc r e a t et h e OMCSs f o l l o w e d by 264 c r y o p r e s巴r v a t i o nf o rf u 加r eu s e .Ass u c hc l i n i c a lc a s e s, c r y o p r e s e r v a t i o nw i t hl i q u i dn i 仕o g e ni sc o n s i d e r e d 265 t ob ed e s i r a b l eb e c a u s et h ep r e s e r v a t i o np e r i o dwouldb emoret h a n6m o n t h s .F u t u r es t u d i e swi 1 l 266 e l u c i d a t et h ee f f e c to fs h o r t -andl o n g t e r mp r e s e r v a t i o nw i t hl i q u i dn i 仕o g e n . 開 ,maybep r e f e r a b l et op r e v e n tt h i sd e t e r i o r a t i o n15, 2 1, 2 3 .U s i n gt h i smethod ,m o l e c u l a rm o t i o ni s 267 Them a c r o s c o p i cf m d i n g sshowt h a tOMCS s i z es e e m st obecomeal i t t l eb i tl a r g e ra f t e r 268 c r y o p r e s e r v ed J t h a w e dp r o c e s s .Wec o n s i d e rt h a tt h ef o l d e ds h e e t柑 u c 加r ewhichr e v e a l e dbyh i s t o l o g y 269 wass p r e a dt om o n o l a y e ri n1 2・weekc r y o p r e s e r v a t i o nOMCS,c l o s et o也es i z eo f也eOMCSb e f o r e 270 s c r a p i n g .I n1 2 ・・w eekc r y o p r e s e r v e dOMCS,o s t e o g e n i cc a p a c i t ywasd e c r e a s e da f t e rt h ei m p l a n t a t i o n . 271 Thef o l l o w i n gc o u l de x p l a i nt h er e a s o n s ;t h ef o l d e ds 仕u c t u r eo fOMCSmayp r e v e n tp e r m e a t i o no ft h e 272 c r y o p r e s e r v a t i o nmediumi n t ot h ef o l d e ds h e e ts 仕u c t u r e姐 dc a u s e也e企e e z i n gdamagef o l l o w e dbyt h e 273 d e c r e a s e dnumbero fs u r v i v a lc e l l s .D e c r e a s e dc e l lnumberi nt h e OMCS r e s u l t e di nr e d u c t i o no f 274 o s t e o g e n i ca b i l i t yi n也巴 1 2・weekc r y o p r e s e r v e dOMCSa 丘町 c r y o p r e s e r v ed J thaw 巴dp r o c巴s s .Thec u l t u r e 275 3 3, d i s h e sw i t hat h e r m o r e s p o n s i v ep o l y m e rg r a f t p o l y( 品i s o p r o p y l a c r y l a m i d e )o rc o l l a g e nmembranes20 276 maya v o i dt h ef o r m a t i o no ft h ef o l d sa n dr e s u l ti ni n c r 巴a s e dnumbero fs u r v i v a lc e l l si nc r y o p r e sぽ v e d 277 OMCSs.P r e v i o u ss t u d yr e p o r t e dt h a t江wasp o s s i b l et oc r y o p r e s e r v eacomealm o n o l a y e rs h e e t( 8mmi n 278 2 0, t h i c k n e s s )c r e a t e dw i t hac o l l a g e nmembraneu s i n g1 .5mlo fc r y o p r e s e r v a t i o nmedium w h i l eweu s e d 279 O . 5 m lc r y o p r e s e r v a t i o nmediumi nt h ep r e s e n ts t u d y .T h e r e f o r e ,i nt h ec r y o p r e s e r v a t i o no ft h eOMCS, i t 280 mayb ep o s s i b l et o白川l e ri n c r 問 問 自ev i a b i l i t ybyu s i n g血o s eg r a f t e dc u l t u r ed i s h e so re n o u g ha m o u n t 281 o fc r y o p r e s e r v a t i o nmedium.Conc巴mingt h i sp o i n t , f u r t h e rs t u d ywi 1 lber e q u i r e d . 282 百l et e c h n i q u ef o rc r y o p r e s e r v a t i o no fc e l ls h e e t sh a sa l r e a d yb e e nr e p o r t e d , 2 0h o w e v e r , t oo u r 1 0 283 k n o w l e d g e, t h i si st h ef r r s tr e p o r to fc r y o p r e s e r v e dc e l ls h e e t sf o r m i n gbonet i s s u ea f t e ri m p l a n t a t i o n .I n 284 t h ee x p e r i m e n to fc r y o p r e s e r v a t i o nofacomeals h e e t , 20 也ef ormo ft h ec e l ls h e e twasm a i n t a i n e d 285 i m m e d i a t e l ya f t e rt h a w i n g ,butt h eformwasnol o n g e rm a i n t a i n e da f t e r24h o u r sofc u l t u r ea f t e rt h e 286 t h a w i n g .I nc o n t r a s t , o u rc e l ls h e e tm a i n t a i n e di t sf o r ma f t e rt h a w i n g .Evenw i t ht h es i m p l emethodu s e d 287 i nt h ep r e s巴n ts 飢d y , t h eex 仕a c e l l u l a rm a t r i xf o r m e dbyo s t e o b l a s t sm a i n t a i n e ds u f f i c i e n td u r a b i l i t yt ot h e 288 町r o p r e s巴r v a t i o nandwec a ne a s i l yp r o d u c eTEBc e l V bi o m a t e r i a lc o n s t r u c t si m m e d i a t e l ya f t e rt h a w i n g , 289 whichs u p p o r t st h ec r y o p r e s e r v a t i o no ft h eOMCSt obeu s e f u . lBecausefewh o s p i t a l sh a v ef a c i l i t i e sf o r 290 c e l lp r o c e s s i n g,加u r eTEa p p r o a c h e sf o rh a r dt i s s u er e c o n s 回 c t i o nw i l lr e q u i r emores i m p l i s t i ct r e a 凶 e n t 291 o p t i o n .T r a n s p o r t a t i o no fBMSCsandOMCSsi so fc r i t i c a li m p o r t a n c ef o rl a r g e 叩 a l ep r o d u c t i o na n d 292 r i m e n t su s i n g human c e l l s and l o n g t e r m c l i n i c a lu s e .A l t h o u g h we needt oc o n d u c ts i m i l a re x p巴: 293 p r e s e r v a t i o na t1 9 60C i n白印r e ,cryopreservedOMCSsf i tt h ec l i n i c a lneedo fp r o v i d i n ga v a i l a b i l i t yo f 294 TEBi na 1 1h o s p i t a l s . 295 296 C o n c l u s i o n 297 Thep r e s e n ts t u d yc l e a r l yi n d i c a t e st h a tt h es t r u c t u r a li n t e g r i t yofOMCSswasm a i n t a i n e d 298 d u r i n gc r y o p r e s e r v a t i o nandt h a w i n g ,and血a tc 巴 l 1swerec a p a b l eo fp r o d u c i n gam i n e r a l i z e dma 仕i xon 299 HAs c a f f o l d s ,r e s u l t i n gi nbonef o r m a t i o n .T h i ss i m p l ec r y o p r e s e r v a t i o nt e c h n i q u ec a nbeu s e df o rt h e 300 a p p l i c a t i o no fOMCSsi nh a r dt i s s u er e c o n s t r u c t i o n . 301 302 Fundings o u r c e :TakedaS c i e n c eF o u n d a t i o n 303 304 C o n f l i c t so fi n t e r e s ts t a t e m e n t 305 Thea u t h o r ss t a t et h a tt h e yhavenoc o n f l i c t so f i n t e r e s tt od i s c l o s e 306 307 Acknowledgments 308 We也ankY a s u a k iTohma(N a r aM e d i c a lU n i v e r s i t y )f o rh i sa d v i c eone x p e r i m e n t a ld巴s i g n , 309 FumikaKunda , MamikoYoshimuraandMiyaMatsumura(N a r aM e d i c a lU凶 v e r s i t yS c h o o lo f M e d i c i n e, 310 J a p a n )f o r出 自 t e c h n i c a la s s i s t a n c e .Wea l s ot h 創l kY o s h i k oDohi(N a r aM e d i c a lU n i v e r s i t y )f o rh e r 311 巴 x p e r i m e n t a la d v i c e . 312 1 1 313 R e f e r e n c e s 314 1 . W a k i t a n iS,I m o t oK,YamamotoT,S a i t oM,M u r a t an,YonedaM.Humana u t o l o g o u sc u l 印r e 315 e x p a n d e db o n e marrow m e s e n c h y m a lc e 1 1回 n s p l a n t a t i o nf o rr e p a i ro fc a r t i l a g ed e f e c t si n 316 託h r i t i ck n e e s .O s t e o a r t h r i t i sC a r t i l a g e1 0( 2 0 0 2 )1 9 9・2 0 6 . o s t e o a 317 2 . O h g u s h iH,K o t o b u k iN,F u n a o k aH,M a c h i d aH,H i r o s eM,T a n a k aY,e ta . lT i s s u ee n g i n e e r e d 318 c e r a m i ca r t i f i c i a lj o i n t-e xv i v oo s t e o g e n i cd i f f e r e n t i a t i o no fp a t i e n tmesenchym a 1c e 1 1 sont o t a l 319 a n k l ej o i n t sf o rt r e a t m e n to fo s t e o a r t h r i t i s .B i o m a t e r i a l s26( 2 0 0 5 )4 6 5 44 6 61 . 圃 320 3 . K a w a t eK,Y a j加 aH,O h g u s h iH,K o t o b u k iN,S u g i m o t oK,0加n町 aT,e ta . lT i s s u e e n g i n e e r e d 321 a p p r o a c hf o rt h e仕e a 佃l e n to fs t e r o i d i n d u c e do s t e o n e c r o s i so ft h ef e m o r a lh e a d :回 n s p l a n t a t i o no f 322 a u t o l o g o u s mesenchymal s t e mc e 1 1 sc u l t u r e dw i t hs t r i c a l c i u mp h o s p h a t ec e r a m i c sa n d 合間 323 v a s c u l a r i z e df i b u l a .Arti fO r g a n s3 0( 2 0 0 6 )9 6 0 9 6 2 . 324 4 . O h g u s h i H,Yoshikawa T,N a k a j i m a H,Tamai S,D o h i Y,Okunaga K . AL203 d o p e d 325 a p a t i t e w o l l a s t o n i t ec o n t a i n i n gg l a s sc 巴r a m i cp r o v o k e so s t e o g e n i cd i f f e r e n t i a t i o no fmarrows t r o m a l 326 s t e mc e 1 1 s .JBiomedM a t e rRes44( 1 9 9 9 )3 8 13 8 8 . ・ 327 k a l l a n eM, O h g u s h iH, YoshikawaT, SempukuT , TamaiS, T a b a t aS, e ta l .O s t e o g e n i cp h e n o t y p e 5 . A 328 e x p r e s s i o no fa 1 1 0 g e n e i cr a tm紅 TOWc e 1 1 s血 p o r o u sh y d r o x y a p a t i t ec e r a m i c s .JBoneM i n e rR e s1 4 329 ( 19 9 9 )5 6 1・5 6 8 . 330 o k uK,KawagoeD,F吋加o r iH,G o t o S,O h g u s h iH .O b s e r v a t i o no fo s t e o g e n i c 6 . K o t o b u k iN,I 331 d i f f e r e n t i a t i o nc a s c a d eo fl i v i n gm e s e n c h y m a ls t e mc e l l son仕 組s p a r e n th y d r o x y a p a t i t ec e r 佃lI c s . 332 B i o m a t e r i a l s26( 2 0 0 5 )7 7 9・7 8 5 . 333 DohiY,O h g u s h iH,S h i m a o k aH, I k e u c h iM, M a t s u s h i m aA, e ta . lI n : f l u e n c eo ft h e 7 . OkamotoM, 334 p o r o s i t yo fh y d r o x y a p a t i t ec e r a m i c soni nv i t r oa n di nv i v ob o n ef o r m a t i o nbyc u l t u r e dr a tb o n e 335 marrow柑 omalc 巴 l 1 s .JM a t e rS c iM a t e rMed1 7( 2 0 0 6 )3 2 7 ・3 3 6 . 336 K o t o b u k iN, T a d o k o r oM, K a w a t eK, Y a j凶 aH, T a k a k u r a, Ye ta . lI nv i v oo s t e o g e n i c 8 . M a t s u s h i m aA, 337 c a p a b i l i t yofhumanmesenchymalc e 1 1 sc u l t u r e donh y d r o x y a p a t i t ea n donb e t a t r i c a l c i u mp h o s p h a t 巴 . 338 A r t i f O r g a n s3 3( 2 0 0 9 )4 7 4・481 . 339 9 . Nak 阻 l u r aA, DohiY, AkahaneM, O h g u s h iH, Nak 吋加aH, F u n a o k aH, e ta . lO s t e o c a l c i ns e c r e t i o n 340 a sa ne a r l ym a r k e ro fi nv i t r oo s t e o g e n i cd i 民 間n t i a t i o no fr ぽm e s e n c h y m a ls t e mc e 1 1 s .T i s s u eEng 341 Pぽ tCM e t h o d s15ο009)1 6 9 ・1 8 0 . 12 342 1 0 .S p u r r EE ,Wiggins NE,Marsden KA,Lowenthal R M,Ragg S J .C r y o p r e s e r v e d human 343 h a e m a t o p o i e t i cs t e mc e l l sr e t a i ne n g r a 血n e n tp o t e n t i a la f t e re x t e n d e d( 5・1 4y e a r s )c r y o s t o r a g e . 344 1 7 . C r y o b i o l o g y44( 2 0 0 2 )210・2 345 1 1 .B r u d e rSP ,Jaiswa1N,HaynesworthSE.Grow血 k i n e t i c s, s e 1 f r e n e w a l ,andt h eo s t e o g e n i cp o t e n t i a 1 346 of p u r i f i e d human mesenchyma1 s t e mc e l l sd u r i n ge x t e n s i v es u b c u l t i v a t i o n and f o l l o w i n g 347 9 4 . c r y o p r e s e r v a t i o n .JC e l lBiochem64( 1 9 9 7 )2782 348 349 ・ 1 2 . YoshikawaT,N a k a j也 aH,Tak 北 町a, Y NonomuraA .O s t e o g e n e s i sw i t hc r y o p r e s e r v e dmarrow 1( 2 0 0 5 )1 5 21 6 0 . mesenchyma1c e l l s .T i s s u eEng1 ・ 350 1 3 . YinH, CuiL, L i uG, Cen1 , CaoY .V i t r e o u sc r y o p r e s e r v a t i o no f t i s s u ee n g i n e e r e dbonecomposedo f 351 bonemaηowmesenchymals t e mc e l l sandp a r t i a l l yd e m i n e r a l i z e dbonem a t r i x .C r y o b i 0 1 0 g y5 9 352 8 7 . ( 2 0 0 9 )1 8 0・1 353 354 1 4 .L i p p e n sE, C o m e l i s s e nM.S10wc o 0 1 i n gc r y o p r e s e r v a t i o no fc e l l m i c r o c a r r i e rc o n s 廿u c t s .C e l l sKoto T i s s u e sO r g a n s1 9 2( 2 0 1 0 )1 7 71 8 6 . 同 355 1 5 .K o t o b u k iN,H i r o s eM,MachidaH,Katou, Y TakakuraY,OhgushiH.V i a b i l i t yando s t e o g e n i c 356 p o t e n t i a 1ofc r y o p r e sぽ vedhumanbonem a r r o w d e r i v e dmesenchyma1c e l l s .T i s s u eEng1 1( 2 0 0 5 ) 357 7 3 . 6 6 36 358 359 360 361 ・ 1 6 .L i uG,ShuC, CuiL, L i uW, CaoY .T i s s u e e n g i n e巴: r e dbonef o r m a t i o nw i t hc r y o p r e s e r v e dhuman bonemarrowmesenchymals t e mc e l l s .C r y o b i 0 1 0 g y5 6( 2 0 0 8 )2092 1 5 . 圃 1 7 . YoshikawaT,OhgushiH,UemuraT,Nak 吋凶aH,I c h i j i m aK,TamaiS,e ta . lHumanmarrow c e l l sd e r i v e dc u 1 t u r e dbonei np o r o u sc e r a m i c s .BiomedMaterEng8( 1 9 9 8 )3 1 1 3 2 0 . 岡・ 362 1 8 . AkahaneM,NakamuraA,OhgushiH,S h i g e m a t s uH,DohiY,T a k a k u r aY .O s t e o g e n i cma 仕i x 363 e l lt r a n s p l a n t a t i o nu s i n go s t e o b l a s t i cc e l ls h e e tr e s u 1 t e di nbonef o r m a t i o nw i t h o u ts c a f f o l da t s h e e tc 364 ane c t o p i cs i t e .JT i s s u eEngRegenMed2( 2 0 0 8 )1 9 6・201 . 365 366 367 368 369 370 園 1 9 . AkahaneM, UehaT, S h i m i z u工S h i g e m a t s uH, KidoA, OmokawaS, e ta . lC e l lS h e e tI n j e c t i o na sa t e c 凶i q u eofo s t e o g e n i cs u p p 1 y .I n t e m a t i o n a 1J o u r n a 1o fStemC e l l s3ο010)1 3 81 4 3 . 聞 2 0 .K i t oK, KagamiH, KobayashiC, UedaM, T e r a s a k iH .E f f e c t so fc r y o p r e s巴r v a t i o nonh i s t 0 1 0 g ya nd v i a b i l i t yofc u l t u r e dcomeale p i t h 巴l i a lc e l ls h e e t s加 r a b b i t .Comea24( 2 0 0 5 )735741 . 嗣 21 . Ko 企o nM D,O p s i t n i c kNC,A t t a w i aM A ,LaurencinCT. Cryopreservationoft i s s u ee n g i n e e r e d c o n s t r u c t sf o rbon 巴.JO r t h o pRes2 1( 2 0 0 3 )1 0 0 5 1 0 1 0 . 13 371 372 373 374 2 2 .K u l e s h o v a LL ,Gouk SS,Hu回 acherDW. V i t r i f i c a t i o na s ap r o s p e c tf o rc r y o p r e s e r v a t i o no f 5 9 6 . t i s s u e e n g i n e e r e dc o n s t r u c t s .B i o m a t e r i a l s28ο007)1 5 8 51 同 2 3 .L i uBL ,McGrathJ J .E f f e c t sof企e e z i n gont h 巴c y t o s k e l e t o n ,f o c a la d h e s i o n sandg a pてj u n c t i o n s i n 2005)4896-4899. m u r i n eo s t e o b l a s tc u l t u r e s .ConfProcIEEEEngMedB i o lS o c5( 375 2 4 . WenF , MagalhaesR, GoukSS, Bha k t aG, Le巴 KH , Hu 加l a c h e rD W ,e ta . lVi 仕e o u sc r y o p r e s e r v a t i o n 376 o f n a n o f i b r o u st i s s u ee n g i n e e r e dc o n s t r u c t sg e n e r a t e du s i n gmesenchymals t r o m a lc e l l s .T i s s u eEng 377 1 4 . P a r tCMethods1 5( 2 0 0 9 )1 0ふ 1 378 379 380 381 382 383 384 385 岨 2 5 . MehlPM.N u c l e a t i o nandc r y s t a lgrow 吐linavi 甘i f i c a t i o ns o l u t i o nt e s t e df o ro r g a nc η o p r e s e r v a t i o n byv i 仕i f i c a t i o n .C r y o b i o l o g y30( 1 9 9 3 )509・5 1 8 . e l lE .Thermal巴x p a n s i o nm e a s u r e m e n t so fc r y o p r o t e c t i v ea g e n t s .P a r t1 1 :measurements 2 6 . Rabi nY,B ofDP6andVS55, andc o m p a r i s o nw i t hDMSO.C r y o b i o l o g y46( 2 0 0 3 )2 6 4 2 7 0 . n oS,FukudaK,Miyoshi S,K o n i s h i F ,KodamaH,PanJ,e ta . l Cardiomyocytes canbe 2 7 . M北 i g e n e r a t e dfrommarrows t r o m a lc e l l si nv i t r o .JC l i nI n v e s t1 0 3( 1 9 9 9 )6977 0 5 . ・ 2 8 . Reye sM,DudekA,J a h a g i r d a rB,KoodieL,MarkerPH ,V e r f a i l l i eCM. O r i g i no fe n d o t h e l i a l 4 6 . p r o g e n i t o r si nhumanp o s t n a t a lbonem a r r o w .JC l i nI n v e s t1 0 9( 2 0 0 2 )3373 嗣 386 紅白隠, ReyesM, KoodieL, J ia n gY, B l a c k s t a dM, LundT, e ta l .Mult ヤotentadultprogenitor 2 9 . Schw 387 c e l l s企ombonemarrowd i f f e r e n t i a t ei n t of u n c t i o n a lh e p a t o c y t el i k ec e l l s .JC l i nI n v e s t1 0 9( 2 0 0 2 ) 388 1 2 9 11 3 0 2 . 司 四 389 ObrockaM, F i s c h e r1 , ProckopD J .I nv i 仕od i f f e r e n t i a t i o no fhumanmarrows t r o m a lc e l l s 3 0 . DengW, 390 i n t oe a r l yp r o g e n i t o r sofn e u r a lc e l l sbyc o n d i t i o n s由a ti n c r e a s ei n t r a c e l l u l a rc y c l i cAMP.Biochem 391 B i o p h y sResCommun282( 2 0 0 1 )1 4 8 1 5 2 . 392 393 3 1 . ChuQ, WangY, FuX, Zh angS .Mechanismo f担 v i t r od i f f e r e n t i a t i o no fbonemarrow柑 omalc e l l s i n t on e u r o n l i k ec e l l s .JHuazhongUnivS c iT e c h n o l o gMedS c i24( 2 0 0 4 )259261 . 幽 394 3 2 . YoungDA ,GavrilovS,PenningtonCJ,N u t t a l lRK ,EdwardsD, RK i t s i sRN ,e ta . lE x p r e s s i o no f 395 m e t a l l o p r o t e i n a s e s andi n h i b i t o r si nt h ed i 能: r e n t i a t i o no fP19CL6 c e l l si n t oc a r d i a cm y o c y t e s . 396 BiochemB i o p h y sResCommun322( 2 0 0 4 )7597 6 5 . 園 397 3 3 . MemonIA ,Sawa, Y FukushimaN, MatsumiyaG, MiyagawaS, T a k e t a n iS, e ta . lR e p a i ro f i m p a i r e d 398 myocardium by means ofi m p l a n t a t i o n ofe n g i n e e r 巴d a u t o l o g o u sm y o b l a s ts h e e t s . JT h o r a c 399 C a r d i o v a s cS u r g1 3 0( 2 0 0 5 )1333-1341 . 400 14 1 401 F i g u r eC a p t i o n s 402 F i g u r e1 .Temp ぽa 仙r ec h a n g e so ft h ec r y o p r e s e r v i n g / t h a w i n gp r o c e s s .( A ) :c r y o p r e s e r v i n gp h a s e,( B ) : 403 t h a w i n gp h a s e . 404 405 F i g u r e2 .M a c r o s c o p i ca n dm i c r o s c o p i c(H&Es t a i n e d )a p p e 訂 a n c eofOMSCsa 食e r也aw 也g .( A )組 d( a ) : 406 企e s hg r o u p , ( B )a n d( b ) :4・weekg r o u p, ( C )組 d( c ) :1 2 ・w eekg r o u p .M i c r o g r a p h sshowt h a t仕l eOMCSi s 407 c o n s i d e r a b l yf o l d e do v e ri nt h e仕e s hg r o u p( a ), ont h e0 仕l e rh a n d , t h ef o l d e dl e s i o nw e r er e d u c e di nbo 由 408 仕l e4 ・( b )阻 d1 2 w e e kg r o u p s( c ) .B l a c kb a ri n d i c a t e s50μm. 409 410 F i g u r e3 .C o n f o c a ll a s e rm i c r o s c o p yi m a g e so fOMCSss t a i n e dw i t hf l u o r e s c e n td y e s,C a l c e i nA M 411 ( G r e巴n ;L i v e )a n dE t h i d i u mh o m o d i m i e r1( R e d ;D e a d ), a 氏e r也a w i n g ;( A )企e s hg r o u p, ( B )4weekg r o u p 412 c )1 2weekg r o u p(A , B, C ;OMCSswass t a i n e da f t e r24h o u r sc u l t u r ea f t e rs c r a p i n g o f fo rt h a w i n g ) . a n d( 413 Whi t eb a ri n d i c a t e s2 0 0凹n . ・ 圃 闘 414 415 F i g u r e4 .X r a yp h o t o g r a p h so fh a r v e s t e dd i s k s ;( A )企e s hg r o u p, ( B )4-weekg r o u p ,( C )1 2weekg r o u p 416 a n d( D )c o n t r o lg r o u p .O b v i o u sc a l c i f i c a t i o ns u r r o u n d i n gt h ed i s k swaso b s e r v e di na l le x p e r i m e n t a l 417 , e x c e p tt h ec o n t r o lg r o u p . g r o u p s ・ 園 418 419 F i g u r e5 .H&Es 匂i n e ds e c t i o n so fh a r v e s t e dc o n s t r u c t s .Low 巴rm a g n i f i c a t i o ni m a g e s ;( A )企e s hg r o u p , 420 ( B )4weekg r o u p, ( C )1 2 w e e kg r o u pa n d( D )c o 附 0 1g r o u p .Bonef o r m a t i o ni n血eHAp o r e sa n dt h e 421 s u r f a c巴 o ft h eHAd i s kc a nb eo b s e r v e di na l le x p e r i m e n t a lg r o u p s,e x c e p tt h ec o n t r o lg r o u p .H i g h 422 m a g n i f i c a t i o ni m a g e s ;( a )企e s hg r o u p ,( b )4 ・w eekg r o u p,( c )1 2・weekg r o u pa n d( d )c o n t r o lg r o u p . 423 Sim i 1 a rb o n ef o r m a t i o np a t t e m s, c o m p r i s i n go s t e o c y t e sa n do s t e o b l a s t si nt h eb o n et i s s u e, w e r eo b s e r v 巴d 424 i nt h ef o r m e rt h r e eg r o u p s .Nob o n et i s s u ewaso b s e r v e di nt h ep o r e so ra tt h es u r f a c eo f t h ec o n t r o lg r o u p . 425 B l a c kb a ri n d i c a t e s200仰n . 凶 426 427 F i g u r e6 .ALPa c t i v i t y( A )a n dOCc o n t e n t s(B)泊也ec o n 佐0 1,企e s h ,4 -weeka n d1 2weekg r o u p s .No 428 s i g n i f i c a n td i f f e r e n c ewasf o u n df o rA LPa c t i v i t yb e t w e e nt h e: f r e s h ,4 -a n d1 2weekg r o u p s .百l eOC 429 c o n t e n to ft h et h r e eg r o u p swass i g n i f i c a n t l yh i g h e rc o m p a r e dw i t hc o n 廿0 . 1OCc o n t e n td e c r e a s e dw i t h 同 ・ 15 430 I nc r e a s e dc r y o p r e s e r v a t i o np e r i o d . 1 6 3gp 晶帯 議 構 晶帯 畠曹 晶帯 晶噂 品帯 司 監 … 一 … ミ 等等き 倒叫やγ ~ 電 器 r 可 o (0議事P )制 時 邸 側ω8 ふ 認3 開 w 3gp い o設 議 《 む 主 守 喝 o 。内守 コ ∞ 一 斗 . H ω﹂ 建 等 建 等 議 (0議事的制問削踊d ω器 ム コ ∞ 一 . m ω﹂ u ω﹂ コ ∞ 一 日 比 . 寸 コ ∞ 一 m ω﹂ uh 必 一 留 品 加 点 円 ぷ留中 gcouφ ﹀官智は 一 u設 jdw!j怨げ ぷ砂金子判附 ぷ 事 bF21 叶 同 町 謝 普段 hF 一 宮 判 MGOωぷ愚品 WC ω﹂ コ ∞ 一 日 比 匂 o tn o 5 ミ 1 . 0 ∞ , 官》 o ぱ事 f吋 写 u設 Idω!jU! L UOC/IOWr I 〈 安部i叶 M4mw 告 争 8
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