Determinazione rapida di residui di Glifosate ed AMPA nelle acque mediante derivatizzazione e determinazione on-line SPE-HPLC M. Volante, R. Fumagalli – ARPA Lombardia - Dip. Lecco A. Fontana, L. De Angelis - Univ. Milano - Dip. Sc. Farmacologiche I. Castelnuovo, A. Pozzi – Univ. Insubria – Dip. Chimica Parleremo di……. • Perché AMPA e Glifosate • Approccio all’analisi dei loro residui • La derivatizzazione mediante FMOC • L’analisi diretta HPLC dei derivati FMOC • L’applicazione del sistema SPARK • Prestazioni ottenute dal metodo “On-line” Determinazione dei residui dei pesticidi nelle acque potabili - superficiali • Più di 400-500 principi attivi appartenenti a classi chimiche diverse autorizzati potenzialmente ritrovabili • Proprietà chimiche e comportamenti analitici molto differenti: richiedono più strumentazioni e più metodi multiresiduali • Necessità di stabilire priorità nelle molecole da tenere sotto controllo • Le priorità sono definite a partire dall’intensità di impiego, la tossicità, la persistenza nell’ambiente Glifosate ed AMPA • Il Glifosate ed il suo metabolita AMPA (acido amino-metil-fosfonico) per la grande quantità di formulati che viene venduta ed utilizzata è indubbiamente in cima a tutte le liste di priorità. • La sua bassa tossicità ne favorisce un larghissimo impiego come diserbante Glifosate ed AMPA • L’alta solubilità in acqua rende queste molecole difficilmente analizzabili con i comuni metodi multiresiduo gascromatografici o HPLC • Sono disponibili metodi dedicati con complessi step preparativi per la purificazione del campione • In passato raramente analizzati: pochi i dati attualmente a disposizione Glifosate ed AMPA • Un èquipe francese (Le Fur, Analusis, 2000, 28, 813-818) ha messo a punto una determinazione diretta HPLC su campione acquoso previa derivatizzazione con FMOC e rivelazione fluorimetria • La sensibilità del metodo può essere implementata mediante estrazione SPE dei derivati fluorescenti Gly-FMOC e AMPA-FMOC e/o sua determinazione mediante LC-MS sfruttando gli ioni (“altamente selettivi”!) del derivato stesso Ns. determinazione “diretta” FMOC / HPLC • 3 ml di campione in vial da 10-20 ml • Aggiunta di 400 ml di tampone borato (standard commerciale) pH 10 • Aggiunta di 500 ml di FMOC 0,5 mM in acetonitrile • 30 minuti di reazione a temperatura ambiente • Stop reazione con 2,5 ml di acido o-fosforico 0,2% v/v Ns. determinazione “diretta” FMOC / HPLC • La determinazione diretta per iniezione (200 ml !) dei derivati in HPLC senza preconcentrazione comporta severe limitazioni di applicazione in prossimità dei limiti di legge (0,1 mg/L) • Presenza di un interferente sovrapposto al picco dell’AMPA • Allargamento dei picchi, linea di base alterata dal residuo idrolizzato del FMOC in alte concentrazioni Ns. determinazione “diretta” FMOC / HPLC • Esempio di determinazione HPLC senza preconcentrazione (l eccitazione = 265 nm, l emissione = 300 nm) Colonna: Spherisorb Amino 250 x 4.6 mm o equivalente Eluente: Acetonitrile - Ac.fosforico 0,2% (80-20), 2 mL/min Rimozione eccesso FMOC-OH con Diclorometano! Ns. determinazione “diretta” On-Line FMOC / HPLC • La fase estrattiva di preconcentrazione dei FMOC derivati può essere effettuata mediante tecnica SPE con adeguata fase (C18?, PLRP?) • Questo stadio può essere convenientemente standardizzato e velocizzato mediante un estrattore SPE on-line interfacciato con il sistema HPLC Ns. determinazione “diretta” On-Line FMOC / HPLC • Cartucce SPE “Certify II” dedicate a AMPA e Glifosate • Solvatazione con 2 ml di acido formico 0,05% • Equilibrazione con 5 ml di isopropanolo • Caricamento sulla cartuccia di 200 ml di campione • Eluizione direttamente in colonna con la fase mobile dell’HPLC • Fine eluizione dopo 10 secondi per evitare il grosso del residuo idrolizzato FMOC-OH e minimizzare il picco in testa al cromatogramma • Pulizia cartuccia con Acetonitrile-Ac.Fosforico 0,2% 75-25 Programmazione SPARK Symbiosis Conditions Events ACE exchange completed HPD1 Syr Ready ACE exchange completed HPD1 Syr Ready “ ACE Cart Exch Left Step 3 Equilibration ACE exchange completed HPD1 Syr Ready HPD1 Pump 1 : Step 4 Flush ACE exchange completed HPD1 Syr Ready ACE exchange completed HPD1 Syr Ready ACE exchange completed HPD1 Syr Ready Step 1 Exchange Step 2 Solvatation Step 2 Solvatation Step 5 Load Sample Step 6 Wash Timed Events Parameters ACE Clamp valve left: [1-2] – HPD to Cart ridge HPD1 Pump 1 : Aspirate: 0,05% Formic Acid Dispense: Out Volume: 2 ml Asp. Flow: 10 ml/min Disp. Flow: 5 ml/ min. Aspirate: Isopropilic alcohol Dispense: Out Volume: 5 ml Asp. Flow: 10 ml/min Disp. Flow: 5 m/min. (Impostare volume campione fisso pari a 200 ul) HPD1 Pump 1 : Step 7 Elute ACE exchange completed HPD1 Syr Ready ACE ACE ACE ACE ACE ACE Step 8 Purge System ACE exchange completed HPD1 Syr Ready HPD1 Pump 1 : Step 9 Move Cartridge ACE exchange completed HPD1 Syr Ready ACE Move Cartr Left ACE AUX 1 : ACE AUX 1 : ACE AUX 3 : ACE AUX 3 : Clamp valve Left: Clamp valve Left: Aspirate: Isopropilic alcohol Dispense: Out Volume: 2 ml Asp. Flow: 10 ml/min Disp. Flow: 2.5 m/min. 01 :00 : 600 PUMP On 01 :01 : 600 PUMP Off 01 :00 : 2475 Flu On 01 :01 : 2475 Flu Off 01 :00 : Pump to Cart to [6-1] 01 :30 : HPD to Cart to [1-2] Aspirate: SSM2 Dispense: OUT SSM2 : 75ACN/25H3PO4 Volume: 25 ml Asp. Flow: 10 ml/min Disp. Flow: 5 m/min. To Tray Ns. determ. “diretta” On-Line FMOC / HPLC • Esempio di determinazione HPLC con preconcentrazione (l eccitazione = 265 nm, l emissione = 300 nm) su SPARK Symbiosis Colonna: Spherisorb Amino 250 x 4.6 mm o equivalente Eluente: Acetonitrile –Ac.fosforico 0,2% (80-20), 2 mL/min. Ns. determinazione “diretta” On-Line FMOC / HPLC: linearità AMPA LINEARITA' AMPA 600000 y = 232017x + 6794 500000 2 R = 0,9966 Area 400000 300000 200000 100000 0 0 0,5 1 1,5 ug/l 2 2,5 Ns. determinazione “diretta” On-Line FMOC / HPLC: linearità Glifosate Linearità Glifosate 60000 y = 25292x - 252,86 2 R = 0,9979 50000 Area 40000 30000 20000 10000 0 0 0,5 1 1,5 ug/l 2 2,5 Ns. determinazione “diretta” on-Line FMOC / HPLC: ripetibilità AMPA e Glifosate • Ripetibilità (CV%) su matrice acqua minerale • AMPA • AMPA 1 mg/L: 0,1 mg/L: 4,8% 2,0% • Glifosate • Glifosate 1 mg/L: 0,1 mg/L: 1,8% 1,5% Ns. determinaz. “diretta” on-Line FMOC / HPLC: confronto con lab. di riferimento (ARPA Dip. Milano) – valori in mg/L • • • • • • • • • • • • • • • • • • • Campione FA 0506 FL 0506 FB 0506 FM 0506 FV 0506 FP 0506 FG 0506 FC 0506 FR 0506 FA 0606 FL 0606 FB 0606 FM 0606 FV 0606 FP 0606 FG 0606 FC 0606 FR 0606 AMPA - On-line SPE < 0,1 0,8 0,4 0,7 < 0,1 0,1 < 0,1 0,8 1,3 0,2 3,7 1,4 1,9 0,2 0,2 0,1 1,3 3,4 AMPA - Lab Riferimento 0,2 1,5 0,6 0,5 < 0,1 < 0,1 < 0,1 1,2 2,1 0,3 3,7 1,5 1,6 < 0,1 0,2 < 0,1 1,3 3,0 Contaminazione acque uso umano Contaminazione acque superficiali Per concludere…. • L’applicazione di un sistema on-line-HPLC all’analisi di Glifosate e AMPA velocizza i tempi e garantisce buona ripetibilità; • Automazione di una analisi dedicata, che si va ad aggiungere alle classiche “multiresiduo”, lavorando “in parallelo”; • Possibilità di avere dati “in tempo reale” relativi a principi attivi di alta priorità.
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