OPTIMIZACIÓN DE LA PRODUCCIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE

OPTIMIZACIÓN DE LA PRODUCCIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE
NANOCELULOSA BACTERIAL OBTENIDA A PARTIR DE RESIDUOS
AGROINDUSTRIALES
Pamela Roldán(1), Patricia Cerrutti(1), María L. Foresti(2), Analía Vázquez(2), Miguel A.
Galvagno(1,3)
(1)
Departamento de Ingeniería Química, Facultad de Ingeniería, Universidad de Buenos Aires, Capital
Federal, Argentina.
(2)
Grupo de Polímeros y Materiales Compuestos, Instituto de Tecnologías y Ciencias de la Ingeniería
(INTECIN), CONICET, Laboratorio de Materiales y Estructuras, Facultad de Ingeniería, Universidad de
Buenos Aires, Las Heras 2214, Capital Federal, Argentina.
(3)
Instituto de Investigaciones Biotecnológicas, CONICET-UNSAM, Campus Miguelete, Av. 25 de Mayo y
Francia CP, San Martín, Argentina
.
Correo Electrónico (Analía Vázquez): [email protected]
Palabras claves: Nanocelulosa bacterial, fuentes de carbono económicas no convencionales; hollejo de uva,
optimización; caracterización.
RESUMEN
La nanocelulosa bacterial (BNC) puede obtenerse mediante ciertas bacterias que la producen como
metabolito primario extracelular. Existe un creciente interés por encontrar fuentes de carbono alternativas,
principalmente residuos industriales y agroforestales. En este trabajo, se obtuvieron películas de BNC
producidas por Gluconacetobacter xylinus utilizando hollejos de uva provenientes de la producción de vino.
Se estudió el efecto de las concentraciones de hollejos y de macerado de maíz -fuente de nitrógeno-, tamaño
del inóculo, temperatura y tiempo de fermentación en la producción de BNC, mediante un diseño
experimental de tipo factorial. La concentración de hollejo de uva y el tiempo de incubación resultaron los
parámetros estadísticamente más significativos (p<0.05), con un efecto positivo sobre la producción de
BNC. Las películas obtenidas fueron caracterizadas mediante microscopía electrónica de barrido,
espectroscopía infrarroja, difracción de rayos X y termogravimetría, presentando características similares a
las producidas con fuentes de carbono de mayor costo como D-glucosa.
Keywords: Bacterial nanocellulose; non-conventional cheap carbon source; grape bagasse; optimization;
characterization.
ABSTRACT
Bacterial nanocellulose (BNC) can be produced by certain bacterial strains as an extracellular primary
metabolite. Currently, there is an increasing interest in the search of alternative carbon sources, mainly
agroforestry industrial residues. In the current contribution, BNC pellicles were produced by
Gluconacetobacter xylinus using grape bagasse, a residue of wine production. The effect of grape bagasse
and corn steep liquor concentrations (nitrogen source), innoculum size, fermentation temperature, and
production time on BNC production were studied by means of a factorial design. Grape bagasse
concentration and production time showed to be the most statistically significant parameters (p<0.05) which
both showed a positive effect on BNC production. The pellicles thus obtained were characterized by means of
scanning electron microscopy, Fourier transform infrared spectroscopy, X-ray diffraction and
thermogravimetric analysis. The obtained BNC had similar characteristics than the one produced by use of
more expensive carbon sources such as D-glucose.
1. INTRODUCCIÓN
La celulosa es un polímero lineal formado por unidades de D-glucosa enlazadas por uniones β (1→4). La
celulosa es el principal componente de la pared de las plantas, y también es sintetizada por algunas
bacterias y ciertos animales llamados tunicados [1]. Si bien las fibras de celulosa y muchos de sus
derivados químicos se conocen y se usan en distintas aplicaciones desde hace más de 150 años, en la
última década ha surgido un interés renovado por la celulosa a partir del conocimiento de que las
macrofibras de celulosa están compuestas por fibrillas de diámetros nanométricos que cuentan con
propiedades mecánicas muy atractivas [2]. En particular, los elementos constitutivos de la celulosa se
denominan microfibrillas y consisten en estructuras de 2-10 nm de diámetro formadas por haces o
manojos (“bundles”) de cadenas paralelas de glucano, que intercalan dominios cristalinos y amorfos. Los
dominios cristalinos de las microfibrillas de celulosa tienen excelentes propiedades mecánicas, con un
módulo elástico del orden de 150 GPa, mayor que el módulo elástico de las fibras de vidrio (85 GPa) y de
aramida (65 GPa) [3]. Si bien tradicionalmente la nanocelulosa se ha obtenido por medios químicos o
mecánicos a partir de fuentes de origen vegetal, desde fines del siglo pasado, comenzó a tener relevancia
la obtención de nanocelulosa de origen bacterial o bionanocelulosa (BNC), ya que su alta pureza y
estructura cristalina permitía su utilización para funciones más refinadas tales como la elaboración de
membranas acústicas y de filtración, elementos utilizados en clínica médica y sanitaria, en aplicaciones en
las que se requiere alta transparencia, baja expansión térmica y alta resistencia, etc. [5-10].
En particular, dentro de las bacterias potencialmente productoras de BNC, Gluconacetobacter xylinus se
destaca por su alto nivel de producción así como por la pureza y estructura del polímero obtenido, muy
semejante al del de origen vegetal [11], pero sin la presencia de ligninas o hemicelulosas.
Tradicionalmente, la BNC se produce a partir de medios de cultivo que utilizan glucosa como fuente de
carbono, por lo que su producción sólo resulta económicamente viable para la obtención de productos de
muy alto valor agregado. El diseño de un medio que utilice principalmente fuentes de C y N de muy bajo
costo, amplía largamente las aplicaciones comerciales de la BNC. Dentro de este rango de sustratos, los
residuos agroindustriales como los hollejos de uva remanentes de la elaboración de vino resultan
altamente atractivos ya que son fuente directa de azúcares fermentescibles (glucosa y fructosa) fácilmente
utilizados por estos microorganismos, y requieren un acondicionamiento previo muy sencillo,
prescindiendo de tratamientos extremos tales como acidificaciones o elevadas temperaturas de trabajo.
Por otro lado, dichos residuos aportan una alta carga orgánica por lo cual deben ser tratados antes de
disponerse al medio ambiente, por lo que su utilización disminuye también los costos de tratamiento de
desechos.
Para la formulación de un medio de cultivo y de las condiciones de incubación en la producción de BNC,
resultan de gran utilidad los Diseños Experimentales de Selección. Para este caso, el análisis de los
valores estadísticos obtenidos mediante ecuaciones del tipo (para cinco variables):
Y = β0 + β1 x1+ β2 x2+ β3 x3+ β4 x4+ β5 x5
[1]
permite conocer qué variables influyen significativamente en el proceso, así como si aumentan o
disminuyen la respuesta propuesta “Y” (ej.: producción de BNC) en el rango estudiado [12]. Al llevarse a
cabo los experimentos dados por la matriz propuesta por el diseño y evaluarse la respuesta, en el caso de
analizarse 5 variables, se obtienen los coeficientes βi correspondientes a la ecuación [1].
En el presente trabajo, la BNC obtenida en las condiciones de máxima producción identificadas a partir
del diseño experimental descripto, fue seguidamente caracterizada en términos de morfología,
distribución de diámetros, estructura química, propiedades térmicas y cristalinidad; comparando los
resultados con los obtenidos para la BNC sintetizada a partir de una fuente de carbono tradicional de
mayor costo como la D-glucosa.
2. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL / METODOLOGÍA
2.1 Microorganismo utilizado, medios de cultivo y condiciones de incubación
Se trabajó con una cepa de Gluconacetobacter xylinus (syn. Acetobacter aceti subsp. xylinus, Acetobacter
xylinum) NRRL B-42 cedida gentilmente por el Dr. Luis Ielpi (Fundación Instituto Leloir, Buenos Aires,
Argentina). Los inóculos se cultivaron en el medio Hestrin y Schramm (HS) compuesto por (%, p/v):
glucosa, 2.0; peptona de carne, 0.5; extracto de levadura, 0.5; fosfato disódico, 0.27; ácido cítrico, 0.15
(pH = 6.0) y se incubaron a 28ºC con agitación (250 rpm) por 48 h en frascos Erlenmeyers manteniendo
una relación vol. de medio a vol. de frasco de 1:5.
Los cultivos para la producción de BNC se incubaron sin agitación en medios conteniendo
concentraciones variables de extractos de hollejos de uva como fuente de carbono o D-glucosa
(controles), y de macerado de maíz (cedido por un productor local) en las concentraciones y condiciones
establecidas por la matriz del diseño experimental, manteniéndose la misma relación de vol. medio: vol.
de frasco que en los inóculos.
2.2 Hollejos de uva
Los hollejos provenientes de la elaboración de vino fueron gentilmente cedidos por las Dras. M. Combina
y C. Rojo (INTA; Luján de Cuyo, Mendoza, Argentina). A partir de ellos se preparó un extracto por
homogeneización mecánica con agregado de volúmenes adecuados de agua, y luego se filtró a través de
papel Whatman Nº 3 y el pH se ajustó a 5.0 unidades con NaOH. La concentración de glucosa y fructosa
se determinó mediante el kit enzimático Boehringer-Mannheim/ R-Biopharm, Cat. No. 10 139 106 035, o
bien mediante el método de 3,5-dinitrosalicílico para la determinación de azúcares reductores. Los
extractos se caracterizaron entonces en función del contenido de los azúcares presentes.
2.3. Determinación de la producción de BNC
Las películas de BNC obtenidas se enjuagaron con agua y luego se hirvieron en una solución de NaOH
2% p/v durante una hora, para luego ser lavadas con agua destilada hasta pH neutro [13]. Posteriormente,
se determinó el peso seco de las películas mediante una termobalanza Precisa XM50. Los resultados se
expresaron como g de masa seca de BNC/ L de medio.
2.4. Diseños experimentales estadísticos
Se aplicó un diseño de selección Fraccional Factorial de tres niveles, considerándose cinco variables:
concentración de glucosa y fructosa provenientes de los hollejos de uva (AR, 10.0 a 60.0 g/L),
concentración de macerado de maíz (MM, 0.0 a 2.0 g/L), concentración del inóculo (I, 104 a 105 cél/mL),
temperatura de incubación (T, 24 a 37ºC) y tiempo de incubación (t, 4 a 20 días). Las variables
codificadas se calcularon según la siguiente ecuación:
xi =
Xi − Xo
∆X i
y la respuesta considerada fue la producción de BNC (g/ L).
[2]
2.5 Caracterización de la BNC
La película de BNC obtenida en las condiciones de máxima producción fue caracterizada mediante
microscopía electrónica de barrido, espectroscopía infrarroja por ATR, difracción de rayos X y
termogravimetría. Para estos estudios, las películas se lavaron con agua y luego se licuaron por 5 minutos.
La BNC recuperada se sumergió en KOH 5% p/v por 14 h y se lavó con agua hasta neutralización, para
ser luego homogeneizada en presencia de agua por 5 minutos más [14].
Para los estudios de microscopía electrónica de barrido (microscopio electrónico de barrido Zeiss Supra
40 operado a 3 kV), el homogenato fue convenientemente diluido en agua destilada. Para los ensayos de
difracción de rayos X (difractómetro Rigaku D/Max-C con goniómetro vertical, Theta-Theta, Wide Angle
Goniometer, ánodo de Cu, longitud de onda: 1.5406 A, rango de 2θ: 5 a 40º), espectroscopía infrarroja
por transformada de Fourier (espectrómetro Nicolet 6700 Thermo Scientific equipado con un accesorio de
ATR Smart Orbit), y termogravimetría (TGA-50 Shimadzu, rampas en el rango de 25°C a 550°C con una
velocidad de calentamiento de 10°C/min bajo atmósfera de nitrógeno (30 mL/min)), las suspensiones de
celulosa fueron previamente secadas a 45ºC por 3 h.
3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
3.1 Diseños experimentales
La Tabla 1 muestra la matriz experimental del Diseño Fraccional Factorial realizado, y la respuesta
obtenida expresada como producción de BNC (g/L). Las variables se expresan en valores reales, y entre
paréntesis se escriben los valores codificados correspondientes.
Tabla 1. Diseño Factorial Fraccional: Valores reales y codificados de las variables estudiadas y
respuesta obtenida expresada como producción de BNC.
Experimento
AR (g/L)
MM (g/L)
60 (+1)
2 (+1)
1
60 (+1)
2 (+1)
2
60 (+1)
2 (+1)
3
60 (+1)
0 (-1)
4
10 (-1)
0 (-1)
5
60 (+1)
0 (-1)
6
35 (0)
1 (0)
7
60 (+1)
0 (-1)
8
10 (-1)
2 (+1)
9
60 (+1)
0 (-1)
10
10 (-1)
0 (-1)
11
35 (0)
1 (0)
12
10 (-1)
2 (+1)
13
10 (-1)
2 (+1)
14
10 (-1)
0 (-1)
15
10 (-1)
0 (-1)
16
10 (-1)
2 (+1)
17
35 (0)
1 (0)
18
60 (+1)
2 (+1)
19
*Promedio de dos ensayos independientes.
I (cél/mL)
T (ºC)
t (d)
4 (-1)
6 (+1)
6 (+1)
6 (+1)
4 (-1)
4 (-1)
5 (0)
6 (+1)
6 (+1)
4 (-1)
6 (+1)
5 (0)
6 (+1)
4 (-1)
6 (+1)
4 (-1)
4 (-1)
5 (0)
4 (-1)
24 (-1)
24 (-1)
37 (+1)
37 (+1)
24 (-1)
24 (-1)
30,5 (0)
24 (-1)
24 (-1)
37 (+1)
37 (+1)
30,5 (0)
37 (+1)
37 (+1)
24 (-1)
37 (+1)
24 (-1)
30,5 (0)
37 (+1)
20 (+1)
4 (-1)
20 (+1)
4 (-1)
20 (+1)
4 (-1)
12 (0)
20 (+1)
20 (+1)
20 (+1)
20 (+1)
12 (0)
4 (-1)
20 (+1)
4 (-1)
4 (-1)
4 (-1)
12 (0)
4 (-1)
BNC (g/L)
*
1,24
0,35
1,08
0,73
0,28
0,23
0,62
1,45
0,55
0,59
0,06
0,63
0,02
0,11
0,13
0,00
0,09
0,68
0,27
Reemplazando en la ecuación [1] los valores de los coeficientes encontrados, resulta:
BNC = -0,38 + 0,012*(AR) + 0,015*(MM) + 0,101*(I) – 0,0138*T + 0,028*t
[3]
Los coeficientes en negritas señalan las variables que resultaron significativas (p< 0,05) en el rango
estudiado, mientras que el signo positivo señala que el incremento de los mismos aumenta la respuesta
obtenida. Sólo el coeficiente correspondiente a la temperatura tuvo valor negativo (aunque no
significativo) lo que sugiere disminuir la temperatura máxima de incubación a ensayar en los próximos
estudios. Los valores de R2 obtenidos fueron de 0,75-0,76.
3.2. Caracterización de las películas
Las películas de BNC obtenidas en las condiciones correspondientes a la máxima producción (~1,5 g/L)
fueron seleccionadas para efectuar los ensayos de caracterización que se detallan a continuación y que
implican el uso de técnicas de microscopía electrónica, espectroscopia infrarroja, difracción de rayos X y
termogravimetría.
La Figura 1 muestra imágenes de microscopía electrónica de la BNC obtenida a partir de hollejos de uva
en las condiciones que maximizaron la producción de nanocelulosa. Las nanofibras de celulosa
producidas consistieron en cintas de sección rectangular que formaron un entretejido fibroso. La
determinación de la distribución de tamaños de las nanofibras obtenidas a partir de hollejos de uva arrojó
valores de anchos de las nanofibras de entre 35 y 70 nm, y espesores en el rango de 13 a 24 nm. La
comparación con las nanofibras obtenidas a partir de la fuente de carbono tradicional utilizada para la
producción de BNC (D-glucosa) demostró que no existen diferencias significativas en los tamaños de
nanofibras hallados usando hollejos de uva como fuente de carbono. En cuanto al largo de las nanofibras,
en ambos casos las mismas tuvieron longitudes de varios micrones.
Figura 1. Nanofibras de celulosa obtenidas por vía bacterial utilizando hollejos de uva como fuente de
carbono.
El análisis por difractometría de rayos X de la BNC obtenida a partir de hollejos de uva en las
condiciones optimizadas, reveló picos cristalinos en 2θ= 14.62° (1-10), 16.29° (110) y 22.48° (200), los
cuales confirmaron que la celulosa obtenida corresponde a Celulosa I. No se encontraron picos de
difracción en las posiciones típicas de Celulosa II (2θ= 12.1º y 20.8º). La Celulosa I es la estructura
cristalina de la celulosa con mayor módulo elástico axial [1].
En cuanto a la cuantificación del índice de cristalinidad (CI) de la celulosa, existen diversos métodos de
cálculo tal cual fuera relevado por Park et al., 2010 [15]. En el presente trabajo se calculó la cristalinidad
de las BNC utilizando un método basado en el área relativa de los picos cristalinos respecto del área total
del difractograma, y el ampliamente utilizado método de Segal, muy reconocido por la sencillez de su
aplicación y que basa sus cálculos en la intensidad de un pico asociado a la contribución cristalina y otra
intensidad asociada a la contribución amorfa de la celulosa. La Tabla 2 resume los valores de CI
obtenidos para la BNC de hollejos de uva por los dos métodos descriptos. Se incluyen así mismo los
resultados correspondientes a la BNC obtenida a partir de D-glucosa como fuente de carbono. Los
resultados demostraron que por ambos métodos usados en el cálculo de CI, la cristalinidad relativa de la
BNC obtenida a partir de hollejos de uvas es similar a la hallada para la BNC de D-glucosa.
Tabla 2. Índice de cristalinidad de BNC obtenida a partir de hollejos de uva y D-glucosa.
Fuente de carbono
CI (%) (método
de las áreas)
74
77
Hollejos de uva
D-glucosa
CI (%) (método
de Segal)
89
92
896
1109
1050
1644
1428
2898
Absorbancia
3342
La Figura 2 muestra el espectro infrarrojo de la BNC obtenida a partir de hollejos de uvas en
comparación con el espectro correspondiente a la BNC procedente de D-glucosa. Los espectros
infrarrojo muestran bandas típicas de la Celulosa I. La banda centrada en 896 cm-1 es característica de los
polímeros de glucosa. La banda en 1050 cm-1 es atribuible a funcionalidades del tipo C-O-C. La banda
en 1109 cm-1 corresponde al estiramiento C-O. La banda en 1159 cm-1 es asignable a los enlaces C-O-C
de la celulosa. La banda centrada en 1428 cm-1 puede asociarse grupos CH2 y carboxilatos superficiales.
La banda en 1644 cm-1 corresponde a vibraciones H-O-H originadas por agua absorbida en la celulosa.
La banda en 2898 cm-1 corresponde al estiramiento CH2. Los grupos hidroxilos de la celulosa se
manifiestan en la banda en 3342 cm-1.
hollejos de uva
D-glucosa
4000
3500
3000
2500
2000
1500
1000
500
-1
Numero de onda (cm )
Figura 2. Espectro infrarrojo de películas de BNC obtenidas por vía bacterial utilizando hollejos de uva
y D-glucosa como fuentes de carbono.
100
90
Masa residual (%)
80
70
60
50
40
D-Glucosa
30
20
Hollejos de uva
10
0
0
50
100
150
200
250
300
350
400
450
500
550
Temperatura (°C)
Figura 3. Termograma de películas de BNC obtenidas por vía bacterial utilizando hollejos de uva y Dglucosa como fuentes de carbono.
La Figura 3 recoge los termogramas obtenidos para las películas de BNC producidas a partir de hollejos
de uvas y de D-glucosa. En ambos termogramas se observan dos regiones de pérdida de masa. La
primera de ella corresponde a la deshidratación de las membranas de BNC y se observa en el rango de 25
a 150°C. La segunda región de pérdida de masa se observó en el rango de 200 a 400°C y la literatura
demuestra que corresponde a la descomposición de celulosa [16]. En cuanto a las temperatura Tonset y
Tmax del pico de descomposición de celulosa halladas a partir de la derivada primera de los datos de
termogravimetría, los valores determinados para la BNC de hollejos de uva (Tonset= 230°C, Tmax= 379°C)
son similares a los hallados para la BNC obtenida a partir de D-glucosa (Tonset= 221°C, Tmax= 378°C).
4. CONCLUSIONES
Se comprobó la factibilidad de obtener nanocelulosa bacteriana a partir de un desecho de la industria
vitivinícola, mediante un tratamiento sencillo de los hollejos de uva residuales. Los extractos obtenidos a
partir de dichos hollejos proveyeron de una fuente de C fácilmente utilizable por el microorganismo
empleado (G. xylinus) bajo la forma de los azúcares reductores glucosa y fructosa. El medio de
fermentación se suplementó con una fuente de N usualmente utilizada industrialmente, como es el
macerado de maíz, subproducto de la obtención de almidón de maíz.
Con respecto a la caracterización realizada sobre la BNC obtenida a partir de hollejos de uva en
condiciones de máxima producción, los estudios de morfología y distribución de diámetros demostraron
que se trata de cintas de de sección rectangular con anchos en el rango de 35-70 nm y espesores en el
intervalo de 13-24 nm, habiéndose obtenido similares a los hallados para BNC obtenida a partir de Dglucosa. El estudio de rayos X así como la espectroscopia infrarroja confirmaron que se trata de Celulosa
I tanto en el caso de las películas de BNC obtenidas a partir de hollejos de uvas como de D-glucosa. Los
valores de índice de cristalinidad determinados fueron similares para ambos métodos de cálculo elegidos,
y coinciden con los rangos reportados en la literatura. También las temperaturas características de la
descomposición de BNC determinadas fueron similares para las dos fuentes de carbono utilizadas.
Similitudes morfológicas, estructurales y térmicas entre las microfibrillas de celulosa microbianas
obtenidas a partir del residuo de la producción vitivinícola y del sustrato tradicional y de mayor costo Dglucosa, sugieren que los hollejos de uva son una fuente de carbono atractiva para la reducción de los
costos de la producción industrial de BNC.
Por todo esto, el medio de fermentación y la metodología aquí estudiada permitirían obtener BNC con
mayor rentabilidad a escala comercial, ampliando así sus potenciales aplicaciones, y disminuyendo a la
vez el vertido de efluentes de alta carga orgánica al ambiente.
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