Protocolos para la obtención y diagnóstico de - Sede del Atlántico

Protocolos para la obtención y diagnóstico de Sistema
de cultivos
Fusarium oxysporum f.sp. cubense
MSc. Gerardo Pérez León
Laboratorio de investigación en Fitopatología y Biología molecular
Dr. Luis Gómez Alpízar
MSc. Ana Tapia Fernández
Biotecnología de plantas
Centro de Investigaciones Agronómicas Laboratorio de investigación en Fitopatología Universidad de Costa Rica
Sede del Atlántico‐Turrialba, CIA
2014
Obtención de muestra de tejido vegetal con marchitez por Fusarium
 Mantener registro de procedencia.
 Conservar en frío (4–6 oC).
 Ingresar sólo en laboratorios certificados.
Traslado
Laboratorio
Campo
Pérez‐Tapia
2
Aislamiento de Fusarium oxysporum f.sp cubense de tejido vegetal infectado
 Necesario garantizar condiciones asépticas.
 Equipo y materiales básicos:
 Cámara de flujo laminar.
 Placas con medio de cultivo PDA.
 Bisturí, pinzas.
 Papel toalla estéril.
 Alcohol 70%; Hipoclorito de sodio 1.5%.
 Agua destilada estéril.
 Mechero o bactoincinerador.
 Parafilm o plástico adherente.
 Incubadora 25‐26°C.
Hipoclorito 1.5%
Modificado de Agrios 2005
Agua estéril
Pérez‐Tapia
3
Obtención de cultivos monoconidiales de Fusarium oxysporum f.sp cubense
2000µl agua destilada estéril
100µl suspensión madre
900µl agua destilada
Agar Agua
Suspensión 10‐1
990µl de agua destilada estéril
10µl de suspensión 10‐2
20µL
12 horas incubación 25ºC
10µl de suspensión 10‐1
Suspensión 10‐4
90µl de agua destilada estéril
Suspensión 10‐3
Pérez‐Tapia
4
Sistemas de conservación de Fusarium oxysporum f.sp cubense
 Útil para desarrollo de colecciones.
 Sistemas de bajo costo y alta eficiencia (hasta 2 años).
 Equipo y materiales básicos:









Cámara de flujo laminar.
Placas con medio de cultivo PDA.
Tubos de vidrio con PDA.
Papel filtro estéril.
Bisturí, pinzas.
Mechero o bactoincinerador.
Parafilm o plástico adherente.
Incubadora 25‐26°C.
Refrigerador a 4°C.
Papel filtro con PDA
Tubo de vidrio con PDA inclinado
Pérez‐Tapia
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Extracción de ADN de Fusarium oxysporum f.sp cubense
 Modificado de propuesto por Rogers and Bendich (1988).
 Método accesible: bajo costo y reactivos disponibles.
 Duración intermedia.
 Eficiente rendimiento en la obtención de ADN amplificable (50‐
500ng/µl).
 Es conveniente usar micelio con 10‐12 días de edad.
 Requiere bajas cantidades iniciales de tejido del hongo (200‐400mg).
ROGERS SO, BENDICH AJ. 1988. Extraction of DNA from plant tissues. In: Gelvin SB, Schilperoort RA (eds). Plant
Molecular Biology Manual. Boston, MA: Kluwer Academic Publisher. pp A6:l-10.
Pérez‐Gómez
6
Extracción de ADN de Fusarium oxysporum f.sp cubense
 Requiere personal capacitado y condiciones asépticas.  Utiliza equipo básico de laboratorio:
Baño maría.
Vortex
Microcentrifuga
Micropipetas
Molino o taladro
Capilla de extracción de gases
Pérez‐Gómez
7
Extracción de ADN de Fusarium oxysporum f.sp cubense
Buffer CTAB
Buffer de extracción ‐20ºC
Buffer TE
Mezcla Fenol:Cloroformo:Alcohol
isoamilico
Secado
2 lavados con Etanol 70%
Acetato de sodio + Isopropanol
Pérez‐Gómez
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Diagnóstico de Fusarium oxysporum f.sp cubense por Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR)  Varios regiones de ADN propuestas.
 Es conveniente disponer de al menos dos set de cebadores para el diagnóstico.
 Requiere personal capacitado y la interpretación pertinentes de resultados.
 Precisa condiciones asépticas.
 Utiliza equipo como:
 Vortex
 Microcentrifuga
 Micropipetas
 Termociclador
 Fuente de poder
 Cámara de electroforesis
 Transiluminador o equipo de documentación
Pérez‐Gómez
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Diagnóstico de Fusarium oxysporum f.sp cubense por Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) Autor
Región
Cebador
Secuencia
5'‐CGCCAGGACTGCCTCGTGA‐3'
5'‐CAGGCCAGAGTGAAGGGGAAT‐
3'
5’‐CACGTTTAAGGTGCCATGAGAG‐
3’
5’‐GCCAGGACTGCCTCGTGA‐3’*
Bentley et al.
IGS
TR4‐F2
TR4‐R1
Dita et al.
IGS
FocTR4‐F
Lin et al.
FocTR4‐
R(s)
SCARS(O Foc 1
P‐A02) Foc 2
EF1
TEF
Condiciones térmicas
T. Desn2
T. Alinea3
T. Exten4
Exten. Final5
68
60
72
5min**
72
3min
95
60
72
72
60s
60s
3min
10min
Tamaño
pB
Ciclos
T. Desn. Inic.1
1500
30
95
2min
95
30s
463
30
95
5min
5′‐CAGGGGATGTATGAGGAGGCT‐3’
242
35
94
94
68
72*
72
5′‐GTGACAGCGTCGTCTAGTTCC‐3’
60s
30s
30s
90s
10min
O’Donnell et 5’‐
750
35
94**
94**
63**
72**
72
ATGGGTAAGGA(A/G)GACAAGAC‐
al.
3’
5’‐
EF2
3min**
45s**
60s**
45s
5min
GA(G/A)GTACCAGT(G/C)ATCATGTT
‐3’
1Temperatura de desnaturalización inicial, 2Temperatura de desnaturalización, 3Temperatura de alineamiento, 4Temperatura de extensión; 5Extensión final
*Este iniciador sustituye a la versión larga del Reverse (FocTR4‐R‐5’‐CGCACGCCAGGACTGCCTCGTGA‐3’) publicada por Dita et al 2010.
** Corresponden a valores estandarizados para CIA 2010‐2012
Pérez‐Gómez
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Diagnóstico de Fusarium oxysporum f.sp cubense por Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) Solución madre o “master mix”
dSH2O
1x = _
25µl _x
12.55 µl
Buffer polimerasa
2.5 µl
Reactivo
dNTPs (2 mM)
2 µl
imprimador F* (10 mM)
2 µl
imprimador R** (10 mM)
2 µl
MgCl2 (25 mM)
1.7 µl
Taq polimerasa (5U)
0.25 µl
Subtotal
23 µl
ADN (10 ng)
2 µl
Total de reacción
25 µl
*Iniciador Forward
**Iniciador Reverse
ADN muestras por evaluar
Electroforesis
‐‐‐‐Foc‐‐‐‐‐‐‐ No + ‐
Foc
‐‐
Pérez‐Gómez 11
Electroforesis de productos de Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) y registro
Producto de PCR
463pb
1400pb
Turrialba
Caribe P. Zeledón China
Pérez‐Gómez
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MSc. Gerardo Pérez León
[email protected]
UNIVERSIDAD DE COSTA RICA
Sede del Atlántico, Turrialba
Costa Rica 2014
Pérez‐León G, Tapia‐Fernández A, Gómez‐Alpizar L. 2014. Protocolos para la obtención y diagnóstico de Fusarium oxysporum f.sp. cubense. I Reunión REMIFOC. San José, CR. 1‐3 Setiembre, 2014. Presentación digital. 14diaspositivas.
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Referencias
 AGRIOS GN. 2005. Plant pathology. 5th Edition, Elsevier Acad. Press. Burlington. Mass, EU. 948p
 BENTLEY S, PATTEMORE J, MOORE NY. 2003. Foc tropical race 4 diagnostic manual. Cooperative Research Centre for Tropical Plant Protection, Queensland University, St. Lucia, Australia.
 DITA MA, WAALWIJK C, BUDDENHAGEN IW, SOUZA JR MT, KEMA GHJ. 2010. A molecular diagnostic for tropical race 4 of the banana Fusarium wilt pathogen. Plant Pathology (59): 348–357.
 LIN YH, CHANG JY, LIU ET, CHAO CP, HUANG JW, CHANG PFL. 2009. Development of a molecular marker for specific detection of Fusarium oxysporum f. sp. cubense race 4. Eur. J. Plant Pathology (123): 353–365.
 O’DONNELL K, KISTLER HC, CIGELNIK E, PLOETZ RC. 1998. Multiple evolutionary origins of the fungus causing Panama disease of banana: concordant evidence from nuclear and mitochondrial gene genealogies. Proc. Natl. Acad. Sci. (95): 2044–2049.
 ROGERS SO, BENDICH AJ. 1988. Extraction of DNA from plant tissues. In: Gelvin SB, Schilperoort RA (eds) Plant Molecular Biology Manual. Boston, MA: Kluwer Academic Publisher. pp A6:l‐10.
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