UNIVERSIDAD PERUANA CAYETANO HEREDIA - UPCH

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UNIVERSIDAD PERUANA CAYETANO HEREDIA
DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA BIOLOGÍA MOLECULAR Y FARMACOLOGÍA
LABORATORIO EN BIOQUÍMICA
2006
ESPECTROFOTOMETRÍA UV-Vis, ABSORCIÓN ATÓMICA Y DE FLUORESCENCIA
I. FUNDAMENTOS
La luz está compuesta por ondas electromagnéticas.
Una onda electromagnética consiste en un campo magnético y un campo eléctrico, perpendiculares
entre sí, los cuales oscilan de forma sinusoidal a medida que se propagan a través del espacio, con una
velocidad de 300,000 Km/seg.
Por motivos de conveniencia, se puede también considerar que la luz consiste en un flujo de cantidades
discretas de energía denominadas cuantos o fotones. La cantidad de energía de cada cuanto determina
la longitud de onda de la radiación.
La relación entre energía y longitud de onda está descrita por la siguiente ecuación:
E=
donde
hc
-- = hv
L
h = constante de Planck = 6.63 x E-34
c = velocidad de la luz
L = longitud de onda (distancia entre la cresta de dos ondas adyacentes)
v = frecuencia (número de oscilaciones por segundo)
Cuando una de estas ondas encuentra una molécula, puede ser dispersada (alterada su dirección de
propagación) o bien absorbida (su energía se transfiere a la molécula). Si la energía electromagnética de
la luz es absorbida, se dice que la molécula está excitada, o en un estado excitado. La región de las
moléculas que pueden ser excitadas por la absorción de la luz se denominan cromóforos.
En un átomo en estado fundamental (no excitado), los electrones ocupan los niveles energéticos más
bajos.
Para pasar a un estado excitado, la energía del electrón debe elevarse en una cantidad correspondiente a
la diferencia de energía entre el nivel fundamental y el excitado (el átomo absorberá sólo los cuantos
que correspondan exactamente a la energía requerida para la transición1). De acuerdo a ello, una
longitud de onda L sólo puede ser absorbida si
L=
hc
------- = hv
E2 – E1
donde,
E1 = energía del electrón en el nivel original
E2 = energía del electrón en el nivel final
Cuando se producen enlaces entre los átomos para formar una molécula, los electrones adquieren
nuevas posiciones en el sistema y por tanto nuevos niveles de energía. Además, los átomos de una
molécula pueden vibrar y rotar alrededor de un eje de enlace, dando origen a subniveles energéticos
vibratorios y rotatorios. Lo mismo que en los átomos, cada uno de los electrones de una molécula ocupa
el nivel de más baja energía que le es posible (el estado fundamental). Análogamente, en las
1. Se denomina transición al cambio entre dos niveles de energía.
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condiciones correctas, un electrón puede adquirir energía, lo que lo eleva a un nivel energético superior
(a un estado excitado).
Se denomina espectro de absorción a una representación gráfica de la probabilidad de absorción de
energía de un sistema a diferentes longitudes de onda.
Debido a la carencia de subniveles energéticos vibratorios en los sistemas elementales, los espectros de
absorción de los átomos son simples espectros de líneas estrechas y claramente separadas.
Dado que en las moléculas el estado fundamental y cada estado excitado están subdivididos en cierto
número de subniveles energéticos, los espectros de absorción de las moléculas se ven generalmente
como espectros de bandas (como son posibles las transiciones entre el estado fundamental y cualquiera
de los niveles de vibración y de rotación del primer estado excitado, las moléculas pueden interactuar
con radiaciones de una amplia gama de longitudes de onda, provocando la producción de espectros en
varias regiones distintas).
Regiones de energía electromagnética
Las radiaciones electromagnéticas se subdividen en varias categorías, de acuerdo a su longitud de onda.
Cada longitud de onda produce diferentes fenómenos físicos en un sistema, de acuerdo a su nivel
energético (fig. 3).
Algunas de estas regiones dan información de gran utilidad al bioquímico y se emplean rutinariamente,
mientras que otras regiones, que requieren aparatos más sofisticados y más experiencia, se utilizan sólo
para la investigación detallada de macromoléculas y otras estructuras subcelulares.
L o n g itu d d e o n d a (n m )
2
0 .1
1
10
R E G IO N
R ayo s X
EFEC TO
E le ctro n e s e xcita d o s
a m a yo re s n ive le s e n erg é tico s
C ap a in te rn a
M E D IO S D E
E S T U D IO
4
10
10
UV
V is
10
In fra rro jo
V ib ra ció n
m o le cu la r
6
10
5
10
M icro o n d a s
R ota ció n
m o le cu la r
C ap a e xte rn a
E sp e ctro sco p ía
d e a b so rció n
n o rm a l
fig . 3 :
3
E sp e ctro sco p ía
infra rro ja
y R am an
R eso n a n cia
m a g n é tica
n u cle a r
P a rte d e l e s p e c tro e le c tro m a g n é tic o d e im p o rta n c ia p a ra la b io q u ím ic a
Para la mayor parte de moléculas, las longitudes de onda correspondientes a las transiciones entre el
estado fundamental y cualquiera de los niveles de vibración del primer estado excitado caen en las
zonas ultravioleta y visible del espectro electromagnético. También son posibles transiciones de baja
energía entre distintos niveles de vibración dentro del mismo nivel electrónico. Estas transiciones se
producen en la zona de las radiaciones infrarrojas.
La espectrofotometría es una de las técnicas analíticas más valiosas de que disponen los bioquímicos.
Se pueden identificar compuestos desconocidos por su espectro de absorción característico en el
ultravioleta, visible o infrarrojo (tabla 1). Pueden determinarse las concentraciones de compuestos
conocidos midiendo la absorción de luz a una o más longitudes de onda. Frecuentemente las reacciones
catalizadas por enzimas pueden seguirse midiendo espectrofotométricamente la aparición de un
producto o la desaparición de un sustrato.
3
TABLA 1.
LONGITUDES DE ONDA DE LAS RADIACIONES ELECTROMAGNETICAS
EN LA REGION VISIBLE DEL ESPECTRO
Violeta
390 - 422 nm
Azul
422 - 492
Verde
492 - 535
Amarillo
535 - 586
Naranja
586 - 647
Rojo
647 - 770
Ley de Lambert-Beer
La fracción de luz incidente que es absorbida por una sustancia, depende: 1) del espesor de la muestra,
2) de la concentración del compuesto absorbente y 3) de la naturaleza química del compuesto.
La relación matemática entre la concentración y la luz absorbida por una sustancia particular fue
formulada por Lambert (Ley de Lambert).
La relación matemática entre la longitud del paso de luz y la luz absorbida por una sustancia particular
fue formulada por Beer (Ley de Beer).
La ley de Lambert-Beer expresa la relación matemática entre la concentración, longitud del paso de luz
(espesor de la muestra) y la luz absorbida por una sustancia particular:
Io
Log -----I
=acl
donde
a = índice de absorbancia o "coeficiente de extinción" para el compuesto particular.
log Io/I = absorbancia (A) o densidad óptica (O.D.).
Si la concentración está expresada en molaridad, a se denomina coeficiente de extinción molar o
coeficiente de absorción molar (am o E).
Si la concentración está dada en g/L, a es llamado coeficiente de absorción específica (as)
am = as x PM
(PM = peso molecular)
Si la concentración está dada en porcentaje peso/volumen al coeficiente de extinción se le da el símbolo
de a1% o E1%
En la mayoría de cálculos bioquímicos se emplean molaridades y coeficientes de extinción molar.
Además, el espesor de la cubeta es generalmente igual a 1 cm. Por lo tanto, a m tiene generalmente
como unidades M-1x cm-1.
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Los coeficientes de absorción varían con las diferentes longitudes de onda. Así, por ejemplo, a m340 se
refiere al coeficiente de extinción molar de una sustancia a 340 nm.
La absorbancia de una solución 1 M de una sustancia a una longitud de onda determinada, medida en
una cubeta de 1 cm de paso, sería numéricamente igual a am. Nótese que la absorbancia es función
lineal de la concentración:
A = amcl
Naturaleza exponencial de la ley de Lambert-Beer:
Consideremos un rayo de luz que atraviesa una cubeta de 1 cm de paso la cual contiene 1 mg/ml de un
compuesto que absorbe la luz. Supongamos que 80% de la luz incidente es transmitida (20% es
absorbida) (fig.4A).
Ahora coloquemos una cubeta idéntica en el paso de luz justo detrás de la primera. Cuál es la intensidad
de la luz transmitida a través de ambas cubetas?. La ley de Lambert y Beer no es una relación lineal. De
esta manera I2 no es 0.6, y cada centímetro de paso de luz no absorbe una cantidad constante de luz,
sino que cada centímetro absorbe 20% de la luz incidente. La luz incidente en la segunda cubeta es 0.8,
y ésta absorbe 20% de luz que recibe (0.16) y transmite el 80 % restante (0.64), que correspondería a
64% de la luz incidente original (fig.4B).
Se habrían obtenido exactamente iguales resultados si utilizando cubetas con 2 cm de paso o
incrementado la concentración del compuesto absorbente, manteniendo l constante (fig.4C).
A.
Io = 1 .0 0
I1 = 0 .8 0
c = 1 m g /L
l = 1 cm
B.
Io = 1 .0 0
I1 = 0 .8 0
I2 = 0 .6 4
c = 1 m g /L
c = 1 m g /L
l = 1 cm
l = 1 cm
C.
Io = 1 .0 0
I = 0 .6 4
c = 1 m g /L
l = 2 cm
fig . 4 :
N a tu ra le za e xp o n e n cia l d e la le y d e L a m b e rt-B e e r
Desviaciones de la ley de Beer
En ciertos casos, si c es muy alta, am pasa a ser función de c, y entonces puede decirse que se viola la
ley de Beer. Esto puede suceder a causa de la dispersión de la luz o de cambios estructurales en el
sistema (p.ej. dimerización, agregación o cambios químicos) que pueden ocurrir a elevadas
concentraciones (fig.5).
5
C o n c e n tr a c ió n
b a ja
C o n c e n tr a c ió n
D e s v ia c ió n
a lta
S e c u m p le
p o s itiv a
D e s v ia c ió n
n e g a tiv a
D en sid a d
ó p tica
C oe ficie n te
de
e xtin ció n
L2
L1
L3
C on ce n tra ció n
L o n g itu d d e o n d a
fig .5 :
D e svia cio n e s d e la le y d e B e e r
II. ESPECTROFOTOMETRIA VISIBLE Y ULTRAVIOLETA
Como ya se mencionó, los espectros de absorción en la región ultravioleta y visible se deben a
transiciones de energía de los electrones exteriores de la molécula, participen o no en los enlaces.
Generalmente están implicados electrones deslocalizados, tales como los electrones de enlace  de los
dobles enlaces C=C, y el par solitario del nitrógeno y el oxígeno.
Componentes de un espectrofotómetro
Las mediciones de absorbancia se realizan con un espectrofotómetro.
Aunque pueden variar en diseño, todos los espectrofotómetros constan de una fuente de luz, un
monocromador (para seleccionar la longitud de onda), un recipiente ópticamente transparente para
contener la muestra, un detector de luz y un registrador para medir las señales que envíe el detector.
Normas para el trabajo en espectrofotometría
1. Los ensayos espectrofotométricos generalmente se realizan en la longitud de onda a la que se
produce el pico de máxima absorción del cromóforo (Lmax).
En una misma molécula pueden existir varios cromóforos con diferentes Lmax; en estos casos se dice
que la sustancia tiene varios máximos de absorción (L1, L2 ...Ln).
Es conveniente confirmar la(s) longitud(es) de onda de máxima absorción cuando se realiza un ensayo
por primera vez.
2. La cubeta de referencia (blanco) debe contener todos los reactivos, excepto la sustancia que se
ensaya, en las mismas concentraciones que en las cubetas de ensayo.
3. La cubeta de referencia y su contenido requieren un cuidado especial, porque cualquier error
cometido en su preparación se reflejará en todos los valores obtenidos.
4. Normalmente, los ensayos deben realizarse por duplicado, y deben representarse los valores
individuales, no la media de ellos.
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5. Debe trazarse la mejor recta entre los puntos, no la mejor recta entre el origen y los otros puntos (si
la mejor recta no pasa por el origen, tanto el blanco como las otras muestras pueden estar mal
preparadas).
6. La curva de calibración puede variar de uno a otro lote de reactivos o de standard; también puede
variar entre ensayos. Por ello es útil construir una nueva curva de calibración cada vez que se hace un
ensayo.
7. Las curvas de calibración no pueden extrapolarse más allá del valor de absorbancia más alto medido.
8. Debido a la naturaleza logarítmica de la escala de absorción, es recomendable que las muestras se
lean entre valores de absorbancia de 0 y 0.7.
9. Si el valor de absorbancia de una muestra queda fuera de la curva de calibración, lo mejor es repetir
el ensayo con una concentración de muestra cuya absorbancia caiga dentro de esta curva.
Si el sistema cumple con la ley de Lambert-Beer, se diluyen las muestras y el blanco con una solución
apropiada (normalmente con la misma solución del blanco).
Para evitar la dilución, se pueden utilizar cubetas con paso de luz más corto.
10. En los ensayos espectrofotométricos la reproducibilidad del método por el experimentador es muy
importante (es esto lo que determina la exactitud de los datos finales). Los aparatos deben estar limpios;
los volúmenes, los tiempos y las temperaturas deben medirse cuidadosamente y seguirse con fidelidad
para obtener resultados reproducibles.
Factores que afectan las propiedades de absorción de un cromóforo
Aunque el espectro de absorción de un cromóforo está determinado básicamente por la estructura
química de la molécula, hay una gran cantidad de factores que pueden producir alteraciones detectables
en Lmax y en am. Son precisamente los efectos de estos factores ambientales los que proporcionan la base
para el uso de la espectroscopía de absorción como instrumento para la caracterización de
macromoléculas.
1. pH: El pH del solvente determina el estado de ionización del cromóforo. En el caso de la tirosina,
por ejemplo, tanto Lmax como am aumentan cuando se disocia el -OH fenólico (fig. 6).
L
m ax
pH 6: 274 nm
L m ax p H 1 3 : 2 9 5 n m
pH 13
4000
a
m
2000
pH 6
250
270
290
310
330
lo n g itu d d e o n d a (n m )
fig . 6 :
E sp e ctro d e a b so rció n d e la tiro sin a a p H 6 y 1 3
2. Polaridad del solvente: En los cromóforos polares (sobre todo si la molécula contiene O, N o S), la
Lmax aparece a longitudes de onda menores en los solventes polares que en los solventes no polares (fig.
7).
7
e tile n g lic o l 2 0 %
a
m
agua
250
260
270
280
290
300
lo n g itu d d e o n d a (n m )
fig . 7 : E fe c to d e la p o la rid a d d e l s o lv e n te s o b re e l e s p e c tro d e la tiro s in a
3. Orientación relativa de los cromóforos cercanos: Las características espaciales de la molécula ejercen
fuertes efectos sobre Lmax y am. El más conocido es el denominado hipocromía de los ácidos nucleicos.
La capacidad de absorción de luz disminuye en el DNA nativo con respecto a una solución con la
misma composición de nucleótidos libres, debido a las interacciones electrónicas entre las bases
apiladas de la cadena doble. Así, el coeficiente de extinción de una solución de DNA se hace mayor
mientras menos cercanos entre sí y más desordenados se encuentren los nucleótidos (mientras más
desnaturalizado esté el DNA) (fig. 8). Este fenómeno es conocido como efecto hipercrómico.
D N A d e d ob le ca d e n a
D N A d e ca de n a sim p le
a b s o rb a n c ia
n u cle ó tid o s lib re s
230
250
270
290
310
330
lo n g itu d d e o n d a (n m )
fig . 8 :
H ip o c ro m ía d e l D N A o e fe c to h ip e rc ró m ic o d e s u h id ró lis is
Ejemplos de aplicaciones
1. Concentración de proteínas
Existen varios métodos espectrofotométricos para la determinación de proteínas en solución.
El método de Biuret se basa en la reacción del Cu+2 con péptidos en una solución alcalina para dar
complejos púrpuras que tienen un máximo de absorción a 540 nm. El método se usa para soluciones
que tienen de 0.5 a 10 mg proteína/ml. Existen compuestos que interfieren con la lectura, tales como
tioles y NH4, que pueden removerse precipitando la proteína con un volumen igual de ácido
tricloroacético al 10%, resuspendiendo el precipitado que contiene las proteínas en NaOH 1 N.
El color producido por el método de Lowry resulta de la reacción de Biuret más la reducción del
reactivo de fosfomolibdato-fosfotungstato (Folin-Ciocalteu) por residuos de tirosina.
La mayoría de proteínas presenta un máximo de absorbancia a 280 nm, debido a la presencia de
aminoácidos aromáticos (tirosina, triptofano y fenilalanina). La absorbancia a 280 nm puede usarse
para medir proteínas en concentraciones entre 0.1 y 0.5 mg/ml, en la ausencia de sustancias que
interfieran con la lectura. Algunas preparaciones de proteínas parcialmente purificadas pueden tener
8
ácidos nucleicos, los cuales tienen un máximo de absorción a 260 nm. Una ecuación para calcular la
concentración de proteína en la presencia de ácidos nucleicos en cubetas de 1 cm de paso es:
[proteína]mg/ml = 1.55 A280nm - 0.76 A260nm
La ecuación fue derivada para enolasa (A280/A260 = 1.75) en la presencia de ácido nucleico de levadura
(A280/A260 = 0.49) y por tanto puede no ser precisa para otras proteínas y otros ácidos nucleicos. La
absorbancia a 280 nm de una solución de proteína 0.1% (p/v) varía entre 0.5 y 2.5, dependiendo de la
proporción de aminoácidos aromáticos que contengan.
Todas las proteínas absorben fuertemente debajo de 230 nm. Por ejemplo, la albúmina sérica bovina
(0.1% p/v) absorbe 5.0 y 11.7 a 225 y 215, respectivamente (comparado con 0.66 a 280 nm). La
absorbancia por debajo de 230 nm es debido al enlace peptídico. Consecuentemente los valores de
a0.1% son casi los mismos para todas las proteínas. Concentraciones de proteínas en el rango de 10 a
100 ug/ml pueden determinarse de la diferencia de absorbancias a 215 y 225 nm. Se prepara una curva
standard graficando A vs. proteínas.
(proteína)ug/ml = 144 (A1cm215 - A1cm225)
La diferencia de absorbancia es usada para minimizar errores que resulten de compuestos no proteicos
en solución. Altas concentraciones de ciertos buffers pueden interferir (no se puede usar 0.1 N NaOH
para disolver la proteína, pero 5 mM NaOH no causa problemas).
2. Concentración, composición y propiedades de los ácidos nucleicos
a) Para el DNA de cadena doble, una A260nm = 1 corresponde a una concentración de 50µg/ml (en este
caso la ley de Beer se cumple hasta una A = 2).
b) En los primeros trabajos para determinar la composicisión en bases del DNA, se hidrolizaba el DNA
y se separaban las bases por cromatografía. Las bases separadas se podían identificar obteniendo sus
espectros y midiendo la Lmax: 260.5 nm (adenina), 264.5 nm (timina), 275.0 (guanina), 267.0 (citosina).
Para evitar la determinación del espectro completo, se podían distinguir unas bases de otras midiendo la
razón A250/A280. Estos valores son 2.00 para la adenina, 1.26 para la timina, 1.63 para la guanina y 0.31
para la citosina. Después de haber identificado las bases, se calculaba la cantidad de cada una de ellas,
ya que los valores de am a Lmax son conocidos: 13,400 (adenina), 7,900 (timina), 8,100 (guanina) y
6,100 (citosina).
c) Como ya se ha discutido, la A260 del DNA aumenta debido al desapilamiento progresivo de los
nucleótidos. Esta fenómeno ha permitido dilucidar algunas de las principales propiedades del DNA,
mediante la evaluación de su estabilidad (midiendo la A260) respecto a distintas condiciones de
temperatura, pH, fuerza iónica, tipo de solvente y otras sustancias.
3. Concentración de microorganismos en una suspensión
La espectrofotometría también es útil para calcular la concentración de microorganismos en
suspensiones. A la longitud de onda que se utiliza (650 nm), toda la absorbancia aparente procede en
realidad de la dispersión de la luz ocasionada por las bacterias. Se debe hacer una curva de calibración
(absorbancia vs. concentración de la suspensión) para cada partícula que se analice, pues la cantidad de
energía dispersada depende del tamaño de la partícula en suspensión.
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ESPECTROFOTOMETRIA DE ABSORCION ATOMICA
La espectrofotometría de absorción atómica se basa en el hecho de que cada elemento, dependiendo de
su conformación electrónica, absorbe energía electromagnética a longitudes de onda específicas.
El espectrofotómetro de absorción atómica mide la cantidad de energía absorbida por los átomos
volatilizados y llevados a carga 0 en la llama. La energía absorbida es proporcional al número de
átomos presentes en el recorrido óptico.
Las longitudes de onda del espectro de un elemento que se absorben con más facilidad, son aquellas en
que el cambio de energía es mínimo, tales como la radiación anaranjada de la línea de transición D del
espectro del sodio, que implica una pequeña transición 3s-3p (fig. 1). Dado que las transiciones
posibles a los electrones de cualquier átomo vienen especificadas por los niveles de energía disponibles
y los niveles ocupados, los espectros atómicos son absolutamente característicos del elemento
implicado. Teóricamente, la estructura electrónica de los átomos más simples podría ser deducida a
partir de sus espectros de líneas.
Componentes de un espectrofotómetro de absorción atómica
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1. Fuente de radiación: Con objeto de producir un haz de radiación con una ancho de banda muy
estrecho, se utilizan lámparas de descarga de cátodo hueco o lámparas de descarga sin electrodo. Las
lámparas de descarga son específicas para el elemento que se ensaya.
2. Nebulizadores (atomizadores), llamas y horno de grafito: El nebulizador y el quemador tienen por
función producir átomos libres y con carga 0 a partir de la muestra que se ensaya.
La fuente de energía para producir átomos libres es el calor de combustión de ciertas mezclas de gases
(tabla 1). El átomo se lleva a carga 0 por acción de agentes óxido-reductores presentes en la mezcla de
gases.
La nebulización se produce mediante una corriente de aire comprimido que pasa por un tubo capilar,
cuya punta está sumergida en la solución de ensayo. El aerosol generado pasa por inyección directa,
con la corriente de aire, hacia el quemador.
Tabla 1. Mezclas de gases y temperaturas de las llamas utilizadas con mayor frecuencia en
espectrofotometría de absorción atómica.
Mezcla de gases
Temperatura °C
Ejemplos de elementos
ensayados
argón/hidrógeno
300-800
As, Se
aire/gas natural
1500
Na, K (Ca)
aire/propano
1900
Ca
aire/hidrógeno
2000
Cs, Rb, K, Na
aire/acetileno
2300
Ca, Mg, Fe, Li *
óxido nitroso/acetileno
2900
Ti, V *
(*) El 90% de los elementos son ensayados bajo estas condiciones.
La principal limitación del uso de la llama es que el sistema nebulizador-quemador es relativamente
ineficiente en la generación de la muestra. Sólo una pequeña fracción de la muestra alcanza la llama, y
la muestra atomizada pasa rápidamente a través del paso de luz.
En el horno de grafito, la llama es reemplazada con un tubo de grafito, calentado eléctricamente. La
muestra es introducida directamente en el tubo, que es calentado en forma seriada con objeto de
remover el solvente y los componentes principales de la matriz, y luego atomizar el resto de la muestra,
donde se encuentra el elemento problema. Toda la muestra es atomizada, y los átomos son retenidos
dentro del tubo, lo que permite que se mantengan en el paso de luz por un tiempo más largo. Estas
características hacen al horno de grafito un sistema con mayor sensibilidad que el tradicional
nebulizador-quemador.
Sin embargo, el tiempo requerido para el análisis con un horno de grafito es más largo, y no todos los
elementos que pueden ser analizados con nebulizador-quemador pueden serlo en horno de grafito.
3. Sistema óptico y detectores: Existen aparatos con ópticas de uno y doble haz. Los de doble haz
incluyen un colimador en el recorrido luminoso y en un circuito adecuado, que evita que la luz
descarriada se registre en el sistema detector.
Interferencias
Las interferencias en absorción atómica son de 5 tipos:
1. Química:
Ocurre cuando el elemento de interés se combina con algún otro catión o anión en solución para formar
un compuesto, que altera su grado de reducción a átomos neutrales en la llama utilizada. Así, el número
de átomos en la llama con capacidad de absorber la radiación emitida por la lámpara varía, variando
también la sensibilidad del ensayo.
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Este problema puede solucionarse, 1) utilizando una llama de mayor temperatura (lo que disminuiría la
probabilidad de formación del compuesto con el elemento problema), o 2) añadiendo un agente
"liberador" a la muestra, que puede reaccionar con el elemento de interés o con el elemento
interferente, de modo tal que no se produzca el compuesto causante de la interferencia.
2. De matriz:
Se pueden obtener errores en los resultados cuando las características físicas (viscosidad, tensión
superficial, etc.) de la muestra y del standard difieren considerablemente. Esto puede suceder cuando la
muestra contiene gran cantidad de sales o ácido, cuando se utilizan diferentes solventes para el standard
y la muestra, o cuando la temperatura del standard es muy diferente de la de la muestra.
Las interferencias de matriz pueden controlarse diluyendo la muestra hasta que el efecto de las sales
disueltas o el ácido sea despreciable. Cuando no es posible diluir la muestra, se pueden añadir al
standard los principales constituyentes de la matriz de la muestra; o si esto tampoco es posible, se
puede utilizar el método de adición (ver adelante).
3. De ionización:
Sucede cuando la temperatura de la llama es lo suficientemente alta como para generar la remoción de
un electrón de un átomo neutral, produciendo un ión cargado positivamente. Aunque este ión es
también capaz de absorber energía, lo hace a una longitud de onda diferente que el átomo con carga 0
(que es la longitud de onda que emite la lámpara específica). Al disminuir el número de átomos
neutrales en la llama, disminuye la sensibilidad de la lectura.
Esta interferencia puede controlarse añadiendo tanto al standard como a la muestra un exceso de algún
elemento fácilmente ionizable (más electronegativo que el elemento problema).
4. Espectrales:
Este tipo de interferencia se produce cuando un elemento presente en la muestra absorbe energía a una
longitud de onda similar al elemento que se quiere cuantificar. Esto produce falsas lecturas,
excesivamente altas.
5. Absorción de fondo
Ciertas muestras, al ser atomizadas, pueden absorber o dispersar la luz emitida por la lámpara fuente
debido a la presencia de moléculas en forma de gas, partículas de sal, humo, etc. El conjunto de estos
factores de interferencia se denomina "absorción de fondo". Por lo general, los efectos de la absorción
de fondo se hacen más notorios a longitudes de onda bajas.
Como el elemento de interés absorbe sólo la longitud de onda emitida por la lámpara fuente, la
absorción de fondo puede ser corregida leyendo la absorbancia de la muestra a una longitud de onda
cercana pero diferente a la del elemento problema.
Otra forma de corregir la interferencia por absorción de fondo es utilizando un dispositivo llamado
corrector de deuterio. En este sistema, se pasa la luz producida por la lámpara fuente y la producida por
un arco de deuterio en forma alternada a través de la llama. El elemento problema absorbe sólo la
longitud de onda proveniente de la lámpara fuente, mientras que la absorción de fondo ocurre en ambos
casos. Un dispositivo electrónico resta la señal de absorción de fondo de la absorción total, corrigiendo
la interferencia.
Método de adición
Este método se utiliza cuando la matriz en que se encuentra el elemento problema produce interferencia
en la lectura, y esta interferencia no puede ser reproducida en el standard (por ejemplo, su composición
es desconocida, o varía demasiado de muestra a muestra).
Procedimiento:
Se toman 3 alícuotas de la muestra. La primera se diluye con solvente a un volumen determinado. La
segunda y la tercera se llevan al mismo volumen pero con cantidades conocidas del elemento problema
(disuelto en el mismo solvente).
Se lee la absorbancia para cada solución y se grafican vs. la concentración de elemento problema
añadida (fig. 3). La recta obtenida se extrapola hasta el cero de absorbancia. El intercepto en el eje de
las x da la concentración del elemento problema en la muestra diluida.
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Para lograr una determinación precisa del elemento problema mediante este método, 1) la curva de
adición que se obtenga debe ser lineal, y 2) las cantidades conocidas de elemento problema que se
añaden deben tener aproximadamente la misma concentración que se espera para el elemento problema
en la muestra diluida.
INTRODUCCIÓN A LA FLUORESCENCIA
Las técnicas de la fluorescencia permiten a investigadores detectar los componentes y la estructura de
los complejos biomoleculares, incluyendo las células vivas, con gran sensibilidad y selectividad. El
propósito de esta introducción es delinear brevemente que es la fluorescencia.
El proceso de Fluorescencia
La fluorescencia es el resultado de un proceso de tres fases que ocurre en ciertos hidrocarburos
poliaromáticos o heterocíclicos llamados moléculas o tintes fluorescentes. Un fluoroforo es una sonda
fluorescente, que es diseñado para localizar una región específica dentro de un espécimen biológico o
para marcar un evento esperado a un estímulo específico. El proceso responsable de la fluorescencia de
las sondas fluorescentes y de otros fluoroforos es ilustrado por el diagrama simple del estado
electrónico (diagrama de Jablonski) mostrado en figura 1.
Figura 1 Diagrama de Jablonski que
ilustra los procesos implicados en la
creación de un estado electrónico
excitado del singlete por la absorción
óptica y la emisión subsiguiente de la
fluorescencia.
Estado 1 : Excitación
Un fotón de energía hvEX que es proveído por una fuente externa tal como una lámpara incandescente o
un láser es absorbido por el fluoroforo, creando un estado electrónico excitado del singlete (S1'). Este
proceso distingue fluorescencia de quimioluminescencia, en cuál el estado excitado es producido por
una reacción química.
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Estado 2 : Singlete excitado
El singlete en estado excitado existe por un tiempo finito (típicamente 1–10 10-9 segundos). Durante
este tiempo, el fluoroforo experimenta cambios conformacionales y está también sujeto a múltiples
interacciones con su ambiente molecular. Estos procesos tienen dos consecuencias importantes.
Primero, si la energía de S1’ se disipa parcialmente producirá un singlete débilmente excitado en su
estado (S1) produciendo una emisión de la fluorescencia menor que la que originalmente podría
emitirse. En segundo lugar, no todas las moléculas excitadas inicialmente por la absorción (etapa 1)
vuelven a su al estado cero o basal (S0) por la emisión de la fluorescencia. Otros procesos tales como la
extinción por colisión, la transferencia de energía de la fluorescencia y la trasferencia al intersistema
pueden también el reducir los S1. La producción de un quantum de la fluorescencia, que es el cociente
del número de los fotones de la fluorescencia emitidos (etapa 3) respecto al número de los fotones
absorbidos (etapa 1), es una medida del grado relativo de la ocurrencia de estos procesos.
Estado 3 : Emisión de la Fluorescencia
Cuando se emite un fotón la energía hvEM vuelve al fluoroforo a su estado basal S0. Debido a la posible
disipación de la energía durante la vida media del estado excitado, la energía emitida de este fotón es
más baja, y por lo tanto se produce una longitud de onda más larga que el hvEX original del fotón de la
excitación. La diferencia en la energía o la longitud de onda representada por (hvEX–hvEM) se llama
corrimiento de energía. El corrimiento de energía es fundamental para la sensibilidad de las técnicas de
la fluorescencia porque permite que los fotones de la emisión sean detectados contra un fondo de luz
bajo, aislándose de los fotones de la excitación. En cambio cuando se usa el espectrofotómetro de
absorción se requiere medir la relación entre los niveles de la luz incidente en la misma longitud de
onda con la luz transmitidos del fluoroforo
Espectro Fluorescencia
El proceso entero de la fluorescencia es cíclico. A menos que el fluoroforo se destruya
irreversiblemente en su estado excitado (un fenómeno importante conocido como photobleaching), el
mismo fluoroforo puede ser excitado y detectado varias veces. Para las moléculas poliatómicas en la
solución, las transiciones electrónicas discretas representadas por el hvEX y el hvEM en la figura 1 son
substituidas por los espectros de energía algo amplios llamados el espectro de la excitación de la
fluorescencia y espectro de emisión de la fluorescencia, respectivamente. Las anchuras de banda de
estos espectros son parámetros de importancia particular para los usos en los que dos o más fluoroforos
(diverso en estructura y por ende en longitudes de emisión/excitación) puedan ser detectados
simultáneamente Con pocas excepciones, el espectro de la excitación de la fluorescencia de una sola
especie del fluoroforo en una solución diluida es idéntico a su espectro de absorción. Bajo las mismas
condiciones, el espectro de emisión de la fluorescencia es independiente de la longitud de onda de la
excitación, debido a la disipación parcial de la energía de la excitación durante la vida media del
estado excitado según lo ilustrado en la figura 1. La intensidad de la emisión es proporcional a la
amplitud de excitación del espectro de la fluorescencia en la longitud de onda de la excitación (figura
2).
Figura 2 Excitación de un fluoroforo a
tres diferentes longitudes de onda (EX
1, EX 2, EX 3) no cambia el perfil de
la emisión sino produce variaciones en
intensidad de la emisión de la
fluorescencia (EM 1, EM 2, EM 3)
eso corresponde a la amplitud del
espectro de la excitación.

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