empleo de antioxidantes en protocolos de criopreservación de

Sistema de Revisiones en Investigación
Veterinaria de San Marcos
EMPLEO DE ANTIOXIDANTES EN
PROTOCOLOS DE
CRIOPRESERVACIÓN DE
ESPERMATOZOIDES
UPG
Veterinaria
REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA
Autor:
Shirley Sujey Evangelista Vargas
Universidad Nacional Mayor de San Marcos
Facultad de Medicina Veterinaria
Enero 2015
TABLA DE CONTENIDO
1.
2.
3.
4.
6.
INTRODUCCIÓN ..................................................................................................... 2
ANTIOXIDANTES PRESENTES EN EL EYACULADO Y EL
ESPERMATOZOIDE ................................................................................................. 5
ANTIOXIDANTES PRESENTES EN EL PLASMA SEMINAL ............................ 6
ESTRÉS OXIDATIVO DURANTE LA CRIOPRESERVACIÓN ........................... 7
LITERATURA CITADA ......................................................................................... 12
Autor: Shirley Sujey Evangelista Vargas
Página 1
EMPLEO DE ANTIOXIDANTES EN PROTOCOLOS
DE CRIOPRESERVACIÓN DE
ESPERMATOZOIDES
Shirley Sujey Evangelista Vargas
[email protected]
1. INTRODUCCIÓN
determinan que la membrana plasmática del
La criopreservación de espermatozoides es
espermatozoide es la primera en resultar dañada
considerada un componente fundamental en
como parte del proceso de criopreservación.
cualquier programa de reproducción asistida.
Inclusive llegan a proponer cuales serían los
Siendo aplicada en la actualidad en diversas
posibles daños por los que pasa la membrana
especies, tanto en humanos como en animales de
plasmática
producción, de compañía o exóticos. Sin
espermatozoide,
embargo, se estima que del cien por ciento de
criopreservación como el descongelamiento (Fig.
espermatozoides que son sometidos al proceso
1). Años más tarde Holt y North (1994), en
de criopreservación, solo el 50% logra sobrevivir
ovinos, demostraron que el daño en la membrana
al momento del descongelamiento (Curry, 2000).
plasmática no solo se da en la región de la
Es debido a la relevancia que alcanza esta
cabeza, sino también, en la pieza media y la
técnica, que en las últimas décadas se viene
pieza principal del flagelo.
que
cubre
tanto,
la
cabeza
durante
del
la
estudiando cómo el proceso de criopreservación
afecta a los espermatozoides de diferentes
especies.
Es así que Hammerstedt et al. (1990), en un
trabajo realizado con espermatozoides bovinos,
Autor: Shirley Sujey Evangelista Vargas
Página 2
Fig. 1. Cambios en el espermatozoide y en el dilutor durante el congelamiento y
descongelamiento (Adaptado de Hammerstedt et al., 1990)
Durante
el
proceso
de
Todos
estos
componentes
van
a
ser
criopreservación las células pasan por
administrados en diferentes proporciones
cambios
dependiendo
bruscos
de temperatura. Para
de
las
características
prevenir los posibles daños producidos
anatómicas (ausencia de alguna de las tres
durante la aplicación de esta técnica, las
glándulas
células a ser criopreservadas deben ser
(componentes
mantenidas en medios que les provean
espermáticas (proteínas que forman las
protección y nutrientes adecuados. Estos
membranas espermáticas, entre otros) de
medios son conocidos como dilutores.
cada
Los dilutores están compuestos por
azúcares, ácidos grasos, proteínas, agentes
accesorias),
del
especie. Sin
que los
plasma
fisiológicas
seminal)
y
embargo, por más
dilutores han sido
concebidos
con la idea de brindar protección al
crioprotectores, entre otros
Autor: Shirley Sujey Evangelista Vargas
Página 3
espermatozoide, estos llegan a ser sustancias
muestras. Esto se debe, a que los leucocitos
que generan un desequilibrio osmótico en la
reaccionan
membrana celular espermática.
produciendo una gran concentración de
Ha
sido
demostrado
los
espermatozoides
este
ROS, lo cual genera un alto estrés oxidativo.
desequilibrio osmótico es el que genera la
Los espermatozoides pertenecientes a dichas
permeabilización
muestras presentaban daño a nivel de la
de
que
ante
la
membrana
espermática, la cual aunada con el shock
membrana
térmico termina por dañar completamente la
peroxidación de los lípidos de la misma.
plasmática
debido
a
la
membrana espermática (Holt y North, 1994).
Los ROS juegan un rol importante en
Es por ello necesario formular dilutores
los mecanismos de capacitación espermática
específicos para cada especie con una
y reacción acrosomal. Es por ello que se
determinada osmolaridad.
embargo,
considera que los ROS son los responsables
por más que se logre generar dilutores con
de conferir la habilidad fecundante a los
osmoralidad adecuada, no se impide que el
espermatozoides. Esto se debe a que
espermatozoide
generalmente
pase
por
Sin
un
proceso
conocido como estrés oxidativo.
los
espermatozoides
son
capaces de controlar bajas concentraciones
El estrés oxidativo se da por un
de ROS endógeno (De Lamirande
y
desequilibrio entre la concentración de
Gagnon, 1995). El problema surge, cuando
especies reactivas de oxígeno (ROS) y los
la concentración de ROS es tan elevada que
antioxidantes presentes en el medio. Aitken
el espermatozoide no puede detener su
(1994),
acción oxidativa.
demostró
que
humanos
con
leucocitospermia eran infértiles, debido a las
altas concentraciones de ROS en estas
Autor: Shirley Sujey Evangelista Vargas
Página 4
2. ANTIOXIDANTES PRESENTES EN
El plasma seminal provee a los
EL EYACULADO Y EL
espermatozoides de un medio tipo tampón
ESPERMATOZOIDE
que es rico en nutrientes y que contribuye en
la protección de los mismos. El plasma
Los machos mamíferos poseen tres
seminal no solo protege la estructura de los
glándulas accesorias como parte de su
espermatozoides, sino que gracias a sus
aparato reproductor, estas son: vesícula
componentes
seminal, próstata y glándulas bulbouretrales
integridad del genoma, la fluidez de la
(Wai-sum et al., 2006).
Las glándulas
membrana y por lo tanto la capacidad
accesorias del macho secretan sustancias que
fecundante del espermatozoide (Shamsi et
poseen un sinnúmero de componentes tales
al, 2009).
como
proteínas,
antioxidantes,
antioxidantes
mantiene
la
Los espermatozoides son células
prostaglandinas, citoquinas, entre otros; esta
particularmente
secreción se conoce con el nombre de
oxidativo, esto se debe a que su membrana
plasma seminal. Sin embargo, no todas las
plasmática
especies presentan estas tres glándulas, por
poliinsaturados y en NADPH-oxidasa. Se
ejemplo los caninos solo poseen próstata
presume que es debido a esta sensibilidad,
(Ellenport, 1982).
Es por ello que
que el plasma seminal posee como parte de
dependiendo de la especie, el plasma
sus componentes sustancias antioxidantes de
seminal puede ser muy complejo y estar
tipo enzimático y no enzimático. Los
compuesto
antioxidantes más encontrados en el plasma
de
diferentes
ingredientes
(Juyena y Stelletta, 2012)
rica
en
al
ácidos
estrés
grasos
seminal de las diferentes especies de
mamíferos
Autor: Shirley Sujey Evangelista Vargas
es
vulnerables
son:
superóxido
dismutasa,
Página 5
catalasa y glutatión peroxidasa así como
significativamente la oxidación de dichos
otros inhibidores de ROS como son las
sustratos. Los antioxidantes pueden inhibir o
vitaminas C y E, hipotaurina, ácido úrico,
retardar la oxidación
albumina y alfa tocoferol (Wai-sum et al.,
captando
2006).
mecanismos que no involucran la captación
radicales
de dos formas:
libres
o
mediante
Como ya hemos visto anteriormente,
de radicales libres. Entonces, se considera
cuando existe un balance fisiológico normal
que los antioxidantes minimizan el daño
entre la producción de antioxidantes y los
oxidativo, por lo tato protegen a las células,
ROS, estos últimos, modulan la activación
incluyendo a los espermatozoides (Fuchs et
de genes y proteínas que son vitales para la
al., 1997), ya que previenen la formación de
proliferación,
ROS o disminuyen el efecto de los mismos.
diferenciación
y
funcionamiento de los espermatozoides. El
El plasma seminal y el propio
inconveniente aparece cuando este balance
espermatozoide
se ve alterado y existe una mayor producción
como parte de la prevención del daño
de ROS, el cual conlleva a un efecto de tipo
oxidativo. Estudios realizados en humanos
patológico conocido como estrés oxidativo.
demuestran la presencia de antioxidantes
producen
antioxidantes
enzimáticos naturales como la superóxido
3. ANTIOXIDANTES PRESENTES EN
EL PLASMA SEMINAL
están
(SOD),
catalasa,
glutation
peroxidasa (GP) y glutation reductasa (GPx)
Los antioxidantes son sustancias que
cuando
dismutasa
bajas
Todos ellos neutralizan el exceso de ROS
concentraciones en comparación con el
quebrando la cadena oxidativa y previenen el
sustrato
daño
oxidable,
presentes
retasa
en
en el plasma seminal (Smith et al., 1996).
o
previene
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estructural y funcional de la célula
Página 6
espermática (Bansal et al., 2011). Sin
conlleva a la pérdida de la capacidad
embargo, los espermatozoides no tienen la
fecundante del espermatozoide o en el peor
habilidad de resintetizar los componentes de
de los casos la muerte del mismo (De
membrana
Lamirande et al., 1998).
y
poseen
baja
capacidad
antioxidativa (Jones et al., 1979).
De todos estos tipos de estrés por los
que pasa el espermatozoide durante la
4.
ESTRÉS OXIDATIVO
criopreservación, el estrés oxidativo es el
DURANTE LA CRIOPRESERVACIÓN
más peligroso. Como ya sabemos el estrés
de
oxidativo se da cuando existe un incremento
importante
en la concentración de los ROS. Los ROS se
procedimiento que es usado con regularidad
producen a nivel de la mitocondria durante
en diferentes especies de mamíferos, tanto
la respiración aeróbica. Sin embargo, en el
con fines de reproducción como parte de un
espermatozoide los ROS se producen tanto a
sistema productivo, como un recurso que nos
nivel de la mitocondria espermática como a
permite conservar material genético especies
nivel de la membrana plasmática por acción
en peligro de extinción.
del complejo enzimático NADPH-oxidasa
La
criopreservación
espermatozoides
Es
es
durante
un
el
proceso
de
(Shamsi et al., 2009).
criopreservación que el espermatozoide pasa
El primer ROS en producirse es el
por una serie de eventos que generan estrés
anión superóxido, el cual dismuta en
térmico,
el
peróxido de hidrógeno (H2O2), el cual a su
espermatozoide, el cual por consiguiente
vez dismuta en radical hidroxilo (Alvarez et
termina
daño
al., 1987). Todos los ROS son altamente
espermático, que llega a ser acumulativo,
citotóxicos; sin embargo, de todos ellos el
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Página 7
osmótico
siendo
y
oxidativo
dañado.
Este
en
extremadamente
nocivo
es
radical
2001) o re-arreglos en la localización de
hidroxilo, el cual puede atacar a casi
fosfolípidos (Medeiros et al., 2002). Además
cualquier
el estrés oxidativo también puede inducir
componente
el
celular
(De
Lamirande et al., 1997).
fragmetación de ADN en el espermatozoide
El proceso de criopreservación se
(Aitken y Krausz, 2001). Así mismo,
realiza sometiendo a las células a bajas
Thompson et al. (2009) demostraron que
temperaturas en forma constante hasta llegar
durante el proceso de criopreservación, es el
a una temperatura menor a los -40 °C y
estrés
posteriormente se procede a almacenar el
fragmentación de ADN.
material
criopreservado
a
-196°C
oxidativo
el
que
produce
en
nitrógeno líquido. Es a partir que los
5. ANTIOXIDANTES EMPLEADOS
espermátozoides llegan a los 5°C que se
EN CRIOPRESERVACIÓN DE
inicia un incrementro exponencial en la
ESPERMATOZOIDES
producción de ROS.
Durante la
Al parecer este incremento de las
concentraciones
de
ROS
a
la
espermatogénesis
los
espermatozoides pasan por diferentes etapas,
bajas
durante las cuales se efectúan cambios
temperaturas estaría asociado con cambios
estructurales y funcionales. Es durante la
ultraestructurales que se producen en el
última fase de la espermatogénesis, que los
espermatozoide. Ya sean cambios en la
espermatozoides poseen una muy limitada
estructura y/o función de la membrana
cantidad de funciones metabólicas y pasan a
plasmática (Wang et al., 1997), alteraciones
ser casi completamente dependientes del
en la distribución de grupos sulfhidrilo en la
medio que los rodea. Es por ello que se son
membrana plasmática (Chatterjee et al.,
dependientes del plasma seminal, ya que este
Autor: Shirley Sujey Evangelista Vargas
Página 8
contiene los nutrientes, antioxidantes y
demás
sustancias
necesarias
para
su
supervivencia.
Es debido a estas evidencias que
muchos investigadores han optado por
agregar antioxidantes a los dilutores para
criopreservación de espermatozoides de
En el plasma seminal de diferentes
especies de mamíferos se pueden observar
diferentes especies de animales.
5.1. Superóxido dismutasa (SOD) y sus
análogos
cuatro tipos de enzimas antioxidantes:
superóxido dismutasa, glutatión peroxidasa,
La
SOD
y
sus
análogos
son
glutatión reductasa y catalasa. Marti et al.
nitróxidos que reaccionan en presencia del
(2008) lograron establecer los patrones de
anión
inmunofluorescencia
superóxido
peróxido de hidrógeno. Sin embargo, el
dismutasa, glutatión peroxidasa y glutatión
peróxido de hidrógeno puede convertirse en
reductasa
de
un radical hidroxilo a través de la reacción
espermatozoides humanos, distribuyéndose
de Fenton (Offer et al., 1998). y ser
todas estas enzimas antioxidantes a lo largo
responsable
de la cola, la región post-acrosomal y
peroxidación lipídica, tal como se ha
acrosomal del espermatozoide. El mismo
demostrado en espermatozoides de humanos
trabajo muestra que a lo largo de la curva de
y ratones (Aitken y Fisher, 1994).
en
de
muestras
frescas
superóxido,
directo
convirtiéndolo
del
inicio
de
en
la
enfriamiento del proceso de criopreservación
Debido a su gran concentración en el
y al post-descongelamiento existe una menor
plasma seminal y a que se encuentran en
concentración de antioxidantes protegiendo a
gran parte de la superficie espermática la
los espermatozoides.
SOD y sus análogos, han sido la elección de
un sin número de investigadores desde que
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Página 9
el Abu-Erreish et al., (1978) iniciaron la
tempol
investigación de aislamiento y las funciones
criopreservación en base a leche a los 5 °C
de la SOD de espermatozoides de carnero,
mejora la motilidad en relación al grupo
concluyéndose que tiene un corto tiempo de
control en ovinos. Similares resultados son
vida y debido a su alto peso molecular no es
reportados por Ruiz et al. (2007) quienes
capaz de penetrar las membranas celulares
congelaron semen de ovino en un dilutor en
fácilmente.
base a Tris junto con Tempo 0.5 mM, el cual
1mM
a
un
dilutor
de
fue adicionado al final de la curva de
Sin embargo, se han identificado
enfriamiento. En bovinos se ha demostrado
análogos de SOD que tienen mayor tiempo
que la adición de tempo y tempol 1mM a los
de vida y un menor peso molecular. Estos
35°C
análogos de SOD son Tempo (2,2,6,6
descongelamiento (Foote et al., 2002).
tetramethyl-1-piperidinyloxyl) y Tempol (4hidroxy
2,2,6,6
piperidinyloxyl),
tetramethyl-1-
los cuales protegen del
disminuye
la
motilidad
Estudios en alpacas indican que la
utilización de análogos de la SOD durante la
criopreservación
de
semen
daño oxidativo a las células (Mitchell et al.,
previene
parcialmente
1990).
motilidad
post
Estudios realizados en bovinos y
post-
fragmentación
la
de
pérdida
descongelamiento
del
ADN
alpaca
y
de
la
espermático
ovinos señalan que la adición de estos
(Santiani et al., 2012, 2013). Según Santiani
análogos de la SOD ayudan a mejorar la
et al. (2013) el Tempol fue el análogo de la
motilidad
post-
SOD que mejores resultados generó. Sin
descongelamiento. Por ejemplo Santiani
embargo, en dicho estudio no se estableció
(2003) refiere que la adición de tempo y
fehacientemente en que momento de la curva
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Página 10
espermática
de enfriamiento se produce la mayor
ovino (Câmara et al., 2011) y humanos (Li et
producción de ROS. Por ende, tampoco se
al., 2011).
definió cual es el momento más adecuado de
adición del Tempol.
Sin embargo, existen otros trabajos
en los cuales se ha empleado la interacción
catalasa y la SOD en el dilutor de
5.2. Catalasa
La
catalasa
criopreservación de espermatozoides de
es
una
de
las
enzimas
humano (De Lamirande et al., 1998) y de
antioxidantes que contiene el eyaculado y
porcino (Roca et al., 2005) y se observa una
que protege al espermatozoide de los efectos
buena
nocivos de los ROS. La catalasa dismuta el
obteniéndose motilidades 44.3 + 9.4%. En
peróxido de hidrógeno en oxigeno y agua,
cambio en bovinos no se ha logrado
evitando así la formación del radical
resultados favorables a su empleo en forma
hidroxilo, el cual es el ROS más citotóxico
individual por más que se han probado
que existe.
diferentes concentraciones (Asadpour et al.,
respuesta
post-descongelamiento,
2011).
En diversos estudios se ha evaluado
el uso de la catalasa como agente preventivo
del
estrés
oxidativo
durante
5.3. Glutation peroxidasa
la
La glutatión peroxidasa es otra
criopreservación. Algunos de estos estudios
enzima antioxidante, que al igual que la
tuvieron muy buenos resultados como es el
catalasa
caso de los empleados en protocolos de
hidrógeno
criopreservación de espermatozoides de
descomponga en oxígeno y agua. Siendo
Autor: Shirley Sujey Evangelista Vargas
Página 11
actúa
sobre
logrando
el
que
peróxido
este
de
se
esta la vía más benigna que puede seguir este
6. LITERATURA CITADA
ROS.
1. Abu-Erreish G, Magnes L, Li T.
Existen muy pocos trabajos empleando
glutatión
peroxidasa
protocolos
de
como
parte
criopreservación
de
1978. Isolation and properties of
los
superoxide
de
spermatozoa and erythrocytes. Biol
espermatozoides, siendo estos en su mayoría en
humanos y en ovinos (Câmara et al., 2011).
Sobre todo estos estudios están orientados a
dismutase
from
ram
Reprod.18:554–560.
2. Aitken RJ. 1994. A free radical
theory of male infertility. Reprod
comprender cuál es su función y su localización
en las glándulas anexas sexuales, en el eyaculado
y en el espermatozoide.
Fertil Dev.6:19–23.
3. Aitken RJ, Fisher H. 1994. Reactive
oxygen
5.4. Otros antioxidantes
Se ha empleado ascorbato (Li et al.,
species
generation
and
human spermatozoa: the balance of
benefit and risk. Bioessays. 16:259-
2010) como parte de un dilutor para la
267.
criopreservación de espermatozoides de humano,
4. Aitken
RJ,
Krausz
C.
2001.
lográndose resultados similares a los obtenidos
Oxidative stress, DNA damage and
con catalasa.
the
Se han estudiado otros antioxidantes
como la vitamina e y el selenio pero no como
adición en los dilutores de criopreservación, sino
Y
chromosome.
Reproduction.122:497–06
5. Alvarez JG, Touchstone JC, Blasco
L, Storey BT. 1987. Spontaneous
más bien suministrados en la dieta de humanos y
animales.
lipid peroxidation and production of
hydrogen peroxide and superoxide in
Autor: Shirley Sujey Evangelista Vargas
Página 12
human
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J
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semen
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freeze-thawing
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bull
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sperm acrosome reaction induced by
Effects of antioxidants and duration
A23187,
of
and biological fluid ultrafiltrates. J
pre-freezing
equilibration
frozen-thawed
ram
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dismutase
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