様式２ 論 甲 文 1006 の 要 約 報 告 番 号 第 学位論文題目 大腸菌における鉄硫黄クラスター生合成系の機能解析 号 氏 名 田中 尚志 鉄硫黄（Fe-S）クラスターは単純な形をしたコファクターだが、化学的には非常に不安 定な物性であるため、その生合成には極めて複雑なマシナリーを必要としている。大腸 菌は 2 種類の Fe-S クラスター生合成系（ISC と SUF）を有しているが、これらの二重欠 失は合成致死となるため、詳細な遺伝学的解析はほとんど行われていなかった。本研究 ではまず、大腸菌を用いて Fe-S クラスター生合成系の解析を目的とした新たな遺伝学的 実験系を構築した。さらに、この実験系を用いて大腸菌 ISC マシナリーについて詳細な 機能解析を進めた。 1. 鉄硫黄クラスター生合成系を完全に欠損した大腸菌変異株の構築と解析 大腸菌が持つ 130 種類以上の Fe-S タンパク質を調べたところ、イソプレノイドの生合成 （MEP 経路）に関与する IspG と IspH のみが大腸菌の生育に必須であることに気がつい た。そこで、大腸菌の MEP 経路を放線菌由来のイソプレノイド合成経路（メバロン酸経 路）に代謝改変したところ、クラスター生合成系の必須性を回避できることを見出した。 MEP 経路には Fe-S 酵素が関与しているが、メバロン酸経路には関与していないためで ある。この大腸菌変異株を用いることにより、isc/suf の遺伝子を自在に操作し、その表 現型を正確に評価できるようになった。 2. SUF マシナリー欠損下における ISC マシナリーの機能解析 P1 トランスダクションにより、sufABCDSE を欠失させた上で iscSUA-hscBA-fdx-iscX の遺 伝子を個別に破壊した 7 種類の変異株を構築して、その表現型を詳しく比較解析した。 その結果、IscS, IscU, IscA, HscB, HscA, Fdx の 6 つの因子が ISC マシナリーの機能に必須 であることが分かった。また、嫌気条件下において IscA と Fdx は、必ずしもマシナリー の機能に必須ではないことが判明した。 3. 鉄硫黄クラスター生合成系 ISC マシナリーの中心成分、IscU の構造機能相関 ISC マシナリーの中心成分である IscU に対して系統的に種々の部位特異的変異を導入 し、その影響を相補実験によって調べた。その結果、4 つのクラスター配位子（Cys37, Cys63, His105, Cys106）に加えて、Tyr3, Asp39, Lys103 が IscU の in vivo 機能に必須であ ること見出した。さらに、復帰変異体を単離してサプレッサー変異の位置を調べたとこ ろ、IscU Tyr3 の二次的なサプレッサー変異を IscS（硫黄原子供与体）に 4 種類同定した。 野生型／変異型 IscU と野生型／サプレッサー変異型 IscS を精製し、相互作用解析、なら びに硫黄原子受け渡し活性測定を行ったところ、IscU Tyr3 は IscS から硫黄原子を受け取 る際の相互作用に重要であることが判明した。IscU Tyr3 は IscS の構造変化を誘起して、 硫黄原子受け渡し反応を促進させる可能性が示唆された。
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