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2016. 10.17
分子生物学
後期第5回
分子生物学分野助教
岡﨑裕之
5-B：遺伝子のクローニング法 (p.110)
・ゲノムDNA/cDNA ライブラリーとは (ポイント1-5)
・遺伝子クローニングとその方法(ポイント6-8)
・PCR法について、その方法と応用 (ポイント9-11)
5-B：遺伝子のクローニング法 (p.110)
①遺伝子クローニング
遺伝子クローニングとは；
DNAライブラリーから特定
の遺伝子構造領域を単離
すること。
5-B：遺伝子のクローニング法 (p.110)
①遺伝子クローニング
DNAライブラリー；断片化さ
れたDNAの集合体
ゲノムDNAライブラリー
⇒ゲノムDNAクローニング
cDNAライブラリー
⇒cDNAクローニング
②-a. ゲノムDNAライブラリーの作製法(p.111)
ショットガンクローニング
ゲノムDNAを制限酵素・超音波
などにより物理的に切断し、手当
たり次第にベクターに組み込ん
だライブラリーを作成する方法。
②-a. ゲノムDNAライブラリーの作製法(p.111)
ショットガンクローニング
1. ゲノムDNAの断片化
2. ファージゲノムDNA
の制限酵素処理
3. ファージDNAへのゲノム
DNA断片の挿入と連結
4. ファージ構成タンパクとの混和
による組換えDNAファージの生成
②-b. cDNAライブラリーの作製法(p.112)
cDNA; mRNAから逆転写反応により生成されたDNA.
⇒イントロンの情報を含まない
遺伝子産物としてのタンパク質を発現させる
ことができる
ある細胞から作成されたcDNAライブラリーは、その細胞
の全ての発現タンパク質の情報が含まれる。
②-b. cDNAライブラリーの作製法(p.112)
1. リンカープライマー
(オリゴdT)の結合
2. 逆転写反応による
cDNAの合成
②-b. cDNAライブラリーの作製法(p.112)
3. RNA分解酵素・
DNAポリメラーゼによる
2本鎖cDNAの合成
4. アダプター配列の
ライゲーション
5. 制限酵素処理と
ベクターへの挿入
6. コロニーの単離
③-a. 核酸塩基配列を利用したクローニング法 (p.114)
目的とする遺伝子やcDNAの(一部の)核酸塩基配列
が明らかな場合に実施できる。
③-a. 核酸塩基配列を利用したクローニング法 (p.114)
一部のアミノ酸配列だけがわかっている場合には、
その配列から予測される塩基配列を基にオリゴヌク
レオチドを複数作成し、混合したものをプローブとして
クローニングを行うことができる。
③-b. 遺伝子産物の特徴, 機能を利用した
クローニング法(p.115)
・特定の抗体に反応するタンパク質
・特定のDNAやRNAと結合性を示すタンパク質
・タンパク質と相互作用するタンパク質
これらをコードするmRNAに相当するものをcDNAラ
イブラリーから探し出す。
③-b. 遺伝子産物の特徴, 機能を利用した
クローニング法(p.115)
目的の遺伝子やcDNAの一部の塩基配列がわ
かれば、データベースから目的遺伝子、cDNA
の全塩基配列を知ることができる。
DNAライブラリーから、PCR法によって目的遺伝
子やcDNAを容易に得ることができる。
③-c. PCR法によるクローニング
(1) クローニング操作におけるポリメラーゼ連鎖反応
(PCR法)
これまでクローニングで見てきたように、ある目的
DNAを増幅するためには、そのDNAを組み込んだ組
換えDNAを作成する必要があった。
PCR法は、DNAの組換えを行わずに目的DNAの増幅
を行うことができる方法である。
また、PCR法によってクローニングを行うためのDNA
断片を得ることができる。
③-c. PCR法によるクローニング
(2) 使用試薬および反応条件について
1) DNAポリメラーゼ
通常の酵素は高温下で熱変性して失活する。
PCR法では好熱菌由来の耐熱性DNAポリメラーゼ
(TaqDNAポリメラーゼなど)が使用される。
⇒TaqDNAポリメラーゼは校正機能がないので注意。
2) 鋳型となるDNAの種類
PCRに用いる鋳型DNAは一本鎖DNA、クローン化
DNA、ゲノムDNA、cDNAのいずれも鋳型として用いる
ことができる。
③-c. PCR法によるクローニング
(2) 使用試薬および反応条件について
3) オリゴプライマー
・鋳型となるDNA上の標的部位を挟むようにして5’お
よび3’末端側の一対のプライマーを設計する。
・プライマーの長さは20～30塩基対、濃度は0.1～
0.5µM程度で用いる。
・プライマーの3’末端側は鋳型DNAの塩基配列と相
補的でなければならない。
・プライマーの分子内・分子間に相補的な配列を含ま
ないように注意する。
③-c. PCR法によるクローニング
③-c. PCR法によるクローニング
PCR法の特徴、注意点など
・1サイクルごとにDNAが2倍に増加する。
⇒PCR反応をn回行うと元のDNAは2n倍に増加する。
・試薬に微量でもDNAが混入すると増幅されてしまい
誤りの原因となる。
・反応の温度、時間、サイクル数は適切に設定する
必要がある。
③-c. PCR法によるクローニング
(3) PCR法の応用；RT-PCR法
復習；ポリメラーゼの種類
・DNA依存性DNAポリメラーゼ⇒複製(DNAポリメラーゼδなど)
・DNA依存性RNAポリメラーゼ⇒転写(RNAポリメラーゼIIなど)
・RNA依存性DNAポリメラーゼ⇒逆転写(逆転写酵素)
・RNA依存性RNAポリメラーゼ⇒RNA複製
逆転写酵素は、RNAを鋳型としてDNAを合成することができる。
PCR法ではRNAを鋳型として使うことができないが、逆転写に
よってcDNAを合成することでPCRの鋳型として用いることがで
きる。これをRT-PCR法と呼ぶ。
③-c. PCR法によるクローニング
PCR法の応用例
・病原菌の検出 (結核菌、インフルエンザウイルス)
・犯罪捜査
・遺伝子検査、親子鑑定
(→p.136～、SNPの検出、マイクロサテライト多型
の検出)

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