Structural information on secondary transporter - ETH E

Diss. ETH No. 23523
Structural information on secondary
transporter proteins from distance
measurements between spin labels
A thesis submitted to attain the degree of
DOCTOR OF SCIENCES of ETH ZURICH
(Dr. Sc. ETH Zurich)
presented by
Kamila Guérin
M.Sc. Jagiellonian University, Krakow, Poland
born on 03.07.1986
citizen of Poland
accepted on the recommendation of
Prof. Dr. Gunnar Jeschke, examiner
Prof. Dr. Roland Riek, co-examiner
Dr. Yevhen Polyhach, co-examiner
2016
Abstract
The classically used methods of structural biology like X-ray diffraction or NMR may
have serious limitations when applied to membrane proteins. Among the factors responsible for that are big protein size, an often large conformational flexibility and the
necessity to use detergent for crystallization. Site-directed spin labelling combined with
pulse EPR measurements and computational methodology offer an independent, complementary approach to study structure and function of such systems.
For membrane proteins, distance measurements by DEER are favourable as the range of
available distances is between 1.5 and 6 nm, which is of the order of their sizes. Electron
spins coming from the labels introduced pairwise into the protein undergo manipulation via a four-pulse sequence which separates the dipolar interaction between electrons
from other interactions. The strength of this interaction encodes the information about
the distance distribution between the labels.
Secondary transporters are the proteins translocating a substrate across the biological membranes against its concentration gradient thanks to the energy released by
the coupled transport of ions or another substrate along their respective concentration
gradient. Although the variety of these transporters is very broad, biochemical and
structural analysis indicated that they share an analogous transport mechanism as well
as some structural features despite low primary sequence similarity. Functions of the
members are as broad as their diversity, ranging from dietary glucose and galactose
absorption to the drug assimilation mechanism as some of them are primary targets of
medicinal and abused drugs. Our focus was the proline permease PutP, engaged among
others in adaptation to the osmotic stress and in virulence of bacteria.
A modelling approach was developed to model the structure of PutP based on sparse
distance constraints. The methodology was tested with simulated constraints on proteins with known structures, which were different either in the size or in the degree of
deviation of the helical shape from ideal. On the example of bovine rhodopsin with
seven relatively straight transmembrane helices, our method was shown to predict the
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fold successfully when distances for all pairs of helix ends are known. The proper fold
is still obtained when the distances are known only between spin labels attached to the
helix ends. In the case of the sodium galactose transporter vSGLT, with an bigger number of transmembrane helices and bigger deviation from ideality, our approach worked
as well, although with higher uncertainty, provided that all distances for helix end pairs
are known. Uncertainty stemming from length and flexibility of the label linker is too
large to find the correct fold with simulated label-to-label distances for vSGLT.
We applied our procedure to the sodium proline secondary symporter PutP, whose structure is unknown. As the number of available distance constraints (75) is not sufficient
to uniquely position 13 transmembrane helices in space, similarity to other proteins
that share presumably the same fold was included by using a template for a ten-helix
core during calculations. Although the template information dominates the obtained
fold of the core, our approach allowed to place two of the three non-core helices of PutP
with respect to the protein core, based solely on the DEER distance data.
Additionally, we adressed the problem of the alternating access mechanism in PutP.
A subset of measurements was performed in order to investigate the relevance of the
extracellular loop 4 in the transport cycle, likewise the influence of substitution of two
significant residues on the protein function. Though due to biochemical difficulties, the
DEER experiment did not deliver direct information concerning the transport mechanism, it clearly proved the importance of two residues, Glu311 and Ala404, in stabilizing
the resting state of the protein.
Zusammenfassung
Klassische Methoden der Strukturbiologie wie die Röntgenkristallographie und Kernspinresonanzspektroskopie (NMR) stossen für Membranproteine oft an frenzen. Verantwortlich sind das hohe Molekulargewicht dieser Proteine, ihre oft grosse Flexibilität
und die Notwendigkeit, zur Kristallisation Detergenzien zu benutzen. Die ortsspezifische
Spinmarkierung in Kombination mit gepulster Elektronen-paramagnetischer ResonanzSpektroskopie (EPR) und Modellierungsmethoden bietet ein unabhängiges, komplementäres Vorgehen für die Untersuchung der Struktur und Funktion von solchen Systemen.
Für Membranproteine sind Distanzmessungen mittels Doppel-Elektronen-ElektronenResonanz (DEER) vorteilhaft, weil die zugänglichen Abstände (zwischen 1.5 und 6
nm) der Grösse der Membranproteine entsprechen. Die durch Spinmarkierung in das
Protein eingeführten Elektronenspins können mit einer 4-Puls-Sequenz so manipuliert
werden, dass ihre Dipol-Dipol-Wechselwirkung separat von anderen Wechselwirkungen
beobachtet werden kann. Die Grösse dieser Wechselwirkung kodiert Information über
Abstände zwischen den Elektronenspins.
Sekundäre Transporter sind Proteine, die Substrate über die Zytoplasmamembran gegen
ihre Konzentrationsgradienten transportieren, wobei ein Kotransport von Ionen entlang von deren Konzentrationsgradienten die nötige Energie liefert. Obwohl die Vielfalt
dieser Transporter gross ist, haben biochemische und strukturelle Analysen einen
schrähnlichen Transportmechanismus und gemeinsame Struktureigenschaften vorausgesagt. Die Funktionen solcher Transporter sind so breitgefächert wie deren Verschiedenheit, von diätischer Absorption von Glukose und Galaktose bis zur Medikamenten- und
Drogenassimilation, so dass einige Vertreter direkte Ziele pharmazeutischer Eingriffe
sind. Unserer Schwerpunkt war der Prolin-Transporter PutP, der zur Anpassung an
osmotischen Stress dient und in die Virulenz bestimmter Bakterien involviert ist.
Eine neue Methode ist entwickelt worden, um die PutP Struktur mittels einer kleinen
Zahl von Abstandsrestriktionen zu modellieren. Diese Methodik ist an Proteinen mit
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Zusammenfassung
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bekannter Struktur mit verschiedenen Grössen und Idealitätsgraden der Helices erprobt
worden wobei simulierte Abstandsrestriktionen verwendet wurden. Am Beispiel von
Rinder-Rhodopsin mit sieben geraden transmembranen Helices, war die Methode erfolgreich, wenn Abstände für alle Paare von Helixenden bekannt waren. Die korrekte
Faltung wird auch erhalten, wenn stattdessen Abstände zwischen Spinmarkern verwendet werden. Im Fall des Natrium/Galaktose-Transporter vSGLT mit mehreren, nicht
idealen transmembranen Helices, funktionierte unsere Methode ebenfalls, allerdings war
die Unsicherheit grösser.
Wir haben die Methode dann für den Natrium-Prolin Symporter PutP, dessen Struktur unbekannt ist, verwendet. Weil 75 Distanzmessungen nicht ausreichend waren,
um 13 transmembrane Helices eindeutig räumlich anzuordnen, wurden strukturelle
Ähnlichkeiten einer 10-Helix-Kernstruktur verwandter Proteine in den Rechnungen benutzt. Obwohl die Faltung dieses Kerns von der Templatinformation dominiert wird,
ermöglichte unsere Methodik die Lokalisierung von zwei der drei weiteren transmembranen Helices relativ zur Kernstruktur, auf der Basis von ausschliesslich experimentellen
Daten.
Ferner wurden Details des Mechanismus des alternierenden Zugangs in PutP aufgeklärt.
Für PutP wurde eine Anzahl von Messungen ausgeführt, um die Relevanz der externen Schleife 4 für den Transport der Substrate zu prüfen. Der mechanistische Vorschlag
wurde auch durch Mutationen von zwei Aminosäureresten getestet. Obwohl die DEERMethodik wegen biochemischer Probleme keine direkte Information über den Transportmechanismum tiefern konnte, ermöglichte sie doch den Nachweis der Wichtigkeit der
Reste Glu311 und Ala404 für die Stabilisierung des Ruhezustandes.

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