クイックマニュアル (和文)

Agencourt FormaPure
Agencourt FormaPure
クイックマニュアル
本クイックマニュアルは簡易版です。使用前には、正式なマニュアル（英文）を必ずご一読ください。
Introduction
ベックマン・コールターの Solid Phase Reversible Immobilization (SPRI) 磁性ビーズ技術によ
り、Formalin-Fixed, Paraffin-Embedded (FFPE) 組織 10 μm 切片 5 枚からの DNA/RNA 抽出
に対応します。本プロトコルでは、FFPE サンプルのパラフィン溶解、脱クロスリンク、組織溶解か
ら、96 ウェルプレートおよびマイクロチューブを用いた DNA/RNA および RNA のみの抽出方法を
解説します。
保存方法
Lysis Buffer
室温保存
Bind 1 Buffer
室温保存
Bind 2 Buffer
4℃保存
Wash Buffer
室温保存
PK Buffer
室温保存
Proteinase K
-20℃保存
本マニュアルの対応製品
A33341 FormaPure 50 preps
A33342 FormaPure 96 preps
A33343 FormaPure 384 preps
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Agencourt FormaPure
Material Supplied by the User
96 ウェル反応プレートを使用する場合
96 ウェル 1.2 mL ディープウェルブロック
1.7 mL マイクロチューブ (1.5 mL マイクロチューブも使用可能です)
A32782 Agencourt SPRIPlate 96R Ring Super Magnet Plate
チューブを使用する場合
1.7 mL マイクロチューブ (1.5 mL マイクロチューブも使用可能です)
A29182 Agencourt SPRIStand 6 Position Tube Magnet
試薬
100%イソプロパノール
90%イソプロパノール (ヌクレアーゼフリー水で用時調製)
70%エタノール (ヌクレアーゼフリー水で用時調製)
(RNA のみの抽出の場合) DNase I (RNase フリー; 2 U/μL)、DNase I Buffer
ヌクレアーゼフリー水
RNase フリー条件での実験について
FormaPure は RNase フリーにて製造されており、試薬製品にヌクレアーゼの混入がないことを
確認しています。本試薬のご使用時は、サンプルへの RNase 混入を防ぐ対策を十分に取った上
で、実験を行うことをお勧めします。
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Agencourt FormaPure
Quick Reference (DNA/RNA 抽出の場合)
A. チューブに FFPE 組織切片サンプルを入れ、Lysis Buffer 溶液 200 μL で完全に浸し、
70~72℃で、60 分間反応。
B. チューブの液相に Proteinase K (40 mg/ml) 溶液 20 μL を加え、ピペッティングで 3 回により
混合。チューブを 55℃で 60 分間反応後、を氷上で 2 分間静置。溶解サンプル 200 μL を反
応プレート・チューブに移す。
1. 反応プレート・チューブに Bind 1 Buffer 150 μL を加え、ピペッティング 5 回により混合。
2. 反応プレート・チューブに Bind 2/イソプロパノール溶液 320 μL を加え、ピペッティング 5 回に
より混合し、55℃で、5 分間反応。反応プレート・チューブを磁気プレート・スタンド上で 5 分間
静置し、上清を除去。
3. 反応プレート・チューブを磁気プレート・スタンド上から下ろし、Wash Buffer 溶液 300 μL を加
え、ピペッティング 5 回により再懸濁し、1 分間静置。反応プレート・チューブを磁気プレート・ス
タンド上で 3 分間静置し、上清を除去。
4. 反応プレート・チューブを磁気プレート・スタンド上から下ろし、70%エタノール 500 μL を加え、
ピペッティング 5 回により再懸濁。反応プレート・チューブを磁気プレート・スタンド上で 5 分間
静置し、上清を除去。
5. 反応プレート・チューブを磁気プレート・スタンド上から下ろし、90%イソプロパノール 500 μL を
加え、ピペッティング 5 回により再懸濁し、反応プレート・チューブを 70℃で 3 分間反応。反応
プレート・チューブを磁気プレート・スタンド上で 3 分間静置し、上清を除去。90%イソプロパノ
ール洗浄と 70℃加熱 3 分間を再度実施。
6. 反応プレート・チューブを磁気プレート・スタンド上から下ろし、70%エタノール 750 μL を加え、
ピペッティング 5 回により再懸濁。反応プレート・チューブを磁気プレート・スタンド上で 5 分間
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Agencourt FormaPure
静置し、上清を除去した後に 5 分間風乾。
7. 反応プレート・チューブを磁気プレート・スタンドから下ろし、ヌクレアーゼフリー水 80 μL を加
え、ピペッティング 5 回により磁性ビーズを十分に再懸濁。反応プレート・チューブを 65~70℃
で 30 秒間静置。反応プレート・チューブを磁気プレート・スタンド上で 1 分間静置し、溶出核酸
を含む上清を、新しい保存用プレート・チューブに移す。
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Agencourt FormaPure
Quick Reference (RNA のみの抽出の場合)
A. チューブに FFPE 組織切片サンプルを入れ、Lysis Buffer 溶液 200 μL で完全に浸し、
70~72℃で、60 分間反応。
B. チューブの液相に Proteinase K (40 mg/ml) 溶液 20 μL を加え、ピペッティングで 3 回により
混合。チューブを 55℃で 60 分間反応後、を氷上で 2 分間静置。溶解サンプル 200 μL を反
応プレート・チューブに移す。
1. 反応プレート・チューブに Bind 1 Buffer 150 μL を加え、ピペッティング 5 回により混合。
2. 反応プレート・チューブに Bind 2/イソプロパノール溶液 320 μL を加え、ピペッティング 5 回に
より混合し、55℃で、5 分間反応。反応プレート・チューブを磁気プレート・スタンド上で 5 分間
静置し、上清を除去。
3. 反応プレート・チューブを磁気プレート・スタンド上から下ろし、70%エタノール 750 μL を加え、
ピペッティング 5 回により再懸濁。反応プレート・チューブを磁気プレート・スタンド上で 5 分間
静置し、上清を除去した後に 5 分間風乾。
4. 反応プレート・チューブを磁気プレート・スタンド上から下ろし、DNase I 溶液 100 μL を加え、
ピペッティング 5 回により再懸濁後、37℃で 15 分間反応。
5. 反応プレート・チューブに Wash Buffer 溶液 300 μL を加え、ピペッティング 5 回により再懸濁
し、室温で 5 分間静置。反応プレート・チューブを磁気プレート・スタンド上で 5 分間静置し、上
清を除去。
6. 反応プレート・チューブを磁気プレート・スタンド上から下ろし、70%エタノール 500 μL を加え、
ピペッティング 5 回により再懸濁。反応プレート・チューブを磁気プレート・スタンド上で 5 分間
静置し、上清を除去。
7. 反応プレート・チューブを磁気プレート・スタンド上から下ろし、90%イソプロパノール 500 μL を
加え、ピペッティング 5 回により再懸濁し、反応プレート・チューブを 70℃で 3 分間反応。反応
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Agencourt FormaPure
プレート・チューブを磁気プレート・スタンド上で 3 分間静置し、上清を除去。90%イソプロパノ
ール洗浄と 70℃加熱 3 分間を再度実施。
8. 反応プレート・チューブを磁気プレート・スタンド上から下ろし、70%エタノール 750 μL を加え、
ピペッティング 5 回により再懸濁。反応プレート・チューブを磁気プレート・スタンド上で 5 分間
静置し、上清を除去した後に 5 分間風乾。
9. 反応プレート・チューブを磁気プレート・スタンドから下ろし、ヌクレアーゼフリー水 80 μL を加
え、ピペッティング 5 回により磁性ビーズを十分に再懸濁。反応プレート・チューブを 65~70℃
で 30 秒間静置。反応プレートを磁気プレート上で 1 分間静置し、溶出核酸を含む上清を、新
しい保存用プレート・チューブに移す。
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Agencourt FormaPure
Purification Procedure
DNA/RNA 抽出の場合
1. Proteinase K 40 mg/ml 溶液を調製します。
Proteinase K のボトルに、PK Buffer を 50 preps の場合は 1.2 mL、96 preps の場合は 2.3
mL、384 preps の場合はボトルあたり 2.3 mL 加え、混合します。調製後の溶液は、-20℃で
保存します。
Wash Buffer 溶液を調製します。
Wash Buffer のボトルに、100%イソプロパノールを 50 preps の場合は 15 mL、96 preps の
場合は 28 mL、384 preps の場合はボトルあたり 112 mL 加え、混合します。調製後の溶液
は、室温で保存します。
2. FFPE 組織切片サンプルを 1.7 mL チューブに入れます。サンプルは、30 μm 切片 5 枚量を
限度とします。
96 ウェルプレートで精製を行う場合も、サンプルの溶解ステップでは 1.7 mL チューブを使用
することをお勧めします。
大きな切片のサンプルは、組織の周りのパラフィンを予め取り除いておいて下さい。
3. チューブに Lysis Buffer 溶液 200 μL を加えます。ピペットのチップで、サンプルを Lysis
Buffer 溶液中に完全に沈めます。
4. チューブを 70~72℃で、60 分間反応します。
組織からパラフィンを取り除くステップです。70℃で 60 分以上の反応は、RNA の収率低下の
可能性があります。反応後、軽い遠心により水滴を落とします。
5. チューブにステップ 1 で調製した Proteinase K (40 mg/ml) 溶液 20 μL を加えます。チューブ
液面上層のパラフィン層をピペットのチップで貫き、サンプルに直接 Proteinase K を加え、ピ
ペッティングで 3 回により混合します。
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6. チューブを 55℃で、60 分間反応します。
組織を溶解し、ヌクレアーゼを不活化するステップです。反応後、軽い遠心により水滴を落とし
ます。
7. チューブを氷上で 2 分間静置し、過剰なパラフィンを凝固します。
8. 溶解サンプル 200 μL を反応プレート (96 ウェル 1.2 mL ウェルサイズプレート) またはチュ
ーブ (1.7 mL マイクロチューブ) に移します。凝固したパラフィンは、持ち込まないようにしま
す。
以降のステップをすぐに行わない場合、反応プレート・チューブは-20℃で一晩保存できます。
9. 反応プレート・チューブに Bind 1 Buffer 150 μL を加え、ピペッティング 5 回により混合しま
す。
10. Bind 2/イソプロパノール溶液を用時調製します。
Bind 2 Buffer のボトルを十分に撹拌し、磁性ビーズを完全に再懸濁します。1 サンプルあた
り、Bind 2/イソプロパノール溶液 320 μL 必要です。Bind 2 Buffer 20 μL と 100%イソプロパ
ノール 300 μL を十分に混合します。
11. 反応プレート・チューブにステップ 10 で調製した Bind 2/イソプロパノール溶液 320 μL を加
え、ピペッティング 5 回により混合します。
12. 反応プレート・チューブを 55℃で、5 分間反応します。
13. 反応プレート・チューブを磁気プレート・スタンド上で 5 分間静置し、溶液中の磁性ビーズを分
離します。反応プレートを磁気プレート上に置いたままで、上清を除去します。
14. 反応プレート・チューブを磁気プレート・スタンド上から下ろし、ステップ 1 で調製した Wash
Buffer 溶液 300 μL を加え、ピペッティング 5 回により再懸濁します。そのまま 1 分間静置し
ます。
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Agencourt FormaPure
15. 反応プレート・チューブを磁気プレート・スタンド上で 3 分間静置し、溶液中の磁性ビーズを分
離します。反応プレート・チューブを磁気プレート上に置いたままで、上清を除去します。
16. 反応プレート・チューブを磁気プレート・スタンド上から下ろし、70%エタノール 500 μL を加え、
ピペッティング 5 回により再懸濁します。
17. 反応プレート・チューブを磁気プレート・スタンド上で 5 分間静置し、溶液中の磁性ビーズを分
離します。反応プレートを磁気プレート上に置いたままで、上清を除去します。
18. 反応プレート・チューブを磁気プレート・スタンド上から下ろし、90%イソプロパノール 500 μL を
加え、ピペッティング 5 回により再懸濁します。反応プレート・チューブを 70℃で、3 分間反応
します。
19. 反応プレート・チューブを磁気プレート・スタンド上で 3 分間静置し、溶液中の磁性ビーズを分
離します。反応プレート・チューブを磁気プレート・スタンド上に置いたままで、上清を除去しま
す。
20. ステップ 18~19 の、90%イソプロパノール洗浄と 70℃加熱 3 分間を繰り返し行います。
21. 反応プレート・チューブを磁気プレート・スタンド上から下ろし、70%エタノール 750 μL を加え、
ピペッティング 5 回により再懸濁します。
22. 反応プレート・チューブを磁気プレート・スタンド上で 5 分間静置し、溶液中の磁性ビーズを分
離します。反応プレートを磁気プレート・スタンド上に置いたままで、上清を除去します。
23. 反応プレート・チューブを 5 分間風乾します。
ウェルの壁に付いた水滴は乾燥させてください。磁性ビーズを過度に乾燥させると、収量が低
下する場合があります。
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Agencourt FormaPure
24. 反応プレート・チューブを磁気プレート・スタンドから下ろし、ヌクレアーゼフリー水 80 μL を加
え、ピペッティング 5 回により磁性ビーズを十分に再懸濁します。さらに、反応プレート・チュー
ブを 65~70℃で 30 秒間静置し、核酸を溶出します。
溶出液量は変更することができますが、40 μL 以上で溶出を行うようにして下さい。
25. 反応プレート・チューブを磁気プレート・スタンド上で 1 分間静置し、溶液中の磁性ビーズを分
離します。溶出核酸を含む上清を、新しい保存用プレート・チューブに移します。
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RNA のみの抽出の場合
1. Proteinase K 40 mg/ml 溶液を調製します。
Proteinase K のボトルに、PK Buffer を 50 preps の場合は 1.2 mL、96 preps の場合は 2.3
mL、384 preps の場合はボトルあたり 2.3 mL 加え、混合します。調製後の溶液は、-20℃で
保存します。
Wash Buffer 溶液を調製します。
Wash Buffer のボトルに、100%イソプロパノールを 50 preps の場合は 15 mL、96 preps の
場合は 28 mL、384 preps の場合はボトルあたり 112 mL 加え、混合します。調製後の溶液
は、室温で保存します。
2. FFPE 組織切片サンプルを 1.7 mL チューブに入れます。サンプルは、30 μm 切片 5 枚量を
限度とします。
96 ウェルプレートで精製を行う場合も、サンプルの溶解ステップでは 1.7 mL チューブを使用
することをお勧めします。
大きな切片のサンプルは、組織の周りのパラフィンを予め取り除いておいて下さい。
3. チューブに Lysis Buffer 溶液 200 μL を加えます。ピペットのチップで、サンプルを Lysis
Buffer 溶液中に完全に沈めます。
4. チューブを 70~72℃で、60 分間反応します。
組織からパラフィンを取り除くステップです。70℃で 60 分以上の反応は、RNA の収率低下の
可能性があります。反応後、軽い遠心により水滴を落とします。
5. チューブにステップ 1 で調製した Proteinase K (40 mg/ml) 溶液 20 μL を加えます。チューブ
液面上層のパラフィン層をピペットのチップで貫き、サンプルに直接 Proteinase K を加え、ピ
ペッティングで 3 回により混合します。
6. チューブを 55℃で、60 分間反応します。
組織を溶解し、ヌクレアーゼを不活化するステップです。反応後、軽い遠心により水滴を落とし
ます。
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7. チューブを氷上で 2 分間静置し、過剰なパラフィンを凝固します。
8. 溶解サンプル 200 μL を反応プレート (96 ウェル 1.2 mL ウェルサイズプレート) またはチュ
ーブ (1.7 mL マイクロチューブ) に移します。凝固したパラフィンは、持ち込まないようにしま
す。
以降のステップをすぐに行わない場合、反応プレート・チューブは-20℃で一晩保存できます。
9. 反応プレート・チューブに Bind 1 Buffer 150 μL を加え、ピペッティング 5 回により混合しま
す。
10. Bind 2/イソプロパノール溶液を用時調製します。
Bind 2 Buffer のボトルを十分に撹拌し、磁性ビーズを完全に再懸濁します。1 サンプルあた
り、Bind 2/イソプロパノール溶液 320 μL 必要です。Bind 2 Buffer 20 μL と 100%イソプロパ
ノール 300 μL を十分に混合します。
11. 反応プレート・チューブにステップ 10 で調製した Bind 2/イソプロパノール溶液 320 μL を加
え、ピペッティング 5 回により混合します。
12. 反応プレート・チューブを 55℃で、5 分間反応します。
13. 反応プレート・チューブを磁気プレート・スタンド上で 5 分間静置し、溶液中の磁性ビーズを分
離します。反応プレートを磁気プレート上に置いたままで、上清を除去します。
14. 反応プレート・チューブを磁気プレート・スタンド上から下ろし、70%エタノール 750 μL を加え、
ピペッティング 5 回により再懸濁します。
15. 反応プレート・チューブを磁気プレート・スタンド上で 5 分間静置し、溶液中の磁性ビーズを分
離します。反応プレートを磁気プレート上に置いたままで、上清を除去します。
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16. 反応プレート・チューブを 5 分間風乾します。
ウェルの壁に付いた水滴は乾燥させてください。
17. DNase I 溶液を用時調製します。
1 サンプルあたり、1× DNase 溶液 100 μL 必要です。ヌクレアーゼフリー水 80 μL、10×
DNase Buffer 10 μL、DNase I 10 μL を混合します。
18. 反応プレート・チューブを磁気プレート・スタンド上から下ろし、ステップ 17 で調製した DNase I
溶液 100 μL を加え、ピペッティング 5 回により再懸濁します。
19. 反応プレート・チューブを 37℃で 15 分間反応し、DNA を消化します。
20. ステップ 1 で調製した Wash Buffer 溶液 300 μL を加え、ピペッティング 5 回により再懸濁し
ます。そのまま室温で 5 分間静置します。
21. 反応プレート・チューブを磁気プレート・スタンド上で 5 分間静置し、溶液中の磁性ビーズを分
離します。反応プレートを磁気プレート上に置いたままで、上清を除去します。
22. 反応プレート・チューブを磁気プレート・スタンド上から下ろし、70%エタノール 750 μL を加え、
ピペッティング 5 回により再懸濁します。
23. 反応プレート・チューブを磁気プレート・スタンド上で 5 分間静置し、溶液中の磁性ビーズを分
離します。反応プレートを磁気プレート上に置いたままで、上清を除去します。
24. 反応プレート・チューブを磁気プレート・スタンド上から下ろし、90%イソプロパノール 500 μL を
加え、ピペッティング 5 回により再懸濁します。反応プレート・チューブを 70℃で、3 分間反応
します。
25. 反応プレート・チューブを磁気プレート・スタンド上で 3 分間静置し、溶液中の磁性ビーズを分
離します。反応プレート・チューブを磁気プレート・スタンド上に置いたままで、上清を除去しま
13
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す。
26. ステップ 24~25 の、90%イソプロパノール洗浄と 70℃加熱 3 分間を繰り返し行います。
27. 反応プレート・チューブを磁気プレート・スタンド上から下ろし、70%エタノール 750 μL を加え、
ピペッティング 5 回により再懸濁します。
28. 反応プレート・チューブを磁気プレート・スタンド上で 5 分間静置し、溶液中の磁性ビーズを分
離します。反応プレートを磁気プレート・スタンド上に置いたままで、上清を除去します。
29. 反応プレート・チューブを 5 分間風乾します。
ウェルの壁に付いた水滴は乾燥させてください。磁性ビーズを過度に乾燥させると、収量が低
下する場合があります。
30. 反応プレート・チューブを磁気プレート・スタンドから下ろし、ヌクレアーゼフリー水 80 μL を加
え、ピペッティング 5 回により磁性ビーズを十分に再懸濁します。さらに、反応プレート・チュー
ブを 65~70℃で 30 秒間静置し、RNA を溶出します。
溶出液量は変更することができますが、40 μL 以上で溶出を行うようにして下さい。
31. 反応プレートを磁気プレート上で 1 分間静置し、溶液中の磁性ビーズを分離します。溶出
RNA を含む上清を、新しい保存用プレート・チューブに移します。
11-QMJ-161108
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