Informationen für die Immunhistochemie, in situ-Hybridisierung und Molekularpathologie newsletter_02_16 Inhalt AmoyDx® SuperARMS Real-Time PCR Assays – Gesteigerte Sensitivität für den Mutationsnachweis an cfDNA.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 Neue CISH-Sonden für die Lymphomdiagnostik. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 Der Zytomed Systems Lesetipp. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 Immunhistochemie bei Karzinomen mit unbekanntem Primärtumor. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 PD-L1 Immunhistochemie........ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7 Termine 7. bis 9. Oktober 2016 Deutsche Pathologie Tage 2016 Berlin 7. Oktober 2016 Immunhistochemie an Lebertumoren Workhop, Berlin 15. Oktober 2016 Grundlagen der Fluoreszenz in situ-Hybridisierung – Theorie und Praxis Workhop, Göttingen 14. bis 17. November 2016 MEDICA Düsseldorf 19. November 2016 Immunhistochemie an Lebertumoren Workhop, Essen newsletter_02_16 AmoyDx® SuperARMS Real-Time PCR Assays – Gesteigerte Sensitivität für den Mutationsnachweis an cfDNA Die Testung von EGFR Mutationen an cfDNA (cell free DNA) aus liquid biopsies wird zunehmend in die Diagnostik Einzug finden. Da der Anteil an Tumor-DNA in diesen Proben im Vergleich zu Proben aus FFPE-Material gering ist, wird eine möglichst hohe Sensitivität des Mutations-Nachweises angestrebt. Unter diesem Aspekt hat unsere Partnerfirma AmoyDx® verschiedene Real-Time PCR Assays mit neuer SuperARMS™ Technologie (Super-Amplification Refractory Mutation System) speziell für cfDNA Proben entwickelt. Das neue SuperARMS™ EGFR T790M Mutation Detection Kit erreicht im Vergleich zu den bisher auf dem Markt befindlichen Real-Time PCR Systemen eine erhöhte Sensitivität von bis zu 0,2 % Mutationsanteil in der wt-DNA beim T790M Nachweis. Ebenfalls neu ist das SuperARMS™ EGFR Mutation Detection Kit. Dieses Kit ermöglicht den Nachweis von 41 Mutationen in den Exons 18 bis 21 des EGFR Gens in cfDNA mit Sensitivitäten von 0,2 – 0,8 % (T790M: 0,2 %). Dieses Kit ist im pre-loaded Format erhältlich. Neue CISH-Sonden für die Lymphomdiagnostik Neben den klassischen Anwendungsgebieten der chromogenen in situ-Hybridisierung (CISH) bei Mamma- oder Sarkomdiagnostik kann die CISHDiagnostik dank neuer ZytoDot® 2C Break Apart Sonden nun auch in der Lymphomdiagnostik eingesetzt werden. Die Detektion der Sonden erfolgt mit dem ZytoDot® 2C CISH Implementation Kit Exon 18: G719C, G719A Exon 19: 29 Deletionen ZytoDot® 2C CISH Sonden für die Lymphomdiagnostik Bezeichnung Markierung Menge ZytoDot® 2C SPEC ALK Break Apart Probe DIG/DNP 100 µl (10 Tests) C-3055-100 ZytoDot® 2C SPEC ALK Break Apart Probe DIG/DNP 400 µl (40 Tests) C-3055-400 ZytoDot® 2C SPEC BCL2 Break Apart Probe DIG/DNP 100 µl (10 Tests) C-3073-100 ZytoDot 2C SPEC BCL6 Break Apart Probe DIG/DNP 100 µl (10 Tests) C-3074-100 ZytoDot® 2C SPEC CCND1 Break Apart Probe DIG/DNP 100 µl (10 Tests) C-3075-100 ZytoDot 2C SPEC IGH Break Apart Probe DIG/DNP 100 µl (10 Tests) C-3071-100 ZytoDot® 2C SPEC MALT1 Break Apart Probe DIG/DNP 100 µl (10 Tests) C-3072-100 ZytoDot® 2C SPEC MYC Break Apart Probe DIG/DNP 400 µl (40 Tests) C-3066-400 ® Exon 20: T790M, S768I, 6 Insertionen Exon 21: L858R, L861Q Assay-Design: Vier Reaktionen - Vier Fluoreszenzen FAM ROX Cy5 HEX/VIC Reaktionsmix 1 19-Del L858R IC* Reaktionsmix 2 T790M IC* Literatur [1] Douillard JY et al. First-line gefitinib in Caucasian EGFR mutation-positive NSCLC patients: a phase-IV, open-label, single-arm study. Br J Cancer 110:5562, 2014 Reaktionsmix 3 G719X L861Q S768I IC* Reaktionsmix 4 20-Ins IC* [2] Zheng D et al. Plasma EGFR T790M ctDNA status is associated with clinical outcome in advanced NSCLC patients with acquired EGFR-TKI resistance. Sci Rep 6:20913, 2016 [3] http://news.merck.de/N/0/2DC5340 5BDD827A1C1257FFD006F7BC2/$File/ PressRelease-Merck_AmoyDxChinaCollaboration_English280716.pdf kolorektalen Karzinom evaluiert werden. Die AmoyDx® SuperARMS Kits sind geeignet für RealTime PCR Geräte mit einem möglichen Reaktionsvolumen von 80 µl. Für die Aufreinigung von cfDNA aus liquid biopsies stehen ein speziell entwickeltes AmoyDx® Circulating DNA Kit sowie die Cell-free DNA Protection Vacuum Tubes zur Verfügung. Zytomed Systems hat bei dem NordiQC Ringversuch HER-2 FISH, H9, 2016 erfolgreich teilgenommen. In diesem Ringversuch sollten 5 Gewebeschnitte auf ihren HER2 (ERBB2)-Status untersucht werden. Die Untersuchung wurde im Zytomed Systems Labor mit der FISH-Sonde „ZytoLight® SPEC ERBB2/CEN 17 Dual Color Probe“ Nachweis der EGFR T790M Mutation an cfDNA (liquid biopsies) SuperARMS EGFR Mutation Detection Kit Nachweis von 41 EGFR Mutationen in den Exons 18–21 an cfDNA (liquid biopsies) Bezeichnung Cell-free DNA Protection Vacuum Tube ZytoDot® 2C SPEC CCND1 Break Apart Probe, Mantelzell-Lymphom, 1 Fusions- und 1 Split-Signal pro Zellkern Zytomed Systems Lesetipp : PD-L1 Immunhistochemie als Herausforderung für die Pathologie Form Menge Bestell-Nr. Bulk 1 Kit (24 Tests) ADX-EG12-R pre-loaded 1 Kit (12 Tests) ADX-EG14-R Kits für die cfDNA Aufreinigung Circulating DNA Kit (Z-2015-200) und dem Vorbehandlungskit „ZytoLight® FISH Tissue Implementation Kit“ (Z-2028-20) unserer Partnerfirma ZytoVision durchgeführt. Das Zytomed Systems Labor nimmt regelmäßig an nationalen und internationalen Ringversuchen zur Qualitätssicherung in der Pathologie (u.a. QuIP, NordiQC, EQA der ESP) teil. Kerr KM and Nicolson MC. Arch Pathol Lab Med 2016 March; 140:249-254 AmoyDx® SuperARMS™ Kits SuperARMS EGFR T790M Mutation Detection Kit ZytoDot® 2C SPEC MYC Break Apart Probe, Non-Hodgkin Lymphom, 1 Fusions- und 1 Split-Signal pro Zellkern Ringversuch News Produktinformation Bezeichnung Bestell-Nr. ZytoLight®, ZytoDot® und ZytoFast® sind eingetragene Marken unserer Partnerfirma ZytoVision GmbH, Bremerhaven. *IC: interne Kontrolle Neben der Anwendung des EGFR-Mutationsnachweises beim Lungenkarzinom können zukünftig auch andere Mutationsnachweise an cfDNA interessant werden. In einer kürzlich gestarteten Kooperation zwischen AmoyDx® und Merck, Darmstadt, soll die Untersuchung von KRAS-, NRAS und BRAF-Mutationen in klinischen Studien beim metastasierenden ZytoDot® 2C SPEC BCL2 Break Apart Probe, Normalgewebe, 2 Fusionssignale pro Zellkern Produktinformation ® Nachweisbare Mutationen mit dem SuperARMS™ EGFR Mutation Detection Kit (C-3044-40) und unserem CISH-Standardprotokoll. Für neue Gewebetypen sollte bei der Gewebevorbehandlung wie üblich eine Anpassung der PepsinEinwirkzeit durchgeführt werden. Für die Auswertung von CISH Break Apart Sonden empfehlen wir die Verwendung eines 100X Objektives (Öl-Immersion) mit hoher Apertur. Non–Small Cell Lung Cancer, PD-L1, and the Pathologist Kerr KM and Hirsch FR. Arch Pathol Lab Med 2016 April; 140:325-331 Programmed Death Ligand-1 Immunohistochemistry: Friend or Foe? Die Autoren diskutieren in diesen beiden Publikationen die aktuelle Situation des PD-L1-Nachweises aus der Sicht des Pathologen und des Onkologen. Insbesondere der Umstand, dass ein einzelnes Zielmolekül im Rahmen der Companion oder Complementary Diagnostics in Abhängigkeit von der in Frage kommenden Therapie mit 4 oder mehr verschiedenen Methoden (und möglicherweise auch noch auf verschiedenen Immunfärbeautomaten) detektiert werden soll, stellt die Pathologie nach Meinung der Autoren vor große, bisher nicht bekannte Herausforderungen. Menge Bestell-Nr. 1 Kit (24 Tests) ADX-BL03-R Kerr & Nicolson, 2016: “The biology of PD-1/PD-L1 is complex, the clinical data for these drugs show considerable variation, the selection performance of the PD-L1 biomarker test is not perfect, and the existence of 4 drug/test combinations adds significantly to the problems faced.” 1 Set (10 Röhrchen) ADX-VT01-R Beide Publikationen sind auf archivesofpathology.org/toc/arpa/140/3 bzw. archivesofpathology.org/toc/arpa/140/4 frei verfügbar. newsletter_02_16 Immunhistochemie bei Karzinomen mit unbekanntem Primärtumor In einem Übersichtsartikel in der Ausgabe vom Juni 2016 der Archives of Pathology & Laboratory Medicine stellen Patricia L. Kandalaft und Allen M. Gown etablierte und neue Antikörper für die Klassifikation von Karzinomen mit unbekanntem Primärtumor (CUP) vor [1]. Darstellung von Arginase-1 am Leberzellkarzinom Etwa 4 % aller Krebspatienten werden mit CUPs vorstellig. Die Identifikation des Primärtumors ist wegen unterschiedlicher Prognosen und Behandlungsoptionen, insbesondere vor dem Hintergrund neuer zielgerichteter Therapien, von höchster klinischer Relevanz. Trotz der Verfügbarkeit verschiedener neuer Genexpressionstests sehen die Autoren die Immunhistochemie nach wie vor als Goldstandard für die CUP-Diagnostik an. Für die Aufarbeitung von CUP sind zwei Klassen von Antikörpern hilfreich: (A) Antikörper gegen Keratine (Zytokeratine) und (B) Antikörper gegen zelloder organspezifische Marker. Adenokarzinom der Lunge GATA3-Nachweis am Urothelkarzinom Duktales Mammakarzinom Serös-papilläres Ovarialkarzinom Adenokarzinom des Endometriums Hepatozelluläres Karzinom Neuroendokrines Karzinom der Lunge Nierenzellkarzinom Adenokarzinom der Prostata Plattenepithelkarzinom der Lunge Urothelkarzinom Napsin A-Nachweis am pulmonalen Adenokarzinom (Tabelle 2, modifiziert nach Kandalaft und Gown, 2016) [1] Lokalisation des Signals Sensitivität Spezifität Zusätzliche Reaktivität Mamma Östrogenrezeptoren Nukleus moderat moderat endometrioides Adeno-CA, seröses Ovarial-CA Mamma GCDFP-15 Zytoplasma niedrig moderat Speicheldrüse, Schweißdrüsentumoren Mamma Mammaglobin Zytoplasma niedrig moderat Speicheldrüse, Schweißdrüsentumoren Mamma GATA3 Nukleus hoch moderat Speicheldrüse, Urothel-CA, Adnextumoren der Haut Kolorektum und GI Villin Zytoplasma und Zytoplasmamembran (Bürstensaum) hoch moderat einige Lungen-CA, Ovarial- und Endometrium-CA Kolorektum CDX2 Nukleus hoch hoch einige Pankreas-, Magen- und Ovarial-CA Hepatozellulär HepPar1 Zytoplasma moderat hoch hepatoide Adeno-CA Hepatozellulär Arginase Nukleus und Zytoplasma hoch hoch TTF-1 Nukleus hoch hoch neuroendocrine CA anderen Ursprungs Napsin A Zytoplasma hoch hoch klarzellige gyn. CA, einige Nierenzellund Schilddrüsen-CA Gynäkologische CA PAX8 Nukleus sehr hoch moderat Nierenzell- und Schilddrüsen-CA Ovar (serös) WT1 Nukleus sehr hoch hoch Mesotheliom 80 - 100 Prostata PSA Zytoplasma sehr hoch sehr hoch 71 - 89 Prostata NKX3.1 Nukleus sehr hoch sehr hoch 60 – 80 Nierenzell PAX8 Nukleus moderat moderat gyn. und Schilddrüsen-CA Plattenepithel, Urothel p63 Nukleus sehr hoch sehr hoch Thymome, Speicheldrüsentumoren, einige neuroendokrine CA, trophoblastische Tumoren, einige pulmonale Adeno-CA Plattenepithel, Urothel p40 Nukleus sehr hoch sehr hoch Thymome, Speicheldrüsentumoren, trophoblastische Tumoren Schilddrüse Thyreoglobulin Zytoplasma hoch sehr hoch Schilddrüse PAX8 Nukleus sehr hoch moderat Urothel Uroplakine Zytoplasmamembran niedrig hoch Urothel GATA3 Nukleus hoch moderat Die in diesem Zusammenhang wichtigsten Keratine sind Keratin 7 und Keratin 20, deren Expression in verschiedenen Karzinomen in Tabelle 1 zusammengefasst ist. Daneben finden Antikörper gegen Keratin 5 (und 14) Verwendung, die dem Nachweis einer plattenepithelialen, urothelialen, myoepithelialen und mesothelialen Differenzierung dienen. Schließlich ist zur Unterscheidung von Karzinomen des pankreatobiliären Systems und Magenkarzinomen der Nachweis von Keratin 17 hilfreich. Keratin 7 Keratin 20 Häufigkeit dieses Immunphänotyps [%] + + + + + + + 75 - 95 Die organ- oder zellspezifischen Marker werden ihrerseits in zwei Gruppen unterteilt: (A) zytoplasmatisch und/oder membranständig lokalisierte Differenzierungsmarker sowie (B) nukleäre Transkriptionsfaktoren. Die Expression der Differenzierungsmarker und der Anteil der für diese Marker positiven Tumorzellen sind abhängig vom Differenzierungsgrad Karzinom- bzw. tumorspezifische Antikörper Antikörper gegen (Tabelle 1, modifiziert nach Kandalaft und Gown, 2016) [1] Kolorektales Adenokarzinom stattdessen auf einen Übersichtsartikel [2], in dem die aktuellen Empfehlungen der ISUP (International Society of Urological Pathology) dargestellt werden. Karzinomtyp Verteilung der Keratin 7 und 20 Immunphänotypen in verschiedenen Karzinomen Karzinomtyp Tabelle 2 gibt eine Übersicht der wichtigsten organspezifischen Marker. Nicht berücksichtigt sind dabei Marker für Keimzelltumoren. Die Autoren verweisen 90 80 – 95 > 90 Lunge (Adeno) und Schilddrüse einschließlich neuroendokrin Lunge (Adeno) 70 – 90 60 – 100 50 – 90 25 - 90 des Tumors. In stärker entdifferenzierten Tumoren findet man allgemein eine schwächere Expression und weniger positive Zellen. Im Gegensatz dazu sind nukleäre Transkriptionsfaktoren meist in der gesamten Tumorzellpopulation nachweisbar und ihre Expression ist (nach Meinung der Autoren) weitgehend unabhängig vom Differenzierungsgrad. gyn. und Nierenzell-CA Mamma- und Speicheldrüsen-CA, Adnextumoren der Haut newsletter_02_16 Anmerkungen von P. L. Kandalaft und A. M.Gown zu den in Tabelle 2 genannten Markern [1] : Die Publikation von Kandalaft und Gown ist auf archivesofpathology.org/toc/arpa/140/6 frei verfügbar. GATA3: Um eine maximale Sensitivität zu erzielen, wird bei Verdacht auf Mammakarzinom der Nachweis aller drei Mamma-spezifischen Marker, also GATA3, GCDFP-15 und Mammaglobin, empfohlen. CDX2: Nahezu 100 % aller kolorektalen Karzinome sind CDX2-positiv. Eine Ausnahme stellen kolorektale Karzinome mit Mikrosatelliten-Instabilität dar, die im Allgemeinen nur eine schwache oder sogar fehlende CDX2-Expression zeigen [3]. Arginase-1: Während bis vor einigen Jahren α-Fetoprotein als der beste Marker für eine hepatozelluläre Differenzierung angesehen wurde, stehen inzwischen mit HepPar1, Glypican-3 und Arginase-1 bessere immunhistochemische Nachweise zur Verfügung. Arginase-1 zeigt dabei die höchste Sensitivität und Spezifität und ist für die Identifizierung von Leberzellkarzinomen der Marker der Wahl. PSA und NKX3.1: In einigen Fällen kann der kombinierte Nachweis von PSA und NKX3.1 für den Nachweis von Adenokarzinomen der Prostata hilfreich sein. Antikörper gegen PSAP (Prostatic Acid Phosphatase) werden dagegen wegen ihrer geringeren Spezifität nicht empfohlen. PAX8: Für den Nachweis metastasierender Nierenzellkarzinome ist PAX8 ein sensitiver und robuster Marker, der PAX2 inzwischen weitgehend ersetzt hat. Bei der Abgrenzung TTF-1 positiver Schilddrüsenkarzinome von TTF-1 positiven pulmonalen Adenokarzinomen hilft die PAX8-Immunhistochemie insofern als dieses Protein in Adenokarzinomen der Lunge nicht nachweisbar ist. Zytomed Systems bietet eine Vielzahl paraffingängiger Antikörper gegen organspezifische Marker an. Die Antikörper sind zum Großteil als CE/IVD klassifi- ziert und meist sowohl als gebrauchsfertige Lösungen für die Immunhistochemie als auch in konzentrierter Form erhältlich. Produktinformation: organpezifische Antikörper (Auswahl) Bezeichnung Arginase-1 Klon: EP261 I Wirt: Kaninchen [1] Kandalaft PJ and Gown AW. Practical Applications in Immunohistochemistry: Carcinomas of Unknown Primary Site. Arch Pathol Lab Med 140:508-523, 2016 [2] Ulbright TM et al.; Members of the ISUP Immunohistochemistry in Diagnostic Urologic Pathology Group. Best practices recommendations in the application of immunohistochemistry in testicular tumors: report from the International Society of Urological Pathology consensus conference. Am J Surg Pathol 38:e50-e59, 2014 [3] Hinoi T et al. Loss of CDX2 expression and microsatellite instability are prominent features of large cell minimally differentiated carcinomas of the colon. Am J Pathol 159:22392248, 2001 Verdünnung Menge Bestell-Nr. - konzentriert 1:100 – 1:200 6 ml 0,1 ml 0,5 ml API3058AA ACI3058A ACI3058B gebrauchsfertig - 6 ml MSG105 konzentriert 1:100 – 1:200 0,5 ml MSK105-05 gebrauchsfertig - konzentriert 1:50 – 1:100 6 ml 0,5 ml 1 ml RBG019 RBK019-05 RBK019 GATA3 Klon: L50-823 I Wirt: Maus gebrauchsfertig - 6 ml MSG100 konzentriert 1:100 – 1:200 0,5 ml MSK100-05 Napsin A Klon: BC15 I Wirt: Kaninchen gebrauchsfertig - 6 ml RBG059 konzentriert 1:100 – 1:200 0,5 ml RBK059-05 NKX3.1 Klon: polyklonal I Wirt: Kaninchen gebrauchsfertig - 6 ml RBG062 konzentriert 1:50 – 1:100 0,5 ml RBK062-05 gebrauchsfertig - konzentriert 1:100 – 1:200 6 ml 0,1 ml 0,5 ml 1 ml API438AA ACI438A ACI438B ACI438C konzentriert 1:50 – 1:100 0,5 ml MSK101-05 gebrauchsfertig - konzentriert 1:200 – 1:500 gebrauchsfertig - konzentriert 1:100 – 1:200 6 ml 0,5 ml 1 ml 6 ml 0,1 ml 1 ml MSG004 MSK004-05 MSK004 API3126AA ACI3126A ACI3126C gebrauchsfertig - 6 ml MSG102 konzentriert 1:50 – 1:100 0,5 ml MSK102-05 Cadherin 17 (CDH17) Klon: 1H3 I Wirt: Maus Literatur Format gebrauchsfertig CDX2 Klon: EPR2764Y I Wirt: Kaninchen PAX8 Klon: BC12 I Wirt: Maus SATB2 Klon: SATBA4B10 I Wirt: Maus TTF-1 Klon: 8G7G3/1 I Wirt: Maus TTF-1 Klon: SPT24 I Wirt: Maus Uroplakin II Klon: BC21 I Wirt: Maus PD-L1 Immunhistochemie Von Dr. med. Till Braunschweig, Institut für Pathologie, Universitätsklinikum Aachen PD-L1 (Programmed Cell Death Ligand 1) sowie der abhängige Rezeptor, PD1 (Programmed Cell death 1), wurden 2000 in Ihrer Funktion und Interaktion beschrieben. PD-1 ist auf den T-Zellen in der Zellmembran lokalisiert. Durch Ligandenbindung wird die T-Zelle deaktiviert. Die Ligandenbindung von PD-L1 an PD-1 wurde zunächst mit dem Effekt der Inhibition der T-Zellproliferation und Verringerung der Zytokinproduktion beschrieben. Eine weitere Funktion der zytotoxischen T-Zellen ist die gezielte Einleitung der Apoptose von Tumorzellen nach spezifischer Antigenpräsentation über Antigen-präsentierende Zellen (APC), z. B. B-Lymphozyten und histiozytäre Zellen. Diese Inaktivierungswege werden als Checkpoints bezeichnet. Zu diesen Checkpoint-Rezeptoren zählen neben dem oben erwähnten PD-1 zum Beispiel auch CTLA4, CD28 und einige weitere. Eine Bindung von Liganden bzw. Aktivierung des Rezeptors führt zu einer Deaktivierung der zytotoxischen T-Lymphozyten. In physiologischen Situationen verhindern APC Zellen durch Oberflächenexpression von PD-L1 eine zytotoxische Reaktion der interagierenden T-Zellen. Die Deaktivierung von T-Zellen mittels Bindung von PD-L1 an PD-1 stellt einen wesentlichen Escape-Mechanismus von Tumorzellen dar [1]. Innerhalb der letzten Jahre wurden einige Inhibitoren entwickelt, die diese Checkpointmechanismen blockieren können, so genannte Checkpoint-Inhibitoren. Eine der ersten Zielstrukturen war CTLA4 [2]. Insbesondere bei Melanomen sehr effektiv, wurde Ipilimumab (Bristol-Myers-Squibb), ein monoklonaler Antikörper, einer der ersten von der European Medicines Agency (EMA) zugelassenen Checkpoint-Inhibitoren. Es folgten Inhibitoren von PD-1: Nivolumab (Bristol-Myers-Squibb) und Pembrolizumab (MSD Sharp & Dohme). Der Einsatz dieser PD-1 Inhibitoren ist, neben einer Kombinationstherapie von Nivolumab mit Ipilimumab beim fortgeschrittenen, nicht mehr operablen malignen Melanom, das nicht-kleinzellige Lungenkarzinom (NSCLC) und für Nivolumab das Nierenzellkarzinom (RCC) [3]. Bislang besteht die Zulassung durch die EMA nur für das vorbehandelte, nicht operable NSCLC (sowohl Plattenepithelkarzinome als auch Adenokarzinome) für die so genannte second line Therapie. Weitere Therapeutika mit einer in den nächsten Jahren zu erwartenden Zulassung für andere Karzinome, z. B. das Harnblasenkarzinom, sind Atezolizumab (Roche) und Durvalumab (Astra-Zeneca). In den verschiedenen Studien wurden unterschiedliche immunhistologische Parameter in Bezug auf das Therapieansprechen untersucht. Dabei konnte keine Abhängigkeit in Bezug auf die PD-1 Expression der T-Lymphozyten gefunden werden. Die immunhistologische PD-L1 Expression wurde als wesentlicher Parameter bei verschiedenen Tumoren beschrieben, wobei neben der Expression von PD-L1 auf den Tumorzellen auch die PD-L1 Expression auf Antigenpräsentierenden Zellen als signifikant korreliert gefunden werden konnte [4]. In der momentanen Zulassungslage besteht für Nivolumab keine Notwendigkeit, die Expression von PD-L1 in Tumoren zu untersuchen. Bei Pembrolizumab ist für die Anwendung bei NSCLC die PD-L1 Färbung bezüglich der Tumorzellen nötig. Eine Expression von mindestens 1 % reicht dabei aus, wobei die Intensität der Färbung und die Ausprägung der membranären Anfärbung (geschlossen – partiell) keine Rolle spielen. Der zukünftige Einsatz in der Erstlinientherapie hat sehr wahrscheinlich höhere Cut-Off Werte. Bei den noch nicht zugelassenen Therapeutika ist in den bisherigen Studien insbesondere das Atezolizumab hervorzuheben, da dort die so genannten Immunzellen, am ehesten APC, hinsichtlich ihrer PD-L1 Expression als Stratifizierungswerkzeug genutzt werden. Die verschiedenen Therapeutika verwenden dabei in den jeweiligen Studien diverse monoklonale Antikörper für die immunhistochemische Färbung, die in einer Harmonisierungsstudie verglichen wurden. Zum Einsatz kommen hier zwei Antikörper der Firma DAKO, Klone 28-8 und 22C3 sowie zwei Antikörper der Firma Roche/Spring, Klone SP142 und SP263. Die Studie konnte zeigen, dass die Spezifität identisch ist. Die 0 100 200 300 µm Abbildung 1: Färbung von Plazenta mit anti-PD-L1, CAL10, 200x mit membranärer Färbung des Synzytiotrophoblasten. 0 100 200 300 µm Abbildung 2: Färbung von Tonsillengewebe mit anti-PD-L1, CAL10, 200x mit membranärer Färbung Antigen-präsentierender Zellen APC). 0 100 200 300 µm Abbildung 3: Färbung eines NSCLC, Plattenepithelkarzinoms, mit antiPD-L1, CAL10, 200x mit membranärer Färbung Tumorzellen (ca. 70 %). newsletter_02_16 IC T IC 0 100 200 300 µm Abbildung 4: Färbung eines Plattenepithelkarzinoms, NSCLC mit anti-PD-L1, CAL10, 200x mit membranärer Färbung von Tumorzellen (T) und tumorassoziierten Immunzellen, APC (IC). G Intensität zeigte in dieser Studie ähnliche Ergebnisse bei den zwei DAKO Antikörpern und dem Roche SP142. Der Roche Antikörper SP263 war als ready-to-use Antikörper deutlich intensiver [5]. Die Antikörper der Firma DAKO sind seit kurzem verfügbar, jedoch kostenintensiv zum Teil als Färbekit zu beziehen. Die Antikörper der Firma Roche sind noch nicht regulär zu beziehen und bislang nur als Färbekit und ebenfalls kostenintensiv erhältlich. Alternativen bieten weitere Firmen, als Auswahl: Von der Firma Abcam wird häufig als Konzentrat der anti PD-L1 Antikörper, Klon 28-8 (identisch mit den DAKO-Klon) angewandt. Von der Firma Cell Signalling existieren zwei Antikörper (E1L3N und E1J2J), wovon der E1L3N häufig verwendet wird. Auch der monoklonale Antikörper PD-L1 CAL10 (Biocare/Zytomed Systems) zeigt ein identisches spezifisches Färbeergebnis und ist dabei kontrastreich und präzise. Für die Positivkontrolle wird Plazentagewebe eingesetzt, in dem der Synzytio- trophoblast eine distinkte starke, membranäre Färbung zeigt (Abb. 1). APC in der Tonsille können auch als Positivkontrolle dienen, sind jedoch in ihrer Anzahl und Färbeintensität variabel (Abb. 2). Im Tumorgewebe ist die Expression variabel, unabhängig von der Auswertung der Tumorzellen oder APC (Abb. 3, Tumorzellen und Abb. 4, APC bzw. Immunzellen). Zur Auswertung für das Scoring im Rahmen der klinischen Anwendung in der Pathologie kommt nur die membranäre Färbung von PD-L1 zum Tragen. Dabei wird nur die Anzahl der gefärbten Tumorzellen bzw. APC in Prozent bestimmt. Die Problematik der Auswertung ist zum einen die zu wertende Positivität auch sehr zarter membranärer Färbungen (Abb. 5) und die bereits in der Zulassung von Pembrolizumab für das NSCLC in der second line Therapie festgelegte Grenze von 1 %. Bei größeren histologischen Präparaten ist ein sehr genaues, zeitintensives Durchmustern in höherer Vergrößerung notwendig [6]. Literatur [1] Igney FH, Krammer PH. Immune escape of tumors: apoptosis resistance and tumor counterattack. J Leukoc Biol 71:907-920, 2002 [2] Pardoll DM. The blockade of immune checkpoints in cancer immunotherapy. Nat Rev Cancer 12:252-264, 2012 [3] Ott PA et al. CTLA-4 and PD-1/PD-L1 blockade: new immunotherapeutic modalities G with durable clinical benefit in melanoma patients.Clin Cancer Res 19:5300-5309, 2013 [4] Sznol M, Chen L. Antagonist antibodies to PD-1 and B7-H1 (PD-L1) in the treatment of 0 25 50 100 µm advanced human cancer. Clin Cancer Res 19:1021-1034, 2013 [5] Scheel AH et al. Predictive PD-L1 immunohistochemistry for non-small cell lung Abbildung 5: Färbung eines Plattenepithelkarzinoms, NSCLC mit anti-PD-L1, CAL10, 400x mit membranärer Färbung von Tumorzellen: die Problematik zeigt sich hier mit fraglich geringer membranärer Färbung in 80 % oder doch nur prominente Zellgrenzen (z. B. G)? cancer: Current state of the art and experiences of the first German harmonization study. Pathologe Aug 10, 2016 [Epub ahead of print] [6] Kerr KM, Hirsch FR. Programmed Death Ligand-1 Immunohistochemistry: Friend or Foe? Arch Pathol Lab Med 140:326-331, 2016 Antikörper und Kontrollen für die PD-L1-Immunhistochemie Bezeichnung PD-L1 (CD274) Klon: CAL10 I Wirt: Kaninchen Format Verdünnung Menge Bestell-Nr. gebrauchsfertig konzentriert 1:100 – 1:200 6 ml 0,5 ml RBG063 RBK063-05 Menge Bestell-Nr. 1 Packung mit 5 Objektträgern HD787 Bezeichnung CD274 (PD-L1) Expression IHC Reference Standard Paraffinschnitte von Stanzen aus 4 Zellkulturblöcken mit unterschiedlicher PD-L1-Expression (- / + / ++ / +++) Anhaltinerstraße 16 | 14163 Berlin | Fon +49 30 804 984 990 | Fax +49 30 804 984 999 [email protected] | www.zytomed-systems.de
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