Mikrobiologische Methoden für den naturwissenschaftlichen

Mikrobiologische Methoden
für den naturwissenschaftlichen Unterricht.
Arbeitsanleitung und Versuchsbeschreibungen
Inhaltsverzeichnis
Dieses Handbuch soll Ihnen notwendige
Informationen über die Arbeitsweise mit
Membranfiltern bei mikrobiologischen
Untersuchungen vermitteln.
Die nachfolgend beschriebenen Versuche
sind nur ein kleiner Ausschnitt aus dem
weiten Anwendungsbereich der Membranfiltertechnik. Wir hoffen, dass wir damit
Anregungen geben und dazu beitragen, den
Unterricht lebendig zu gestalten. Die Anzahl
der Versuche werden wir noch erweitern und
nehmen dazu auch gern Ihre Anregungen
entgegen.
1. Nachweis von Mikroorganismen
3
2. Die Nährmedien
4
3. Methoden zur mikroskopischen
Untersuchung
6
4. Mikrobiologisches Praktikum
9
5. Grundausrüstung für Schulversuche 10
6. Versuch 1
Nachweis von Mikroorganismen
im Wasser
11
Für spezielle Fragen steht Ihnen unsere
Abteilung PM Laborfiltration|Mikrobiologie
zur Verfügung.
7. Versuch 2
Nachweis von Mikroorganismen
in der Luft
13
Telefon 0551.308.0 oder 308.3433
8. Versuch 3
Nachweis von Mikroorganismen
im Erdreich
14
9. Versuch 4
Wirkung von Antibiotika
15
10. Versuch 5
Nachweis von Hefen in der Natur
16
11. Versuch 6
Gasbildung durch alkoholische
Gärung
17
12. Versuch 7
Bakterienwachstum bei
unterschiedlichen Temperaturen
18
13. Allgemeine Arbeitshinweise
in Bildern
19
14. Alternative Edelstahlgeräte
21
2
Nachweis von Mikroorganismen
Die Mikroorganismen können durch unterschiedliche Verfahren nachgewiesen und
bestimmt werden.
Zum Nachweis werden kulturelle und
mikroskopische Methoden, zur Differenzierung gewöhnlich biochemische und
serologische Methoden angewendet.
Beim kulturellen Nachweis bedient man sich
flüssiger und fester Nährböden, in oder auf
denen die Mikroorganismen durch Wachstum
angereichert werden.
Wenn im Zusammenhang mit dem Keimnachweis die Membranfiltermethode gegenüber
anderen Methoden bevorzugt wird, dann
vor allem dort, wo einige wenige Mikroorganismen in relativ großen Flüssigkeitsmengen
nachzuweisen sind. Durch Filtration werden
auf der Oberfläche eines Membranfilters
Mikroorganismen abgeschieden, die größer
als die gewählte Porengröße des Membranfilters sind. Das ist nur deshalb möglich, weil
Membranfilter mit definierten Porengrößen
gefertigt werden können.
Beim Keimnachweis werden normalerweise
Membranfilter mit 0,45 μm Porengröße
verwendet.
Das Membranfilter wird nach der Filtration
dem Gerät entnommen, auf einen geeigneten
Nährboden aufgelegt und nach spezifischen
Bedingungen bebrütet. Die Nährstoffe
diffundieren durch die Porenstruktur des
Filters an die Keime heran, die sich vermehren
und sichtbare Kolonien bilden.
Oberflächenstruktur eines 11406 Membranfilters,
0,45 μ Porengröße. (REM Aufnahme, 6750x)
Bei der Koloniezahlbestimmung, wie z.B. im
Rahmen einer Wasseruntersuchung, wird
durch Auszählen nur die Anzahl der Kolonien
ermittelt. Um die makroskopische Auswertung, die rein optische Beurteilung der
sichtbaren Kolonien, zu erleichtern, wird
in bestimmten Fällen den Nährmedien ein
Indikator zugesetzt, der geeignet ist, aufgrund der Stoffwechselvorgänge eine Farbstoffreaktion herbeizuführen, die typisch für
bestimmte Keimarten ist (z. B. der charakteristische Metallglanz [Fuchsinglanz] von
Escherichia coli auf Endo-Nährmedien). Soll
die Auswertung einer Kultur über das reine
Auszählen der Kolonien hinausgehen, muss
in jedem Fall mit Hilfe einer Impfnadel oder
Impföse Material aus einer typischen, einzeln
gewachsenen Kolonie entnommen werden.
Sollen mikroskopische Präparate über längere
Zeit aufbewahrt werden (Dauerpräparate),
kommen nur solche in Betracht, bei denen
die Mikroorganismen durch geeignete Färbemethoden angefärbt wurden. Die für mikrobiologische Untersuchungen einzusetzenden
Sartorius Stedim Biotech Membranfilter
bestehen aus biologisch inertem Cellulosenitrat. Die Membranfilter, die zusammen mit
den Nährkartonscheiben Würze, Standard
und Endo zum Umfang dieses Kits gehören,
sind beim Typ Würze grau und beim Typ
Standard grün eingefärbt. Die Anfärbung
erlaubt einen deutlichen Kontrast gegenüber
den meist hell wachsenden Kolonien. Der
Gitternetzaufdruck erleichtert das Auszählen
dicht gewachsener Kolonien, weil ein Quadrat
von 3,1 mm Kantenlänge einem 1/130 der
wirksamen Filtrationsfläche entspricht.
Im Abschnitt »Methoden zur mikroskopischen
Untersuchung« auf der Seite 7 wird die
Bereitung verschiedener Präparate ausführlich beschrieben.
Mikroskopische Präparate erlauben eine
erste Orientierung über Größe, Form und
Beweglichkeit der Bakterien und anderer
Mikroorganismen.
Hier wird – wegen des schärferen
Kontrastes – der mikroskopischen DunkelfeldMethode gegenüber der Hellfeld-Methode
der Vorzug gegeben.
Schnitt durch ein Membranfilter: a) obere Bildhälfte:
Oberfläche; b) Mitte: Schnittkante; c) untere Bildhälfte:
vertikaler Schnitt (REM Aufnahme 2500x)
Partikelabtrennung auf einem Membranfilter
(REM Aufnahme 6700x)
3
Die Nährmedien
Die Nährmedien müssen genügend Feuchtigkeit, einen für das Wachstum geeigneten
pH-Wert und spezifische Nährstoffe enthalten. Deshalb können auf Nährböden, die zur
Züchtung von Bakterien besonders geeignet
sind, Pilze nicht optimal angezüchtet werden.
Das gilt auch für die Anzüchtung von
Bakterien auf Nährböden für Pilze.
Nährkartonscheiben
Nährkartonscheiben, kurz NKS genannt,
sind sterile Nährböden in Trockenform.
Nach Anfeuchten mit sterilem destillierten
Wasser sind sie gebrauchsfertig. Die im nachfolgenden Text am häufigsten verwendeten
Nährböden sind die Standard-NKS zur
Bestimmung der Koloniezahl (Gesamtkeimzahl), Würze-NKS, ein Nährboden zum
Nachweis von Hefen und Schimmelpilzen,
Endo-NKS, ein selektiver Nährboden zum
Nachweis des Indikatorkeimes Escherichia
coli und coliformer Keime.
Auf allgemeinen (kollektiven) Nährmedien
lassen sich alle Mikroorganismen anzüchten,
wobei einige Spezies nur sehr schwach
wachsen. Dagegen wachsen auf speziellen
(selektiven) Medien nur bestimmte Arten
oder Gruppen bei gleichzeitiger Hemmung
unerwünschter Gattungen.
Die Nährkartonscheiben werden während
des Herstellungsprozesses mit dem entsprechenden Nähmmedium getränkt, anschließend getrocknet und sterilisiert. Daher muss
vor der mikrobiologischen Anwendung
die zuvor entzogene Wassermenge wieder
zugesetzt werden.
Der Einsatz selektiver Nährböden ist dort
von praktischer Bedeutung, wo nur wenige
Keime in einer Überzahl dominierender
Keime nachgewiesen werden sollen.
Die Befeuchtung der Nährkartonscheiben
ist optimal, wenn an der Randzone ein
deutlicher Flüssigkeitsüberschuss sichtbar
ist. Im Untersuchungsmaterial vorhandene
Mikroorganismen werden durch den Siebeffekt des Membranfilters auf der Oberfläche
abgeschieden. Nach dem Auflegen auf die
feuchte Nährkartonscheibe findet der Austausch von Nährstoffen und Stoffwechselprodukten durch das Porensystem des
Membranfilters statt. Während der Bebrütung
entwickeln sich Kolonien, die in ihrer
Ausbildung (Form und Färbung) denen auf
vergleichbaren Agarnährböden entsprechen.
Nährmedien
Die zur Anzüchtung von Mikroorganismen
zu verwendenden Nährmedien haben
unterschiedliche Zusammensetzungen.
Natürliche Nährmedien wie Bierwürze,
Fleischextrakt etc. und auch synthetische
können kollektiv oder selektiv sein.
Nährmedien können flüssig oder fest sein.
Durch Zusatz eines erstarrenden Festigungsmittels (Gelatine oder Agar) wird ein flüssiges
Medium zu einem festen Nährboden. Nur
mit festen Nährböden ist eine quantitative
Aussage möglich, weil dort einzeln wachsende
Kolonien bewertet und ausgezählt werden
können. Bei den von Sartorius Stedim Biotech
entwickelten Nährkartonscheiben werden
statt der Trägersubstanzen Gelatine oder Agar
Cellulosekartonscheiben als Nährbodenträger
verwendet.
Bakterien bevorzugen im allgemeinen
pepton- und fleischextrakthaltige Nährböden
im pH-Bereich 6,8-8,0, während Hefen
und Schimmelpilze zuckerhaltige Medien
im pH-Bereich 2,0-6,0 bevorzugen. Feste
Nährböden, Agar-Nährböden wie auch
Nährkartonscheiben werden hauptsächlich
im Zusammenhang mit Membranfiltern
eingesetzt, weil quantitative Analysen
hiermit leicht und sicher durchgeführt
werden können. Die Mikroorganismen
entwickeln sich auf dem bebrüteten
Membranfilter zu einzeln wachsenden
Kolonien, deren makroskopische und
mikroskopische Beurteilung leicht möglich
ist.
4
Zur Isolierung und z.B. zur morphologischen,
biochemischen und serologischen Untersuchung werden die Kolonien mit einer
Impfnadel vom Membranfilter abgeimpft.
Ein Verdünnungsausstrich ist ebenfalls auf
der Oberfläche des Membranfilters möglich.
Bebrütete Membranfilter, die zur Dokumentation aufbewahrt werden sollen, können
auf Vliespapier im Trockenschrank dreißig
Minuten bei 70°C getrocknet werden.
Hierdurch ist eine sichere Abtötung aller
vegetativen Keimformen gewährleistet. Das
Aufkleben der Membranfilter erfolgt mit
lösungsmittelfreiem Klebstoff.
Endo-Nährkartonscheiben Typ 140 53
Das Endo-Nährmedium ist ein LactoseFuchsin-Sulfit-Medium, nach dem japanischen Arzt Endo benannt und wird zum
Nachweis von Escherichia coli und coliformen
Bakterien in vielen Standards ausdrücklich
empfohlen.
Infolge des Gehaltes an Natriumsulfit und
Fuchsin werden grampositive Bakterien
weitgehend unterdrückt. Es findet eine
Selektion zugunsten der gramnegativen
Bakterien statt (E.coli und Coliforme).
Lactoseabbauende coliforme Keime bilden
Aldehyde und Säuren. Aldehyd wiederum
setzt Fuchsin aus der Fuchsin-Sulfit-Verbindung frei, so dass die Kolonien rot gefärbt
werden. Bei E.coli ist diese Reaktion so
intensiv, dass Fuchsin auskristallisiert und
den Kolonien einen grünschimmernden,
beständigen Metallglanz (Fuchsinglanz)
verleiht. Bakterien der Art E.coli werden in
großer Zahl im Darminhalt von Menschen und
Tieren angetroffen. Ihr Nachweis im Wasser
gilt als Zeichen einer fäkalen Verunreinigung.
Stanpard-Nährkartonscheiben
Typ 14055
Das Standard-Nährmedium ist ein Kollektivmedium und wegen seines reichen Nährstoffangebotes für das Anzüchten eines breiten
Artenspektrums besonders geeignet. Mit
einem pH-Wert von 7,2 bietet dieses Medium
den meisten Bakterien optimale Wachstumsbedingungen. Es wird hauptsächlich zur
Bestimmung der Koloniezahl aus Trinkwasser,
Oberflächenwasser, Abwässern und ähnlichem eingesetzt. Es enthält den Indikator
TTC (Triphenyltetrazoliumchlorid) der durch
Reduktion zu Formazan die dort anwachsenden Kolonien ziegelrot färbt. Dadurch lassen
sich auch sehr klein wachsende Kolonien
sehr deutlich erkennen.
Würze-Nährkartonscheiben Typ 14058
Das Würze-Nährmedium auf der Basis von
Bierwürze ist ein bewährtes Medium zum
Nachweis von Hefen und Schimmelpilzen.
Sein natursaurer Charakter mit einem
pH-Wert von 4,4 hemmt dabei das Wachstum
von Bakterien. Hefen wachsen meist als
glatte, weiße oder gefärbte Kolonien.
Schimmelpilze bilden samt- oder wattebauschartige Kolonien, die in der frühen
Wachstumsphase weiß sind und später – nach
Konidienbildung – unterschiedlich gefärbt
sein können. Die in ihrer natürlichen Farbe
wachsenden Kolonien bilden einen deutlichen
Kontrast auf dem schwarzen Hintergrund des
Membranfilters.
Es handelt sich hier um das grau eingefärbte
Membranfilter, 13005, das im feuchten
Zustand schwarz ist und serienmäßig allen
Würze-Nährkartonscheiben beigefügt ist.
Sartorius Stedim Biotech Nährbouillon in
Röhrchen
Die Nährbouillon wird zur Durchführung
von Versuchen im Rahmen dieses Kits zum
Anzüchten verschiedener aerob wachsender
Bakterien benötigt.
Die anderen coliformen Bakterien können
fäkalen Ursprungs sein, sie haben aber ihren
Hauptvermehrungsort im Oberflächenwasser
und Abwasser. Der Nachweis im Wasser
gilt als Zeichen einer entsprechenden
Verunreinigung. Im Trinkwasser dürfen
diese Bakterien nicht nachweisbar sein.
Sie wird in verschraubbaren wiederverwendbaren Glasröhrchen in 20 ml-Mengen steril
geliefert.
Anmerkung zur Lagerung: Die Endo-NKS
müssen immer lichtgeschützt aufbewahrt
werden.
Hefen und Schimmelpilze aus Rückbier
E. coli und Coliforme aus Flusswasser
Sartorius Stedim Biotech Nährbouillon in Röhrchen
Mischkultur aus Brunnenwasser
5
Methoden zur mikroskopischen Untersuchung
Mikroskopische Präparate
Das Lebendpräparat vermittelt ein natürliches
Bild von der Form und der natürlichen Bewegung der Mikroorganismen. Zum Nachweis
der Beweglichkeit der Bakterien bedient man
sich der Dunkelfeld-Methode. Dabei wird ein
starker Kontrast erreicht. Das direkte Licht
wird abgeblendet, zerstreutes Licht fällt an
den Seiten des Kondensors ein. Im dunklen
Beobachtungsfeld leuchten die seitlich
angestrahlten Objekte (Bakterien und
Verunreinigungen) hell auf.
Im Hellfeld werden die Bakterien sichtbar,
weil das Durchlicht an und in ihnen anders
gebrochen wird als in der Untersuchungsflüssigkeit. Im Blickfeld erscheinen sie als
graue oder dunkle Objekte.
Anfertigen eines einfachen Präparates
Auf den gereinigten Objektträger wird ein
Wassertropfen aufgebracht. Die Impföse
wird durch Ausglühen in der Bunsenbrennerflamme sterilisiert. Das Untersuchungsmaterial wird mit der abgekühlten Impföse in
den Wassertropfen getupft und das Deckglas
aufgelegt. Ein so gewonnenes Präparat dient
zur ersten Orientierung über Größe, Form
und Beweglichkeit.
Bakterien, die durch die Filtration auf Membranfiltern angereichert wurden, lassen sich
auf sehr einfache Weise mikroskopieren. Auf
dem gereinigten Objektträger wird anstelle
des Wassertropfens ein Tropfen Immersionsöl
aufgebracht. Das luftgetrocknete Membranfilter wird auf den Objektträger aufgelegt.
Nach Auflegen des Deckglases kann mit
Durchlicht mikroskopiert werden. Genauere
Bestimmungen sind mit Hilfe gefärbter
Präparate möglich.
Färbeverfahren
Im fixierten (abgetöteten) Zustand nehmen
Bakterien sehr viel mehr Farbstoff auf.
Deshalb ist die Untersuchung fixierter,
gefärbter Präparate als die mikrobiologische
Standardmethode zu bezeichnen. Die Färbung
gelingt um so besser, je dünner der Ausstrich
angefertigt und je schonender die Fixierung
vorgenommen wurde. Die Bakterienmenge
ist richtig bemessen, wenn der Ausstrich
als durchsichtiger, leicht getrübter Fleck zu
sehen ist.
Fixierung
Zweck der Fixierung ist das Haften der
Bakterien an der Glasfläche und das Abtöten
unter weitgehender Strukturerhaltung. Dazu
wird der Objektträger mit dem Ausstrich
nach unten 3 + durch die kleine Flamme des
Bunsenbrenners gezogen. Zeigt der Ausstrich
nach oben, muss dieses ca. 10 + erfolgen.
Ausstrichpräparat
Auf einen gut gereinigten und entfetteten
Objektträger wird ein Wassertropfen aufgebracht und darin Bakterien aufgeschwemmt.
Danach wird mit Hilfe des Deckglases der
Ausstrich gefertigt (siehe Skizze). Der Ausstrich wird an der Luft getrocknet, fixiert
und gefärbt.
Färbung mit Tintenstift
Auf dem Objektträger wird neben dem
fixierten Präparat so lange mit einem
Tintenstift in einem Wassertropfen gerührt,
bis eine violette Farblösung entstanden ist.
Diese wird über das Präparat verteilt und
soll 5-10 Minuten einwirken. Danach wird
mit Wasser gespült und getrocknet.
Dauerpräparat
Ist ein Ausstrich gut gefärbt, kann man ihn als
Dauerpräparat aufbewahren. Dazu wird auf
den trockenen Ausstrich ein Tropfen Canadabalsam oder Caedax gegeben und mit einem
sauberen Glas bedeckt. Lichtgeschützt lassen
sich Dauerpräparate jahrelang aufbewahren.
Anzüchten einer Reinkultur
Reinkulturen lassen sich mit verschiedenen
Methoden anzüchten. Zur Auftrennung eines
Bakteriengemisches (z. B. ein stark verkeimtes
Oberflächenwasser oder eine mit verschiedenen Keimen angereicherte Nährbouillon)
bedient man sich folgender Verfahren:
a) Verdünnungsreihe
Vor der Untersuchung von Proben mit
zu erwartendem hohen Keimgehalt ist
es notwendig, diese Proben nach einem
bestimmten Schema zu verdünnen.
Man geht dabei folgendermaßen vor:
Färben mit Farbstofflösungen
Zunächst werden Stammlösungen hergestellt.
Dazu werden die Farbstoffe (z. B. Methylenblau oder Fuchsin) in 96%igem Alkohol bis
zur Sättigung gelöst. In der Flasche sollte ein
ungelöster Rest als Bodensatz zurückbleiben.
Nach einer Filtration über ein Faltenfilter sind
Stammlösungen, lichtgeschützt aufbewahrt,
unbegrenzt haltbar.
Alkalische Methylenblau-Lösung
(nach Löffler)
100 ml destilliertes Wasser
30 ml
Stammlösung
1 ml
1%ige Kalilauge
(Nach Mischung filtrieren)
Karbol-Fuchsin-Lösung
(nach Ziehl-Neelsen)
100 ml einer 5%igen Phenol-Lösung
10 ml
Fuchsin-Stammlösung
(nach Mischung filtrieren)
Phenol-Lösung
5 g Phenol wird unter Schütteln in 100 ml
Wasser gelöst.
Vorsicht: Phenol und Fuchsin sind giftig,
deshalb Hautkontakt vermeiden. Beide
Farbstofflösungen sind auch gebrauchsfertig im Handel zu beziehen.
6
Färben
Der getrocknete und fixierte Ausstrich wird
auf eine Färbewanne oder ein ähnliches
Gefäß gelegt. Die Farbstofflösung wird aufgetropft bis das Präparat bedeckt ist. Nach ca. 5
Minuten Färbedauer wird mit Leitungswasser
so lange gespült, bis keine Farbstoffwolken
mehr entstehen. Danach trocknen lassen. Mit
Karbol-Fuchsin-Lösung ca. 1 Minute färben.
In unserem Beispiel soll eine Verdünnung in
10er Schritten beschrieben werden.
Handelsübliche Reagenzröhrchen mit ca.
15 ml Volumen werden mit 9 ml Wasser oder
physiologischer Kochsalzlösung beschickt,
mit einem Stopfen verschlossen und in einem
Reagenzglasständer im Autoklaven bei 121°C
oder im Dampftopf sterilisiert (30 Minuten).
Nach Beendigung der Sterilisationszeit wird
nach Abkühlen das erste Röhrchen mit 1 ml
der zu untersuchenden Probe beimpft. Der
erste Verdünnungsschritt 1:10 ist hiermit
erreicht.
Schema einer Verdünnungsreihe
Nach kräftigem Durchschütteln wird aus
dieser ersten Verdünnung 1 ml entnommen
und auf das nächste Röhrchen übertragen.
In dem 2. Röhrchen liegt nun die Verdünnung
1:100 vor.
Weitere Verdünnungsschritte werden in der
gleichen Weise vorgenommen. Zum Zwecke
der mikrobiologischen Untersuchung wird
aus den einzelnen Verdünnungsstufen
jeweils 1 ml entnommen und in der bereits
beschriebenen Weise membranfiltriert oder
nach anderen Verfahren untersucht.
Wenn nach der üblichen Bebrütungszeit
von 48 Stunden ausgewertet wird, so findet
man meist in 2 oder 3 Kulturen einer Verdünnungsreihe Koloniezahlen, die in einem
Bereich liegen, der das Auszählen ermöglicht.
Dabei liegen die »auszählbaren« Koloniezahlen im Bereich zwischen 30 und 200 Kolonien
pro Petrischale oder Membranfilter.
Bei Kulturen mit mehr als 200 Kolonien
erschwert zu dichter Bewuchs das Auszählen
der Kolonien, es kommt zu einem verminderten Nährstoffangebot und die anfallenden
Stoffwechselprodukte verhindem oft völlig
den Nachweis langsam wachsender Keime.
Unterhalb 30 Kolonien wird aufgrund
der biologischen Schwankungsbreite die
statistische Aussage zu unsicher.
Die bei der Auswertung ermittelte Koloniezahl wird mit dem entsprechenden Verdünnungsfaktor multipliziert. Daraus ergibt
sich die Koloniezahl der unverdünnten Probe.
Zu Anfang dieses Abschnittes wurde die
Sterilisation von Wasser in verschlossenen
Reagenzröhrchen kurz erläutert.
Steht kein Autoklav oder Dampftopf zur
Verfügung, werden die leeren Reagenzröhrchen im Trockenschrank bei 180°C in
1 Stunde trocken sterilisiert.
Steriles Wasser wird durch eine Sterilfiltration
durch ein Membranfilter mit 0,2 μm Porengröße gewonnen.
Dazu wird das Membranfilter 11307-025 in
den Filtrationsvorsatz aus Kunststoff eingelegt und dieser in kochendem Wasser oder
Dampftopf sterilisiert. Nach der Sterilisation
wird der Filtrationsvorsatz auf eine Spritze
gesetzt und das in der Spritze befindliche
Wasser wird durch Herunterdrücken des
Kolbens sterilfiltriert.
7
b) Verdünnungsausstrich
Mit einer sterilen Impföse wird Material aus
der Bakteriensuspension entnommen. Mit der
Öse wird in engen Schlangenlinien über die
Oberfläche einer Agar-Platte oder über ein
auf der getränkten Kartonscheibe liegendes
Membranfilter gestrichen. Im letzten
Abschnitt kommt es zur Vereinzelung der
Bakterien und nach der Inkubation zu
einzeln wachsenden Kolonien.
Eine noch bessere Auftrennung erhält man,
wenn man den Ausstrich wie bei Abb. 3
ausführt.
Beide beschriebenen Verfahren führen
zum Anzüchten von Einzelkolonien, die
anschließend zur Erhaltung und Konservierung auf Schrägagarröhrchen überimpft
werden können.
Schrägagar-Röhrchen
Reagenzröhrchen mit Watte |Staniol-Verschluss oder Röhrchen mit Schraubverschluss
(z.B. geleerte Sartorius Stedim Biotech Nährbouillon-Röhrchen) werden zur Hälfte mit
entsprechendem Agar-Medium (z.B. WürzeAgar) gefüllt, verschlossen und sterilisiert.
Während der Erstarrung des Agars werden
die Röhrchen in Schräglage gelegt. Dadurch
wird die Agaroberfläche in der gewünschten
Weise um das zwei- bis dreifache vergrößert.
Die schräge Agaroberfläche vereinfacht
das Beimpfen und eine Entnahme von Zellmaterial, ohne dabei die Oberfläche zu
beschädigen.
Nach Beimpfen des Schrägagar-Röhrchens
wird dieses 48 h bebrütet. Das gut verschlossene Röhrchen wird im Kühlschrank
aufbewahrt. Durch die niedrige Temperatur
kommt das Wachstum zum Stillstand,
Nährstoffe werden kaum verbraucht, Stoffwechselprodukte fallen in Minimalmengen
an. Austrocknen des Nährbodens ist aufgrund
der großen Schichtdicke nicht möglich.
Trotzdem werden Schrägagar-Kulturen
etwa nach 2-3 Monaten erneut auf einen in
der gleichen Weise bereiteten Schrägagar
überimpft, um die Reinkultur schonend über
lange Zeit aufbewahren zu können.
8
1. Schema eines Verdünnungs-Ausstrichs
3. Schema eines fraktionierten Ausstrichs
2. Ausstrich nach Bebrütung
4. Fraktionierter Ausstrich nach Bebrütung
Mikrobiologisches Praktikum
Kulturen von Mikroorganismen auf Membranfiltern, in oder auf anderen Medien,
müssen mit großer Sorgfalt behandelt
werden. Der Untersucher muss sich so
verhalten, als handele es sich in jedem Fall
um Krankheitserreger.
Allgemeine methodische Arbeitshinweise
Um den Erfolg der Experimente nicht zu
gefährden ist es notwendig, immer unter
aseptischen Bedingungen zu arbeiten, d. h.,
dass alle unerwünschten Mikroorganismen
ferngehalten werden müssen.
Zur Filtration einer Probe durch ein
Membranfilter wird Unterdruck benötigt.
Dazu kann einer der beiden seitlichen
Anschlüsse über die mitgelieferte Schlaucholive mit einer Unterdruckquelle, z. B. einer
Wasserstrahlpumpe verbunden werden.
Der Umgang mit Mikroorganismen ist
gefahrlos, wenn bestimmte Verhaltensmaßregeln beachtet werden:
Es sollte deshalb in einem vor Luftzug
geschützten Raum neben einer Bunsenbrennerflamme gearbeitet werden. Etwa
30 Minuten vor Arbeitsbeginn ist der Arbeitsplatz mit einer desinfizierenden Lösung
zu besprühen oder abzuwaschen. Es ist notwendig, dass die Gerätschaften wie Pinzette,
Filtrationsgerät, Probenahmegefäß u.s.w.
steril sind.
Damit die Durchführung der Experimente
nicht an einen Ort gebunden ist, in dem
festmontierte Unterdruckquellen installiert
sind, enthält der Sartorius Stedim Biotech
Schulkit eine 50 ml Spritze und ein Dreiwegeventil zur Erzeugung von Unterdruck. Mit dieser Geräteausrüstung können die Experimente
auch direkt in der freien Natur – an einem
Fluss oder See – durchgeführt werden.
Filtrationsgerät 16510
Das Filtrationsgerät aus Kunststoff 16510
bildet die Grundlage für die Durchführung
der Versuche. Vor der Durchführung des
Experiments wird das Oberteil des Gerätes
einschließlich der Filterunterstützung durch
Eintauchen in kochendes Wasser sterilisiert.
Eine Sterilisation des Auffanggefäßes
(Unterteil) ist nicht notwendig, da bei den
Experimenten das Filtrat verworfen wird.
Mit einer abgeflammten Tiegelzange werden
die Teile des Filtrationsgerätes aus dem
siedenden Wasser entnommen und nach
kurzem Abtropfen zusammengeschraubt.
Das Einlegen des sterilen Membranfilters
ins Filtrationsgerät geschieht wie folgt:
Um einen solchen Versuch durchzuführen,
wird das Dreiwegeventil mit der Spritze
zusammengebaut. In das freie Ende des Silikonschlauchs wird der Kunststoffadapter
17108 eingesteckt. Der Adapter wird dann in
die seitliche Öffnung des Gerätes eingeführt.
Nachdem die gegenüberliegende seitliche
Öffnung und die drei Öffnungen im Auffanggefäß (Unterteil) verstopft sind, kann durch
Betätigen des Kolbens der Spritze Unterdruck
erzeugt werden.
– Gründliches Händewaschen vor und nach
der Arbeit.
– Die Arbeitsplätze sind vor Beginn der
Arbeiten mit einem geeigneten Desinfektionsmittel (z.B. 70%igem Alkohol)
abzureiben (Oberflächendesinfektion).
– Am Arbeitsplatz soll nicht gegessen und
getrunken werden.
– Bakterienkulturen dürfen nicht offen
stehen.
– Bakterienmaterial darf nicht mit den
Händen berührt werden.
– Bakteriensuspensionen nie mit dem Mund
pipettieren, immer Pipettierhilfen benutzen.
(z. B. Peleus-Ball).
– Impfösen und Impfnadeln müssen vor
und nach dem Gebrauch durch Ausglühen
sterilisiert werden.
– Arbeitsgeräte, die mit Bakterien in
Berührung gekommen sind, müssen
sterilisiert werden.
– Glas- und Porzellangeräte können bei 180°C
1 Stunde im Trockenschrank oder durch
Auskochen sterilisiert werden. Metallgeräte
werden, wie die Glasgeräte, hitze sterilisiert
oder abgeflammt.
Nach Aufreißen der Einzelverpackung wird
das sterile Membranfilter mit einer abgeflammten Pinzette entnommen und auf die
Filterunterstützung des Filtrationsgerätes
aufgelegt (siehe »Allgemeine Arbeitshinweise
in Bildern« auf Seite 19/20). Danach wird das
Oberteil des Gerätes aufgeschraubt.
Bei Versuchen in der freien Natur können
äußere Bedingungen vorliegen, die ein mikrobiologisches Arbeiten erschweren Zum Schutz
vor einer Kontamination (Staub, Luftkeime)
wird deshalb der Trichter abgenommen und
dafür die Kappe aufgeschraubt. Auf einen der
Anschlüsse im Oberteil wird ein Filtrationsvorsatz aus Kunststoff, 13 mm d, mit einem
Glasfaserfilter bestückt, aufgesetzt. Jetzt
kann die Luft frei von Schmutzstoffen ins
Oberteil des Gerätes gelangen.
– Petrischalen- und Reagenzglaskulturen sind
2 Std. mit einer 10%igen Formalinlösung zu
überschichten, bevor die Gefäße gereinigt
werden können. Kulturen in Plastikgefäßen
können, sofern die Möglichkeit gegeben ist,
verbrannt werden, andernfalls sind sie vor
dem Verwerfen mit Formalinlösung zu
desinfizieren.
Filtrationsgerät 16510
9
Grundausrüstung für Schulversuche
Sämtliche Teile des Schulkit sind auch
einzeln lieferbar, mit Ausnahme der Kunststoffspritze (50 ml) 16647, die außerhalb
dieser Ausrüstung unter der Best.-Nr. 16647 E
in Packungen zu 12 Stuck lieferbar ist.
Die in der Grundausrüstung in der Normpackung 14095-047 N enthaltenden Nährkartonscheiben, Typ Endo, Standard und
Würze sind auch getrennt (in Packungen zu
100 Stck.) unter folgenden Bestellnummern
lieferbar:
1
9
10
14055-047 N
Standard-Nährkartonscheiben, für
Koloniezahl, in Petrischalen, mit einzeln
verpackten Filtern, steril (100 St.)
11
12
2
140 53-047 N
Endo Nährkartonscheiben, für E. coli und
Coliforme, in Petrischalen, mit einzeln
verpackten Filtern, steril (100 St.)
14058-047 N
Würze Nährkartonscheiben, für Hefen und
Schimmelpilze, in Petrischalen, mit einzeln
verpackten Filtern, steril (100 St.)
4
5
6
Nährkartonscheiben für andere mikrobiologische Zielsetzungen finden in unserer
Broschüre SM-4017d
3
Die Bebrütung der Kulturen unter definierten
Bedingungen wird in Brutschränken durchgeführt.
24002 Schulkit für mikrobiologische Experimente, im Alu-Koffer
Komplett im Alu- Koffer verpackt:
1
1+ 16510
2
3
4
5
6
7
8
9
10
1+ 16639
1+ 17108 D
1+ 16647
1+ 16625
1+ 16646 E
1+ 16517 E
1+ 117109
1+ 14132K
1+ 14095047 N
11
12
1+ 11307025 N
1+ 13400013 S
Filtrationsgerät aus Polycarbonat, für Unterdruck oder Oberdruck,
47 mm, 250 ml
Dreiwegeventil
Kunststoff-Adapter (10 St.) für Verbindung 16639 und 16510
Einwegspritze aus Kunststoff, 50 ml, steril
Edelstahlpinzette
Einwegspritzen aus Kunststoff, 20 ml, steril (12 St.)
Filtrationsvorsätze aus Kunststoff, 25 mm (12 St.)
Impföse mit Halter
Nährbouillon in Röhrchen steril (50 + 20 ml)
Endo-, Würze-, Standard-Nährkartonscheiben
für Schulkit in Petrischalen, mit Filter, steril
Zelluslose-Nitrat-Membranfilter, weiß; 25 mm, 0,2 μm (100 St.)
Glasfaserfilter, weiß, 13 mm (200 St.)
Wir empfehlen:
18113 Brutschrank 220 V/50 Hz
Folgende Ausrüstung ist hervorragend
für die Verarbeitung von sterilem Wasser,
insbesondere für die Befeuchtung von
Nährkartonscheiben, geeignet:
16685-2
Dosierspritze mit einstellbarem Volumen von
0,5 bis 5,0 ml in Schritten von 0,5 ml
16214
Filtrationsvorsatz aus Edelstahl, 25 mm.
1324
Edelstahlnadel für Luer-Konus
11107-25
Cellulose-Acetat-Membranfilter, weiß,
0,25 mm, 0,2 μm (100 St.)
Der Filtrationsvorsatz mit eingelegtem
Filter kann entweder durch
Autoklavieren (121°C, 20’) oder mit
Trockenhitze (180°C, 1 h) sterilisiert werden.
10
Versuch 1
1. Nachweis von Mikroorganismen
im Wasser
1.1 Einleitung
In industrialisierten Ländern ist das Wasser
durch kommunale oder industrielle Abwässer
besonders gefährdet. Insbesondere bei
Oberflächenwasser (Flüsse, Teiche und Seen)
besteht die Gefahr einer Verschmutzung.
Die natürlichen Grundwasservorräte reichen
oft in dicht besiedelten Gebieten für die
Trinkwasserversorgung nicht aus, so dass
zur Ergänzung des Trinkwasserbedarfs
aufbereitetes Oberflächenwasser verwendet
werden muss. Durch verunreinigtes Trinkwasser können jedoch gefährliche Darmerkrankungen verursacht werden, die in
leichteren Fällen zu einem Krankheitsbild
führen, das allgemein unter dem Begriff
»Durchfall« zusammengefasst wird. Um den
Verbraucher vor Erkrankungen zu schützen,
sind vom Gesetzgeber regelmäßige mikrobiologische Kontrollen vorgeschrieben.
Die Aufsichtsbehörden führen solche Untersuchungen durch und überwachen außerdem
interne Untersuchungen von Wasserwerken
und Betrieben mit eigenen Brunnenanlagen.
Die mikrobiologische Untersuchung des
Trinkwassers umfasst
a) die Bestimmung der Koloniezahl und
b) den Nachweis von Escherichia coli und
coliformen Bakterien.
Zu a)
Als Koloniezahl wird die Zahl der auszählbaren Kolonien bezeichnet, die sich aus den
in 1 ml Untersuchungswasser befindlichen
Bakterien auf nährstoffreichen, peptonhaltigen Nährmedien bei bestimmter
Bebrütungstemperatur innerhalb von 48 h
entwickeln.
(Genaue Definition siehe einschlägige Verordnungen wie »Deutsche Einheitsverfahren zur
Wasseruntersuchung« oder »EG Richtlinie der
Trinkwasserqualität«)
Da Mikroorganismen oft in Keimverbänden
vorkommen oder an Partikel in großer Zahl
angelagert sind, muss die Zahl der Kolonien
nicht mit der Zahl der vermehrungsfähigen
Keime übereinstimmen. Deshalb wurde der
Definition Koloniezahl gegenüber Keimzahl
der Vorzug gegeben.
Zu b)
Der Nachweis von Escherichia coli und
coliformen Bakterien im Trinkwasser ist als
eine Untersuchung auf Nichtvorhandensein
dieser Keime anzusehen. Deshalb werden für
diesen Nachweis 100 ml Wasser zur Untersuchung über ein Membranfilter filtriert.
Escherichia coli und die übrigen coliformen
Bakterien gehören zur Familie der Enterobacteriaceae. Da einige humanpathogene
Gattungen, z. B. der Typhuserreger Salmonella
typhosa ebenfalls aus der Familie der
Enterobacteriaceen, mit praktisch gleichen
Nährstoffansprüchen ausgestattet und
gleichem Hauptvermehrungsort unter
ähnlichen Bedingungen vorkommt, gilt der
Nachweis der Indikatorkeime im Trinkwasser
als gefährliche Verunreinigung.
Aufbereitetes Leitungswasser aus dem
Leitungswassernetz ist von vorzüglicher
Qualität. Deshalb sollten Sie für den Versuch
möglichst Oberflächenwasser (Fluss oder See)
verwenden. Der Nachweis von E. coli und
coliformen Keimen auf Endo-NKS ist bereits
unter »Endo-Nährkartonscheiben« beschrieben. Die typische Koloniebildung ermöglicht
einem geübten Untersucher bereits vorab die
makroskopische Beurteilung der angewachsenen Kolonien. Neben der Eigenschaft, die
Enterobakterien in einer typischen Koloniebildung zum Nachweis zu bringen, wirkt
das Medium gleichzeitig als Selektivmedium,
indem es das Wachstum grampositiver
Bakterien hemmt.
1.2 Benötigte Geräte, Membranfilter
und Nährkartonscheiben
Filtratonsgerät 16510
Filtrationsvorsatz 16517
mit Membranfilter 11307-025
Petrischale mit Nährkartonscheibe »Standard«
Petrischale mit Nährkartonscheibe »Endo«
1.3 Probe
Zur Entnahme der Wasserprobe aus einem
Fluss oder Teich verwenden Sie einen
sauberen, möglichst sterilen Behälter (Glasflasche mit Schraubverschluss). Nehmen Sie
die Probe wenn möglich 20 cm unterhalb
der Oberfläche.
1.4 Methodische Durchführung
In das vorbereitete Filtrationsgerät werden
10 bis 20 ml Wasser mit Hilfe der Spritze
durch den Filtrationsvorsatz als Vorlage
in den Trichter des Filtrationsgerätes
sterilfiltriert.
Zur Untersuchung auf coliforme Keime
werden je nach Verschmutzungsgrad 0,1 ml
bis 1,0 ml der Wasserprobe gleichmäßig mit
der Pinzette in der Vorlage verteilt. Mit der
Spritze und dem Dreiwege-Ventil wird die
Luft aus dem Unterteil des Filtrationsgerätes
abgesaugt. Die Probe wird filtriert.
Mit abgeflammter Pinzette wird das
Membranfilter dem Gerät entnommen und
unter vorsichtigem Anheben des Deckels auf
die befeuchtete Nährkartonscheibe gelegt.
(Endo-Nährkartonscheibe)
Zur Bestimmung der Koloniezahl wird das
Filtrationsgerät wieder in der gleichen Weise
vorbereitet und steriles Wasser im Trichter des
Gerätes vorgelegt.
Aus einer zuvor hergestellten Verdünnungsreihe (siehe Verdünnungsreihe!) wird mit
einer Pipette 1 ml aus einer der Verdünnungsstufen entnommen und in der Vorlage
verteilt. Sollen Kulturen mit steigenden
Koloniezahlen angesetzt werden, so beginnt
die Untersuchung immer mit der am stärksten
verdünnten Probe. Die Filtration der Verdünnung, die Entnahme des Filters aus dem
Filtrationsgerät, das Auflegen auf eine vorbereitete Nährkartonscheibe erfolgt in der
gleichen Weise wie bei der Untersuchung auf
coliforme Keime.
Allerdings wird das Filter zur Koloniezahlbestimmung auf eine vorbereitete »Standard
Nährkartonscheibe« aufgelegt.
Die Kulturen, die Endo-Nährkartonscheiben
und auch die Standard-Nährkartonscheiben,
können bei Raumtemperatur 48 Stunden
bebrütet werden. Wenn möglich, werden die
Endo-Kulturen in einem Brutschrank bei 37°C
über 24 h bebrütet. Während der Bebrütung
werden die Petrischalen nicht umgedreht.
11
1.5 Auswertung
Nach der Bebrütung werden die Kulturen
ausgewertet. Dazu werden die auf den
Membranfiltern gewachsenen Kolonien,
ggf. mit einer Lupe ausgezählt.
Standard: Die auf diesem Nährboden
wachsenden Bakterien sind ziegelrot
gefärbt. Dadurch bilden sie auf dem hellen
Untergrund einen deutlichen Kontrast. (Der
Zusatz TTC, Triphenyltetrazoliumchlorid,
wird zu Formazan, einem roten Vitalfarbstoff
reduziert).
Endo: Auf diesem Selektivmedium wachsen
ausschließlich Escherichia coli und coliforme
Bakterien, wobei die Kolonien mit grünem
metallischen Glanz von E. coli und die
leuchtend roten Kolonien von coliformen
Bakterien gebildet werden.
12
Zur weiteren Differenzierung oder zum
Anstellen einer Reinzucht können einzeln
gewachsene Kolonien mit einer Impföse vom
Membranfilter abgeimpft und in ein Nährbouillon-Röhrchen übertragen werden. Die
beimpfte Bouillon kann bei Raumtemperatur
bebrütet werden. Die Reinzucht wird für
einen der nächsten Versuche benötigt.
Zur Dokumentation werden die Filter von
den immer noch feuchten Nährkartonscheiben abgenommen und bei 70°C im
Trockenschrank getrocknet. Dabei werden
die vegetativen Zellen abgetötet. Die
getrockneten Membranfilter können dann
mit einem lösungsmittelfreien Kleber in
Untersuchungsprotokolle eingeklebt und
mit einer Klarsichtfolie vor Beschädigung
geschützt werden.
Versuch 2
2. Nachweis von Mikroorganismen
in der Luft
2.1 Einleitung
Luft besitzt keine eigene mikrobiologische
Flora, da sie ungünstige Lebensbedingungen
bietet. Fast immer fehlen geeignete Nährstoffe und der benötigte Wassergehalt.
Darüberhinaus sind Luftkeime in der freien
Atmoshäre der UV-Strahlung ausgesetzt, die
besonders die vegetativen Lebensformen
vieler Mikroorganismen schädigt. Dennoch
bleiben gewisse Bakterien, Hefen und
Schimmelpilze über längere Zeiträume in der
Luft lebensfähig. Die sporen- und farbstoffbildenden Organismen sind besonders
geschützt. Die sporenbildenden Dauerformen
durch ihre resistente Schutzhülle, die sie
gegen alle möglichen Widrigkeiten der
Umwelt schützt, die farbstoffbildenden
aufgrund der Farbstoffeinlagerung gegen
die ultra-violette Strahlung. Die meisten
Mikroorganismen sind an Partikel angelagert.
Sie sind Teile ausgetrockneter Substrate,
in denen sie gewachsen sind. Die an einem
bestimmten Ort vorkommenden Arten stammen überwiegend von den in unmittelbarer
Nachbarschaft vorhandenen Quellen ab. So
wird beispielsweise an einem windigen Tag
die Luft über einem Acker die gleichen Arten
von Mikroorganismen enthalten, die im
Erdreich anzutreffen sind. Wo viele Menschen
beisammen sind, z. B. Kinos, Schulen,
Betriebskantinen, werden Mikroorganismen
oft durch Husten und Niesen übertragen.
In Räumen, in denen sich Menschen
aufhalten, finden wir in der Luft Bakterien
aus dem Erdreich (Staub) und eine Reihe
anderer Bakterien und Pilze, die von den
Menschen selbst stammen. Durch das Öffnen
von Fenstern und Türen und durch Luftbewegungen werden Mikroorganismen
immer wieder hochgewirbelt.
Mit dem folgenden Versuch können Sie selbst
die Eignung ihres Arbeitsplatzes für mikrobiologisches Arbeiten feststellen, indem Sie
unter geänderten Bedingungen den Gehalt an
Luftkeimen an Ihrem Arbeitsplatz überprüfen.
2.2 Benötigte Geräte, Membranfilter
und Nährkartonscheiben
Bereiten Sie 8 Petrischalen mit je 4 Standardund 4 Würze-Nährkartonscheiben vor, indem
Sie das Filter gleich auf die befeuchtete Nährkartonscheibe in die Petrischale legen.
2.3 Probe
Die Luftkeimbestimmung nach dem
Sedimentationsprinzip wird gewöhnlich
mit Agar-Nährböden durchgeführt. Soll die
Bestimmung von Keimen in der Luft mit
Nährkartonscheiben durchgeführt werden,
muss auf den befeuchteten Nährboden
immer das Membranfilter aufgelegt werden.
Nur so ist es möglich, von den sedimentierten
Luftkeimen einzeln wachsende Kolonien
anzuzüchten.
2.4 Methodische Durchführung
Beschriften Sie die Petrischalen mit Namen,
Ort der Aufstellung und Prüfzeit. Stellen Sie
gleichzeitig je eine Petrischale mit Standardund Würze-Nährkartonscheiben auf.
2.4.1 Überprüfen Sie Ihren Arbeitsplatz,
indem Sie je eine Petrischale mit Standardund Würze-Nährkartonscheiben öffnen und
in die Nähe stellen, während Sie andere
Arbeiten durchführen. Durch Luftbewegungen z.B. bei Betreten des Raumes durch
Personen, werden Mikroorganismen hochgewirbelt. (Ungünstige Bedingungen am
Arbeitsplatz).
2.5 Auswertung
Zur Auswertung der angewachsenen Kulturen
und zum besseren Erkennen der Einzelheiten,
sollten Sie eine Lupe benutzen. Auf dem
Standard Medium werden Sie bevorzugt
Bakterien nachweisen können, die aufgrund
des TTC-Zusatzes mehr oder weniger rot
gefärbt sind. Hefen- und Schimmelpilzkolonien werden nur sehr langsam wachsen.
Auf dem Würze-Medium wachsen bevorzugt
Hefen und Schimmelpilze. Hefen wachsen
meist als gewölbte weiße oder farbige
Kolonien. Bei Luftkeimuntersuchungen
überwiegen die farbigen Kolonien.
Schimmelpilze bilden meist samt- oder
wattebauschartige Kolonien, die in der
frühen Wachstumsphase weiß sind und
später, je nach Art, unterschiedlich gefärbt
sein können. Vereinzelt wachsen auf dem
Würze-Medium auch Bakterien an; doch
auch hier werden farbige Kolonien überwiegen (Farbstoffbildende Mikroorganismen
sind resistenter gegenüber UV-Strahlung).
2.4.2. Verbessern Sie jetzt die Bedingungen
an Ihrem Arbeitsplatz, indem Sie mit einem
geeigneten Desinfektionsmittel (z.B. Äthanol
70%ig) Ihren Arbeitsplatz besprühen oder
abwaschen.
Stellen Sie nach angemessener Einwirkungszeit an gleicher Stelle wieder zwei geöffnete
Petrischalen auf. Veranlassen Sie, dass Fenster
und Türen geschlossen bleiben und niemand
während der Prüfzeit den Raum betritt.
2.4.3 Stellen Sie die nächsten beiden Petrischalen in der Nähe einer stark befahrenen
Straße (z. B. Fensterbank) auf.
2.4.4. Die verbleibenden Petrischalen stellen
Sie an einem nach Ihrer Meinung besonders
geschützten Platz auf. (z. B. unter einer
Käseglocke).
Wählen Sie für diese Versuchsreihe gleiche
Prüfzeiten (zwischen 15 und 60 Minuten).
2.4.5. Danach werden die Petrischalen
sorgfältig verschlossen und anschließend bei
Raumtemperatur an lichtgeschützter Stelle
oder im Brutschrank 48 h bebrütet. Da Luftkeime mehr oder weniger stark geschädigt
sind, wachsen sie oft erst nach mehreren
Tagen zu sichtbaren Kolonien heran. Deshalb
sollten Sie die endgültige Auswertung erst
nach 3 oder 5 Tagen vornehmen.
13
Versuch 3
3. Nachweis von Mikroorganismen
im Erdreich
3.1. Einleitung
Der Boden ist der wichtigste, natürliche
Lebensraum für Mikroorganismen. ihre
Anzahl hängt sehr stark von der Bodenbeschaffenheit ab. Ein Gramm feuchter
schwerer Ackerboden kann enthalten:
Bakterien
Aktinomyceten
Pilze
Algen
Protozoen
ca. 2 500 000 000
ca. 700 000 000
ca. 400 000 000
ca.
50 000
ca.
30 000
Darüber hinaus enthält guter Ackerboden
etwa 400 m Pilzmycel. Der Keimgehalt
schwankt stark, da er von vielen Faktoren
abhängig ist. Die gröBte Anzahl von Mikroorganismen befindet sich in der Nähe der
Oberfläche, weil dort, wegen des größeren
Nährstoffangebotes, die bessere Vermehrung
stattfindet. In tieferen Bodenschichten nimmt
die Zahl der Mikroorganismen stark ab.
3.2. Benötigte Geräte, Membranfilter
und Nährkartonscheiben
Filtrationsgerät 16510
Filtrationsvorsatz 16517
mit Membranfilter 11307-025
Bereiten Sie sich 5 sorgfältig gesäuberte
Reagenzröhrchen vor, indem Sie diese
5-10 Minuten durch Auskochen entkeimen.
Entnehmen Sie die Röhrchen mit einer
abgeflammten Pinzette dem kochend
heißen Wasser und stellen Sie diese nach
Verschließen mit einem Wattestopfen oder
einer Alu-Kappe in einen Reagenzglasständer.
(Wattestopfen oder Alu-Kappen zuvor,
wenn möglich, 30’ bei 180°C sterilisieren.)
3.3 Probe
Nehmen Sie mit einem Probenlöffel nach
Entfernung der oberen Schicht eine kleine
Menge Erde in ein verschließbares Fläschchen
oder in einen mit Alu-Folie verschlossenen
Erlenmeyer-Kolben.
14
3.4 Methodische Durchführung
Zur Durchführung dieses Versuches sollten
Sie, wegen der zu erwartenden hohen
Keimzahl, vor Beginn der Filtration eine
Verdünnungsreihe herstellen.
Benutzen Sie dazu die durch Auskochen
sterilisierten Röhrchen.
3.4.1 Geben Sie in eine sterile, verschließbare
Flasche 1 g Erde und füllen mit sterilem
Wasser bis auf 100 ml auf.
Verschließen Sie die Flasche. Durch kräftiges
Schütteln lösen Sie die Erdprobe gut auf.
Aus dieser ersten Verdünnung (10 -2)
werden für weitere Verdünnungen sterile
Reagenzröhrchen benutzt.
Filtrieren Sie in das erste Reagenzröhrchen
9 ml steriles Wasser ein, stellen Sie das
Reagenzröhrchen in den Ständer und füllen
Sie die weiteren Röhrchen bis zur gleichen
Höhe ebenfalls mit sterilfiltriertem Wasser
auf.
Entnehmen Sie aus der Flasche (erste Verdünnung 10 -2) mit einer sterilen Pipette 1 ml
und füllen Sie diese Teilmenge in das erste
Reagenzröhrchen. Nach gutem Durchmischen
liegt dort eine Verdünnung von 10 -3 vor.
Nach Entnahme von 1 ml aus dem Reagenzröhrchen wird die jeweils nächste Verdünnung um eine Zehnerpotenz weiterverdünnt.
(10 -4, 10 -5 usw.)
3.4.2 Wenn Sie die Verdünnungen nicht
in genau abgemessenen Zehnerschritten
ansetzen, können Sie auch nach folgendem
vereinfachten Verdünnungsschema arbeiten:
Füllen Sie eine kleine Menge der Erdprobe in
ein wie unter 3.2. vorbereitetes Reagenzglas.
Filtrieren Sie ca. 10 ml steriles Wasser hinzu.
Lösen Sie die Probe durch kräftiges Schütteln
auf. Nach Absetzen der unlöslichen Bestandteile überimpfen Sie mit einer abgeflammten
Platinöse die Suspension ins erste Röhrchen.
Durch Schütteln verteilen Sie die Keime im
Röhrchen und überimpfen auf das nächste
Röhrchen. Dadurch erhalten Sie Verdünnungen in abnehmender Konzentration.
3.4.3 Legen Sie in das Filtrationsgerät 16510
ein steriles Membranfilter ein. Filtrieren Sie
mit Hilfe der Spritze und dem Filtrationsvorsatz ca. 10 ml steriles Wasser (Vorlage)
in den Trichter des Filtrationsgerätes.
Entnehmen Sie dann mit der Pipette aus
der stärksten Verdünnungsstufe (z. B. 10 -6)
1 ml der Verdünnung und verteilen Sie
diese Menge gleichmäßig in der Vorlage.
Mit der Spritze und dem Dreiwegeventil
erzeugen Sie den für die Filtration erforderlichen Unterdruck. Die Probe wird filtriert.
Danach entnehmen Sie mit einer abgeflammten Pinzette das Membranfilter aus
dem Gerät und legen es unter vorsichtigem
Anheben des Deckels auf die angefeuchtete
Standard-Nährkartonscheibe.
3.4.4 Sie arbeiten in der gleichen Weise, wenn
Sie aus der Verdünnung die Probe filtrieren,
die auf der Würze-Nährkartonscheibe
bebrütet wird.
Sollten Sie nach der vereinfachten Verdünnungsreihe arbeiten, können Sie vergleichbare Teilmengen entnehmen oder – bei
Bebrütung auf nur einem Nährmedium – die
gesamte Menge eines Röhrchens filtrieren.
Die bereits vor Beginn der Versuchsreihe
beschrifteten Petrischalen werden zur
Bebrütung über 48 h an lichtgeschützter
Stelle bei Raumtemperatur aufgestellt.
3.5 Auswertung
Nach der Bebrütung werden die Kulturen
ausgewertet, deren Koloniezahl innerhalb der
biologischen Schwankungsbreite jeweils um
eine Zehnerpotenz voneinander abweichen
kann. Zur Bestimmung der Koloniezahl
des Ausgangsmaterials werden nur solche
Kulturen berücksichtigt, deren Koloniezahl
zwischen 30 und 200 Kolonien liegt.
(Erläuterungen siehe Verdünnungsreihe.)
Versuch 4
4. Wirkung von Antibiotika
4.1 Einleitung
Auf sehr dicht bewachsenen Membranfiltern
können oft sehr deutlich die antagonistischen
Beziehungen zwischen den Mikroorganismen
erkannt werden. Die dabei von einigen Pilzen
und Bakterien (Aspergillus, Penicillium, Actinomycetales) ausgeschiedenen Antibiotika
(Stoffwechselprodukte) sind Substanzen,
die schon in geringen Konzentrationen das
Wachstum von Mikroorganismen hemmen.
Man unterscheidet zwischen hemmend
wirkenden (Bacteriostatica, Fungistatica) und
abtötenden Stoffen (Bactericide, Fungicide).
Die ersten Antibiotika sind zufällig an der
Bildung von Hemmhöfen entdeckt worden.
Auf einer Agarplatte, die mit einem Testkeim
dicht beimpft war, blieb um den zufällig
auf die Platte gelangten Schimmelpilz das
Wachstum des dichten Bakterienrasens
aus. Das aus der Schimmelpilzkolonie in
den Agar diffundierte Stoffwechselprodukt
(Antibiotika) verursacht die Bildung des
Hemmhofes im geschlossenen Bakterienrasen.
4.2 Benötigte Geräte, Membranfilter
und Nährkartonscheiben
Filtrationsgerät 16510
Filtrationsvorsatz 16517
mit Membranfilter 11307-025
1 Reagenzröhrchen, ausgekocht,
mit Stopfen verschlossen
Petrischale mit Standard-Nährkartonscheibe
4.3 Methodische Durchführung
Filtrieren Sie mit Hilfe der Spritze und
Filtrationsvorsatzes 5-10 ml steriles Wasser
in das Reagenzröhrchen. Verschließen Sie
es mit dem Stopfen.
Impfen Sie von einem mit Kolonien bewachsenen Membranfilter mit der Impföse etwas
Bakterienmasse ab und überführen sie in das
Reagenzglas. Reiben Sie – zur besseren Aufschwemmung der Bakterien – die Impfnadel
vorsichtig an der Wandung. Durch Schütteln
des Reagenzröhrchens werden die Bakterien
gleichmäßig verteilt.
4.3.1 In das Filtrationsgerät 16510 legen Sie
ein steriles Membranfilter ein. Filtrieren Sie
ca. 10 ml steriles Wasser in den Trichter des
Filtrationsgerätes.
Enffernen Sie dann den Stopfen vom
Reagenzröhrchen und flammen Sie die
Öffnung des Röhrchens ab. Gießen Sie den
Inhalt in die sterile Vorlage im Trichter.
4.4 Auswertung
Nach der Bebrütung wird die Kultur ausgewertet. Dabei ist ein mehr oder weniger weiter
Hemmhof im sonst dichten Bakterienrasen zu
sehen. Das Ausmaß der Wachstumshemmung
liegt im spezifischen Wirkungsspektrum des in
diesem Fall aktiven Antibiotikums begründet.
Die Antibiotika unterscheiden sich bezüglich
ihrer Wirkung auf grampositive und gramnegative Bakterien und andere Mikroorganismen. Zur Dokumentation wird das
Membranfilter abgenommen und zwischen
Fließpapier 1 Std. bei 80°C im Trockenschrank
getrocknet. Dabei werden die vegetativen
Zellen abgetötet.
Nach der Trocknung kann das Membranfilter
mit einem lösungsmittelfreien Kleber in
ein Protokollbuch eingeklebt und mit einer
Klarsichtfolie vor Beschädigungen geschützt
werden.
Mit der Spritze und dem Dreiwegeventil
erzeugen Sie den für die Filtration erforderlichen Unterdruck. Die Probe wird filtriert.
Danach entnehmen Sie mit abgeflammter
Pinzette das Membranfilter aus dem Gerät
und legen es unter vorsichtigem Anheben
des Deckels auf die angefeuchtete StandardNährkartonscheibe.
4.3.2 Mit der abgeflammten Impfnadel
entnehmen Sie aus einer Schimmelpilzkolonie
aus Versuch 3 (möglichst mit sichtbarer
Hemmhofbildung) ein wenig Substanz und
tupfen diese an zwei auseinanderliegenden
Stellen auf das Membranfilter. Dabei werden
Sporen übertragen, die mit deutlicher Hemmhofbildung in dem dichten Bakterienrasen zu
Kolonien anwachsen.
Die beschriftete Petrischale wird an lichtgeschützter Stelle bei Raum temperatur
48 h bebrütet.
15
Versuch 5
5. Nachweis von Hefen in der Natur
5.1 Einleitung
Hefen sind einzellige Pilze, die sich durch
Sprossung vermehren. Viele Hefearten
können Zucker vergären. Sie sind in der Natur
weiter verbreitet als allgemein angenommen
wird. Man findet sie an allen Standorten,
an denen vergärbare, zuckerhaltige Säfte
zur Verfügung stehen: auf Früchten und
Blättern, im Nektarsaft der Blüten, im Boden
als Zersetzer abgestorbener Pflanzenteile.
Hefen wurden erstmals von Antonie van
Leeuwenhoek im Jahre 1680 entdeckt. Sie
zeigen eine große Vielfalt von Formen:
kugelförmig, elliptisch, spindel-, wurst- oder
zitronenförmig.
Viele Heferassen werden technologisch
genutzt. Die Herstellung von Wein, Bier und
Branntwein ist ohne Hefe nicht denkbar, bei
der Vergärung der zuckerhaltigen Substrate
wie Most, Würze oder Maische werden
Alkohol und Kohlendioxid gebildet. Diese
Eigenschaft der Hefe ist für die Bäckerei von
großer Bedeutung. Durch die Entwicklung
von CO2 werden im Teig Blasen gebildet, die
das Brot oder den Kuchen lockern.
5.2 Benötigte Geräte, Membranfilter
und Nährkartonscheiben
Filtrationsgerät 16510
Petrischale mit Nährkartonscheibe Typ Würze
zum Nachweis von Hefen und Schimmelpilzen.
Filtrationsvorsatz 16517 mit Membranfilter
11307-25 für steriles Wasser.
5.3 Probe
Bei den folgenden Versuchen sollen in der
Natur vorkommende Hefen von der Schale
einer Weintraube isoliert und auf WürzeNährkartonscheiben angezüchtet werden. Auf
Äpfeln, Birnen, Pfirsichen oder Weintrauben
sind neben anderen Mikroorganismen vor
allem Hefen anzutreffen. In vielen Weinbaugebieten werden auch heute noch die
auf den Trauben befindlichen Hefen für den
Gärungsprozess bei der Weinherstellung
genutzt.
16
5.4 Methodische Durchführung
Mit der Spritze werden 2-30 ml Wasser
durch den Filtrationsvorsatz in den Trichter
des Filtrationsgerätes filtriert. Mit einer
abgeflammten Pinzette wird eine Weintraube
in den Trichter gelegt. Nach Aufsetzen des
Deckels auf den Trichter wird die Weintraube
im Trichter durch Umschwenken stark
bewegt, um vorhandene Mikroorganismen
von der Oberfläche abzuwaschen. Dann wird
der Deckel abgeschraubt, die Weintraube
mit steriler Pinzette entnommen und die
Flüssigkeit durch Anlegen von Unterdruck
filtriert.
Das Membranfilter wird mit steriler Pinzette
dem Filtrationsgerät entnommen und unter
vorsichtigem Anheben des Deckels auf die
feuchte Würze-Nährkartonscheibe gelegt.
Die Petrischale wird zur Bebrütung bei
Raumtemperatur möglichst an einem vor
Tageslicht geschützten Platz gestellt.
5.5 Auswertung
Nach der Bebrütung wird die Kultur ausgewertet. Da wir ein Medium verwendet haben,
auf dem Hefen und Schimmelpilze besonders
gut wachsen und das Wachstum von Bakterien gehemmt wird, sind die Hefekolonien als
gewölbte, glatte, weiße oder farbige Kolonien
zu sehen, während die Bakterienkolonien oft
nur mit der Lupe erkannt werden können.
Versuch 6
6. Gasbildung durch alkoholische Gärung
6.1 Einleitung
Wie in der Einleitung des Versuches Nr. 5
»Nachweis von Hefen in der Natur« erläutert,
sind Hefen, insbesondere SaccharomycesHefen, in der Lage, zuckerhaltige Substrate
zu vergären. Hauptsächlich entsteht bei der
alkoholischen Gärung Äthylalkohol, der im
Substrat verbleibt, und Kohlendioxid (oft
Kohlensäure genannt), das zum größten
Teil in die Luft entweicht. So entsteht in
einer abgefüllten verschlossenen Flasche
(z.B. Apfelsaft) ein hoher Druck, wenn eine
alkoholische Gärung stattfindet. Diese
entsteht durch eine Infektion mit Hefen.
Im folgenden Versuch soll veranschaulicht
werden, welche Mengen Kohlendioxid-Gas
schon bei der Vergärung relativ kleiner
Mengen Apfelsaft oder ähnlicher Fruchtsäfte
entstehen.
Die in den Lebensmittelgeschäften
erhältlichen Säfte sind zur Erhöhung der
biologischen Haltbarkeit nach der Abfüllung
pasteurisiert worden. (Pasteurisation =
Kurzzeiterhitzung).
Durch diese Maßnahmen sind alle vegetativen
Zellen im geschlossenen Gefäß abgetötet
worden.
6.2 Benötigte Geräte, Membranfilter
und Nährkartonscheiben
Filtrationsgerät 16510
Petrischale mit Nährkartonscheibe Typ Würze
zum Nachweis von Hefe und Schimmelpilzen.
Filtrationsvorsatz 16517
mit Membranfilter 11307-025
6.3 Probe
Bei Durchführung des Gärversuches zur
Erzeugung von Kohlendioxid-Gas wird eine
einzeln wachsende Saccharomyces-HefeKolonie aus Versuch 5 auf einen keimfreien
Saft überimpft.
6.5 Auswertung
Während dieser Zeit hat sich der Ballon über
dem beimpften Röhrchen mit Gas angefüllt.
Es handelt sich hierbei um Kohlendioxid (CO2)
das die Hefe bei der Vergärung des Zuckers
erzeugt.
6.4 Methodische Durchführung
Legen Sie das sterile Membranfilter 13005
in das sterilisierte Filtrationsgerät ein.
Der Ballon auf dem zweiten Röhrchen bleibt
leer, da keine Gärung stafflindet.
Öffnen Sie die Saftflasche in der Nähe
des Bunsenbrenners und füllen Sie nach
Abflammen der Flaschenmündung
ca. 50 ml Saft in das Filtrationsgerät.
Durch Anlegen des Unterdrucks mit Hilfe der
Spritze und des Dreiwegeventils wird der Saft
filtriert.
Mit abgeflammter Pinzette wird das Filter
entnommen und unter vorsichtigem Anheben
des Deckels auf die Würze-Nährkartonscheibe
aufgelegt. Die Petrischale wird 48 h bei
Raumtemperatur bebrütet. Diese Kultur hat
nur eine Kontrollfunktion hinsichtlich der
Keimfreiheit des Saftes.
Sie können diesen Versuch mit abgepackter
Bäckerhefe wiederholen, da es sich bei der
Bäckerhefe ebenfalls um eine zuckervergärende Hefe (Saccharomyces-Hefe) handelt.
Sie können nachweisen, dass es sich bei dem
Gas tatsächlich um Kohlendioxid handelt,
indem Sie das Gas mit Hilfe eines gebogenen
Glasröhrchens in eine Baryt-Lösung (Ba [OH]2)
einströmen lassen.
Kohlendioxid reagiert mit Ba [OH]2 unter
Bildung des unlöslichen Niederschlags
(Bariumcarbonat [BaCo3]). Dadurch wird
die Lösung schwach milchig getrübt. Die
Überprüfung der Kulturen auf dem Medium
Würze ergibt in fast allen Fällen keinen
Befund.
6.4.1 Saugen Sie ca. 20 ml des Saftes in die
Spritze. Nach Aufsetzen des Filtrationsvorsatzes mit Filter 11307.025 (0,2 μm
Porengröße) sterilfiltrieren Sie in jedes der
beiden Reagenzröhrchen 10 ml des Saftes.
Mit der abgeflammten Impföse übertragen
Sie eine Hefekolonie einer Kultur aus
Versuch 5 in eines der beiden Röhrchen.
Durch Zusammenpressen oder Aufrollen
entfernen Sie die Luft aus beiden Ballons.
Ziehen Sie vorsichtig über jedes Röhrchen
einen Ballon und stellen Sie die Röhrchen
in einen Reagenzglasständer. Kennzeichnen
Sie das beimpfte Röhrchen.
1 Flasche handelsüblichen Saft, z.B. Apfelsaft
2 sterile Reagenzgläser, mit Stopfen
verschlossen
Bebrüten Sie bei Raumtemperatur und
überprüfen Sie die Gasentwicklung nach
24 und 48 Stunden.
2 kleine Gummiballons (Luftballons)
17
Versuch 7
7. Bakterienwachstum bei
unterschiedlichen Temperaturen
7.2 Benötigte Geräte, Membranfilter
und Nährkartonscheiben
7.1. Einleitung
Neben einer Reihe individueller Eigenschaften
wie dem physiologischen Leistungsvermögen
oder der Vorliebe für einen bestimmten
ph-Bereich, besitzen Mikroorganismen
auch die Eigenschaft, bei einer bestimmten
Umgebungstemperatur besonders lebhaftes
Wachstum zu zeigen. Die für jede Art typische
Temperatur ist deren optimale Wachstumstemperatur. Man unterscheidet drei
Hauptgruppen, zwischen denen fließende
Übergänge bestehen. Die psychrophilen
(kälteliebenden) Arten können sich schon bei
Temperaturen kurz über dem Gefrierpunkt
vermehren, die thermophilen (wärmeliebenden) haben ihre optimale Wachstumstemperatur bei über 45°C, während die in großer
Zahl vorkommenden mesophilen Arten ihre
optimale Wachstumstemperatur in mittleren
Temperaturbereichen um 25°C-40°C haben.
In natürlichen Substanzen wie Wasser oder
Erde lassen sich Vertreter aller drei Gruppen
nachweisen. Dabei sind jedoch die mesophilen
Mikroorganismen in der Überzahl, weil die
genannten Lebensbereiche vorwiegend
mittleren Temperaturen ausgesetzt sind und
unter diesen Bedingungen die mesophilen
Keime gewöhnlich schneller wachsen als die
thermophilen und psychophilen.
Filtrationsgerät 16510
Sollen Mikroorganismen in einem beliebigen
Milieu nachgewiesen werden, so wird immer
die Bebrütungstemperatur gewählt, die der
natürlichen Umgebungstemperatur der nachzuweisenden Keime entspricht. So wird beispielsweise zum Nachweis des Indikatorkeims
Escherichia coli im Rahmen einer Wasseruntersuchung eine Bebrütungstemperatur
von 37°C gewählt, weil Bakterien dieser Art
ihren Hauptvermehrungsort im Verdauungstrakt von Menschen und warmblütigen Tieren
haben und sich deshalb bei dieser Temperatur
am schnellsten vermehren können. Andere
Mikroorganismen, z.B. solche, die aus dem
Erdreich stammen, werden bei Bebrütungstemperaturen um 25°C angezüchtet.
Auch bei Temperaturen, die nicht ihrer
optimalen Wachtumstemperatur entsprechen,
können Mikroorganismen wachsen, jedoch
erheblich langsamer.
Der Einfluss der Temperatur auf das Wachstum von Bakterienkulturen kann durch
den folgenden Versuch leicht nachgewiesen
werden.
18
Filtrationsvorsatz 16517
Membranfilter 11307.025
Petrischalen mit StandardNährkartonscheiben
6 Reagenzröhrchen mit Stopfen verschlossen
7.3 Probe
Beimpfen Sie ein Nährbouillon-Röhrchen
mit ein wenig Bakterienmaterial aus einer
einzeln gewachsenen Kolonie von einem der
vorausgegangenen Versuche (z.B. Versuch 1).
Zur besseren Verteilung wird das Bakterienmaterial an der Wand verrieben und nach
Verschließen des Röhrchens durch Schütteln
gleichmäßig verteilt.
7.4 Methodische Durchführung
Bei Raumtemperatur wird das Röhrchen
24 Stunden bebrütet. Sie können beobachten,
dass die Nährbouillon nach der Bebrütung
völlig trüb geworden ist (starke Bakterienvermehrung). Bereiten Sie sich 6 sorgfältig
gereinigte Reagenzröhrchen vor, indem
Sie diese 5-10 Minuten durch Auskochen
entkeimen.
Entnehmen Sie die Röhrchen mit einer
abgeflammten Pinzette dem kochendheißen
Wasser und stellen sie nach Verschließen mit
einem Wattestopfen oder einer Alu-Kappe
in einen Reagenzglasständer. (Wattestopfen
oder Alu-Kappen zuvor, wenn möglich, 30’
bei 180°C sterilisieren.)
Filtrieren Sie in das erste Reagenzröhrchen
9 ml steriles Wasser ein, stellen das Reagenzröhrchen in den Ständer und füllen Sie die
weiteren Röhrchen ebenfalls bis zur gleichen
Höhe mit sterilfiltriertem Wasser auf.
Stellen Sie von der Reinkultur eine Verdünnungsreihe her. Gehen Sie dabei in der Weise
vor, wie unter Abschnitt Verdünnungsreihe
beschrieben.
Legen Sie in das Filtrationsgerät 16510 ein
steriles Membranfilter ein. Filtrieren Sie mit
Hilfe der Spritze und dem Filtrationsvorsatz
10 ml steriles Wasser in den Trichter des
Filtrationsgerätes. Entnehmen Sie mit der
Pipette aus der stärksten Verdünnungsstufe
(z.B. 10 -6) 1 ml der Verdünnung und verteilen
Sie diese Menge gleichmäßig in der Vorlage.
Mit der Spritze und dem Dreiwegeventil
erzeugen Sie den für die Filtration erforderlichen Unterdruck.
Die Probe wird filtriert. Danach entnehmen
Sie mit einer abgeflammten Pinzette das
Membranfilter aus dem Gerät und legen es
unter vorsichtigem Anheben des Deckels auf
die angefeuchtete Standard-Nährkartonscheibe.
Für jede weitere Verdünnungsstufe mit
zunehmender Konzentration ist der
Arbeitsgang gleich.
Sollten Sie nach der vereinfachten
Verdünnungsreihe arbeiten, können Sie
vergleichbare Teilmengen entnehmen
und in der sterilen Vorlage verteilen.
Damit in drei verschiedenen Temperaturbereichen bebrütet werden kann müssen aus
jeder Verdünnungsstufe drei gleiche Proben
filtriert werden.
Beschriften Sie die Petrischalen mit der
entsprechenden Verdünnungsstufe und den
Ziffern 1-3.
Die Petrischalen der verschiedenen Verdünnugsstufen und der Ziffer 1 werden in den
Kühlschrank gestellt. Die Petrischalen mit der
Ziffer 2 werden an lichtgeschützter Stelle bei
Raumtemperatur bebrütet, die Petrischalen
mit der Ziffer 3 werden entweder bei 37°C
im Brutschrank oder an einem Platz mit
vergleichbarer Temperatur, z.B. oberhalb
eines Heizkörpers zur Bebrütung aufgestellt.
7.5 Auswertung
Werten Sie nach 48 Stunden die Kulturen aus,
indem Sie die mit bloßem Auge sichtbaren
Kolonien auf dem Membranfilter auszählen.
Dabei werden Sie feststellen können, dass das
Wachstum in einem der Temperaturbereiche
am weitesten fortgeschritten ist.
Bebrüten Sie die beiden in den anderen
Bereichen angezüchteten Kulturen jetzt
ebenfalls unter optimalen Wachstumsbedingungen und werten Sie nach 48 Stunden aus.
Vergleichen Sie dann die Koloniezahl mit
der nach der Bebrütung unter ungeeigneten
Temperaturbedingungen.
Allgemeine Arbeitshinweise in Bildern
2. Vorbereiten der 50-ml-Spritze mit
dem Dreiwegeventil, dem Adapter und
dem Filtrationsgerät zur Erzeugung
von Unterdruck.
1. Vorbereiten der Sprike und des
Filtrationsvorsatzes
1.1. Membranfilter mit 0,2 μm Porengröße
in das Unterteil des Filtrationsvorsatzes
einlegen.
1.4. …und sterilen Filtrationsvorsatz auf die
Kunststoffspritze aufsetzen.
2.1. Sinker am Silikonschlauch des Dreiwegeventils durch Kunststoff-Adapter ersetzen.
Dreiwegeventil mit der 50-ml-Kunststoffspritze verbinden.
1.2. Beim Verschrauben Unterteil des
Filtrationsvorsatzes waagerecht halten.
Anschließend durch Auskochen sterilisieren.
1.5. Steriles Wasser zur Filtration bei kleinen
Probemengen vorlegen.
2.2. Kunststoff-Adapter in den seitlichen
Anschluss des Filtrationsgerätes stecken.
Gegenüberliegenden Anschluss mit Stopfen
verschließen.
1.3. Unsteriles Wasser in die Kunststoffspritze
aufziehen…
2.3. Mit der Spritze im Geräteunterteil
Unterdruck erzeugen und damit die Filtration
ermöglichen.
19
3. Vorbereiten der Nährkarton scheiben
4. Vorbereiten des Filtrationsgerätes zur
Filtration
3.1. Zehner-Verpackung aufschneiden,
Petrischalen so herausnehmen, dass sie
geschlossen bleiben.
4.1. Membranfilter mit abgeflammter
Pinzette aus Einzelverpackung entnehmen…
3.2. Mit 3,5 ml sterilem destillierten Wasser
die Nährkartonscheibe benetzen.
4.2. …und auf Filterunterstützung
des Filtrationsgerätes legen. Oberteil
aufschrauben.
4.3. Probe durch den Trichter einfüllen.
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4.4. Nach der Filtration das Membranfilter
mit einer Pinzette dem Filtrationsgerät
entnehmen…
4.5. …und unter »Abrollen« auf die
befeuchtete Nährkartonscheibe auflegen.
Alternative Edelstahlgeräte
Die in den Versuchen beschriebenen mikrobiologischen Arbeiten lassen sich anstelle
des Filtrationsgerätes aus Kunststoff 16510
auch mit einem Filtrationsgerät aus Edelstahl
16201 durchführen. Dieses Gerät hat sich
seit vielen Jahren in allen Bereichen der
mikrobiologischen Anwendung bewährt.
Dieses Gerät wird seit vielen Jahren für
mikrobiologische Kontrolluntersuchungen
eingesetzt. Es wird durch Abflammen des
Innenkegels sterilisiert.
Dadurch wird das Arbeiten mit dem Gerät
vereinfacht und die Untersuchungen sind
schneller durchzuführen. Die Filtrationsgeräte
werden auf Saugflaschen oder im Routinebetrieb auf Mehrfachabsaugvorrichtungen
aufgesetzt.
Zur Erzeugung von Unterdruck wird entweder
eine Wasserstrahlpumpe (16611) oder eine
Laborpumpe (16692) verwendet.
Das Unterteil des Filtrationsgerätes wird mit
Hilfe eines Stopfens auf eine Saugflasche
gesetzt. Diese wird über einen Vakuumschlauch (16623) und eine Woulff’sche
Flasche (16610) mit der Laborpumpe verbunden. Bei Verwendung einer Wasserstrahlpumpe entfällt die Woulff’sche Flasche.
Der Hahn im Unterteil des Gerätes wird
geöffnet und die Pumpe in Betrieb gesetzt.
Mit dem Bunsenbrenner wird der Filtertisch
abgeflammt. Dabei wird die Flamme auch
durch die Metallfritte gesaugt. Es wird nur
so lange abgeflammt, bis das sich an der
Oberfläche bildende Schwitzwasser wieder
verschwunden ist. Nach Abflammen der
unteren Seite des Aufsatzes wird dieser auf
den Filtertisch aufgesetzt. Anschließend wird
der Aufsatz innen spiralförmig abgeflammt,
der Hahn verschlossen und der Deckel aufgesetzt. Jetzt kann das Membranfilter in das
Gerät eingelegt werden. Es wird mit einer
sterilen Pinzette auf den Filtertisch aufgelegt.
Empfohlene Geräte, Filter und Nährkartonscheiben
Der Aufsatz wird wieder aufgesetzt und mit
dem Hebelverschluss verschlossen. Nachdem
die zu untersuchende Probe in das Filtrationsgerät überführt wurde, wird der Hahn im
Unterteil geöffnet und die Filtration durchgeführt.
entweder 16611
Wasserstrahlpumpe mit 3" Gewindeanschluss
oder 16612 Laborpumpe für Unterdruck,
220 V, 50 Hz, zusammen mit
Die in einer zu untersuchenden Probe enthaltenen wasserunlöslichen Schwebstoffe lagern
sich auf der Oberfläche des Membranfilters
ab und behindern dadurch die Entwicklung
des Kolonienwachstums.
Durch eine Vorfiltration unter Zuhilfenahme
des Zusatzgerätes, (kann mit der Filtration in
einem Arbeitsgang durchgeführt werden),
lässt sich eine Abtrennung der Schwebstoffe
auf dem bakteriologischen Vorfilter und
damit eine ungestörte Kultivierung der Keime
erreichen.
16201
Filtrationsgerät aus Edelstahl für Unterdruck
47/50 mm, 500 ml
16672
Saugflasche, 2 Liter
17173
Gummistopfen für 16201, 16219, 16220
auf 16672
16610
Woulff’sche Flasche, 500 ml
3+ 16623
Gummi-Vakuumschlauch (1 m)
16625
Edelstahlpinzette
16807
Zusatz zur Vorfiltration aus Edelstahl, zur
Abscheidung wasserunlöslicher Feststoffe in
einem Arbeitsgang
11301.050ACN
Zellulosenitrat Vorfilter, weiß, 8 μm, 50 mm,
(100 St.)
Bei Verwendung dieser Ausrüstung
empfehlen wir Nährkartonscheiben mit
einem Durchmesser von 50 mm:
14095.050 N
Endo-Würze-Standard Nährkartonscheiben
für Schulkit in Petrischalen mit einzeln
verpackten Filtern, steril (100 St. gemischt)
14053.050 N
Endo Nährkartonscheiben, für E. coli und
Coliforme, in Petrischalen, mit einzeln
verpackten Filtern, steril (100 St.)
140 55.050 N
Standard-Nährkartonscheiben für Koloniezahl, in Petrischalen, mit einzeln verpackten
Filtern, steril (100 St.)
Zusatzgerät zur Vorfiltration 16807
140 58.050 N
Würze Nährkartonscheiben für Hefen und
Schimmelpilze, in Petrischalen, mit einzeln
verpackten Filtern, steril (100 St.)
Filtrationsgerät aus Edelstahl 16201, 500 ml Aufgussraum
und Zusatzgerät zur Vorfiltration 16807
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Sartorius Stedim Biotech GmbH
August-Spindler-Straße 11
37079 Göttingen
Telefon 0551.308.0
Fax 0551.308.3289
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Technische Änderungen vorbehalten.
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Gedruckt auf chlorfrei gebleichtem Papier
W/sart-231
Publication No.: SM-6044-d11054
Order No.: 80830-000-55
Ver. 05 | 2011

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