und Säulenchromatographie

OC-Seminar / DC und Dry-Flash-Chromatographie - Stadlbauer
Seminar: Organisch-Chemische Übungen
Dünnschicht-Chromatographie
und
Dry-Flash-Column-Chromatographie
Die Lernunterlagen können über UNIGRAZonline
heruntergeladen werden
1
OC-Seminar / DC und Dry-Flash-Chromatographie - Stadlbauer
1. Allgemeines
Rückblende: Grundpraktikum
Beispiel:
„Säulenchromatographie von
Pflanzenfarbstoffen“:
Säulentrennung und
DC-Untersuchung von
Spinat
2
1
OC-Seminar / DC und Dry-Flash-Chromatographie - Stadlbauer
2. Trennprinzipien
Mobile Phase (= Lösung eines Substanzgemisches in
Lösungsmittel/Gemisch)
z strömt über stationäre Phase
= oberflächenreicher Feststoff oder
= stationäres Lösungsmittel + Substanzgemisch.
z unterschiedliche Affinität
zur mobilen/stationären Phase
= unterschiedliche Laufstrecken
z
3
OC-Seminar / DC und Dry-Flash-Chromatographie - Stadlbauer
Trennprinzip ADSORPTION
z
z
4
an der Oberfläche der stationären Phase:
besteht aus feingepulverten polaren
Materialien, z. B. aus Kieselgel,
Aluminiumoxid
z
Ad/Desorption durch H-Brücken und DipolDipol-Wechselwirkungen
z
Desaktivierung der stationären Phase:
- durch Wasser oder durch
- stark polare organische Lösungsmittel
2
OC-Seminar / DC und Dry-Flash-Chromatographie - Stadlbauer
Trennprinzip VERTEILUNG
z
z
zwischen 2 nicht-mischbaren Flüssigkeiten.
Eine davon ist auf Träger fixiert
= stationäre Phase
Träger: z.B. Cellulosepulver, Polyamid
5
OC-Seminar / DC und Dry-Flash-Chromatographie - Stadlbauer
Trennqualität
z
z
z
Trennleistung =
Zonenverbreiterung (Diffusion
etc): Materialabhängig
Selektivität = Rf-WertUnterschied für die
aufgetrennten Substanzen
(Strukturabhängig)
= Auflösung
Kammereinfluss
6
3
OC-Seminar / DC und Dry-Flash-Chromatographie - Stadlbauer
3. Die stationäre Phase
z
Kommerzielle Sorbenzien garantieren
gleichbleibende Qualität in Art und Aktivität
= Etablierung als Routinemethoden
• Polare (hydrophile) Phasen:
straight / normal phases
• Unpolare (hydrophobe) Phasen:
Umkehrphasen, reversed phases (RP)
• mittelpolare Phasen: modifizierte Sorbenzien
7
OC-Seminar / DC und Dry-Flash-Chromatographie - Stadlbauer
Chemische Zusammensetzung und
Struktur - Kieselgel
CHEMISCHE Struktur beeinflusst SELEKTIVITÄT
Sorbenzien für die
Adsorptionschromatographie
• Kieselgel (90% der Trennungen)
... bildet H-Brücken
• modifiziertes Kieselgel (durch Silane hydrophob)
8
4
OC-Seminar / DC und Dry-Flash-Chromatographie - Stadlbauer
Aluminiumoxid
Aluminiumoxid
- neutral - basisch – sauer
- Aktivitätsstufen I - V:
z
durch Belegen (= Desaktivieren) der aktivsten
Stellen mit Wasser (0 - 18%)
9
OC-Seminar / DC und Dry-Flash-Chromatographie - Stadlbauer
Polyamid, Cellulose
z
z
Verteilungschromatographie
Bindung von Lösungsmittelanteilen an Träger
(ähnlich wie Papierchromatographie)
z
Typische Anwendungsbeispiele: für
Aminosäuren, Kohlenhydrate
z
Acetylierte Cellulose (RP): für polycyclische
Aromaten, Chinone, Carbonsäuren
10
5
OC-Seminar / DC und Dry-Flash-Chromatographie - Stadlbauer
Korn- und Porencharakteristik
GEOMETRISCHE Struktur beeinflusst TRENNLEISTUNG
z
z
z
z
z
Partikeldurchmesser (klein)
Korngrößenverteilung (eng)
Porenvolumen (angepasst)
Oberfläche (groß)
Kornstruktur (sphärisch)
= gute Trennleistung
= hohe Adsorptionskraft
11
OC-Seminar / DC und Dry-Flash-Chromatographie - Stadlbauer
4. Die mobile Phase
z
z
z
z
z
z
DC - aufsteigend: Durch Kapillardruck strömt
Fließmittel aus Vorratsgefäß in kapillare Hohlräume.
SC (Schwerkraft, Überdruck) - absteigend
Polarität -> Elutionskraft = großer Rf-Wert der
Substanz
Solvatisierung von Substanzen = Lösung im
Laufmittel
Konkurrent um aktive Adsorptionsstellen
Verteilungschrom.: unpolarer + polarer Anteil
12
6
OC-Seminar / DC und Dry-Flash-Chromatographie - Stadlbauer
Eluotrope Reihe, Mixotrope Reihe
Empirische Ordnung nach steigender Elutionskraft
Cyclohexan
Tetrachlormethan
Toluen
Chloroform
Dichlormethan
Acetonitril
2-Propanol
unpolar
13
Ethanol
Dioxan
Essigester THF
Aceton
Methanol
Pyridin
Wasser
mittelpolar
stark polar
OC-Seminar / DC und Dry-Flash-Chromatographie - Stadlbauer
5. Präparative
Säulenchromatographie
z
z
z
z
z
z
14
Meist Fest-Flüssig-Chromatographie (feste
stationäre Phase)
Adsorbens: Normal- oder Umkehrphasen
dazu passend eher unpolare (organische) oder
polare Laufmittel (z.B. Wasser, Puffer)
Typischer Porendurchmesser: 60 Å (Kieselgel 60)
Drucklose SC (nur Schwerkraft)= großer
Zeitaufwand
Abhilfe: Flash-Chromatographie (Überdruck durch
Gasflasche, Partikel-Durchmesser: 30 - 60µ)
7
OC-Seminar / DC und Dry-Flash-Chromatographie - Stadlbauer
Dry-Flash-Säulenchromatographie (1)
z
z
z
z
z
Partikeldurchmesser: klein -> 15 µm
(wie DC-Kieselgel, aber Kieselgel H
statt G), größere Oberfläche
Unterdruck durch Vakuumpumpe (D)
Material wird sehr breit auf eine
Glasfritte gepackt (A)
Das Bett darf trocken laufen
dadurch einfache Gradientenelution
möglich
15
OC-Seminar / DC und Dry-Flash-Chromatographie - Stadlbauer
Dry-Flash-Säulenchromatographie (2)
z
z
z
Detektion: bei färbigen Substanzen visuell,
sonst Fraktionen schneiden und mit DC
überprüfen.
Maximale Trennmenge: Gramm-Bereich
Probleme: Vakuum ... Verdunstungskälte Kondensation von Wasser an der
Glasapparatur.
16
8
OC-Seminar / DC und Dry-Flash-Chromatographie - Stadlbauer
6. Dünnschichtchromatographie
z
z
z
z
z
Substanzen: schwerflüchtig,
polar und unpolar
kostengünstig
große Probenanzahl in kurzer Zeit
keine elektrische Energie notwendig
Auch Anwendung, wenn GC/LC nicht möglich:
- zB Probenmaterial beschädigt Fertig-Säulen
- zB Detektion ist aufwendig
- zB Probenbestandteile dürfen nicht zerstört werden
17
OC-Seminar / DC und Dry-Flash-Chromatographie - Stadlbauer
Methoden und Anwendungsformen
• Analytische Methode: qualitative bzw.
quantitative Identifizierung
= Prozess- und Reinheitskontrolle
z
Präparative Methode: Präparative SchichtChromatographie (PSC):
= Reinigung und Isolierung durch Extraktion
aus Schicht
18
9
OC-Seminar / DC und Dry-Flash-Chromatographie - Stadlbauer
Beschreibung des Laufverhaltens - Rf-Wert
a... Laufstrecke des Laufmittels
b.... Laufstrecke der Substanz
- bis zum Mittelpunkt des
Substanzflecks
b
Rf = -----a
bei unregelmäßigen Flecken:
Angabe von Rf-Bereichen
19
OC-Seminar / DC und Dry-Flash-Chromatographie - Stadlbauer
Aussagekraft von Rf-Werten
z
z
z
Brauchbare Rf-Werte liegen zwischen 0.2
und 0.8 (Frontläufer und Sitzenbleiber sind
unbrauchbar)
Rf-Werte sind in der DC nur Richtwerte
Daher: Immer mit Standard vergleichen
20
10
OC-Seminar / DC und Dry-Flash-Chromatographie - Stadlbauer
Konzentration & Rf-Wert
Bei der Sättigungskonzentration
der stationären Phase:
z
¾
Gerade knickt ab
¾
Laufstrecke ändert sich!
¾durch
nicht-lineare Adsorptions-
¾isothermen
Daher: Rf-Wert auch von der
Konzentration abhängig
21
OC-Seminar / DC und Dry-Flash-Chromatographie - Stadlbauer
Schichteigenschaften
Schichtdicke: 50 µm (HPTLC) - bis zu 2 mm (PSC)
z Binder: Gips, organische Polymere
z Fluoreszenzindikatoren
zur Detektion mittels Fluoreszenzlöschung
z
22
11
OC-Seminar / DC und Dry-Flash-Chromatographie - Stadlbauer
7. Laufmitteleinfluss auf
Trennproblem
n-Hexan
Toluen
23
Toluen/
Chloroform
Chloroform
Aceton
OC-Seminar / DC und Dry-Flash-Chromatographie - Stadlbauer
Spot-Test zur Laufmittelwahl
¾Auftragen des Trennguts
als kleinen Fleck
Hexan
¾ Laufmittel verdunsten
lassen
Tetrachlor¾ Kapillare in der Mitte
methan
des Substanzflecks
Toluen
aufsetzen
Aceton
¾zirkulares
Chromatogramm
24
12
OC-Seminar / DC und Dry-Flash-Chromatographie - Stadlbauer
Standard-Laufmittel
Für Kieselgel/Aluminiumoxid (Adsorption)
z
Unpolare Substanzen:
Aceton-Toluen (1:10)
z
mittelpolare Substanzen: Aceton-Toluen (1:3)
oder
Chloroform-Aceton (7:3)
z
stark polare Substanzen:
Methanol - Chloroform (1:9)
25
OC-Seminar / DC und Dry-Flash-Chromatographie - Stadlbauer
Standard-Laufmittel
Für Cellulose oder Papierchrom. (Verteilung)
Saure Substanzen:
n-Butanol - Aceton - Eisessig - Wasser (3:3:7:2)
Basische Substanzen:
2-Propanol - Ammoniak - Wasser (6:3:1)
26
Merkregel: Säuren in sauren Laufmitteln trennen
Basen in basischen Laufmitteln trennen
(Similia similibus solvuntur)
13
OC-Seminar / DC und Dry-Flash-Chromatographie - Stadlbauer
8. Praktische Hinweise zur
Durchführung
Handhabung der Fertigschichten
Träger: meist Aluminiumfolie (zuschneiden)
z Kanten versäubern .... Sonst schiefe
Chromatogramm-Bahnen!
z Plattenmaterial nur
am Rand berühren
z
27
OC-Seminar / DC und Dry-Flash-Chromatographie - Stadlbauer
Auswahl des Lösungsmittels
Lösungsmittel muss wasserfrei sein (Ads.), Probe
vollständig lösen, ungiftig, nicht zu hoch siedend
Polarität des
Lösungsmittels
= entscheidend für
Startzone
28
Standard-Lösungsmittel:
Adsorption: meist Aceton
Verteilung: Wasser, Ethanol
14
OC-Seminar / DC und Dry-Flash-Chromatographie - Stadlbauer
Auftragen der Probe
z
Wichtig: Vergleichssubstanzen und Probe immer
am SELBEN Chromatogramm auftragen
• Punkt- oder bandförmig (PSC),
• nicht zu konzentriert
sonst Schwanzbildung
durch Schicht-Übersättigung
• Startpunkte mit weichem Bleistift
markieren (ca. 1 cm Abstand v. unten)
• Beschriftung nur oberhalb der Front
29
OC-Seminar / DC und Dry-Flash-Chromatographie - Stadlbauer
Auftragemethode
Auftragen für qualitative DC´s
•
•
•
•
Füllen der Kapillaren:
selbsttätig durch Eintauchen
Kapillaren aufsetzen Entleerung durch Kontakt mit
Sorbensoberfläche ... Schicht
nicht beschädigen!
Konzentration möglichst so
wählen, dass einmaliges
Auftragen reicht.
Startzonen vor dem nächsten
Auftragen trocknen.
30
15
OC-Seminar / DC und Dry-Flash-Chromatographie - Stadlbauer
Positionierung der Proben
Bei Identitätsproblemen:
Überlappende Auftragung
Dadurch besserer
Vergleich als durch
nebeneinanderliegende
Probenflecken
31
OC-Seminar / DC und Dry-Flash-Chromatographie - Stadlbauer
9. Entwickeln
Aufgabe des Laufmittels & Anforderung
•
•
•
•
z
Lösen und Transport des Substanzgemisches;
Selektivität
Rf-Werte im mittleren Bereich halten
Ausreichende Reinheit (Stabilisatoren?)
Ausreichende Stabilität, keine Toxizität
β-Fronten beachten - täuschen falsche Rf-Werte
vor
32
16
OC-Seminar / DC und Dry-Flash-Chromatographie - Stadlbauer
Ansetzen & Aufbewahren der Laufmittel
• Einzelkomponenten getrennt abmessen (sonst
Fehler durch Volumsänderung)
• Gut vermischen, Vorrat gut verschließen, nicht zu
lange aufbewahren
Laufmittel nicht wiederverwenden: Verdunstung,
chem. Reaktion, bevorzugte Adsorption
z
„Jede DC-Platte hat das Recht auf ein frisches
Laufmittel“
33
OC-Seminar / DC und Dry-Flash-Chromatographie - Stadlbauer
Aufsteigende Entwicklung
- Benetzung nur unterhalb
der Startpunkte
- Deckel muss
geschlossen sein
- Laufmittel max. 20 cm
Startflecken vergrößern sich zur Front hin!
Laufmittelfront markieren (Bleistift, einritzen) Platte gut trocknen.
Temperaturkonstanz & Lichtschutz beachten
34 Kammer NICHT bewegen
17
OC-Seminar / DC und Dry-Flash-Chromatographie - Stadlbauer
10. DC-Trennkammern
Gesättigte
Normalkammer
z
Rf-Werte linear ...
¾ gut für große RfWerte
35
OC-Seminar / DC und Dry-Flash-Chromatographie - Stadlbauer
Nichtgesättigte Normalkammer
Verdunstung an der Front
¾ mehr Lösungsmitteldurchsatz
¾ mehr Trennstufen
¾ kleinere Rf-Werte werden
auseinandergezogen
¾ bessere Trennung im unteren
Bereich
Zusammenlaufen der großen RfWerte).
z
36
18
OC-Seminar / DC und Dry-Flash-Chromatographie - Stadlbauer
11. Detektion
Visuelle Detektion bei Tageslicht
z
Detektion bei Tageslicht: nur bei färbigen
Substanzen
37
OC-Seminar / DC und Dry-Flash-Chromatographie - Stadlbauer
Visuelle Detektion - Fluoreszenzlöschung
• DC-Folien fluoreszieren hellgrün oder
hellblau (Fluoreszenzindikatoren F254).
• UV-aktive Strukturelemente (Aromaten,
konjugierte C=C-Doppelbindungen...)
löschen Emission
¾ dunkle Flecken auf
hellfluoreszierendem Hintergrund
(Achtung - kurzwelliges UV-Licht, 254 nm)
Intensität proportional der Konzentration
38
Fluoreszenz bei UV 365 nm: nicht proportional!!
19
OC-Seminar / DC und Dry-Flash-Chromatographie - Stadlbauer
Derivatisierung
• wenn Substanzen nicht färbig oder UV-aktiv sind
¾Aufsprühen von Nachweisreagenzien (häufigste
Technik)
¾Tauchen von DC-Platten (umweltfreundlicher,
billiger)
•
Bedampfen von DC-Platten - Reaktion mit Iod, Chlor,
Thermo- oder Photochemische Reaktion
39
OC-Seminar / DC und Dry-Flash-Chromatographie - Stadlbauer
Derivatisierung durch Aufsprühen
z
z
z
40
Besprühen mit Laborsprüher
Homogenes Benebeln, bis
Schicht leicht glänzt - NICHT
zuviel!
Eventuell nach dem Sprühen
erwärmen
Durchführung in Sprühbox (=
giftiger, agressiver Reagenznebel,
Lösungsmitteldämpfe).
Handschuhe und Schutzbrillen
tragen
20
OC-Seminar / DC und Dry-Flash-Chromatographie - Stadlbauer
Derivatisierung durch Tauchen
Vorteile gegenüber Sprühen:
¾ gleichmäßigere Belegung der Schicht
¾ keine Geräte notwendig
¾ bessere Reproduzierbarkeit
¾ keine Kontamination des Arbeitsplatzes
Manuelles Tauchen: einfach durchführbar
ca. 3 sek eintauchen, Platte mit Luft abblasen und
Rückseite reinigen
Tauchlösungen weniger konzentriert als
Sprühlösungen
Wasser meist durch Alkohol ersetzt
z
41
OC-Seminar / DC und Dry-Flash-Chromatographie - Stadlbauer
Derivatisierungsreagenzien - Ninhydrin
Ninhydrin - Nachweis von
Aminosäuren, Aminen,
0.2% Ninhydrin in Ethanol oder
Butanol;
Besprühen oder Tauchen, dann
auf ca. 110 °C erwärmen
.... Gelbe, braune, blaue und
violette Flecken.
42
21
OC-Seminar / DC und Dry-Flash-Chromatographie - Stadlbauer
Derivatisierungsreagenzien – V/S
Vanillin - Schwefelsäure
für höhere Alkohole, Steroide,
etherische Öle....:
0.5-1% Vanillin in konz.
Schwefelsäure oder in EtOHkonz.H2SO4 (1:4 - 1:10);
Besprühen oder Tauchen, dann
auf ca. 120 °C erhitzen.
43
OC-Seminar / DC und Dry-Flash-Chromatographie - Stadlbauer
12. Auswertung
Visuelle Auswertung
z
¾
•
Qualitativ: Kontrolle von Syntheseansätzen
(Identifikation, Reinheitsprüfung):
Rf-Werte sind nicht genau reproduzierbar, deshalb
***IMMER*** Referenzsubstanzen am selben
Chromatogramm
Halbquantitativ: Konzentrationsreihen, Vergleich
der Fleckengröße
44
22
OC-Seminar / DC und Dry-Flash-Chromatographie - Stadlbauer
Säulentrennung von Azobenzen
N N
trans (E) -
z
z
z
z
hν
N N
Azobenzen
cis (Z) -
Herstellung von einheitlichem (E)-Azobenzen
(Thermolyse)
(E)-> (Z)-Isomerisierung von Azobenzen durch
Photolyse im UV
Auftrennung durch Dry-Flash-Säulen-Chromatographie
DC-Untersuchung der Reinheit der beiden Isomeren auf
Kieselgel
45
OC-Seminar / DC und Dry-Flash-Chromatographie - Stadlbauer
Trennung & Nachweis von Aminosäuren
O
NH2
OH
R
+
O
O
O
N
O
O
z
z
z
OH
O
Identifizierung von Aminosäuren durch Vergleich
mit bekannten Aminosäuren:
stark polare Verbindungen: NH2- oder COOH-Gruppe
- daher: Verteilungschromatographie auf Cellulose
Detektion: viele AS im UV unsichtbar – daher
- Detektion der aromatischen AS im UV
- Derivatisierung mit Ninhydrin
46
23
OC-Seminar / DC und Dry-Flash-Chromatographie - Stadlbauer
DC-Analyse eines unbekannten
Substanzgemisches
O
O
H3C
OH
H3C
CH3
N
H
OH
H3C
•
CH3
Probengemisch von 2 Substanzen mit
unterschiedlicher Polarität und UV-Aktivität
DC-Vergleich (Kieselgel) mit 4 bekannten Substanzen
Detektion:
- Fluoreszenzlöschung
- Derivatisierung: Tauchen in Vanillin-Schwefelsäure
•
•
47
OC-Seminar / DC und Dry-Flash-Chromatographie - Stadlbauer
Test
z
z
z
z
Trennprinzipien, stationäre Phasen, Laufmittel,
Lösungsmittel
Rf-Wert (Bestimmung, Einflüsse, Berechnung)
Trennleistung, Selektivität, Einflüsse
Detektionsmethoden, Auswertemethoden
48
24
OC-Seminar / DC und Dry-Flash-Chromatographie - Stadlbauer
Ende des Vorlesungsteils
49
25

Download Report