Expression therapeutischer Proteine in bakteriellen Systemen

Expression therapeutischer Proteine in bakteriellen Systemen
Dr. Klaus Eisele
klaus.eisele@uni‐ulm.de
Gentechnisch hergestellte Proteine als mikrobielle Produkte Herstellung in Escherichia coli u . a. Bakterien Protein Anwendung Interferon Insulin Wachstumshormone Urokinase
Parathyroid‐Hormon Interleukin‐2 Influenza‐Virus Cytomegalovirus
MKS‐Virus Antivirale Substanz Diabetes‐Behandlung Wachstumsdefekte
Blutgerinnungs‐Probleme
Calcium‐Regulation T‐Zellen‐Wachstumsförderung
Impfstoff
Impfstoff
Impfstoff
Und noch viele weitere….
Bakterielle Proteinexpression:
Was spricht für E.coli?
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Einfaches System (Klonierung, Transformation, Kultivierung)
Kostengünstig
Schnelles Wachstum
Hochzelldichtekultivierung möglich
Was spricht gegen E.coli?
• Keine posttranslationale Modifikation (N‐ oder O‐Glycosylierung…)
• Cytoplasmatisch ‐S—S‐ Brücken nur teilweise ausgebildet ( Periplasma)
• Ausbildung von „inclusion bodies“*
*inclusion bodies: sind kleine Partikel im Inneren von Zellen bestehen aus Ansammlungen von zumeist fehlerhaft oder unvollständig gefalteten Proteinen
Entstehen oft bei exzessiver Proteinsynthese
Bildung kann auch gezielt angeregt und das entstandene Protein industriell weiterverwertet werden
Voraussetzungen für eine erfolgreiche Proteinexpression:
Das Plasmid origin of replication
Origin of replication (ORI) Definiert die Kopienzahl des Plasmids in der Zelle
Low copy :
Medium copy
High copy
10 ‐ 12 Kopien (p15A)
15 ‐ 20 Kopien (pBR322)
500 – 700 Kopien (pUC 19)
Ein Plasmid kann verschiedene ORI´s tragen: Konventioneller ORI: steuert die Kopienzahl in der Zelle f1 origin: führt unter bestimmten Bedingungen zur Produktion von einzelsträngiger Vektor‐DNA  effektivere Produktion
Nicht alle ORI´s sind miteinander kompatibel da sie unterschiedlich stabil in E. coli repliziert werden. Gefahr des Verlusts der Geninformation.
Voraussetzungen für eine erfolgreiche Proteinexpression:
Das Plasmid Resistenzmarker
Resistenzmarker
wird zur Selektion benötigt
sorgt für permanente Nutzung und Replikation der Plasmid‐DNA
Ampicillin‐Resistenz (ampR)
Vermittelt durch ß‐Lactamase (bla‐Gen)  Hydrolyse des ß‐Lactamrings
Vorsicht bei dichten Kulturen Gefahr der Übersäuerung des Mediums
Kanamycin‐Resistenz
Inaktivierung durch Aminoglycosid‐Phosphotransferase im Periplasma
 Nur bei Gram negativen Bakterien gut
Voraussetzungen für eine erfolgreiche Proteinexpression:
Das Plasmid multiple clonig site
Der Promotor
• Proteinüberproduktion erfordert einen starken Promotor
• möglichst geringe basale Transkription („dichter“ Promotor)
 wichtig bei toxischen Proteinen, um toxischer Selektion des Expressionsplasmids vorzubeugen
• Induzierbar um den Promotor für die Transkription zu „öffnen“
Häufigster Induktor ist IPTG (Isopropyl‐ß‐D‐thiogalactopyranosid)
IPTG: Induktor des lac‐Operons, bindet an den Lac I‐Repressor(lacI Genprodukt).
allosterische Konformationsänderung des Repressors, die seine Wechselwirkung mit dem lac Operator
inhibiert.
Voraussetzungen für eine erfolgreiche Proteinexpression:
Das Plasmid MCS
Ribosomenbindestelle (RBS) Shine‐Dalgarn‐Sequenz:
Effizienz der Translationsinitiation wird erhöht durch:
Sequenz der RBS
Initiationscodon  ATG ist besser als GTG
Folgecodon A/T‐reiche Codons sind vorteilhaft
Terminator für die RNA‐Polymerase
Terminator‐Loop erhöht die Stabilität der m‐RNA
gegen Abbau durch RNAse
sollte nach der MCS im Vector vorhanden sein
Die multiple cloning site:
T7 
Promotor spezifisch für T7‐RNA‐Polymerase
lacO 
lac operator region blockiert nachfolgende Gene
RBS 
Ribosomenbindestelle
ATG 
modifiziertes Startcodon
6xHis 
TagI zur Reinigung
Xpress epitop TagII zur Reinigung
EK 
Protease Schnittstelle zur Entfernung der Tags
Schnittstellen  Einfügen des Inserts (gerichtet)
T7 terminator  Hairpin am Ende der m‐RNA
lacI = Überproduktion des lac Repressorproteins um den Operator lacO zu blocken bis
zur Induktion
Resistenzgen gegen Antibiotikum
pET‐Vector mit allen Elementen
Zwei origins of replication:
f1 origin ermöglicht die Produktion von single stranded vector bei geeigneten
Bedingungen
pBR322 ori der konventionelle ORI unter Kontrolle von rop
 20 copies/cell
Voraussetzungen für eine erfolgreiche Proteinexpression:
Bakterium
genetische Eigenschaften
E. coli BL 21 (DE 3):
E.coli BL 21: • Restriktions‐defizienter Stamm
 keine Restriktionsendonucleasen, d.h. eingebrachte Fremd‐DNA bleibt erhalten
E. coli B‐Stamm mit DE3: • enthält im Genom ein DNA Fragment des Bakteriophagen λ. • Fragment codiert für die T7‐RNA‐Polymerase und • den vorgeschalteten Lac I‐Repressor
• Transformierte Plasmide die unter Kontrolle des T7‐Promotors stehen sind solange reprimiert bis der Induktor (IPTG) zugegeben wird. !! in unserem Fall doppelte Repression !! Voraussetzungen für eine erfolgreiche Proteinexpression:
Bakterium
genetische Eigenschaften
Verringerung des Proteinabbaus während der Expression
lon : keine Lon‐Protease
 reduziert den Proteinabbau im Cytosol
ompT :
Mutation von Protease VII (Membranprotein der äusseren Membran)
 reduziert Proteolyse von Sekrteierten Proteinen
Verbesserung der Induktion
gal :
Defizient im Galaktose Metabolismus
 Vorteil: zugegebener Induktor IPTG bleibt erhalten
 Nachteil: kein gesteuertes “Induktionsniveau”
Voraussetzungen für eine erfolgreiche Proteinexpression:
Induktion Start der Proteinsynthese
Induktion durch Zugabe von IPTG:
IPTG bindet an Lac I Protein
 Repressor dissoziiert
T7‐Polymerase wird transkribiert/translatiert
 T7‐Polymerase bindet an den T7‐Promotor
Nach IPTG‐Zugabe beginnt die Bildung von T7‐Polymerase (Genom)
und die MCS des Plasmids wird freigegeben
 Bildung der m‐RNA
T7‐RNA‐Polymerase: 230 Basen/sec
E. coli RNA‐Polymerase: 50 Basen/sec
 Große Mengen m‐RNA führen zu entsprechender Bildung von Protein
Voraussetzungen für eine erfolgreiche Proteinexpression:
Das Bakterium: Sekretion
Sekretion:
lösliche Proteine sollten optimalerweise aus dem Bakterium heraus transportiert werden:
• Geschieht über ein Sekretions‐System (E. coli Sec‐System)
hierfür werden spezielle Peptid‐Signalsequenzen benötigt (Sec‐Signal)
• Sec‐B bindet an das neu synthetisierte Protein  verhindert vorzeitige Faltung
• Sec‐A (ATP‐Hydrolase) erkennt die Signalsequenz und schleust das Protein durch den Translokator‐Komplex SecY, SecG, SecE aus dem Cytoplasma
Voraussetzungen für eine erfolgreiche Proteinexpression:
Das Bakterium: Sekretion inclusion bodies
Mangelnde Sekretion oder toxische Proteine führen dazu, dass die exprimierten
Proteine in Einschlußkörperchen (inclusion bodies) eingekapselt werden
Inclusion Bodies:
• Ansammlung von Protein in der Zelle
• meist nicht sekretiertes oder missgefaltetes Protein
• häufig bei viraler Infektion
Vermeidung:
• geringere Wachstumstemperatur
• gleichzeitige Überproduktion von Chaperonen
• gleichzeitige Überexpression von seltenen tRNAs
• Produktion von Fusionsproteinen
• Rückfaltung von inclusion bodies
Gewinnung exprimierter Proteine aus der Lösung
Reinigung mittels Affinitätschromatografie über einen mit dem Protein exprimierten Tag

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