筋萎縮性側索硬化症(ALS)の 神経変性メカニズムを解明 和歌山県立医科大学 神経内科学講座 伊東 秀文 共同研究者 和歌山県立医科大学 医学部 綾木 孝、伊東 秀文（神経内科学） 大阪市立大学 医学部 及川 大輔、徳永 文稔（分子細胞生物学） 群馬大学 生体調節研究所、医学部 中澤 世識、亀井 希代子、竹吉 泉、 愛媛大学 プロテオサイエンスセンター 高橋 宏隆、竹田 浩之、澤崎 達也 広島大学 原爆放射線医科学研究所 川上 秀史 京都大学 医学部 岩井 一宏 畑田 出穂 東京大学 理学部 石井 亮平、石谷 隆一郎、濡木 理（構造生物学） 発表内容 • ALS 克服のための基本戦略 • ALSについて、わかっていることと、わからなかったこと • ユビキチン修飾系とNF-kBシグナル伝達経路の生理機能 • オプチニューリンの直鎖状ユビキチン結合性と病態との関連 （分子細胞生物・構造生物学的解析） • 筋萎縮性側索硬化症(ALS)発症 における意義 （病理学的解析） • 今後の展開 発表内容 • ALS 克服のための基本戦略 • ALSについて、わかっていることと、わからなかったこと • ユビキチン修飾系とNF-kBシグナル伝達経路の生理機能 • オプチニューリンの直鎖状ユビキチン結合性と病態との関連 （分子細胞生物・構造生物学的解析） • 筋萎縮性側索硬化症(ALS)発症 における意義 （病理学的解析） • 今後の展開 ALSの症状と社会的認知 随意筋を支配する上位および下位運動ニューロンが選択的に侵 される進行性の神経変性疾患 四肢の筋力低下と筋萎縮により寝たきりとなり、呼吸筋麻痺によ り死亡する。 引用：ALS・運動ニューロン疾患 （辻省次総編集、中山書店） Lou Gehrig アイスバケツチャレンジ （引用：wikipedia） （引用：http://blog.livedoor.jp/） Guam/Kii ALS ALS の生命予後 Kaplan-Meier法による病型別生存曲線 栁澤信夫：第40回 日本神経学会総会 サテライトシンポジウムより引用 http://www.als.gr.jp/staff/seminar/seminar40/seminar40_02.html レヴィ小体 α-シヌクレイン Lewy body 凝集 細胞死 レヴィ小体形成 遺伝性パーキンソン病の原因遺伝子 Abou-Sleiman PM, Muqit MM, Wood NW. Expanding insights of mitochondrial dysfunction in Parkinson‘s disease. Nat Rev Neurosci. 2006;7(3):207-19. Pathways to parkinsonism Abou-Sleiman PM, et al. Nat Rev Neurosci. 2006. 発表内容 • ALS 克服のための基本戦略 • ALSについて、わかっていることと、わからなかったこと • ユビキチン修飾系とNF-kBシグナル伝達経路の生理機能 • オプチニューリンの直鎖状ユビキチン結合性と病態との関連 （分子細胞生物・構造生物学的解析） • 筋萎縮性側索硬化症(ALS)発症 における意義 （病理学的解析） • 今後の展開 ALS の神経病理 ユビキチン染色 円形封入体 正常 ALS TDP-43 染色 筋萎縮性側索硬化症 (ALS) ALS Guam/Kii ALS Sporadic ALS Familial ALS (FALS) SOD1 TDP-43 FUS Unknown 家族性ALSの70%は原因遺伝子不明 劣性型 FALS 患者の homozygosity mapping ALS の新規原因遺伝子 optineurin (2010) Maruyama H, Morino H, Ito H, et al. Nature 465:223-226, 2010. OPTN の構造 huntingtin Optineurin は autophagy receptor である Tumbarello DA et al. J Cell Sci 2013;126:2561-70 The rate of discovery of ALS-related genes タンパク分解 RNA 代謝 Sreedharan J, Brown RH Jr. Amyotrophic lateral sclerosis: Problems and prospects. Ann Neurol 2013;74:309-16 ALS の分子病態 RNA 代謝 タンパク分解 ストレス顆粒形成 ？ TDP-43 or FUS 核ｰ細胞質間 輸送障害 封入体 形成 タンパク分解系の異常 Thomas M, et al. RNA dysfunction and aggrephagy at the centre of an amyotrophic lateral sclerosis/frontotemporal dementia disease continuum. Brain 2013;136:1345-60. 発表内容 • ALS 克服のための基本戦略 • ALSについて、わかっていることと、わからなかったこと • ユビキチン修飾系とNF-kBシグナル伝達経路の生理機能 • オプチニューリンの直鎖状ユビキチン結合性と病態との関連 （分子細胞生物・構造生物学的解析） • 筋萎縮性側索硬化症(ALS)発症 における意義 （病理学的解析） • 今後の展開 ユビキチン・プロテアソームシステム (UPS) The Nobel Prize in Chemistry 2004 "for the discovery of ubiquitin-mediated protein degradation" Aaron Ciechanover Avram Hershko Irwin Rose Photos: Copyright © The Nobel Foundation Ubiquitin の構造と機能 76アミノ酸 MQIFVKTLTGKTITLEVEPSDTIENVKAKIQDKEGIPPD QQRLIFAGKQLEDGRTLSDYNIQKESTLHLVLRLRGG https://en.wikipedia.org/wiki/Ubiquitin Ubiquitin の構造と機能 Ｋ４８ Ｋ６３ https://en.wikipedia.org/wiki/Ubiquitin Polyubiquitin の多様性 ユビキチン修飾系の最新モデル Ub 基質 基質 E1, E2, E3, ATP Ub Ub Ub Ub 基質 Ub 基質 K6 UbUb Ub 基質 K33 Ub Ub Ub Ub Ub MQIFVKTLTGKTITLEVEPS DTIENVKAKIQDKEGIPPD QQRLIFAGKQLEDGRTLSD YNIQKESTLHLVLRLRGG Ub マルチ-モノユビキチン化 Ub Ub Ub Ub Ub Ub Ub 基質 K11 基質 K27 基質 K29 Ub Ub Ub Ub Ub Ub Ub Ub Ub 基質 K48 基質 K63 基質 M1 Ub Ub Ub Ub P P Ub Ub 基質 基質 基質 分枝鎖 混成鎖 リン酸化 Ub Ub Ub Ub Ac Ub 基質 アセチル化 Ubiquitin の構造と機能 http://mcp.med.kyoto-u.ac.jp/research/ubiquitin-about/ NF-kBは炎症や免疫の中心的なレギュレーター 抗原受容体刺激 TCR 細菌・ウイルス感染 BCR LPS dsRNA 炎症性サイトカイン TNF-a IL-1b 遺伝毒性ストレス 紫外線、放射線 活性酸素種 NF-kB 抗アポトーシス 免疫制御タンパク質 Serum amyloid protein Complement C3 炎症性サイトカイン VCAM TNF-a ICAM IL-1 TCRa, b IL-6 MHC I IL-12 NF-kB抑制 IkBa c-Rel p105 A20 Bcl-XL IAPs G-CSF M-CSF NF-kBシグナルの破綻は多くの疾患を引き起こす 抗原受容体刺激 TCR 細菌・ウイルス感染 BCR LPS dsRNA 炎症性サイトカイン TNF-a 遺伝毒性ストレス IL-1b NF-kB 癌 乳がん 大腸がん 胃がん 肝臓がん 円柱腫 毛包上皮腫 B細胞リンパ腫 多発性骨髄腫 骨髄性白血病 炎症性疾患 自己免疫疾患 炎症性大腸炎 クローン病 皮膚炎 関節リウマチ SLE 多発性硬化症 乾癬 アトピー性皮膚炎 抗がん剤、紫外線、放射線 活性酸素種 神経変性疾患 緑内障 筋萎縮性側索硬化症 パーキンソン病 アルツハイマー病 生活習慣病 糖尿病 アテローム性動脈硬化症 LUBACによる直鎖状ユビキチン鎖を介した NF-kB活性化とその破綻が引き起こす疾患 直鎖状ポリユビキチン鎖 HOIL-1L HOIP SHARPIN LUBAC (Linear ubiquitin chain assembly complex) NF-kB 炎症、免疫制御、細胞生存に 関わる遺伝子の発現調節 Kirisako, T. et al., EMBO J. (2006) Tokunaga, F. et al., Nature Cell Biol. (2009) Tokunaga, F. et al., Nature (2011) Tokunaga, F. et al. EMBO J. (2012) 癌、炎症性疾患、自己免疫疾患、 生活習慣病、神経変性疾患 発表内容 • ALS 克服のための基本戦略 • ALSについて、わかっていることと、わからなかったこと • ユビキチン修飾系とNF-kBシグナル伝達経路の生理機能 • オプチニューリンの直鎖状ユビキチン結合性と病態との関連 （分子細胞生物・構造生物学的解析） • 筋萎縮性側索硬化症(ALS)発症 における意義 （病理学的解析） • 今後の展開 Optineurin (OPTN) は 孤発性・家族性ALSの発症に関与 孤発性ALS SOD1-FALS FUS-FALS Maruyama H, Ito H, et al. Nature 465:223-6, 2010. Ito H, et al. Acta Neuropathol 121:555-7, 2011. 筋萎縮性側索硬化症 (ALS) ALS OPTN Guam/Kii ALS Sporadic ALS Familial ALS (FALS) SOD1 TDP-43 分子メカニズムが異なる FUS Unknown OPTN Unknown ALS の分子病態 Pathological condition ストレス顆粒形成 ？ TDP-43 or FUS 核ｰ細胞質間 輸送障害 封入体 形成 タンパク分解系の異常 オプチニューリン Thomas M, et al. RNA dysfunction and aggrephagy at the centre of an amyotrophic lateral sclerosis/frontotemporal dementia disease continuum. Brain 2013;136:1345-60. NF-κB活性 変異 OPTN は NF-κB抑制作用を喪失 Maruyama H, Morino H, Ito H, et al. Nature 465:223-226, 2010. Optineurin Knockdown cell では 細胞死が誘導される Akizuki M, Ito H* et al. J Neurochem 2013;126:699-704 OPTN の構造 直鎖状ユビキチン結合？ UBAN huntingtin Maruyama H, Morino H, Ito H, et al. Nature 465:223-226, 2010. Q545Q H486R E478G D474N Q454E Q398X E322K Q165X M98K R96L E50K H26D WT 0 (kDa) 80 58 46 30 R96L R96L M98K M98K Q165X Q165X E322K E322K Q398X Q398X Q454E Q454E D474N D474N E478G E478G H486R H486R R545Q Q545Q H26D H26D E50K E50K LUBAC WT NF-κB (fold induction) オプチニューリンのALS型変異体は NF-kB活性抑制能を喪失している 変異; 緑内障 ALS 120 100 80 60 40 20 FLAG-OPTN Respons Respons 60 40 125 nM ()#%&'% 250 nM )#+%&'% 500 nM #++%&'% 500 nM #++%&'% 20 1000 nM (+++%&'% オプチニューリンのUBANドメインは 直鎖状ユビキチンに結合する 40 20 0 -50 0 50 100 150 200 250 300 350 0 400 -50 0 50 100 Time (sec) 200 250 300 350 400 Time (sec) -20 -20 オプチニューリン c 150 d N N a proximal UbNEMO distal UbOPTN distal UbNEMO distal Ub 直鎖状ユビキチン distal Ub distal Ub 直鎖状ユビキチン N proximal UbOPTN dista Ub R74 E16 E16 E478 OPTN/NEMOQ2 R479 distal UbNEMO distal UbOPTN R482 オプチニューリン proximal Ub proximal U Q2 proximal U proximal Ub OPTN proximal Ub proximal Ub OPTN b C C C dista Ub 東京大学大学院理学研究科 濡木理教授との共同研究 dista Ub オプチニューリンが欠損した細胞では NF-kB活性化が亢進する 転写因子の 核移行 オプチニューリンが 欠損した細胞 元の細胞 NF-kB標的遺伝子の発現 3000 2500 2000 1500 1000 500 0 TNF-a (h) 0 1 0 1 HeLa OPTNが OPTN-/--H2 元の 細胞 欠損した 細胞 80 70 60 50 40 30 20 10 0 10 ICAM1 ICAM1(fold (foldinduction) induction) オプチニューリンが 欠損した細胞 BIRC3(fold (foldinduction) induction) BIRC3 元の細胞 IL-6(fold (foldinduction) induction) IL-6 細胞内シグナル 0 2 0 2 -/HeLa OPTN -H2 OPTNが 元の 細胞 欠損した 細胞 8 6 4 2 0 0 1 0 1 HeLa OPTNが OPTN-/--H2 元の 細胞 欠損した 細胞 オプチニューリンが欠損した細胞では アポトーシス（細胞死）が亢進する 生存細胞数解析 100 80 60 80 60 40 40 オプチニューリンが 60 0 Trypanblue-positive blue-positivecells cells(%) (%) Trypan Trypan blue-positive cells (%) 40 60 60 12 24 12 24 +CHX (h) +CHX (h) * * ** ** 20 40 40*** 0 20 *** 20 0 12 TNF- +CHX (h) 0 12 *** HeLa OPTN-/--H2 e 80 120 120 100 100 60 80 80 40 60 60 20 40 40 100 60 60 欠損した細胞 20 40 20 40 40 0 40 12 24 0 12 24 20 20 +CHX (h) TNFTNF(h) 20 20 0 b TNFTNF死細胞数解析 60 bb 120 120 100 80 100 80 80 60 100 元の細胞 80 100 Cellviability viability(%) (%) Cell Cell viability (%) 100 d 120 120 0 0 c 0 12 24 12 24 TNF- (h) TNF- (h) 12 20 CHX 20 (h) 0 0 * 断片化DNA量 2.5 * c c 2.0 2.5 2.5 1.5 *2.0 1.0 0.5 ssDNA ssDNA( ( A405) A405) a 120 120 a 120 ssDNA ( A405) a オプチニュー リンが欠損 元の細胞 -/HeLa OPTN -H2 した細胞 HeLa OPTN-/--H2 TNF- TNF-a (kDa) 82 4 08 2 OPTN 4 8 -/--H2 d +CHX 0 (h) 2TNF4 0 8 2 40HeLa -/58 d +CHX (h) HeLa OPTN -H2 TNF-(h) 0 2 4 8 0 2 4 8 +CHX (kDa) 58 +CHX 0 2 4 846 (h) 0 2 4 8 46 (kDa) 58 (kDa) 58 30 46 30 46 カスパーゼ8 25 25 30 IB: Caspase 8 30 IB: Caspase 8 25 17 25 17 IB: Caspase 8 IB: Caspase 8 17 活性型 17 カスパーゼ活性化 24 30 25 7 30 25 17 17 7 12 24 7 12 24 30 IB: Caspase 3 30 CHX (h) IB: Caspase 3 25 カスパーゼ3 25 CHX (h) ** * * IB: Caspase 3 IB: Caspase 3 IB: cleaved IB: 活性型 cleaved 17 caspase 3 17 caspase カスパーゼ33 17 175cleaved IB: 58 caspase 3 175 46 IB: tubulin175 80 80 IB: PARP 58 58 IB:80 cleaved オプチニューリン IB: OPTN 17 caspase 3 17 2.0 1.5 1.5 1.0 1.0 7 カスパーゼ8 ** 0 24 0 24 TNF- +CHX (h) 0 0.5 0.5 OPTN-/--H2 HeLa 00 0 0 0 24 248 00 24 24 0 12 00 12 Lysate IP: TNF+CHX (h)caspase TNF+CHX (h) 0 12 TNF+CHX (h) TNF- +CHX (h) 0 12 -/-/-/-OPTNが -/元の HeLa OPTN -H2 HeLa OPTN -H2 HeLa OPTN -H2 -/--H2 HeLa OPTN HeLa OPTN-/--H2 TNF元の TNFOPTNが HeLa OPTN -H2 細胞 欠損した 0 3 6 0 3 6 3 6 0欠損した 3 6 +CHX (h) ee +CHX (h) 0 細胞 細胞88 Lysate IP: caspase caspase IB: RIP1 IB: RIP1 Lysate IP: 細胞 -/HeLa OPTN OPTN-/--/--H2 -H2 HeLa HeLa HeLa OPTN OPTN-/--H2 -H2 TNF- 30 25 46 46 17 30 30 25 25 IB:PARP PARP IB: 7 IB: RIP1 IB: FADD 17 17 17 58 46 本研究の分子細胞生物・構造生物学 的解析で明らかになったこと 1) オプチニューリンはUBANドメインのE478で 直鎖状ユビキチンに結合する 2) オプチニューリンのALS型変異体はNF-kB 活性抑制能を喪失しており、オプチニューリン が欠損した細胞ではNF-kB活性が亢進する 3) オプチニューリンが欠損した細胞では活性型 カスパーゼ３・８が増加しており、アポトーシス が亢進する 発表内容 • ALS 克服のための基本戦略 • ALSについて、わかっていることと、わからなかったこと • ユビキチン修飾系とNF-kBシグナル伝達経路の生理機能 • オプチニューリンの直鎖状ユビキチン結合性と病態との関連 （分子細胞生物・構造生物学的解析） • 筋萎縮性側索硬化症(ALS)発症 における意義 （病理学的解析） • 今後の展開 オプチニューリンは細胞の生と死のシグナルを制御、 その破綻はALSを発症させる 正常型オプチニューリンの場合 HOIL-1L HOIP SHARPIN TNFa TNFa TNF受容体 TNF受容体 HOIL-1L HOIP SHARPI N 複合体I RIP1 IKKa M1 M1 NEMO M1 P IKKa M1 IKKb M1 NEMO M1 P IKKb M1 複合体II オプチニューリン IkBa p50 p65 複合体I RIP1 IKKa M1 M1 NEMO M1 P IKKa M1 IKKb M1 NEMO M1 P IKKb M1 複合体II M1 M1 P ＡＬＳ型オプチニューリン変異の場合 RIP1 FADD カスパーゼ 8 P IkBa p50 オプチニューリン ALS型変異体 RIP1 FADD カスパーゼ 8 p65 M1 M1 NF-kB 活性抑制 細胞死抑制 NF-kB 異常活性化 p65 M1 p65 M1 p65 M1 細胞質内封入体 ALS 細胞死亢進 OPTN 変異を伴う FALS 優性型 (E478G) 劣性型 (Q398X) OPTN 変異を伴う FALS （E478G）にも TDP-43 陽性封入体が出現する 優性型 (E478G) 劣性型 (Q398X) TDP-43 TDP-43 pTDP-43 OPTN-ALS患者の運動ニューロン封入体には 直鎖状ポリユビキチン鎖と活性型NF-kBが共局在 コントロール 直鎖状ユビキチン 活性型NF-kB （リン酸化p65) E478G変異 Q398X変異 直鎖状ポリユビキチン鎖・活性型NF-kBは ALS患者のTDP-43凝集体と共局在する OPTN-ALS患者の運動ニューロンでは 細胞死を司る酵素（カスパーゼ）が活性化している コントロール 活性型カスパーゼ３ 活性型カスパーゼ8 E478G変異 Q398X変異 ALS の分子病態 Pathological condition Cell death 封入体 形成 NF-kB 異常活性化 カスパーゼ活性化 直鎖状ユビキチン鎖 OPTNの封入体 への取り込み OPTN機能障害 Thomas M, et al. RNA dysfunction and aggrephagy at the centre of an amyotrophic lateral sclerosis/frontotemporal dementia disease continuum. Brain 2013;136:1345-60. 本研究の神経病理学的解析で 明らかになったこと 1) オプチニューリン変異ALS患者3例の運動 ニューロンに出現するTDP-43陽性封入体に、 直鎖状ユビキチン鎖と活性化NF-κBが共存 している。 2) OPTN-ALS患者の運動ニューロンでは、細胞 死を司るカスパーゼ３・８が活性化している。 3) オプチニューリン機能障害によるNF-κBの異常 活性化とアポトーシスの亢進が、ALSに共通の 細胞死メカニズムである可能性がある。 発表内容 • ALS 克服のための基本戦略 • ALSについて、わかっていることと、わからなかったこと • ユビキチン修飾系とNF-kBシグナル伝達経路の生理機能 • オプチニューリンの直鎖状ユビキチン結合性と病態との関連 （分子細胞生物・構造生物学的解析） • 筋萎縮性側索硬化症(ALS)発症 における意義 （病理学的解析） • 今後の展開 まとめと今後の展開 ＡＬＳ型オプチニューリン変異の場合 新たな創薬標的 の可能性 HOIL-1L HOIP SHARPIN LUBAC P RIP1 IKKa M1 IKKa TNF受容体 M1 NEMO M1 P IKKb ・アルツハイマー病、パーキンソン病などユビ キチン陽性凝集体形成を伴う神経変性疾患 に関連するユビキチンの連結を詳細に解析し、 発症に至る細胞メカニズムを解析する。 複合体 I M1 NEMO M1 IKKb M1 M1 M1 ・孤発性ALSや他の遺伝子変異に起因する 家族性ALSにおいても、直鎖状ユビキチン 鎖生成を介するNF-kB活性亢進という、同 様の細胞応答が見られるか確認する。 複合体 II RIP1 P IkBa p50 オプチニューリン ALS型変異体 p65 FADD カスパーゼ8 M1 M1 NF-kB 異常活性化 p65 M1 p65 M1 p65 M1 細胞質凝集体 ALS 細胞死亢進 ・ALS治療薬開発を目的にLUBACの活性阻 害剤探索を行う。 ありがとうございました。
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