試薬キット到着後の保存状態 Lysis Buffer 室温 Bind I Buffer 室温 Bind

FormaPure-2 070108
Agencourt FormaPure Kit プロトコール
キット内容物の保存条件
試薬
キット到着後の保存状態
Lysis Buffer
室温
Bind I Buffer
室温
Bind II Buffer
4℃
Wash Buffer
室温
Proteinase K
-20℃
Proteinase K Buffer
室温
抽出精製プロトコール
（１）キット初回使用時のみのステップ：Proteinase K に専用バッファー（PK Buffer）を下
記用量（40mg/mL）加え、よく溶解する（高濃度の溶液のため、泡立ちに気をつけながら溶
解する）。溶液はマイナス 20℃で保存する。
添加するPKBuffer量
50 Prep Kit 96 Prep Kit 384 Prep Kit
1.2mL
2.3mL
2.3mL/tube
＊50 サンプル用キット（FormaPure Kit – Small もしくは FormaPure Starter Kit）の場合は、PK チューブに
Proteinase K Buffer を直接加える。96 サンプル用キット（FormaPure Kit – Medium）あるいは 384 サンプル
用キット（FormaPure Kit – Large）の場合は、別の容器で溶解する。
（２）キット初回使用時のみのステップ：Wash Buffer に 100%イソプロパノールを下記用
量で加える。よく混和し、室温に保存する。
50 Prep Kit 96 Prep Kit 384 Prep Kit
添加するisopropanol量
15mL
28mL
112mL/tube
＊ステップ（１）
（２）はキット初回使用時のみのステップ。２回目以降のキット使用は下記ステップ１よ
り始める。
１．１サンプルあたり 20uL の Binding Buffer II と 300uL の 100%イソプロパノールを混合す
る（用事調整：例
10 サンプルの場合、200uL の Binding Buffer II と 3mL の 100%イソプロ
パノールを混和する）。
２．チューブもしくは 96 ウェルプレートに、Lysis Buffer を 200uL 分注する。
３．FFPE 切片（10 ミクロンを 1～5 切片：10mg まで）をチューブもしくは 96 ウェルプレ
ートに入れ、70～72℃で 60 分インキュベート。
＊このインキュベーションを過度に行うと RNA にダメージを与える場合があるので注意が必要。
４．ステップ（１）で調整した PK 溶液 20uL を加え、よく混和する（ピペッティング 2 回
以上）。
５．55℃で 60 分インキュベートする。続いて 2 分間、氷上で冷やす。
６．上記ステップ５のライゼートを、新たなチューブもしくは 96 ウェルプレートに移す。
７．150uL の Bind I Buffer と、ステップ１で調整した 320uL の Bind II Buffer を加える。ピ
ペッティング 5 回以上でよく混ぜた後、55℃で 5 分間インキュベートする。
８．Magnetic 6-tube Stand もしくは Ring Super Magnet Plate 上で 5 分間静地。
＊溶液が透明になったことを確認した上で次のステップに進む。
９．Magnetic 6-tube Stand もしくは Ring Super Magnet Plate 上に、チューブもしくは 96 ウェ
ルプレートを静地したまま、磁性ビーズに触れないように溶液をピペッティングで吸い取
る。
＊この操作は Magnetic 6-tube Stand にチューブを静置いたまま、もしくは Ring Super Magnet Plate 上に 96
ウェルプレートを静地したまま行う。寄せられた磁性ビーズが溶液内で崩れてしまった場合は、数 uL の上
清を残す。
RNA のみの抽出：ステップ１３に進む（DNase 処理を行う場合はステップ１０～１２の洗
浄は必要無い）。
DNA および RNA の同時抽出：下記ステップに進む。
１０．Magnetic 6-tube Stand もしくは Ring Super Magnet Plate から、チューブもしくは 96 ウ
ェルプレートを移動させ、300uL の Wash Buffer を加える。ピペッティング 5 回以上でよく
混和後、1 分間放置。
１１．続いて Magnetic 6-tube Stand もしくは Ring Super Magnet Plate 上で、チューブもしく
は 96 ウェルプレートを 1 分間静地。
＊溶液が透明になったことを確認した上で次のステップに進む。
１２．磁性ビーズに触れないように溶液をピペッティングで吸い取る。
＊この操作は Magnetic 6-tube Stand にチューブを静置いたまま、もしくは Ring Super Magnet Plate 上に 96
ウェルプレートを静地したまま行う。寄せられた磁性ビーズが溶液内で崩れてしまった場合は、数 uL の上
清を残す。
１３．Magnetic 6-tube Stand もしくは Ring Super Magnet Plate から、チューブもしくは 96 ウ
ェルプレートを移動させ、750uL の 70%エタノールを加える。ピペッティング 5 回以上で磁
性ビーズを良く混和する。
１４．Magnetic 6-tube Stand もしくは Ring Super Magnet Plate 上に、チューブもしくは 96 ウ
ェルプレートを 1 分間静地。
＊溶液が透明になったことを確認した上で次のステップに進む。
１５．磁性ビーズに触れないように溶液をピペッティングで吸い取る。
＊この操作は Magnetic 6-tube Stand にチューブを静置いたまま、もしくは Ring Super Magnet Plate 上に 96
ウェルプレートを静地したまま行う。寄せられた磁性ビーズが溶液内で崩れてしまった場合は、数 uL の上
清を残す。
RNA のみの抽出：下記ステップに進む。
DNA および RNA の同時抽出：ステップ２１に進む。
１６． Magnetic 6-tube Stand もしくは Ring Super Magnet Plate から、チューブもしくは 96
ウェルプレートを移動させ、調整した 100uL の DNase 溶液を加える。
＊DNase 溶液を用事調整する―80uL のヌクレアーゼフリー水と、10uL の 10X DNase buffer（cat# 8170G,、
Ambion 社）、10uL の DNaseI（cat#2222、Ambion 社）を混和する。
１７．ピペッティング 5 回以上で DNase 溶液と磁性ビーズを良く混和後、37℃で 15 分間イ
ンキュベートする。
１８．550uL の Wash Buffer を加え、ピペッティング 5 回以上で良く混合する。その後、室
温で 10 分間インキュベート。
＊DNase 溶液を除かず、ステップ２０後のチューブもしくは 96 ウェルプレートに直接 Wash Buffer を加え
る。
１９．Magnetic 6-tube Stand もしくは Ring Super Magnet Plate 上に、チューブもしくは 96 ウ
ェルプレートを 10 分間静地。
＊溶液が透明になったことを確認した上で次のステップに進む。
２０．磁性ビーズに触れないように溶液をピペッティングで吸い取る。
＊この操作は Magnetic 6-tube Stand にチューブを静置いたまま、もしくは Ring Super Magnet Plate 上に 96
ウェルプレートを静地したまま行う。寄せられた磁性ビーズが溶液内で崩れてしまった場合は、数 uL の上
清を残す。
２１．Magnetic 6-tube Stand もしくは Ring Super Magnet Plate から、チューブもしくは 96 ウ
ェルプレートを移動させ、750uL の 70%エタノールを加える。ピペッティング 5 回以上で磁
性ビーズを良く混和する。
２２．Magnetic 6-tube Stand もしくは Ring Super Magnet Plate 上に、チューブもしくは 96 ウ
ェルプレートを 5 分間静地。
＊溶液が透明になったことを確認した上で次のステップに進む。
２３．磁性ビーズに触れないように溶液をピペッティングで吸い取る。
＊この操作は Magnetic 6-tube Stand にチューブを静置いたまま、もしくは Ring Super Magnet Plate 上に 96
ウェルプレートを静地したまま行う。寄せられた磁性ビーズが溶液内で崩れてしまった場合は、数 uL の上
清を残す。
２４．Magnetic 6-tube Stand もしくは Ring Super Magnet Plate から、チューブもしくは 96 ウ
ェルプレートを移動させ、500uL の 90%イソプロパノールを加える。ピペッティング 5 回以
上で磁性ビーズを良く混和後、70℃で 3 分間インキュベートする。
２５．Magnetic 6-tube Stand もしくは Ring Super Magnet Plate 上に、チューブもしくは 96 ウ
ェルプレートを 1 分間静地。
＊溶液が透明になったことを確認した上で次のステップに進む。
２６．磁性ビーズに触れないように溶液をピペッティングで吸い取る。
＊この操作は Magnetic 6-tube Stand にチューブを静置いたまま、もしくは Ring Super Magnet Plate 上に 96
ウェルプレートを静地したまま行う。
２７．２４～２６の 90%イソプロパノールによる洗浄ステップをもう 1 度繰り返す。
２８．Magnetic 6-tube Stand もしくは Ring Super Magnet Plate から、チューブもしくは 96 ウ
ェルプレートを移動させ、750uL の 70%エタノールを加える。ピペッティング 5 回以上で磁
性ビーズを良く混和する。
２９．Magnetic 6-tube Stand もしくは Ring Super Magnet Plate 上に、チューブもしくは 96 ウ
ェルプレートを 1 分間静地。
＊溶液が透明になったことを確認した上で次のステップに進む。
３０．磁性ビーズに触れないように溶液をピペッティングで吸い取る。
＊この操作は Magnetic 6-tube Stand にチューブを静置いたまま、もしくは Ring Super Magnet Plate 上に 96
ウェルプレートを静地したまま行う。寄せられた磁性ビーズが溶液内で崩れてしまった場合は、数 uL の上
清を残す。
３１．10 分間静地し、風乾。
＊エタノールの残留が見えないまで十分静地するが、過度に風乾しない。
３２．Magnetic 6-tube Stand もしくは Ring Super Magnet Plate から、チューブもしくは 96 ウ
ェルプレートを移動させ、80uL のヌクレアーゼフリー水を加える。ピペッティング 5 回以
上で磁性ビーズをリサスペンド後、65～70℃で 30 秒間インキュベートする。
＊溶出液量はサンプル量や下流のアプリケーションに合わせて変動させることができるが、少なくとも
40uL は必要。潜在的な磁性ビーズのキャリーオーバーのリスクを減らすためには、溶出液量を増やす。
３３．Magnetic 6-tube Stand もしくは Ring Super Magnet Plate 上に、チューブもしくは 96 ウ
ェルプレートを移し、1 分間静地後、核酸溶出液を分取する。
＊溶液が透明になったことを確認した上で溶出液を分取する。

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