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LC-MS/MS-Analyse von Hormonen und Pestiziden in Laborwasser vor
und nach der Aufreinigung
Seit
einigen
Jahren
wird
Flüssigkeitschromatographie
die
Kopplung
(HPLC)
oder
von
Hochleistungs-
Ultra-Hochleistungs-
Flüssigkeitschromatographie (UHPLC) mit der Massenspektrometrie für
Spuren- und Ultraspurenanalysen organischer Verbindungen eingesetzt, um
auf die Bedenken hinsichtlich der Gesundheit und Sicherheit von Mensch und
Umwelt einzugehen. So wurden zum Beispiel Kontaminanten, hinsichtlich
derer zunehmend Besorgnis besteht (CEC), wie Hormone, Pharmazeutika
und polare Pestizide, in Umwelt- und Trinkwasser auf der ganzen Welt
gefunden, wenn auch nur in Spuren. 1,2 CEC haben eine potenziell
ökotoxische Wirkung, und zwar sogar in sehr geringer Konzentration. 3 Um
sich dieser Bedenken hinsichtlich verstärkt auftretender Kontaminanten
anzunehmen, haben die amerikanische Umweltbehörde EPA 4 und die
Europäische
Kommission5
verschiedene
Weiterentwicklungen
in
neue
Verordnungen und Zulassungsverfahren einfließen lassen. Ein weiterer
Bereich, der von Bedenken hinsichtlich der Sicherheit von Mensch und
Umwelt betroffen ist, ist der Bereich der landwirtschaftlich erzeugten
Lebensmittel, der sich in letzter Zeit gezwungen sah, detailliertere
Beschreibungen der Nahrungskette zu liefern, also vom Rohmaterial bis zum
fertigen Produkt. Dies soll den Forderungen der Öffentlichkeit nach mehr
Sicherheit hinsichtlich Qualität, Sicherheit und Herkunft der konsumierten
Nahrungsmittel
nachkommen.
Dies
umfasst
die
Messung
von
Spurenkomponenten, die erwünscht (z. B. Polyphenole), unerwünscht
(Spuren von Pestiziden) oder verboten (z. B. Toxine) sind. 6
Auf dem Gebiet der Flüssigkeitschromatographie-Massenspektrometrie (LCMS) stehen heute dank Weiterentwicklungen bei Hardware und Säulen
verlässliche Systeme zur Verfügung, die konsistente und zuverlässige
Ergebnisse liefern.7 Außerdem wurde durch Verbesserungen der Instrumente
bei gleichzeitigem raschen Fortschritt der analytischen Methoden ermöglicht,
Verbindungen
auch
in
Spuren-
und
Ultraspurenkonzentrationen
1
nachzuweisen.8 Es ist daher für die auf dem Gebiet der Ultraspurenanalyse
von organischen Substanzen arbeitenden Wissenschaftler wichtig, sich stets
vor Augen zu halten, dass Kontaminationen auch mit sehr geringen
Konzentrationen bedenklich sind. Komponenten des HPLC- oder UHPLCGerätes, das Massenspektrometer, 9 die Handhabung und Aufbereitung der
Proben sowie1 die zur Analyse verwendeten Reagenzien und Lösungsmittel
können alle zur Kontamination beitragen.
Wasser spielt beim HPLC- und UHPLC-Verfahren eine große Rolle und wird
extensiv während des gesamten Arbeitsablaufs eingesetzt. Spuren- und
Ultraspurenanalysen, die diese Techniken verwenden, erfordern ein sehr
geringes Rauschen der Basislinie.10 Es ist daher wichtig, die Eignung des für
diese Analysen verwendeten Reinstwassers zu überprüfen. Ionisierbare
organische Kontaminanten im Wasser erhöhen das Hintergrundrauschen,
was wiederum die Sensitivität verringert. Bei Gradiententrennungen unter
Verwendung von Reversed-Phase-Säulen erfordert der Equilibrierungsschritt
in der Regel 5 bis 10 Säulenvolumina der anfänglichen mobilen Phase, 11,12 die
einen hohen Wasseranteil aufweist. Die organischen Kontaminanten der
wässerigen mobilen Phase lagern sich am Kopf der Säule an und lösen sich
als Peaks in nachfolgenden Gradientenläufen auf. Das Auftreten von einem
oder mehreren Fremdpeaks im Chromatogramm ist für jene entscheidend, die
unbekannte, in der Probe enthaltene, Verbindungen identifizieren wollen. Ein
Fremdpeak kann
leicht fälschlich als Probenkomponente
angesehen
werden.13
Angesichts der niedrigen Detektionsgrenzen, die heute mit modernen
HPLC/UHPLC- und MS-Geräten möglich sind, und den äußerst geringen
Konzentrationen, um die es sich bei Spuren- und Ultraspurenanalysen
handelt, ist es wichtig festzustellen, dass die detektierten Analyten tatsächlich
von der Probe und nicht von dem in den verschiedenen Schritten des
Experiments verwendeten Wasser stammen. In dieser Studie haben wir
gezeigt, dass ein Laborwasseraufbereitungssystem die im Leitungswasser
enthaltene CECs (Hormone und Pestizide) entfernt, sodass Reinstwasser
2
entsteht, das frei von Kontaminanten ist, die die Genauigkeit und Sensitivität
der Spuren- und Ultraspurenanalysen beeinträchtigen würden.
EXPERIMENT
Geräte, Chromatographie- und MS-Bedingungen
Für die Analyse auf Hormone wurde ein Agilent 1290 Infinity ® HPLC-System
mit dem Agilent® 6420 Triple Quadrupole LC-MS-System gekoppelt. Bei der
Säule handelte es sich um eine Purospher ® STAR RP-18 endcapped (2 µm)
Hibar® HR 50-2.1 mm (Merck Millipore). Für die Detektion von Hormonen
wurde das LC-MS/MS-Verfahren verwendet. Die Geräteparameter von HPLC
und MS für LC-MS/MS sind in Tabelle 1 aufgeführt. Die MRM (Multiple
Reaction
Monitoring)-Übergänge sind Tabelle 2
Konzentrationen
von
neun
Hormonen
wurden
zu
entnehmen. Die
nach
dem
Standard-
Additionsverfahren gemessen.
Tabelle 1. HPLC- und MS-Parameter für LC-MS/MS (Hormonanalyse) und
LC-MS (Pestizidvoruntersuchungen) unter Verwendung der Agilent ® 1290
HPLC- und Agilent® 6420 Triple Quadrupole-Systeme (QQQ).
HPLC-Bedingungen
MS-Bedingungen
®
Purospher STAR Ionisationsmodus
Säule
RP-18e (2µm) 50- für
2.1
Fließrate
0,5 ml/min
Injektionsvolume
40 µl Probe, 10 µl
n
Standard
1 % Essigsäure in
Eluent A
Milli-Q® Wasser
Acetonitril
(LiChrosolv®
Eluent B
Gradient
min; % B)
(Zeit,
Hypergrade)
0, 0 %; 2, 0 %; 5,
ESI+, MRM
Hormonanalysen
Ionisationsmodus
ESI+ 0-6 min,
für
ESI- 6-13 min;
Pestizidanalysen
scan
Kapillaren
4000 V
Zerstäuber
37 psi
Trockengas
N2, 7,5 l/min,
300 oC
100 %; 6, 100 %;
9, 0 %; 13, 0 %
3
Tabelle 2. Multiple Reaction Monitoring (MRM)-ESI+-Übergänge für die
Hormone (intensivstes Fragment in fettgedruckt, die Reihenfolge der
Fragmente nach relativer Intensität)
Verbindung
Androstendion
Androsteron
Corticosteron
Cortison
Östradiol
Östron
Progesteron
OH-Progesteron
Testosteron
Vorstufenion (m/z)
287
291
347
361
273
271
315
331
289
Fragmente (m/z)
97, 269, 109
273, 255, 174
329, 311, 293
343, 163, 325
255, 159, 135
253, 157, 197
297, 97, 279
313, 295, 271
96, 253, 271
Voruntersuchungen zur Anwesenheit von Pestiziden in Wasserproben
erfolgten mittels LC-MS. Die Pestizide wurden vorläufig durch Zuordnung zu
m/z-Werten identifiziert.
In einer separaten Analysereihe wurde ein Pestizid-Screeningverfahren durch
die Waters Corporation durchgeführt; dabei wurde die in Tabelle 3(b)
beschriebene Mischung von 18 Pestizid-Standards verwendet. Ein ACQUITY ®
UPLC-System wurde mit einem Xevo ® G2-S QTof-Massenspektrometer
gekoppelt; die Parameter sind Tabelle 4 zu entnehmen.
Tab 3. Liste der Pestizide, die mittels LC-MS (a) unter Verwendung der
Systeme Agilent® 1290 HPLC und Agilent® 6420 Triple Quadrupole und
mithilfe des UHPLC-MS-Verfahrens (b) unter Verwendung des ACQUITY ®
UPLC-Systems
in
Kopplung
mit
Massenspektrometer analysiert wurden.
4
einem
Xevo ®
G2-S
QTof-
(a) LC-MS (QQQ)
Atrazin
Diethylatrazin
Simazin
Propazin
Cyanazin
2,4-Dichlorophenoxyessigsäure
2,4,5-Dichlorophenoxyessigsäure
Paraquat
Plyphosat
(b) UHPLC-MS (QTOF)
Methamidophos
Monolinuron
Acephat
Chlortoluon
Methomyl
Metobromuron
Dichrotophos
Atrazin
Atrazin-desethyl
Linuron
Metoxuron
Sebuthylazin
Cyanazin
Terbuthylazin
Simazin
Metolachlor
Hexazinon
Buprofezin
Tab 4. UHPLC-MS-Parameter für das Pestizid-Screening mit dem ACQUITY ®
UPLC-System und dem Xevo® G2-S QTof-Massenspektrometer.
UHPLC-Bedingungen
MS-Bedingungen
®
ACQUITY
BEH
Säule
Ionisationsmodus
C18 2.1x100mm
Flussrate
0,450 ml/min
Injektionsvolume
100 µl
Kapillarspannung
n
10
ml
Eluent A
Ammoniumacetat
(pH5) in 990 ml
ESI+, MSE
1,00 kV
Konus
20 V
Quellentemperatur
120 °C
Milli-Q® Wasser
10
ml
Eluent B
Ammoniumacetat
(pH5) in 990 ml
MeOH
0, 2%; 0,25, 2%;
Gradient
min; % B)
(Zeit, 12,25,
99%;
13, Desolvatisierung
99%; 13,01, 2%; (Stickstoff)
1000 l/h, 550
°C
17, 2%
Proben und Standards
Für die Hormonanalysen mithilfe des LC-MS/MS-Verfahrens und für die
Voruntersuchungen zu den Pestiziden mit der LC-MS-Methode wurden
5
Proben aus Laboratorien in Finnland, Frankreich, Spanien, China und Indien
herangezogen. Es gab zwei Probensätze: (1) Leitungswasser und (2)
Reinstwasser
von
Milli-Q-
Wasseraufbereitungssystemen.
Vor
der
Probenahme wurden zwei Liter Wasser verworfen; zum Auffangen des
Wassers wurden Borosilikatglas-Flaschen verwendet, die vor der Verwendung
drei Mal mit Reinstwasser gespült wurden. Diese Flaschen wurden mit
Reinstwasser und mittels Beschallung gründlich gereinigt, mit Aceton und
Reinstwasser gespült, danach getrocknet und fest verschlossen, sodass sie
zur Verwendung bereit waren. Ein-Liter-Proben wurden vor der Analyse mit
LC-MS/MS mit Festphasenextraktion (SPE) angereichert. Merck Millipore
LiChrolut® EN (Divinylbenzol-basiertes Polymer) wurde für die Proben aus
Frankreich, Finnland, China und Indien verwendet, während Phenomenex ®
Strata-X™
(Divinylbenzol-basiertes
Polymer) für
die
Proben
aus
dem
spanischen Labor verwendet wurde.
Im
Pestizid-Screeningexperiment
wurden
sechs
Sätze
aus
Pestizidmischungen unter Verwendung der Standards vorbereitet, wobei die
finalen Konzentrationen für jedes Pestizid 1, 5, 10, 50, 100 und 1000 ng/l
betrugen. Frisch erzeugtes Milli-Q® Wasser wurde zur Vorbereitung von
Leerproben, Standards und der mobilen Phase verwendet, um jede vom
Wasser ausgehende Interferenz zu ermitteln.
Wasseraufbereitungssysteme
Die Milli-Q® Systeme produzieren Reinstwasser mit einem Widerstand von
18,2 MΩ·cm und einem Gesamtkohlenstoffgehalt (TOC) unter 5 µg/l (außer in
Indien, wo der TOC-Wert 48 ppb beträgt).
Experiment
Finnland
Frankreich
Spanien
China
Indien
6
Verwendetes Wasseraufbereitungssystem
Milli-Q® Integral
Milli-Q® Integral mit LC-Pak® Polisher
Elix® + Milli-Q® Advantage A10® mit Millipak®
Filter
Elix® + Milli-Q® Advantage A10® mit Millipak®
Filter
Milli-Q® Integral
ERGEBNISSE UND DISKUSSION
Wasser, das für Spuren- und Ultraspurenanalysen mit HPLC (UHPLC)MS/MS verwendet wird, sollte die geringstmögliche Konzentration an
organischen Kontaminanten enthalten, damit die Genauigkeit der Analyse
sichergestellt ist und eine optimale Sensitivität durch das Gerät gewährleistet
ist.
LC-MS/MS-Detektion von Hormonen im Leitungs- und Reinstwasser von
Laboratorien
Von den fünf analysierten Leitungswasserproben (aus Laboren in Finnland,
Frankreich, Spanien, China und Indien) wurden Östradiol und Androsteron in
den
Leitungswasserproben
der
Labore
in
Frankreich
und
Spanien
nachgewiesen, während Corticosteron in der chinesischen Wasserprobe
detektiert wurde (Abbildung 1).
(A)
7
(B)
(C)
Abbildung 1. MRM-Chromatogramme von Hormonen in Leitungswasser von
Laboren und nach der Aufbereitung (A) Östradiol (B) Androsteron (C)
Corticosteron
Hormonkonzentrationen in Leitungswasserproben
Östradiol ist ein natürlich vorkommendes Steroidöstrogen und stammt von
menschlichen
Ausscheidungen
(Harn)
und
verschreibungspflichtigen
Arzneimitteln.14 Es wurde in verschiedenen aquatischen Systemen detektiert,
einschließlich
jenen,
die
als
Trinkwasserquellen
dienen. 15
Die
Leitungswasserproben wurden dreifach auf die Anwesenheit von Hormonen
analysiert. Die Östradiolkonzentrationen im Leitungswasser der französischen
Probe lag bei 265,4 ng/l, in der spanischen Probe bei 297,9 ng/l. Androsteron
ist ein androgenes Steroidhormon, das von Mensch und Tier ausgeschieden
8
wird
und
über
kommunales
oder
landwirtschaftliches
Abwasser
in
Oberflächengewässer gelangen kann.16 Die Androsteron-Konzentration in
Leitungswasser von Laboren betrug 515,3 ng/l in Frankreich und 1635 ng/l in
Spanien. Corticosteron wurde mit einer Konzentration von 14,91 ng/l in
Leitungswasser von chinesischen Laboren nachgewiesen.
Hormonkonzentrationen in Reinstwasserproben
Die Laboratorien in Finnland, Frankreich, Spanien, China und Indien
verfügten über Aufbereitungssysteme zur Erzeugung von Reinstwasser aus
Leitungswasser. Das Reinstwasser wurde dreifach auf die Anwesenheit von
Hormonen analysiert. In Frankreich, Spanien und China, wo Spuren von
Hormonen im Leitungswasser der Labore gefunden worden waren, ließen
sich im damit erzeugten Reinstwasser keine Hormone mehr nachweisen. Die
Wasseraufbereitungssysteme der Labore hatten die im Leitungswasser
enthaltenen Spuren von Hormonen erfolgreich aus dem Wasser entfernt.
Tabelle 5 fasst die Ergebnisse der Untersuchung auf Hormone zusammen.
Tab 5. Hormonkonzentrationen im Leitungswasser von Laboren und im damit
* hergestellten Reinstwasser
Hormon
Östradiol
Androsteron
Konzentration (ng/l)
Leitungswasserproben
Nach Aufreinigung
265,4
Nicht nachweisbar
297,9
Nicht nachweisbar
515,3
Nicht nachweisbar
1635
Nicht nachweisbar
14,9
Nicht nachweisbar
Corticosteron
Gerätespezifische Nachweisgrenze (IDL): 10 - 50 ng/l
Methodenspezifische Nachweisgrenze (MDL): 10 - 50 pg/l
*Alle hier angegebenen Daten beziehen sich auf einen einmaligen Analysezeitpunkt und
einen einzigen Standort und sind nicht repräsentativ für das Wasser in den verschiedenen
Ländern, aus denen die Proben stammten.
9
Voruntersuchungen mit LC-MS auf Pestizide in Leitungswasser und
Reinstwasser von Laboratorien
Für die Voruntersuchungen auf die Anwesenheit von Pestiziden in
Leitungswasser und dem daraus erzeugten Reinstwasser wurde das LC-MSVerfahren
verwendet.
Abbildung
2
zeigt
das
extrahierte
Ionen-
Chromatogramm von 2,4,5-Trichlorphenoxy-Essigsäure in Leitungswasser
(schwarze Linie), das in ein Wasseraufbereitungssystem eines spanischen
Labors eingespeist wurde. Die Peaks bei 9,6 und 10,5 min weisen auf das
wahrscheinliche
Vorliegen
von
2,4,5-Trichlorphenoxyessigsäure
im
Leitungswasser hin. Die Peaks zeigen sich nicht mehr, nachdem das Wasser
aufbereitet wurde (Abildung 2. blaue Linie). Diese Voruntersuchungen
sprechen dafür, dass das Wasseraufbereitungssystem der Labore die Spuren
organischer Substanzen mit m/z-Werten, die den für die Analysen
ausgewählten Pestiziden entsprechen, erfolgreich entfernen konnte. Die
Ergebnisse rechtfertigen weitere Untersuchungen, da es keine Interferenzen
durch Pestizide oder andere Verbindungen, die möglicherweise dieselbe
Masse besitzen, gab.
Abbildung 2. Extrahiertes Ionen-Chromatogramm von 2,4,5-TrichlorphenoxyEssigsäure in Leitungswasser und dem damit erzeugten Reinstwasser eines
spanischen Labors
10
Pestizid-Screening
Das Pestizid-Screening mithilfe von UHPLC-MS (QTOF) erfordert die
Verwendung von Reinstwasser zur Herstellung der mobilen Phase,
Standards, Leerproben und Proben. Bei Laboranalysen sind die in der Probe
enthaltenen Analyten in der Regel in Konzentrationen im ng/l-Bereich und oft
sogar in Konzentrationen unter 10 ng/l vorhanden. Die Mischung von
Standards kann verwendet werden, um die Eignung von Reinstwasser und
die Leistung der UHPLC-MS (QTOF)-Technologie für die Analyse von
Pestiziden in geringer Konzentration zu beurteilen. Es erscheint somit
offensichtlich, dass die Auswirkung einer Kontamination des Wassers stärker
ausgeprägt ist, wenn Standards mit geringer Pestizidkonzentration analysiert
werden. Aus diesem Grund wurde die Eignung von Reinstwasser für eine
Pestizid-Screeningmethode damit getestet, dass mit dem Reinstwasser
Mischungen bekannter Pestizidkonzentrationen im ng/l-Bereich, konkret mit 1,
5, 10, 50, 100 und 1000 ng/l, sowie Leerproben und die wässerige mobile
Phase hergestellt wurden. Im Ergebnis wurden in der ReinstwasserLeerprobe keinerlei Pestizide nachgewiesen. Zudem wurden die Standards
mit geringen Konzentrationen bei ihren anfänglichen Konzentrationen ohne
vom Reinstwasser stammende Interferenzen erfolgreich detektiert. Insgesamt
hat
die
Verwendung
von
Reinstwasser
höchster
Qualität
zu
der
hervorragenden Leistung der UHPLC-MS (QTOF)-Technologie und damit zum
Erfolg der Analytik beigetragen. Abbildung 3 zeigt ein Beispiel eines
Kalibrierungsdiagramms aus dem Pestizid-Screeningexperiment.
11
Abbildung 3. Kalibrierungsdiagramm für Simazin
Die Bedeutung der Gesamtkohlenstoffkonzentrationen (TOC) in Wasser
Das Ausmaß einer Kontamination mit organischen Substanzen ist bei der
Spurenanalyse
organische
mit
LC-MS/MS
Kontaminanten
im
von
außerordentlicher
Wasser
die
Leistung
Wichtigkeit,
des
da
Gerätes
beeinträchtigen und damit auch die Qualität der erzeugten Daten negativ
beeinflussen. Eine organische Kontamination des Wassers, das zur
Herstellung der mobilen Phase verwendet wird, könnte das Rauschen an der
Basislinie verstärken, was zu einer Verringerung des Signal-Rausch (S/N)Verhältnisses führen und die Detektion geringer Analytenkonzentrationen
erschweren würde. Es könnte auch zu Geisterpeaks führen und damit die
Interpretation der Daten zur wahren Herausforderung werden lassen.
Die Konzentration an gesamtem oxidierbarem Kohlenstoff (TOC) stellt einen
generellen Indikator für eine Kontamination des Wassers mit organischen
Substanzen dar. Für das LC-MS/MS-Verfahren wird ein TOC-Wert von unter 5
ppb empfohlen. Laborwasseraufbereitungssysteme, wie die bei den hier
beschriebenen Experimenten verwendeten, sind mit integrierten TOCMonitoren ausgestattet, damit der Anwender den TOC-Wert des verwendeten
Reinstwassers kennt. Reinstwasser oder Wasser des Reinheitsgrades Typ 1,
12
das mit einem korrekt installierten und gut gewarteten Milli-Q-System
hergestellt wurde, hat einen TOC-Wert von <5 ppb. Es kann vorkommen,
dass der TOC-Monitor Werte über der Spezifikation von 5 ppb registriert. In
diesen Situationen muss sofort gehandelt werden.
Entfernung von Spuren organischer Substanzen in Leitungswasser durch
Laborwasseraufbereitungssysteme
Die
in
dieser
Studie
eingesetzten
Laborwasseraufbereitungssysteme
kombinieren die in Tabelle 5 aufgeführten Technologien, um Kontaminanten
aus dem als Speisewasser verwendeten Leitungswasser wirkungsvoll zu
eliminieren. Um eine optimale Wasserqualität sicherzustellen, sollten
Wasseraufbereitunssysteme verwendet und regelmäßig gewartet werden.
Tab 5. Wasseraufbereitungstechnologien, die für die Herstellung von
Reinstwasser aus Leitungswasser verwendet werden
SCHLUSSFOLGERUNG
Spuren
von
Hormonen
wurden
bei
der
Untersuchung
von
Leitungswasserproben mit dem LC-MS/MS-Verfahren festgestellt. Nach
Aufreinigung des Wassers mithilfe eines Laborwasseraufbereitungssystems
konnten keine Hormone mehr detektiert werden. Voruntersuchungen
sprechen dafür, dass dieses System in der Lage ist, Spuren von Pestiziden in
dem als Speisewasser verwendeten Leitungswasser wirksam zu entfernen.
Gemäß
einem
Pestizid-Screeningprotokoll
UHPLC/hochauflösender
MS
(QTOF)
unter
Verwendung
produzierte
ein
vom
ähnliches
Wasseraufbereitungssystem Reinstwasser für die Herstellung der mobilen
Phase und Standards. Bei der Analyse von Mischungen, die bekannte
Pestizidkonzentrationen enthielten, brachte das Reinstwasser keinerlei
Interferenzen
ein
und
die
Kalibrierungsdiagramme
zeigten
eine
ausgezeichnete Linearität. Die in dieser Arbeit präsentierten Daten belegen
die Eignung von Laborwasseraufbereitungssystemen zur Herstellung von
Reinstwasser für Spuren- und Ultraspurenanalysen mittels LC_MS/MS. Eine
13
verlässliche Quelle für Reinstwasser trägt dazu bei sicherzustellen, dass
Analysedaten von höchster Qualität erzielt werden.
DANKSAGUNG
Merck Millipore dankt dem Laboratory of Analytical Chemistry der Universität
Helsinki, Finnland, wo die LC-MS/MS-Studie durchgeführt wurde, und
insbesondere Mikael Tilli, Raymundo Lizcano und der Laborleiterin MarjaLiisa Riekkola. Der Dank der Autoren geht auch an Maricar Tarun-Dube und
unsere Kollegen von Merck Millipore, vor allem an Cecilia Devaux und
Patricia Renard, für ihre wertvollen Beiträge.
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