Structure, culturability and adaptation cues of the - ETH E

DISS. ETH NO. 23510
Structure, culturability and adaptation cues of
the Arabidopsis leaf microbiota
A thesis submitted to attain the degree of
DOCTOR OF SCIENCES of ETH ZURICH
(Dr. sc. ETH Zurich)
presented by
Daniel Bastian Müller
Dipl. Biol., Goethe University Frankfurt
born July 10, 1984
citizen of Germany
accepted on the recommendation of
Prof. Dr. Julia A. Vorholt
Prof. Dr. Rudolf Aebersold
Prof. Dr. Martin Ackermann
2016
Abstract
The host microbiota, a phylogenetically diverse community of microorganisms inhabits healthy
multicellular organisms, including plants and mammals. Detailed taxonomic analyses revealed that
community composition is not random, but exhibits a defined and consistent structure shaped by a
variety of cues. Research of the past decades has revealed that the microbiota influences host nutrition
and health and consequently, the host and its microbiota should be regarded as co-evolved inter-species
consortia. A better understanding of the microbiota and the complex interplay with its host will help to
develop and implement effective applications to increase host fitness.
Plant microbiota research under natural conditions is an inherently challenging task, owing to
phylogenetic complexity and frequently changing environmental conditions. Synthetic communities of
known composition represent a valuable tool to conduct experiments under controlled laboratory
conditions, however, diverse culture collections mimicking the phylogenetic structure of the natural
microbiota are indispensable. This thesis describes the establishment of a bacterial microbiota strain
collection, covering the majority of abundant taxa that are reproducibly found on natural Arabidopsis
leaves. Re-inoculation of all strains on germ-free plants resulted in leaf community patterns resembling
the nature microbiota, while competition with isolates of a corresponding root microbiota culture
collection suggests a competitive advantage for leaf colonization and specialization to the cognate
habitat. Genome drafts of 206 leaf isolates provided insights into microbial physiology and further
revealed significant differences to root- and soil- derived genomes, also reflecting differences in
adaptation and organ specialization. Proteomic analysis of two abundant key members of the leaf
microbiota underlined different metabolic strategies for phyllosphere colonization and indicated widely
distributed and taxa-specific substrates and mechanisms of energy conservation used under in situ
conditions. Besides plant host mediated cues and different metabolic capacities of the community
members, binary interactions are expected to drive microbiota establishment. Analysis of over 50.000
bipartite interactions revealed that two bacterial orders predominate in production of antibiotics and
indicated that chemical warfare is less often targeted against close relatives. Activity of some isolates
against known phytopathogenic bacteria on agar plates did not necessarily translate to corresponding
phenotypes in planta, but resulted in the identification of seven strains lowering disease severity of
Arabidopsis, caused by a common bacterial pathogen. In summary, the At-LSPHERE strain collection
with its corresponding genome sequences represents a unique resource for future experimental and
bioinformatic analyses of the leaf microbiota and will, in combination with investigations on microbial
adaptation on plants, help to move the field of plant microbiota research forward.
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Zusammenfassung
Alle höheren Lebewesen, wie auch Pflanzen und Säugetiere, werden von einer Vielzahl an
Mikroorganismen, der Mikrobiota, besiedelt. Die detaillierte Analyse der phylogenetischen
Zusammensetzung dieser Lebensgemeinschaft von Mikroorganismen zeigte, dass diese nicht zufällig,
sondern konstant und reproduzierbar ist und letztlich auf dem Einfluss vieler äusserer Faktoren beruht.
Die Forschung der letzten Jahre hat durch eine Fülle an Beispielen eindrucksvoll belegt, dass die
Mikrobiota einen weitreichenden Einfluss auf die Ernährung und Gesundheit des beherbergenden
Vielzellers hat. Beide Parteien können aus diesem Grund als eine über Millionen von Jahren evolvierte
Einheit betrachtet werden. Demnach sollte die Physiologie von Pflanzen und Tieren nicht ungeachtet
der dazugehörigen Mikroorganismen untersucht werden, denn ein besseres Verständnis dieses
komplexen Wechselspiels kann dazu dienen, Massnahmen zur Verbesserung des Gesundheitszustandes
des Wirtsorganismus zu erkennen.
Die Komplexität der nativen Mikrobiota, in Kombination mit den kontinuierlich schwankenden
Umweltbedingungen, erschwert unweigerlich die Erforschung dieser Gemeinschaft unter natürlichen
Bedingungen.
Ein
Lösungsansatz
dieses
Problems
kann
die
Verwendung von
manuell
zusammengestellten, künstlichen bakteriellen Gemeinschaften unter kontrollierten Laborbedingungen,
darstellen. Zu diesem Zweck ist eine Stammsammlung, welche die Diversität der nativen Mikrobiota
widerspiegelt, unverzichtbar. Diese Arbeit beschreibt die Etablierung einer Stammsammlung, die den
Grossteil der Bakterienarten enthält, die unter gewöhnlichen Bedingungen auf Arabidopsis Blättern
nachgewiesen werden können. Die Gesamtheit dieser Isolate bildete auf sterilen Laborpflanzen eine
bakterielle Gemeinschaft mit grosser Ähnlichkeit zur nativen Pflanzen-Mikrobiota, während
Kolonisierung der Pflanze unter kompetitiven Bedingungen mit Wurzelisolaten auf einen
Wachstumsvorteil und eine Spezialisierung der Bakterien an ein Leben auf Blättern hindeuten.
Sequenzierung der Genome von 206 Blatt-Isolaten ermöglichte tiefe Einblicke in die Physiologie der
Bakterien und offenbarte weiter signifikante Unterschiede zu Wurzelisolaten, welche ebenfalls eine
Spezialisierung an die Blattoberfläche suggerieren. Eine systematische Analyse der bakteriellen
Proteine, die verstärkt während der Kolonisierung der Phyllosphäre produziert werden, verdeutlichte
die unterschiedlichen Anpassungen des Stoffwechsels zweier exemplarischer Modellstämme und gibt
Hinweise
auf
weit-verbreitete
Substrate,
als
auch
auf
spezifischere
Mechanismen
der
Energiekonservierung. Neben Einflüssen der Pflanze und unterschiedlichen metabolischen Fähigkeiten
der Bakterien wird angenommen, dass auch die Interaktionen zwischen den einzelnen Mitgliedern der
Gemeinschaft für die konstante Struktur der Mikrobiota mitverantwortlich sind. Die Untersuchung von
über 50,000 binären Interaktionen offenbarte, dass die Produktion von Antibiotika überwiegend auf
zwei bakterielle Ordnungen zurückzuführen ist und sich diese chemischen Waffen selten gegen
nahverwandte Organismen richten. Des Weiteren inhibierten einige dieser Stämme auch des Wachstums
von bekannten Pflanzen-Pathogenen auf Agarplatten, was nicht zwangsläufig auch zu einer Inhibition
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des Krankheitserregers auf Pflanzen führte, jedoch konnten sieben Isolate identifiziert werden, welche
Arabidopsis-Pflanzen erfolgreich vor Krankheitsymptomen des Erregers schützten. Generell gesehen
stellt
die
etablierte
At-LSPHERE
Stammsammlung,
zusammen
mit
den
dazugehörigen
Genomsequenzen eine einzigartige Ressource für weitere experimentelle und bioinformatische
Analysen der Pflanzen-Mikrobiota dar und wird, in Kombination mit Analysen der bakteriellen
Anpassung an die Blattoberfläche, entscheidend zum Fortschritt des Forschungsfeldes beitragen.
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