みちのくウイルス塾資料 20160716 新規の誘電率顕微鏡による溶液中の 水溶液中の生物試料やナノ粒子をそのまま ウイルスや生物試料の直接観察 ナノレベルで直接観察する技術 （高分解能誘電率顕微鏡の開発） （高分解能誘電率顕微鏡の開発） 産業技術総合研究所 バイオメディカル研究部門 小椋 俊彦 ウイルスの感染過程を直接見るためには？ 条件 １．10 nmの分解能 ２．溶液中での観察 ３．生きた状態 ４．観察損傷がない ５．無染色で観察 （一般財団法人 大阪市東淀川区医師会ホームページより） 非常に困難 どんな観察方法があるのか？ 観察法 光学顕微鏡 分解能 液中 観察 染色処理 × 200nm ◎ 〇 超解像蛍光顕 〇 ～10nm 微鏡 ◎ 一部必要 × 試 料 損 傷 の 有 無◎ 簡便性 価格 ◎ 10 ～ 200 万円 △ △ 1億円 〇 数千万円 △ 数千万円 △ 数千万円 × 数百億円 〇 数千万円 必須 レーザー損傷 △ × 一部必要 電子線損傷 × × 必須 電子線損傷 走査電顕 ◎ 1nm × 透過電顕 ◎ 0.1nm × 大気圧電顕 〇 10nm 〇 × × 必須 電子線損傷 Ｘ線自由電子 レーザー 〇 10nm ◎ ◎ Ｘ線損傷 走査誘電率 顕微鏡 〇 10nm ◎ ◎ 〇 × 新規開発技術 生物試料の観察技術 溶液中 光学顕微鏡 分解能 0.2μm 観察が困難 大気圧 電子顕微鏡 分解能 1 nm 電子線ダメージ大 真空中 粒子径 10μm 細胞 1μm バクテリア 100 nm ウィルス 10 nm タンパク質 複合体 タンパク質 1 nm 走査電子顕微鏡の大腸菌の観察例 固定・脱水後に金属コート処理 電顕によるウィルスの観察方法 ・負染色サンプル ・透過電子顕微鏡画像 ・重金属の状態を観察 ・ウィルスは乾燥した状態 ・真空による変性有り ウィルスの負染色画像 (国立感染研ホームページより） 生きたウィルスの観 察手段が望ましい ２．走査電顕による試料の観察 ・走査電顕（SEM)の利点 １. 比較的安価 ２. 操作が簡単 ・生物試料観察の問題点 １. 真空による変性 ２. 電子線による損傷 ３. コントラストが極めて低い ４. チャージによる画像の変化 ・従来の観察方法 １. 脱水・固定処理 ２. 負染色 ３. 金属コーティング １. 処理が煩雑 ２. アーティファクト ３. 試料の変性 Fig.4 これまでの電子顕微鏡による大気圧・液中観察 高圧透過電顕使用 750keV イカダモの観察結果 Nagata F. and Ishikawa F., Jpn. J. Appl. Phys. Vol.11 (1972), pp1239-1244 これまでの電子顕微鏡による大気圧・液中観察 Science (1974) 超高圧電顕使用 1MeV以上 最近の電子顕微鏡による大気圧・液中観察 Hela Cellの観察結果 ・上面を薄膜とするカプセル型 ・走査電顕を用いて反射電子で観察 ・細胞は、固定・染色処理 Thiberg S. et.al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol.101 (2004), pp3346-3351 培養細胞の光顕画像 QXカプセルによる培養細胞の観察 QXカプセルによるSEM画像 QXカプセルによるSEM画像 コントラストが低く観察が困難 最近の電子顕微鏡による大気圧・液中観察 走査透過電顕による観察 De Jonge N. et.al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol.106 (2009), pp2159-2164 最近の電子顕微鏡による大気圧・液中観察 COS7 cellの観察 ラベルインキュベーション の時間 5分 ラベルインキュベーション の時間 １０分 乾燥したサンプル ・細胞は、グルタルアルデヒドにより固定 ・EGF-Auラべリング De Jonge N. et.al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol.106 (2009), pp2159-2164 これまでの大気圧・液中観察法 １. 電子線ダメージが大きい ２. コントラストが低い 目標 最近の液中観察法 １. 固定化処理 ２. 重金属による染色 ３. 金属ラべル １. 水液中での観察 ２. 電子線によるダメージが無い ３. 染色なしに高コントラスト画像を得る ４. 非染色・非固定による観察 新規観察方法の開発 まずは生物試料の高コントラスト観察から 条件 １．10 nmの分解能 ２．溶液中での観察 ３．生きた状態 ４．観察損傷がない ５．無染色で観察 2005年にさきがけ研究に採択 走査電顕による高コントラス・ 低ダメージ観察法の開発を開始 低コントラストの原因 電子線 走査 ２次電子 試料 10 µm 試料支持台 ステージと試料の２次電子 放出の差が小さい さきがけの予算で日本電子社製JSM6390を購入 間接２次電子コントラスト観察方法 概念図 低加速 電子線 2次電子 カーボン 薄膜 2次電子 電子散乱範囲 生物サンプル Toshihiko Ogura, Biochem. Biophys. Res. Commun. Vol.377 (2008), pp27-84 SEMによるバクテリアの観察 2次電子による観察 表層5nm程度からの情報 カーボン膜厚 40 nm Toshihiko Ogura, Biochem. Biophys. Res. Commun. Vol.377 (2008), pp27-84 電子線の加速電圧の変化によるコントラストの推移 Toshihiko Ogura, Biochem. Biophys. Res. Commun. Vol.377 (2008), pp27-84 高コントラスト画像のメカニズム In-direct Secondary Electron Contrast (ISEC) image Fig. 9 Toshihiko Ogura, Biochem. Biophys. Res. Commun. Vol.377 (2008), pp27-84 T4 phageのISEC image A 電界放射型高分解能SEM、 カーボン膜厚 15-10 nm B FE SEM (Carbon 15 nm) 0.6 kV 100 nm 200 nm C FE SEM (Carbon 10 nm) D 0.5 kV Toshihiko Ogura, Biochem. Biophys. Res. Commun. Vol.380 (2009), pp254-259 T4 phage ISEC imageの3Dマップ 250 200 150 100 50 0 Monte Carlo Simulationによる解析 Toshihiko Ogura, Biochem. Biophys. Res. Commun. Vol.380 (2009), pp254-259 試料支持膜の改良による分解能向上 Ogura, T. PloS ONE 7(10), e46904(7pp) (2012) バキュロウイルスの観察結果 Ogura, T. PloS ONE 7(10), e46904(7pp) (2012) タンパク質（プロテアソーム）の観察結果 Ogura, T. PloS ONE 7(10), e46904(7pp) (2012) 次は液中での生きた観察を目指す 条件 １．10 nmの分解能 ２．溶液中での観察 ３．生きた状態 ４．観察損傷がない ５．無染色で観察 方策 ・真空による蒸発を防ぐ 大気圧ホルダー ・電子線を薄膜に照射し ２次物理量を計測 大気圧カプセルの概要 電子線 2次電子 電子散乱 範囲 2次電子 生物サンプル Ogura, Biochem. Biophys. Res. Commun. Vol.377 (2008), pp27-84 Tomie et.al., Science, Vol.252, p691-692 (1991) 電子線 走査 金属薄膜 窒化シリコン膜 水溶液 電子散乱範囲 サンプル ２次物理量 検出器 誘電率顕微鏡の原理 特徴 １. 電子線ダメージが無い ２. 液中生物試料の高コントラスト観察 ３. 水の層が10μm程度でも観察可能 比誘電率 水： 80 生物試料： 2～3 新規誘電率顕微鏡の概要 モンテカルロシミュレーション 液中試料の非染色・ 非固定、高コントラスト 観察を可能とする。 Toshihiko Ogura, PLOS ONE. Vol.9 (2014), e92780 酵母の観察結果 Toshihiko Ogura, PLOS ONE. Vol.9 (2014), e92780 バクテリアの観察結果 Toshihiko Ogura, PLOS ONE. Vol.9 (2014), e92780 ライトフライヤー（Image credit: Library of Congress） バイアス電圧による検出信号の増強 Control signal Thermionic SEM EB Carbon tape Blanking unit Chopped EB Function generator Reference signal Holder Scan Bias Eb Si frame SiN Sample Water Lock-in amplifier SiN GND O-ring Measurement terminal AC preamplifier Low-pass filter Toshihiko Ogura, BBRC. (2014) Vol.450, 1684-1689. Data recorder バイアス電圧による検出信号の増強 Toshihiko Ogura, BBRC. (2014) Vol.450, 1684-1689. 検出信号の増強メカニズム（仮説） バクテリアの観察結果 高分解能誘電率顕微鏡システム Toshihiko Ogura, BBRC. (2015) Vol.459, 521-528. 高分解能誘電率顕微鏡システム バクテリアの観察結果 Toshihiko Ogura, BBRC. (2015) Vol.459, 521-528. バクテリアの観察結果 バキュロウイルスの観察結果 Toshihiko Ogura, BBRC. (2015) Vol.459, 521-528. IgM抗体の観察結果 IgM抗体のモデル構造 Daniel M. et al., PNAS (2009) Toshihiko Ogura, BBRC. (2015) Vol.459, 521-528. 最後の鍵は生きた細胞の観察 培養細胞観察システム T. Okada & T. Ogura, Sci.Rep.,6,29169 (2016) マウス培養細胞の観察結果 マウス培養細胞の観察結果 培養細胞の観察結果 T. Okada & T. Ogura, Sci.Rep.,6,29169 (2016) 培養細胞の観察結果 T. Okada & T. Ogura, Sci.Rep.,6,29169 (2016) 要素技術はほぼクリア 条件 １．10 nmの分解能 ２．溶液中での観察 ３．生きた状態 ４．観察損傷がない ５．無染色で観察 方策 真空による蒸発を防ぐ大 気圧ホルダー 電子線による電位変化 を検出 新規誘電率顕微鏡の開発 ただし、まだウイルスの細胞 感染の観察には道半ば 分解能とホルダーの 安定性が不可欠 まとめ 新規誘電率顕微鏡の開発 １. 液中サンプルの観察が可能 ２. 電子線によるダメージが無い ３. 染色なしに高コントラスト画像を得る ４. 分解能が8 nm ５. 通常のSEMに小規模な改良で対応 溶液中の生物試料やナノ粒子を そのままの状態で観察
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