chemoproteomic technologies for the study of - ETH E

DISS. ETH NO. 23529
CHEMOPROTEOMIC TECHNOLOGIES FOR THE
STUDY OF CELL SURFACE PROTEINS AND
THEIR INTERACTIONS WITH LIGANDS
A thesis submitted to attain the degree of
DOCTOR OF SCIENCES of ETH ZURICH
(Dr. sc. ETH Zurich)
presented by
NADINE SOBOTZKI
M. Sc. (TUM), Technical University Munich
born on 06.07.1986
citizen of Germany
accepted on the recommendation of
Prof. Dr. Ruedi Aebersold, examiner
Prof. Dr. Bernd Wollscheid, co-examiner
Prof. Dr. Erick Carreira, co-examiner
Prof. Dr. Shana Sturla, co-examiner
Dr. Nicola Zamboni, co-examiner
Dr. Claus Riemer, co-examiner
2016
2
Abstract
ABSTRACT
The plasma membrane is the physical boundary of the cell and acts as a gatekeeper for the
transfer of information from and to the microenvironment. The qualitative and quantitative cellspecific repertoire of proteins and lipids residing in the plasma membrane as well as their nanoscale organization enables but also restricts information transfer. Information, encoded in the
form of biomolecules, but also mechanical and electrical cues, can be transmitted directly via
transport mechanisms or relayed through receptor-mediated signaling. Therefore, it is essential
for a basic understanding of cellular biology to obtain a physical map of the surfaceome including
its functional interactions with the microenvironment.
In my PhD thesis I developed and applied two next-generation chemoproteomic technologies
which enable first, the relative quantitative mapping of the cellular surfaceome and second, the
identification of surfaceome interactors for functional orphan ligands.
The click-chemistry based cell surface capture (Click-CSC) technology combines the novel bifunctional linker azido-butyryllysine-hydrazide (AHA) with the non-toxic organocatalyst 5methoxyanthranilic acid (5-MA) to enable a more sensitive and robust quantitative surfaceome
screening. Application of the Click-CSC technology showed that one-tenth of cellular starting
material compared to the original CSC technology is sufficient to obtain informative surfaceome
snapshots. This opens unique opportunities to screen rare or sorted cell populations such as
+
+
-
+
shown here for splenic CD11b CD4 and CD11b CD8α dendritic cell subtypes from mouse. The
particular ability of the Click-CSC technology to tag and enrich for glycosylated proteoforms
enabled the identification and relative quantification of surfaceome members not detectable with
the previous CSC technology, such as GPCRs and O-linked glycoproteins. Click-CSC technology
provides now an opportunity for the detection of cell surface-specific protein post-translational
modifications as modulators of cell-specific signaling.
HATRIC-based ligand receptor capture technology (HATRIC-LRC) utilizes the newly designed
acetone-derived hydrazone and azide containing tri-functional compound HATRIC to identify
receptors for orphan ligands on living cells. In contrast to the well known TRICEPS-based LRC
technology, HATRIC-LRC combines a new 5-MA catalyzed hydrazide chemistry for faster
receptor-capture with a click chemistry-based protein-centric workflow. HATRIC-LRC enables
now robust and successful receptor identification from as little as 1 million cells at physiological
pH, which is critical for receptor-ligand de-orphanisation on primary cells of often-limited
availability. In an advanced biomedical application of HATRIC-LRC we identified and validated a
host receptor panel for influenza a virus (IAV), the causative agent of the common flu. Validation
Abstract
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experiments including the RNAi-mediated depletion of the single genes of the identified receptor
panel (CD98, DISP2, MYOF) showed a reduction in the IAV infection rate by more than 50%.
Surprisingly, knock down of the single gene CD98 even led to a reduction of IAV infection of over
80%, indicating that CD98 could be a target for pharmaceutical intervention modulating IAV entry
into cells. Furthermore, I expanded the application space of the HATRIC-LRC to the identification
of receptors for small molecules. HATRIC-LRC with folate and the drug imatinib enabled the
detection of the respective receptors, expanding the application space for LRC into the
pharmaceutical domain. HATRIC was patented (EP15003213.4), licensed and is productively
used by Dualsystems Biotech AG.
In summary, with Click-CSC and HATRIC-LRC I developed two chemoproteomic applications,
which enable and catalyze surfaceome research. The shown data demonstrate how both
technologies provide unprecedented molecular insights into the cellular surfaceome and its
interactors. However, Click-CSC and HATRIC-LRC are foremost providing the community with a
versatile toolbox to decode functionally relevant extracellular interactions, especially in the context
of host-pathogen interactions.
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Zusammenfassung
ZUSAMMENFASSUNG
Die Plasmamembran ist die physikalische Grenze einer Zelle und dient als Wärter für den
Informationsaustausch zwischen der Zelle und ihrer Umgebung. Das qualitative und quantitative
Repertoire von Proteinen und Lipiden, die sich an der Zelloberfläche befinden, sowie deren
Organisation bestimmen, welche Informationen in die Zelle weitergegeben werden, und welche
nicht. Informationen, die in Form von Biomolekülen kodiert sind oder als mechanische und
elektrische Stimuli auftreten, werden entweder aktiv in die Zelle hinein- oder heraustransportiert
oder mithilfe von Rezeptor-vermittelter Signalübertragung übermittelt. Daher ist es essentiell eine
physikalische Karte des Zelloberflächenproteoms und dessen Interaktionen zu erhalten, um
grundlegende Informationsflüsse in der Zellbiologie zu verstehen.
In dieser Doktorarbeit habe ich daher zwei innovative chemoproteomische Technologien
entwickelt, die zum einen die relativ-quantitative Beschreibung des Zelloberflächenproteoms und
zum anderen die Identifikation von Ligand-Rezeptor Interaktionen ermöglichen.
Die Click-Chemie basierte, sogenannte “Cell surface capture” (Click-CSC) Technologie
kombiniert die Verwendung der bifunktionalen Reagenzie Azido-butyryllysine-Hydrazid mit dem
ungiftigem Katalysator 5-Methoxyanthranilsäure (5-MA) und ermöglicht so eine sensitivere und
robustere Untersuchung des Zelloberflächenproteoms. Click-CSC liefert mit nur einem Zehntel
des
Ausgangsmaterials,
das
für
vergleichbare
Methoden
notwendig
war,
informative
Momentaufnahmen des Zelloberflächenproteoms. Dies eröffnet einzigartige Möglichkeiten für die
Untersuchung von seltenen oder sortierten Zellpopulationen, wie hier am Beispiel der
+
dendritischen Zellpopulationen CD11b CD4
+
-
and CD11b CD8α
+
demonstriert wurde. Die
besondere Fähigkeit von Click-CSC glykosylierte Proteoformen zu markieren und anzureichern
ermöglichte zudem die Identifikation und relative Quantifizierung von Zelloberflächenproteinen,
die zuvor mit der verwandten CSC Technologie nicht detektierbar waren. Darunter befanden sich
GPCRs und O-glykosylierte Proteine. Click-CSC eröffnet auf diese Weise nun eine neue
Möglichkeit, posttranslationalen Modifikationen des Zelloberflächenproteoms zu untersuchen, die
essentiell sind für die zellspezifische Signalübermittlung.
Die HATRIC-basierte “ligand-receptor capture” Technologie (HATRIC-LRC) verwendet ein neues
tri-funktionales Reagenz, das ein Aceton-geschütztes Hydrazon sowie Azid enthält, namens
HATRIC, um Rezeptoren für “Waisen-Liganden” auf lebenden Zellen zu identifizieren. Im
Gegensatz zur zuvor bekannten TRICEPS-basierten LRC Technologie, kombiniert HATRIC-LRC
eine neue 5-MA katalysierte Hydrazidchemie, die ein schnelleres Einfangen des Rezeptors
ermöglicht, mit einer Click Chemie-basierten Anreicherung von Proteinen. Auf diese Weise
Zusammenfassung
5
ermöglicht HATRIC-LRC die robuste und erfolgreiche Identifizierung von Rezeptoren ausgehend
von einer Million Zellen Ausgangsmaterial bei physiologischem pH. Die Reduktion des
Ausgangsmaterials
Zurverfügungstellung
ist
ein
von
kritischer
mehr
Faktor
für
Ausgangsmaterial
viele
Anwendungen,
schwierig
wäre,
wie
bei
denen
die
beispielsweise
Gewebeproben und primäre Zellen. Mit HATRIC-LRC war es uns nun zum ersten Mal möglich
drei Zelloberflächenproteine zu identifizieren, die bei der Infektion mit Influenza A Viren (IAV) eine
zentrale Rolle spielen. Mithilfe von Validierungsexperimenten konnte ermittelt werden, dass die
Verminderung der Genexpression dieser Rezeptoren (CD98, DISP2, MYOF) die Infektionsrate
mit IAV dramatisch reduzierte. Überraschenderweise reduzierte das Herunterregulieren eines
einzelnen Gens, CD98, die Infektionsrate mit IAV um mehr als 80%. Dies deutet darauf hin, dass
CD98 in der Zukunft als Ziel für therapeutische Interventionen dienen könnte. Zudem konnte ich
anhand der Beispiele Folsäure und Imatinib zum ersten Mal zeigen, dass auch die Identifizierung
von Rezeptoren für kleine organische Moleküle möglich ist. HATRIC wurde dementsprechend
patentiert und wurde zudem bereits von Dualsystems Biotech AG lizensiert.
Zusammenfassend
ist
zu
sagen,
dass
ich
mit
Click-CSC
und
HATRIC-LRC
zwei
chemoproteomische Methoden entwickelt habe, die die Erforschung des Zelloberflächenproteoms
erleichtern und vorantreiben. Die aufgezeigten Beispiele demonstrieren wie beide Technologien
bisher unmögliche, molekulare Einblicke in die Organisation des Zelloberflächenproteoms sowie
dessen Interaktoren ermöglichen.

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