セラミド合成酵素ファミリーによる2-ヒドロキシセラ ミドの合成:脂肪酸鎖長に基づく基質特異性 2-Hydroxy-ceramide synthesis by ceramide synthase family: enzymatic basis for the preference of FA chain length -Yukiko Mizutani et al. J. Lipid Res. 2008;49:2356-2364 2015/08/03 M1 羅 霄霖 皮膚におけるセラミド LCB: スフィンゴシン ジヒドロスフィンゴシン フィトスフィンゴシン(14-16) 6-ヒドロキシスフィンゴシン(17) R FA:(哺乳類 C14-26) 組織 C16,C24 皮膚や脳 2-OH-FA(5,6) 皮膚 ω-OH-C30-36/C18:2-FA 14. Breimer, M. E et al. Lipids. 1975;10: 17–19. 15. Flamand, N et al. J. Chromatogr. B Biomed. 1994;656: 65–71. 16. Bouhours, D et al. Glycobiology.1999;9: 875–886. 17. Robson, K. J et al. J. Lipid Res.1994;35: 2060–2068. セラミド合成に関する酵素 CERAMIDE -by aacrjournals DES1 スフィンゴ塩基C4位不飽和化酵素 DES2 スフィンゴ塩基C4位の水酸化酵素 FA2H 脂肪酸C2位の水酸化酵素 CerS1/LASS1 C18 CerS2/LASS2 C22,24 CerS3/LASS3 ≥C18 CerS4/LASS4 C20,22,24 CerS5/LASS5 C16 CerS6/LASS6 C16 23. Venkataraman, K., C et al.J. Biol. Chem. 2002;277: 35642–35649. 24. Guillas, I et al.J. Biol. Chem.2003; 278: 37083–37091. 25. Riebeling, C et al.J.Biol.Chem.2003;278:43452–43459. 26. Mizutani, Y et al.Biochem. J. 2005;390: 263–271. 27. Mizutani, Y et al.Biochem. J. 2006;398: 531–538. 28. Laviad, E. L et al.J. Biol. Chem. 2007;283: 5677–5684. 目的 そこで、 セラミド合成酵素により、2-ヒドロキシセラミドを産 生するか? 基質が2-ヒドロキシアシルーCoAではないか? 各セラミド合成酵素が対応する基質は何によって異なる か? について確認した。 産物 基質 酵素 酵素基質複合体 酵素産物複合体 ヒトケラチノサイトの分化によるFA2Hの制御 A NHEK細胞 (0,3,6,9 days)→RT-PCR→電気泳動 (終端分化マーカー) ヒトケラチノサイト分化により、FA2Hの遺伝子発現量が増加させた。 ヒトケラチノサイトの分化によるCerSの制御 B NHEK細胞(0,3,6,9 days) ↓ リアルタイムPCR ヒトケラチノサイト分化により、 CerS3の遺伝子発現量が増加させた。 CerSによる2-OH-CERsの合成(1) A Upper band: C22:0, C24:0, C24:1-CERs Low band:C16:0- and C18:0-CERs(27) HEK 293T細胞 ↓ ( pcDNA3 FA2H,FA2H/DES2) トランスフィクション(3 days) ↓ 3HDS添加(3h) ↓ 脂質抽出 ↓ TLC HEK 293T細胞において、 FA2Hにより、2-OH-CERsを合成した。 FA2H/DES2により、2-OH-phyto-CERsを合成 した。 (27) Mizutani, Y et al. Biochem. J. 2006; 398: 531–538 CerS3による2-OH-CERsの合成(1) FB1は過剰産生されるCerSの活性を阻害せず、 内因性CerSの活性の阻害剤である。(23) B HEK 293T細胞 ↓ ( pcDNA3 FA2H,CerS3,FA2H/CerS3) トランスフィクション(3 days) ↓ FB1(-/+)処理 ↓ 3HDS添加(3h) ↓ 総脂質抽出 ↓ TLC CerS3+FA2H→ 2-OH-CERs (23)Venkataraman, K et a. J. Biol. Chem. 2002;277: 35642–35649 CerS3による2-OH-CERsの合成(2) C FB1(-) ( pcDNA3FA2H, FA2H/CerS3) トランスフィクション ↓ HPLC/MS HEK 293T細胞において、 CerS3により、中長鎖2-OH-CERsを合成した。 CerSによる2-OH-CERsの合成(2) D HEK 293T細胞→ ( pcDNA3 FA2H,CerS1-6/FA2H)トランスフィクション(3 days) →FB1(-/+)処理→ 3HDS添加(3h)→総脂質抽出→TLC 各CerSにより、特定な鎖長の2-OH-CERsを合成した。 (2-OH-アシルCoAに対する基質特異性はヒドロキシアシルCoAと類似ことが推測で きた。) CerS1による2-OH-C18:0-CERsの合成(1) HEK 293T細胞 ↓ ( pcDNA3 CerS1, 6)トランスフィクション ↓ 3HDS/ DS/no-OH-C14,16,18,20:0-CoA, 2-OH-C18:0-CoA添加(15min) ↓ 総脂質抽出 ↓ TLC A CerS1+2-OH-C18:0-CoA→ 2-OHCERs CerS1による2-OH-C18:0-CERsの合成(2) ↓ 3H DS,DS,2-OH-C18:0CoA添加(15min) ↓ Bligh&Dyer法 ↓ HPLC/MS 2-OH-C18:0-CoAとその構造異性体はCerS1の基質である。 CerS2,5による2-OH-CERsの合成 A HeLa細胞→RT-PCR→電気泳動 B HeLa細胞 ↓ (siRNA CerS2,5) トランスフィクション(3 days) ↓ RT-PCR ↓ 電気泳動 HeLa細胞において、CerS2,5の遺伝子 発現量がより多い。 CerS2,5による2-OH-CERsの合成 HeLa細胞 ↓ (pcDNA3 FA2HとsiRNA CerS2,5,2/5)コトラ ンスフィクション (3 days) ↓ 3HDS添加(3h) ↓ 総脂質抽出 ↓ TLC C HeLa細胞において、 長鎖脂肪酸CoAに特異的のCerS2,4が短鎖脂肪 酸CoAに特異的のCerS5より多く存在していた。 CerS2/5ノックダウンすると、長鎖短鎖-セ ラミドが減少した。 CerS2,5による2-OH-HexCERsの合成 D HeLa細胞 ↓ (pcDNA3 FA2HとsiRNA CerS2,5) コトランスフィクション (3 days) ↓ Bligh&Dyer法 ↓ HPLC/MS HeLa細胞において、 CerS2ノックダウン→長鎖2-OH-HexCERs↓ (C22,24) CerS5ノックダウン→短鎖2-OH-HexCERs↓ (C16) まとめ •FA2h,CerS3がケラチノサイトの分化に関与する。 •各CerSが、 CerS1→C18 CerS2→C22,24 CerS3→≥C18 CerS4→C20,22,24 CerS5→C16 CerS6→C14,16 特定な鎖長をもつ2-OH-FA-CoAと基質特異性的に反 応して、特定な鎖長をもつ2-OH-CERsを産生する。
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