講義スライド - Kuroda Lab University of Tokyo

実習の前に…
黒田研の実習では、ファイルをダウンロードしても
らうことが多くあります。
まずは、下記のホームページを開いてください。
http://kurodalab.bi.s.utokyo.ac.jp/class/Summer/2013
→直打ち
または
①Googleで「東京大学黒田研究室」検索
②黒田研のH.P.に入り、http://kurodalab.bi.s.u-tokyo.ac.jp/
以下をclass/Summer/2013に変更
実習アウトライン
現象の特性
微分回路、積分回路、プローブ特性、
アナログデジタル変換、メモリ、振動現象
これらはシンプルな分子ネットワークの
組み合わせで生まれる！
前向き制御（フィードフォワード）
後向き制御（ポジティブ、ネガティブ
フィードバック）
実習アウトライン
プローブの問題
微分回路、積分回路
Tempo
ral rate
Ras
分子で作るメモリ
アナログデジタル変換
リズムと周波数応答
シミュレーション演習
狙い
初日イントロ
2日目プローブと信号
3日目実験結果からの数理モデル作成
4日目時間パターンに対する選択的応答
5日目スイッチ応答とメモリ
6日目振動現象
シミュレーション演習
狙い
初日イントロ
2日目プローブと信号
3日目実験結果からの数理モデル作成
4日目時間パターンに対する選択的応答
5日目スイッチ応答とメモリ
6日目振動現象
2. Circuit Engineering
Genetic Circuits
準備体操
生化学反応の基本的なふるまい
1次反応;
例;タンパク質などの分解,放射性同位元素の崩壊
x

分解
dx
x

dt

x  A0 e

t

1
0.9
0.8
0.7
0.6
x(t)
x
ただし、t = 0のとき、x=A0
0.5
0.4
0.3
ポイント
Memoryless property
その時その時でいつも同じ。履歴を引きずらない
0.2
0.1
0
0
2
4
6
8
10
Time
6
t
2. Circuit Engineering
準備体操
Genetic Circuits
生化学反応の基本的なふるまい
逐次1次反応；leaky integrator（漏れ積分器）
1次反応に外部入力(ステップ刺激）を加える
Integrator Leak
(積分器）（漏れ）

I
x

分解
dx

Ix
dt
ただし、t = 0のとき、x = 0

t
x  I (1  e  )
x(t)
I
空気抵抗を考えた場合の自由落下の式と同じ。
0

穴のあいたバケツに水を一定速度で入れるのとも同じ。
t
7
生化学反応は漏れ積分で近似できる


A  B 
 AB
kf
A
kb
AB
time
dAB
 kfA(1  AB)  kbAB
dt
ifA  Kd
dAB
 kfA  kbAB
dt

time
ただし、 AB  B  1
シミュレーション演習
狙い
初日イントロ
2日目プローブと信号
3日目実験結果からの数理モデル作成
4日目時間パターンに対する選択的応答
5日目スイッチ応答とメモリ
6日目振動現象
2008 ノーベル化学賞
緑色蛍光蛋白質の発見と開発
細胞
組織
個体
生体を生きたまま非侵襲に染色、可視化できる
望みの部位だけ可視化できる
蛋白質の発現等を定量できる
シミュレーション演習
狙い
2日目プローブと信号
Ca2+プローブのダイナミックレンジ
時定数
Transient and sustainedのどちらをひろうか。
(decoupling, coupling)
図と説明
Ca2+イメージング
（膵臓ランゲルハンス島）
グルコース刺激した膵臓ランゲルハンス島のカルシウム応答
• すべてのカルシウム応答が見えている?
• 生体内のカルシウム応答（<100nM,数十マイクロ秒）
Ca 2+プローブと反応速度定数
-バイオプローブ‐
Ca2+ インパルス刺激（※50msec幅の矩形波を仮定)
50ms
0.5Hz
1Hz
•
2Hz
プローブの応答はカルシウム濃度の変化を正しく反映している？
⇒必ずしもカルシウム波形が正確に反映されているわけではない
プローブを使う際は応答速度に注意する。
シミュレーション演習
狙い
初日イントロ
2日目プローブと信号
3日目実験結果からの数理モデル作成
4日目時間パターンに対する選択的応答
5日目スイッチ応答とメモリ
6日目振動現象
細胞運命決定機構：増殖と分化のスイッチ
現象を分子に帰着せさることができない！
ERKの時間波形が異なるだけで異なる現象を制御
Phosphorylated ERK (%)
一過性 ERK 活性化
EGF or NGF
EGF
増殖
100
80
60
40
20
0
0
エンコード
NGF
PC12 cells
（precursor of neuron）
Phosphorylated ERK (%)
Time
10
20
30
40
50
60
Time (min)
持続性 ERK 活性化
分化
100
80
60
40
20
0
0
10
20
30
Time (min)
40
50
デコード
60
RasとRap1によるERK活性の制御
EGF
Phosphorylated ERK (%)
Transient ERK activation
100
80
60
40
20
0
0
10
20
30
40
50
60
Time (min)
NGF
Phosphorylated ERK (%)
Sustained ERK activation
100
80
60
40
20
0
0
10
20
30
Time (min)
40
50
60
不活性化機構が違いを生み出す !
Ras 微分回路
GEFi
TrkA
pR
GAPi
Rap1 積分回路
GEFi
TrkA
pR
SOS
GEF
Rasi
Ras Ras
GAP
RasGAP
pR dependent
C3G
GEF
Rap1i
Rap1 Rap1
GAP
(constant)
Rap1GAP
pR independent
実験結果からモデルのパラメータを決める
y
y
f (t )
+
+
+
+
+
f (t )
k=a
k=a
k=b
k=b
t
t
<
+
+
+
+
シミュレーション演習
狙い
初日イントロ
2日目プローブと信号
3日目実験結果からの数理モデル作成
4日目時間パターンに対する選択的応答
5日目スイッチ応答とメモリ
6日目振動現象
細胞運命決定機構：増殖と分化のスイッチ
現象を分子に帰着せさることができない！
ERKの時間波形が異なるだけで異なる現象を制御
Phosphorylated ERK (%)
一過性 ERK 活性化
EGF or NGF
EGF
増殖
100
80
60
40
20
0
0
エンコード
NGF
PC12 cells
（precursor of neuron）
Phosphorylated ERK (%)
Time
10
20
30
40
50
60
Time (min)
持続性 ERK 活性化
分化
100
80
60
40
20
0
0
10
20
30
Time (min)
40
50
デコード
60
RasとRap1によるERK活性の制御
EGF
Phosphorylated ERK (%)
Transient ERK activation
100
80
60
40
20
0
0
10
20
30
40
50
60
Time (min)
NGF
Phosphorylated ERK (%)
Sustained ERK activation
100
80
60
40
20
0
0
10
20
30
Time (min)
40
50
60
RasとRap1経路の特性の違い
Receptor
GEF
GAP
Ras
Growth factors
t
Receptor
GEF
Rap1 GAP
ERK
ERK
速い活性化と遅い不活性化
不活性化が一定
Encoders
Ras
t
刺激の速さに応答：微分回路
Rap1
t
刺激の強さに応答：積分回路
Sasagawa, S. et al, Nat. Cell Biol. 2005, 7 (4), 365-373
Ras のシンプルモデル
Rasのシンプルモデル
Receptor
GEF
GAP
Ras
GAP
ERK
GEF
速い活性化と遅い不活性化
incoherent
FeedFowared Loop
(iFFL)
→時間変化を捉える！
q < 1: GEF が早い
q > 1 : GEF が遅い
Ras のシンプルモデル
Receptor
GEF
GAP
Ras
ERK
速い活性化と遅い不活性化
incoherent
FeedFowared Loop
(iFFL)
→時間変化を捉える！
q < 1: GEF が早い
q > 1 : GEF が遅い
ランプ刺激：刺激の速度を変えよう
刺激のスピードとqの関係に着目！
ステップ
GAP
stimulation  
(const.)
GEF
r: (rate of pR)
ランプ
stimulation   (1  e rt )
Ras
刺激の速度に対する一過性ERKの応答
EGF 刺激
Rasのシステムは刺激の速度（強度ではない）を捉えていた。
EGF
Phosphorylated ERK (%)
持続性ERKの活性化
100
80
60
?
40
20
0
0
10
20
30
40
50
60
NGF
Phosphorylated ERK (%)
Time (min)
100
?
80
60
40
20
0
0
10
20
30
40
50
60
Time (min)
Inactivation is constant
NGF刺激の速度を変えてみると
NGF stimulation
NGFの最終濃度（強度） → 持続性ERKの活性化
Rap1とRasのシンプルモデル
違いはたった一つ
SOS
Ras：さっきと同じ
GEF
GEFi
TrkA
pR
GAPi
Rap1
GEFi
TrkA
pR
Rasi
Ras Ras
GAP
RasGAP
刺激依存
C3G
GEF
Rap1i
Rap1 Rap1
GAP
(constant)
Rap1GAP
刺激非依存
RasとRap1の定常状態
Ras
Ras 
Rap1
1
1  pR
1  pKe
1  p  pR
pR
Rap1 
(1  Ke) pR  Ke
1
1
1  Ke
0.1
0.01
Ras 
0.001
0.001 0.01
1  pKe
0.1
pR
0.1
0.01
1
1
10
100
1
1  Ke
Rap1
Ras
1
Rap1 
0.001
0.001 0.01
0.1
pR
pR
Ke
1
10
100
RasとRap1経路の特性の違い
ステップ
ランプ
パルス
刺激
t
t
速い、遅い時間成分
t
速い時間成分
遅い時間成分
Ras-like system
(微分回路）
Rap1-like system
(積分回路）
t
t
t
t
t
t
刺激の時間パターンに情報が入っていた！
活性化ERKの時間情報デコーディング
Growth
factor
刺激の時間情報
Ras/Rap1
Encoder
広い意味での周波数応答
ERK
ERKへのエンコード
Decoder1
ON
gene A
Decoder2
OFF
gene B
OFF
gene A
増殖
ベースの変動で増殖したくない
ON
下流でのデコード
gene B
分化
異なる現象（増殖と分化）
ノイズで分化したくない
TAKE HOME MESSAGE
分子は媒体
分子自体は情報ではない！
分子は媒体
電磁波
周波数、振幅
空気振動
音楽、ニュース
分子やネットワークは媒体
→情報を伝えるもの
成長因子
時間波形
シグナル分子波形
分子の「変動パターン」が情報細胞増殖
→分子ネットワークの上を伝わるもの
細胞分化
シミュレーション演習
狙い
初日イントロ
2日目プローブと信号
3日目実験結果からの数理モデル作成
4日目時間パターンに対する選択的応答
5日目スイッチ応答とメモリ
6日目振動現象
大腸菌lacオペロンの双安定性
• 大腸菌は糖の濃度
を記憶する
• ポジティブ・フィード
バックで記憶する
• 協調作用
Ozbudak et al. (2004) Nature
記憶（Hysteresis)のある（ない）
スイッチ応答
記憶ありスイッチ
（ポジティブフィードバックなし）
記憶なしスイッチ
（ポジティブフィードバックなし）
20
x 10
-3
0.8
15
y (LacY-GFP)
y (LacY-GFP)
0.7
10
5
0
0
20
40
60
80
100
time
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
ヒステリシスなし
-5
0.6
120
0
ヒステリシスあり
0
20
40
60
80
100
time
120
シミュレーション演習
狙い
初日イントロ
2日目プローブと信号
3日目実験結果からの数理モデル作成
4日目時間パターンに対する選択的応答
5日目スイッチ応答とメモリ
6日目振動現象
ネガティブフィードバックのみ
Repressilator
入力
Repressilator
Michael B. Elowitz & Stanislas Leibler ,2000,Nature
39
ポジティブ+ネガティブフィードバック
Action potential (活動電位）
Hodgkin Huxley model
↓
FitzHugh-Nagumo model
Stim. elec
Recd.
elec
ボトムアップ
時間情報コード
（ローカル）
動作原理
縮約（単純化）
トランスオミクス
（グローバル）
今回の実習はボトムアップトップダウン
最先端ではトップダウンも組み合わせる
生体のホメオスタシス（恒常性）
インスリン作用のシステム生物学
１．トランスオミクス
ローカル
グローバル
２．時間情報コード
インスリンの作用と標的臓器
インスリンの放出
炭水化物の全身での代謝を制御
グリコーゲン合成、糖新生、タンパク質合成
血糖を下げる唯一のホルモン
インスリンが作用できなくなると糖尿病に
インスリン作用のシステム生物学
個別の実験結果を人手で
自分の頭の中で再構築
それをマンガで表現
木を見て森を描く
インスリン作用のシステム生物学
個別の実験結果を人手で
自分の頭の中で再構築
それをマンガで表現
ハイスループットに大量計測
計算機を使って再構築を自動化
ルールに基づき表現
これから
木を見て森を描く
森を描いてから木を見る
インスリン作用の全貌
インスリン
Phospho-proteome
シグナル伝達
リン酸化
アロステリック
制御
代謝物
トランスオミクス解析による
インスリン作用経路の自動同定
インスリン
④ リン酸化プロテオミクス
③
1. 代謝物
2. 境界酵素
3. 境界酵素のリン酸化
4. インスリンから境界酵素ま
での経路同定
5. 代謝物によるアロステリッ
ク制御
メタボロミクス
48

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