異種移植と遺伝子改変 １．異種移植の推進になぜ遺伝子改変が必要か. ２．マウスでの遺伝子改変(gene targeting)法. ３．ミニブタでの遺伝子改変(gene targeting)法. －マウスと異種移植用動物でのgene targeting 法の違い－ ４．異種移植用遺伝子改変ミニブタ開発における現在の問題点と解決の方向性. １．異種移植の推進になぜ遺伝子改変が必要か. 同種移植、すなわちヒトからヒトへの移植においては免疫抑制剤 の開発によって拒絶反応(この場合には「急性拒絶反応」と「慢性 拒絶反応」)をコントロールできるようになり、移植医療が進展し た。 一方、ブタなどの臓器をヒトやサルに移植した場合には、移植後 数分以内に急激な拒絶反応(「超急性拒絶反応」)がおきる。ブタを 含めほとんどの哺乳類は細胞表面にaガラクトース抗原という糖鎖 をもっている。一方ヒトやサル(旧世界サルおよび霊長類)はこの糖 鎖をつくる酵素を欠損しているため、体内にaガラクトース抗原を もたず、この抗原に対する自然抗体を作っている(図)。ブタの臓器 をヒトやサルに移植するとブタのaガラクトース抗原にこの自然抗 体が結合し、これに補体が加わって細胞破壊のプロセスがはじまる。 この「超急性拒絶反応」を防ぐためには遺伝子改変によって上記の 糖鎖をつくる酵素を失活させ、ブタ臓器の細胞表面からaガラク トース抗原を除くことが最も有効な方法であると考えられている。 2. マウスでの遺伝子改変 (gene targeting)法 (下津 2005 を一部改変) Gene targetingとは？ • 特定の遺伝子に任意の突然変異を導入する技術. • トランスジェニックとの違い・・・トランスジェニックで は、導入遺伝子が染色体上にランダムに挿入され る。 ・用途・・・ノックアウトマウス・ノックインマウスの作製 - ノックアウトマウスは染色体上のある特定の遺伝子 を人為的に破壊し，機能を失わせたマウス. - ノックインマウスとは特定の場所に、特定の遺伝子 を導入したマウス. これらは遺伝子の機能を個体レベルで明らかにする ために有用である。 Gene targeting の流れ １．ES細胞を作る ２．遺伝子を組み換える ３．キメラマウスを作る ４．交配によって遺伝子欠損マウスを作る １．ES細胞を作る ・ ES細胞とは？ embryonic stem cell（胚性幹細胞）のこと. 体中のあらゆる細胞に分化する能力をもつ. ・ES細胞の作り方 胚盤胞期の卵の内部に できる細胞塊を取り出し、 分化阻害因子などを添 加しながら培養する. 全能性を保つには未分 化状態を維持することが 重要. ○ 通常は生殖系列(germ line)に入ることが確認されている ES細胞のlineを入手して利用することが多い。 ２．遺伝子を組み換える • 相同組換えという 現象を利用する • 相同組換えとは？ DNAの二重らせ んの一部がほぐれ、 そこに相同配列の 遺伝子がくると、本 来の鎖との間に組 換えを起こす現象 をいう. ・相同組換えを起こす 確率は低いので、 組換えが起こったこ とを見つける工夫が 必要。 ↓ ・ポジティブ選択 ・ネガティブ選択 ３．キメラマウスを作る • キメラマウスとは？・・・個体を構成する細胞が、異 なった遺伝的背景を持ったものから構成されてい るマウスのこと。 • 選別したES細胞を増 殖させて、胚盤胞期 の初期胚に注入し、 キメラマウスを作製 する． ES細胞 ４．交配して遺伝子欠損マウスを作る • キメラマウスの体内に，ES細胞に由来する生殖系 列の細胞があることが重要. • これを生殖系列キメラと呼び、このキメラマウスを交 配することによって、ES細胞由来のマウス個体を得 ることができる. ３．ミニブタでの遺伝子改変 (gene targeting)法. －マウスと異種移植用動物での gene targeting 法の違い－ マウスではES細胞を用いたgene targetingが日常的におこな われるようになったが、マウス以外の実験動物や家畜については 個体への分化後に生殖系列細胞(germ line)に寄与するES細胞 は知られていない。 1996年に体細胞核移植によるクローン羊の誕生が報告されて 以後、核移植クローン技術を用いた遺伝子改変(gene targeting) 個体の作出がおこなわれるようになった。すなわち、体細胞を培 養して体外でgene targetingなどの遺伝子操作をおこない、この 細胞をもちいて核移植クローンをつくることにより個体とする方法 である。 ブタについても上記の方法でknock out個体がつくられている。 Gene targeting の流れ １．体細胞を準備する. ２．遺伝子を組み換える. ３．核移植クローン個体をつくる. １．体細胞を準備する. ミニブタ培養体細胞 ○ 通常はembryonic fibroblastsなどを使うことが多い。 ２．培養体細胞を用いて遺伝子を組み換える • 相同組換えという現象 を利用する. • 相同組換えとは？ DNAの二重らせんの 一部がほぐれ、そこに 相同配列の遺伝子がく ると、本来の鎖との間 に組換えを起こす現象 をいう. 標的遺伝子 X 選択マーカー 正常ゲノム X targeting construct ｔargetingにより改変されたallele 選択マーカー ・ ES細胞は組換え活性が高いことが知られており、体細胞で は組換えが起こったことを見つける工夫がさらに重要となる. ３．核移植クローン個体を作る 体外成熟卵子の作成 除核 遺伝子改変細胞の導入 融合 fused embryosの活性化 発生開始 受胚雌に移植 ４．異種移植用遺伝子改変ミニブタ開発における 現在の問題点と解決の方向性. 培養体細胞での遺伝子操作と核移植クローン作出で、マウス以 外の動物においてもgene targetingを含む遺伝子改変が可能と なった。しかし、遺伝子操作をおこなった細胞からの核移植ク ローン作出効率は低く、また、体細胞クローン由来産子ではさま ざまな発生異常がおこることが知られている。 これらに対する対策として、より未分化で継続的な培養が可能 な細胞株を取得して核移植に用いることが考えられている。移植 核の初期化の機構については不明であるが、未分化な細胞ほど初 期化が容易であろうと考えられている。また、近年第4の幹細胞 としてGS細胞 (germ line stem cell 精子幹細胞)が注目されている。 この細胞は精巣より樹立され、in vitroで長期に培養可能、かつそ の間染色体異常がほとんど起こらない。遺伝子導入が比較的容易 とされており(マウスについてはgene targetingも報告されている)、 遺伝子改変GS細胞よりできた精子を用いて個体をつくることが できる。
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