理工学研究所 共同研究第１類 ⌮ᕤᏛ◊✲ᡤ ඹྠ◊✲➨㸯㢮 理工 微小管ドラッグ感受性突然変異株による チューブリン機能ドメインの同定 研究代表者 ◊✲௦⾲⪅ 箕浦 ⟪ᾆ 高子 㧗Ꮚ 研究員 ◊✲ဨ はじめに 微小管はα-およびβ-チューブリンのヘテロ⼆量体が規 ৵ଵमȘ-उेलș-ॳগشঈজথभঊॸট৬ऋૠ 則的に配列した管状重合体であり、細胞分裂時の紡錘体や ಋपଦഔखञଵ૾়৬दँॉؚཝীຝৎभၯᑪ৬ृ 鞭毛・繊毛の主軸を形成する。コルヒチンやノコダゾール Ꮖหྐ؞หभກ॑ਛघॊ؛॥ঝॳথृঀ॥ॲ॰شঝ など、微小管の重合を阻害する薬剤の多くはβ-チューブ ऩनؚ৵ଵभ়॑༛૩घॊఇදभऎमș-ॳগشঈ リンの特定の部位に結合し、そのコンフォメーションを変 জথभ્भਜ਼प়खؚजभ॥থইज़ওش३ঙথ॑ 化させることにより、微小管重合を妨げる。微小管の重合 ৲औचॊऒधपेॉؚ৵ଵ়॑࿉ऑॊ؛৵ଵभ় 阻害は細胞分裂を抑制するので、これらの薬剤は抗ガン剤 ༛૩मཝীຝ॑೪घॊभदؚऒोैभఇදमಿफ़থද としても⽤いられる。本研究は、突然変異株の作出が容易 धखथु৷ःैोॊ؛মଢ଼मؚே౮ઙभলऋઍಔ なモデル生物クラミドモナスからこうした薬剤に耐性を示 ऩঔॹঝেॡছॻঔॼ५ऊैऒअखञఇදपິਙ॑ં す突然変異株を単離し、微小管ドラッグの効果を分子構造 घே౮ઙ॑खؚ৵ଵॻছॵॢभટ॑ীଡୗ のレベルで解析しようとするものである。 भঞঋঝदੰෲखेअधघॊुभदँॊ؛ GDP （２）hpr1 ౮भ 変異の同定 كڮقhpr1 遺伝⼦配列を解析した結果、 ଦഔ॑ੰෲखञટ ؚhpr1の原因遺伝⼦はシャペロン hpr1भਉम३কঌটথ タンパク質APM1｛HSP40（熱ショックタンパク質）の一つ｝ ॱথঃॡସAPM1وHSP40ق३ঙॵॡॱথঃॡସكभणى をコードする遺伝⼦APM1であり、全⻑450アミノ酸のうちの18 ॑॥ॻشघॊAPM1 दँॉؚ৸শ450॔ঀभअठभ18 番目のグリシンが終⽌コドンに変化するナンセンス変異が⽣じ ৯भॢজ३থऋીૃ॥ॻথप৲घॊॼথ७থ५౮ऋেग ていることが判明した。APM1の変異株はこれまでにもいくつか थःॊऒधऋਖ਼खञ؛APM1भ౮ઙमऒोऽदपुःऎणऊ 報告されているが、null変異株が得られたのは、これがはじめて ਾઔऔोथःॊऋؚnull౮ઙऋ੭ैोञभमؚऒोऋमगीथ である。 दँॊ؛ 野生株 েઙ ATGCCCGGGGGCTTTGGAGAAATG 60 ATGCCCGGGGGCTTTGGAGAAATG GGAG 60 M P P G G G G F F G G E E M M 20 M 20 hpr1 ATGCCCGGGGGCTTTTGAGAAATG 60 ATGCCCGGGGGCTTTTGAGAAATG TGAG 60 M P P G G G G F F * * 18 M 18 図3）APM1 3كAPM1 のcDNA部分配列（上段）および推定アミノ酸配列（下段） भcDNAীଦഔقكउेल॔ঀଦഔৣقك β-tubulin ș-tubulin （３）抗 كگقಿ APM1 抗体の作成 ಿ৬भਛ コルヒチンなどの ॥ঝॳথऩनभ 結合部位 ়ਜ਼ GTP APM1-MBP 融合タンパク質を抗原とする抗 ়ॱথঃॡସ॑ಿਉधघॊಿ APM1 抗体を作 ಿ৬॑ 成した。野生株の細胞体にのみ、APM1タンパク質が検出された。 ਛखञ؛েઙभཝ৬पभाؚAPM1ॱথঃॡସऋਫ਼লऔोञ؛ プロピザミド উট উটআ२ॻ 図1）微小管と、その構成単位である 1ك৵ଵधؚजभଡਛਜ਼दँॊ α/β-チューブリンヘテロ⼆量体の構造 ̢̣-ॳগشঈজথঊॸট৬भଡୗ 図2）微小管ドラッグ、 2ك৵ଵॻছॵॢؚ プロピザミドとコルヒチン উটআ२ॻध॥ঝॳথ （１）新規プロピザミド耐性変異株 hpr1 भ の単離 كڭقৗૠউটআ२ॻິਙ౮ઙ UV照射によってクラミドモナスに突然変異を誘導し、新規プ UVසೝपेढथॡছॻঔॼ५पே౮॑ාखؚৗૠউ ロピザミド耐性変異株 hpr1 ॑खञ؛ を単離した。 hpr1 मউটআ२ॻ はプロピザミド টআ२ॻິਙ౮ઙ だけでなく、コルヒチンに対しても極めて高い耐性を示す。 टऐदऩऎؚ॥ঝॳথपৌखथुாीथৈःິਙ॑ંघ؛ 表1）hpr1 भউটআ२ॻິਙقཝੜ༢भਙૻຎك のプロピザミド耐性（細胞増殖の定性的比較） 1كhpr1 プロピザミド濃度 (M) 2 4 6 8 10 20 30 35 ++ + - - - - - ++ + + - hpr1 +++ +++ +++ +++ +++ 表2）hpr1 2كhpr1 のコルヒチン耐性（細胞増殖の定性的比較） भ॥ঝॳথິਙقཝੜ༢भਙૻຎك コルヒチン濃度 (mM) 0 野生株 +++ hpr1 +++ 0.5 1 1.2 各関 要 空気圧 軸方向 径方向 コルヒチン これまでの経過 0 装 ・広 空 α-tubulin Ș-tubulin 野生株 +++ +++ ・セン ・高出 1.4 1.5 2 4 +++ ++ ++ + - - - +++ +++ +++ +++ ++ + - –, swollen, dead cells incapable of dividing; +, some normal-sized dividing cells ++, many normal sized, dividing cells; +++, mostly normal sized, dividing cells. 共同研究者 ુଢ଼ 岩舘 గ࿂ 満雄（研究員、理⼯学部准教授） قଢ଼৩ؚ৶ੵ৾ၳઇ౸ك 小泉 ࿖ืقଢ଼৩ؚ৶ੵ৾ଢ଼ఐে୵ఐ৾௧వୖ ৵ 淳也（準研究員、理⼯学研究科生命科学専攻博士課 程前期２年） ஙڮফك 神谷 ઋદ 律（客員研究員、学習院⼤学理学部客員教授・理⼯ ق৩ଢ଼৩ؚ৾ಆপ৾৶৾৩ઇ౸؞৶ੵ 学部共同研究員） ৾ુଢ଼৩ك ― 12― ①：発現誘導前の ⋇؟ਠාभ ⼤腸菌全タンパク質 পႯ༳৸ॱথঃॡସ ②：発現誘導後の ⋈؟ਠාभ ⼤腸菌全タンパク質 পႯ༳৸ॱথঃॡସ ③：アミロースによる ⋉॔؟টش५पेॊ アフィニティ精製画 ॔ইॕॽॸॕಖଲ 分 ী 図4）APM1-MBP融合タンパク質の精製 4كAPM1-MBP়ॱথঃॡସभಖଲ ①：野生株、細胞体 ⋇؟েઙؚཝ৬ ②：hpr1、細胞体 ⋈؟hpr1ؚཝ৬ ③：野生株、鞭毛軸糸 ⋉؟েઙؚᏆหກໃ ④：hpr1、鞭毛軸糸 ⋊؟hpr1ؚᏆหກໃ ＊：非特異的反応 ؟ٮశ્౮ખૢ MR 図5）抗APM1抗体による 5كಿAPM1ಿ৬पेॊ ウエスタンブロッティング क़ग़५ॱথঈটॵॸॕথॢ hpr1 はapm1のnull変異株と判明した（図３）。抗 मapm1भnull౮ઙधਖ਼खञق؛كگಿ APM1抗体を⽤いたウエスタンブロットの結果、野生株の APM1ಿ৬॑৷ःञक़ग़५ॱথঈটॵॺभટؚেઙभ APM1は主に細胞体に局在することが明らかになった（図 APM1मपཝ৬पଂघॊऒधऋैऊपऩढञق ５）。APM1 は細胞質内ではたらく唯一の1型HSP40であ ؛كڱAPM1 मཝସदमञैऎིभ1HSP40दँ り、それが全く発現しなくても細胞の増殖性や運動機能に ॉؚजोऋ৸ऎਠखऩऎथुཝभੜ༢ਙृઈਃચप 一⾒何の異常も認められなかったことは、意外である。 ৄ୦भ౮ଞुੳीैोऩऊढञऒधमؚਔਗदँॊ؛ また、hpr1 ऽञؚhpr1 は既存のapm1 मใோभapm1 変異株とは異なり、APM ౮ઙधम౮ऩॉؚAPM やプロピザミドだけでなく、コルヒチンにも耐性を示す新 ृউটআ२ॻटऐदऩऎؚ॥ঝॳথपुິਙ॑ંघৗ 規の性質をもつ（表１，２）。 ૠभਙସ॑ुण؛كڮڭق HSP70/HSP40シャペロンシステムでは、タンパク質の HSP70/HSP40३কঌটথ३५ॸदमॱؚথঃॡସभ フォールディング活性を担うHSP70は数種類に限られて ইज़شঝॹॕথॢણਙ॑૿अHSP70मਯரథपैोथ おり、多数存在するHSP40がそれぞれシャペロン作⽤の उॉؚਯோघॊHSP40ऋजोझो३কঌটথ৷भ 対象を限定すると考えられている。apm1変異により ৌ॑घॊधઅइैोथःॊ؛apm1౮पेॉ チューブリン重合阻害剤に対する性質が変わることから、 ॳগشঈজথ়༛૩දपৌघॊਙସऋॎॊऒधऊैؚ APM1はチューブリンまたは微小管をHSP70/HSP40シャ APM1मॳগشঈজথऽञम৵ଵ॑HSP70/HSP40३ক ペロンシステムに誘導する機能をもつ可能性が考えられる。 ঌটথ३५ॸपාघॊਃચ॑ुण૭ચਙऋઅइैोॊ؛ あるいは、微小管を不安定化または脱重合させる因子のは ँॊःमؚ৵ଵ॑ਂ৲ऽञम়औचॊभम たらきを阻害することにより、間接的に微小管を安定化さ ञैऌ॑༛૩घॊऒधपेॉؚமप৵ଵ॑৲औ せている可能性もある。 चथःॊ૭ચਙुँॊ؛ 本研究により⾒出された微小管と微小管ドラッグ、シャ মଢ଼पेॉৄলऔोञ৵ଵध৵ଵॻছॵॢؚ३ক ペロンとの新たな関係は、新タイプの抗がん剤開発への手 ঌটথधभৗञऩঢ়બमؚৗॱॖউभಿऋ॒ද৫षभু がかりを与えるものである。 ऋऊॉ॑ଖइॊुभदँॊ؛ ・肘関 トル ・部品 ・上腕 ＜ ポテ ン ひ
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