研究推進・支援本部 麻布大学 麻布 大 学 研 究 推 進・支 援 本部 改変蛍光タンパク質遺伝子を用いた 新しい変異原試験法の開発 Development of a new method for testing mutagenicity using modified fluorescence protein genes 久松 伸 講師 麻布大学 生命・環境科学部 環境科学科 環境遺伝子工学研究室 Shin Hisamatsu / Assistant Prof. Department of Environmental Science, School of Life and Environmental Science 化学物質に対する変異原性の評価には、微生物を用いる簡便な方 法から高等生物を用いた様々な方法がある。微生物を用いる方法は 操作が簡便であるという利点があるものの、微生物はヒトに比べ代謝 系に大きな違いがあることから、必ずしもその試験結果をヒトに外挿で きないことが危惧される。また、マウスなどの高等生物を用いる方法で は、操作が煩雑で判定に熟練した技術が必要などの欠点がある。この 様なことから今回、培養細胞を用い評価が容易な新しい変異原性試験 方法の開発を行った。 本法では、まず、DNAの変異を容易に検出できるよう、緑色蛍光タン 既存の変異原試験法 微生物を用いる方法 利点： 操作が簡便、迅速な判定が可能 欠点： 微生物はヒトに比べ代謝系に大 きな違いがあり、必ずしも試験結 果をヒトに外挿できない 哺乳動物を用いる方 法 利点： ヒトに近いモデルで毒性の評価 パク質（AcGFP）遺伝子に変異原性によるDNA損傷を検出するための 標的配列を連結した改変AcGFP遺伝子を構築した。続いて、この遺伝 子をヒト腎細胞由来培養細胞に導入し、緑色蛍光を発する細胞株を得 た。得られた細胞のDNA損傷の感受性を調べるために、いくつかの変 異原性物質を培地に加え、細胞毎の蛍光強度をセルアナライザーを 用いて調べた。その結果、変異原性物質を暴露すると、ほぼ濃度依存 的に蛍光が消失する細胞が増加することがわかった。 従って本法は、哺乳動物を対象とした、化学物質の変異原性を簡便 に評価できる試験法となると考えられる。 pAcGFP1-N1 CMV pro が可能 欠点： 操作が煩雑で、判定には熟練し た技術が必要 pMC-TG AcGFP Ter 変異原検出用配列 培養細胞を用い、評価が容易な緑色蛍光タンパク質 (AcGFP)遺伝子を用いた新しい試験法の開発 細胞数 遺伝子を導入していな い細胞と遺伝子を導 入 した細 胞の 蛍光 強 度 か ら 無 蛍光 領 域 と 蛍光領域を定義した。 供試した変異原性物質 methyl methanesulfonate ethyl methanesulfonate N-methyl-N-nitrosourea N-ethyl-N-nitrosourea mitomycin C (MMC) 5-fluorouracil 1-nitropyrene 蛍光が消失した細胞の割合 (%) GFP強度 AcGFP遺伝子を導入した 細 胞 （ GFP293 細 胞 ） を MMC に 暴 露 す る と 、 225 nMまではコントロールに比 べ有意差はなかった。一方 、改変したAcGFP遺 伝子 を 導 入 し た 細 胞 （ TGFP293細胞）は、濃度依 存的に応答した。 本法は、微生物を用いる試 験法や哺乳動物の培養細 胞を用いた他の 試験法 と 同様の応答を示した。他の 変異原性物質を供試した 場合にも、他法と同様の応 答を示した。 MMC濃度 (nM) 本法は、他の試験法と同様の応答を示しており、直接ヒトの細胞を用いた定量的な評価が可能あることや、短時間の簡単な操作で変異原試験を 行えるため、化学物質の変異原性を調べる一次スクリーニングなどに適用できると考えられる。（特許出願済み） 〒252-5201 神奈川県相模原市中央区淵野辺1-17-71 TEL:042-754-7111(ext.2438) FAX:042-850-2511 E-mail: [email protected] URL: http://www.azabu-u.ac.jp/sgk/ 担当：根本，渡邉
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