non-thermal plasma inactivation of - ETH E

DISS. ETH NO. 23318
NON-THERMAL PLASMA INACTIVATION
OF MICROORGANISMS
ON GRANULAR FOOD PRODUCTS
A thesis submitted to attain the degree of
DOCTOR OF SCIENCES of ETH ZURICH
(Dr. sc. ETH Zurich)
presented by
DENIS BUTSCHER
MSc ETH PE, ETH Zurich
born on 14.02.1984
citizen of Federal Republic of Germany
accepted on the recommendation of
Prof. Dr. Dr. h.c. Philipp Rudolf von Rohr (ETH Zurich), examiner
Prof. Dr. Martin Loessner (ETH Zurich), co-examiner
2016
Abstract
Fresh produce is frequently contaminated with microorganisms from air
and dust, water and soil, from animal feces and pollution during transport
and processing. Focusing on wheat grains, their native microflora may contain bacteria or molds which deteriorate product quality and spoil grains
so that crop loss is a major problem. Moreover, some toxin-producing and
pathogenic microorganisms are occasionally found on wheat grains which
can pose a threat to human health. Even more serious is the situation for
sprouts such as alfalfa. Like wheat grains, they naturally carry a great variety of microorganisms, which may also include pathogens like Salmonella,
pathogenic Escherichia coli or Listeria monocytogenes. This microflora is
strongly proliferated during the sprouting process since the applied conditions (warm, humid, nutrient rich) are also favorable for bacterial growth.
As sprouts are often eaten raw or rarely processed, thermal inactivation of
microorganisms during cooking does not apply. That is why the consumption of sprouts has frequently resulted in serious outbreaks of foodborne
illnesses.
Numerous methods for the decontamination of grains, seeds and sprouts
have been investigated, including chemical interventions (chlorine based,
ozone, organic acids, electrolyzed water), biological interventions (protective cultures, bacteriocins, bacteriophages) and physical interventions (thermal inactivation, electromagnetic field, irradiation, UV light, high pressure,
super critical CO2 treatment). However, no treatment has yet achieved sufficient inactivation of pathogens on an applicable and competitive industrial
scale while maintaining the product quality.
In this thesis, non-thermal plasma treatment is investigated as a promising
alternative for the decontamination of granular food products, where the
synergistic combination of plasma-generated charged and excited species,
reactive neutrals and UV photons can inactivate microorganisms. For this,
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Abstract
two versions of a low pressure plasma circulating fluidized bed reactor
(PCFBR) were designed and constructed based on fluid dynamic simulations of pneumatic conveying in the riser tube. The plasma discharge was
then characterized with optical, electrical and thermal probes to quantify
the concentration of plasma-generated reactive species and to evaluate the
thermal impact on substrate particles. Finally, the inactivation of bacterial
endospores on wheat grains through plasma was investigated under the
variation of treatment time, plasma power input, pressure and process gas
composition.
To avoid the high expenses of vacuum equipment, the focus was then shifted
to atmospheric pressure systems and a dielectric barrier discharge (DBD)
was constructed for the plasma treatment of granular food products. With
this plasma discharge wheat grains and sprout seeds were decontaminated,
and the influence of the type of microbial contamination, substrate surface
properties and moisture content, as well as the impact of power supply
settings were studied. Besides the inactivation of microorganisms also the
effect of plasma treatment on the product quality (baking performance of
wheat dough, germination probability of sprout seeds) was investigated.
The general capability of the applied plasma systems to inactivate microorganisms was demonstrated with polymeric model substrates, where
the contamination with bacterial endospores could be reduced by 4.04 logarithmic units (log) in the low pressure PCFBR and by 4.79 log in the
atmospheric pressure DBD. In contrast, the decontamination of granular
food products turned out to be considerably more challenging, since microorganisms on natural products are more difficult to attack as they can be
protected by the rough surface structure and crevices, thus being shielded
from plasma-generated reactive species. At comparable conditions, the reduction of bacterial endospores on wheat grains was only 1.10 log in the
PCFBR and 1.02 log in the DBD.
Differences in inactivation efficiency were also observed when comparing
different microbial systems (native microflora, artificial E. coli contamination, bacterial endospores), which might be influenced by the location of
microorganisms in the seed matrix, but also due to variations in their resistance attributed to the cell wall structure. For example, under the same
conditions the native microflora on alfalfa seeds was reduced by 1.60 log in
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the DBD, while the plasma inactivation of artificially deposited E. coli resulted in a reduction of 1.89 log and Bacillus amyloliquefaciens endospores
in contrast were only reduced by 0.78 log.
Improvement in treatment efficiency was possible by modifying the sample
moisture content. Moistening alfalfa seeds from 8.76 to 17.00 %wb (percent
wet based) increased the reduction of the native microflora in the DBD
from 0.75 to 1.66 log. Further moistening, however, reduced the inactivation
efficiency (0.56 log at 29.82 %wb ). The beneficial aspect of moisture can be
attributed to the formation of reactive oxygen species , whereas humidity
in the plasma discharge is also known to quench the plasma and reduce the
generation of reactive species. The optimum in substrate moisture content
depends on the type of substrate and microbial contamination, but also
the type of plasma discharge and its operating conditions are supposed
to play a role. For example, the decontamination of wheat grains from
bacterial endospores in the DBD was better for 14.81 %wb (1.44 log) than
for 17.01 %wb (1.02 log). Besides the variation in sample moisture content,
also the type of process gas affects the intensity of the plasma discharge
and the formation of reactive species, where argon showed best results in
PCFBR experiments, closely followed by air, but differences to other gases
(oxygen, nitrogen and mixtures) were rather small.
Further improvement could be achieved by tuning the settings of the plasma
power supplies. In PCFBR experiments an increase in power elongated the
axial extent of the plasma zone and slightly increased the inactivation of
endospores on wheat grains, and in DBD experiments elevating the frequency or voltage of the pulsed power supply also resulted in higher inactivation due to an increase in power density and the formation of reactive
species. For example the logarithmic reduction of bacterial endospores was
increased from 0.44 to 1.29 when augmenting the voltage from 6 to 10 kV,
and the reduction of the native microflora on alfalfa seeds was increased
from 1.07 to 2.04 log when doubling the frequency from 5 to 10 kHz.
While a higher power density has shown to be beneficial for plasma decontamination, it simultaneously increased the gas temperature in the discharges. Therefore, it was carefully evaluated, if the thermal impact was
responsible for microbial inactivation and if the product quality was affected. In the PCFBR, energy influx measurements and the solution of the
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Abstract
heat equation showed a maximal surface temperature of wheat grains of
90 ○C for the conditions applied, which does not inactivate bacterial endospores, and a bulk temperature of 60 ○C, which should not affect wheat
grain quality. In agreement to this, the analysis of functional wheat grain
properties did not show any degradations. Measurements of the gas temperature in the DBD also showed a maximum temperature of around 90 ○C
for applied conditions. This temperature did not result in the reduction of
tested microorganisms and wheat grain quality was not affected, but the
germination potential of alfalfa seeds was reduced for temperatures higher
than 65 ○C. For lower process gas temperatures, the germination probability
could, however, be improved up to 20 % as compared to untreated seeds.
In addition to temperature, the impact of mechanical stress was tested,
where a small contribution to inactivation was observed in the PCFBR
due to abrasion, while the microbial contamination in DBD experiments
was unaffected by the vibration of the discharge. Furthermore, also the
electromagnetic field and the inert gas atmosphere (argon) did not harm
microorganisms. As a result, the inactivation of microorganisms could be
attributed to the plasma-generated reactive species, and chemical sputtering was assumed to be the predominant mechanism, where ions cause
defects in the coat of microorganisms and oxygen species interact with these
defects to form volatile compounds.
In summary, experimental results in this thesis show that plasma decontamination of granular food products is possible, but it is considerably more
challenging than the plasma decontamination of smooth model substrates.
It was found that the inactivation efficiency can be improved by adapting
the sample moisture content, the process gas mixture and the settings of
the plasma power supply. Highest reduction of Bacillus amyloliquefaciens
endospores on wheat grains was 2.59 log after an effective treatment time
of 73.5 s in the PCFBR, and Geobacillus stearothermophilus endospores on
wheat grains were reduced by 3.12 log after 60 min treatment in the DBD.
In the same setup, E. coli on alfalfa seeds could be reduced by up to 3.00 log
within 10 min. Functional wheat grain properties were not affected by the
applied plasma conditions, and the germination potential of alfalfa seeds
could even be improved with mild treatment.
Zusammenfassung
Bei frischen Lebensmitteln ist häufig eine Kontaminierung durch Mikroorganismen festzustellen, die aus der Umwelt (Luft, Staub, Wasser, Erde, Tierfäkalien) oder durch eine Verschmutzung während des Transports
bzw. im Verarbeitungsprozess auf die Produkte übertragen wird. Bei Weizenkörnern, die im Fokus der vorliegenden Arbeit stehen, kann die natürliche Mikroflora Bakterien und Schimmelkulturen enthalten, die die Produktqualität verschlechtern oder die Weizenkörner verderben können, was
zu grossen Ernteverlusten führen kann. Darüber hinaus werden auf Weizenkörnern immer wieder auch toxinbildende und pathogene Mikroorganismen festgestellt, die eine Gesundheitsgefahr für den Menschen darstellen können. Noch bedenklicher ist dieser Umstand mit Blick auf Sprossen
wie beispielsweise Alfalfasprossen. Wie Weizenkörner tragen auch Sprossen
von Natur aus eine grosse Vielzahl von Mikroorganismen auf ihrer Oberfläche, unter denen sich auch Krankheitserreger wie Salmonellen, pathogene
Escherichia coli oder Listeria monocytogenes finden können. Insbesondere
während des Keimprozesses kann sich diese Mikroflora stark vermehren, da
die dabei angewendeten Bedingungen (warm, feucht, nährstoffreich) auch
förderlich für das Bakterienwachstum sind. Da Sprossen häufig roh oder nur
wenig verarbeitet verzehrt werden, erfolgt keine thermische Inaktivierung
wie z.B. während eines Kochvorgangs. Daher hat der Verzehr von Sprossen
in der Vergangenheit auch immer wieder zu lebensmittelbedingten Krankheitsausbrüchen geführt.
In der Forschung finden sich zahlreiche Methoden zur Dekontaminierung
von Getreidekörnern, Samen und Sprossen, wie beispielsweise chemische
Behandlungen (auf der Basis von Chlor, Ozon, organischen Säuren, elektrolysiertes Wasser), biologische Behandlungen (Schutzkulturen, Bakteriozine, Bakteriophagen) und physikalische Behandlungen (thermische Inaktivierung, elektromagnetische Felder, Bestrahlung, UV-Licht, Hochdruck,
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Zusammenfassung
überkritische CO2 -Behandlung). Bislang lieferte jedoch keine der Behandlungsmethoden zufriedenstellende Ergebnisse hinsichtlich der Inaktivierung
von Pathogenen auf Lebensmitteln, die im industriellen Massstab wirtschaftlich umsetzbar ist und zugleich die Produktqualität erhält.
Die vorliegende Arbeit befasst sich mit der Behandlung von kornförmigen
Nahrungsmitteln durch ein nicht-thermisches Plasma als einer viel versprechenden Alternative im Bereich der Lebensmitteldekontaminierung. Bei
dieser Methode führt die synergetische Kombination von durch Plasma erzeugten geladenen und angeregten Teilchen, reaktiven Neutralteilchen und
UV-Photonen zur Inaktivierung von Mikroorganismen. Hierzu wurden, basierend auf fluiddynamischen Simulationen der pneumatischen Förderung
im Steigrohr, zwei Ausführungen einer bei Niederdruck betriebenen zirkulierenden Wirbelschicht mit integrierter Plasmazone (plasma circulating
fluidized bed reactor, PCFBR) ausgelegt und konstruiert. Um die Konzentration der durch Plasma erzeugten reaktiven Teilchen quantifizieren und
die thermische Belastung der behandelten Substrate beurteilen zu können,
erfolgte in einem nächsten Schritt eine Charakterisierung der Plasmaentladung mittels optischer, elektrischer und thermischer Sonden. Schliesslich
wurde die Inaktivierung bakterieller Endosporen auf Weizenkörnern durch
die Plasmabehandlung unter Veränderung von Behandlungsdauer, PlasmaLeistungseintrag, Druck und Zusammensetzung des Prozessgases untersucht.
Um die hohen Betriebskosten von Vakuumanlagen zu umgehen, wurde der
Fokus in der weiteren Untersuchung auf Systeme, die bei Atmosphärendruck operieren, gerichtet und eine dielektrische Barrierenentladung (dielectric barrier discharge, DBD) zur Behandlung grobkörniger Nahrungsmittel konstruiert. Mittels dieser DBD wurden Weizenkörner und Sprossensamen dekontaminiert und dabei die Einflüsse der Art der mikrobiellen
Verunreinigung, der Oberflächeneigenschaften des Substrats und dessen
Feuchtigkeitsgehalts sowie der Einfluss der Einstellungen der Stromquelle untersucht. Neben der Inaktivierung von Mikroorganismen wurden auch
die Auswirkungen der Plasmabehandlung auf die Produktqualität betrachtet.
Das grundsätzliche Potenzial der in der vorliegenden Arbeit verwendeten
Plasma-Systeme zur Inaktivierung von Mikroorganismen konnte mit Hil-
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fe von Modellsubstraten aus Kunststoff gezeigt werden. Dabei wurde im
PCFBR eine Reduktion der Kontamination mit bakteriellen Endosporen
von 4.04 logarithmischen Einheiten (log) und in der DBD eine Reduktion
von 4.79 log erreicht. Im Gegensatz dazu stellte sich jedoch die Dekontaminierung von Weizenkörnern und Sprossensamen weitaus schwieriger dar,
da Mikroorganismen auf natürlichen Produkten durch die raue Oberfläche
sowie in Rissen und Spalten abgeschirmt und so vor den durch Plasma
erzeugten reaktiven Teilchen geschützt werden können. Unter vergleichbaren Bedingungen wurde lediglich eine Reduktion der Mikroorganismen von
1.10 log im PCFBR und 1.02 log in der DBD erreicht.
Ein Vergleich unterschiedlicher mikrobieller Verunreinigungen (natürliche
Mikroflora, künstliche Kontaminierung mit E. coli, bakterielle Endosporen)
zeigte ebenfalls Unterschiede in der Inaktivierungseffizienz, die auf die Lage
der Mikroorganismen in den Samenmatrizen zurückzuführen sein könnten,
aber auch eine Folge der unterschiedlichen Resistenz der Zellwandstrukturen sein könnte. So konnte unter gleichen Bedingungen beispielsweise die
natürliche Mikroflora auf Alfalfasamen durch die Plasmabehandlung in der
DBD um 1.60 log reduziert werden, wohingegen die künstlich aufgebrachte Kontamination mit E. coli sogar um 1.89 log, die Kontamination mit
Bacillus amyloliquefaciens Endosporen aber lediglich um 0.78 log reduziert
werden konnte.
Eine Verbesserung der Behandlungseffizienz konnte durch eine Veränderung
des Feuchtigkeitsgehalts der Proben erreicht werden. Die Befeuchtung der
Alfalfasamen von 8.76 auf 17.00 %wb (Prozent feuchtebasiert) führte in der
DBD zu einer verbesserten Reduktion der Mikroflora von 0.75 auf 1.66
log. Eine weitere Befeuchtung verschlechterte die Reduktion aber wieder
(0.56 log bei 29.82 %wb ). Der teils vorteilhafte Einfluss der Feuchtigkeit
ist auf die Bildung reaktiver Sauerstoffspezies zurückzuführen. Dabei ist
jedoch zu berücksichtigen, dass Feuchtigkeit in der Plasmaentladung auch
zu einer Schwächung des Plasmas und einer Abnahme der Bildung reaktiver
Teilchen führen kann. Der optimale Feuchtigkeitsgehalt des Substrats ist
abhängig von der Art des Substrats und der mikrobiellen Verunreinigung,
aber auch die Art der Plasmaentladung und und ihre Betriebsbedingungen
spielen vermutlich eine Rolle. So war beispielsweise die Dekontaminierung
von bakteriellen Endosporen auf Weizenkörnern in der DBD wirksamer
bei einer Feuchtigkeit von 14.81 %wb (1.44 log) als bei einer Feuchtigkeit
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Zusammenfassung
von 17.01 %wb (1.02 log). Neben der Veränderung des Feuchtigkeitsgehalts
der Proben beeinflusst auch das verwendete Prozessgas die Intensität der
Plasmaentladung und die Bildung reaktiver Teilchen. Dabei zeigten sich
in den Versuchen im PCFBR bei der Verwendung von Argon die besten
Ergebnisse. Nur wenig schlechter fielen die Ergebnisse unter Verwendung
von Luft als Prozessgas aus, wobei die Unterschiede zu anderen Gasen
(Sauerstoff, Stickstoff und Argon/Sauerstoff- sowie Stickstoff/SauerstoffGasmischungen) ebenfalls nur gering waren.
Eine weitere Verbesserung konnte durch eine Veränderung der Einstellungen der Stromquelle der Plasmaentladung erreicht werden. In den Experimenten im PCFBR führte eine Erhöhung der Leistung zu einer grösseren
axialen Ausdehnung der Plasmazone sowie zu einer leicht verbesserten Inaktivierung von Endosporen auf Weizenkörnern. In den Experimenten in
der DBD führte eine Erhöhung von Frequenz oder Spannung der gepulsten
Stromversorgung ebenso zu einer besseren Inaktivierung, die auf eine Zunahme der Leistungsdichte und dadurch eine verstärkte Bildung reaktiver
Teilchen zurückzuführen ist. Zum Beispiel konnte die logarithmische Reduktion bakterieller Endosporen von 0.44 auf 1.29 log verbessert werden,
wenn die Spannung von 6 auf 10 kV erhöht wurde. Die Inaktivierung der
natürlichen Mikroflora auf Alfalfasamen liess sich durch eine Verdopplung
der Frequenz von 5 auf 10 kHz von 1.07 auf 2.04 log steigern.
Auch wenn sich eine erhöhte Leistungsdichte für die Dekontaminierung
durch Plasma zunächst als vorteilhaft zeigt, ist zu berücksichtigen, dass
sie zugleich auch zu einer Erhöhung der Gastemperatur in der Entladung
führt. Diese Tatsache erforderte daher im Weiteren eine Untersuchung um
festzustellen, ob die Temperaturzunahme ursächlich für die mikrobielle Inaktivierung war und ob sie die Produktqualität beeinflusste. Im PCFBR
ergaben Messungen des Leistungseintrags auf Oberflächen in der Plasmaatmosphäre und deren Analyse mittels der Wärmeleitgleichung eine maximale
Oberflächentemperatur der Weizenkörner von 90 ○C für die in den Experimenten verwendeten Versuchsbedingungen. Diese Temperatur führt nicht
zu einer Inaktivierung bakterieller Endosporen. Die Temperatur im Inneren der Weizenkörner lag unter 60 ○C, was die Qualität der Weizenkörner
nicht beeinträchtigen sollte. In Übereinstimmung dazu zeigte die Analyse
der funktionellen Eigenschaften der Weizenkörner keine Verschlechterung
der Teig- und Backeigenschaften. Die Messungen der Gastemperatur in der
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DBD ergaben unter Versuchsbedingungen ebenfalls ein Temperaturmaximum von ca. 90 ○C. Diese Temperatur führte zu keiner Reduzierung der
getesteten Mikroorganismen und auch die Qualität der Weizenkörner verschlechterte sich nicht. Bei den getesteten Alfalfasamen war hingegen eine
Abnahme der Keimfähigkeit bei Temperaturen über 65 ○C festzustellen.
Jedoch konnte bei geringeren Temperaturen des Prozessgases eine Verbesserung der Keimfähigkeit um bis zu 20 % gegenüber unbehandelten Samen
erzielt werden.
Neben dem Temperatureinfluss wurde auch der Einfluss mechanischer Belastungen analysiert. Die pneumatische Förderung der Weizenkörner im
PCFBR verursachte eine leichte Abrasion der Weizenkornschale und dadurch eine Reduktion der mikrobiellen Belastung. Die Vibration der DBD
zur gleichmässigen Behandlung der Substrate hatte hingegen keinen Einfluss auf die mikrobielle Belastung. Auch das elektromagnetische Feld und
die Argonatmosphäre wirkten sich nicht auf die mikrobielle Belastung aus.
Demzufolge konnte die Inaktivierung der Mikroorganismen auf die durch
Plasma erzeugten reaktiven Teilchen zurückgeführt werden. Als vorherrschender Mechanismus wurde chemisches Sputtern vermutet, bei dem der
Einschlag von Ionen auf der Substratoberfläche Schäden in der Zellwand der
Mikroorganismen verursacht, an denen Sauerstoffteilchen dann zu flüchtigen Verbindungen reagieren.
Zusammenfassend ist festzustellen, dass die Dekontaminierung grobkörniger Lebensmittel durch Plasma möglich, jedoch deutlich schwieriger als die
Behandlung glatter Modellsubstrate ist. Die Inaktivierungseffizienz kann
jedoch durch Anpassungen beim Feuchtigkeitsgehalts der Proben, der Prozessgasmischung und der Einstellungen der Stromquelle verbessert werden.
Das beste Ergebnis bei der Reduzierung von Bacillus amyloliquefaciens Endosporen auf Weizenkörnern lag bei 2.59 log nach einer effektiven Behandlungszeit von 73.5 s im PCFBR, und bei der Reduzierung von Geobacillus
stearothermophilus Endosporen auf Weizenkörnern bei 3.12 log nach einer
Behandlung von 60 min in der DBD. Bei den Alfalfasamen lag die Reduzierung von E. coli im selben System bei bis zu 3.00 log nach einer Behandlungsdauer von 10 min. Die funktionellen Eigenschaften der Weizenkörner
wurden durch die angewendeten Plasmabedingungen nicht beeinträchtigt.
Die Keimfähigkeit der Alfalfasamen konnte bei milder Behandlung sogar
verbessert werden.

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