HyVolution – Superauflösung mit einem konfokalen - Analytik-News

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Publikationsdatum: 21.04.2016
HyVolution – Superauflösung mit einem konfokalen Mikroskop
Rolf T. Borlinghaus, Constantin Kappel
Leica Microsystems Mannheim
Mit der Erfindung des Mikroskopes stellte
sich auch die Frage, ob es möglich sei, in
einem mikroskopischen Bild mehr Details zu
sehen, anstatt die Objekte einfach nur zu
vergrößern. Ernst Abbe war der erste, der
dieser Frage auf den Grund ging und herausfand, dass es tatsächlich eine Grenze für
die Feinheit der Details gibt, die in gewöhnlichen Lichtmikroskopen sichtbar werden
können[1].
Rohbildern noch versteckte Information
herauszukristallisieren. Jedes System, das in
der Lage ist, besser als die Abbe-Grenze
aufzulösen, wird „super-auflösend“ genannt[3].
Dabei muss klar sein, dass Abbe damit nicht
widerlegt wird: seine Überlegungen und seine
Schlüsse über die Sichtbarkeit von linienförmigen Objekten in klassischen Mikroskopen sind nach wie vor gültig. Dasselbe gilt
auch für die Analyse über die Trennbarkeit
von punktförmigen Emittern durch verschiedene Autoren[4][5][6], die zu einer Serie von
Auflösungsgrenzen führte, die alle nahe bei
der Abbe-Grenze liegen. Eine ausführliche
Erläuterung findet sich in [2].
Ernst Abbe setzte den Standard
Diese “Abbe-Grenze” hängt von der Wellenlänge des Lichtes (also seiner Farbe) und der
numerischen Apertur NA des verwendeten
Objektives ab:
d Abbe 

2  NA
Ernst Abbe im Original: „… so folgt, dass, wie
auch das Mikroskop in Bezug auf die förderliche Vergrößerung noch weiter vervollkommnet werden möchte, die Unterscheidungsgrenze für centrale Beleuchtung doch
niemals über den Betrag der ganzen, und für
äusserste schiefe Beleuchtung niemals über
den der halben Wellenlänge des blauen
Lichts um ein Nennenswerthes hinausgehen
wird“. Diese „äusserste schiefe Beleuchtung“
wird mit dem Einsatz eines Kondensors
erreicht, der wenigstens dieselbe numerische
Apertur hat, wie das Objektiv[2]. Dabei darf
man nicht vergessen: um 1850 n.Chr. war ein
Mikroskop zumeist ein Gerät für Durchlichtanwendung im Bereich des sichtbaren
Lichtes; die Fluoreszenzmikroskopie wurde
erst 50 Jahre später entwickelt.
Freilich löste so ein Statement einen Wettstreit darüber aus, ob es nicht doch möglich
wäre, besser als diese Grenze auflösen zu
können. Ultraviolett-Beleuchtung und neue
Immersionssysteme für höhere Aperturen
wurden entwickelt, wobei damit aber nur die
Parameter  und NA verändert werden – es
wird die Abbe-Grenze also verschoben, aber
nicht überschritten. Als Extremfall könnte
man hier das Elektronenmikroskop anführen,
bei dem die de-Broglie-Wellenlänge von der
Abb 1. Optischer Schnitt durch die Oberflächenstrukturen eines Pantoffeltierchens. Die
grünen Objekte sind Basalkörperchen der
Zilien, mit denen sich diese Lebewesen
im Wasser fortbewegen. Da die Oberfläche nicht glatt ist, sind nicht alle diese
Körperchen im Schärfebereich. Die ringförmigen Strukturen haben einen Durchmesser von etwa 200 nm. Sie werden mit
einem gewöhnlichen Mikroskop nicht
aufgelöst, wie an den geschlossenen
Kreisen des konfokalen Bildes im Hintergrund zu sehen ist.
Wendet man HyVolution auf diese
Objekte an, kann man die Ringe hervorragend auflösen, sichtbar im eingesetzten
Bild. Das Präparat wurde freundlicherweise von Anne Aubusson-Fleury, CNRS
Gif-sur-Yvette in Frankreich zur Verfügung gestellt.
Beschleunigungsspannung abhängt. Das
ermöglicht in der Praxis Auflösungen kleiner
als 0,1 nm.
Um die Abbe-Grenze wirklich zu überschreiten, kann man zwei unterschiedliche Ansätze
verfolgen. Ein Weg ist, optische Geräte und
Methoden zu entwickeln, die inhärent eine
höhere Auflösung ermöglichen, der andere
Weg führt über die Anwendung mathematischer Modelle auf die gemessenen Daten
zum Ziel. Dabei wird versucht, die in den
-1-
Optische Super-Auflösung
Ein optisches Gerät, das besser als die
Abbe-Grenze auflösen kann, ist das konfokale Mikroskop[7]. Üblicherweise wird die
konfokale Mikroskopie als Gold-Standard für
die Aufnahme optischer Schnitte betrachtet.
Das ist auch richtig, und wie es scheint, wird
dieses Verfahren auch seine Rolle als unverzichtbares Arbeitspferd für Fluoreszenzmikroskopie in der modernen Forschung in
Biologie und Medizin beibehalten. Daneben
bietet es auch eine ganze Serie verschiedener Anwendungen in der Materialwissenschaft, in der Halbleiterforschung, in der
Qualitätssicherung und in weiteren Gebieten.
Neben der Fähigkeit damit optische Schnitte
zu erzeugen – hier wird der Kontrast in der
Tiefe ausgenutzt –, kann ein konfokales
Mikroskop auch eine höhere laterale Auflösung bieten. Ebenso, wie die Dicke des
optischen Schnittes, hängt auch die laterale
Auflösung hier vom Durchmesser der Lochblende (Pinhole) im Detektionspfad ab[8]. Das
konfokale Mikroskop erzeugt im Zwischenbild
ein Beugungsmuster des leuchtenden Punktes im Präparat. Dieses Muster zeichnet sich
durch einen hellen zentralen Kreis („AiryScheibchen“) aus, der von hellen und dunklen Ringen umgeben ist. Normalerweise soll
die Lochblende gerade so groß wie dieses
Airy-Scheibchen sein (1 Airy-Unit, AU).
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Für diesen Fall, und alle größeren Durchmesser ist die laterale Auflösung mehr oder
weniger konstant und entspricht der lateralen
Auflösung eines gewöhnlichen Mikroskopes,
eben der Abbe-Grenze. Das ist die gestrichelte Kurve in Abbildung 2. Der Lochblendendurchmesser 1 AU wird durch die graue
senkrechte Linie angegeben.
Wird die Lochblende kleiner als 1 AU, dann
wird die laterale Auflösung besser, bis sie bei
einem Durchmesser von 0 einen beugungsbegrenzten Wert einnimmt, der etwa 30%
kleiner ist als die Abbe-Grenze. Natürlich
bleibt dieser Wert theoretisch, da nun gar
kein Licht mehr auf den Detektor fällt.
Bei einem Durchmesser von beispielsweise
0,6 AU, im Bild gekennzeichnet durch die
rote senkrechte Linie, wird diese Verbesserung schon um mehr als die Hälfte ausgenutzt, wobei der Lichtverlust im Vergleich
zu 1 AU nur etwa 10% beträgt. Die Helligkeit
ist im Bild durch die grüne Kurve wiedergegeben. Hier wurde der gesamte Lichtfluss
durch die Lochblende aufintegriert, der aus
einem punktförmigen Objekt stammt. Diese
Kurve enthält also keine Beträge von Objekten oberhalb oder unterhalb der Fokusebene,
deshalb strebt sie einem festen Grenzwert
zu, der hier zu 1 skaliert wurde. Man erkennt
aus der Kurve auch, dass die Helligkeit um
1 AU herum recht konstant ist. Das liegt
daran, dass das Beugungsmuster hier einen
dunklen Ring, also eine Nullstelle, aufweist
und deshalb die Intensität nicht zu- oder
abnehmen kann. Bei diesem Blendendurchmesser werden aber ohnehin schon fast 90%
des gesamten Lichtes aufgesammelt, und
eine weitere Öffnung wirkt sich nur marginal
auf die Helligkeit aus. Für eine Öffnung auf
beispielsweise 1,25 AU, angezeigt durch die
blaue senkrechte Linie, erhöht sich die Helligkeit um weniger als 2%. Wenn das Bild größerer Blenden deutlich heller wird, liegt das
daran, dass man nun unscharfe Bildbeiträge
mit aufnimmt. Das ist nun aber genau das,
was man durch die vergleichsweise hohe
Investition in ein konfokales Mikroskop vermeiden wollte – deshalb sollte die Blende
nicht über 1 AU geöffnet werden.
Wie oben angemerkt, wird in der konfokalen
Mikroskopie ein Durchmesser der Lochblende von 1 AU empfohlen. Weniger effizient arbeitende Geräte mögen es erforderlich machen, die Blende etwas weiter zu
öffnen, damit man überhaupt ein brauchbares
Bild aufnehmen kann. Für einen guten
Betrieb des Gerätes muss ein konfokales
Mikroskop eine hohe Transmission aufweisen. Das wird in der Leica SP-Serie durch
die Verwendung eines spektrometrischen
Detektors erreicht. Statt optischer Filter
kommt hier ein über den ganzen Wellen-
Abb. 2:
Optisches Verhalten eines konfokalen Mikroskopes in Abhängigkeit vom Durchmesser der
Lochblende.
Grün: Lichtmenge aus der Fokusebene.
Schwarz (gestrichelt): Auflösung in xy.
Schwarz (durchgezogen): Schichtdicke.
Die Intensität ist auf den maximalen Fluss normiert, die Halbwertsbreiten in optischen Einheiten.
Die absoluten Werte sind für die Betrachtung hier nicht relevant. Einzelheiten im Text.
Halbwertsbreiten nach [8].
längenbereich
gleichmäßig
hochtransparentes und polarisationsunabhängiges
Glasprisma zum Einsatz. Ein Spektrometerspalt hat tatsächlich 100% Transmission, da
er ja nur aus „Rändern“ besteht und kein
Glas enthält. Für simultane Aufnahme von
mehreren Kanälen dienen Spiegelschichten,
deren Reflexionsgüte bei 98% oder besser
liegt. Auch der Hauptstrahlteiler kann in der
Leica SP-Serie durch ein akustooptisches
Element ersetzt werden, den akustooptischen
Strahlteiler (AOBS)[9]. Die für die Anregung
ausgesparten Bändchen sind hier sehr
schmal (2-4 nm) und können sehr schnell
beliebig umgeschaltet werden. Die wertvollen
Photonen aus der Fluoreszenzemission
gehen deshalb nicht am Strahlteiler verloren.
Dazu kommt die Verwendung von modernsten Hybrid-Detektoren (HyD)[10], das sind
Sensoren, die bezüglich der Kombination aus
Photonenausbeute,
Rauscharmut
und
Geschwindigkeit allen klassischen Photoelektronenvervielfachern überlegen sind und
das Photonenzählverfahren auch bei gewöhnlich hellen Proben möglich machen. Das
sorgt für brillante Bilder – auch bei Lochblendendurchmessern unterhalb 1 AU:
Rechnerischen Superauflösung
„Sehen heißt glauben“ (Seeing is
believing[11]) scheint ein selbstverständlicher
Imperativ für wissenschaftliche Experimente
zu sein. Allerdings ist das Gegenteil der Fall!
-2-
Wenn wir etwas sehen, endet die Objektivität
hinter der Augenlinse. Die Retina, Teil des
komplexen und unberechenbaren Computers
namens „Gehirn“, macht schon räumliche
und zeitliche Verrechnungen des eintreffenden Lichtsignals, bevor ein Impuls in den
Sehnerv abgeschickt wird. Das „Bild“, das in
unserem Bewusstsein entsteht ist demnach
etwas, das wir allenfalls glauben können.
Wenn wir etwas wirklich wissen wollen, müssen wir Messungen anstellen. Deshalb sind
alte Stiche in antiken Mikroskopiebüchern
zwar sehr schön und kunstvoll, aber der
dargestellte Inhalt ist durch die Wahrnehmung des Mikroskopikers – und durch die
Fertigkeit des Künstlers – stark entstellt.
Realistischere Bilder konnte man nach der
Erfindung der Fotographie erzeugen. Aber
auch in der „nassen Fototechnik“ wurden
Verfahren ausgeklügelt, die es erlauben,
bestimmte Details besser zu sehen und
andere zu verdecken. Mit elektronischen
Aufnahmeröhren und der diese ersetzenden
Chip-Technologie, lassen sich erstmalig
aufgenommene Bilder direkt manipulieren.
Das sollte man wissen, wenn man seine
digitale Kamera verwendet: so gut wie kein
Gerät liefert heute noch Rohdaten – die
„Retina“ hat auch hier schon Einzug gehalten. Solche Bildmanipulationen bieten nämlich auch neue Lösungen. Die elektronischen
Verfahren erlauben Objekte sichtbar zu
machen, die vorher unsichtbar waren. Dabei
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wird dennoch nicht die Auflösung verbessert,
sondern der Kontrast künstlich gesteigert.
Wenn Objekte sehr klein sind, erzeugen sie
in einem Durchlichtmikroskop nur eine winzige Störung in einem ansonsten sehr hellen
Hintergrund. Durch Erhöhen der Verstärkung
und gleichzeitigem Verschieben der Nulllinie
können diese Störungen sichtbar gemacht
werden. Was man dann sieht ist ein
Beugungsmuster, dessen Form und Größe
durch die Gesetze der Beugung bestimmt
sind.
Heißt das nun, dass es gänzlich aussichtslos
ist, die Auflösung in bereits aufgezeichneten
Bilddaten zu verbessern? Einfache Kontrastund Helligkeitsänderungen, oder etwa Mittelverfahren und Schönung können das nicht
leisten. Aber es gibt ausgeklügelte Operationen, die genau dieses leisten. Die Idee
hinter den „Bild-Rekonstruktionsverfahren”[12]
ist klar und im Prinzip einfach. Das Licht, das
vom Objekt ausgeht, erfährt durch die optischen Elemente des Mikroskopes eine komplexe „Faltung“ (engl. convolution). Diese
Faltung kann man durch eine mathematische
Operation beschreiben. Wenn wir also die
dazugehörige inverse Operation auf die
Bilddaten anwenden, können wir hoffen, dass
das Ergebnis näher an der ursprünglichen
Helligkeitsverteilung im Objektraum liegt.
Solche Verfahren der „Deconvolution“ bieten
eine Erhöhung der Auflösung sowohl lateral
als auch axial um etwa ein zweifaches[13].
Dabei wird durch solche Entfaltung nicht nur
die Auflösung verbessert, sondern auch das
Rauschen vermindert, das Signal-RauschVerhältnis (SNR) also erhöht. Solche
Rechenoperationen brauchen freilich etwas
Zeit, aber man kann heute durch den Einsatz
von vielen parallel arbeitenden Hochgeschwindigkeitsprozessoren diese Zeit auf
einen Wimpernschlag reduzieren. Dazu wird
entsprechende Software zur mathematischen
Berechnung großer Datenmengen eingesetzt, etwa CUDA (Compute Unified Device
Architecture).
Das Zusammenspiel
Beliebig hohe Super-Auflösung ist nur möglich, wenn Moleküle eingesetzt werden, die
nichtlineares Verhalten zeigen. Beispielsweise solche, die zwischen zwei Zuständen
umschalten können – im einfachsten Fall
„dunkel“ und „hell“[14]. Solche unbegrenzt
superauflösende Verfahren sind STED
(Stimulated Emission Depletion) und die
Lokalisierungsmikroskopie[15].
Während STED eine Methode ist, die primär
keiner rechnerischen Verfahren bedarf, sind
die Lokalisierungsmethoden in hohem Maße
rechnerische Verfahren. Das Ergebnis bei
letzteren ist auch keine Intensitätsverteilung
Literatur
Abbe EK: "Beiträge zur Theorie des Mikroskops
und der mikroskopischen Wahrnehmung". Archiv
für Mikroskopische Anatomie 9 (1) 413–468, 1873
[2] Borlinghaus RT: „Konfokale Mikroskopie in
Weiß – optische Schnitte in allen Farben“
Springer-Verlag Berlin Heidelberg, Softcover ISBN
978-3-662-49358-8, DOI 10.1007/978-3-66249359-5 (2016)
[3] Lauterbach MA: “Finding, defining and breaking
the diffraction barrier in microscopy – a historical
perspective”. Nanoscopy 2012, 1:8
[4] Rayleigh (Strutt JW): “On the theory of optical
images, with special reference to the microscope”.
Philos Mag Ser 5 42(255): 167–195, 1879
[5] Sparrow CM: “On spectroscopic resolving
power.” Astrophysical Journal 44:76, 1916.
[6] Houston, WV: “A compound interferometer for
fine structure work.” Physical Review, 29 (3). pp.
478-484, 1927
[7] Minsky M: "Memoir on Inventing the Confocal
Scanning Microscope" Scanning 10, pp128-138,
1988
[8] Wilson T: “Optical Aspects of Confocal
Microscopy”, Chapter 3 in: Confocal Microscopy,
Ed: Wilson T, Academic Press, London, 1990
[9] Borlinghaus RT: “The white confocal“, The
European Physical Journal Plus. 127:131 (2012)
[10] Borlinghaus RT, Birk H and Schreiber F: “
Detectors for Sensitive Detection: HyD” in Current
Microscopy Contributions to Advances in Science
and Technology (A. Méndez-Vilas, Ed.) Formatex
(2012)
[11] Parœmiologia Anglo-Latina, Clarke J. (editor),
London, 1639
[12] Scientific Volume Imaging: Image Restoration
vs Image Enhancement retrieved Jan. 19th 2016
[13] Scientific Volume Imaging: Expectet Resolution
Improvement: retrieved Nov. 16th, 2015.
[14] Hell SW, Dyba M and Jakobs S: “Concepts for
nanoscale resolution in fluorescence microscopy.”
Curr Opin Neurobiol 2004, 14:599-609
[15]
Borlinghaus RT: „Unbegrenzte Lichtmikroskopie – über Auflösung und SuperHochauflösung und die Frage, ob man Moleküle
sehen kann“. Springer-Verlag Berlin Heidelberg, ebook ISBN 978-3-658-09874-2, DOI 10.1007/9783-658-09874-2 (2015)
[16] Schrader M, Hell SW & van der Voort HTM:.
”Potential of confocal microscopes to resolve in
the 50-100 nm range.” Appl. Phys. Lett. 69 (24),
pp. 3644-3646. (1996)
[17] Diaspro A, Annunziata S & Robello M: “SinglePinhole Confocal Imaging of Sub-Resolution
Sparse Objects Using Experimental Point Spread
Function and Image Restoration” Micr. Res.and
Tech
[1]
Abb. 3: Perfekt
aufgelöste
DNA-Origamis
(Gattaquant DNA Technologies) mit Leica
TCS SP8 HyVolution. Sogenannte “Nanorulers” mit einem Abstand der Emitter von
140 nm. Im Hintergrund gewöhnliche
konfokale Aufnahme, im vergrößerten
Kästchen zwei solcher Origamis bei Einsatz von HyVolution.
mehr, wie man das von einem gewöhnlichen
Bild erwartet, sondern eine räumliche
Koordinatenkarte einzelner Emitter.
Techniken, die begrenzte Superauflösung
bieten, beispielsweise strukturierte Beleuchtung oder optische Pixel-Neuordnung (image
scanning), verwenden Serien von Bildern, die
durch Berechnungen ein verbessertes Bild
ergeben. Eine Kombination von optischen
und rechnerischen Methoden ist also nicht
die Ausnahme, sondern eher der Regelfall.
Leica HyVolution verbindet diese Optionen in
einem hocheffizienten konfokalen Mikroskop
(Leica TCS SP) und einer professionellen
und bewährten Dekonvolutions-Software SVI
Huygens. Auflösungsverbesserung durch
reduzierte Pinhole-Durchmesser mit anschließender Entfaltung wurde für streuende
Objekte[16] und für fluoreszierende Objekte[17]
beschrieben. Die HyVolution Lösung integriert nicht nur die verbesserte Auflösung
durch sub-Airy konfokale Mikroskopie und
rechnerische Entfaltung, sondern bietet
zudem schnelle Berechnung durch CUDA
programmierte grafische CPU-Arrays und
eine bequeme und schnelle Übertragung der
Daten in die verschiedenen Module. Das
Leica TCS SP8 liefert durch die hohen
Transmissionen und hochempfindlichen
Sensoren dabei sehr rauscharme Bilder, so
dass die Entfaltung mit großem Gewinn und
sogar für simultan aufgenommene Mehrkanal-Bilder einfach und schnell möglich ist.
Abbildung 1 zeigt hervorragend aufgelöste
Basalkörperchen der Zilien von Pantoffeltierchen, die etwa 200 nm Durchmesser
haben. In Abbildung 3 ist eine gute Trennung
von Emittern in 140 nm auf einem DNAOrigami nachgewiesen.
-3-

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