Während der Lagerung freigesetzte und intrazellulär
verbliebene Zytokine TGFβ1 und sCD40L in
Thrombozytapheresekonzentraten von den Zellseparatoren
Trima und Amicus
______________________________________________
Aus der Chirurgischen Klinik mit Poliklinik der
Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg
Direktor: Prof. Dr. med. W. Hohenberger
durchgeführt in der
Transfusionsmedizinischen und Hämostaseologischen Abteilung
Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg
Leiter: Prof. Dr. med. R. Eckstein
Der Medizinischen Fakultät
der Friedrich-Alexander-Universität
Erlangen-Nürnberg
zur Erlangung des Doktorgrades Dr. med.
vorgelegt von
Melinda Vajko
aus Budapest
Als Dissertation genehemigt
von der Medizinischen Fakultät
der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg
Tag der mündlichen Prüfung: 05.05.2105
Vorsitzender des Promotionsorgans: Prof. Dr. med. Dr. h.c. J. Schüttler
Gutachter:
Prof. Dr. med. R. Zimmermann
Prof. Dr. med. R. Eckstein
INHALTSVERZEICHNIS:
1.
Zusammenfassung und Summary
1
1.1.
Zusammenfassung
1
1.2.
Summary
3
2.
Einleitung
5
2.1.
Thrombozytenkonzentrate
5
2.2.
Der Aufbau von Thrombozyten
6
2.3.
Funktion der Blutplättchen
7
2.4.
Thrombozytäre Proteinbiosynthese
10
2.5.
Wachstumsfaktoren in Thrombozyten
14
2.5.1.
Transforming growth factor β1 (TGFβ1)
14
2.5.2.
Löslicher CD40-Ligand (sCD40L)
16
2.6.
Zielsetzung der Studie
19
3.
Material und Methoden
21
3.1.
Studiendesign
21
3.2.
Spenderauswahl
21
3.3.
Probengewinnung
22
3.4.
Herstellung der Thrombozytenkonzentrate mittels Apherese 22
3.4.1.
Funktionsprinzip des Zellseparators Amicus
23
3.4.2.
Funktionsprinzip des Zellseparators Trima Accel
26
3.4.3.
Vergleichende Darstellung der Zellseparatoren
28
3.4.3.1.
Allgemeine Charakteristika der Maschinen
28
3.4.3.2.
Unterschiede der metabolischen Parameter
29
3.4.3.3.
Gebrauch des Antikoagulans
30
3.4.3.4.
Leukozytenreduktion
30
3.5.
Bestimmung der Spiegel von TGFβ1 und sCD40L mittels
ELISA-Technik
31
3.5.1.
Allgemeines Funktionsprinzip der ELISAs
31
3.5.2.
Quantitative Bestimmung des TGFβ1-Gehalts
32
3.5.3.
Quantitative Bestimmung des sCD40L-Gehalts
33
3.6.
Statistische Datenauswertung
35
4.
Ergebnisse
36
4.1.
Allgemeine Messparameter
36
4.2.
Thrombozytengehalt der Apheresekonzentrate
36
4.3.
Ergebnisse der ELISAs
37
4.3.1.
Messungen des Wachstumsfaktors TGFβ1
37
4.3.1.1.
Verlauf des TGFβ1 nach Apherese mit der Maschine
Trima Accel
4.3.1.2.
Verlauf der Konzentration des Zytokins TGFβ1 nach
Apherese mit der Maschine Amicus
4.3.1.3
37
39
Verlauf der intrazellulären TGFβ1-Konzentration im
Vergleich der Präparate beider Zellseparatoren
40
4.3.2
Messung des Wachstumsfaktors sCD40L
41
4.3.2.1.
Verlauf der Konzentration des sCD40L nach Apherese
durch den Zellseparator Trima Accel
4.3.2.2.
Verlauf der sCD40L-Konzentration in Produkten des
Zellseparators Amicus
4.3.2.3.
46
Vergleich des Zytokingehalts im CTAD-Plasma nach
Zellapherese durch Trima Accel und Amicus
4.4.2.
45
Gegenüberstellung der Zellseparatoren Trima Accel
und Amicus
4.4.1.
43
Verlauf des intrazellulären sCD40L im Vergleich
Trima Accel versus Amicus
4.4.
42
46
Vergleich der intrazellulären Zytokinkonzentration je 105
Thrombozyten in Trima Accel- und Amicus-Konzentraten
48
5.
Diskussion
51
6.
Literaturverzeichnis
63
7.
Abkürzungsverzeichnis
79
8.
Danksagung
82
9.
Lebenslauf
83
-1-
1.
ZUSAMMENFASSUNG UND SUMMARY
1.1
Zusammenfassung
Hintergrund und Ziele:
Thrombozytenkonzentrate werden heute am häufigsten zur Prophylaxe oder
Therapie von Blutungen bei Patienten mit hyporegenerativen Thrombozytopenien während der Behandlung maligner Neoplasien eingesetzt. Neben
anderen Inhaltsstoffen werden Zytokine, die sich in thrombozytären α-Granula
befinden, während der Lagerung von Thrombozytenkonzentraten freigesetzt.
Dazu gehören auch mehrere Zytokine, die explizit als angiogen und onkogen
gelten, unter anderem TGF(transforming growth factor)β1 und der lösliche
CD40-Ligand (sCD40L). Die Freisetzung dieser Zytokine könnte einen
Überlebensnachteil für Patienten zur Folge haben. Die vorliegende Arbeit
untersucht, wie viel TGFβ1 und sCD40L während der Lagerungszeit von
Thrombozytapheresekonzentraten
von
zwei
Zellseparatoren
in
den
plasmatischen Anteil freigesetzt wird, welcher intrazelluläre Verlust mit der
Freisetzung einhergeht und ob eine Neusynthese dieser Proteine stattfindet.
Material und Methoden:
32 Thrombozytenapheresekonzentrate von freiwilligen Spendern wurden im
Rahmen der Studie zur einen Hälfte am Zellseparator Terumo Trima Accel,
zur anderen Hälfte am Zellseparator Fenwal Amicus gewonnen. Den Thrombozytapheresekonzentraten wurden anschließend Proben entnommen, aus
denen einerseits CTAD-Plasma, andererseits mittels Zugabe des Detergens
Triton X-100 Lysat hergestellt wurde. Sowohl im zellfreien Plasmaüberstand
der Thrombozytapheresekonzentrate als auch im Lysat wurden TGFβ1 und
sCD40L mittels ELISA-Technik untersucht. Die Messungen erfolgten am
Entnahmetag sowie an den darauf folgenden Tagen +1, +3 sowie +5.
-2Ergebnisse:
Bedingt durch die höhere Thrombozytenkonzentration in den Konzentraten
vom Zellseparator Amicus waren die Konzentrationen von TGFβ1 und sCD40L
in den Lysaten dieser Konzentrate höher als in denen vom Zellseparator Trima
Accel. Bezogen auf 105 Thrombozyten bestanden keine Unterschiede.
Während der Lagerung nimmt der sCD40L-Gehalt in den Lysaten signifikant
um ca. ein Drittel ab, während der Gehalt des TGFβ1 weitgehend konstant
bleibt. In den Überständen steigen die Konzentrationen beider Zytokine
während der Lagerung an, wobei der überwiegende Anteil beider Zytokine bis
zum Tag +5 intrazellulär verbleibt.
Schlussfolgerungen:
Die zwei in dieser Studie eingesetzten Zellseparatoren Trima Accel und
Amicus weisen Unterschiede in ihrem Funktionsprinzip auf, was bekanntermaßen zu einer etwas stärkeren Thrombozytenaktivierung in Präparaten vom
Zellseparator Amicus führt. Dieser Effekt beeinflusst die nachweisbaren
Konzentrationen der Zytokine TGFβ1 und sCD40L in den Lysaten und den
Überständen jedoch kaum. Im Wesentlichen sind die Unterschiede auf die
unterschiedliche Konzentration der Thrombozyten in den Präparaten
zurückzuführen. Die Messungen zeigten ein Ausbleiben signifikanter
Veränderungen der intrazellulären TGFβ1-Menge während der fünftägigen
Lagerung. Dies kann als Hinweis auf eine kontinuierliche Nachsynthese
während den Tagen der Lagerung gewertet werden. Dagegen nimmt der
intrazelluläre Gehalt an sCD40L innerhalb der fünftägigen Lagerung um etwa
ein Drittel ab. Inwieweit diese Befunde tatsächlich klinische Signifikanz für die
Empfänger von Thrombozytapheresekonzentraten haben, kann man derzeit
nicht beantworten.
-31.2
Summary
Background
Platelet concentrates are most commonly used for prophylaxis or treatment of
bleeding in patients with hyporegenerative thrombocytopenia due to leukemia,
lymphoma or other malignant neoplasms. In addition to other ingredients of
platelet α-granules, cytokines are released during storage of platelet
concentrates. This includes several cytokines, which are explicitly considered
as angiogenic and oncogenic, including TGF-(transforming growth factor-)β1
and soluble CD40 ligand (sCD40L). The release of these cytokines could
cause a survival disadvantage for recipients of platelet concentrates. The
present study examined how much of TGFβ1 and sCD40L is released during
the storage period of plateletapheresis concentrates from two different cell
separators. In addition the measurements elucidate whether the release of
these cytokines is accompanied by an intracellular loss or is compensated by
de novo synthesis of these proteins.
Study Design and Methods
32 plateletapheresis concentrates were obtained from volunteer donors to one
half by cell separator Terumo Trima Accel and to one half by the Fenwal
Amicus cell separator. From samples of these plateletapheresis concentrates,
CTAD plasma was obtained by centrifugation. In addition, lysates were
prepared by means of addition of the detergent Triton X-100. The cell-free
supernatants as well as the lysates were examined for their content of TGFβ1
and sCD40L by an ELISA technique. The measurements were made on the
day of collection and on the days +1, +3 and +5 thereafter.
Results
Due to the higher platelet concentration in concentrates from the Amicus cell
separator, the concentrations of TGFβ1 and sCD40L in the lysates of these
concentrates were higher than in those from the Trima Accel cell separator. In
relation to 105 platelets there were no differences. During storage, the sCD40Lcontent increases in the lysates significantly by about one third, while the
content of TGFβ1 remains largely constant. In the supernatants, the
-4concentrations of both cytokines increase during storage. Nevertheless, the
majority of both cytokines remains intracellularly until day +5.
Conclusions
The two cell separators Trima Accel and Amicus, which were used in this
study, show differences in their operating principle, which leads – as is known
- to a slightly higher platelet activation in preparations from the cell separator
Amicus. This effect, however, hardly affected the detectable concentrations of
the cytokines TGFβ1 and sCD40L in the lysates and supernatants. Essentially,
the measured differences are due to the different concentration of platelets in
the concentrates from the two different cell separators. The measurements did
not show any significant changes in the intracellular TGFβ1 concentrations
during the five-day storage. This could indicate a continuous synthesis of
TGFβ1 by stored platelets. In contrast, the intracellular content of sCD40L
decreases within the five-day storage by about one third. To what extent these
findings actually are of any clinical importance for the recipient of platelet
concentrates, can not yet be answered.
-5-
2.
EINLEITUNG
2.1.
Thrombozytenkonzentrate
Thrombozytenkonzentrate bereichern seit über 50 Jahren die transfusionsmedizinischen Therapiemöglichkeiten [12]. Mit den Jahren stieg der Verbrauch
stark an, weil sich die Indikationen zur Thrombozytengabe änderten und
ausweiteten [130]. Früher wurden Thrombozytenkonzentrate nicht selten zu
therapeutischen Zwecken zur Behandlung akuter Blutungen beispielsweise im
Rahmen
komplizierter
Operationen
transfundiert
[12,130].
Mit
dem
medizinischen Fortschritt entwickelten sich aber rasch zunehmend feinere
Operationstechniken, so dass die Zahl der operativen Eingriffe zwar zunahm,
die Rate an massiven Blutungskomplikationen jedoch deutlich sank. Mittlerweile werden Thrombozytenkonzentrate perioperativ nur noch relativ selten
aus rein prophylaktischen Gründen während größerer Eingriffe verabreicht
[12,130]. Gelegentlich kommen sie bei schweren komplexen Hämostasestörungen bei Polytrauma und Schock zum Einsatz.
Die führenden Anwender von Thrombozyten sind heute nicht die chirurgischen, sondern die internistischen sowie die pädiatrischen Abteilungen, die
am häufigsten mit hyporegenerativen Thrombozytopenien während der Behandlung maligner Neoplasien konfrontiert sind [7,94,100,130]. In der Onkologie beinhalten die Therapieschemata häufig stark zytotoxische Chemotherapeutika, die neben den entdifferenzierten Zellen auch gesundes Gewebe in
Mitleidenschaft ziehen. Besondere Bedeutung haben hier hämatologische
Erkrankungsbilder wie Leukämien und maligne Lymphome, deren aggressive
Behandlung stark knochenmarktoxisch ist [3,7,100,130]. Dabei wird nicht nur
die intramedulläre Produktion von Leukozyten, sondern auch die von
Blutpättchen stark gehemmt [45,77,88], sodass viele Patienten vor allem in der
Phase der Induktionstherapie unter einer gravierenden Thrombozytopenie
leiden [3,7,48,63,75]. In der Folge können sich starke Blutungen entwickeln,
deren Risiko durch die vorbeugende Verabreichung von Thrombozytenkonzentraten ab einem Wert unter etwa 10.000 Thrombozyten/ µL
reduziert werden soll [11,12,100,101].
-6Generell sind zwei verschiedene Arten von Thrombozytenkonzentraten zu
unterscheiden: Zum einen gibt es die gepoolten Thrombozytenkonzentrate,
die aus Vollblutspenden von vier bis sechs Spendern hergestellt werden [30],
zum anderen die Einzelspender-Konzentrate, auch Thrombozytapheresekonzentrate, die in nur einer Sitzung an einem Zellseparator mittels Zytapherese
gewonnen werden [12,14,36,69,100]. In den letzten Jahren stieg die Anzahl
transfundierter Thrombozytapheresekonzentrate an, wohingegen die Zahl der
gepoolten Thrombozytenkonzentrate aus Vollblut abnahm [100]. Grund hierfür
ist unter anderem der Umstand, dass bei der Vollblutspende etwa fünf bis
sechs
Spender
gebraucht
werden,
um
durch
Pooling
die
gleiche
Thrombozytenzahl zu erreichen, die bei einem Apheresekonzentrat von nur
einem Spender gewonnen wird [100].
Im Anschluss an die Entnahme werden die Thrombozytenkonzentrate nach
ihrer Aufbereitung für den klinischen Gebrauch in den meisten westlichen
Ländern je nach Gesetzeslage 5 bis 7 Tage bei 22°C gelagert [94,100,121].
Nur in Deutschland wurde durch ein Votum des Arbeitskreises Blut beim
Bundesgesundheitsministerium im Jahr 2008 die Verwendbarkeit von
Thrombozytenkonzentraten auf die 4 dem Entnahmetag folgenden Tage
verkürzt [4].
2.2
Der Aufbau von Thrombozyten
Im Blut zirkulierende Thrombozyten sind kernlose Zellfragmente, die durch
Sequestrierung aus Megakaryozyten entstehen und in der Hämostase und bei
der Wundheilung eine zentrale Rolle spielen [49,122]. Sie messen 2 - 4 μm im
Durchmesser und haben ein Zellvolumen von 6 - 11 fl [85]. Normwerte der
Thrombozytenanzahl liegen zwischen 150.000 und 450.000/μl, wobei ein
gesunder Mensch pro Tag 35.000 bis 44.000 Blutplättchen pro μl Blut nachproduziert [85]. Die durchschnittliche Überlebenszeit der Plättchen beträgt
lediglich 9 - 11 Tage [100,118,122]. Nur ⅔ der Gesamtplättchenzahl befinden
sich in der Zirkulation. Das restliche Drittel wird reversibel in der Milz
gespeichert. [85,100]
-7Während der Abschnürung aus den Vorläuferzellen geht der Zellkern zwar
verloren [25,76], jedoch enthalten die reifen Blutplättchen noch Mitochondrien
und verschiedene Sekretgranula [20,27]. Elektronenmikroskopisch lassen sich
folgende Hauptelemente im Aufbau der Thrombozyten erkennen: Die äußere
Zone, die sich aus der Zellmembran und den mit ihr assoziierten Strukturen
aufbaut.
Die
Sol-Gel-Zone,
die
Matrix
des
Zytoplasmas,
die
mit
Mikrofilamenten, Mikrotubuli und submembranären Filamenten drei Fasersysteme besitzt [20]. Und zuletzt liegt in der Sol-Gel-Zone eingebettet die
Organellenzone des Thrombozyten mit zwei weiteren Hauptelementen. Für
den Energiehaushalt des Plättchens sind die Mitochondrien zuständig, die den
Stoffwechsel überwiegend aus aerober Glykolyse aufrecht erhalten [27,126].
In der Organellenzone finden sich zudem die Speichergranula der
Blutplättchen, von denen vier verschiedene Typen unterschieden werden
können: α-Granula, δ-Granula, Lysosomen und Mikroperoxisomen. Hervorzuheben sind hierbei die α-Granula, die eine Vielzahl an plättchenspezifischen
Proteinen enthalten, unter anderem β-Thromboglobulin, von-WillebrandFaktor, oder auch VEGF (Vascular endothelial growth factor), PDGF (Platelet
derived growth factor) und weitere Zytokine und Wachstumsfaktoren [21,106].
Es zeigt sich somit, dass Thrombozyten trotz absenten Zellkerns ein
organisiertes Zytoskelett, spezialisierte Sekretgranula sowie die für den
Energiegewinn erforderliche Organellen enthalten [122].
2.3.
Funktion der Blutplättchen
Grundsätzlich gilt es, Thrombozyten in einen aktiven Zustand zu versetzen,
bevor sie ihre Funktion ausüben können [34]. Dabei lassen sich zwei
Signalwege unterscheiden, die beide in die Aktivierung der Blutplättchen
münden. Einerseits spielt das bei einer Gefäßverletzung freigelegte Kollagen
eine Rolle [34]: So haften Thrombozyten zunächst durch ihren oberflächlichen
Kollagenrezeptor Glykoprotein VI an subendothelialen Kollagenstrukturen,
was zusätzlich durch den während des Traumas freigesetzten von-WillebrandFaktor getriggert wird [34,49]. Andererseits generiert der durch die
Gefäßwände freigesetzte Gewebefaktor (tissue factor) Thrombin, welches die
Thrombozyten nicht nur aktiviert, sondern auch die Freisetzung von ADP,
Serotonin und Thromboxan A2 aus den Plättchen bewirkt [34]. Diese
-8Mediatoren tragen zusammen mit Adrenalin zu der Adhäsion der bereits
aktivierten Blutplättchen bei. Des Weiteren rekrutieren sie ihrerseits weitere
Thrombozyten, die eine zusätzliche Stabilisierung des Thrombozytenpfropfs
bewirken [49].
Während dieser Interaktionen kommt es zu spezifischen, rezeptorvermittelten
molekularen Vorgängen, wie intrazelluläre Modellierung oder Phosphorylierung, die zunächst in einer präzisen Zell-Matrix-Adhäsion, dann schließlich
in Vesikelsekretion enden [122]. Infolge ihrer Strukturänderung entleeren die
Plättchen die in ihnen enthaltenen elektronendichten und α-Granula. Diese
tragen durch die Freisetzung von Thrombospondin zum Übergang der
reversiblen in die irreversible Thrombozytenaggregation bei, die zudem durch
Fibrinogenbrücken vernetzt wird [49]. Abbildung 1 verdeutlicht die Veränderungen der Thrombozyten nach ihrer Aktivierung.
Abbildung 1: Strukturen ruhender und aktivierter Thrombozyten
Thrombozytäre
Aktivierung
führt
zu
Phophorylierung
zytosolischer Proteine und zytoskeletalen Umbauvorgängen,
die in der Sekretion der α-Granula enden. [41]
-9-
Neben den bereits erwähnten Inhaltstoffen sind in den thrombozytären
Granula noch viele weitere Verbindungen gespeichert: Unter anderem finden
sich Fibrinogen, die Gerinnungsfaktoren V und VIII, der von-Willebrand-Faktor
sowie eine Reihe von weiteren Wachstumsfaktoren [49]. Diese Inhaltsstoffe
stimulieren nicht nur Fibroblasten, Muskelzellen und Osteoblasten, sondern
wirken sich auch chemotaktisch auf verschiedene Elemente der Wundheilung
und der Immunabwehr aus [133].
Neben ihrer Rolle als essenzieller Bestandteil der Hämostase stellen
Blutplättchen somit vielseitige Bestandteile des Blutes dar, die neben
thrombotischen
und
inflammatorischen
Ereignissen
auch
proliferative
Vorgänge beeinflussen [47,106,122].
Wie bereits oben erwähnt, werden in den α-Granula der Thrombozyten
Zytokine, Wachstumsfaktoren und andere bioaktive Moleküle gespeichert [63].
Vor allem deren onkogene und angiogene Eigenschaften [63,106] lassen ein
Wechselspiel
zwischen
Thrombozyten
und
Tumorzellen
vermuten
[6,11,47,53,79,106].
Bereits 1865 beschrieb der Internist Armand Trousseau [107] die heute unter
der klinischen Bezeichnung „Thrombophlebitis saltans sive migrans“ bekannte
Koinzidenz zwischen malignen Neoplasien und venösen Thrombosen
[53,106,127]. Er zeigte dabei an mehreren Kasuistiken auf, dass die phleböse
Thrombitis
als
Begleit-
bzw.
Folgeerscheinung
im
Rahmen
von
Karzinomerkrankungen auftreten kann [24,31,107].
Über diese tumorzellinduzierte Thrombozytenaktivierung [24,63,71,89] hinaus
gehen die Beobachtungen, dass hierbei nicht nur die Entstehung von
Thromben begünstigt wird, sondern auch die Tumorzellen selbst von den
aktivierten Blutplättchen profitieren. So bilden diese unter anderem eine Art
Schutzwall um die malignen Zellen, die sich dadurch vom Immunsystem
unerkannt durch die Gefäßstrukturen bewegen können [53,71,89].
Viel wichtiger ist jedoch die Feststellung, dass aktivierte Thrombozyten
ihrerseits die in ihnen gespeicherten Wachstumsfaktoren und Zytokine
freisetzen, sodass diese ihre Effekte auf die Neoangiogenese entfalten können
- 10 und somit Metastasierung unterstützen [3,46,63,79,106,127]. Mehrere
Untersuchungen zeigten, dass eine direkte Korrelation zwischen der
Aktivierung von Thrombozyten durch Tumorzellen in vitro und dem
Metastasierungspotenzial dieser Tumorzellen in vivo besteht. [71,81,106].
Hinzu kommt die Beobachtung, dass in Thrombozytenkonzentraten zur Transfusion nach der Entnahme während den Tagen der Lagerung eine Freisetzung
der gespeicherten Wachstumsfaktoren beziehungsweise Zytokine stattfindet
[21,67,72,75,132,134]. Diskutiert wird dabei, ob nicht nur die bereits vor der
Spende
angereicherten
und
intrazellulär
gespeicherten
Faktoren
ausgeschüttet werden, sondern ob Thrombozyten in der Lage sind, diese auch
in vitro selbstständig zu produzieren [95,118,128].
2.4
Thrombozytäre Proteinbiosynthese
Heute ist klar belegt, dass Blutplättchen trotz absenten Zellkerns in der Lage
sind, Proteinbiosynthese zu betreiben [29,60,65,95,118,122,123].Wie bereits
erwähnt verlieren Blutplättchen bei der Abzweigung aus ihren Vorläuferzellen
den Zellkern und somit auch die Fähigkeit zur Transkription der DNA in RNA
[95,122].
Ausnahmen bilden hierbei lediglich die 13 mRNA (messenger RNA) und die 2
rRNA (ribosomal RNA), die durch das mitochondriale Genom kodiert werden
[95,122].
Doch
auch
in
eukaryoten
Zellen
läuft
der Prozess der
Proteinbiosynthese nach der Transkription nicht mehr im Zellkern, sondern im
Zytoplasma ab [95]. Dort wird die mRNA prozessiert und aus dem Nukleus in
das Zytoplasma transportiert, wo sie schließlich in Proteine umgeschrieben
wird [122].
Auf diese Weise können auch Thrombozyten den Weg der Biosynthese ab
dem Schritt der Translation gehen. Dabei gliedert sich die Translation ebenso
wie in eukaryoten Zellen in drei Phasen: Initiation - Elongation - Termination
[122].
Dieser Ablauf
stellt einen aufwendig regulierten Schritt
der
Proteinbiosynthese dar, durch den es den Thrombozyten möglich wird, diesen
Prozess gezielt zu steuern.
- 11 Die Tatsache, dass Blutplättchen ihre Syntheserate nur auf translationaler
Ebene regulieren können, bietet für die Zelle Vorteile: Sie umgeht somit den
zeitlich langwierigen Prozess der Transkription und kann ohne Verzögerungen
direkt und rasch auf äußere Einflüsse reagieren [122].
Blutplättchen enthalten dabei nicht nur näherungsweise 2 × 10-15 mRNA pro
Zelle, sondern auch ein Transkriptom, das ungefähr 4000-6000 Transkripte
umfasst [95,123]. Thrombozytäre mRNA ist vollauf funktionstüchtig, da sie die
Haupteigenschaften eukaryoter mRNA, wie die 5’-m7G(7-Methylguanosin)Cap-Struktur und den Poly(A)-Schwanz am 3’-Ende, besitzt. Des Weiteren
weist die mRNA unter anderem Transkripte auf, die auch in Megakaryozyten
gefunden wurden. Dabei konnten in Thrombozytenspenden verschiedener
Spender Ähnlichkeiten im Transkriptom nachgewiesen werden, was die
Annahme zulässt, dass Blutplättchen im Rahmen ihrer Reifung von ihren
Progenitorzellen mit Ausgangsmaterial ausgestattet werden [95,122].
Neben dieser Mitgift weisen Proteine der Thrombozyten auch plättchenspezifische Eigenschaften auf, wie durch McRedmond et al. beschrieben
wurde: Es finden sich lediglich 69% des megakaryotischen Proteoms auf der
Ebene der Plättchen-RNA wieder, was auf eine partielle thrombozytäre
Regelung der Proteinbiosynthese hindeutet [65].
Im Weiteren besitzen Thrombozyten rRNA, die für die Struktur der Ribosomen
relevant ist. Die vorhandene 18S und 28S rRNA verbindet sich mit den 40Sund 60S Untereinheiten der thrombozytären Ribosomen und bildet zusammen
mit dem ribosomalen P-Antigen und dem Protein S6 den für die
Proteinbiosynthese
essenziellen
polyribosomalen
Translationskomplex
[95,128].
In eukaryoten Zellen erscheinen die Ribosomen stets mit dem rauen
endoplasmatischen Retikulum (rER) vergesellschaftet. Dieser Zellbestandteil
ist auch in Thrombozyten nachweisbar [95].
Zusätzlich wurden Verbindungen der Ribosomen mit dem thrombozytären
Zytoskelett gefunden, was das Zytoskelett als alternativen Ort der Translation
in prokaryoten wie auch in eukaryoten Zellen hervorhebt [95,122]. Mit dem
- 12 Zytoskelett sind aber nicht nur Ribosomen verknüpft, sondern neben weiteren
Bauteilen der Proteinbiosynthese auch mRNA. Analog hierzu beobachteten
Schubert et al. eine Abnahme der Genexpression nach Auflösung dieser
Verbindungen [95].
Edelstein und Bray bauten auf diesen Befunden auf und stellten fest, dass
Thrombozyten zusätzlich zu mRNA und rRNA auch miRNA (micro RNA)
enthalten [29]. miRNA umfasst 21 - 23 Nukleotide und wird in verschiedenen
mehrzelligen Organismen exprimiert, wobei der Mensch zwischen 400 und
1000 verschiedene miRNA-Moleküle besitzt [29]. MiRNA kann sowohl
kontinuierlich als auch signalinduziert exprimiert werden und beeinflusst durch
Auswirkungen auf die zelluläre mRNA maßgeblich die Genexpression auf
Translationsebene.
Darüber hinaus zeigten Denis et al. die Existenz eines funktionellen
Spliceosoms in Thrombozyten [25]. Spliceosome finden sich vor allem in den
Nuklei eukaryoter Zellen, wo sie für das Spleißen der prä-mRNA in ihre finale
Form, die mRNA, zuständig sind. Dabei werden nicht nur die überflüssigen
Genabschnitte (Introns) entfernt, sondern auch die Genexpression reguliert. In
diesem Zusammenhang beschrieben Zimmermann und Weyrich zum einen,
dass Megakaryozyten bei der Sequenzierung junge Thrombozyten mit einem
Spliceosom ausstatten [128]. Zum anderen fanden sie ungespleißte prämRNA im Transkriptom der Plättchen. Mit Hilfe des Spliceosoms modifizieren
Thrombozyten beispielsweise die prä-mRNA des Tissue-Faktors sowie des IL1β [95,123], wodurch sie auch ohne Transkription in der Lage sind, die
Proteinsynthese dieser Zytokine zu beeinflussen.
Als weitere Elemente der thrombozytären Proteinbiosynthese lassen sich
biochemische Mechanismen hinzufügen, die ebenfalls auf posttranskriptioneller Ebene wirken. Obwohl noch nicht alle Feinheiten dieser Abläufe
beschrieben sind, ist bereits bekannt, dass mRNA auch in Thrombozyten
sowohl am 3’- als auch am 5’-Ende UTR’s (untranslated regions) enthält [95].
Neben weiteren Faktoren, die an die 3’-UTR binden können, exprimieren
aktivierte Thrombozyten iPABP (inducible poly(A) binding protein), das sich
gleich seiner Aktivität in anderen Zellsystemen auch hier durch Bindung an
- 13 den Poly(A)-Schwanz des 3’-Endes steigernd auf die Translation auswirkt.
Ferner verlängert die Poly(A)-Sequenz die Überlebenszeit der mRNA durch
kreisförmige Formation. Dabei interagiert der Poly(A)-Schwanz mit Hilfe
spezieller thrombozytärer Bindungsproteine mit dem m7G-Cap am 5’-Ende.
Angesichts der fehlenden Möglichkeiten der Blutplättchen, ihren mRNA-Vorrat
wieder aufzustocken, erscheint dies von großem Vorteil.
Weitere Studien befassten sich mit dem 5’-Ende der mRNA, das den
Anbindungspunkt der Ribosomen an die mRNA und somit auch den essentiellen Initiationsschritt der Translation kennzeichnet. Dabei spielt eIF4E eine
zentrale Rolle: Als Cap-Binding-Protein vermittelt es nach Bildung des
Initiationskomplexes eIF4F am 5’-Ende die Annäherung zwischen Ribosomen
und mRNA [95,122].
Einerseits wird eIF4E durch MAP-Kinase-(p38 mitogen activated protein)
abhängige Signalkaskaden phosphoryliert und dadurch aktiviert, andererseits
unterstützt das Zellprotein mTOR diesen Vorgang (mammalian target of
rapamycin) durch Phosphorylierung des Inhibitors 4E-BP1 (eIF4E-binding
protein 1) [12]. Durch die Phosphorylierung von 4E-BP1 zerfällt der eIF4E 4E-BP1 Komplex in seine Bestandteile und der Zelle steht mehr freies eIF4E
zur Verfügung, wodurch die Translation gefördert wird [60,95]. Diese Annahme
stützend zeigten Schubert et al. einen Abfall der Protein-syntheserate in
aktivierten Blutplättchen nach Hemmung der durch mTOR ausgelösten
Signalkaskade mit Rapamycin [95].
Im Weiteren wird eIF4E für gewöhnlich im Membranskelett der Thrombozyten
gelagert, wodurch es durch die räumliche Trennung nicht mit der mRNA
interagieren kann. Bei Aktivierung der Blutplättchen wird diese Distanz
allerdings durch zelluläre Umstrukturierung aufgehoben, was in einer
gesteigerten Translationsrate resultiert.
Zusammenfassend lässt sich feststellen, dass Thrombozyten komplexe,
multifunktionelle Zellstrukturen aufweisen, die ihnen ein mannigfaltiges
Einsatzgebiet ermöglichen. Dabei sind sie durch die Sekretion ihrer Granula
nicht nur „Initiatoren der Entzündungs,- Proliferations- und Umbauphasen, die
auf eine Gewebsverletzung folgen und im Wundverschluss enden“ [133].
- 14 Vielmehr zeigt sich, dass sie mit dem Werkzeug zur Proteinbiosynthese
ausgestattet und somit in der Lage sind, ihren Feinbau eigenständig zu
modifizieren.
2.5.
Wachstumsfaktoren in Thrombozyten
In dieser Studie wurden mit TGFβ1 und sCD40L zwei der in den thrombozytären Granula gespeicherten Proteine untersucht. Im Folgenden soll über
diese beiden Wachstumsfaktoren ein kurzer Überblick vermittelt werden.
2.5.1. Transforming growth factor β1 (TGFβ1)
Zwei Grundformen des TGF (transforming growth factor) lassen sich unterscheiden, TGF-α und TGF-β. Beide zählen zu einer Superfamilie, die weitere
30 Zytokine wie Aktivine, Inhibine oder BMPs (bone morphogenetic proteins)
beinhaltet. Sie haben allesamt Einfluss auf Zelldifferenzierung und -wachstum
[37,38].
Von TGFβ existieren 5 Subtypen, wobei TGFβ 4 und TGFβ5 nur bei Hühnern
und Amphibien, TGFβ1, TGFβ2 und TGFβ3 auch bei Säugetieren und
Menschen vorkommt [59]. Die letzten drei spielen eine Rolle in Spezifizierungsprozessen und können von den meisten menschlichen Zellen freigesetzt
werden. Dabei wird jede Sub-/Isoform durch ein eigenes Gen auf
unterschiedlichen Chromosomen kodiert, obwohl alle Isoformen eine 70%-ige
Übereinstimmung ihrer Aminosäuresequenzen aufweisen [59].
Es wird angenommen, dass TGFβ2 und TGFβ3 im Gegensatz zu TGFβ1 in
vergleichsweise kleinen Mengen synthetisiert werden. Demzufolge soll im
Weiteren vor allem TGFβ1 beleuchtet werden.
Diese Isoform weist eine homodimere Struktur auf, wobei jede der zwei 25 kDa
schweren Untereinheiten aus 112 Aminosäuren besteht [59]. TGFβ1 kann
sowohl autokrin als auch parakrin freigesetzt werden und befindet sich dabei
in einem inaktiven oder latenten Zustand. Im Gegensatz zum aktiven TGFβ1
kann es in seiner latenten Form seine Wirkung als Wachstumsfaktor jedoch
nicht entfalten.
- 15 Allerdings führt die latente Struktur nicht nur zu einer besseren Molekülstabilität, sondern begünstigt auch durch bisher unbekannte Mechanismen die
Umgehung des lysosomalen Abbaus [37,59]. Hierzu bleibt das C-terminale
Ende des zunächst 392 Aminosäuren umfassenden Präkursor-Proteins,
welches das reife TGFβ1 enthält, durch nicht-kovalente Bindungen mit dem Nterminalen Ende, auch als LAP (latency-associated peptide) bezeichnet,
verbunden [37,96]. Sie bilden den latenten TGFβ1-Komplex [59,90]. Dieser
lässt sich anschließend in vivo sowohl von Plasmin und Kathepsin D durch
proteolytische Spaltung des N-terminalen Endes als auch durch nichtenzymatische, direkte Interaktion mit Thrombospondin-1 (TSP-1) aktivieren
[37,96].
Einblicke in die Vielseitigkeit dieses Wachstumsfaktors hinsichtlich seiner
Einflüsse auf Hämatopoese, Angiogenese sowie auf den Knochenmetabolismus ergaben sich auszahlreichen Studien [37]. Zu den Hauptwirkungen des
TGFβ1 zählt neben der Proliferationshemmung der meisten ektodermalen
Zellen die Förderung des Wachstums mesenchymaler Zellen. Weitere Effekte
sind die Unterstützung der Wundheilung durch Fibrosierung mittels Bildung
von extrazellulärer Matrix in Wundgebieten [59] sowie immunmodulierende
Effekte im Organismus [33]. Dabei spielt TGFβ1 vor allem in inflammatorischen
Reaktionen eine Rolle [96,114,115]. So wird durch die Induktion unreifer
Leukozyten, die Ausschüttung von Interleukinen aus Monozyten sowie die
Rekrutierung weiterer Entzündungsmediatoren, wie beispielsweise von
Prostaglandinen, die Entzündungskaskade getriggert [96,115].
Interessanterweise kann TGFβ1 jedoch auch eine Hemmung der zuvor
aktivierten Monozyten und der Zytokinsynthese auslösen. Solch eine
Herunterregulation wird im Zusammenspiel des TGFβ1 mit aktivierten T-Zellen
evident. So wird nicht nur die Proliferationsfähigkeit der T-Zellen, sondern
auch ihre Aktivität, ebenso wie das Wachstum und die Differenzierung der BZellen sowie die lymphozytäre Freisetzung von IgG und IgM gehemmt
[33,38,90,115].
Neben diesen vielseitigen Einflüssen weist TGFβ1 des Weiteren Auswirkungen
auf Wachstum und Metastasierung von Tumorzellen auf [58,74,98]. Dabei
müssen die verschiedenen Tumorstadien unabhängig voneinander betrachtet
- 16 werden. Zunächst wirkt sich TGFβ1 supprimierend auf die Karzinogenese aus:
Zellapoptose wird unterstützt und zelluläre Proliferation der Tumorzellen
gehemmt. Dieser inhibitorische Einfluss geht in späteren Tumorstadien durch
Mutationen
verloren
und
der
Wachstumsfaktor
stimuliert
dann
die
Angiogenese und Metastasierung der malignen Zellen [58].
TGFβ1 ist in der Lage, Fibroblasten zur Produktion extrazellulärer Matrix
anzuregen, wodurch die Adhäsion metastasierender Zellen vereinfacht wird.
Des Weiteren hemmt es, wie bereits oben erwähnt, mittels Proliferations- und
Wirkungseinschränkung der T- und B-Zellen, die mögliche Immunantwort des
Körpers [9,10]. So zeigt sich zum Beispiel in einem Großteil der Pankreas- und
Kolonkarzinome eine Mutation in zumindest einem Element des TGFβSignalweges [39,113].
2.5.2. Löslicher CD40-Ligand (sCD40L)
CD40 und sein Ligand, CD40L, gehören beide zur Superfamilie der Tumornekrosefaktoren (TNF) [13,121] und spielen durch ihre Interaktion vor allem
bei Entzündungsprozessen und Immunantworten des Organismus eine Rolle
[18]. Dabei bildet CD40 vor allem auf den Oberflächen von Thrombozyten und
aktivierten CD4+ T-Zellen ein Trimer mit einer Molekularmasse von 50 kDa
[26]. Zudem wird es auch von natürlichen Killerzellen, B-Zellen, Mastzellen,
basophilen Granulozyten sowie CD8+ T-Zellen exprimiert [13,18]. Auch
endotheliale Zellen, Makrophagen, glatte Muskelzellen und Fibroblasten
weisen CD40 und CD40L als Oberflächenstrukturen auf [2,5,109,121].
Nach Bindung des Transmembranproteins CD40L mit einer Molekularmasse
von 39 kDa übermittelt der Rezeptor komplexe Signalkaskaden, die sich vorwiegend in Immunzellaktivierung, Zellproliferation, aber auch in Apoptose
äußern und dabei primär Zytokine wie IL-1, IL-6, IL-8 oder TNF-α in ihrer Differenzierung beeinflussen. Des Weiteren wird so die Produktion angiogener
Faktoren wie VEGF oder FGF (fibroblast growth factor) unterstützt [18].
Wie durch Graf et al. bereits beschrieben, exprimieren T-Zellen CD40L nicht
nur auf ihrer Oberfläche, sondern sind zudem in der Lage, CD40L in löslicher
Form
freizusetzen
[40].
Dieses
sCD40L
(soluble
CD40L)
hat
ein
- 17 Molekulargewicht von 18 kDa und entsteht durch proteolytische Spaltung von
CD40L.
Nicht nur T-Zellen, sondern auch Thrombozyten sind in der Lage, sCD40L zu
produzieren. André et al. stellten fest, dass sogar mehr als 95% des
zirkulierenden sCD40L in Blutplättchen gespeichert ist [2]. In unstimulierten
Thrombozyten befindet sich CD40L intrazellulär. Nach Aktivierung von
Thrombozyten durch ADP, Kollagen oder Thrombin wird es auf der Oberfläche
präsentiert. Hier wird es schließlich gespalten und als sCD40L abgestoßen
[2,87]. Dabei spielen neben Aktin und einigen Metalloproteasen auch
Untereinheiten des NADPH eine Rolle [87]. Der genaue Mechanismus der
Freisetzung ist bisher noch unklar. Parallel zur zunehmenden Aktivierung von
Thrombozyten während der Lagerung in Thrombozytenkonzentraten steigt
auch die Freisetzung von sCD40L aus den Zellen in den Plasmaanteil der
Präparate [55,56,110,119]. Auch diese Form der lagerungsbedingten
Thrombozytenaktivierung setzt also sCD40L frei.
Insgesamt lassen sich primär drei strukturelle Domänen des sCD40L
aufzeigen, durch die seine vielfältige Funktionsweise zustande kommt: Die
TNF-α-homologe Domäne, die dem CD40L auch in seiner löslichen Form die
Bindung an den CD40-Rezeptor ermöglicht; die Lysin-Arginin-Glutamin-säure
– Domäne (KGD), durch die das sCD40L in der Lage ist, an GP IIb/IIIa zu
binden, sowie seine trimere Struktur, die sCD40L nach Bindung an seinen
Rezeptor die Induktion wichtiger Signalkaskaden erlaubt [2].
Zwar geht während der Spaltung des CD40L in das kleinere sCD40L die
Transmembranregion, wie auch ein Teil der extrazellulären Domäne verloren,
es bleibt jedoch die TNF- α homologe Region erhalten, wodurch sCD40L an
seinen Rezeptor CD40 binden kann. Somit bleibt auch in der löslichen Form
die volle biologische Aktivität sowie die proinflammatorische Komponente
bestehen [40], ein Umstand, der bei einer Vielzahl der Patienten eine fiebrige
Immunantwort nach der Transfusion mit sich bringt, da während der Lagerung
von Thrombozytenkonzentraten bis zu 50% des thrombozytär gespeicherten
sCD40L freigesetzt werden sollen [2,11,21,44,56].
- 18 sCD40L ist nicht nur in der Lage, Entzündungsantworten einzuleiten indem es
Chemokine freisetzt, sondern wirkt sich durch seine Bindungskapazität an GP
IIb/IIIa überdies prothrombotisch aus. Dabei werden verschiedene Prozesse,
die die Entstehung von Atheroskleroseherden und Plaqueruptur begünstigen,
vermittelt: Entzündungsreaktion, Thrombusbildung, sowie Hemmung der
endothelialen Regeneration nach Plaqueruptur [2,109]. Diesen Umstand
beweisend stellten Urbich et al. erhöhte sCD40L/CD40L Blutwerte bei
Patienten mit akutem Koronarsyndrom fest, ebenso wie sie einen
Zusammenhang zwischen hohen sCD40L Werten im Blut und einem
gesteigerten kardiovaskulären Risiko besonders bei sonst gesunden Frauen
zeigten [109]. Diese Effekte sind dermaßen ausgeprägt, dass sCD40L
womöglich als ein Prädiktor für das Restenose-Risiko nach einer
Koronarstent-Implantation
dienen
könnte
[2,108,109].
Durch
diese
Beschaffenheit lassen sich neben den bereits genannten weitere Effekte des
sCD40L auf vaskuläre Ereignisse erklären: Es wurden Auswirkungen auf
Adipositas, Hypercholesterinämie, instabile Angina Pectoris, wie auch auf
Diabetes mellitus nachgewiesen [108].
Zudem lassen sich erhöhte sCD40L-Spiegel bei Autoimmunerkrankungen wie
bei der rheumatoiden Arthritis oder dem systemischen Lupus erythematodes
messen
[2].
Auch
das
zentrale
Nervensystem
ist
von
den
proinflammatorischen Eigenschaften des sCD40L betroffen: Es wird
angenommen, dass das durch Mikroglia synthetisierte sCD40L die Entstehung
der Alzheimer’schen Krankheit fördert [13,18].
Weitere Effekte zeigt CD40L durch seine Rolle im Antigenswitch im Rahmen
der Immunantwort des menschlichen Körpers: Liegen im Organismus
erniedrigte Mengen an CD40L vor, so führt dies zu einer Ansammlung von
IgM, jedoch gleichzeitig zu einem Mangel an IgG, IgA sowie an IgE (X-linked
immundeficiency; HIGM-1) [17,57]. Dies hat unter anderem eine erhöhte
Infektanfälligkeit,
ein
höheres
Vorkommen
an
autoimmunologischen
Erkrankungen sowie eine erhöhte Rate an Magenkrebs und Lymphomen zur
Folge [22].
Hinzu kommt der Einfluss des sCD40L auf die Onkogenese. Dabei zeigt es
ähnlich dem TGFβ1 eine pleiotrope Wirkung, indem es einerseits in niedrigen
- 19 Konzentrationen gesunde B-Zellen in ihrer Differenzierung zu Plasmazellen
anregt und damit maligne Zellen durch Einleitung der natürlichen Immunantwort des Körpers abfängt [5]. Andererseits stimuliert sCD40L die
Proliferation maligner Zellen und bietet ihnen Schutz vor Apoptose
[5,35,93,125].
2.6. Zielsetzung der Studie
Die genaue Herkunft der Proteine wie TGFβ1 oder sCD40L blieb lange unbekannt. Es wurde zunächst angenommen, dass sie aus den Megakaryozyten
stammen und bei der Abschnürung den reifen Thrombozyten aus ihren
Vorläuferzellen weitergegeben werden [95]. Ungeachtet der Untersuchungen
von Warshaw et al., die bereits 1967 zeigten, dass Thrombozyten in der Lage
sind, 14C-L-Leucin aufzunehmen und in ihre Proteine einzubauen, folglich
also die Fähigkeit zur Proteinbiosynthese besitzen [118], wurde jahrelang
angenommen, dass diese Syntheserate nur in einem sehr geringen Maß und
diskontinuierlich abläuft [95]. Dem widersprechend konnte in den letzten
Jahren gezeigt werden, dass die Synthese von Interleukin-1β in Thrombozyten
nach deren Aktivierung stattfindet [60,123]. Angesichts dieser Erkenntnisse ist
es durchaus möglich, dass nicht nur inflammatorische, sondern auch
onkogene und angiogene Faktoren einer thrombozytären Regulierung und
Produktion unterliegen.
Zielsetzung dieser Studie war die nähere Betrachtung der angiogenen und
onkogenen Zytokine TGFβ1 und sCD40L hinsichtlich ihrer Synthese und
Freisetzung in Blutplättchen aus Thrombozytenkonzentraten.
Hierfür wurden konventionelle Thrombozytapheresespenden an freiwilligen
Spendern vorgenommen, wobei mit Trima Accel und Amicus zwei
unterschiedliche Zellseparatoren zum Einsatz kamen. Beide Separatoren
werden
in
der
Transfusionsmedizinischen
und
Hämostaseologischen
Abteilung des Universitätsklinikums Erlangen im Routinebetrieb eingesetzt.
Bei der Thrombozytapherese an diesen Zellseparatoren handelt es sich also
um ein etabliertes Spendeverfahren.
- 20 Den gewonnenen Thrombozytapheresekonzentraten wurden anschließend
Proben entnommen, aus denen einerseits CTAD-Plasma, andererseits mittels
Zugabe eines Detergens Lysat hergestellt wurde. Sowohl im zellfreien
Plasmaüberstand der Thrombozytapheresekonzentrate als auch im Lysat
wurden TGFβ1 und sCD40L mittels ELISA-Technik untersucht.
Dabei wurde im CTAD-Plasma die in vitro während der Präparatelagerung
freigesetzte Menge dieser Zytokine gemessen, während die Gesamtmenge
der freigesetzten und noch intrazellulär gespeicherten Zytokine im Lysat
bestimmt werden konnte. Aus diesen Messwerten ließen sich anschließend
Schlüsse auf die intrazellulär gespeicherte Menge beider Wachstumsfaktoren
ziehen. Um den Verlauf der Konzentrationen der Zytokine TGFβ1 und sCD40L
während der Lagerung von Thrombozytapheresekonzentraten genauer
verfolgen zu können, wurden die Messungen sowohl am Entnahmetag als
auch an den darauf folgenden Tagen +1, +3 sowie +5 vorgenommen. Durch
dieses Vorgehen soll diese Studie nicht nur weitere Erkenntnisse über das
Ausmaß der Zytokinfreisetzung in Thrombozytapheresekonzentraten von zwei
Zellseparatoren während den Tagen der Lagerung, sondern auch Auskünfte
über die thrombozytäre Proteinbiosynthese dieser Wachstumsfaktoren liefern.
- 21 -
3.
MATERIAL UND METHODEN
3.1.
Studiendesign
Im Rahmen der Studie wurden insgesamt 32 Thrombozytapheresekonzentrate von freiwilligen Spendern aus dem universitätseigenen Spendedienst der
Transfusionsmedizinischen und Hämostaseologischen Abteilung in der
Chirurgischen Klinik des Universitätsklinikums Erlangen (Schillerstr. 8, 91054
Erlangen) untersucht. Dabei wurden jeweils 16 Konzentrate mit dem Zellseparator Amicus (Baxter, Deerfield, IL, USA) sowie 16 mit dem Separator Trima
Accel (TerumoBCT, vormals CaridianBCT, Lakewood, CO, USA) hergestellt.
Nach Gewinnung der Konzentrate wurden diese nicht für die Versorgung von
Patienten weiterverwendet, sondern auf einem Flachbett-Agitator bei 22°C
insgesamt 5 Tage lang in kontinuierlicher Bewegung gehalten, um an den
Tagen 0 (Herstellungstag), +1, +3 sowie +5 mehrere Aliquots entnehmen zu
können. Aus diesen Proben wurden mittels ELISA-Technik die Spiegel der
Wachstumsfaktoren TGFβ1 und sCD40L an den vier Zeitpunkten der
Probeentnahme jeweils in dem aus CTAD-Röhrchen gewonnenen Überstand
wie auch in dem mithilfe des Detergens Triton X-100 hergestellten Lysat
bestimmt.
3.2.
Spenderauswahl
An der Studie nahmen 32 gesunde erwachsene Spender, darunter 11 Frauen
und 21 Männer teil, wobei ein Spender im Verlauf insgesamt zwei
Thrombozytenkonzentrate unterschiedlichen Spendedatums für die Studienzwecke bereitstellte. Das Thrombozytenkonzentrat einer Spenderin musste
der Studienreihe entzogen werden, da das Volumen der Spende mit nur 200
ml zu weit unter dem durchschnittlichen Konzentratvolumen von 250 ml lag.
Alle Spender stammen aus dem Spenderpool der Transfusionsmedizinischen
und Hämostaseologischen Abteilung des Universitätsklinikums Erlangen und
willigten schriftlich ein, ihre Proben für Studienzwecke bereit zu stellen. Alle
Probanden wurden negativ auf HIV, HBV und HCV getestet, sie erfüllten somit
- 22 die Eignungskriterien der europäischen und deutschen Richtlinien für
Thrombozytapheresespender [14].
3.3.
Probengewinnung
Aus den gewonnenen Thrombozytenkonzentraten wurden jeweils an Tag 0
(Tag der Spende), Tag +1, Tag +3 und Tag +5 Proben entnommen, um die
Bestimmung der Wachstumsfaktorfreisetzung jeweils im CTAD-Überstand
und im Lysat vornehmen zu können.
Für die Gewinnung des Überstandes wurden pro Spender und Tag jeweils
zwei CTADMonovetten (2,9 ml CTAD; Natriumcitrat, Theophyllin, Adenosin,
Dipyridamol; Sarstedt AG&Co, Nümbrecht, Deutschland) befüllt und anschließend 10 Minuten bei 4000 RPM zentrifugiert. Nach der Zentrifugation wurden
je Wachstumsfaktor 2×1000 μl des Überstandes aus den Röhrchen
entnommen und bis zur ELISA-Durchführung bei -70 ºC gelagert.
Für die Gewinnung der Aliquots aus dem Lysat wurde zunächst eine 0,5%
Triton X-100-Lösung (Serva Electrophoresis, Heidelberg, Deutschland)
.angefertigt, in der die Spenderproben 10-fach verdünnt wurden. Aus dieser
Lösung wurden anschließend ebenfalls 4×1000 μl Probenmaterial entnommen
und bei -70°C gelagert.
3.4.
Herstellung der Thrombozytenkonzentrate mittels Apherese
Für die Thrombozytensubstitution geeignete Thrombozytenkonzentrate lassen
sich entweder aus Vollblutspenden oder wie bei dieser Studie durch Zytapherese mittels Zellseparatoren (Einzelspender-Verfahren) gewinnen.
Bei der Apherese durchläuft das Spenderblut einen extrakorporalen Kreislauf,
in dem die Thrombozyten dem Vollblut entzogen werden, die Restbestandteile
des Blutes allerdings dem Spender unmittelbar wieder zugeführt werden. Das
Verfahren kann grundsätzlich ebenso für die Thrombozytengewinnung als
auch für die Gewinnung anderer Blutbestandteile, z.B. von Blutstammzellen
genutzt werden [1,23,110,131].
- 23 Hierfür existieren verschiedene Geräte, die sowohl in ihrer Funktionsweise als
auch in dem post-transfusionellen Verhalten mit ihnen gewonnenen Thrombozyten leichte Unterschiede aufzeigen [23]. Zwei dieser Maschinen, der
Zellseparator Amicus (Baxter, Deerfield, IL, USA ) und der Zellseparator Trima
Accel (CaridianBCT, Lakewood, CO, USA) kamen im Rahmen dieser Studie
zum Einsatz, wobei beide Zellseparatoren im Routinebetrieb der Transfusionsmedizinischen und Hämostaseologischen Abteilung verwendet werden, sodass ein etabliertes Spendeverfahren zum Einsatz kam [131,132].
Es wurden insgesamt 32 Thrombozytapheresen durchgeführt, davon 16 am
Zellseparator Amicus und 16 am Zellseparator Trima. Das durchschnittliche
Sollfüllvolumen der hergestellten Thrombozytaphresekonzentrate lag bei 250
ml. Beide Maschinen verwenden ACD-A-Lösung als Antikoagulans. Diese ist
aus den Bestandteilen Zitronensäure-Monohydrat, Natriumcitrat-Dihydrat und
Glucose-Monohydrat zusammengesetzt. Beide Zellseparatoren verwenden
zusätzlich Kochsalzlösung (NaCl 0,9%, MacoPharma, Langen, Deutschland)
zum Vorfüllen der Apheresesets vor Beginn der Spende.
3.4.1. Funktionsprinzip des Zellseparators Amicus
Der Zellseparator Baxter Amicus beinhaltet als zentrales Bauteil eine gürtelförmige Kammer mit zwei Kompartimenten, die um eine Rotationsspule gewickelt ist, sodass sie sich innerhalb der Rotationseinheit drehen kann [15,16].
Zunächst wird das Vollblut des Spenders antikoaguliert und in die
Separationskammer geleitet, um anschließend durch ein Zwischenstück, das
als Zelldetektor fungiert, in die Sammelkammer gepumpt zu werden. Hier
werden die Thrombozyten angereichert und verbleiben während der gesamten
Prozedur in der Sammelkammer und damit im Einfluss der Beschleunigungskräfte in der rotierenden [15,16]. Grundlegendes Funktionsprinzip der
Separationskammer ist die durch die Kammerrotation hervorgerufene
Zentrifugalkraft, unter deren Einfluss sich das Vollblut in seine zellulären
Bestandteile auftrennt, und zwar infolge unterschiedlicher Massendichte der
verschiedenen Blutbestandteile.
- 24 Durch das Einschwemmen des Vollblutes in die Separationskammer wird
zusätzlich ein Druck erzeugt, durch den die Thrombozyten eine Rampe hinaufbefördert werden, sodass sie die Kammer in dieselbe Richtung wieder
verlassen können, durch die zuvor das Vollblut eingetreten ist. Durch diesen
Vorgang werden auch größere und somit schwerere Blutplättchen erfasst, die
sonst von der konventionellen Separationstechnik nicht berücksichtigt werden
würden.
Während der Passage dieser Separationskammer wird das Blut zusätzlich
konzentriert, sodass die Granulozyten absinken und zusammen mit den
Erythrozyten entfernt werden können. Auf diesem Weg wird eine Hämatokritdifferenz innerhalb der Kammer generiert, die den Hämatokrit von anfangs
35% (bei Eintritt des Vollblutes) auf etwa 80% (nach der der Abspaltung der
Blutplättchen) anhebt. Somit wird eine Art „Wall“ zwischen den zwei
Abschnitten der Kammer gebildet.
Im Verlauf werden also durch den Verlust des Plasmas die restlichen
Bestandteile des Blutes daran gehindert, zurückzufließen. Dabei werden
Erythrozyten entfernt, ebenso wie die Monozyten, die bis zu ihrem Abtransport
im hinteren Teil der Kammer zirkulieren [15]. Verbleibende Thrombozyten
hingegen werden an die Oberfläche getrieben und können sich so dem
plättchenreichen Plasma (PRP) anschließen. Allerdings wird ein Teil des
thrombozytenreichen Plasmas zurück zum geförderten Spender-Vollblut
transportiert,
um
dessen
Hämatokrit
bereits
vor
Eintritt
in
die
Separationskammer zu reduzieren [15]. Das restliche plättchenreiche Plasma
wird schließlich in die zentrifugeninterne Sammelkammer befördert, aus der
nachfolgend
das
thrombozytenarme
Plasma
abgesaugt,
mit
den
Restbestandteilen des Vollblutes aus dem Separationsprozess wieder
vermengt und zum Spender zurückgeführt wird [15].
Abbildung 2 verdeutlicht die Funktionsweise des Zellseparators Amicus.
- 25 -
Abbildung 2: Funktionsweise des Zellseparators Amicus
Thrombozyten, Monozyten und Granulozyten strömen in die Separationskammer ein. Wenn durch PRP verdünntes Blut eintritt, strömt gleichzeitig
Plasma aus. Dadurch werden die Thrombozyten eine Rampe hochgepresst,
auf der sie die Kammer in dieselbe Richtung verlassen, aus der das Blut
hereingeflossen ist. Die Monozyten treffen derweil auf die Außenwand (HighG-Wall) und treiben weiter auf die gegenüberliegende Seite der Kammer, auf
der der Hämatokrit bei ca. 80% liegt, und somit höher ist. Dieser Unterschied
im Hämatokritniveau schützt anschließend die Monozyten vor dem Rückfluss
denn sie werden bei der 35-80% Hämatokrit-Grenze abgelenkt und zirkulieren
bis zum Abschluss der Apherese in der Separationskammer. Die Granulozyten
fallen ebenfalls gegen die Außenwand und treiben mit den Erythrozyten aus
der Kammer [16, mit freundlicher Genehmigung von Baxter Healthcare].
In regelmäßigen Abständen füllt sich die Separationskammer mit Vollblut,
infolgedessen treten rote und weiße Blutkörperchen in den Zelldetektor über
und versetzen den Separator in eine Art Pausierzustand. Der gesamte
Aphereseprozess wird angehalten, wodurch die Pumpe ihren Verlauf umkehrt
und thrombozytenarmes Plasma gegensinnig befördern kann. Hierdurch wird
- 26 gewährleistet, dass die Maschine eventuell in der Weiterleitung verbliebene,
verunreinigende Zellen zurück in die Separationskammer leiten kann [15]. Erst
am Ende der Prozedur werden die Thrombozyten schließlich aus der
Sammelkammer in den Aufbewahrungsbeutel gespült, wo sie resuspendiert
werden. Diese Resuspension fand in Plasma des Spenders statt. Alternativ
könnte sie auch mit einer Lösung durchgeführt werden, die zu 35% aus
autologem Plasma und zu 65% aus einem Zusatzmittel (T-Sol, PAS II, Baxter)
besteht [42,52].
Der gesamte Aphereseprozess lässt sich hierbei sowohl mit einer
Doppelkammer-Nadel als auch mit der Einzelkammer-Nadel durchführen. Bei
der Doppelkammer-Nadel wird das antikoagulierte Vollblut kontinuierlich in die
Separationskammer gepumpt, während das bereits aufbereitete Blut durch die
Rücklaufleitung zum Spender zurück befördert werden kann. Dies ist bei
Gebrauch einer Einzelkammer-Nadel nicht möglich, hier wird durch die Pumpe
ein Überangebot an Vollblut gefördert, sodass die Zentrifuge nur einen Teil
des Blutes aufbereiten kann. Der Überschuss wird anschließend in ein
Reservoir umgeleitet, ebenso wie das plättchenarme Plasma und die
zellulären Überreste aus der Separatorkammer.
All diese Sammelbecken werden elektrisch überwacht, sodass die Maschine
automatisch von der Sog-Phase in die Rückfuhr-Phase, in der das angestaute
Material aus den Reservoirs zum Spender zurückbefördert wird, umschalten
kann, sobald ein gewisses Sättigungsmaß der Sammelbeutel überschritten
wird [15].
3.4.2. Funktionsprinzip des Zellseparators Trima Accel
Wie beschrieben, verbleiben die Thrombozyten im Zellseparator Baxter
Amicus für die Dauer des gesamten Apheresevorgangs in einer kleinen
Auffangtasche, wodurch sie leicht miteinander und mit der Plastikfläche des
Beutels in Kontakt treten können [50]. Im Gegensatz hierzu transportiert der
Zellseparator Trima Accel die Blutplättchen rasch aus dem Abschnitt der
Zentrifuge weiter in einen größeren Sammelbehälter, sodass die Thrombozyten hier nicht eng beieinander gelagert werden [50,86].
- 27 Neben diesem zeigen sich weitere Unterschiede zwischen den in dieser Studie
eingesetzten Zellseparatoren:
Trima Accel benutzt einen einstufigen Kanal mit konstantem Radius, durch
den das Vollblut des Spenders gegen den Uhrzeigersinn in einem beständigen
Fluss geleitet wird [86]. Dadurch werden die Einzelbestandteile des Blutes
gemäß den wirkenden Zentrifugalkräften und verschiedenen Teilchen-dichten
aufgetrennt. Erythrozyten, Leukozyten und Thrombozyten ordnen sich
schichtweise an, wobei eine in der Zone des Buffy-Coats angebrachte Rille die
Auftrennung in Blutplättchen und weiße Blutkörperchen unterstützt [16].
Abbildung 3 veranschaulicht die Funktion des Zellseparators Trima Accel.
Abbildung 3: Einzelkammersystem des Zellseparators Trima Accel.
Hier wird das Blut nur entgegen dem Uhrzeigersinn geleitet, wobei die Auftrennung im gesamten Kreisumfang vorgenommen wird [16 mit freundicher
Genehmigung von Terumo BCT]
- 28 Anschließend werden die Thrombozyten durch eine Leukozytenreduktionskammer (leukocyte reduction system, LRS) geschleust, um verbliebene
Leukozyten aus dem Plättchenkonzentrat auswaschen zu können, bevor es
im Auffangbeutel gelagert wird [16].
Dabei wird als letzter Schritt der Apherese das Plättchenkonzentrat mit Plasma
versetzt, bis die gewünschte Thrombozytenkonzentration erreicht ist.
Während dieser Phase arbeiten die Plasma- und die Sammelpumpe zusammen, wobei durch die Geschwindigkeitsdifferenz der beiden Pumpen die
Durchflussrate durch die LRS-Kammer bestimmt wird. Eine geeignete
Einstellung der Pumpen vermeidet somit eine negative Flussrate in der LRSKammer und daraus folglich eine Verunreinigung des Thrombozytenkonzentrates durch rückfließende Leukozyten [86].
Der Zellseparator Trima Accel besitzt insgesamt drei FlowmanagementSysteme, durch die sich die Infusionsrate des Antikoagulans, die
Vollblutentnahme und die Rückflussrate jeweils einzeln abstufen lassen.
Dadurch lässt sich nicht nur die Prozessionsrate sehr sensibel einstellen,
sondern auch die Flussrate kann individuell und situationsbedingt angepasst
werden. Dies steigert schlussendlich den Spenderkomfort [16].
3.4.3.
Vergleichende Darstellung der Zellseparatoren
3.4.3.1.
Allgemeine Charakteristika der Maschinen
Bereits im Vorfeld wurden die Zellseparatoren Amicus und Trima Accel in
mehreren Studien [16,32,62,78,116] auf Unterschiede untersucht, wobei der
Fokus vor allem auf das Volumen und die Thrombozytenkonzentration der erhaltenen Präparate, den Thrombozytengewinn und die Effizienz des Aphereseprozesses gelegt wurde.
Burgstaler et al. fanden dabei heraus, dass die Konzentratsvolumina nach
Apherese durch den Zellseparator Trima Accel signifikant niedriger (Volumen
[Trima Accel] 389 ± 82 ml; [Amicus] 447 ± 233 ml), die Plättchenkonzentration
jedoch signifikant höher war als bei Amicusprodukten (Plättchenkonzentration
[Amicus] 1436 ± 93 × 109/ml; [Trima] 1705 ± 225 × 109/ml).
- 29 Die Thrombozytenmenge zeigte keine deutlichen Unterschiede, obwohl die
Sammeleffizienz (collection efficiency, CE) des Separators Amicus signifikant
über den Werten der Maschine Trima Accel lag (CE [Trima Accel] 75,9 ± 9,7
%; CE [Amicus] 85,7 ± 11,3 %) [16]. Berechnet wurde die Sammeleffizienz
dabei nach der Formel CE = [(preprocedure PLT count + postprocedure PLT
count/2) × (volume processed - AC volume)] × 100 [16].
Auffällig war auch, dass die Plättchenanzahl der Spender vor dem
Aphereseprozess keine bedeutenden Differenzen zeigte, nach dem Vorgang
jedoch ein signfikanter Unterschied zwischen den Zellseparatoren (postprozedurale Plättchenanzahl [Amicus] 175 ± 35 × 109/L; [Trima] 199 ± 36 ×
109/L) bestand [16,50].
Betrachtet man des Weiteren den CCI-Wert (corrected count increment), der
als Maßstab für einen Transfusionserfolg herangezogen wird [51] und sich aus
der Formel 𝐶𝐶𝐼 =
(𝑃𝐿𝑇 𝑝𝑜𝑠𝑡−𝑃𝐿𝑇 𝑝𝑟𝑒) ×10−9 × 𝐵𝑆𝐴 (𝑚2 )
𝑃𝐿𝑇 (𝑢𝑛𝑖𝑡)×10−11
bestimmen lässt, zeigte sich
kein signifikanter Unterschied zwischen den 1h- und 18-24h-CCI-Werten der
beiden Zellseparatoren [32].
3.4.3.2. Unterschiede der metabolischen Parameter
Auch in der ungleichen Ausprägung einiger metabolischer Parameter zeigen
sich Differenzen zwischen den beiden Maschinen. Macher et al. verglichen in
ihrer Studie der Zellseparatoren Amicus und Trima Accel die Glukose-, Laktatund LDH-Werte sowie den pH der gewonnenen Thrombozytenkonzentrate
[62]. Dabei zeigten Amicus-Konzentrate zwar niedrigere Glucose- und pHWerte, übertrafen jedoch Trima-Accel-Konzentrate in den Laktat- und LDHWerten. In all diesen Kategorien waren die Werte sowohl für den
Messzeitpunkt Tag 0, als auch für Tag +2 signifikant unterschiedlich [62]. Dies
lässt einerseits auf einen höheren Metabolismus der Amicus-Präparate,
andererseits auf eine bessere Gaspermeabilität der Sammelbeutel des Trima
Accel schließen.
- 30 3.4.3.3.
Gebrauch des Antikoagulans
Zwar verwenden beide Zellseparatoren ACD-A (Acid-Citrate-Dextrose-A) als
Antikoagulans, jedoch benötigt der Zellseparator Amicus auch während der
Separation zusätzlich Salzlösungen. Davon verbraucht Amicus bereits im Vorfeld zur Vorbereitung 310 ml und während der Reinfusion annähernd 30 ml,
die zusammen mit der durchschnittlichen Menge infundierten Antikoagulans
von 369 ml dem Spender während der Reinfusion zugeführt wurden [16].
Der Zellseparator Trima Accel ist durch den einstufigen Kanal in der Lage, mit
weniger Antikoagulans auszukommen, da durch die Formung des Kanals die
Blutplättchen zwischen Plasma und Erythrozyten gepresst werden. Dadurch
können sie nicht mit der Innenfläche des Kanals in Kontakt treten. Dies führt
zu
weniger Verklumpung der Thrombozyten,
wodurch
die
niedrige
Antikoagulans-Ratio von 13:1 im Vergleich zu der Antikoagulans-Ratio des
Zellseparators Amicus (10:1) erklärt werden kann [16]
Zusammenfassend lässt sich feststellen, dass der Zellseparator Amicus
während der gesamten Prozedur dem Spender insgesamt 382 ml mehr
Volumen zuführt, was näherungsweise 7,6 % der Gesamtblutmenge
entspricht. Dadurch wird das periphere Blut weit mehr verdünnt als während
einer Apheresespende am Zellseparator Trima Accel [16].
3.4.3.4.
Leukozytenreduktion
Ein weiterer wichtiger Punkt, den es bei einem Vergleich der Zellseparatoren
Trima Accel und Amicus zu beachten gilt, ist die Leukoreduktionsrate der
Maschinen. Macher et al. fanden in Konzentraten des Separators Amicus
höhere Leukozytenkonzentrationen als in Produkten des Zellseparators Trima
Accel. Allerdings überschritt die Konzentration die Marke von 1x10 6
Leukozyten je Thrombozytapheresekonzentrat nicht und entsprach somit den
Richtlinienanforderungen für zelluläre Blutkomponenten, die heute extrem
leukozytenarm sein müssen [16,62].
- 31 3.5.
Bestimmung der Spiegel von TGFβ1 und sCD40L mittels ELISATechnik
Die Bestimmung der Konzentrationen der Wachstumsfaktoren TGFβ 1 und
sCD40L wurde mithilfe zweier ELISA-(Enzyme Linked Immunosorbent Assay)kits (R&D Systems Inc., Minneapolis, USA) durchgeführt.
3.5.1.
Allgemeines Funktionsprinzip der ELISAs
Die hier verwendete ELISA-Technik, das sogenannte „Sandwich“- oder auch
„Antigen-ELISA“, zeigt das nachzuweisende Antigen, beziehungsweise antigentragende Moleküle, indem sie einem Sandwich gleich zwischen zwei Antikörpern gebunden werden. Hierzu wird der erste Antikörper (capture
antibody), der an bestimmte Epitope der zu untersuchenden Wachstumsfaktoren TGFβ1 und sCD40L bindet, in die 96 Vertiefungen (wells) einer
Mikrotiterplatte aufgetragen, in die anschließend die Probe mit dem zu
untersuchenden Antigen gegeben wird. Dafür wurden die bei -70 ºC
gelagerten Proben zunächst bei Raumtemperatur aufgetaut.
In der darauf folgenden Inkubationszeit gehen die in der Probe gelösten
Antigene mit dem an den Wänden der Testfelder haftenden Antikörper eine
Komplexbindung ein. Im anschließenden Waschvorgang werden die Wells von
allen bis zu dem Zeitpunkt ungebundenen Antigenen gesäubert, bevor in
Folge ein zweiter Antikörper (detection antibody) in Form des Konjugates
hinzugegeben wird. Dieser bindet nun in einer zweiten Inkubationsphase
ebenfalls an das Antigen, sodass ein Antikörper-Antigen-Antikörperkomplex
entsteht. Voraussetzung für einen erfolgreichen Versuchsablauf ist hierbei
allerdings, dass die zwei Antikörper gegen unterschiedliche Epitope des Antigens gerichtet sind, wodurch eine kompetitive Hemmung ausgeschlossen
werden kann.
Des Weiteren haftet an dem Fc-Ende des Detektionsantikörpers, dem Ende
ohne Bindungskapazität, ein Enzym. Dieses kann nach einem zweiten
Waschvorgang, bei dem überschüssiges Detektionsmaterial entfernt wird,
quantitativ bestimmt werden. Für die Quantifizierung wird den in den
Vertiefungen verbleibenden Antikörper-Antigen-Antikörperkomplexen ein
- 32 chromogenes Substrat beigefügt, das mit diesem Enzym ein Reaktionsprodukt
bildet. Das kann nun anhand seiner optischen Extinktion im Vergleich zu einer
ebenfalls
angesetzten
Standardreihe
mit
bekannten
Konzentrationen
quantifiziert werden. Nach einer dritten Inkubationsphase und abschließender
Zugabe einer Stopp-Lösung, durch die die Farbreaktion schlagartig
unterbunden wird, kann die Indikatorreaktion photometrisch bestimmt werden
[28,43,92,104].
3.5.2.
Quantitative Bestimmung des TGFβ1-Gehalts
Hierzu wurden die Proben gemäß den Herstellerangaben (R&D Systems1)
zunächst bei Raumtemperatur aufgetaut. TGFβ 1 liegt in den Plättchen im
latenten Zustand vor, sodass es zunächst zu seiner immunreaktiven Form
aktiviert werden muss, um die Messung vornehmen zu können [37,59].
Hierfür wurden die Patientenproben mit zwei Lösungen versetzt: Erstens
wurden je 40 μl der Probe mit 20 μl einer 1 N HCl-Lösung vermischt und dann
10 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Zweitens wurden zur Neutralisation
der angesäuerten Proben 20 μl einer 1,2 N Natronlauge (NaOH) sowie 0,5 M
Hydroxyethylpiperazin-N`-2-Ethansulfonsäure
(HEPES)
zugegeben,
gut
vermengt und anschließend durch Zugabe des Calibrator Diluent RD5-53
verdünnt. Hierbei musste der Verdünnungsfaktor für jede Patientenprobe
individuell variiert werden, sodass eine Verfälschung der Messwerte
ausgeschlossen werden konnte.
Im Anschluss wurde wie eine Verdünnungsreihe des TGFβ 1-Standards angefertigt. Dazu wurde der Standard mit 2 ml Calibrator Diluent RD5-53 verflüssigt
und somit eine Ausgangslösung von 2000pg/ml erzielt. Nach einer kurzen
Inkubationszeit von 5 Minuten wurden die einzelnen Verdünnungen von 1000
pg/ml, 500 pg/ml, 250 pg/ml, 125 pg/ml, 62,5 pg/ml und 31,2 pg/ml durch
konsekutives Zupipettieren von 200 μl der nächst höheren Verdünnungsstufe
angefertigt. Der Calibrator Diluent RD5-53 selbst diente bei der Messung als
Nullstandard (0 pg/ml).
Nach Anfertigung der Verdünnungsreihe wurden die Vertiefungen der Mikrotiterplatte mit je 50 μl Assay Diluent RD1-73 und 50 μl des Standards, der
- 33 Kontrolllösung oder aktivierter Patientenprobe befüllt. Darauf folgte eine
zweistündige Inkubationszeit, nach deren Ablauf die Testfelder der
Mikrotiterplatte insgesamt viermal mit je 400μl Waschpuffer gereinigt und mit
je 100 μl TGFβ1 Konjugat befüllt wurden.
Anschließend wurde die Platte erneut für zwei Stunden inkubiert und im
darauffolgenden viermaligen Waschgang ausgewaschen. Danach wurden die
Testfelder mit jeweils 100 μl Substrate-Solution versetzt, die sich aus dem
Hydrogenperoxid-haltigen Color Reagent A und dem Chromogen (Tetramethylbenzidin)-haltigen Color Reagent B zusammensetzt. Im Anschluss
wurde die Platte bei Raumtemperatur für 30 Minuten in lichtgeschützter
Umgebung inkubiert.
Nach Zugabe der chlorwasserstoffhaltigen Stop-Solution wurde die Extinktion
ebenfalls innerhalb von 30 Minuten in einem ELISA-Reader bei einer
Wellenlänge von 450 nm gemessen. Indem auch hier alle Proben und die
Kontrolllösung beziehungsweise die Verdünnungsreihe im Doppelansatz
angelegt wurden, ließen sich die Mittelwerte der Extinktionen ermitteln. Die
Ergebnisse der Messung mussten im Anschluss mit dem jeweiligen
Verdünnungsfaktor multipliziert werden.
3.5.3.
Quantitative Bestimmung des sCD40L-Gehalts
Neben den Messungen des TGFβ1-Spiegels wurde der ebenfalls in Thrombozyten enthaltene Wachstumsfaktor sCD40L in den Proben untersucht. Nach
Auftauen der zu untersuchenden und im Vorweg bei -70°C gelagerten
Patientenproben
bei
Raumtemperatur
wurden
diese
zunächst
nach
Herstellerangaben (R&D Systems) mit dem Calibrator Diluent RD5P(1X)
verdünnt, wobei das Ausmaß der Verdünnung zwischen 5-fach und 20-fach
variieren konnte. Auf diese Weise wurde eine auf das Probenmaterial
zugeschnittene Messung der Patientenproben gewährleistet.
Im nächsten Schritt wurde eine Verdünnungsreihe der Standardlösung angefertigt. Zunächst wurde dabei aus dem im Versuchskasten enthaltenen
sCD40L Standard und 1 ml destillierten Wasser die Ausgangslösung von
40.000 pg/ml angerührt.
- 34 Im Anschluss wurden durch Zupipettieren von je 500 μl des nächsthöheren
Standards zu 500 μl Calibrator Diluent RD5P(1X) konsekutiv die Konzentrationen von 4000 pg/ml, 2000 pg/ml, 1000 pg/ml, 500 pg/ml, 250 pg/ml,
125 pg/ml, sowie 62,5 pg/ml erreicht. Der Diluent RD5P(1X) selbst entsprach
dabei dem in der Messung verwendeten Nullstandard (0 pg/ml).
Anschließend wurde jede der Vertiefungen der Platte zuerst mit 100 μl Assay
Diluent RD1-65, dann mit 100 μl der verdünnten Patientenprobe bzw. der
Kontrolllösungen befüllt. Nach Ablauf der Inkubationszeit von zwei Stunden
auf einem horizontal kreisenden Schüttler bei Raumtemperatur wurde durch
den anschließenden vierfachen Waschvorgang mit je 400 μl Pufferlösung das
überschüssige, nicht gebundene Probenmaterial aus den Testfeldern entfernt.
Danach wurden je 200 μl sCD40L-Konjugat in die Vertiefungen gegeben und
erneut eine zweistündige Inkubationszeit auf dem Rüttler angehängt. Nach
einem weiteren Waschvorgang wurden je 200 μl Substrate-Solution in die
Testfelder pipettiert. Die Substrate-Solution setzte sich dabei aus Color
Reagent A und B, die Hydrogenperoxid und Chromogen (Tetramethylbenzidin)
enthielten, zusammen. Im Anschluss folgte eine 30-minütige Inkubationszeit
in Ruhe und lichtgeschützter Umgebung.
Im nächsten Schritt kam die Zugabe der schwefelsäurehaltigen Stop-Solution.
Nachfolgend wurde innerhalb von 30 Minuten die Messung der Probenplatte
in einem ELISA-Reader bei einer Wellenlänge von 450 nm vorgenommen.
Sowohl die Standards als auch die Proben wurden im Doppelansatz
angefertigt, sodass aus den Extinktionen die Mittelwerte berechnet werden
konnten. Auch hier mussten abschließend die Messwerte mit dem jeweiligen
Verdünnungsfaktor multipliziert werden.
- 35 3.6.
Statistische Datenauswertung
Die Ergebnisse der In-vitro-Messungen wurden mit dem Programm Microsoft
Office Excel 2003 tabellarisch zusammengefasst, um mit dem Statistikprogramm SPSS® für Windows® (Version 19, SPSS, Inc, Chicago, IL, USA)
analysiert werden zu können. Die Werte wurden mit Hilfe des Lilliefors- und
Shapiro-Wilks-Test auf Normal-verteilung geprüft. Dabei wurde bei nichtnormalverteilten Daten die statistische Analyse mit nicht-parametrischen
Methoden durchgeführt, wobei der Mann-Whitney-U-Test für Gruppenvergleiche diente. Bei normalverteilten Messwerten allerdings wurde der T-Test
für verbundene und unverbundene Daten vorgenommen. In beiden Fällen
wurden Unterschiede für signifikant erachtet, wenn p<0,05 war.
- 36 -
4.
ERGEBNISSE
4.1.
Allgemeine Messparameter
Für die Versuchsreihe wurden 32 Thrombozytapheresekonzentrate hergestellt. Dabei betrug die durchschnittliche Separationsdauer mit dem Zellseparator Trima Accel 43 ± 3,95 Minuten (Schwankungsbreite 36 bis 50 Minuten)
und mit dem Zellseparator Amicus 48,94 ± 9,57 Minuten (Schwankungsbreite
36 bis 63 Minuten). Das mittlere Volumen der Thrombozytenkonzentrate, die
an
der
Trima
Accel
hergestellt
wurden,
betrug
250,6
±
3,7
ml
(Schwankungsbreite 242 bis 258 ml). Das durchschnittliche Volumen der
Amicus-Produkte lag mit 246,5 ± 4,3 ml (Schwankungsbreite 238 bis 253 ml)
im Vergleich geringfügig niedriger.
4.2.
Thrombozytengehalt der Apheresekonzentrate
Im Standardverfahren enthält ein Thrombozytenkonzentrat 2 - 4 × 1011
Thrombozyten in 200-300 ml Plasma, somit ergibt sich ein mittlerer Thrombozytengehalt von 1,2 × 106 /µl [14]. In dieser Studie wurde die durchschnittliche Thrombozytenkonzentration der Apheresekonzentrate lediglich an
Tag 0, dem Zeitpunkt der Entnahme, bestimmt. Sie wies nach Apherese am
Zellseparator Trima Accel einen Mittelwert von 1,24 ± 0,14 ng/ ml auf,
wohingegen der Durchschnitt in den Aphereseprodukten der Maschine Amicus
mit 1,51 ± 0,27 ng/ml deutlich über diesem Wert lag. Tabelle 1 zeigt diese
Ergebnisse.
Tabelle 1:
Thrombozytenkonzentration in Apheresekonzentraten von den
Zellseparatoren Trima Accel und Amicus im Vergleich
Angegeben sind Mittelwerte ± Standardabweichung (SD) bei 32
Spendern
Trima
Mittelwert
Tag 0
1,24
Amicus
SD
± 0,14
Mittelwert
1,51
SD
± 0,27
- 37 -
Thrombozytenkonzentration Amicus und Trima Accel
1800
1600
1400
1200
Standardabweichung
1000
Mittelwert
800
600
400
200
4.3.0Ergebnisse der ELISAs
1
2
Abbildung 4: Mittlere Thrombozytenkonzentration ± Standardabweichung in
den Produkten von den Zellseparatoren Amicus (1) und Trima
Accel (2)
4.3.
Ergebnisse der ELISAs
4.3.1. Messung des Wachstumsfaktors TGFβ1
Die Konzentration des Wachstumsfaktors TGFβ1 wurde sowohl in den CTADPlasmen als auch im Lysat bestimmt, wobei an den Messzeitpunkten Tag 0
(Entnahmetag der Spende) sowie Tag +1, +3 und +5 gemessen wurde.
4.3.1.1. Verlauf des TGFβ1 nach Apherese mit der Maschine Trima Accel
Bei Messungen der durch den Zellseparator Trima Accel gewonnenen Proben
lagen die Ausgangswerte im Lysat bei 338,02 ± 106,67 ng/ml, stiegen an Tag
+1 leicht auf 347,78 ± 80,1 ng/ml an, um an Tag +3 wieder auf 329,94 ± 111,34
ng/ml abzusinken. Schließlich stieg die Konzentration des TGFβ 1 am letzten
Messzeitpunkt an Tag +5 auf 338,40 ± 121,05 ng/ml an. Zusammenfassend
lässt sich sagen, dass die Konzentration des TGFβ 1 trotz leichter
Schwankungen recht konstant blieb. Daher ergaben sich keine signifikanten
Unterschiede zwischen den Messwerten an Tag 0 versus Tag +5.
Anders verhielt sich hierbei die Konzentration dieses Wachstumsfaktors in den
CTAD-Proben. So stieg sie von ihrem Ausgangswert an Tag 0 von 2,01 ± 2,16
- 38 ng/ml kontinuierlich signifikant über die Werte 11,93 ± 7,66 ng/ml an Tag +1,
sowie 26,84 ± 11,98 ng/ml an Tag +3, schließlich an Tag +5 auf 36,3 ± 9,22
ng/ml an. Dabei ergab sich eine signifikante Erhöhung der Messwerte Tag 0
versus Tag +5. Tabelle 2 gibt diesen Verlauf wieder.
Tabelle 2:
Mittlere Konzentrationen (ng/ml) ± SD des Zytokins TGFβ1 in
Apheresekonzentraten von der Maschine Trima Accel in Lysatund CTAD-Proben in Abhängigkeit von der Dauer der Lagerung
TGFβ1 im Lysat
TGFβ1 im CTAD-Überstand
Mittelwert SD
Mittelwert
SD
Tag 0
338,02
± 106,67
2,01
± 2,16
Tag +1
347,78
± 80,1
11,92 *
± 7,66
Tag +3
329,94
± 111,34
26,84 *, †
± 11,98
Tag +5
338,40
± 121,05
36,3 *, †, ‡
±9,22
* p < 0,05 versus Werte vom vorherigen Messzeitpunkt,
† p< 0,05 versus Werte von Messung an Tag 0,
‡ p < 0,05 versus Werte von Messung an Tag +1
Konzentration TGFβ1 (ng/ml)
Verlauf der TGFβ1 Konzentration in Produkten des Zellseparators
Trima Accel
400
350
300
250
200
150
100
50
0
Abbildung 5:
TGFβ1
Lysat
TGFβ1
CTAD
0
1
3
5
Lagerungstag
Konzentrationsverlauf des Wachstumsfaktors TGFβ 1 in
Lysat- und CTAD-Proben nach Zytapherese am Zellseparator Trima Accel
- 39 4.3.1.2. Verlauf der Konzentration des Zytokins TGFβ1 nach Apherese
mit der Maschine Amicus
Auch nach Apherese durch diesen Zellseparator blieben die Werte der LysatProben ohne signifikante Veränderung. So betrug die Ausgangskonzentration
an Tag 0 454,63 ± 12,53 ng/ml, stieg an Tag +1 anschließend leicht auf 483,34
± 122,87 ng/ml an, fiel jedoch an Tag +3 auf 478,38 ± 106,62 ng/ml und an
Tag +5 schließlich nochmals auf 457,05 ± 30,28 ng/ml zurück.
Anders verhielt es sich bei den CTAD-Aliquots. Die Konzentrationen an TGFβ1
verdoppelten sich vom Anfangswert von 15,83 ± 22,98 ng/ml an Tag 0 bereits
an Tag +1 fast auf 28,49 ± 35,25 ng/ml, stiegen zum nächsten Messzeitpunkt
an Tag +3 nochmals auf 43,01 ± 28,46 ng/ml, um schließlich an Tag +5 einen
Endwert von 52,46 ± 30,28 ng/ml anzunehmen. Zwischen dem ersten Messwert an Tag 0 und dem letzten an Tag +5 konnte ein signifikanter Anstieg der
Konzentration in den CTAD-Proben bestimmt werden (Siehe auch Tabelle 3).
Tabelle 3:
Mittelwerte ± SD (ng/ml) der TGFβ1-Konzentrationen in
Apheresekonzentraten von dem Zellseparator Amicus in den
Lysat- und CTAD-Proben
TGFβ1 im Lysat
TGFβ1 im CTAD-Überstand
Mittelwert
SD
Mittelwert
SD
Tag 0
454,63
± 12,53
15,83
± 22,98
Tag +1
483,34
± 122,87
28,49 *
± 35,25
Tag +3
478,38
± 106,62
43,01 *, †
± 28,46
Tag +5
457,05
± 30,28
52,46 †, ‡
± 30,28
* p < 0,05 versus Werte vom vorherigen Messzeitpunkt,
† p < 0,05 versus Werte von Messung an Tag 0,
‡ p < 0,05 versus Werte von Messung an Tag +1
- 40 -
Konzentration TGFβ1 (ng/ml)
Verlauf der TGFβ1 Konzentration in Produkten des
Zellseparators Amicus
600
500
400
TGFβ1
Lysat
300
200
TGFβ1
CTAD
100
0
0
1
3
Lagerungstag
5
Abbildung 6: Tagesverlauf der TGFβ1-Konzentrationen in Lysat-Proben im
Vergleich zu CTAD-Proben der Amicus-Produkte
4.3.1.3.
Verlauf
der
intrazellulären
TGFβ1-Konzentration
im
Vergleich der Präparate beider Zellseparatoren
Ein direkter Vergleich der Kontentrate von den beiden Zellseparatoren lässt
sich anhand der intrazellulären Konzentration des TGFβ 1 anstellen. Der
Separator Trima Accel wies Ausgangswerte von 336,01 ± 105,99 ng/ml auf,
um dann an Tag +1 auf 335,85 ± 78,55 ng/ml, an Tag +3 auf 303,10 ± 111,14
ng/ml und schließlich am letzten Messzeitpunkt auf 293,55 ± 114,47 ng/ml
herabzufallen.
Ebenso verhielt es sich bei dem Zellseparator Amicus, hier lag die
Ausgangskonzentration an Tag 0 bei 438,8± 125,35 ng/ml, stieg an Tag +1
leicht auf 454,85 ± 124 ng/ml an, sank jedoch anschließend an Tag +3 wieder
auf 435,37 ± 104,54 ng/ml und an Tag +5 weiter auf 404,59 ± 125,07 ng/ml
herab.
- 41 Auffällig hierbei ist, dass die Konzentrationen in den Aphereseprodukten
beider Zellseparatoren zwar recht gleich anstiegen bzw. abfielen, jedoch
überstiegen die Werte der Amicus-Konzentrate die Messwerte der Produkte
des Zellseparators Trima Accel signifikant um knapp 100 ng/ml. Zur
Verdeutlichung dient Abbildung 7.
Tabelle 3: Mittelwerte ± SD (ng/ml) der intrazellulären TGFβ1-Konzentration
der Produkte der Zellseparatoren Trima Accel und Amicus
Trima
Amicus
Mittelw
e
SD
r
t
Mittelwert
SD
Tag 0
336,01 *
± 105,99
438,8
± 125,35
Tag +1
335,85 *
± 78,55
454,85
± 124
Tag +3
303,10 *
± 111,14
435,37
± 104,54
Tag +5
293,55 *
± 114,47
404,59
± 125,07
* p < 0,05 versus Werte des Zellseparators Amicus am jeweiligen Messzeitpunkt
Konzentration TGFβ1 (ng/ml)
Verlauf der intrazellulären TGFβ1 Konzentration in den
Zellseparatoren Trima Accel und Amicus
500
400
Trima
300
200
Amicus
100
0
Abbildung 7:
0
1
3
5
Lagerungstag
Verlauf der intrazellulären Konzentration des Wachstumsfaktors TGFβ1 im direkten Vergleich der Zellseparatoren
Trima Accel und Amicus
- 42 4.3.2. Messung des Wachstumsfaktors sCD40L
Neben TGFβ1 wurde der Wachstumsfaktor sCD40L untersucht.
Das Messprinzip blieb dabei gleich, auch hier wurde die Konzentration des
sCD40L in im Voraus entnommenen Aliquots am Entnahmetag der Spende
(Tag 0), sowie an den darauf folgenden Lagerungstagen +1, +3 und +5
gemessen.
4.3.2.1.
Verlauf der Konzentration des sCD40L nach Apherese durch
den Zellseparator Trima Accel
Bei Proben des Separators Trima Accel verhielt sich die Konzentration des
sCD40L in den Lysatproben anfangs recht stabil, d.h. sie betrug am Entnahmetag der Spende (Tag 0) 37,11 ± 9,95 ng/ml, an Tag +1 37,09 ± 8,95 und
an Tag +3 36,00 ± 22,25 ng/ml. Allerdings sank die Konzentration hier an Tag
+5 auf 29,16 ± 8,61 ng/ml ab. Es zeigten sich jedoch keine signifikanten
Unterschiede zwischen den Messewerten.
Im Gegensatz hierzu stieg die sCD40L-Konzentration in der CTAD-Lösung
konstant und signifikant an. Beginnend bei 0,15 ± 0,25 ng/ml an Tag 0, erhöhte
sie sich an Tag +1 auf 1,18 ± 0,78 ng/ml, an Tag +3 auf 3,31 ± 1,42 ng/ml, um
schließlich an Tag +5 bei 4,41 ± 1,81 ng/ml zu verbleiben. Somit ließ sich eine
fast 30-fache und damit signifikante Zunahme der sCD40L-Konzentration in
den CTAD-Proben zwischen Messpunkt Tag 0 und Tag +5 beobachten. Zur
Veranschaulichung siehe auch Abbildung 5.
Tabelle 4:
Konzentrationen des Wachstumsfaktors (ng/ml) sCD40L in
Aphereseprodukten des Zellseparators Trima Accel an den
vier Messzeitpunkten
sCD40L Lysat
sCD40L CTAD
Mittelwert
SD
Mittelwert
SD
Tag 0
37,11
± 9,95
0,15
± 0,25
Tag +1
37,09
± 8,95
1,18 *
± 0,78
Tag +3
36,00
± 22,25
3,31 *, †
± 1,42
- 43 -
29,16 †, ‡
Tag +5
4,41 †, ‡
± 8,61
± 1,81
* p < 0,05 versus Werte vom vorherigen Messzeitpunkt,
† p < 0,05 versus Werte von Messung an Tag 0,
‡ p< 0,05 versus Werte von Messung an Tag +1
Konzentration sCD40L
(ng/ml)
Verlauf der sCD40L Konzetration in Produkten des
Zellseparators Trima Accel
40
35
30
25
20
15
10
5
0
sCD40L Lysat
sCD40L CTAD
0
1
3
5
Lagerungstag
Abbildung 8: Konzentrationsverlauf des Zytokins sCD40L nach Zellapherese
durch den Zellseparator Trima Accel
4.3.2.2.
Verlauf
der
sCD40L-Konzentration
in
Produkten
des
Zellseparators Amicus
Anfangs betrugen die Mittelwerte in den Lysat-Aliquots 47,77 ± 15,20 ng/ml
(Tag 0), um anschließend kontinuierlich zunächst auf 44,53 ± 16,63 ng/ml (Tag
+1), dann auf 41,31 ± 28,46 ng/ml (Tag +3) und abschließend an Tag +5 auf
37,80 ± 13,65 ng/ml abzufallen. Obwohl die Werte in den Lysatproben um etwa
ein Viertel sanken, ergab sich keine signifikante Abnahme.
Im Gegensatz hierzu stiegen auch bei dieser Maschine die in den CTADProben gemessenen Werte signifikant an. Ausgehend vom Anfangswert von
2,21 ± 5,92 ng/ml an Tag 0, nahm die Zytokinkonzentration an Tag +1 auf 4,16
- 44 ± 6,79 ng/ml, an Tag +3 auf 5,72 ± 15,56 und letztendlich an Tag +5 auf 6,81
± 3,79 ng/ml zu.
Daraus resultierte ein Anstieg um das dreifache des Startwertes, was auch
eine signifikante Zunahme der sCD40L-Konzentration zwischen Tag 0 und
Tag +5 begründet.
Tabelle 5:
Verlauf der Konzentration (ng/ml) an sCD40L in Proben des
Zellseparators Amicus an den Messtagen Tag 0, Tag +1, Tag
+3 und Tag +5
sCD40L Lysat
Mittelw
sCD40L CTAD
SD
Mittelwert
SD
e
r
t
Tag 0
47,77
± 15,20
2,21
± 5,92
Tag +1
44,53
± 16,63
4,16 *
± 6,79
Tag +3
41,31
± 28,46
5,72 *, †
± 15,56
Tag +5
37,80
± 13,65
6,81 †, ‡
± 3,79
*p < 0,05 versus Werte vom vorherigen Messzeitpunkt,
† p < 0,05 versus Werte von Messung an Tag 0,
‡ p < 0,05 versus Werte von Messung an Tag +1
- 45 -
Konzentration sCD40L
(ng/ml)
Verlauf der sCD40L Konzentration in Produkten des
Zellseparators Amicus
60
50
40
sCD40L Lysat
30
sCD40L CTAD
20
10
0
0
1
3
5
Lagerungstag
Abbildung 9:
Gegenläufiges Verhalten der Konzentration an sCD40L in
Lysat- und CTAD-Proben des Zellseparators Amicus
4.3.2.3. Verlauf des intrazellulären sCD40L im Vergleich Trima Accel
versus Amicus
An Tag 0 ließen sich in den Proben des Zellseparators Trima Accel Ausgangswerte von 36,96 ± 0,94 ng/ml messen, die dann jedoch stetig abfielen. An Tag
+1 maß die Konzentration noch 35,91 ± 8,50 ng/ml, an Tag +3 32,7 ± 21,93
ng/ml, an Tag +5 lediglich 24,76 ± 7,43 ng/ml.
Sehr ähnlich verhielten sich auch die Messwerte der dem Zellseparator
Amicus entstammenden Proben. Hier betrug der Anfangswert 45,56 ± 17,33
ng/ml, sank jedoch bereits an Tag +1 auf 40,37 ± 19,09 ng/ml, an Tag +3 auf
35,59 ± 10,45 ng/ml, um schließlich an Tag +5 nur noch 30,99 ± 13,67 ng/ml
zu betragen.
Insgesamt ergaben sich jedoch zu keinem Zeitpunkt signifikante Unterschiede
zwischen den zwei Zellseparatoren Trima Accel und Amicus.
- 46 Tabelle 6:
Gegenüberstellung der intrazellulären sCD40L-Konzentration ±
SD (ng/ml) in Proben der Zellseparatoren Trima Accel und
Amicus
Trima
Amicus
Mittelwert
SD
Mittelwert
SD
Tag 0
36,96
± 0,94
45,56
± 17,33
Tag +1
35,91
± 8,50
40,37
± 19,09
Tag +3
32,7
± 21,93
35,59
± 10,45
Tag +5
24,76
± 7,43
30,99
± 13,67
Konentration sCD40L
(ng/ml)
Verlauf der intrazellulären sCD40L Konzentration in Proben der
Zellseparatoren Trima Accel und Amicus
50
40
30
Trima Accel
20
Amicus
10
0
0
1
3
5
Lagerungstag
Abbildung 10:
Verlauf der intrazellulären Konzentration an sCD40L in
Proben der Zellseparatoren Trima Accel und Amicus an
den Lagerungstagen 0, +1, +3, +5
- 47 4.4.
Gegenüberstellung der Zellseparatoren Trima Accel und
Amicus
4.4.1.
Vergleich des Zytokingehalts im CTAD-Plasma nach
Zellapherese durch Trima Accel und Amicus
Der tagesabhängige Verlauf dieser Messwerte wurde bereits ausführlich
beschrieben. Wird nun die direkte Gegenüberstellung der zwei Zellseparatoren anhand der Zytokinkonzentration in den CTAD-Proben betrachtet,
erscheinen zwei Punkte relevant. Zum einen bestand für die Messwerte des
Wachstumsfaktors TGFβ1 an den Zeitpunkten Tag 0, Tag +1 sowie an Tag +3
ein signifikanter Unterschied zwischen den Zellseparatoren.
Im Gegensatz hierzu standen zum anderen die Messungen für das Zytokin
sCD40L, die lediglich an Tag +5 einen signifikanten Unterschied zwischen
Trima Accel und Amicus aufzeigten. Siehe auch Tabelle 7.
Tabelle 7:
Messwerte der Zytokinkonzentrationen ± SD (ng/ml) in den
CTAD-Proben der Zellseparatoren Trima Accel und Amicus
Zytokinkonzentration im CTAD-Plasma
TGFβ1
Amicus
sCD40L
Trima Accel
Amicus
Trima Accel
Mittelwert
SD
Mittelwert
SD
Mittelwert
SD
Mittelwert
SD
15,8 †
±23,0
2,0 †
±2,2
2,2
±5,9
0,1
±0,2
±7,7
4,2 *
±6,8
1,2 *
±0,8
Tag+3 43,0 *† ±28,5 26,8 *† ±12,0
5,7 *
±15,6
3,3 *
±1,4
Tag+5
6,8 †
±3,8
4,4 †
±1,8
Tag 0
Tag+1 28,5 *† ±35,2 11,9 *†
52,5
±30,3
36,3 *
±9,2
* p < 0,05 versus Werte vom vorherigen Messzeitpunkt,
† p < 0,05 versus Werte des gleichen Tages/andere Maschine
- 48 -
Zytokinkonzentration in
ng/ml
Zytokinkonzentration im CTAD-Plasma
60000
50000
TGFß1 Trima Accel
40000
TGFß1 Amicus
30000
sCD40L Trima Accel
20000
sCD40L Amicus
10000
0
0
1
3
5
Tag
Abbildung 11:
Verlauf der Zytokinkonzentrationen im CTAD-Plasma nach
Zellapherese durch Trima Accel und Amicus an den
Messzeitpunkten Tag 0, Tag +1, Tag +3 sowie Tag +5
4.4.2.
Vergleich der intrazellulären Zytokinkonzentration je 105
Thrombozyten in Trima Accel- und Amicus-Konzentraten
Da durch die Bundesärztekammer lediglich das durchschnittliche Volumen der
Spendekonzentrate auf 200-300 ml festgelegt ist [14], kann das tatsächliche
Volumen zwischen den einzelnen Konzentraten leicht variieren. Um eine
ausgeglichene
Zellseparatoren
Ausgangssituation
zu
schaffen,
für
erscheint
den
es
Vergleich
der
beiden
sinnvoll,
den
TGFβ 1-
beziehungsweise sCD40L-Gehalt pro 105 Thrombozyten zu untersuchen.
Dabei wies die TGFβ1-Konzentration/105 Thrombozyten bei der Maschine
Trima Accel einen Anfangswert von 27,54 ± 9,58 pg/ml auf, nahm dann jedoch
an Tag +1 zunächst auf 27,39 ± 7,09 pg/ml ab, um anschließend an Tag +3
weiter auf 24,76 ± 9,08 pg/ml und an Tag +5 auf 23,93 ± 9,52 pg/ml zu fallen.
Es ließen sich keine signifikanten Ungleichheiten feststellen.
Bei dem Zellseparator Amicus betrug der Ausgangswert 28,91 ± 5,72 pg/ml an
Tag 0, stieg danach an Tag +1 auf 29,98 ± 5,88 pg/ml, um jedoch an Tag +3
bereits wieder auf 28,77 ± 4,66 pg/ml und abschließend an Tag +5 nochmals
- 49 auf 26,56 ± 5,67 pg/ml zu fallen. Auch hier verhielten sich die Konzentrationen
ohne signifikante Veränderung.
Auffällig ist, dass im Gegensatz zu den Ergebnissen des Vergleichs des ungenormten Zytokingehalts der Thrombzytenkonzentrate nun hierbei kein
signifikanter Unterschied mehr zwischen den zwei Zellseparatoren zu
erkennen ist. Gleich dem Vorgehen bei dem Zytokin TGFβ 1 wurde auch bei
den Messungen des Wachstumsfaktors sCD40L die Konzentration/10 5
Thrombozyten genormt, um eine ausgeglichene Vergleichsbasis zwischen
den zwei Zellseparatoren zu schaffen.
Dabei wurde ersichtlich, dass die Konzentration des sCD40L nach Apherese
durch die Maschine Trima Accel von dem Ausgangswert an Tag 0 bei 2,98 ±
0,70 ng/ml zunächst an Tag +1 auf 2,9 ± 0,65 ng/ml, dann an Tag +3 auf 2,59
± 1,48 ng/ml fiel, um schließlich an Tag +5 bei 2 ± 0,55 ng/ml zu verbleiben.
Dieser Tendenz folgten auch die Messwerte der Amicus-Produkte, so nahm
auch hier die Konzentration des Wachstumsfaktors stetig ab: Zu Beginn
maßen die Werte 2,99 ± 0,87 ng/ml (Tag 0), fielen jedoch im Verlauf an Tag
+1 auf 2,67 ± 1,07 ng/ml, an Tag +3 auf 2,31 ± 0,82 ng/ml und letztendlich auf
2,03 ± 0,78 ng/ml. Gleich den Ergebnissen des Wachstumsfaktors TGFβ 1
zeigte sich auch hier zu keinem Zeitpunkt ein signifikanter Unterschied
zwischen den Zellseparatoren.
Tabelle 8:
Mittelwerte ± SD (ng/ml) der intrazellulären Zytokinkonzentration/105 Thrombozyten an den Messpunkten Tag 0, +1, +3, +5
Intrazelluläre Zytokinkonzentration/105 Thrombozyten
TGFβ1
Amicus
Mittelwe
rt
Tag
0
Tag+
1
28,91
29,98
SD
±5,7
2
±5,8
8
sCD40L
Trima Accel
Mittelwe
rt
27,54
27,39
SD
±9,5
8
±7,0
9
Amicus
Mittelwe
rt
2,99
2,67
SD
±0,8
7
±1,0
7
Trima Accel
Mittelwe
rt
2,98
2,9
SD
±0,7
0
±0,6
5
- 50 Tag+
3
Tag+
5
28,77
26,56
±4,6
6
±5,6
7
24,76
23,93
±9,0
8
±9,5
2
2,31 †
2,03 †
±0,8
2
±0,7
8
2,59 *, †
2 †, ‡
±1,4
8
±0,5
5
p < 0,05 versus Werte vom vorherigen Messzeitpunkt,
† p < 0,05 versus Werte von Messung an Tag 0,
‡ p< 0,05 versus Werte von Tag +1
Konzentration in ng/ml
Verlauf der intrazellulären Konzentration TGFß 1/10
Thrombozyten
5
35
30
25
TGFß Trima
20
15
TGFß Amicus
10
5
0
0
1
3
5
Tag
Abbildung 12:
Konzentrationen an TGFβ1/105 Thrombozyten nach Zellapherese
mit Trima Accel versus Amicus an Tag 0, +1, +3 sowie +5
- 51 -
Konzentration in ng/ml
Verlauf der intrazellulären Konzentration sCD40L/10
Thrombozyten
5
3,5
3
2,5
sCD40L Trima Accel
2
1,5
sCD40L Amicus
1
0,5
0
0
1
3
5
Tag
Abbildung 13:
Verlauf der sCD40L-Konzentration/105 Thrombozyten an den
Messzeitpunkten Tag 0, +1, +3 und +5 in den Zellseparatoren
Trima Accel und Amicus
- 52 -
5. DISKUSSION
In der vorliegenden Arbeit wurden die Zytokine TGFβ1 und sCD40L in Thrombozytapheresekonzentraten von zwei verschiedenen Zellseparatoren am Herstellungstag und dann im Verlauf an den Tagen +1, +3 und +5 gemessen.
Dabei wurde sowohl die Konzentration der in den Konzentraten zum jeweiligen
Untersuchungszeitpunkt frei vorliegenden Zytokine als auch die in den Konzentraten intra- und extrazellulär vorhandene Gesamtmenge beider Zytokine
untersucht.
Die Ergebnisse dieser Messungen sind unter mehreren Aspekten interessant
und mehren das Wissen über Eigenschaften von Thrombozytapheresekonzentraten:
Die Ergebnisse können hinsichtlich des so genannten Lagerungsschadens
bewertet werden, den Thrombozytapheresekonzentrate während der Lagerung erleiden. Die Freisetzung von Inhaltsstoffen der α-Granula von Thrombozyten in das Plasma der Präparate gilt als wesentlicher Teil des Lagerungsschadens bei Thrombozyten [54,73,83,84,97,105,111,112]. Die Konzentrationen insbesondere des in den Konzentraten zum jeweiligen Untersuchungszeitpunkt frei vorliegenden Zytokins sCD40L sind interessant, da
dieses Zytokin jüngst mit unerwünschten Reaktionen auf Thrombozytentransfusionen in Verbindung gebracht wurde [44,70,91,120]. Die frei vorliegenden
Konzentrationen beider Zytokine sind des Weiteren interessant, da in der
Literatur intensiv über die Bedeutung frei in Thrombozytenkonzentraten vorliegender Zytokine für Tumorwachstum und Metastasierung spekuliert wird
[11,53,79]. Und schließlich erlauben die gemessenen Werte der in den Konzentraten intra- und extrazellulär vorhandenen Gesamtmengen beider
Zytokine Aussagen in Hinblick auf die Proteinbiosynthese in gelagerten
Thrombozytenkonzentraten [95,118,123]. Diese Aspekte sollen im Folgenden
im Einzelnen diskutiert werden.
Thrombozyten sind vielseitig in Reaktionen des menschlichen Organismus
eingebunden. Neben ihrer Bedeutung für die Blutgerinnung, die hauptsächlich
an der Oberfläche aktivierter Thrombozyten abläuft, spielen sie eine Rolle in
- 53 der Wundheilung und haben Auswirkungen auf inflammatorische und
proliferative Vorgänge, insbesondere auf die Angioneogenese, die wiederum
für Tumorwachstum und –metastasierung essentiell ist [11,53,79].
Thrombozytenkonzentrate werden therapeutisch bei akuten Blutungen und
prophylaktisch zur Verhinderung akuter Blutungen vor allem im Rahmen einer
chemotherapieinduzierten hyporegenerativen Thrombozytopenie verabreicht
[130]. Jüngst durchgeführte prospektive Studien bestätigten eindrucksvoll,
dass die prophylaktische Thrombozytentransfusion mit einem Transfusionstrigger bei einem Thrombozytenwert von 10.000/µl Blut bei schweren
hyporegenerativen Thrombozytopenien schwere Blutungen vermeiden kann,
die bei ausschließlich therapeutischem Thrombozyteneinsatz nicht nur
häufiger auftreten, sondern untragbar oft tödlich enden können [101,102,117].
Die hierbei eingesetzten Konzentrate werden dabei meist durch Thrombozytapherese eines Spenders gewonnen und bis zu 5 Tage bei stetiger
Agitation aufbewahrt. In Deutschland wurde die Verwendbarkeit von
Thrombozytenkonzentraten aufgrund einer Empfehlung des Arbeitskreises
Blut jüngst auf 4 Tage nach dem Spendetag begrenzt [4], während
international auch an einer Ausdehnung der Verwendbarkeit auf bis zu sieben
Tage gearbeitet wird [116].
Damit Thrombozyten in vivo ihre Wirkungen entfalten können, müssen sie
zunächst, durch welchen Auslöser auch immer, aktiviert werden. Im Rahmen
der Aktivierung werden auch die intrathrombozytär gespeicherten Wachstumsfaktoren, unter anderem die Zytokine TGFβ1 und sCD40L, freigesetzt.
Dabei findet die Thrombozytenaktiverung nicht nur in vivo, sondern auch in
vitro während der Lagerung im Thrombozytenkonzentrat statt. Kanter et al.
fanden dies bei etwa 10-15% der in den untersuchten Konzentraten
enthaltenen Thrombozyten [54]. Dabei werden die Plättchen beispielsweise
durch den Kontakt mit künstlichen Membranen oder durch mechanische
Einwirkungen in einen aktivierten Zustand versetzt [54,97].
Dies lässt vermuten, dass Blutplättchen nach der erfolgten Aktivierung auch in
vitro ihre gespeicherten Wachstumsfaktoren ausschütten. Tatsächlich zeigte
sich eben dies in zahlreichen Studien, die einen direkten Zusammenhang
- 54 zwischen der thrombozytären Aktivierungsrate und der Entleerung der αGranula nachwiesen [21,72,75,84,95,99,132,134]. Sie beschrieben eine extrazelluläre Zunahme an freigesetzten Zytokinen im Zusammenhang mit vorangegangener Aktivierung der Thrombozyten [42,51,61,62,99].
Ausschlaggebend für die Aktivierungsrate der Blutplättchen erschien vor allem
das Ausmaß des Oberflächenkontakts [19,62]. Je intensiver die Plättchen mit
einer künstlichen Membran in Berührung kommen, umso höher ist die
Aktivierungsrate der Thrombozyten [62]. Daraus lässt sich folgern, dass der
Apheresevorgang und damit die Wahl des Zellseparators großen Einfluss auf
die Aktivierung sowie auf die Freisetzung der intrazellulär gespeicherten
Proteine hat [50,99].
Allerdings muss eindringlich darauf hingewiesen werden, dass die Aktivierung
von Thrombozyten auch an den Kunststoffwänden von Blutentnahmeröhrchen
stattfinden kann. Und auch die gängigen Antikoagulantien hemmen die nach
Probengewinnung in vitro weiterlaufende oder sogar erst richtig in Gang
kommende Thrombozytenaktivierung sehr unterschiedlich [131]. Hierbei
werden oft gravierende präanalytische Fehler gemacht. Ethylendiamintetraessigsäure, das Tetraanion der Ethylendiamintetraessigsäure, (englisch
Ethylendiamintetraacetat, EDTA) ist ein Komplexbildner, der besonders
stabile Chelatkomplexe mit Kationen mit einer Ladungszahl von mindestens
+2 bildet. EDTA bindet daher vor allem Calcium und ist deshalb ein beliebtes
Antikoagulans. EDTA ist jedoch in einem interindividuell höchst unterschiedlichen Ausmaß in der Lage, Thrombozyten zu aktivieren [134]. Dieses Phänomen ist in der Hämatologie bekannt, weil bei einzelnen Personen durch in vitro
ablaufende Bildung großer Thrombozytenaggregate bei der Blutbildmessung
eine schwere Thrombozytopenie vorgetäuscht werden kann, die so genannte
Pseudothrombopenie [45]. Das einzige Antikoagulans, das in vitro jede
Thrombozytenaktivierung komplett aktiviert, ist CTAD, eine Mischung aus
Zitrat, Theophyllin, Adenosin und Dipyridamol [134]. Daher untersuchten wir in
der vorliegenden Arbeit die Freisetzung der Zytokine TGFβ1 und sCD40L im
CTAD-Plasma, das heißt, im Überstand von Thrombozytenkonzentraten, von
denen Aliquots in CTAD-Röhrchen abgenommen wurden.
- 55 Des Weiteren untersuchten wir den Gesamtgehalt der Zytokine TGFβ1 und
sCD40L. Dazu mussten die intrazellulären Mengen dieser Zytokine vollständig
freigesetzt werden. Zu diesem Zweck wurden Lysate von Aliquots der Thrombozytapheresekonzentrate in dem Detergens Triton X-100 angefertigt, weil die
Arbeitsgruppe in der Transfusionsmedizinischen und Hämostaseologischen
Abteilung in der Vergangenheit gezeigt hatte, dass nur die Lyse in einem
Detergens alle intrazellulär gebundenen Zytokine aus Thrombozyten freisetzen kann. Dies gelingt weder mit Zyklen von Einfrieren und Auftauen noch
mit dem Auslösen von Gerinnung in den Proben in gleicher Weise [129].
Im Rahmen dieser Studie wurden zwei verschiedene Zellseparatoren zur
Gewinnung der Thrombozytenkonzentrate eingesetzt. Die Zellseparatoren
Amicus und Trima Accel weisen einige Unterschiede in ihrem Funktionsprinzip
auf, sodass Abweichungen der Eigenschaften ihrer Aphereseprodukte
voneinander nicht auszuschließen sind. Wird der Fokus der Betrachtung
zunächst auf die Konzentration der Zytokine TGFβ 1 und sCD40L im CTADPlasma gelegt, wird ersichtlich, dass die Werte sowohl nach Apherese durch
den Zellseparator Amicus als auch durch den Separator Trima Accel im
Verlauf kontinuierlich und signifikant anstiegen.
Wie bereits beschrieben, können Blutplättchen während der Lagerung trotz
kontinuierlicher Agitation durch den Kontakt mit der Oberfläche des
Aufbewahrungsbeutels sowie durch interzelluläre Interaktionen aktiviert
werden. Rinder et al. und andere zeigten in länger zurückliegenden
Untersuchungen, dass 40 bis 60% der konzentriert gelagerten Blutplättchen
nach 5 Tagen Lagerung das Markerprotein für thrombozytäre Aktivierung,
CD62P, exprimieren [64,83,84,124]. Diese Daten stammen aber aus einer
Zeit, in der Thrombozytapheresekonzentrate sehr große Mengen an
Leukozyten enthielten. Heutige Apheresesysteme erlauben dagegen die
Herstellung extrem leukozytenarmer Präparate auch ohne Filtration [61,68]. In
solchen Präparaten liegt die CD62P-Expression initial unter 12 % und nach
fünftägiger Lagerung bei etwa 25 % [131]. Dies scheint aber für Thrombozytapheresekonzentrate vom Zellseparator Amicus nicht zu gelten. In
Thrombozytapheresekonzentraten von diesem Zellseparator liegt die Rate
- 56 CD62P-exprimierender Thrombozyten schon am Tag +1 nach Herstellung bei
30 bis 35 % und steigt bis Tag 5 auf im Mittel 50 % [42,99].
Die in vitro während der Lagerung in Thrombozytenkonzentraten ablaufende
Aktivierung der Zellen wird als ‚platelet storage lesion’ beschrieben, wobei
noch nicht vollständig erforscht wurde, ob die partielle Thrombozytenaktivierung, der partielle Verlust an Zytokinen und auch an thrombozytärer
Funktionalität Auswirkungen auf die klinische Wirkung der Thrombozytenkonzentrate nach ihrer Transfusion zur Folge hat [54,73,83,84,105].
Zentral ist die Frage, ob eine teilweise Aktivierung von Thrombozyten im Rahmen der Lagerung von Thrombozytenkonzentraten Auswirkungen auf die
Funktion der Zellen einerseits und ihr Überleben in der Zirkulation andererseits
hat. Beide Aspekte sind getrennt zu betrachten, nachdem gezeigt werden
konnte, dass die Lagerung von Thrombozyten statt wie üblich bei +22 ± 2 °C
bei +4 ± 2 °C deren Funktion nicht verschlechtert, sondern sogar leicht
verbessert, obwohl seit langem bekannt ist, dass bei +4 ± 2 °C gelagerte
Thrombozyten extrem schnell aus der Zirkulation verschwinden [80].
Mehrere Studien verneinten das Bestehen von Auswirkungen der frühzeitigen
Aktivierung der Blutplättchen in vitro auf die Funktion und das Überleben
transfundierter Thrombozyten [8,66,82]. Michelson et al. demonstrierten, dass
auch aktivierte Plättchen in der Lage sind, in vivo unbeeinflusst zu zirkulieren
und zu funktionieren [66]. Weitere Studien bestätigten diese Feststellung,
indem gezeigt werden konnte, dass aktivierte Thrombozyten, die nicht an der
Thrombusformation teilnehmen, in eine inaktive Form gebracht und somit nicht
der
Zirkulation
entzogen
werden
[8].
Der
Zustand
der
leichten
Thrombozytenaktivierung mit CD62P-Expression ist also offenbar reversibel,
sodass solcherart aktivierte Blutplättchen anschließend erneut in die aktive,
adhäsive Form überführbar waren [8,82].
Dem widersprechend beschrieben andere Studiengruppen einen verfrühten
Abbau bereits in vitro aktivierter Thrombozyten nach deren Transfusion
[42,83,84]. Dabei wurden bei Thrombozyten von dem Zellseparator Amicus
Effekte auf die Überlebensrate der transfundierten Thrombozyten [42,83], das
- 57 Ansprechen auf Stimuli [42,61] sowie auf die in vitro Blutungszeit [42] nachgewiesen. Hagberg et al. und andere Arbeitsgruppen berichteten über eine
bedeutend erhöhte thrombozytäre Expression von CD62P nach Apherese
durch den Separator Amicus [42,51,62]. Sie beschrieben im Weiteren auch die
daraus resultierenden und vermehrt auftretenden Adhäsionen zwischen
Blutplättchen und Leukozyten. Letzteres endet schließlich in einer erhöhten
Immunantwort des Empfängers, die nicht nur in inflammatorischen
Begleiterscheinungen der Plättchentransfusion eine Rolle spielt [42,99],
sondern auch eine verfrühte Elimination der Thrombozyten aus dem Blut zur
Folge haben kann [42,52,84].
Des Weiteren ist zu beachten, dass Thrombozyten, die auf ihrer Oberfläche
CD62P exprimieren, bereits ganz oder teilweise degranuliert sind, also
biologisch potente Bestandteile wie beispielsweise ADP verloren haben.
Gleich der verminderten Expression von GPIb/IX-Komplexen auf der Oberfläche der Amicus-Thrombozyten führt dies zu einer Abnahme der hämostaseologischen Effektivität [42]. Zudem wurde im Vorfeld eingeschränktes
Ansprechen der durch den Zellseparator Amicus gewonnenen Plättchen auf
Stimulation mit ADP und TRAP (thrombin receptor activating peptide)
nachgewiesen [42].
Studien von Jilma-Stohlawetz et al. unterstützten diese Erkenntnisse nicht nur,
sie zeigten zudem bei Amicus-Thrombozyten eine niedriger ausgeprägte
Reaktion auf Thrombin-Rezeptor-Stimulation als bei Plättchen des Zellseparators Trima Accel [50]. Dabei stach zwar die hohe Sammeleffizienz des
Separators Amicus im Vergleich zu anderen Zellseparatoren hervor, jedoch
wiesen Thrombozyten der Amicus-Konzentrate nach Transfusion die höchste
Rate an Aktivitätsverlust auf [50].
All diese Punkte können zu der Annahme führen, dass die Qualität der Thrombozytenkonzentrate nach der Apherese mit dem Zellseparator Amicus durch
die verstärkte in vitro Aktivierung der Blutplättchen eingeschränkt ist. [42,52].
Picker et al. verglichen ebenfalls die Zellseparatoren Amicus und Trima Accel,
ohne jedoch auf den Aktivierungsgrad beziehungsweise die Funktionalität der
Blutplättchen einzugehen. Sie beschrieben in ihrer Gegenüberstellung die
- 58 Zellapherese der beiden Maschinen in den meisten der untersuchten
Parameter als äquivalent [78].
In Anbetracht dieser Untersuchungen stellt der Apheresevorgang einen
zentralen Punkt für das weitere Wirkpotenzial der Konzentrate dar.
Wie bereits beschrieben, werden Thrombozyten im Zellseparator Amicus
während des gesamten Aphereseprozesses in einem engen Behälter
gesammelt, der beständig Zentrifugalkräften ausgesetzt ist [15,16,50,103].
Unter diesen Umständen treten die Plättchen problemlos mit der Innenwand
des Behältnisses oder mit anderen Thrombozyten in Kontakt [15,16,62],
wodurch die Aktivierungskaskade eingeleitet wird [42,50,99,103].
Im Gegenzug verweilen die Blutplättchen während des Aphereseprozesses
durch den Zellseparator Trima nicht dauerhaft in einem Sammelbehälter,
sondern werden in 15-minütigen Zyklen in den größeren und vor allem nicht
Zentrifugalkräften ausgesetzten Sammelbeutel weitertransportiert [103].
Wird zunächst die „initiale Läsion“ der Blutplättchen [42] betrachtet, konnte die
hier vorliegende Studie aufzeigen, dass die Werte an Tag 0 nach Apherese
durch den Zellseparator Amicus lediglich bei Betrachtung des Zytokins TGFβ 1
einen signifikanten Unterschied in der Freisetzung des Wachstumsfaktors im
Vergleich zu Trima Accel zeigte (Trima Accel 2,01 ± 2,16 ng/ml, Amicus 15,83
± 22,98 ng/ml). An den darauffolgenden Messzeitpunkten Tag +1 (Trima Accel
11,92 ± 7,66 ng/ml, Amicus 28,49 ± 35,25 ng/ml) und Tag +3 (Trima Accel
26,84 ± 11,98 ng/ml, Amicus 43,01 ± 28,46 ng/ml) zeigten sich bei diesem
Zytokin ebenfalls signifikante intermaschinelle Ungleichheiten.
Demhingegen anders verhielt sich sCD40L mit nur einer nachweisbaren
signifikanten Differenz zwischen den beiden Zellseparatoren an Tag +5 (Trima
Accel 4,41 ± 1,81 ng/ml, Amicus 6,81± 3,79 ng/ml).
Hier zeigten sich die Messergebnisse nach Apherese durch den Zellseparator
Amicus signifikant höher als die korrespondierenden Werte in den
Trimaprodukten.
In diesem Punkt stimmen die Ergebnisse dieser Studie nicht mit den
Resultaten von Skripchenko et al. überein, die keinen signifikanten
- 59 Unterschied
zwischen
sCD40L-Konzentrationen
in
Produkten
der
Zellseparatoren Trima Accel und Amicus an Tag +5 finden konnten [99].
Beide Zytokine erreichten während dieser Studie unabhängig von der Wahl
des Zellseparators ihre Maximalwerte erst an Tag +5 (TGFβ1 Trima Accel 36,3
± 9,22 ng/ml, Amicus 52,46 ± 30,28 ng/ml; sCD40L Trima Accel 4,41 ± 1,81
ng/ml, Amicus 6,81± 3,79 ng/ml). Diese Aussage korreliert ebenfalls nicht mit
den Angaben in der Literatur, so wurde bereits mehrfach Tag +3 als
Messzeitpunkt mit der maximalen Zytokinkonzentration aufgewiesen [55,99].
Die Ergebnisse unserer Studie zeigen diskontinuierliche signifikante
Unterschiede zwischen den Zellseparatoren. Dabei konnten für den
Wachstumsfaktor TGFβ1 signifikante Unterschiede an den Messzeitpunkten
Tag 0, Tag +1 sowie Tag +3 beschrieben werden. Bei Betrachtung des
Zytokins sCD40L zeigte sich lediglich an dem Messtag +5 ein signifikanter
Unterschied zwischen Trima Accel und Amicus. Weitere Unterschiede
zwischen den Zelleparatoren ließen sich anhand dieser Messungen nicht
bestätigen.
Zusammenfassend lässt sich aus diesen Beobachtungen die Schlussfolgerung ziehen, dass die Wahl des Zellseparators einen Einfluss auf den
Aktivierungsgrad der Thrombozyten, folglich auch auf die Degranulation der
thrombozytären Speicher aufweist. Dies konnten die Messungen im CTADPlasma bestätigen, was sich mit der publizierten Studienlage deckt
[32,42,50,62,99].
Dennoch bleibt die Feststellung, dass transfundierte Thrombozyten trotz ihrer
Aktivierung noch funktionstüchtig sind. Sie zirkulieren, sind in der Lage, die in
ihnen gespeicherten Faktoren frei zu setzen und stillen die Blutung zeitgerecht
[84]. Obwohl sie scheinbar schneller aus der Blutzirkulation entfernt werden,
besitzen sie die Fähigkeit, sich von den Lagerungsbedingungen zu erholen
[84].
In diesem Zusammenhang stellt sich die Frage, wie sich bereits aktivierte
Thrombozyten nach der Transfusion im Blutstrom erholen können. Eine
mögliche Erklärung für diesen Mechanismus liefert die Fähigkeit der
Blutplättchen zur Proteinbiosynthese. Wie bereits im Vorfeld eine Vielzahl an
- 60 Untersuchungen zeigte, sind Thrombozyten trotz absentem Zellkern in der
Lage, in vivo Proteine eigenständig zu generieren [60,95,118,123,128]. Als
zentraler Trigger-Faktor für die Proteinbiosynthese in Blutplättchen kristallisiert
sich allem voran die Thrombozytenaktivierung heraus [118,128]. Relevant wird
diese
Tatsache
thrombozytären
in
Anbetracht
Aktivierung
der
während
bereits
der
beschriebenen
Zellapherese
partiellen
und
den
Lagerungstagen. In diesem Zusammenhang stellten Weyrich et al. fest, dass
Blutplättchen in Thrombozytenkonzentraten allmählich ihren Vorrat an RNA
verlieren [122]. Dies steht im Gegensatz zur kontinuierlichen mRNAExpression von eIF4E und Intergrin αIIbβ3 [123], wie sie in zirkulierenden
Blutplättchen stattfindet.
Die hier vorliegende Studie untersuchte in diesem Zusammenhang das Verhalten der intrathrombozytär gespeicherten TGFβ1- bzw. sCD40L-Menge. Um
den
Störeinfluss
leichter
Schwankungen
der
Konzentratsvolumina
auszugleichen, wurden die Konzentrationen von TGFβ1- bzw. sCD40L auf 105
Thrombozyten genormt. Bei Betrachtung der Ergebnisse muss zwischen den
beiden Zytokinen unterschieden werden.
So zeigte TGFβ1 bei keiner der beiden Zellseparatoren eine signifikante
Veränderung zwischen den Messpunkten Tag 0 (Trima Accel 27,45 ± 9,58
ng/ml, Amicus 28,91 ± 5,72 ng/ml) und Tag +5 (Trima Accel 23,93 ± 9,52
ng/ml, Amicus 26,56 ± 5,67 ng/ml). Im Gegensatz hierzu wies jedoch das
Zytokin sCD40L bei beiden Maschinen eine signifikante Abnahme zwischen
dem ersten und dem letzten Messzeitpunkt auf (Trima Accel 2,98 ± 0,70 ng/ml
[Tag 0] versus 2,00 ± 0,55 ng/ml [Tag +5], Amicus 2.99 ± 0,87 ng/ml [Tag 0]
versus 2,03 ± 0,78 ng/ml [Tag +5]).
In Anbetracht der Thrombozytenaktivierung während der Apherese und
während den Lagerungstagen sowie der damit verbundenen Freisetzung der
gespeicherten Wachstumsfaktoren stellt dies einen relevanten Punkt dar.
Würden gelagerte Thrombozyten keine Proteinbiosynthese betreiben, müsste
sich ein stetiges Absinken der intrathrombozytären Zytokinmenge ergeben.
Dies konnte in dieser Studie lediglich für den Wachstumsfaktor sCD40L
gefunden werden.
- 61 Demgegenüber wurde festgestellt, dass die intrathrombozytäre Zytokinmenge
an TGFβ1 zwischen Tag 0 und Tag +5 nicht signifikant abfällt. Dieser Punkt
entspricht der Literatur, in der bereits vielfach auf eine eigenständige
Nachproduktion von Wachstumsfaktoren in Blutplättchen hingewiesen wurde
[41,54,118,122,123].
Schubert et al. warfen jedoch die Frage auf, ob dieser Anstieg im Proteingehalt
der gelagerten Plättchenkonzentrate Folge der durch die thrombozytäre
Aktivierung gesteigerte de novo Synthese ist, oder ob die Proteine bereits in
den Granula gespeichert vorhanden waren [95].
Dies konnte bei den hier vorgelegten Messungen ausgeschlossen werden,
indem die Zytokinmenge nicht nur im CTAD-Plasma, sondern auch im Lysat
bestimmt wurde. Aus der Differenz dieser Wertepaare konnte gezeigt werden,
dass die Konstanz der intrazellulären TGFβ1-Konzentration nicht durch eine
schrittweise Entleerung thrombozytärer α-Granula zu erklären ist, sondern auf
eine de novo Proteinsynthese schließen lässt. Dabei war weder für TGFβ 1
noch für sCD40L eine signifikante Veränderung der Konzentrationen im Lysat
zwischen Tag 0 und Tag +5 messbar (TGF β 1 Trima Accel 338,02 ± 106,67
ng/ml [Tag 0] versus 338,40 ± 121,05 ng/ml [Tag +5]; Amicus 454,63 ± 12,53
ng/ml [Tag 0] versus 457,05 ± 30,28 ng/ml [Tag +5] ; sCD40L Trima Accel
37,11 ± 9,95 ng/ml [Tag 0] versus 29,16 ± 8,61 ng/ml [Tag +5]; Amicus 47,77
± 15,20 ng/ml [Tag 0] versus 37,80 ± 13,65 ng/ml [Tag +5]), wohingegen die
Konzentrationen sowohl des TGFβ1 als auch des sCD40L im CTAD-Plasma
signifikant anstiegen (TGFβ1 Trima Accel 2,01 ± 2,16 ng/ml [Tag 0] versus 36,3
± 9,22 ng/ml [Tag +5]; Amicus 15,83 ± 22,98 ng/ml [Tag 0] versus 52,46 ±
30,28 ng/ml [Tag +]; sCD40L Trima Accel 0,15 ± 0,25 ng/ml [Tag 0] versus
4,41 ± 1,81 ng/ml [Tag+5]; Amicus 2,21 ± 5,92 ng/ml [Tag 0] versus 6,81 ±
3,79 ng/ml [Tag +5)].
Bereits im Vorfeld konnte durch Weyrich et al. gezeigt werden, dass einige
andere Proteine wie unter anderem IL-1β und Bcl-3 nur signalabhängig
synthetisiert werden. Diese signalvermittelte Stimulation der Expression kann
jedoch in vivo auch in bereits aktivierten Thrombozyten ablaufen [122] und
ebenfalls weitere Proteine betreffen.
- 62 Ob diese Beobachtung auch in vitro Gültigkeit zeigt, erschien hierbei noch
unbekannt. In Anlehnung an diese Forschungen könnte die in unseren
Messungen fehlende signifikante Abnahme der intrazellulären TGFβ1-Menge
bedeuten, dass auch während den Tagen der Lagerung kontinuierlich
nachsynthetisiert wird. Dagegen verhält es sich beim sCD40L offenbar anders.
Sollten Thrombozyten jedoch tatsächlich in der Lage sein, ihre bioaktiven
Stoffe auch in vitro zu produzieren, würde das folglich eine stetig steigende
Menge an Proteinen bedeuten und somit stärkere Auswirkungen der
synthetisierten Wachstumsfaktoren.
Diese Frage wurde aktuell in den Mittelpunkt gerückt, nachdem einige
Studiengruppen über eine direkte negative Abhängigkeit zwischen der Zahl
transfundierter Thrombozytenkonzentrate und dem Überleben der Patienten
mit
Leukämie
berichteten
[11,48].
Allerdings
wurde
bei
diesen
Untersuchungen lediglich die Anzahl benötigter Konzentrate mit dem Outcome
des
Patientenkollektivs
in
Zusammenhang
gesetzt,
ohne
die
Rahmenbedingungen der einzelnen Patienten miteinzubeziehen. In diesem
Fall
kann
davon
ausgegangen
werden,
dass
Patienten
in
einem
fortgeschrittenen Krankheitsstadium sowohl mehr Konzenrate benötigen als
auch unabhängig von der Anzahl erhaltener Thrombozytentransfusionen ein
weitaus schlechteres Outcome aufweisen. In diesem Sinne ist es bisher nicht
gelungen, Thrombozytenkonzetraten einen krankheitsverkürzenden, und
somit für das Patientenüberleben relevanten Effekt nachzuweisen.
Zusammenfassend waren, bedingt durch die höhere Thrombozytenkonzentration in den Konzentraten vom Zellseparator Amicus, die Konzentrationen von
TGFβ1 und sCD40L in den Lysaten dieser Konzentrate höher als in denen
vom Zellseparator Trima Accel. Bezogen auf 10 5 Thrombozyten bestanden
keine Unterschiede. Während der Lagerung nimmt der sCD40L-Gehalt in den
Lysaten signifikant um ca. ein Drittel ab, während der Gehalt des TGFβ1
weitgehend konstant bleibt. In den Überständen steigen die Konzentrationen
beider Zytokine während der Lagerung an, wobei der überwiegende Anteil
beider Zytokine bis zum Tag +5 intrazellulär verbleibt.
- 63 Die zwei in dieser Studie eingesetzten Zellseparatoren Trima Accel und
Amicus weisen Unterschiede in ihrem Funktionsprinzip auf, was bekanntermaßen zu einer etwas stärkeren Thrombozytenaktivierung in Präparaten vom
Zellseparator Amicus führt. Dieser Effekt beeinflusst die nachweisbaren
Konzentrationen der Zytokine TGFβ1 und sCD40L in den Lysaten und den
Überständen jedoch kaum. Im Wesentlichen sind die Unterschiede auf die
unterschiedliche Konzentration der Thrombozyten in den Präparaten
zurückzuführen. Die Messungen zeigten ein Ausbleiben signifikanter Veränderungen der intrazellulären TGFβ1-Menge während der fünftägigen
Lagerung. Dies kann als Hinweis auf eine kontinuierliche Nachsynthese
während den Tagen der Lagerung gewertet werden. Dagegen nimmt der
intrazelluläre Gehalt an sCD40L innerhalb der fünftägigen Lagerung um etwa
ein Drittel ab. Inwieweit diese Befunde tatsächlich klinische Signifikanz für die
Empfänger von Thrombozytapheresekonzentraten haben, kann man derzeit
nicht beantworten.
- 64 -
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- 80 -
7.
7
ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS
AC
Antikoagulans
ACD-A
Acid-Citrate-Dextrose-A
ADP
Adenosindiphosphat
Bcl-3
B-cell leukaemia/lymphoma 3
BMP
Bone morphogenetic protein
BSA
Body surface area
B-Zelle
B-Zelllymphozyten
CCI
Corrected count increment
CD
Cluster of differentiation
CD40L
CD40-Ligand
CE
Collection efficiency
CTAD
Citrat, Theophyllin, Adenosin, Dipyridamol
DNA
Desoxyribonukleinsäure
eIF
Eukaryotic initiation factor
ELISA
Enzyme-linked immunosorbent assay
et al.
et alii
Fc
Kristallisiertes Fragment
FGF
Fibroblast growth factor
GP
Glykoprotein
HBV
Hepatitis-B-Virus
HCl
Salzsäure
HCV
Hepatitis-C-Virus
HEPES
Hydroxyethylpiperazin-N`-2Ethansulfonsäure
HIGM-1
X-linked immunodeficiency with hyper–
immunoglobulin M
HIV
Humanes Immundefizienz-Virus
Ig
Immunglobulin
IL
Interleukin
iPABP
Inducible poly(A) binding protein
KGD
Lysin-Arginin-Glutaminsäure
LAP
Latency-associated peptide
- 81 LDH
Laktatdehydrogenase
LKS
Leukoreduktionskammer
MAP
Mitogen activated protein
m7G
7-Methylguanosin
miRNA
Micro-Ribonukleinsäure
mRNA
Messenger Ribonukleinsäure
mTOR
Mammalian target of rapamycin
NaCl
Kochsalz
NADPH
Nicotinamidadenindinukleotidphosphat
NaOH
Natriumhydroxid
PAS
Platelet additive solution
PDGF
Platelet derived endothelial growth factor
PLT
Platelet
PRP
Plättchenreiches Plasma
RBC
Red blood cells
rER
Raues Endoplasmatisches Retikulum
RNA
Ribonukleinsäure
rRNA
Ribosomale Ribonukleinsäure
sCD40L
Soluble CD40 Ligand
SD
Standardabweichung
TGF
Transforming growth factor
TNF
Tumornekrosefaktor
TRAP
Thrombin receptor activating peptide
TSP
Thrombospondin
T-Zelle
T-Zelllymphozyten
UTR
Untranslated region
VEGF
Vascular endothelial growth factor
WBC
White blood cells
4E-BP
EIF4E-binding protein
- 82 Vorsätze:
k
Kilo (103)
m
Milli (10-3)
μ
Mikro (10-6)
n
Nano (10-9)
p
Piko (10-12)
f
Femto (10-15)
Einheiten:
°C
Grad Celsius
Da
Dalton
g
Gramm
l
Liter
m
Meter
M
Molarität
N
Stoffmenge
pH
pondus hydrogenii
RPM
Revolutions per minute
- 83 -
8.
DANKSAGUNG
Mein besonderer Dank gilt allen, die mich bei meiner wissenschaftlichen Arbeit
unterstützt und zu ihrem Gelingen beigetragen haben.
Besonders möchte ich mich bei meinem Betreuer Prof. Dr. Robert
Zimmermann bedanken. Er hat diese Arbeit initiiert, begleitet und stets unterstützt. Vielen Dank für die wissenschaftlichen Diskussionen, die immer
bereichernd waren und mir eine neue und meist viel positivere Sichtweise auf
Versuche und Ergebnisse gegeben haben. Vielen Dank zudem für die großartige Betreuung und die vielen Anmerkungen in dieser Arbeit.
Mein Dank gilt auch dem ganzen Team der Transfusionsmedizinischen und
Hämostaseologischen Abteilung, das mir bei Fragen im Labor stets bereitwillig
mit Antworten und Hilfestellungen zur Seite stand.
Auch danke ich Herrn Prof. Dr. R. Eckstein, Leiter der Transfusionsmedizinischen und Hämostaseologischen Abteilung in der Chirurgischen Klinik des
Universitätsklinikums Erlangen, der die finanziellen und wissenschaftlichen
Rahmenbedingungen zur Durchführung dieser Arbeit geschaffen hat.
Ein allerletztes Dankeschön geht an meine Familie, meine Freunde sowie an
Pascal, die mir mit Rat und Tat vor allem bei technischen Fragen zur Seite
standen, mich während der ganzen Zeit immer unterstützt und in meiner Arbeit
bestärkt haben.
- 84 -
9.
LEBENSLAUF
Name:
Melinda Vajko
Geburtstdatum:
25.07.1987
Geburtsort:
Budapest
Staatsangehörigkeit:
Deutsch
Email:
[email protected]
Fachärztliche Weiterbildung:
Ab 09/2014:
Departement Innere Medizin, Spital Bülach, Schweiz
Ausbildung:
05/2014:
Abschluss Zweiter Abschnitt der Ärztlichen Prüfung
nach ÄappO 2002, Note 2,5
02/2013 bis 01/2014:
Praktisches Jahr
09/2013 - 01/2014:
Chirurgische Klinik, FAU Erlangen-Nürnberg
06/2013 - 09/2013:
Departement Medizin, Kantonsspital Luzern,
Schweiz
02/2013 - 06/2013:
Klinik für Hals,-Nasen,-Ohrenheilkunde,
FAU Erlangen-Nürnberg
10/2009 bis 07/2013:
Klinischer Ausbildungsabschnitt
Erlangen-Nürnberg
an
der
FAU
10/2007 bis 09/2009:
Vorklinischer Ausbildungsabschnitt an der FriedrichAlexander-Universität (FAU) Erlangen-Nürnberg,
Abschluss mit dem Ersten Abschnitt der Ärztlichen
Prüfung nach ÄAppO 2002, Note: 3,5
09/1998 bis 07/2007:
Emil-von-Behring Gymnasium, Spardorf
Zeugnis der allgemeinen Hochschulreife, Note: 1,4
09/1994 bis 07/1998:
Adalbert-Stifter-Grundschule, Erlangen

Informationsblatt für Blutplättchen (Thrombozyten)

Informationsschreiben an Hundehalter

Blutplättchen

MM Amicus BLV-VSKT

Thrombozytopenie Als Thrombozytopenie bezeichnet man einen

Aktiviert Thrombozyten Die innovative Behandlung bei Sehnen

Registrierung und lückenlose Rückverfolgbarkeit zum Schutz

Sie haben Fragen?

Hallo Zäme Zuerst möchte ich darüber orientieren, dass wir unser

Newsletter Ausbildung SKG AUSGABE 5/2015