Intronunabhängige Expression des Glykoproteins G
des Vesicular-Stomatitis-Virus
zur Pseudotypisierung lentiviraler Vektoren
Dissertation
zur Erlangung des Grades eines Doktors der Naturwissenschaften
der Fakultät für Chemie der Ruhr-Universiät Bochum
angefertigt in der
Abteilung für Molekulare und Medizinische Virologie,
Institut für Hygiene und Mikrobiologie, Medizinische Fakultät,
Ruhr-Universität Bochum
vorgelegt von
Daniela Stefanou
aus Hüls
Bochum, 2006
Die in der vorliegenden Dissertation präsentierten Experimente wurden in der Zeit von April
2001 bis März 2004 unter der Anleitung von Prof. Dr. Klaus Überla in der Abteilung für Molekulare und Medizinische Virologie des Instituts für Hygiene und Mikrobiologie der
Medizinischen Fakultät der Ruhr-Universität Bochum angefertigt.
Abkürzungen
AB
AIDS
APS
b
BGH
bp
C. elegans
cm
cm2
dATP
DEPC
DIG
DMEM
DMSO
DNA
E. coli
EB
EDTA
EJC
FBS
g
GFP
GFU
°C
h
HBS
HCMV
HEPES
HIV
HRP
Hsp
IRE
IRES
IVS
kJ
kb
kD
l
LB
Akut-Box
erworbenes Immundefizienz-Syndrom (acquired immunodeficieny syndrome)
Ammoniumperoxodisulfat
Basen
Rinder-Wachstumshormon (bovine growth hormone)
Basenpaare
Caenorhabditis elegans
Zentimeter
Quadratzentimeter
2’-Desoxyadenosin-5’-triphosphat
Diethylpyrocarbonat
Digoxygenin
Dulbecco’s Modified-Eagle-Medium
Dimethylsulfoxid
Desoxyribonukleinsäure (deoxyribonucleic acid)
Escherichia coli
Elutionspuffer (elution buffer)
Ethylendiaminotetraessigsäure
exon-junction-complex
Fötales Rinderserum (fetal bovine serum)
Gramm
grün fluoreszierendes Protein
grüne-Fluoreszenz-bildende Einheit (green fluorescence forming unit)
Grad Celsius
Stunde
HEPES gepufferte Salzlösung (HEPES buffered saline)
humanes Cytomegalievirus
4-(2-Hydroxyethyl)-1Piperazin-Ethansulfonsäure
humanes Immundefizienzvirus
Meerrettichperoxidase (horseradish peroxidase)
Hitzeschockprotein
Iron-responsive-Element
interne Ribosomeneintrittsstelle
Intron (intervening sequence)
Kilojoule
Kilobasenpaare
Kilo-Dalton
Liter
lysogeny broth
Abkürzungen
LMO
LTR
M
MBS
MBS-T
MIE
min
µg
µl
ml
MLV
mM
mol
MOPS
mRNA
NF
ng
PAGE
PBS
PCR
pH
pmol
RNA
Rpl32
RRE
RT
s
s.
s. o.
s. u.
S.O.C
SCID-X1
LIM-domain only
long terminal repeat
molar
Maleinsäure gepufferte Salzlösung (maleic acid buffered saline)
Maleinsäure gepufferte Salzlösung mit Tween 20
major immediate early
Minute
Mikrogramm
Mikroliter
Milliliter
Maus-Leukämievirus
millimolar
Mol
Morpholinopropansulfonsäure
Messenger-Ribonukleinsäure
Nukleärer Faktor
Nanogramm
Polyacrylamid-Gelelektrophorese
Phosphat gepufferte Salzlösung (phosphate buffered saline)
Polymerase-Kettenreaktion (polymerase chain reaction)
potentia Hydrogenii
Pikomol
Ribonukleinsäure (Ribonucleic acid)
Ribosomales Protein L32
Rev-responsive-Element
Reverse Transkriptase
Sekunde
siehe
siehe oben
siehe unten
super optimal catabolite repression
X-chromosomal vererbte schwere kombinierte Immundefizienz
(X-linked severe combined Immunodeficiency)
SDS
Natriumdodecylsulfat (sodiumdodecylsulfate)
SEAP
Sekretierte Alkalische Phosphatase
SIN-Vektor sich selbst inaktivierender Vektor
SIV
Affen- (Simian) Immundefizienzvirus
SSC
Natriumchlorid-Natriumcitrat-Puffer (sodium chloride sodium citrate buffer)
ssRNA
einzelsträngige RNA (single stranded RNA)
SV40
Simian Virus 40
TAE
Tris-Acetat-EDTA-Puffer
iii
Abkürzungen
TBE
TEMED
Tris
tRNA
U
Upm
UsnRNP
usw.
UTR
V
v/v
VSV
VSV-G
w/v
WB
z.B.
iv
Tris-Acetat-Borat-Puffer
N,N,N’,N’-Tetramethylethylendiamin
Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan
Transfer-Ribonukleinsäure
Einheit (unit)
Umdrehungen pro Minute
Uridinreiches kleines nukleäres Ribonukleoprotein
(uridinrich small nuclear ribonucleoprotein)
und so weiter
nicht translatierte Region (untranslated region)
Volt
Volumen pro Volumen
Vesicular-Stomatitis-Virus
Glykoprotein G des Vesicular-Stomatitis-Virus
Masse (weight) pro Volumen
Westernblot
zum Beispiel
Aminosäuren wurden mit den üblichen Drei- und Einbuchstabenabkürzungen, Nukleinsäurebasen mit den gängigen Einbuchstabenabkürzungen bezeichnet.
Inhalt
1
EINLEITUNG...................................................................................................................1
1.1
GENTHERAPIE MITTELS PSEUDOTYPISIERTER LENTIVIRALER VEKTOREN ....................1
1.1.1
Viraler Gentransfer in der Gentherapie.................................................................1
1.1.2
Drei-Plasmid-Verpackungssystem .........................................................................2
1.1.3
Pseudotypisierung mit VSV-G ................................................................................3
1.2
2
OPTIMIERUNG DER PSEUDOTYPISIERUNGSEFFIZIENZ ...................................................5
1.2.1
HCMV-MIE-5’-UTR...............................................................................................5
1.2.2
Codonoptimierung..................................................................................................8
MATERIAL UND METHODEN..................................................................................10
2.1
PLASMIDE ..................................................................................................................10
2.1.1
VSV-G-Expressionsplasmide ................................................................................10
2.1.2
gag-pol-Expressionsplasmide...............................................................................14
2.1.3
Vektor-Konstrukte.................................................................................................15
2.1.4
Weitere Plasmide..................................................................................................15
2.2
OLIGONUKLEOTIDE UND WEITERE NUKLEINSÄUREN .................................................16
2.3
EUKARYONTEN UND PROKARYONTEN .......................................................................17
2.4
ENZYME, ANTIKÖRPER UND ANDERE PROTEINE ........................................................18
2.5
CHEMIKALIEN, KITS, SONSTIGE VERBRAUCHSMATERIALIEN ......................................19
2.6
KUNSTSTOFF-EINMALARTIKEL ..................................................................................20
2.7
PUFFER, MEDIEN UND LÖSUNGEN .............................................................................21
2.8
TECHNISCHE AUSSTATTUNG .....................................................................................24
2.9
ARBEITEN MIT ZELLKULTUREN UND LENTIVIREN .....................................................25
2.9.1
Kultivierung von 293T- und 293A-Zellen.............................................................25
2.9.2
Kryokonservierung von Zellen .............................................................................25
2.9.3
Auftauen kryokonservierter Zellen .......................................................................25
2.9.4
Transiente Transfektion von 293T-Zellen mittels Calcium-Phosphat..................26
2.9.5
Ernte lentiviraler Vektoren...................................................................................27
2.9.6
Infektion von 293A-Zellen mit lentiviralen Vektoren ...........................................27
2.9.7
Titerbestimmung ...................................................................................................27
2.10
ARBEITEN MIT ESCHERICHIA COLI ..............................................................................28
2.10.1
Transformation von E. coli...............................................................................28
Inhalt
vi
2.10.2
2.11
ARBEITEN MIT PROTEINEN ........................................................................................29
2.11.1
SEAP-Bestimmung............................................................................................29
2.11.2
Westernblot-Analyse.........................................................................................29
2.12
3
Kultivierung von E. coli....................................................................................28
ARBEITEN MIT NUKLEINSÄUREN ...............................................................................30
2.12.1
Fotometrische Bestimmung von Nukleinsäure-Konzentrationen .....................30
2.12.2
mRNA-Präparation...........................................................................................31
2.12.3
Northernblot-Analyse .......................................................................................31
2.12.4
Total-RNA Präparation mit anschließender DNase-Spaltung .........................32
2.12.5
RNA-Struktur-Vorhersage ................................................................................33
2.12.6
Plasmidpräparationen......................................................................................33
2.12.7
Polymerase-Kettenreaktion (PCR) ...................................................................33
2.12.8
Spaltung von DNA mittels Restriktionsendonukleasen.....................................36
2.12.9
Auffüllen von Einzelstrang-Enden ....................................................................37
2.12.10
Reinigung von DNA ..........................................................................................37
2.12.11
Agarose-Gelelektrophorese ..............................................................................37
2.12.12
DNA-Extraktion aus Agarose ...........................................................................38
2.12.13
Phosphorylierung und komplementäre Anlagerung von Oligonukleotiden .....38
2.12.14
Ligation.............................................................................................................38
2.12.15
TA-Klonierung ..................................................................................................39
2.12.16
DNA-Sequenzierung .........................................................................................39
ERGEBNISSE.................................................................................................................41
3.1
EXPRESSION VON VSV-G MITTELS PCDNA3.1(+)-BASIERTER PLASMIDE ................41
3.2
EXAKTE DELETION DES ERSTEN HCMV-MIE-INTRONS ............................................43
3.2.1
Einfluss des Spleiß-Prozesses und der Exon-Sequenzen auf die Expression .......43
3.2.2
Nachweis der Spleißprodukte ...............................................................................46
3.2.3
Deletion weiterer HCMV-Sequenzen aus der VSV-G-Expressionskassette .........48
3.3
EINFLUSS VON CODONOPTIMIERUNG AUF DIE EXPRESSION .......................................50
3.3.1
Erste Konstrukte mit codonoptimierter Sequenz für VSV-G ................................50
3.3.2
VSV-Gsyn-G-Fusions-RNA ....................................................................................52
3.3.3
Sequenz-Analyse der Wildtyp-VSV-G-DNA aus pCI-G........................................53
3.3.4
Korrektur der codonoptimierten VSV-G-Sequenz ................................................54
3.3.5
Kombination von HCMV-MIE-5’-UTR mit codonoptimierter VSV-G-Sequenz...58
Inhalt
4
vii
DISKUSSION .................................................................................................................60
4.1
INTRONUNABHÄNGIGE EXPRESSION VON VSV-G .....................................................60
4.2
DAS HCMV-MIE-INTRON UND SPLEIßEN ALS EXPRESSIONSVERSTÄRKER ...............60
4.3
EXONISCHE HCMV-SEQUENZEN IN DER 5’-UTR ALS EXPRESSIONSVERSTÄRKER ....62
4.4
EXPRESSION EINES CODONOPTIMIERTEN, MUTIERTEN VSV-G ..................................64
4.5
PSEUDOTYPISIERUNG MIT OPTIMIERTER FÜR VSV-G CODIERENDER SEQUENZ..........66
4.6
CODONOPTIMIERUNG IN VERBINDUNG MIT DER HCMV-5’-UTR..............................67
5
ZUSAMMENFASSUNG................................................................................................69
6
LITERATUR ..................................................................................................................70
DISSERTATIONSBEZOGENE PUBLIKATION..............................................................80
DANKSAGUNG .....................................................................................................................81
LEBENSLAUF .......................................................................................................................82
1 Einleitung
1.1 Gentherapie mittels pseudotypisierter lentiviraler Vektoren
1.1.1
Viraler Gentransfer in der Gentherapie
Durch Einbringen therapeutischer Gene in Körperzellen bietet die Gentherapie neue Möglichkeiten in der Behandlung vieler verschiedener ererbter und erworbener Krankheiten wie Mukoviszidose, Duchenne-Muskeldystrophie, Ornithin-Transcarbamoylase-Mangel, schwere
kombinierte Immundefizienzen, Hämophilie, AIDS, Tumorleiden, Bluthochdruck und neurodegenerative Erkrankungen [1-9]. Ein Kernpunkt der Gentherapie-Forschung ist die Entwicklung effizienter Methoden für den Transfer des therapeutischen Gens in die zu behandelnden
Zellen. Der Gentransfer kann nicht-viral (z.B. durch Gene-Gun, Elektroporation, kationische
Lipide, Nanopartikel) oder viral (z. B. durch auf Adenoviren, Adeno-assoziierte Viren, Herpesviren oder Retroviren basierenden Vektoren) vermittelt werden [10,11]. Die Evolution hat
die Mechanismen des viralen Gentransfers, der Teil des Vermehrungszyklus der Viren ist,
perfektioniert, so sind virale Vektoren den nicht-viralen in ihrer Effizienz überlegen [11].
Die viralen Vektoren lassen sich danach einteilen, entweder eine vorübergehende oder eine
langfristige Expression des therapeutischen Gens zu vermitteln; je nach Anwendung ist das
eine oder das andere vorzuziehen [11]. Eine langfristige Expression des Transgens ermöglichen z. B. die retroviralen Vektoren, die dieses in das Genom der Zielzelle integrieren. Die
beiden identischen Kopien des einzelsträngigen RNA-Genoms, das das therapeutische Gen
enthält, werden dazu nach Eintritt in das Cytoplasma von der viralen Reversen Transkriptase
in doppelsträngige DNA umgeschrieben; diese wird in den Zellkern transportiert und von der
viralen Integrase in das Wirtszellgenom eingefügt [12]. Neben dem Vorteil der dauerhaften
Transgen-Expression und der Übertragung des Transgens auf die Tochterzellen birgt die Integration allerdings auch die Gefahr einer Insertionsmutagenese: Drei von zehn Patienten
entwickelten fast drei Jahre nach erfolgreicher Gentherapie ihrer X-chromosomal vererbten
schweren kombinierten Immundefizienz (SCID-X1) eine unkontrollierte exponentielle klonale T-Zell-Proliferation durch die Integration des retroviralen Vektors in die Nähe des Promo-
1 Einleitung
2
tors des Proto-Onkogens LMO2 [13]. Das reale Risiko der Insertions-Mutagenese bedeutet
jedoch nicht die grundsätzliche Abkehr von retroviralen Vektoren in der Gentherapie [14].
Zu den retroviralen Vektoren gehören u. a. die onkoretroviralen und die lentiviralen Vektoren.
Vertreter der Lentiviren sind z.B. das humane Immundefizienzvirus und das Immundefizienzvirus der Affen (HIV bzw. SIV), die das erworbene Immundefizienz-Syndrom (AIDS) bei
Menschen bzw. bei Affen verursachen können [15-17]. Im Gegensatz zu den onkoretroviralen
transduzieren lentivirale Vektoren nicht nur sich teilende sondern auch sich nicht teilende
Zellen [18,19]. Lentivirale Vektoren sind somit auch für die Behandlung terminal differenzierter Zellen wie Neuronen oder Muskelzellen geeignet [20,21]. Für die Gentherapie postmitotischer Zellen bieten sich auch integrationsdefiziente lentivirale Vektoren an, da mit diesen
ein deutlich reduziertes Integrations-Risiko verbunden ist; sie sind vielen nichtintegrierenden
viralen Vektoren in ihrer höheren Klonierungskapazität und niedrigeren Immunogenität überlegen [22].
1.1.2
Drei-Plasmid-Verpackungssystem
Die in der vorliegenden Arbeit eingesetzten integrierenden lentiviralen Vektoren sind nicht
replikationsfähig und durchlaufen den lentiviralen Replikationszyklus nur bis zur Integration
[23,24]. Zur Herstellung der Vektoren werden mindestens drei verschiedene Plasmide transient in 293T-Zellen transfiziert, die daraufhin die Vektoren produzieren. Ein Plasmid codiert
für das Vektorgenom, ein weiteres für die zur Verpackung des Virus nötigen Proteine und ein
drittes für das Hüll-Glykoprotein.
Sowohl das verwendete SIV- als auch das HIV-1-Vektorkonstrukt enthalten als Reportergen
das Gen für das grün fluoreszierende Protein (GFP) unter der Transkriptions-Kontrolle eines
HCMV-MIE-Promotor/Enhancers sowie die für die Transkription, Verpackung, reverse
Transkription und Integration notwendigen cis-aktiven lentiviralen Sequenzen [23,24]. Das
SIV-Vektorkonstrukt enthält darüber hinaus die intakten codierenden Sequenzen für die Regulatorproteine Tat und Rev. Die Transkription des SIV-Vektors erfolgt durch die Promotoraktivität der U3-Region des 5’-LTRs (long terminal repeat) und wird durch das virale Protein
Tat verstärkt [24]. Die LTRs der Lentiviren bilden die Flanken des Vektorgenoms und bestehen beide aus der U3-, R- und U5-Region [25]. Die Transkription des verwendeten HIV-1Vektors erfolgt Tat-unabhängig durch einen HCMV-MIE-Promotor, den das Konstrukt an
Stelle der U3-Region im 5’-LTR trägt [23]. Beide Vektorkonstrukte weisen Deletionen im
1 Einleitung
3
Bereich der U3-Region des 3’-LTRs auf, die bei der reversen Transkription als Matrize für die
U3-Region des 5’-LTRs dient. Die ins Genom der Zielzelle integrierte provirale DNA weist
folglich Deletionen im lentiviralen Promotor auf und kann durch diesen nicht transkribiert
werden. Beide Vektoren werden daher als sich selbst inaktivierende Vektoren bezeichnet
[23,24].
Die Transduktion der Zielzellen durch lentivirale Vektoren ist nicht von der Neusynthese viraler Proteine abhängig, alle nötigen Proteine sind bereits im Viruspartikel verpackt. Daher
können die viralen Proteine bei der Produktion der Vektoren in trans von gesonderten Plasmiden exprimiert werden. Die in der vorliegenden Arbeit verwendeten SIV- und HIV-1-gagpol-Expressionsplasmide codieren für die Matrixproteine, die im Viruspartikel der Hüllmembran von innen anliegen, die Capsidproteine, die die beiden Genom-Kopien mit der
Capsidstruktur umgeben, und die Nukleocapsidproteine, die mit der genomischen RNA komplexiert sind, sowie für die Enzyme Protease, die das Gag- und Gag-Pol-Vorläuferprotein
spaltet, Reverse Transkriptase und Integrase [24,26,27]. Ferner enthält das SIV-gag-polExpressionsplasmid intakte Leserahmen für die Regulatorproteine Tat und Rev sowie die akzessorischen Gene vif, vpx und vpr; als Promotor dient die U3-Region im 5’-LTR [24]. Im
Gegensatz dazu enthält die Expressionskassette des verwendeten HIV-1-gag-polExpressionsplasmids einen HCMV-MIE-Promotor/Enhancer und eine codonoptimierte gagpol-Sequenz, aber keine weiteren HIV-1-Sequenzen [26].
Werden zur Vektorproduktion ein Vektorkonstrukt und ein Verpackungsplasmid cotransfiziert, die beide keine tat- und rev-Gene enthalten, so sind nötigenfalls zusätzlich tat- und revExpressionsplasmide zu transfizieren. Tat verstärkt die LTR-getriebene Expression, Rev vermittelt durch Wechselwirkung mit dem RNA-Element Rev-responsive-Element (RRE) den
Export ungespleißter und einfach gespleißter lentiviraler RNA aus dem Zellkern ins Cytoplasma [28,29].
1.1.3
Pseudotypisierung mit VSV-G
Bei der Produktion lentiviraler Vektoren wird das Glykoprotein ebenfalls in trans von einem
gesonderten Plasmid exprimiert. Natürliche SI- und HI-Viren weisen als Produkte des envGens das Transmembranprotein gp41 und das externe Glykoprotein gp120 als Komplex in
ihrer Hüllmembran auf und können nur Zellen infizieren, die den CD4-Rezeptor tragen [30].
Diesem beschränkten Tropismus liegt die spezifische Wechselwirkung des Glykoprotein-
1 Einleitung
4
Komplexes mit dem CD4-Rezeptor in der Cytoplasmamembran der Wirtszelle zu Grunde.
Das gp120 interagiert zusätzlich mit einem Chemokin-Corezeptor. Nach mehrfach aufeinander folgenden Konformationsänderungen der Glykoproteine und des Rezeptors vermittelt das
gp41 die Fusion der viralen mit der Wirtszellmembran, der virale Kern gelangt ins Cytoplasma [12].
Zur Veränderung des Tropismus eines umhüllten viralen Vektors bedient man sich der Pseudotypisierung. Es werden dabei Vektoren produziert, die statt des natürlichen Glykoproteins
das eines anderen umhüllten Virus tragen und so dessen Wirtszellspezifität übernehmen.
Schon lange vor der Entwicklung viraler Vektoren waren Pseudotypen bekannt, sie entstehen
beispielsweise in Zellen, die von zwei oder mehr nicht verwandten Viren infiziert sind [31].
Von großer Bedeutung für die Erforschung viraler Vektoren und für die Gentherapie sind
Pseudotypen mit dem Glykoprotein G aus der Hülle des Vesicular-Stomatitis-Virus, da sich
mit ihnen eine sehr große Vielfalt von Zelltypen infizieren lassen.
Das umhüllte Rhabdovirus VSV mit einem einzelsträngigen kontinuierlichen RNA-Genom in
Negativstrang-Orientierung wird in die VSV-Serotypen Indiana und New Jersey unterteilt und
ist der Erreger der vesikulären Stomatitis bei Pferden, Rindern und Schweinen mit Symptomen, die denen der Maul- und Klauenseuche ähneln [32-35]. Die 67-kD-Monomere des trimeren Glykoproteins G (VSV-G) sind in der Hülle des Virus über 20 Aminosäuren lange
Transmembran-Domänen verankert, die daran angrenzenden 29 C-terminalen Aminosäuren
bilden die basische cytoplasmatische Domäne [36,37]. Die aus 446 Aminosäuren bestehende
Ectodomäne ist an zwei Stellen glycosyliert; die beiden Kohlenhydratketten sind identisch,
dreifach verzweigt und enden in jeder der drei Verzweigungen in einem Sialinsäurerest [38].
Die terminalen Sialinsäurereste sind essentiell für die Adsorption des VSV an die Wirtszelle
[39,40]. Das unreife Protein enthält N-terminal ein 16 Aminosäuren umfassendes Signalpeptid, das bei Eintritt des entstehenden Proteins ins endoplasmatische Retikulum abgespalten
wird [41]. Das Protein wird über den Golgi-Apparat zur Cytoplasmamembran transportiert,
für dieses Ziel enthält es das YTDIE-Exportmotiv in seiner cytoplasmatischen Domäne [42].
VSV-G stellt bei der Infektion den ersten Kontakt mit der Zielzelle her, indem es mit einem
bisher unbekannten ubiquitären zellulären Rezeptor interagiert; bei diesem Rezeptor handelt
es sich nicht – wie früher einmal angenommen – um das Membranlipid Phosphatidylserin,
letzteres spielt erst bei der Einleitung der Membranenfusion eine Rolle [43,44]. Im Gegensatz
zu natürlichen Lentiviren, deren Hülle direkt mit der Cytoplasmamembran fusioniert, gelangen VSV und Pseudotypen mit dem Glykoprotein VSV-G durch clathrinabhängige rezeptor-
1 Einleitung
5
vermittelte Endocytose in die Wirtszelle [45]. Nach Ansäuerung des Endosoms führen die
elektrostatischen Wechselwirkungen zwischen dem VSV-G in der viralen und dem Phosphatidylserin in der endosomalen Membran zu einer drastischen Konformationsänderung des
VSV-G sowie zur Fusion der beiden Membranen, in Folge dessen das Nukleocapsid in das
Cytoplasma entlassen wird [44,46,47].
Neben dem breiten Tropismus von VSV-G-Pseudotypen haben diese auch den Vorteil, die
Virushülle so zu stabilisieren, dass die Vektoren durch Zentrifugation konzentrierbar sind und
so hochtitrige Vektorpräparate erhalten werden können [48]. Diese beiden Vorzüge sind bedeutend für ex vivo und lokale in vivo Gentherapie-Anwendungen. Bei systemischer Verabreichung pseudotypisierter Vektoren sind Glykoproteine besser geeignet, die für den zu behandelnden Zelltyp bzw. das zu behandelnde Organ spezifisch sind, um an diesen Orten wirksame Konzentrationen zu erreichen und um Nebenwirkungen, die durch Transduktion nicht
zu behandelnder Zellen entstehen, zu vermindern.
1.2 Optimierung der Pseudotypisierungseffizienz
1.2.1
HCMV-MIE-5’-UTR
Für die Produktion lentiviraler Vektoren in größerem Maßstab sind stabile VerpackungsZelllinien geeigneter als transient transfizierte Zellen. Bei der Herstellung solcher Verpackungs-Zelllinien für lentivirale Pseudotypen mit dem Glykoprotein VSV-G klonierte Dr.
Seraphin Kuate die für VSV-G codierende Sequenz in eine einfache induzierbare Expressionskassette, da konstitutiv exprimiertes VSV-G toxisch für die Zellen ist [48]. Die VSV-GExpression gelang aber erst, nachdem er auch die 5’ nicht translatierte Region (5’-UTR) inklusive des ersten Introns der major immediate early (MIE) Gene des humanen Cytomegalievirus (HCMV) aus dem zu Grunde gelegten VSV-G-Expressionsplasmid zwischen Promotor
und codierender Sequenz kloniert hatte [49,50].
Das β-Herpesvirus HCMV (systematischer Name: humanes Herpesvirus 5) trägt ein doppelsträngiges DNA-Genom und ist eine Ursache für mild verlaufende infektiöse Mononukleosen bei älteren Kindern und Erwachsenen, für Leberentzündungen bei jüngeren Kindern, für
schwere Lungenentzündungen bei Kleinkindern und für Geburtsfehler bei Neugeborenen; bei
1 Einleitung
6
Immunbeeinträchtigten, wie Transplantations- oder AIDS-Patienten, ist der Verlauf einer
HCMV-Infektion schwerer und endet häufiger mit dem Tod [32,51]. Für die Gentherapie und
andere biotechnologische Anwendungen ist HCMV in sofern von großer Bedeutung, als dass
ihm eines der stärksten bekannten Promotor/Enhancer-Elemente entstammt, das Verwendung
in vielen eukaryotischen Expressions-Vektoren findet und auch Bestandteil der meisten in der
vorliegenden Arbeit verwendeten Expressionsplasmide ist [52-59]. Es handelt sich um die
Promotor/Enhancer-Region der Major-immediate-early-(MIE)-Gene. Die HCMV-Gene werden zeitlich reguliert exprimiert – beginnend mit den Immediate-early-Genen, zu denen die
MIE-Gene gehören. Die codierenden Sequenzen beginnen im zweiten Exon. Exon 1 und die
ersten Nukleotide des Exons 2 bilden die 5’-UTR der durch alternatives Spleißen entstehenden mRNAs [60]. Auch diese 5’-UTR und das Intron aus dieser Region haben eine Bedeutung für die heterologe Genexpression: Diese Elemente können die Expression verstärken [61,62].
Der positive Effekt von Introns und des Spleißens auf die Genexpression ist auch für viele
andere Introns und Organismen beschrieben, z.B. ist (1) für die Produktion der RNA für
β-Globin durch das rekombinante SV40-Kaninchen-β-Globin-Virus eines der β-GlobinIntrons IVS1 oder IVS2 nötig [63], wird (2) die Expression des unc-54-Gens für eine Isoform
der schweren Kette des Myosins des Fadenwurms C. elegans durch eines der vier Introns nahe dem 5’-Ende stimuliert [64], wird (3) das Gen Rpl32 für das Ribosomen-Protein L32 der
Maus ohne ein spleißbares Intron gar nicht, bei Vorhandensein eines der Introns 2 oder 3 oder
sogar eines fremden Introns aus dem Gen für die Immunglobulin schwere Kette µ der Maus
zu 10 bis 20 % und bei Vorhandensein des Introns 1 zu 100 % exprimiert [65], wird (4) das
Reportergen für die Chloramphenicol-Acetyltransferase unter der Kontrolle des Promotors
des Mais-alkohol-dehydrogenase1-Gens in Mais 100-mal stärker exprimiert, wenn sich zwischen Promotor und codierender Sequenz das Intron 1 des Mais-alkohol-dehydrogenase1Gens befindet [66].
Als Prä-mRNA-Spleißen wird der Prozess bezeichnet, bei dem das Intron entfernt und die
flankierenden Exons ligiert werden. Das geschieht über zwei Umesterungsreaktionen. Zuerst
greift die 2’-Hydroxylgruppe eines Adenosinrestes der Verzweigungsstelle im Intron die
Phosphodiesterbindung der 5’-Spleißstelle an und es entsteht eine Lasso-Struktur; die freigewordene 3’-Hydroxylgruppe des 5’-Exons greift daraufhin die Phosphodiesterbindung der 3’Spleißstelle an, die Exons werden so verbunden und das Intron als Lasso-Struktur freigesetzt
[67]. Das Erkennen der Spleiß- und Verzweigungsstellen sowie die Katalyse der Umeste-
1 Einleitung
7
rungsreaktionen werden durch das Spleißosom vermittelt. Das Spleißosom ist ein Komplex,
der aus fünf uridinreichen kleinen nukleären Ribonukleoproteinen (UsnRNP) und zahlreichen
Nicht-snRNP-Spleißfaktoren besteht; es formiert sich schrittweise in bestimmter Reihenfolge
an der zu prozessierenden Prä-mRNA aus seinen Komponenten [68]. Im Laufe dieses Prozesses werden nach und nach bestimmte Proteine 20 bis 24 Nukleotide stromaufwärts der ExonExon-Verbindungsstelle angeheftet, die auch nach Beenden des Spleißens dort verbleiben,
diese werden exon-junction-complex (EJC) genannt. Der EJC ist das Bindeglied zwischen
dem Spleiß-Vorgang und nachfolgenden Schritten des mRNA-Metabolismus, er besteht aus
wenigen festen Komponenten im Inneren und einigen peripheren – zum Teil transienten –
Faktoren [69].
Es werden verschiedene Wirkungsebenen und Ursachen für die Verstärkung der Genexpression durch Introns diskutiert, für viele Introns ist jedoch noch nicht bekannt, welche die vorherrschende Wirkung ist [70]. So kann ein Intron beispielsweise unerlässlich sein, um den
Transport der mRNA aus dem Zellkern ins Cytoplasma zu gewährleisten, da Komponenten
des EJC durch ihre Interaktion mit Exportfaktoren die Effizienz des Exports erhöhen [71,72].
Darüber hinaus haben Komponenten des EJC und des Spleißosoms direkten Kontakt zur Polyadenylierungs-Maschinerie, dies führt zu einer effizienteren Polyadenylierung und somit zu
höheren mRNA-Niveaus im Zellkern und im Cytoplasma [73-75]. Spleißen verstärkt zudem
die Translation, dies geht einher mit einer vermehrten Assoziation von gespleißter mRNA mit
Polysomen und ist wiederum durch Komponenten des EJC vermittelt [76]. Introns können
aber auch bereits auf die Transkription einwirken: als DNA, wenn sie enhancer enthalten
[77,78], oder nach der Transkription, da Komponenten der Spleißmaschinerie mit Transkriptions-Initiations- bzw. –Elongations-Faktoren interagieren und auf diese Weise sowohl die
Initiation als auch die Elongation der Transkription stimulieren [79,80]. Das erste HCMVMIE-Intron enthält eine Bindestelle für den Transkriptionsfaktor NF1, die aber nicht so bedeutend für den expressionsfördernden Effekt des Introns ist wie eine ebenso enthaltene Region, die dem enhancer im ersten Intron des Gens für Troponin I der Wachtel homolog ist;
diese Region wirkt in vivo muskelspezifisch, in vitro aber auch in Nicht-Muskelzellen [61,81].
Nicht nur für das erste Intron der HCMV-MIE-Gene wurde ein expressionsfördernder Effekt
nachgewiesen, sondern auch für die 5’ nicht translatierten HCMV-MIE-Exon-Sequenzen. Aus
den Untersuchungen von Ghazal und Nelson geht hervor, dass einerseits die konservierte Box
5’-TGACCTCCATAGAAGACA-3’ eine Expressionsverstärkung bewirkt – dabei spielt die
Bindung zweier im Zellkern lokalisierter Proteine an diese Box eine Rolle – andererseits je-
1 Einleitung
8
doch auch weitere Sequenzabschnitte der 5’-UTR einen Beitrag zur Expressionsverstärkung
leisten [62]. Die Bedeutung dieser weiteren Sequenzabschnitte als regulatorische Elemente
wurde bisher nicht näher charakterisiert.
Ziele der vorliegenden Arbeit waren es also, (1) zu klären, ob im Falle der VSV-G-Expression
für die Pseudotypisierung lentiviraler Vektoren das Intron oder die nicht translatierten ExonSequenzen den entscheidenden positiven Effekt liefern, (2) bisher nicht beschriebene regulatorische Elemente zu finden und (3) die HCMV-Sequenzen in der 5’-UTR auf das unerlässlichste einzugrenzen.
1.2.2
Codonoptimierung
Die Verstärkung der VSV-G-Expression durch die HCMV-MIE-5’-UTR zeigt, dass die
VSV-G-Expression prinzipiell gesteigert werden kann. Das bedeutet aber nicht zwangsläufig,
dass diese Maßnahme die einzig mögliche ist, noch dass sie die beste VSV-G-Expression und
die höchsten Titer der mit VSV-G pseudotypisierten Vektoren hervorbringt. Außerdem könnte der Verzicht auf die zusätzlichen HCMV-Sequenzen entscheidend sein, wenn in einer Expressionskassette nur ein beschränkter Platz zur Verfügung steht.
Eine Technik zur Steigerung der Expression heterologer Gene und insbesondere der Expression viraler Gene in Säugerzellen ist die Codonoptimierung: Dazu wird die codierende Sequenz
neu synthetisiert und nur jene Codone benutzt, die in stark exprimierten Genen des Wirtes am
häufigsten auftreten [82]. Dieser Technik liegt zu Grunde, dass viele Aminosäuren durch zwei
bis sechs synonyme Tripletts codiert werden und es abhängig von der Spezies und vom Expressions-Niveau eines Proteins unterschiedliche Vorlieben für die Synonyme gibt [83-85].
Die Ursache für den Einfluss der Codonoptimierung auf die Expression wird kontrovers diskutiert. Der ausschlaggebende Einfluss der Codonoptimierung wird zum einen auf Translations-Ebene angenommen, da bei nicht codonoptimierten Genen auch seltenere tRNAs benötigt
werden und infolgedessen „Versorgungs-Engpässe“ vorstellbar sind und die Häufigkeit der
Codon-Synonyme in stark exprimierten Genen mit der Häufigkeit der entsprechenden Isoakzeptor-tRNAs korreliert [86,87]. Robinson et al. konnten jedoch in E. coli zeigen, dass die
Verfügbarkeit beladener tRNAs, die seltene Codone erkennen, erst unter extremen Bedingungen, d. h. bei hohen Transkriptionsraten und mehrfacher Verwendung des suboptimalen Codons in dem Gen, zum geschwindigkeitslimitierenden Faktor der Protein-Biosynthese
wird [88].
1 Einleitung
9
Ein Effekt der Codonoptimierung auf Vorgänge, die der Translation vorausgehen, ist für codonoptimierte gag-pol-Gene des HIV-1 und des SIV beschrieben. Diese codonoptimierten
Gene ermöglichen die von der HIV-1-5’-UTR, dem Rev-responsive-Element (RRE) und dem
Rev-Protein unabhängige Expression des Gag-Proteins aufgrund einer Erhöhung der nukleären mRNA-Stabilität und des konstitutiven Exports aus dem Zellkern [26]. Zudem führt die
cytoplasmatische Transkription von Wildtyp-HIV-1-gag ebenso zur Expression des Proteins
wie die von codonoptimiertem gag, während die Gag-Expression bei nukleärer Transkription
nur unter Verwendung des codonoptimierten gag-Gens gelingt; somit können es in dem Fall
nur prätranslationale Mechanismen wie mRNA-Stabilisierung und -Prozessierung sowie
nukleocytoplasmatischer Export sein, die entscheidend zur Expression codonoptimierter Gene
beitragen [89]. Eine mRNA-Stabilisierung wird schon dadurch erreicht, dass die Codonoptimierung gleichzeitig zu einer Steigerung des GC-Gehalts der Sequenz führt, was eine Steigerung der Halbwertszeit der mRNA zur Folge hat [90].
Weitere Ziele der vorliegenden Arbeit waren es folglich, (4) die HCMV-MIE-5’-UTRunabhängige VSV-G-Expression durch eine codonoptimierte für VSV-G codierende Sequenz
zu untersuchen, (5) Hinweise auf die Wirkungsebene der Codonoptimierung als Expressionsverstärkung zu finden und (6) zu überprüfen, ob durch Codonoptimierung alleine oder in
Kombination mit der HCMV-MIE-5’-UTR noch eine Steigerung der Titer der mit VSV-G
pseudotypisierten lentiviralen Vektoren möglich ist.
2 Material und Methoden
2.1 Plasmide
2.1.1
VSV-G-Expressionsplasmide
a) pHIT-G
pHIT-G enthält die für VSV-G codierende Sequenz [91], leitet sich von dem MLV-envExpressionsplasmid pHIT 123 ab und trägt somit das SV40 ori, die HCMV-major-immediateearly-(MIE)- Promotor/Enhancer-Region sowie die 5’-UTR mitsamt des ersten Introns der
HCMV-MIE-Gene [92].
b) pCD-G
pCD-G wurde von Prof. Dr. Ralf Wagner erhalten, der die für VSV-G codierende Sequenz
aus pHIT-G in das kommerziell erhältliche pcDNA3.1(+) (Invitrogen, Karlsruhe) eingesetzt
hat.
c) pCD-Gsyn
pCD-Gsyn wurde von Prof. Dr. Ralf Wagner erhalten, der die codonoptimierte DNA für VSVG entsprechend der im Genbankeintrag J02428 veröffentlichten Aminosäure-Sequenz des
VSV-G synthetisiert und in pcDNA3.1(+) eingesetzt hat.
d) pCI-G
Manuela Günther fügte das erste HCMV-MIE-Intron in pCD-G ein, indem sie das 1,2-kbFragment des durch die Restriktionsendonukleasen SnaBI und HindIII gespaltenen pHIT-G in
durch dieselben Restriktionsendonukleasen gespaltenes pCD-G klonierte.
Die für VSV-G codierende Sequenz wurde im Rahmen der vorliegenden Arbeit in Zusammenarbeit mit Dr. Dennis Hoffmann sequenziert (s. 2.12.16).
2 Material und Methoden
11
e) pCI-Gsyn
Manuela Günther fügte das erste HCMV-MIE-Intron in pCD-Gsyn ein, indem sie das 1,2-kbFragment des durch die Restriktionsendonukleasen SnaBI und HindIII gespaltenen pHIT-G in
durch dieselben Enzyme gespaltenes pCD-Gsyn klonierte.
f) pCI-GΔI
Zur Deletion des HCMV-MIE-Introns aus pCI-G wurde mit den Restriktionsendonukleasen
SacII und HindIII zunächst ein 893 bp großer, das Intron umfassender Sequenz-Abschnitt aus
pCI-G (s. Abb. 2-1) entfernt und anschließend durch Ligation einer Verbindungs-Sequenz, die
durch Phosphorylierung und komplementäre Aneinanderlagerung der Oligonukleotide ΔIs
und ΔIa gewonnen wurde, die herausgeschnittene Nicht-Intron-Sequenz wieder ergänzt. Nach
der Klonierung wurde pCI-GΔI zur Kontrolle von der SacII- bis zur HindIII-Schnittstelle sequenziert (s. 2.12.16).
Abb. 2-1. Plasmidkarten. – Schematische Darstellung der Plasmide pCI-G, pCI-Gsyn und pCD-G und
Lage der Erkennungssequenzen der eingesetzten Restriktionsendonukleasen. HCMV-P: Promotor/Enhancer-Region der Major-immediate-early-Gene des humanen Cytomegalievirus; HCMVIntron: erstes Intron der HCMV-major-immediate-early-Gene; VSV-G: codierende Sequenz für das
VSV-G-Protein; VSV-Gsyn: nach Genbankeintrag J02428 codonoptimierte codierende Sequenz für das
VSV-G-Protein; Ori: Replikationsursprung des SV40-Virus; Neomycin: Neomycin-Resistenzgen;
Amp: Ampicillin-Resistenz-Gen.
g) pCI-GΔIΔSL
Aus pCI-G (s. Abb. 2-1) wurden das HCMV-MIE-Intron und die vermutlich stemloop bildende HCMV-MIE-Exon-Sequenz entfernt. Dazu wurde pCI-G mit den Restriktionsendonukleasen HindIII und SacII gespalten und zuviel herausgeschnittene Sequenzen durch Einfügen
2 Material und Methoden
12
einer Verbindungs-Sequenz, die durch Phosphorylierung und komplementäre Aneinanderlagerung der Oligonukleotide ΔSLs und ΔSLa gewonnen wurde, wieder ergänzt. Nach der Klonierung wurde pCI-GΔIΔSL zur Identifizierung von der SacII- bis zur HindIII-Schnittstelle
sequenziert (s. 2.12.16).
h) pCSL-G
Aus pCI-G (s. Abb. 2-1) wurden das HCMV-MIE-Intron und die HCMV-MIE-Exon-Sequenz
5’ der stemloop bildenden Exon-Sequenz entfernt. Dazu wurde pCI-G mit den Restriktionsendonukleasen BamHI und SacI gespalten und zuviel herausgeschnittene Sequenzen durch
Einfügen einer Verbindungs-Sequenz, die durch Phosphorylierung und komplementäre Aneinanderlagerung der Oligonukleotide ΔSLs und ΔSLa gewonnen wurde, wieder ergänzt. Nach
der Klonierung wurde pCSL-G zur Identifizierung von der ersten SacI- bis zur BamHISchnittstelle sequenziert (s. 2.12.16).
i)
pCI-Gsyn-G
Durch PCR wurde das Start-Codon in der Wildtyp-DNA-Sequenz für VSV-G von ATG zu
ATA mutiert, 5’ der codierenden Sequenz eine EcoRI-Schnittstelle und unmittelbar 3’ des
Stop-Codons eine XhoI-Schnittstelle eingefügt. Das Amplifikat wurde mit den Restriktionsendonukleasen EcoRI und XhoI gespalten und in mit den gleichen Restriktionsendonukleasen gespaltenes pCI-Gsyn (s. Abb. 2-1) kloniert.
j)
pCI-GsynΔBam
pCI-GsynΔBam wurde zur Konstruktion von pCI-GsynMut benötigt. pCI-Gsyn (s. Abb. 2-1)
wurde mit der Restriktionsendonuklease BamHI gespalten, die entstandenen EinzelstrangEnden zu vollständigen Doppelsträngen aufgefüllt und intramolekular miteinander ligiert.
Nach Denaturierung der Ligase wurde vor der Klonierung eventuell noch vorhandenes unverändertes pCI-Gsyn mit der Restriktionsendonuklease BamHI gespalten.
k) pCI-GsynMut
Die vsv-gsyn-Sequenz wurde an den Positionen 169 (A Æ C), 171 (C Æ G) und 288 (G Æ C)
mittels PCR mutiert (s. 2.12.7). Dabei wurde die Sequenz zwischen der HindIII- und PmlISchnittstelle unter Verwendung von Mutagenese-Primern in drei überlappenden Abschnitten
2 Material und Methoden
13
amplifiziert und die Abschnitte durch Overlap-Extension-PCR wieder zur Sequenz vollständiger Länge zusammengefügt (s. 2.12.7). Nach Sequenzierung des Overlap-Extension-PCRProdukts wurde dieses mit den Restriktionsendonukleasen HindIII und PmlI gespalten und in
ebenso gespaltenes pCI-GsynΔBam kloniert. Plasmide mit BamHI-Schnittstelle wurden von
der HindIII- bis zur PmlI-Schnittstelle sequenziert (s. 2.12.16).
Wäre das mutierte Fragment in pCI-Gsyn statt in pCI-GsynΔBam kloniert worden, hätte nicht
durch Spaltung mittels Restriktionsendonukleasen zwischen dem mutierten Plasmid und einem als Verunreinigung mitgeführten, ungespaltenen bzw. einfach gespaltenen und religierten
pCI-Gsyn unterschieden werden können, da die Mutagenese keine Schnittstellen für verfügbare
Restriktionsendonukleasen betraf.
l)
pCI-Gopt
Da unter den untersuchten pCI-GsynMut-Klonen, die alle mindestens eine zusätzliche, unerwünschte Mutation aufwiesen, ein Klon war, bei dem die unerwünschte Mutation nahe genug
an einer Restriktionsschnittstelle (PmlI-Schnittstelle) lag, wurde nicht weiter nach einem Klon
ohne zusätzliche Mutation gesucht, da dies wenig effizient schien, sondern die unerwünschte
Mutation durch eine einfache Mutagenese-PCR revertiert.
Dazu wurde die Sequenz von der HindIII- bis zur PmlI-Schnittstelle unter Verwendung eines
Mutagenese-Primers amplifiziert (s. 2.12.7), mit den Restriktionsendonukleasen PmlI und
HindIII gespalten und in ebenso gespaltenes pCI-GsynΔBam kloniert. Plasmide mit BamHISchnittstelle wurden von der HindIII- bis zur PmlI-Schnittstelle sequenziert (s. 2.12.16).
Das so erhaltene pCI-Gopt trägt eine Sequenz, die für das gleiche VSV-G codiert wie pCI-G,
im Unterschied dazu allerdings codonoptimiert ist (s. auch Tab. 2-1).
2 Material und Methoden
14
Tab. 2-1. Codon-Verwendung. – Anzahl der für die angegebene Aminosäure (AS) verwendeten Codone in der Wildtyp- (wt) und der codonoptimierten (opt) VSV-G-Sequenz.
AS
Codon
wt opt
AS
Codon
wt opt
AS
Codon
Gly
GGA
GGC
GGG
GGT
19
4
6
9
0
38
0
0
Pro
CCA
CCC
CCG
CCT
12
3
2
10
0
25
0
2
Tyr
TAC
TAT
9
11
20
0
Cys
TGC
TGT
11
4
15
0
GCA
GCC
GCG
GCT
5
6
1
13
0
25
0
0
Phe
TTC
TTT
16
10
26
0
Lys
AAA
AAG
15
16
1
30
Trp
TGG
15
15
Arg
Val
GTA
GTC
GTG
GTT
3
9
9
8
0
0
29
0
Ser
1
14
0
0
0
0
9
4
6
7
5
9
0
0
0
0
40
0
47
0
0
0
0
0
8
3
3
1
0
0
TTA
TTG
CTA
CTC
CTG
CTT
7
10
11
8
1
10
AGA
AGG
CGA
CGC
CGG
CGT
Leu
AGC
AGT
TCA
TCC
TCG
TCT
His
Thr
ACA
ACC
ACG
ACT
7
12
2
10
0
31
0
0
CAC
CAT
5
12
17
0
Asp
GAC
GAT
11
17
28
0
Ile
ATA
ATC
ATT
7
15
14
0
36
0
Asn
AAC
AAT
8
10
18
0
Glu
GAA
GAG
16
9
0
25
Gln
Met
ATG
11
11
CAA
CAG
11
6
2
15
Ala
wt opt
m) pCD-Gopt
Die für VSV-G codierende codonoptimierte Sequenz wurde mit den Restriktionsendonukleasen EcoRI und HindIII aus pCI-Gopt gespalten und an die Stelle der Wildtyp-Sequenz in
pCD-G (s. Abb. 2-1) kloniert
2.1.2
gag-pol-Expressionsplasmide
a) SgpΔ2
SgpΔ2 ist ein SIV-gag-pol-Expressionsplasmid und leitet sich von dem Plasmid pBRmac239
ab, das die gesamte provirale DNA des SIVmac239 enthält. In SgpΔ2 sind eine für die Verpackung wichtige Region und ein Teil der für Env codierenden Sequenz deletiert und das nefGen ist durch eine Punktmutation inaktiviert, außerdem ist der SIV 3’ LTR durch das Polyadenylierungssignal des RinderWachstumshormons ersetzt [24].
2 Material und Methoden
15
b) Hgpsyn
Dieses HIV-1-gag-pol-Expressionsplasmid wurde von Prof. Dr. Ralf Wagner erhalten. Es
basiert auf pcDNA3.1(+) und enthält unter der Kontrolle eines CMV-Promotors das bloße
synthetische, codonoptimierte HIV-1-gag-pol-Gen – ohne 5’ UTR und ohne Rev-responsiveElement [26].
2.1.3
Vektor-Konstrukte
a) ViCGΔBH
Katrin Bräutigam ersetzte in dem SIV-Vektor-Konstrukt ViGΔBH [24], das sich von dem die
gesamte provirale SIVmac239-DNA enthaltenden Plasmid pBRmac239 ableitet, das an Position des nef-Genes befindliche GFP-Gen mit stromaufwärts liegender U3-Region des Spleen
Focus Forming Virus durch das GFP-Gen aus HIV-CS-CG mit stromaufwärts liegendem
HCMV-MIE-Promotor und erhielt so ViCGΔBH. Die gag-pol-, vif-, vpx-, vpr-, env- und nefGene sind durch Punktmutationen und Deletionen inaktiviert. Die U3-Region des 3’ LTR ist
fast vollständig deletiert, daher handelt es sich um einen sich selbst inaktivierenden Vektor
(SIN-Vektor).
b) HIV-CS-CG
Die U3-Region des 5’ LTR dieses von Ulrike Blömer erhaltenen HIV-1-Vektor-Konstrukts ist
durch einen HCMV-MIE-Promotor ersetzt und in der U3-Region des 3’ LTR TATA-Box
sowie Bindungsstellen für die Transkriptionsfaktoren Sp1 und NF-κB deletiert (SIN-Vektor).
Als Reportergen dient GFP mit einem internen HCMV-MIE-Promotor [23].
2.1.4
Weitere Plasmide
a) pcTat
Das von Joachim Hauber erhaltene HIV-1-tat-Expressionsplasmid enthält das tat-Gen eines
HIV-1 cDNA-Klons unter transkriptioneller Kontrolle eines HCMV-MIE-Promotors [93].
2 Material und Methoden
16
b) pcRev
Das von Joachim Hauber erhaltene HIV-1-rev-Expressionsplasmid enthält das rev-Gen eines
HIV-1 cDNA-Klons unter transkriptioneller Kontrolle eines HCMV-MIE-Promotors [93].
c) pSEAP
pSEAP-Control (BD Biosciences, Heidelberg; hier als „pSEAP“ bezeichnet) dient der Expression der Sekretierten Alkalischen Phosphatase in eukaryotischen Zellen.
2.2 Oligonukleotide und weitere Nukleinsäuren
Tab. 2-2. Primer für Polymerase-Kettenreaktionen und Sequenzierungen.
Bezeichnung
Sequenz (5’-3’)
3’XhoI-VSV-Ga1
5’EcoRI-VSV-Gs1
Exa1
Exs1
ILa1
ILs1
Krypta2
Krypts2
M13 Forward (-20)3
M13 Reverse3
MutVSV-GsynMuta1
CTGCACTCGAGTTATTACTTTCCAAGTCGGT
CCGCCGAATTCATAAAGTGCCTTTTGTACTTAG
GTACTCGTCCACCAGCACGT
TCCTTGACACGAAGCTTGGT
CTTCACTTGCAGGGCGGTGCCGATCAGGT
GCACCGCCCTGCAAGTGAAGATGCCCAA
TGAGCTTGACGGGCAATAATGG
TCAGATCGCCTGGAGACGCCAT
GTAAAACGACGGCCAG
CAGGAAACAGCTATGAC
TCCACCAGCACGTGGTGAGGGGTCACTTGCACGATCACGGCCTCGGCGTCGGTCACG
GTGGCGTA
GTACAAAAGGCACTTCATGGTGG
CACGCTGTTTTGACCTCCATAGA
GATGCTGTGGGTGATGTACTTGGGGCCGTA
AGTACATCACCCACAGCATCAGGAGCTTCA
CCTTTCCATGGGTCTTTTCTGC
CGAAGCAGTGATTGTCCAGGTG
GGGTCTTCCAATCTCTCCAGTGG
TGTAGAGTTATGGACAGTGGGGCA
CTGATCATTCCGACCATTCTTGAG
ATGGCTGGCAACTAGAAGGCAC
CTTCACTTTGTAGTCGCTGT
CCACCAGACATAATAGCTGA
pCI-GIa2
pCI-GIs2
QHa1
QHs1
SEQpCI-G11
SEQpCI-G21
SEQpCI-G31
SEQpCI-G41
SEQpCI-G51
SEQpCI-G61
SEQpCI-GsynMuta1
SEQpCI-GsynMuts1
1
Bezugsquelle: SIGMA-ARK, Darmstadt
Bezugsquelle: biomers.net, Ulm
3
Bezugsquelle: Invitrogen, Karlsruhe
2
2 Material und Methoden
17
Tab. 2-3. Oligonukleotide für die komplementäre Anlagerung zu Verbindungssequenzen. Die
Nukleinsäuren wurden von biomers.net, Ulm bezogen.
Bezeichnung Sequenz (5’-3’)
GATCCGAGCTCGGTACCAAGCTTCGTGTCAAGGACGGTGAGTCACTCTTGGCACGCGGTTCACTAA
ACGAGCT
CGTTTAGTGAACCGCGTGCCAAGAGTGACTCACCGTCCTTGACACGAAGCTTGGTACCGAGCTCG
AGCTTCGTGTCAAGGACGGTGAGTCACTCTTGGCACGGGGAATCCGCGTTCCAATGCACCGTTCCC
GGCCGC
GGCCGGGAACGGTGCATTGGAACGCGGATTCCCCGTGCCAAGAGTGACTCACCGTCCTTGACACGA
AGCTTGGGAATCCGCGTTCCAATGCACCGTTCCCGGCCGC
GGCCGGGAACGGTGCATTGGAACGCGGATTCCCA
SLa
SLs
ΔIa
ΔIs
ΔSLa
ΔSLs
Tab. 2-4. Weitere Nukleinsäuren und Nukleotide.
Bezeichnung
Bezugsquelle
Fischsperma-DNA „DNA, MB grade“ Roche, Mannheim
ssRNA-Leiter
NEB, Frankfurt/Main
100 bp DNA Leiter
Invitrogen, Karlsruhe
1 kb DNA Leiter
Invitrogen, Karlsruhe
dATP, dCTP, dGTP, dTTP
Amersham, Freiburg
ATP
Amersham, Freiburg
2.3 Eukaryonten und Prokaryonten
Tab. 2-5. Zelllinien.
Zelllinie Beschreibung
ATCC-Nr.
293A
293T
CRL-1573
CRL-11268
Humane Nierenepithel-Zellen, mit Adenovirus-5-DNA transformiert
293A-Zellen, in die das Gen für das große T-Antigen des SV40-Virus eingefügt wurde
Tab. 2-6. Bakterienstämme.
Bakterienstamm Genotyp
DH5α
XL2-Blue
F-, φ80dlacZΔM15, Δ(lacZYA-argF)U169, deoR, recA1, endA1, hsdR17
(rk-, mk+), phoA, supE44, λ-, thi-1, gyrA96, relA1
recA1 endA1 gyrA96 thi-1 hsdR17 supE44 relA1 lac
[F´ proAB lacIqZΔM15 Tn10 (Tetr) Amy Camr]
Bezugsquelle
Invitrogen,
Karlsruhe
Stratagene,
Amsterdam, NL
2 Material und Methoden
18
2.4 Enzyme, Antikörper und andere Proteine
Tab. 2-7. Polymerasen und DNA-/RNA-modifizierende Enzyme. Geeignete Reaktionspuffer
wurden von den angegebenen Herstellern mitgeliefert.
Bezeichnung
Produktname
Bezugsquelle
DNase I
Reverse Transkriptase
RNase A
T4-DNA-Ligase
T4-DNA-Ligase
T4-DNA-Polymerase
T4-Polynukleotid-Kinase
Taq- und Tfu-DNA-Polymerase-Mischung
Taq-DNA-Polymerase
DNA-free
SuperScript II RT
Ambion, Huntingdon, UK
Invitrogen, Karlsruhe
Applichem, Darmstadt
MoBiTec, Göttingen
NEB, Frankfurt/Main
NEB, Frankfurt/Main
NEB, Frankfurt/Main
Qbiogene, Heidelberg
Amersham, Freiburg
TaKaRa DNA-Ligation-Kit Ver.2.1
Arrow-Taq-Polymerase
Tab. 2-8. Restriktionsendonukleasen. Die roten Linien symbolisieren die Schnittstellen.
Die Enzyme wurden mit Reaktionspuffern von NEB in Frankfurt am Main bezogen.
Bezeichnung
BamHI
EcoRI
HindIII
PmlI
Erkennungssequenz
G|G
C C
G|A
C T
A|A
T T
C A
G T
A T
T A
A T
T A
G C
C G
C|G
G|C
C C
G|G
T C
A|G
T T
A|A
T G
A C
Bezeichnung
SacI
SacII
XhoI
Erkennungssequenz
G A G
C|T C
C C G
G G|C
C|T C
G A G
C T|C
G A G
C|G G
G C C
G A G
C T|C
Tab. 2-9. Antikörper und Protein-Größenstandards.
Bezeichnung
Bezugsquelle
Proteingrößenstandard „Precision Plus“
Monoklonaler Antikörper gegen HIV-1 p24 (AG3.0), produziert in
Balb/c Milzzellen × SSP2/10 Myelomzellen, Zellkulturüberstand
Monoklonaler Antikörper gegen VSV-G, produziert in Maus, Klon
P5D4, Ascites-Flüssigkeit
Polyklonale Kaninchen-Anti-Maus-Immunglobuline, meerrettichperoxidasekonjugiert (HRP)
Biorad, München
AIDS Research and Reference Reagent
Program, Dr. Jonathan Allan [94]
Sigma-Aldrich, München
DakoCytomation, Hamburg
2 Material und Methoden
19
2.5 Chemikalien, kits, sonstige Verbrauchsmaterialien
Tab. 2-10. Chemikalien.
Chemikalie
Bezugsquelle
4-(2-Hydroxyethyl)-1Piperazin-Ethansulfonsäure (HEPES), freie Säure
Acrylamid-Bisacrylamid-Lösung 40 % (37,5:1)
Agar
Agarose
Ammoniumperoxodisulfat (APS)
Ampicillin
Aqua B. Braun
Bromphenolblau
Calciumchlorid (CaCl2)
Diethylpyrocarbonat (DEPC)
Dimethylsulfoxid (DMSO)
Dinatriumhydrogenphosphat (Na2HPO4)
Eisessig
Ethanol
Ethidiumbromidlösung 1%
Ethylendiaminotetraessigsäure (EDTA)
Formaldehyd 37 %
Formamid (deionisiert)
Glucose
Glycerin
Hefeextrakt
Isopropanol
Kaliumacetat
Kaliumchlorid
Magermilchpulver
Magnesiumchlorid
Maleinsäure
β-Mercaptoethanol
Biomol, Hamburg
Carl Roth, Karlsruhe
Applichem, Darmstadt
Invitrogen, Karlsruhe
Carl Roth, Karlsruhe
Applichem, Darmstadt
B. Braun, Melsungen
Sigma-Aldrich, München
J. T. Baker, Griesheim
Applichem, Darmstadt
Applichem, Darmstadt
J. T. Baker, Griesheim
J. T. Baker, Griesheim
J. T. Baker, Griesheim
Carl-Roth, Karlsruhe
VWR, Darmstadt
J. T. Baker, Griesheim
Sigma-Aldrich, München
J. T. Baker, Griesheim
J. T. Baker, Griesheim
Applichem, Darmstadt
J. T. Baker, Griesheim
J. T. Baker, Griesheim
J. T. Baker, Griesheim
Heirler Cenovis, Radolfzell
J. T. Baker, Griesheim
J. T. Baker, Griesheim
Sigma-Aldrich, München
Morpholinopropansulfonsäure (MOPS)
N,N,N’,N’-Tetramethylethylendiamin (TEMED)
Natriumacetat
Natriumchlorid (NaCl)
Natriumcitrat
Natriumdodecylsulfat (SDS)
Natriumhydroxid (NaOH)
Saccharose
Salzsäure (HCl)
Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan (Tris)
Trypton
Tween 20
Applichem, Darmstadt
Carl Roth, Karlsruhe
J. T. Baker, Griesheim
J. T. Baker, Griesheim
J. T. Baker, Griesheim
Applichem, Darmstadt
J. T. Baker, Griesheim
Sigma-Aldrich, München
J. T. Baker, Griesheim
Applichem, Darmstadt
Applichem, Darmstadt
Applichem, Darmstadt
2 Material und Methoden
20
Tab. 2-11. Kits.
Bezeichnung
Bezugsquelle
Alpha Innotech Chemiglow West
DIG High Prime DNA Labelling and Detection Starter Kit II
DIG PCR Probe Synthesis Kit
DNA-free
Fast Track 2.0 Kit
Jetquick DNA Clean-Up Spin Kit
Jetquick Gel Extraction Spin Kit
Jetquick PCR Purification Spin Kit
Jetstar Maxi Plasmid Purification Kit
Phospha-Light-SEAP-Reporter-Gene-Assay-System
Qiagen Plasmid Maxi Kit
Qiaprep Spin Miniprep Kit
Qiaquick Gel Extraction Kit
Qiaquick Nucleotide Removal Kit
Qiaquick PCR Purification Kit
RNeasy Mini Kit
Superscript First-Strand Synthesis System for RT-PCR
TaKaRa DNA-Ligation-Kit Ver.2.1
Topo TA Cloning
Biozym, Hess. Oldendorf
Roche, Mannheim
Roche, Mannheim
Ambion, Huntingdon, UK
Invitrogen, Karlsruhe
Genomed, Löhne
Genomed, Löhne
Genomed, Löhne
Genomed, Löhne
Applied Biosystems, Darmstadt
Qiagen, Hilden
Qiagen, Hilden
Qiagen, Hilden
Qiagen, Hilden
Qiagen, Hilden
Qiagen, Hilden
Invitrogen, Karlsruhe
MoBiTec, Göttingen
Invitrogen, Karlsruhe
Tab. 2-12. Sonstige Verbrauchsmaterialien.
Bezeichnung
Bezugsquelle
0,2-µm-Spritzenvorsatzfilter
0,45-µm-Spritzenvorsatzfilter
Filterpapier
Filterpapier für „Mini Trans-Blot Cell“
Nytran Nylon-Membran
Protran Nitrocellulose-Membran
Zellstoff
Zentrifugenröhrchen
Sarstedt
Sarstedt
Whatman Schleicher & Schuell, Dassel
Bio-Rad, München
Whatman Schleicher & Schuell, Dassel
Whatman Schleicher & Schuell, Dassel
B. Braun, Melsungen
Beckman, Krefeld
2.6 Kunststoff-Einmalartikel
Einmalartikel aus Kunststoff (z.B. Zellkulturflaschen, Pipetten, Pipettenspitzen, Reaktionsgefäße usw.) wurden von den Firmen Nunc (Wiesbaden), Sarstedt (Nümbrecht), Biozym (Hessisch Oldendorf), Starlab (Ahrensburg) und Greiner (Frickenhausen) bezogen.
2 Material und Methoden
21
2.7 Puffer, Medien und Lösungen
Tab. 2-13. Medien, Puffer, Lösungen für Arbeiten mit Zellkulturen und Lentiviren. In
„Aqua B. Braun“. Für Fertigprodukte ist die Bezugsquelle angegeben.
Medium
Zusammensetzung
Kulturmedium
DMEM
10 % (v/v) FBS
1 % (v/v) Penicillin-Streptomycin
Kulturmedium
10 % (v/v) DMSO
frisch angesetzt, auf Eis gekühlt
DMEM
5 % (v/v) FBS
1 % (v/v) Penicillin-Streptomycin
mit L-Glutamin
4,5 g/l D-Glucose
ohne Pyruvat
30 min bei 56 °C inaktiviert
10000 U/ml Penicillin G
10000 µg/ml Streptomycin
in 0,85 % NaCl-Lösung
1,37 M NaCl
27 mM KCl
43 mM Na2HPO4
14 mM KH2PO4
pH 7,4
2 M CaCl2
steril filtriert
250 mM HEPES (freie Säure)
1,4 M NaCl
14 mM Na2HPO4
20 % (v/v) 10 × HBS,
Aliquote mit pH 7,05 bis 7,15
Transfektionseffizienzen ermittelt,
ungeeignete Aliquote verworfen
Einfriermedium
Infektionsmedium
Dulbecco’s Modified
Eagle Medium (DMEM)
Fötales Rinderserum (FBS)
Penicillin-Streptomycin-Lösung
10 × PBS
2 M CaCl2
10 × HBS
2 × HBS
Bezugsquelle
Invitrogen, Karlsruhe
Biochrom, Berlin
Invitrogen, Karlsruhe
Invitrogen, Karlsruhe
2 Material und Methoden
22
Tab. 2-14. Bakterienmedien. In Reinstwasser.
Bezeichnung
Zusammensetzung
S.O.C.-Medium
2 % (w/v) Trypton
0,5 % (w/v) Hefe-Extrakt
8,6 mM NaCl
2,5 mM KCl
10 mM MgCl2
20 mM Glucose
pH 7,0
1,5 % (w/v) Agar
in LB-Medium
0,01 % (w/v) Ampicillin
in Petrischalen gegossen
1 % (w/v) Trypton
0,5 % (w/v) Hefeextrakt
0,17 M NaCl
pH 7,0
LB-Medium
0,01 % (w/v) Ampicillin
LB-Ampicillin-Agar-Platten
LB-Medium
LB-Ampicillin-Medium
Tab. 2-15. Puffer und Lösungen für RNA-Agarose-Gelelektrophorese
und Northernblots.
Bezeichnung
Zusammensetzung
RNA-Probenpuffer
50 % (v/v) Formamid (deionisiert)
16,6 % (v/v) Formaldehyd 37 %
10 % (v/v) 10 × MOPS
0,2 ‰ (w/v) Bromphenolblau
1,5 ‰ (v/v) Ethidiumbromidlösung 1 %
in DEPC-Wasser
Reinstwasser mit
1 ‰ DEPC geschüttelt
über Nacht unter dem Abzug inkubiert
DEPC durch Autoklavieren inaktiviert
200 mM MOPS
50 mM Natriumacetat
20 mM EDTA
in DEPC-Wasser
pH 7,0
3 M NaCl
300 mM Natriumcitrat
in Reinstwasser
pH 7,0
Bestandteile des „DIG High Prime DNA
Labelling and Detection Starter Kit II“
DEPC-Wasser
10 × MOPS
20 × SSC
DIG Easy Hyb, Anti-DigoxigeninAntikörper, CSPD
Tab. 2-16. Puffer für die Agarose-Gelelektrophorese.
Puffer
Bezugsquelle
50 × TAE
10 × TBE
Applichem, Darmstadt
Applichem, Darmstadt
2 Material und Methoden
23
Tab. 2-17. Puffer und Lösungen für SDS-PAGE, Westernblots und Probenaufarbeitung. In
Reinstwasser, falls nicht anders angegeben.
Bezeichung
Zusammensetzung
WB-Probenpuffer
1,1 % (w/v) SDS
11 % (v/v) Glycerin
11 % (v/v) β-Mercaptoethanol
8,9 % (v/v) 0,5 M Tris-Puffer, pH 6,8
1,1 ‰ (w/v) Bromphenolblau
20 % (w/v) Saccharose
10 % (v/v) 10 × PBS
in „Aqua B. Braun“
steril filtriert
25 % (v/v) Acrylamid-Bisacrylamid-Lösung 40 % (37,5:1)
33 % (v/v) 1,5 M Tris-Puffer, pH 8,8
0,1 % (w/v) SDS
0,1 % (w/v) APS
0,8 ‰ (v/v) TEMED
12,5 % (v/v) Acrylamid-Bisacrylamid-Lösung 40 % (37,5:1)
14 % (v/v) 0,5 M Tris-Puffer, pH 6,8
0,1 % (w/v) SDS
0,1 % (w/v) APS
0,8 ‰ (v/v) TEMED
1 M Maleinsäure
1,5 M NaCl
pH 7,5
10 % (v/v) 10 × MBS
0,3 % (v/v) Tween 20
5 % (w/v) Magermilchpulver
in MBS-T
0,5 ‰ (v/v) Monoklonaler Antikörper gegen HIV-1 p24
in 5 % Magermilch
0,01 ‰ (v/v) Monoklonaler Antikörper gegen VSV-G
in 5 % Magermilch
0,5 ‰ (v/v) Kaninchen-Anti-Maus-Immunglobuline/HRP
in 5 % Magermilch
50 % (v/v) Chemiglow-West-Luminol/Enhancer
50 % (v/v) Chemiglow-West stabile Peroxid-Lösung
20 % Saccharose-Lösung
10 % Trenngel
Sammelgel
10 × MBS
MBS-T
5 % Magermilch
Anti-HIV-1-p24-Lösung
Anti-VSV-G-Lösung
Anti-Maus/HRP-Lösung
Chemiglow-West-Lösung
Tab.
2-18.
Puffer
für
MiniPlasmidpräparationen. In Reinstwasser.
Puffer
Zusammensetzung
P1
50 mM Tris
10 mM EDTA
0,1 ‰ RNase A
pH 8,0
200 mM NaOH
1 % (w/v) SDS
3 M Kaliumacetat
pH 5,5
1 mM Tris
pH 8,5
P2
P3
1/10 × EB
2 Material und Methoden
24
2.8 Technische Ausstattung
Tab. 2-19. Geräte und Apparaturen.
Gerät
Bezugsquelle
Analysenwaage “Scaltec SPB63”
Bilddokumentations-System “ChemiImager 4400”
CO2-Inkubator „Heraeus HERAcell 240“
Elektroblot-Apparatur “Mini Trans-Blot Cell”
Elektrophorese-Apparatur (horizontal) “PerfectBlue”
Elektrophorese-Apparatur (vertikal) “Mini Protean 3”
Folienschweißgerät
Fotometer „BioPhotometer“
Flüssigstickstoff-Behälter „MVE Cryosystem 6000“
Gefrierschrank (-20 °C)
Gefrierschrank (-80 °C) „-86C ULT Freezer“
Gefrierschrank (-80 °C) „MDF-U71V“
Heißluftsterilisator “Heraeus T6420”
Hochsensitives Bilddokumentations-System
Inverses Fluoreszenzmikroskop “Axiovert 100”
Inverses Mikroskop “TMS”
Kreisschüttler „Certomat SII“
Magnetrührer “IKA-Combimag RCT”
Mikropipetten “Pipetman P”
Mikrotiterplatten-Luminometer “Orion”
Mikrowellengerät “R-220A”
Mikrozentrifuge „5417 C“
Neubauer-Zählkammer
pH-Meter “GPHR 1400A”
Pipettierhilfe “Pipetus-akku”
Präzisionswaage “Scaltec SBA31”
Reinstwasseranlage “Seralpur Pro 90 CN”
Schüttelgerät “Scientific Industries Vortex-Genie 2”
Schüttelinkubator “Thermomixer comfort”
Schüttelwasserbad “1086”
Schüttler (wippend) „Rockomat“
Sicherheitswerkbank „Heraeus Herasafe“
Spannungsgeber “Consort E835”
Spannungsgeber „Power Pack P25”
Thermocycler “MJ Research PTC100”
Tischzentrifuge „6K15“ mit Winkelrotor „12500“
Tischzentrifuge „GPR“ mit Ausschwingrotor
Ultrazentrifuge „Optima L-70 K“ mit Ausschwingrotor „SW 41 Ti“
Wasserbad
Wasserbad
Denver, Göttingen
Biozym, Hess. Oldendorf
Thermo Electron, Langenselbold
Bio-Rad, München
Peqlab, Erlangen
Bio-Rad, München
Krups, Solingen
Eppendorf, Hamburg
Chart, Marietta, GA, USA
Siemens, München
Thermo Electron, Dreieich
Sanyo, München
Thermo Electron, Langenselbold
Hamamatsu, Herrsching am Ammersee
Carl Zeiss, Oberkochen
Nikon, Düsseldorf
Sartorius, Göttingen
IKA-Werke, Staufen
Gilson, Bad Camberg
Berthold, Pforzheim
Sharp, Hamburg
Eppendorf, Hamburg
Carl Roth, Karlsruhe
Greisinger Electronic, Regenstauf
Hirschmann, Eberstadt
Denver, Göttingen
Elga, Celle
Carl Roth, Karlsruhe
Eppendorf, Hamburg
GFL, Burgwedel
Tecnomara, Zürich, CH
Thermo Electron, Langenselbold
Peqlab, Erlangen
Biometra, Göttingen
Bio-Rad, München
Sigma, Osterode am Harz
Beckman Coulter, Krefeld
Beckman Coulter, Krefeld
Memmert, Schwabach
Breda Scientific, Breda, NL
Zur Ausstattung gehörten ferner ein 37°C- und zwei 4°C-Räume.
2 Material und Methoden
25
2.9 Arbeiten mit Zellkulturen und Lentiviren
2.9.1
Kultivierung von 293T- und 293A-Zellen
Die Zellen wurden zur Erhaltung in 75 cm2 Zellkulturflaschen in 20 ml Kulturmedium kultiviert. Die Kulturen wurden dreimal wöchentlich passagiert; dazu wurde das Kulturmedium
verworfen, der Zellrasen mit 10 ml 1 x PBS abgespült, die Zellen mit 2 ml Trypsinlösung
abgelöst und nach Zugabe von 8 ml frischem Kulturmedium resuspendiert. 1 ml der Suspension wurde zu 19 ml Kulturmedium in eine neue Zellkulturflasche übertragen, der Rest entweder verworfen oder für weitere Experimente verwendet. Die Kulturen wurden bei 37 °C
unter 5 % CO2 und gesättigter Luftfeuchtigkeit inkubiert; diese Bedingungen wurden bei allen
Zellkultur-Inkubationen in den im Folgenden beschriebenen Methoden eingehalten.
2.9.2
Kryokonservierung von Zellen
Um den Bestand kryokonservierter Kulturen zu erhalten, wurden frische Kulturen in 175 cm2
Zellkulturflaschen expandiert. Bei Erreichen von 80 % Konfluenz wurde der ZellkulturÜberstand verworfen, der Zellrasen mit 20 ml PBS gespült, die Zellen mit 4 ml Trypsinlösung
abgelöst, nach Zugabe von 46 ml Kulturmedium resuspendiert, mit Hilfe einer NeubauerZählkammer gezählt und durch Zentrifugation bei 1000 Upm (Tischzentrifuge „GPR“) sedimentiert. Mit eiskaltem Einfriermedium wurden die Zellen auf Eis in einer Dichte von 5 × 106
bis 1 × 107 Zellen/ml resuspendiert und in 1-ml-Portionen auf Kryogefäße verteilt. Die Kulturen wurden in einem isolierten Gefäß bei – 80 °C langsam eingefroren. Nach zwei Tagen
wurden die Kulturen in einen mit Flüssigstickstoff gefüllten Behälter überführt und dort gelagert.
2.9.3
Auftauen kryokonservierter Zellen
Die Eigenschaften der verwendeten 293T- und 293A-Zellen veränderten sich nach einigen
Passagen, daher mußten alle zwei bis drei Monate die Kulturen verworfen und kryokonservierte Zellen niedriger Passage frisch in Kultur genommen werden. Ein Kryogefäß mit 1 ml
Kultur wurde aus dem Flüssigstickstoff-Behälter direkt in ein 37 °C warmes Wasserbad überführt und dort unter Schwenken aufgetaut. Unmitteltbar nach dem Auftauen wurde die Zell-
2 Material und Methoden
26
suspension zu 20 ml Kulturmedium gegeben und die Zellen dann gleich durch Zentrifugation
bei 1000 Upm (Tischzentrifuge „GPR“) sedimentiert. Das Sediment wurde in 5,5 ml Kulturmedium resuspendiert, 5 ml der Suspension wurden in eine 25 cm2 Zellkulturflasche gegeben,
die restlichen 0,5 ml wurden zu 4,5 ml Kulturmedium in eine weitere 25 cm2 Zellkulturflasche gegeben. Nach etwa acht Stunden Inkubation wurde das Kulturmedium in beiden Kulturen gegen frisches ausgetauscht. War die dünner ausgesäte Kultur nach zwei bis drei Tagen
konfluent, so wurde diese expandiert, die andere verworfen, andernfalls wurde die dichter
ausgesäte Kultur expandiert.
2.9.4
Transiente Transfektion von 293T-Zellen mittels Calcium-Phosphat
a) Zur Vektor-Produktion, für die Westernblot-Analyse und für die Total-RNA-Präparation
Am Tag vor der Transfektion wurden 1,2 × 106 Zellen in eine 25 cm2 Zellkulturflasche ausplattiert. Unmittelbar vor der Transfektion wurde das Medium (5 ml pro Flasche) gewechselt,
dazu wurde stets frisch angesetztes Medium verwendet. Die zu transfizierende DNA (s. Abbildungsunterschriften im Kapitel 3 Ergebnisse) wurde gegebenenfalls mit Fischsperma-DNA
auf 15 µg aufgefüllt und auf Eis zu 31 µl 2 M CaCl2 gegeben. Der Ansatz wurde mit „Aqua
B. Braun“ auf 250 µl aufgefüllt, kurz gevortext und dazu unter Vortexen 250 µl eisgekühlter
2 × HBS-Puffer zugetropft. Der gesamte Ansatz wurde dann zum Überstand der zu transfizierenden Zellen getropft und die Flasche in waagerechter Position vorsichtig geschwenkt, um
eine gleichmäßige Verteilung der Calcium-Phosphat-DNA-Präzipitate zu gewährleisten. Acht
bis zwölf Stunden nach der Transfektion wurde das Medium gewechselt.
b) Für die mRNA-Präparation
Am Tag vor der Transfektion wurden 7 × 106 293T-Zellen in eine 175 cm2 Zellkulturflasche
ausgesät. Unmittelbar vor der Transfektion wurde der Zellkulturüberstand durch 35 ml frisch
angesetztes Kulturmedium ersetzt.
Auf Eis wurden zu 217 µl 2M CaCl2 35 µg des SIV-Vektor-Plasmids ViCGΔBH, 35 µg des
HIV-1-gag-pol-Expressions-Plasmids Hgpsyn, 14 µg VSV-G-Expressionsplasmid und 21 µg
Fischsperma-DNA gegeben, mit „Aqua B. Braun“ auf 3,5 ml aufgefüllt und kurz gevortext.
Dazu wurden unter vortexen 3,5 ml eiskalter 2 × HBS-Puffer getropft und der gesamte Ansatz
anschließend zum Überstand der zu transfizierenden Zellen getropft. Durch vorsichtiges
Schwenken der Flasche in waagerechter Position wurde für eine gleichmäßige Verteilung der
2 Material und Methoden
27
Calcium-Phosphat-DNA-Präzipitate gesorgt. Acht bis zwölf Stunden nach der Transfektion
wurde das Kulturmedium gewechselt. Zwei Tage nach Transfektion wurde die mRNA präpariert
2.9.5
Ernte lentiviraler Vektoren
Zwei Tage nach der Transfektion wurde der Zellkulturüberstand 5 bis 10 min bei 1200 Upm
(Tischzentrifuge „GPR“) zentrifugiert und der Überstand anschließend durch einen 0,45 µm
Spritzenvorsatz-Filter filtriert. Das Filtrat wurde sofort in Infektions-Experimenten eingesetzt,
nicht benötigte Mengen wurden in Portionen von 1 ml bei – 80 °C aufbewahrt.
2.9.6
Infektion von 293A-Zellen mit lentiviralen Vektoren
Am Tag vor der Infektion wurden unter Verwendung von Infektionsmedium 1 × 105 293AZellen pro Kavität in eine 24-Kavitäten-Platte ausgesät. Zur Infektion wurden frisch geerntete
oder im Wasserbad bei 37 °C aufgetaute Vektor-Präparate 1:10 und 1:100 in Infektionsmedium verdünnt. Von den Zellen wurde der Überstand entfernt und 200 µl unverdünntes, 1:10bzw. 1:100 verdünntes Vektorpräparat zugegeben. Nach einer Inkubation von 4 h wurden die
Kavitäten mit Infektionsmedium auf je 1 ml aufgefüllt.
2.9.7
Titerbestimmung
Da alle eingesetzten Vektorkonstrukte das Gen für das grün fluoreszierende Protein (GFP)
enthalten, konnte die grüne Fluoreszenz für die Titerbestimmung ausgenutzt werden. Mit Hilfe eines inversen Fluoreszenzmikroskops wurden die grün fluoreszierenden Zellen in einer der
angesetzten Verdünnungsstufen in 7 von 196 Gesichtsfeldern einer Kavität zwei bis drei Tage
nach der Infektion ausgezählt. Der Titer ergab sich dann durch Multiplikation mit dem Verdünnungsfaktor, anschließender Multiplikation mit dem Faktor 196/7, um die Zahl der grünen
Zellen in der gesamten Kavität zu errechnen, sowie Multiplikation mit dem Faktor 5, um die
Zahl der grüne-Fluoreszenz-bildenden Einheiten in 1 ml unverdünntem Vektorpräparat
(GFU/ml) zu erhalten.
2 Material und Methoden
28
2.10 Arbeiten mit Escherichia coli
2.10.1 Transformation von E. coli
Plasmide wurden in E. coli transformiert, um durch anschließende Vermehrung der transformierten E. coli eine Vermehrung der Plasmide zu erreichen. Es wurden kommerziell erworbene, chemisch kompetente E. coli XL2-Blue sowie von Dr. Susann Lucke und Dr. Hella
Monse hergestellte chemisch kompetente E. coli DH5α transformiert.
Dazu wurden 1 bis 2 µl einer Plasmidlösung (100 ng/µl), eines Ligationsproduktes oder eines
TA-Klonierungs-Produktes zu 10 bis 25 µl E. coli XL2-Blue- bzw. 50 µl E. coli DH5αSuspension gegeben, behutsam gemischt und 30 min auf Eis inkubiert. Nach einem Hitzeschock von 45 s bei 42 °C wurde für weitere 2 min auf Eis inkubiert und das 9fache des Volumens der Bakterien-Suspension an S.O.C.-Medium zugegeben. Es wurde 1 h unter Schütteln bei 37 °C inkubiert. Zuletzt wurde der gesamte Ansatz oder nur ein Teil davon mit einem
Drigalski-Spatel auf LB-Ampicillin-Agar-Platten ausplattiert und über Nacht bei 37 °C inkubiert.
2.10.2 Kultivierung von E. coli
a) Für Mini-Plasmidpräparationen
Eine Kolonie auf einer LB-Ampicillin-Agar-Platte mit transformierten E. coli wurde mit einer
Pipettenspitze durchstoßen und letztere in ein vorbereitetes Kultur-Röhrchen mit 2 bis 3 ml
LB-Ampicillin-Medium gegeben. Alternativ wurden 2 bis 3 ml LB-Ampicillin-Medium mit
50 µl LB-Ampicillin-Medium angeimpft, das seinerseits beim Ansatz einer Kolonie-PCR (s.
2.12.7) angeimpft wurde. Die Kulturen wurden über Nacht bei 37 °C geschüttelt.
b) Für Maxi-Plasmidpräparationen
100 bis 500 ml LB-Ampicillin-Medium wurden mit 1/1000 Volumen Vorkultur (z. B. Rest
einer Kultur für Mini-Plasmidpräparation) oder 1/1000 Volumen Glycerinkultur angeimpft.
Die Kultur wurde über Nacht bei 37 °C geschüttelt.
2 Material und Methoden
29
c) Glycerinkultur
Zur Kryokonservierung wurden 500 µl einer frischen E. coli Kultur vorsichtig mit 500 µl
Glycerin vermischt und bei – 20 °C eingefroren.
2.11 Arbeiten mit Proteinen
2.11.1 SEAP-Bestimmung
Zwei Tage nach Cotransfektion des Expressionsplasmids für die Sekretierte Alkalische
Phosphatase pSEAP (100 ng auf 15 µg Gesamt-DNA) wurde das Enzym im Zellkulturüberstand mit Hilfe des „Phospha-Light-SEAP-Reporter-Gene-Assay-System“ quantifiziert. Dabei
erfolgte die Bestimmung im Chemilumineszenz-Verfahren mit CSPD als Substrat. Die Ansatzgröße wurde halbiert, ansonsten wurden die Angaben des Herstellers genau befolgt. Die
Chemilumineszenz wurde mittels Mikrotiterplatten-Luminometer gemessen.
2.11.2 Westernblot-Analyse
a) Lyse transfizierter Zellen für den Westernblot
Zwei Tage nach Transfektion wurde der Zellkultur-Überstand dekantiert und der Zellrasen
vorsichtig mit PBS gespült. Anschließend wurden 500 µl WB-Probenpuffer auf den Zellrasen
pipettiert. Nach kurzer Inkubation bei Raumtemperatur wurde das visköse Lysat in ein 1,5 ml
Reaktionsgefäß überführt und bis zur Verwendung bei – 20 °C aufbewahrt.
b) Aufarbeitung der Viruspartikel für den Westernblot
Die Viruspartikel wurden aus dem Vektorpräparat mittels Ultrazentrifugation durch ein Saccharosekissen sedimentiert. Dazu wurden 2 ml 20 % Saccharose-Lösung in ein Zentrifugenröhrchen vorgelegt, das Vektorpräparat darüber geschichtet und das Röhrchen mit Infektionsmedium aufgefüllt. Es wurde mit 28000 Upm für 2 h bei 4 °C in der Ultrazentrifuge
zentrifugiert und anschließend der gesamte flüssige Überstand abgehoben. Das (unsichtbare)
Sediment wurde durch wiederholtes Abspülen des Bodens des Zentrifugenröhrchens mit
100 µl WB-Probenpuffer in selbigem gelöst.
2 Material und Methoden
30
c) Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE)
Das Gießen des vertikalen Gels und die Vorbereitung der Elektrophoresekammer erfolgten
nach Angaben des Herstellers der Apparatur „Mini Protean 3“.
Das Gel bestand zu etwa ¾ aus Trenngel und zu etwa ¼ aus Sammelgel.
Es wurden 5 µl des Größenstandards „Precision Plus“ und je 20 µl der Zell-Lysate bzw. Viruspartikel-Proben aufgetragen. Die Zell-Lysate und die Viruspartikel-Proben sind zuvor für
5 min bei 100 °C denaturiert und für 2 min bei 14000 Upm in der Mikrozentrifuge zentrifugiert worden. Die Elektrophorese erfolgte für 45 min bei 200 V.
d) Transfer und Immunodetektion
Nach SDS-PAGE wurden die Proteine aus dem Trenngel auf eine Nitrocellulose-Membran im
Elektroblot-Verfahren in 1 h bei 100 V übertragen. Die Apparatur „Mini Trans-Blot Cell“
wurde dabei nach Angaben des Herstellers zusammengesetzt.
Die Membran wurde dann 2 min in MBS-T gewaschen, über Nacht in 5 % Magermilch geblockt und anschließend unterhalb der 50 kD Bande des Größenstandards durchtrennt. Der
Abschnitt mit den Proteinen kleiner als 50 kD wurde für 3 h in Anti-HIV-1-p24-Lösung inkubiert. Der Abschnitt mit den Proteinen größer als 50 kD wurde für 3 h in Anti-VSV-G-Lösung
inkubiert. Die Membranen wurden dann fünfmal für 5 min in MBS-T gewaschen, für 2 h in
Anti-Maus/HRP-Lösung inkubiert und wieder fünfmal für 5 min in MBS-T gewaschen.
Zur Detektion wurden insgesamt 0,5 ml Chemiglow-West-Lösung auf die Membranen geträufelt, diese dann 5 min zwischen zwei Folien inkubiert und nach Herauswalzen der überschüssigen Flüssigkeit eingeschweißt. Die Chemilumineszenz wurde mit einer hochsensitiven Kamera dokumentiert.
2.12 Arbeiten mit Nukleinsäuren
2.12.1 Fotometrische Bestimmung von Nukleinsäure-Konzentrationen
Mit einem Fotometer wurde die Extinktion der DNA (RNA) in Wasser bei 260 nm gemessen.
Einer Extinktion von 1 entsprechen 50 µg DNA (40 µg RNA) pro ml Wasser.
2 Material und Methoden
31
2.12.2 mRNA-Präparation
Zur Lyse der Zellen und zur mRNA-Präparation wurde das „Fast-Track 2.0 Kit“ nach den
Angaben des Herstellers benutzt. Dabei wurde die Lyse durch SDS vermittelt und zur Bindung und Isolation der PolyA+-RNA Oligo-dT-Zellulose-Pulver eingesetzt. Das gewonnene
RNA-Sediment wurde in 25 µl Fast-Track-2.0-Elutions-Puffer gelöst.
2.12.3 Northernblot-Analyse
a) Synthese der Sonde
Die Sonde wurde mit dem „PCR DIG Probe Synthesis Kit“ – aus dem Digoxigenin (DIG)
Markierungs- und Detektionssystem von Roche – durch Einbau von DIG-11-dUTP mittels
Polymerase-Ketten-Reaktion generiert. Sie war gegen die 130 b 5’ des AAUAAA-Motivs des
Rinder-Polyadenylierungssignals im hgpsyn-Transkript und in den Transkripten der
pcDNA3.1(+) basierten VSV-G-Expressionsplasmide gerichtet.
b) Denaturierung der Proben
Die mRNA-Proben und die RNA-Leiter wurden mit je 2 Volumen RNA-Probenpuffer versetzt, 10 min bei 65 °C denaturiert und sofort auf Eis gekühlt. Es wurden je 2 µg mRNA bzw.
5 µl RNA-Leiter eingesetzt.
c) RNA-Agarose-Gelelektrophorese
Die mRNA-Proben wurden in einem 1,5 %igen Agarose-Gel getrennt; dazu wurden 0,75 g
Agarose in 47,3 ml 1 × MOPS aufgekocht, 2,7 ml Formaldehyd (37 %) zugefügt und das Gel
gegossen. Die horizontale Elektrophorese-Apparatur wurde so hergerichtet, dass die Pufferkammern nur so weit mit 1 × MOPS gefüllt wurden, dass das Gel nicht überschichtet wurde.
Die Proben wurden in die trockenen Taschen gefüllt und sind zunächst bei 100 V für ca.
10 min ins Gel eingelaufen. Dann wurde das Gel mit 1 × MOPS überschichtet und die Proben
bei 80 V für 2 h getrennt.
d) Transfer der RNA
Die aufgetrennten Proben wurden durch Kapillar-Transfer auf die positiv geladene Nylonmembran übertragen. Dazu wurde ein rechteckiger Plastik-Deckel von der Größe des Gels in
2 Material und Methoden
32
ein 20 × SSC Reservoir gestellt, ein mit 20 × SSC durchtränktes, dickes Filterpapier als Brücke so über den Deckel gelegt, dass beide Enden in das 20 × SSC ragten. Darauf wurde das
Gel gelegt, dann folgte die Membran, anschließend ein trockenes Filterpapier von der Größe
des Gels. Passgenau um das Gel wurde eine Maske gelegt, die aus einer Klarsichthülle zugeschnitten worden war, um den direkten Kontakt der über dem Gel befindlichen trockenen Lagen mit der unter dem Gel befindlichen nassen Lage zu verhindern. Auf das trockene Filterpapier wurde ein etwa 10 cm hoher Stapel Zellstoff gelegt, das sandwich wurde mit einer
Glasplatte und einem Gewicht abgeschlossen. Der Transfer erfolgte über Nacht, die Membran
wurde anschließend kurz in 2 × SSC gewaschen und für 30 min bei 120 °C im Heißluftsterilisator gebacken.
e) Hybridisierung und Detektion der Sonde
Prähybridisierung und Hybridisierung mit „DIG Easy Hyb“ sowie nachfolgende WaschSchritte erfolgten nach den Angaben des Herstellers des Digoxigenin (DIG) Markierungs- und
Detektionssystems unter Verwendung der dort aufgeführten Puffer und Lösungen; dabei enthielt die Hybridisierungslösung 4 µl Sonde/ml „DIG Easy Hyb“ und für die Prähybridisierung, die Hybridisierung sowie den hochstringenten Wasch-Schritt wurde eine Temperatur
von 50 °C gewählt.
Die hybridisierte Sonde wurde mit einem Anti-Digoxigenin-Antikörper, der mit Alkalischer
Phosphatase konjugiert war, unter Verwendung des Substrats CSPD im ChemilumineszenzVerfahren nach Angaben des Herstellers detektiert. Die Chemilumineszenz wurde mit einer
hochsensitiven Kamera dokumentiert.
2.12.4 Total-RNA Präparation mit anschließender DNase-Spaltung
Zwei Tage nach Transfektion wurden mit Trypsin abgelöste 293T-Zellen durch Zentrifugation bei 1200 Upm (Tischzentrifuge „GPR“) sedimentiert, mit eiskaltem PBS gewaschen, erneut sedimentiert, die Sedimente in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bis zur RNAPräparation bei -80 °C gelagert.
Die Total-RNA wurde mit Hilfe des „RNeasy Mini Kits“ nach dem Protokoll des Herstellers
gewonnen. Unter Verwendung von „DNA-free“ wurden anschließend eventuelle DNAVerunreinigungen in der Total-RNA-Präparation mittels DNase gespalten und die DNase anschließend inaktiviert, dabei wurden die Anweisungen des Herstellers genau befolgt.
2 Material und Methoden
33
2.12.5 RNA-Struktur-Vorhersage
Zur Vorhersage von RNA-Sekundär-Strukturen wurde das Programm „RNAfold“ mit den
Standard-Einstellungen über den Vienna-RNA-Web-Server (http://rna.tbi.univie.ac.at/) benutzt [95].
2.12.6 Plasmidpräparationen
Plasmide wurden aus E. coli im kleinen (Mini-) und großen (Maxi-) Maßstab unter Verwendung von kits präpariert. Bei geringeren Anforderungen an die Reinheit des Präparats wurden
Mini-Plasmidpräparationen nach der folgenden kostengünstigeren Methode durchgeführt:
1,5 ml Kultur wurden 1 min bei 14000 Upm in der Mikrozentrifuge zentrifugiert und das Sediment anschließend in 250 µl Puffer P1 resuspendiert. Mit 250 µl Puffer P2 wurden
die Bakterien dann unter Schwenken lysiert. Durch Zugabe von 250 µl Puffer P3 und unter
erneutem Schwenken wurden genomische Bakterien-DNA, Proteine, Zelltrümmer und SDS
gefällt. Nach Zentrifugation für 10 min bei 14000 Upm in der Mikrozentrifuge wurde der Überstand in ein neues Reaktionsgefäß überführt. Durch Zugabe von 0,7 Volumen Isopropanol
wurde die Plasmid-DNA gefällt. Nach Zentrifugation für 1 h bei 4 °C und 14000 Upm in der
Mikrozentrifuge wurde das DNA-Sediment mit 70 % (v/v) Ethanol gewaschen, dann wurde
für 10 min bei 4 °C und 14000 Upm in der Mikrozentrifuge zentrifugiert. Der Überstand wurde dekantiert, das DNA-Sediment an der Luft getrocknet und in 30 µl 1/10 × EB gelöst.
2.12.7 Polymerase-Kettenreaktion (PCR)
a) Mutagenese-PCR
Die zur Konstruktion des Plasmids pCI-Gsyn-G benötigte PCR erfolgte unter Verwendung von
Arrow-Taq-DNA-Polymerase, einer Mischung aus Taq-DNA-Polymerase und korrekturlesender Tfu-DNA-Polymerase. Der PCR-Ansatz wurde dem angegebenen Programm gemäß
im Thermocycler inkubiert.
2 Material und Methoden
34
Ansatz:
1 µl
1 µl
1 µl
5 µl
0,2 µl
0,1 µl
42 µl
Programm:
pCI-G (10 pg/µl)
primer 5’EcoRI-VSV-Gs (10 pmol/µl)
primer 3’XhoI-VSV-Ga (10 pmol/µl)
10 × T. Pol Puffer
dNTPs (je 10 mM)
Arrow-Taq-DNA-Polymerase (5 U/µl)
„Aqua B. Braun“
2 min
30 s
30 s
100 s
7 min
94 °C
94 °C
58 °C
72 °C
72 °C
× 35
Für die Konstruktion des Plasmids pCI-GsynMut wurde die Sequenz zwischen der HindIIIund PmlI-Schnittstelle in drei überlappende zu amplifizierende Abschnitte unterteilt und drei
Mutagenes-PCRs durchgeführt. Die Ansätze wurden nach dem unten angegebenen Programm
im Thermocycler inkubiert.
Ansätze:
Programm:
Ansatz 1: Ansatz 2: Ansatz 3:
2 µl
pCI-Gsyn (10 pg/µl)
primer Exs (10 pmol/µl)
1 µl
primer ILa (10 pmol/µl)
1 µl
primer ILs (10 pmol/µl)
primer QHa (10 pmol/µl)
primer QHs (10 pmol/µl)
primer Exa (10 pmol/µl)
10 × T. Pol Puffer
5 µl
dNTPs (je 10 mM)
0,2 µl
Arrow-Taq-Polymerase (5 U/µl) 0,1 µl
„Aqua B. Braun“
41 µl
2 µl
2 µl
2 min
30 s
30 s
45 s
7 min
1 µl
1 µl
5 µl
0,2 µl
0,1 µl
41 µl
94 °C
94 °C
55 °C
72 °C
72 °C
× 35
1 µl
1 µl
5 µl
0,2 µl
0,1 µl
41 µl
Für die Konstruktion des Plasmids pCI-Gopt wurde zur Reversion der unerwünschten Mutation folgender PCR-Ansatz nach dem angegebenen Programm im Thermocycler inkubiert:
Ansatz:
1 µl
1 µl
1 µl
5 µl
0,2 µl
0,1 µl
42 µl
Programm:
pCI-GsynMut
primer MutVSV-GsynMuta (10 pmol/µl)
primer Exs (10 pmol/µl)
10 × T. Pol Puffer
dNTPs (je 10 mM)
Arrow-Taq-Polymerase (5 U/µl)
„Aqua B. Braun“
2 min
30 s
30 s
1 min
7 min
94 °C
94 °C
55 °C
72 °C
72 °C
× 35
2 Material und Methoden
35
b) Overlap-Extension-PCR
Bei einer Overlap-Extension-PCR lagern sich in den ersten Zyklen die denaturierten TeilSequenzen an den komplementären Überlappungs-Stellen aneinander und werden verlängert,
in den späteren Zyklen wird die so entstandene Sequenz vollständiger Länge mit den äußeren
primern amplifiziert (s. auch Abb. 2-1).
Abb. 2-2. Overlap-Extension-PCR-Produkt. – primer sind
durch blaue Pfeile, Restriktionsschnittstellen durch senkrechte
Balken und VSV-Gsyn-Sequenzabschnitte in rosa dargestellt.
Die Exs-ILa- (224 bp), ILs-QHa- (134 bp) und QHs-Exa-Amplifikate (191 bp) (s. o.) wurden
im Rahmen der Konstruktion des Plasmids pCI-GsynMut durch eine Overlap-Extension-PCR
zur Sequenz vollständiger Länge zusammengefügt. Der PCR-Ansatz wurde dem unten angegebenen Programm gemäß im Thermocycler inkubiert.
Ansatz:
1 µl
1 µl
1 µl
1 µl
1 µl
5 µl
0,2 µl
0,1 µl
40 µl
Programm:
Exs-ILa-Amplifikat (Gelextrakt)
ILs-QHa-Amplifikat (Gelextrakt)
QHs-Exa-Amplifikat (Gelextrakt)
primer Exs (10 pmol/µl)
primer Exa (10 pmol/µl)
10 × T. Pol Puffer
dNTPs (je 10 mM)
Arrow-Taq-Polymerase (5 U/µl)
„Aqua B. Braun“
2 min
30 s
30 s
45 s
7 min
94 °C
94 °C
55 °C
72 °C
72 °C
× 35
2 Material und Methoden
36
c) Kolonie-PCR
Alternativ zur Spaltung mittels Restriktionsendonukleasen wurden TA-Klone durch KoloniePCR analysiert. Jede zu untersuchende Kolonie transformierter E. colis wurde mit je einer
Pipettenspitze durchstoßen, diese zuerst in 50 µl LB-Ampicillin-Medium und dann in 15 µl
Grundmischung ausgespült. Die PCR-Ansätze wurden nach dem unten angegebenen Programm im Thermocycler inkubiert. Die angeimpften Medium-Aliquote wurden bei 4 °C gelagert, mit diesen konnten erforderlichenfalls später größere Kulturen angeimpft werden.
Programm:
5 min
20 s
20 s
90 s
95 °C
95 °C
55 °C
72 °C
Grundmischung (pro Ansatz):
× 40
1,5 µl
0,3 µl
0,3 µl
0,3 µl
12,5 µl
0,15 µl
10 x PCR-Puffer
dNTPs (je 10 mM)
primer M13 Forward (-20) (10 pmol/µl)
primer M13 Reverse (10 pmol/µl)
„Aqua B. Braun“
Taq-Polymerase
d) Reverse-Transkriptase-PCR
Je 5 µg Total-RNA wurden mit 2 pmol primer Krypta unter Verwendung des kits „Superscript First-Strand Synthesis System for RT-PCR“ nach Angaben des Herstellers revers
transkribiert und wie folgt amplifiziert:
Ansatz:
2,5 µl
0,5 µl
0,5 µl
0,5 µl
1 µl
0,5 µl
19,5 µl
Programm:
10 × PCR-Puffer
dNTPs (je 10 mM)
primer Krypts (10 pmol/µl)
primer Krypta (10 pmol/µl)
cDNA
Taq-Polymerase
„Aqua B. Braun“
2 min
20 s
20 s
80 s
7 min
95 °C
95 °C
57 °C
72 °C
72 °C
× 35
2.12.8 Spaltung von DNA mittels Restriktionsendonukleasen
Maxi-Plasmidpräparationen wurden zur Kontrolle und Mini-Plasmidpräparationen in Reihenuntersuchungen zur Identifizierung oder zum Treffen einer Vorauswahl für eine anschließende Sequenzierung durch Spaltung mittels Restriktionsendonukleasen analysiert. 1 bis 2 µg
2 Material und Methoden
37
DNA wurde mit 1 µl des angegebenen Enzyms für 8 bis 12 h unter den vom Hersteller angegebenen Pufferbedingungen bei der für das Enzym optimalen Temperatur inkubiert.
2.12.9 Auffüllen von Einzelstrang-Enden
Bei der Spaltung von DNA durch Restriktionsendonukleasen entstandene überhängende Einzelstrang-Enden konnten mit Hilfe des Enzyms T4-DNA-Polymerase zu doppelsträngigen
Enden aufgefüllt werden. Diese Fill-in-Reaktion wurde nach den Anweisungen des Herstellers des Enzyms durchgeführt.
2.12.10 Reinigung von DNA
a) PCR-Produkte und mittels Restriktionsendonukleasen gespaltene DNA
Erforderlichenfalls wurden PCR-Produkte und durch Spaltung mittels Restriktionsendonukleasen entstandene Fragmente mit Hilfe von PCR-Purification-Kits oder DNA-Clean-UpKits nach Angaben der Hersteller gereinigt. Alternativ erfolgte die Reinigung durch AgaroseGelelektrophorese mit anschließender Extraktion der DNA aus der entsprechenden GelBande, wenn unerwünschte DNA-Moleküle entfernt werden sollten (s. u.).
b) DNA < 100 bp
Nach komplementärer Anlagerung von Oligonukleotiden wurden die so gewonnenen Doppelstränge mit Hilfe des „Qiaquick Nucleotide Removal Kits“ nach Anweisungen des Herstellers
gereinigt.
2.12.11 Agarose-Gelelektrophorese
DNA-Moleküle wurden der Größe nach durch Agarose-Gelelektrophorese getrennt. Die Agarose-Konzentration (0,8 bis 1,5 % (w/v)) und der Lauf-Puffer (1 × TAE- oder 0,5 × TBEPuffer) wurden abhängig von der Größe der zu trennenden DNA-Moleküle nach den Angaben
in „Molecular Cloning“ [96] gewählt. Ebenfalls in Abhängigkeit von der Größe der zu trennenden DNA-Moleküle wurde die 100 bp DNA-Leiter oder die 1 kb DNA-Leiter als Größen-
2 Material und Methoden
38
standard aufgetragen. Die horizontale Apparatur wurde gemäß der Anleitung des Herstellers
benutzt.
2.12.12 DNA-Extraktion aus Agarose
DNA wurde aus Agarosegel-Banden mit Hilfe von Gel-Extraction-Kits unter Beachtung der
Anweisungen des jeweiligen Herstellers extrahiert.
2.12.13 Phosphorylierung und komplementäre Anlagerung von Oligonukleotiden
Die anzulagernden Oligonukleotide wurden zunächst mittels T4-Polynukleotid-Kinase
phosphoryliert, um eine nachfolgende Ligation zu ermöglichen. Der PhosphorylierungsAnsatz (s. u.) wurde 1 h bei 37 °C inkubiert. Anschließend wurden 7,5 µl 20 × SSC zugefügt,
um nichtkomplementäre Anlagerungen zu reduzieren, und 10 min bei 70 °C denaturiert. Die
komplementäre Anlagerung wurde durch langsames (0,3 °C pro min) Abkühlen auf 21 °C
erreicht.
Phosphorylierungsansatz:
2,5 µl
2,5 µl
2 µl
4 µl
26 µl
3 µl
Oligonukleotid 1
Oligonukleotid 2
ATP (10 mM)
10 × Kinase-Puffer
„Aqua B. Braun“
T4-Poynukleotid-Kinase (10 U/µl)
2.12.14 Ligation
DNA-Moleküle wurden bei 16 °C mittels T4-DNA-Ligase in einem 10-µl-Ansatz über Nacht
ligiert, dabei wurden der mitgelieferte Puffer und 400 U T4-DNA-Ligase eingesetzt.
Alternativ erfolgte die Ligation unter Verwendung des „DNA Ligation Kit, Version 2.1“
(auch T4-DNA-Ligase-basierend) bei 16 °C in 30 min unter genauer Befolgung der Anleitung
des Herstellers.
2 Material und Methoden
39
2.12.15 TA-Klonierung
Die Taq-Polymerase hängt ein einzelnes dATP an die 3’-Enden von PCR-Produkten. Über
diese 3’-A-Überhänge können PCR-Produkte in spezielle TA-Klonierungs-Plasmide eingefügt werden, welche linearisiert sind und einzelne 3’-T-Überhänge aufweisen. Das benutzte
Plasmid pCR-2.1-TOPO aus dem „TOPO-TA-Cloning-Kit“ besitzt außerdem eine kovalent
gebundene Topoisomerase I, die die Ligation des komplementär angelagerten PCR-Produkts
mit dem Plasmid bewirkt. Nach TA-Klonierung gemäß den Anweisungen des Herstellers
wurden die Plasmide in E. coli transformiert.
2.12.16 DNA-Sequenzierung
a) Im Hause
Sowohl Sinn- als auch Gegensinnstrang der für VSV-G codierenden Sequenz in pCI-G wurden in drei Abschnitten sequenziert. Für die Sinnstrang-Sequenzierung wurden die primer
SEQpCI-G1, SEQpCI-G2 und SEQpCI-G3 und für die Gegensinnstrang-Sequenzierung die
primer SEQpCI-G4, SEQpCI-G5 und SEQpCI-G6 eingesetzt. Die Ansätze für die DidesoxyKettenabbruch-Reaktion wurden wie unten angegeben im Thermocycler inkubiert.
Danach wurden die Reaktionsprodukte gefällt. Dazu wurden die Ansätze jeweils mit 80 µl
„Aqua B. Braun“, 10 µl 3 M Natriumacetat, pH 5,2 und 250 µl Ethanol versetzt, 30 min bei
4 °C und 14000 Upm in einer Mikrozentrifuge zentrifugiert, die Überstände verworfen,
350 µl 70 % (v/v) Ethanol zugegeben, weitere 10 min bei 4 °C und 14000 Upm zentrifugiert,
die Überstände erneut verworfen und die unsichtbaren Sedimente an der Luft getrocknet.
Die Sequenzierung wurde von Dr. Dennis Hoffmann an Geräten der Abteilung für Humangenetik durchgeführt.
Reaktionsansätze
3 µl pCI-G (0,1 µg/µl)
1 µl primer (10 pmol/µl)
4 µl ABI-Ready-Reaction-Mix
Programm:
2 min
20 s
20 s
4 min
95 °C
95 °C
57 °C
60 °C
× 35
2 Material und Methoden
40
b) Seqlab
Die Tab. 2-20 zeigt die Plasmide und PCR-Produkte, die mit dem jeweils angegebenen primer von der Firma Seqlab in Göttingen sequenziert wurden.
Tab. 2-20. Sequenzierungen durch Seqlab.
Matrizen-DNA
primer
100 ng
600 ng
600 ng
600 ng
600 ng
20 pmol
20 pmol
20 pmol
20 pmol
20 pmol
OE-Amplifikat
pCI-GsynMut
pCI-GsynMut
pCI-Gopt
pCI-Gopt
Querverweis
Exa
pCI-GsynMuts
pCI-GsynMuta
pCI-GsynMuts
pCI-GsynMuta
2.1.1 k)
2.1.1 k)
2.1.1 k)
2.1.1 l)
2.1.1 l)
c) Genterprise
Die Tab. 2-21 zeigt die Plasmide und PCR-Produkte, die mit dem jeweils angegebenen primer von der Firma Genterprise in Mainz sequenziert wurden.
Tab. 2-21. Sequenzierungen durch Genterprise.
Matrizen-DNA
primer
Querverweis
300 ng pCI-GΔI
60 pmol pCI-GIs
2.1.1 f)
300 ng pCI-GΔI
60 pmol pCI-GIa
2.1.1 f)
35 ng
0,3-kb-pCI-G-Amplifikat
60 pmol Krypts
2.12.4
35 ng
0,3-kb-pCI-G-Amplifikat
60 pmol Krypta
2.12.4
35 ng
0,3-kb-pCI-GΔI-Amplifikat
60 pmol Krypts
2.12.4
35 ng
0,3-kb-pCI-GΔI-Amplifikat
60 pmol Krypta
2.12.4
35 ng
pCR-2.1(0,7-kb-Amplifikat)
60 pmol M13 Forward (-20)
2.12.4
35 ng
pCR-2.1(0,7-kb-Amplifikat)
60 pmol M13 Reverse
2.12.4
35 ng
pCR-2.1(1,15-kb-Amplifikat)
60 pmol M13 Forward (-20)
2.12.4
35 ng
pCR-2.1(1,15-kb-Amplifikat)
60 pmol M13 Reverse
2.12.4
3 Ergebnisse
3.1 Expression von VSV-G mittels pCDNA3.1(+)-basierter Plasmide
VSV-G-Expressionsplasmide werden zur Produktion pseudotypisierter Viren eingesetzt. Dazu
hat sich das Plasmid pHIT-G bewährt [24,91,97,98], in welchem die VSV-G-Transkription
durch den HCMV-major-immediate-early-Promotor (HCMV-MIE-Promotor) angetrieben
wird und sich zwischen Promotor und der für VSV-G codierenden Sequenz das erste Intron
und die flankierenden, nicht translatierten Exon-Sequenzen der HCMV-MIE-Gene befinden
(s. Abb. 3-1). Dr. Seraphin Kuate brachte das VSV-G-Gen unter die Kontrolle eines durch
Ponasteron induzierbaren Promotors [50] und stellte dabei fest, dass die Expression nur gelang, wenn nicht nur die für VSV-G codierende Sequenz, sondern auch die HCMV-MIEIntron- und -Exon-Sequenzen in die induzierbare Expressionskassette kloniert wurden [49].
Dieses Ergebnis wurde zunächst in der vorliegenden Arbeit mit pCDNA3.1(+)-basierten
Plasmiden nachvollzogen.
Abb. 3-1. Expressionskassetten der VSV-G-Expressionsplasmide pHIT-G, pCD-G und pCI-G
(schematische Darstellung). – HCMV-Promotor: Promotor/Enhancer-Region der Major-immediateearly-Gene (MIE-Gene) des humanen Cytomegalievirus; Ex 1: HCMV-MIE-Exon 1; Ex 2: nicht
translatiertes 5’-Ende des HCMV-MIE-Exons 2; Intron: erstes HCMV-MIE-Intron; VSV-G: codierende Sequenz für das Glykoprotein G des Vesicular-Stomatitis-Virus; VSV 3’-UTR: nicht translatierte
Wildtypsequenz am 3’-Ende des VSV-G-Gens; SV40 pAd: Polyadenylierungssignal des SV40-Virus;
BGH pAd: Polyadenylierungssignal des Rinder-Wachstumshormons.
Dazu wurden die Pseudotypisierungseffizienz und das VSV-G-Expressionsvermögen der
pCDNA3.1(+)-Konstrukte pCD-G und pCI-G untersucht, welche nur die für VSV-G codie-
3 Ergebnisse
42
rende Sequenz bzw. sowohl die für VSV-G codierende Sequenz und als auch das HCMVMIE-Intron mit flankierenden, nicht translatierten Exon-Sequenzen enthielten (s. Abb. 3-1),
und diese denen des pHIT-G gegenübergestellt.
Durch Cotransfektion der VSV-G-Expressionsplasmide wurden SIV-Vektoren pseudotypisiert und deren Titer anschließend auf 293A-Zellen als grüne-Fluoreszenz-bildende Einheiten
pro ml (GFU/ml) bestimmt. Mit pHIT-G wurden Titer von (5,7 ± 2,1) × 105 GFU/ml erzielt;
die unter Verwendung von pCD-G erhaltenen Titer waren etwa 7000fach niedriger
((82 ± 13) GFU/ml); mittels pCI-G wurden wieder Titer in der ursprünglichen Größenordnung erreicht ((6,8 ± 1) × 105 GFU/ml) (s. Abb. 3-2).
Abb. 3-2. VSV-G-Expression mittels pHIT-G, pCIG und pCD-G. - Zur Produktion lentiviraler
Vektoren wurden 293T-Zellen mit 5 µg ViCGΔBH (SIV-Vektor-Konstrukt), 5 µg SgpΔ2 (SIV-gagpol-Expressionsplasmid) und 2 µg des angegebenen VSV-G-Expressionsplasmids cotransfiziert. Nach
zwei Tagen wurden die Vektoren geerntet und die Zellen lysiert. A: Die Titer der lentiviralen Vektoren wurden als grüne-Fluoreszenz-bildende Einheiten pro ml (GFU/ml) auf 293A-Zellen bestimmt.
Gezeigt sind Mittelwert und Standardabweichung aus drei Experimenten. Kontrollexperimente ohne
VSV-G-Expressionsplasmid lieferten Titer < 5 GFU/ml (nicht dargestellt). B: Die Zelllysate wurden
unter Verwendung monoklonaler Antikörper gegen VSV-G und HIV-1 p24 einer Westernblot-Analyse
unterzogen. CA: Capsidprotein.
Es bestätigte sich in der Westernblot-Analyse von Lysaten entsprechend transfizierter SIVPartikel produzierender 293T-Zellen, dass sich VSV-G mit pHIT-G und pCI-G stark exprimieren ließ, die Expression von VSV-G mittels pCD-G jedoch unterhalb der Nachweisgrenze
blieb (s. Abb. 3-2). Ein damit übereinstimmendes Bild zeigte sich auch in der NorthernblotAnalyse von mRNA-Präparationen aus 293T-Zellen, die SIV-Vektoren produzierten, die mittels eines HIV-1-gag-pol-Expressionsplasmids verpackt worden waren: Sogar bei – im-
3 Ergebnisse
43
Vergleich zur pCI-G-Probe – stärkerem gag-pol-Signal, das zur Normierung herangezogen
wurde, ließ sich keine von pCD-G transkribierte VSV-G-mRNA nachweisen (s. Abb. 3-3).
Abb. 3-3. Northernblot-Analyse der von pCI-G und pCD-G
transkribierten mRNA aus transfizierten Zellen. – 293TZellen wurden mit ViCGΔBH (SIV-Vektorkonstrukt), Hgpsyn
(HIV-1-gag-pol-Expressionsplasmid) und dem angegebenen
VSV-G-Expressionsplasmid cotransfiziert. Die nach zwei Tagen aus den transfizierten Zellen isolierte mRNA wurde einer
Northernblot-Analyse unterzogen. Die DNA-Sonde war gegen
die 130 b 5’ des AAUAAA-Motivs des RinderPolyadenylierungssignals in den gag-pol- und VSV-GTranskripten gerichtet.
3.2 Exakte Deletion des ersten HCMV-MIE-Introns
3.2.1
Einfluss des Spleiß-Prozesses und der Exon-Sequenzen auf die Expression
Da das Plasmid pCI-G im Vergleich zum Plasmid pCD-G sowohl das erste Intron als auch
das Exon 1 und das nicht translatierte 5’-Ende des Exons 2 der HCMV-major-immediateearly-Gene (HCMV-MIE-Gene) enthielt, wurde überprüft, ob der beobachtete positive Effekt
auf die Expression durch das Intron bzw. das Spleißen, oder durch die nicht translatierten Exon-Sequenzen bewirkt wird.
Dazu wurde das VSV-G-Expressionsplasmid pCI-GΔI (s. Abb. 3-4) konstruiert, das als primäres Transkript, also ohne Spleiß-Prozesse, eine mRNA liefert, die identisch ist mit der reifen, d. h. gespleißten, mRNA aus pCI-G, also auch die HCMV-MIE-Exon-Sequenzen enthält.
3 Ergebnisse
44
Abb. 3-4. Expressionskassetten der VSV-G-Expressionsplasmide pCI-G, pCI-GΔI und pCD-G
(schematische Darstellung). – HCMV-Promotor: Promotor/Enhancer-Region der Major-immediateearly-Gene (MIE-Gene) des humanen Cytomegalievirus; Ex 1: HCMV-MIE-Exon 1; Ex 2: nicht
translatiertes 5’-Ende des HCMV-MIE-Exons 2; Intron: erstes HCMV-MIE-Intron; VSV-G: codierende Sequenz für das Glykoprotein G des Vesicular-Stomatitis-Virus; BGH pAd: Polyadenylierungssignal des Rinder-Wachstumshormons.
Die Pseudotypisierungseffizienz und das VSV-G-Expressionsvermögen der Plasmide pCI-G,
pCI-GΔI und pCD-G wurden wie in 3-1 anhand lentiviraler Vektoren durch Titerbestimmung
sowie Western- und Northernblot-Analyse miteinander verglichen.
Abb. 3-5. VSV-G-Expression mittels pCI-GΔI. – A: Zur Produktion lentiviraler Vektoren wurden
293T-Zellen mit 5 µg ViCGΔBH (SIV-Vektor-Konstrukt), 5 µg Hgpsyn (HIV-1-gag-pol-Expressionsplasmid) und 2 µg des angegebenen VSV-G-Expressionsplasmids cotransfiziert. Die Titer der nach
zwei Tagen geernteten lentiviralen Vektoren wurden als grüne-Fluoreszenz-bildende Einheiten pro ml
(GFU/ml) auf 293A-Zellen bestimmt. Gezeigt sind Mittelwert und Standardabweichung aus drei Experimenten. Kontrollexperimente ohne VSV-G-Expressionsplasmid lieferten Titer < 5 GFU/ml (nicht
dargestellt). B: 293T-Zellen wurden mit 5 µg ViCGΔBH (SIV-Vektor-Konstrukt), 5 µg SgpΔ2 (SIVgag-pol-Expressionsplasmid) und 2 µg des angegebenen VSV-G-Expressionsplasmids cotransfiziert.
Die Zellen wurden zwei Tage nach Transfektion lysiert und einer Westernblot-Analyse unter Verwendung monoklonaler Antikörper gegen VSV-G und HIV-1 p24 unterzogen. CA: Capsidprotein.
3 Ergebnisse
45
Die Titer der SIV-Vektoren, die unter Verwendung eines HIV-1-gag-pol-Expressionsplasmids
verpackt
und
mittels
pCI-GΔI
pseudotypisiert
worden
waren,
waren
mit
5
(2,0 ± 0,5) × 10 GFU/ml noch etwa halb so hoch wie die der mittels pCI-G pseudotypisierten
Vektoren, die sich auf (4,3 ± 0,9) × 105 GFU/ml beliefen; die Titer der mittels pCD-G pseudotypisierten Vektoren waren mit (790 ± 130) GFU/ml mehr als 500fach niedriger als die
mittels pCI-G und 250fach niedriger als die mittels pCI-GΔI pseudotypisierten Vektoren (s.
Abb. 3-5 A).
In der Westernblot-Analyse von 293T-Zellen, die SIV-Vektoren produzierten, die mittels pCIG, pCD-G oder pCI-GΔI VSV-G-pseudotypisiert waren, zeigte sich eine etwas stärkere VSVG-Bande in der pCI-G-Probe als in der pCI-GΔI-Probe, VSV-G-Expression durch pCD-G
war nicht nachweisbar (s. Abb. 3-5 B).
Abb. 3-6. Northernblot-Analyse der von pCI-G, pCD-G und pCI-GΔI transkribierten mRNA aus
transfizierten Zellen. – 293T-Zellen wurden mit ViCGΔBH (SIV-Vektorkonstrukt), Hgpsyn (HIV-1gag-pol-Expressionsplasmid) und dem angegebenen VSV-G-Expressionsplasmid cotransfiziert. A:
Die nach zwei Tagen aus den transfizierten Zellen isolierte mRNA wurde einer Northernblot-Analyse
unterzogen. Die DNA-Sonde war gegen die 130 b 5’ des AAUAAA-Motivs des Rinder-Polyadenylierungssignals in den gag-pol- und VSV-G-Transkripten gerichtet. B: Von der Intensität der Banden
wurde die Intensität des Hintergrundes der jeweiligen Bahn subtrahiert und die so bereinigten VSV-GBanden-Intensitäten zu den bereinigten gag-pol-Banden-Intensitäten ins Verhältnis gesetzt.
Analog ergab sich durch Northernblot-Analyse der mRNA aus 293T-Zellen, die SIVVektoren produzierten, die mittels eines HIV-gag-pol-Expressionsplasmids verpackt und mit-
3 Ergebnisse
46
tels pCI-G, pCD-G oder pCI-GΔI pseudotypisiert waren, dass das Verhältnis von VSV-G- zu
gag-pol-mRNA in Lentiviren produzierenden 293T-Zellen, die transfiziertes pCI-GΔI enthielten, nur 1,7fach geringer war als in solchen, die pCI-G enthielten, aber 10,1fach höher als in
solchen, die pCD-G enthielten (s. Abb. 3-6).
3.2.2
Nachweis der Spleißprodukte
Um zu beweisen, dass die VSV-G-Expression mit pCI-GΔI nicht durch das Spleißen der
mRNA, sondern durch das Vorliegen der fusionierten Exon-Sequenzen so stark war, wurde
gezeigt, dass bei der Konstruktion dieses Plasmids nicht eventuell vorhandene kryptische
Spleißstellen aktiviert wurden. Dazu wurde Total-RNA aus transfizierten 293T-Zellen isoliert
und die 5’-Enden der primären VSV-G-Transkripte und der Spleißprodukte mittels RT-PCR
amplifiziert. Die Abb. 3-7 zeigt das Resultat der Agarose-Gelelektrophorese der Amplifikate:
Die mit Abstand intensivste Bande repräsentiert ein etwa 300 bp großes Amplifikat in der
pCI-G- und in der pCI-GΔI-Probe. In der pCI-G Probe zeigen sich noch zwei weitere Banden:
Eine zarte bei etwas mehr als 1,1 kb und eine nicht erwartete bei etwa 700 bp.
Abb. 3-7. Transkripte und Spleißprodukte: AgaroseGelelektrophorese von RT-PCR-Produkten. – 293T-Zellen
wurden mit 5 µg ViCGΔBH (SIV-Vektor-Konstrukt), 5 µg
SgpΔ2 (SIV-gag-pol-Expressionsplasmid) und 2 µg des angegebenen VSV-G-Ex-pressionsplasmid cotransfiziert. Aus
den transfizierten Zellen wurde Total-RNA präpariert und
von den in dieser enthaltenen VSV-G-RNAs die gesamten 5’Enden einschließlich der ersten 132 b der für VSV-G codierenden Sequenz mit dem primer Krypta revers transkribiert,
zur Kontrolle wurde die Reaktion auch ohne Reverse
Transkriptase (RT) angesetzt. Dann wurden die Einzelstränge
mit dem Primer-Paar Krypts und Krypta ausgehend vom
Transkriptionsstart amplifiziert und die Amplifikate einer
Agarose-Gelelektrophorese unterzogen
3 Ergebnisse
1130-bp-pCI-G
713-bp-pCI-G
303-bp-pCI-G
303-bp-pCI-GΔI
pCI-GΔI
pCI-G
1130-bp-pCI-G
713-bp-pCI-G
303-bp-pCI-G
303-bp-pCI-GΔI
pCI-GΔI
pCI-G
47
1
130
TCAGATCGCCTGGAGACGCCATCCACGCTGTTTTGACCTCCATAGAAGACACCGGGACCGATCCAGCCTCCGCGGCCGGGAACGGTGCATTGGAACGCGGATTCCCCGTGCCAAGAGTGACGTAAGTACC
TCAGATCGCCTGGAGACGCCATCCACGCTGTTTTGACCTCCATAGAAGACACCGGGACCGATCCAGCCTCCGCGGCCGGGAACGGTGCATTGGAACGCGGATTCCCCGTGCCAAGAGTGAC--------TCAGATCGCCTGGAGACGCCATCCACGCTGTTTTGACCTCCATAGAAGACACCGGGACCGATCCAGCCTCCGCGGCCGGGAACGGTGCATTGGAACGCGGATTCCCCGTGCCAAGAGTGAC--------TCAGATCGCCTGGAGACGCCATCCACGCTGTTTTGACCTCCATAGAAGACACCGGGACCGATCCAGCCTCCGCGGCCGGGAACGGTGCATTGGAACGCGGATTCCCCGTGCCAAGAGTGAC--------TCAGATCGCCTGGAGACGCCATCCACGCTGTTTTGACCTCCATAGAAGACACCGGGACCGATCCAGCCTCCGCGGCCGGGAACGGTGCATTGGAACGCGGATTCCCCGTGCCAAGAGTGAC--------TCAGATCGCCTGGAGACGCCATCCACGCTGTTTTGACCTCCATAGAAGACACCGGGACCGATCCAGCCTCCGCGGCCGGGAACGGTGCATTGGAACGCGGATTCCCCGTGCCAAGAGTGACGTAAGTACC
—————————
131
260
GCCTATAGAGTCTATAGGCCCACCCCCTTGGCTTCTTATGCATGCTATACTGTTTTTGGCTTGGGGTCTATACACCCCCGCTTCCTCATGTTATAGGTGATGGTATAGCTTAGCCTATAGGTGTGGGTTA
------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------GCCTATAGAGTCTATAGGCCCACCCCCTTGGCTTCTTATGCATGCTATACTGTTTTTGGCTTGGGGTCTATACACCCCCGCTTCCTCATGTTATAGGTGATGGTATAGCTTAGCCTATAGGTGTGGGTTA
1130-bp-pCI-G
713-bp-pCI-G
303-bp-pCI-G
303-bp-pCI-GΔI
pCI-GΔI
pCI-G
261
390
TTGACCATTATTGACCACTCCCCTATTGGTGACGATACTTTCCATTACTAATCCATAACATGGCTCTTTGCCACAACTCTCTTTATTGGCTATATGCCAATACACTGTCCTTCAGAGACTGACACGGACT
------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------TTGACCATTATTGACCACTCCCCTATTGGTGACGATACTTTCCATTACTAATCCATAACATGGCTCTTTGCCACAACTCTCTTTATTGGCTATATGCCAATACACTGTCCTTCAGAGACTGACACGGACT
——————— —————
391
520
CTGTATTTTTACAGGATGGGGTCTCATTTATTATTTACAAATTCACATATACAACACCACCGTCCCCAGTGCCCGCAGTTTTTATTAAACATAACGTGGGATCTCCACGCGAATCTCGGGTACGTGTTCC
--------------GATGGGGTCTCATTTATTATTTACAAATTCACATATACAACACCACCGTCCCCAGTGCCCGCAGTTTTTATTAAACATAACGTGGGATCTCCACGCGAATCTCGGGTACGTGTTCC
---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------CTGTATTTTTACAGGATGGGGTCTCATTTATTATTTACAAATTCACATATACAACACCACCGTCCCCAGTGCCCGCAGTTTTTATTAAACATAACGTGGGATCTCCACGCGAATCTCGGGTACGTGTTCC
———————————————
521
650
GGACATGGGCTCTTCTCCGGTAGCGGCGGAGCTTCTACATCCGAGCCCTGCTCCCATGCCTCCAGCGACTCATGGTCGCTCGGCAGCTCCTTGCTCCTAACAGTGGAGGCCAGACTTAGGCACAGCACGA
GGACATGGGCTCTTCTCCGGTAGCGGCGGAGCTTCTACATCCGAGCCCTGCTCCCATGCCTCCAGCGACTCATGGTCGCTCGGCAGCTCCTTGCTCCTAACAGTGGAGGCCAGACTTAGGCACAGCACGA
---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------GGACATGGGCTCTTCTCCGGTAGCGGCGGAGCTTCTACATCCGAGCCCTGCTCCCATGCCTCCAGCGACTCATGGTCGCTCGGCAGCTCCTTGCTCCTAACAGTGGAGGCCAGACTTAGGCACAGCACGA
1130-bp-pCI-G
713-bp-pCI-G
303-bp-pCI-G
303-bp-pCI-GΔI
pCI-GΔI
pCI-G
651
780
TGCCCACCACCACCAGTGTGCCGCACAAGGCCGTGGCGGTAGGGTATGTGTCTGAAAATGAGCTCGGGGAGCGGGCTTGCACCGCTGACGCATTTGGAAGACTTAAGGCAGCGGCAGAAGAAGATGCAGG
TGCCCACCACCACCAGTGTGCCGCACAAGGCCGTGGCGGTAGGGTATGTGTCTGAAAATGAGCTCGGGGAGCGGGCTTGCACCGCTGACGCATTTGGAAGACTTAAGGCAGCGGCAGAAGAAGATGCAGG
---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------TGCCCACCACCACCAGTGTGCCGCACAAGGCCGTGGCGGTAGGGTATGTGTCTGAAAATGAGCTCGGGGAGCGGGCTTGCACCGCTGACGCATTTGGAAGACTTAAGGCAGCGGCAGAAGAAGATGCAGG
1130-bp-pCI-G
713-bp-pCI-G
303-bp-pCI-G
303-bp-pCI-GΔI
pCI-GΔI
pCI-G
1130-bp-pCI-G
713-bp-pCI-G
303-bp-pCI-G
303-bp-pCI-GΔI
pCI-GΔI
pCI-G
1130-bp-pCI-G
713-bp-pCI-G
303-bp-pCI-G
303-bp-pCI-GΔI
pCI-GΔI
pCI-G
1130-bp-pCI-G
713-bp-pCI-G
303-bp-pCI-G
303-bp-pCI-GΔI
pCI-GΔI
pCI-G
1130-bp-pCI-G
713-bp-pCI-G
303-bp-pCI-G
303-bp-pCI-GΔI
pCI-GΔI
pCI-G
781
910
CAGCTGAGTTGTTGTGTTCTGATAAGAGTCAGAGGTAACTCCCGTTGCGGTGCTGTTAACGGTGGAGGGCAGTGTAGTCTGAGCAGTACTCGTTGCTGCCGCGCGCGCCACCAGACATAATAGCTGACAG
CAGCTGAGTTGTTGTGTTCTGATAAGAGTCAGAG--------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------CAGCTGAGTTGTTGTGTTCTGATAAGAGTCAGAGGTAACTCCCGTTGCGGTGCTGTTAACGGTGGAGGGCAGTGTAGTCTGAGCAGTACTCGTTGCTGCCGCGCGCGCCACCAGACATAATAGCTGACAG
—————————
———————
911
1040
ACTAACAGACTGTTCCTTTCCATGGGTCTTTTCTGCAGTCACCGTCCTTGACACGAAGCTTGGTACCGAGCTCGGATCCGCCGCCACCATGAAGTGCCTTTTGTACTTAGCCTTTTTATTCATTGGGGTG
--------------------------------------TCACCGTCCTTGACACGAAGCTTGGTACCGAGCTCGGATCCGCCGCCACCATGAAGTGCCTTTTGTACTTAGCCTTTTTATTCATTGGGGTG
--------------------------------------TCACCGTCCTTGACACGAAGCTTGGTACCGAGCTCGGATCCGCCGCCACCATGAAGTGCCTTTTGTACTTAGCCTTTTTATTCATTGGGGTG
--------------------------------------TCACCGTCCTTGACACGAAGCTTGGTACCGAGCTCGGATCCGCCGCCACCATGAAGTGCCTTTTGTACTTAGCCTTTTTATTCATTGGGGTG
--------------------------------------TCACCGTCCTTGACACGAAGCTTGGTACCGAGCTCGGATCCGCCGCCACCATGAAGTGCCTTTTGTACTTAGCCTTTTTATTCATTGGGGTG
ACTAACAGACTGTTCCTTTCCATGGGTCTTTTCTGCAGTCACCGTCCTTGACACGAAGCTTGGTACCGAGCTCGGATCCGCCGCCACCATGAAGTGCCTTTTGTACTTAGCCTTTTTATTCATTGGGGTG
————————————————————
1041
1130
AATTGCAAGTTCACCATAGTTTTTCCACACAACCAAAAAGGAAACTGGAAAAATGTTCCTTCTAATTACCATTATTGCCCGTCAAGCTCA
AATTGCAAGTTCACCATAGTTTTTCCACACAACCAAAAAGGAAACTGGAAAAATGTTCCTTCTAATTACCATTATTGCCCGTCAAGCTCA
AATTGCAAGTTCACCATAGTTTTTCCACACAACCAAAAAGGAAACTGGAAAAATGTTCCTTCTAATTACCATTATTGCCCGTCAAGCTCA
AATTGCAAGTTCACCATAGTTTTTCCACACAACCAAAAAGGAAACTGGAAAAATGTTCCTTCTAATTACCATTATTGCCCGTCAAGCTCA
AATTGCAAGTTCACCATAGTTTTTCCACACAACCAAAAAGGAAACTGGAAAAATGTTCCTTCTAATTACCATTATTGCCCGTCAAGCTCA
AATTGCAAGTTCACCATAGTTTTTCCACACAACCAAAAAGGAAACTGGAAAAATGTTCCTTCTAATTACCATTATTGCCCGTCAAGCTCA
Abb. 3-8. Transkripte und Spleiß-Produkte: Alignment der RT-PCR-Produkt-Sequenzen. –
Nach präparativer Agarose-Gelelektrophorese wurden die 0,3 kb großen Amplifikate aus der pCI-Gund pCI-GΔI-Probe direkt sequenziert, die 0,7 kb und 1,1 kb großen Amplifikate aus der pCI-G-Probe
zunächst in pCR2.1-TOPO TA-kloniert und dann als inserts dieses Plasmids sequenziert. (Alle Sequenzierungen wurden von der Firma GENterprise durchgeführt). Übereinstimmungen mit HCMVMIE-Exon-Sequenzen sind blau, mit dem ersten HCMV-MIE-Intron orange und mit der für VSV-G
codierenden Sequenz grün unterlegt. Die Sequenz-Motive für die 5’-Spleißstellen sind rot, für die 3’Spleißstellen schwarz und für die Verzweigungsstellen grün unterstrichen [99].
Zur eindeutigen Identifizierung der Banden in Abb. 3-7 wurden die 0,3 kb großen Amplifikate
direkt nach Isolation aus einem Agarose-Gel und die 0,7 und 1,1 kb großen Amplifikate nach
TA-Klonierung sequenziert und die Sequenzen hinsichtlich Spleiß- und Verzweigungsstellen
analysiert (s. Abb. 3-8)..
3 Ergebnisse
3.2.3
48
Deletion weiterer HCMV-Sequenzen aus der VSV-G-Expressionskassette
Von pCI-GΔI transkribierte VSV-G-mRNA enthält in der 5’UTR eine 138 Basen umfassende
aus HCMV-MIE-Exonen stammende Sequenz, die nicht notwendigerweise in ihrer ganzen
Länge für die positive Wirkung auf die VSV-G Expression unerlässlich ist. Verzichtbare Sequenzanteile sollten in einem nächsten Schritt herausgefiltert und entfernt werden.
Dazu wurde zunächst die Sekundär-Struktur der HCMV-MIE-5’UTR mit Hilfe des Programms RNA-Fold vorhergesagt (s. Abb. 3-9) [100,101]. Ein Bereich von 32 Nukleotiden
zeigte bei der Berechnungen eine Stemloop-Struktur, an deren Spitze sich die Spleißstelle
befindet; diese Struktur mit einer Änderung der freien Enthalpie von ΔG = - 42 kJ/mol bildet
sich laut Berechnung nicht aus, wenn das Intron noch enthalten ist.
Abb. 3-9. Sekundärstruktur-Vorhersage der
HCMV-MIE-5’-UTR.
– A: 5’-Nichttranslatierte-Region (UTR) ohne Intron. B: 5’UTR mit HCMV-Intron. Türkis: Exon 1 5’ des
stemloops, Violett: Exon 1 im stemloop, Orange: HCMV-Intron, Blau: Exon 2. Die Strukturen
wurden mit dem Programm „RNAfold“ berechnet [100,101].
Zur Überprüfung der Entbehrlichkeit dieser Struktur für die VSV-G-Expression wurden die
Plasmide pCI-GΔIΔSL und pCSL-G konstruiert, die im Unterschied zu pCI-GΔI von den
HCMV-Sequenzen in der 5’UTR gerade die stemloop bildende Sequenz nicht (pCI-GΔIΔSL)
bzw. nur noch die stemloop bildende Sequenz (pCSL-G) enthalten (s. Abb. 3-10 A).
3 Ergebnisse
49
Die Deletion der stemloop bildenden Sequenz aus pCI-GΔI reduzierte den Titer der entsprechend pseudotypisierten SIV-Vektoren von (2,3 ± 0,3) ×106 GFU/ml auf etwa die Hälfte
((1,2 ± 0,1) × 106 GFU/ml), während die Deletion der Sequenz 5’ der stemloop bildenden
Sequenz den Titer um den Faktor 23 auf (1,0 ± 0,1) × 105 GFU/ml reduzierten; dieser mittels
pCSL-G erzielte Titer war allerdings immer noch 10fach höher als der mittels pCD-G erhaltene ((1,0 ± 0,4) × 104 GFU/ml) (s. Abb. 3-10 B).
Abb. 3-10. Pseudotypisierungseffizienz nach Deletion von HCMV Sequenzen aus der 5’UTR. –
A: Schematische Darstellung der 5’UTR der angegebenen VSV-G-Expressionsplasmide. Türkis:
HCMV-MIE-Exon-1-Sequenzen 5’ des vorhergesagten stemloops, violett: HCMV-MIE-Exon-1Sequenzen im stemloop, blau: HCMV-MIE-Exon-2-Sequenzen, gelb: pCDNA3.1(+)-Sequenzen, grau:
KOZAK-Sequenz. B: Zur Produktion lentiviraler Vektoren wurden 293T-Zellen mit 5 µg ViCGΔBH
(SIV-Vektor-Konstrukt), 5 µg SgpΔ2 (SIV-gag-pol-Expressionsplasmid) und 2 µg des angegebenen
VSV-G-Expressionsplasmids cotransfiziert. Die Titer der lentiviralen Vektoren wurden als grüneFluoreszenz-bildende Einheiten pro ml (GFU/ml) auf 293A-Zellen bestimmt. Gezeigt sind Mittelwert
und Standardabweichung aus drei Experimenten. Kontrollexperimente ohne VSV-GExpressionsplasmid lieferten Titer < 5 GFU/ml (nicht dargestellt).
In Übereinstimmung damit konnten durch Westernblot-Analyse der Lysate von 293T-Zellen,
die pseudotypisierte SIV-Vektoren produzierten, und Northernblot-Analyse der mRNA aus
293T-Zellen, die pseudotypisierte SIV-Vektoren produzierten, die mittels eines HIV-gag-polExpressionsplasmids verpackt worden waren, in der pCSL-G Probe kein VSV-G-Protein bzw.
keine VSV-G-mRNA nachgewiesen werden, während die Nachweise für die pCI-GΔI- und
pCI-GΔIΔSL-Proben gelangen (s. Abb. 3-11).
3 Ergebnisse
50
Abb. 3-11. Western- und Northernblot-Analyse nach Deletion von HCMV-Sequenzen aus der
5’UTR. – A: Westernblot-Analyse. 293T-Zellen wurden mit 5 µg ViCGΔBH (SIV-VektorKonstrukt), 5 µg SgpΔ2 (SIV-gag-pol-Expressionsplasmid) und 2 µg des angegebenen VSV-GExpressionsplasmids cotransfiziert. Die Lysate dieser Zellen wurden einer Westernblot-Analyse unter
Verwendung monoklonaler Antikörper gegen VSV-G und HIV-1 p24 unterzogen. CA: Capsidprotein.
B: Northernblot-Analyse. 293T-Zellen wurden mit ViCGΔBH (SIV-Vektorkonstrukt), Hgpsyn (HIV-1gag-pol-Expressionsplasmid) und dem angegebenen VSV-G-Expressionsplasmid cotransfiziert. Die
nach zwei Tagen aus den transfizierten Zellen isolierte mRNA wurde einer Northernblot-Analyse
unterzogen. Die DNA-Sonde war gegen die 130 b 5’ des AAUAAA-Motivs des RinderPolyadenylierungssignals in den gag-pol- und VSV-G-Transkripten gerichtet.
3.3 Einfluss von Codonoptimierung auf die Expression
3.3.1
Erste Konstrukte mit codonoptimierter Sequenz für VSV-G
Es wurde untersucht, ob durch Codonoptimierung der für VSV-G codierenden Sequenz auch
unter völligem Verzicht von HCMV-Sequenzen in der 5’ nicht translatierten Region der
VSV-G-mRNA eine gute Expression des VSV-G-Proteins möglich ist.
Dazu wurde von Prof. Dr. Ralf Wagner die codonoptimierte DNA für VSV-G entsprechend
der im Genbankeintrag J02428 veröffentlichten Aminosäure-Sequenz des VSV-G synthetisiert und zur Konstruktion des Plasmids pCD-Gsyn in pcDNA3.1(+) kloniert (s. Abb. 3-12).
3 Ergebnisse
51
Für Kontroll-Experimente wurden das erste Intron und die flankierenden nicht translatierten
Exon-Sequenzen der HCMV-major-immediate-early-Gene aus pHIT-G in pCD-Gsyn zwischen
HCMV-Promotor und der für VSV-G codierenden Sequenz kloniert und so das Plasmid pCIGsyn erzeugt (s. Abb. 3-12).
Abb. 3-12. Expressionskassetten der VSV-G-Expressionsplasmide pCD-G, pCD-Gsyn, pCI-G und
pCI-Gsyn (schematische Darstellung). – HCMV-Promotor: Promotor/Enhancer-Region der Majorimmediate-early-Gene (MIE-Gene) des humanen Cytomegalievirus; Ex 1: HCMV-MIE-Exon 1; Ex 2:
nicht translatiertes 5’-Ende des HCMV-MIE-Exons 2; Intron: erstes HCMV-MIE-Intron; VSV-G:
codierende Sequenz für das Glykoprotein G des Vesicular-Stomatitis-Virus; VSV-Gsyn: nach Genbankeintrag J02428 codonoptimierte codierende Sequenz für das VSV-G-Protein; BGH pAd: Polyadenylierungssignal des Rinder-Wachstumshormons.
Es wurden SIV-Vektoren hergestellt, bei deren VSV-G-Pseudotypisierung eines der Plasmide
pCD-G, pCD-Gsyn, pCI-G oder pCI-Gsyn eingesetzt wurde. Die Abb. 3-13 A zeigt, dass die
Titer der mittels pCD-G (220 GFU/ml), pCD-Gsyn (1,1 × 103 GFU/ml) und pCI-Gsyn
(2,0 × 103 GFU/ml) pseudotypisierten Vektoren alle um zwei bis drei Zehnerpotenzen niedriger lagen als die Titer der mittels pCI-G (5,7 × 105 GFU/ml) pseudotypisierten Vektoren. Da
sogar pCI-Gsyn keine hohen Titer lieferte, wurde die VSV-Gsyn-Expression durch WesternblotAnalyse von Zell-Lysaten und Virus-Partikeln untersucht (s. Abb. 3-13 B). So konnte in Lysaten von SIV-Vektoren produzierenden 293T-Zellen, sowohl durch pCI-G als auch durch pCIGsyn exprimiertes VSV-G nachgewiesen werden. In den produzierten Vektoren konnte VSVG nur dann nachgewiesen werden, wenn sie mittels pCI-G nicht aber mittels pCI-Gsyn pseudotypisiert waren.
3 Ergebnisse
52
Abb. 3-13. Pseudotypisierungseffizienz und VSV-G-Expressionsvermögen der Plasmide pCDGsyn und pCI-Gsyn. – Durch Cotransfektion von 293T-Zellen mit 5 µg des SIV-Vektor-Plasmids
ViCGΔBH, 5 µg des SIV-gag-pol-Expressionsplasmids SgpΔ2 und 0,5 µg des angegebenen VSV-GExpressionsplasmids wurden lentivirale Vektoren produziert. A: Die Titer der Vektoren wurden als
grüne-Fluoreszenz-bildende Einheiten pro ml (GFU/ml) auf 293A-Zellen bestimmt. Ein Kontrollexperiment ohne VSV-G-Expressionsplasmid lieferte einen Titer < 5 GFU/ml (nicht dargestellt). B: Nach
72 h wurden die Vektor produzierenden Zellen lysiert und die Viruspartikel aus den ZellkulturÜberständen sedimentiert. Bei der anschließenden Westernblot-Analyse wurden monoklonale Antikörper gegen VSV-G und HIV-1 p24 zur Immunodetektion eingesetzt. CA: Capsidprotein.
3.3.2
VSV-Gsyn-G-Fusions-RNA
Um auszuschließen, dass für die korrekte Expression und Lokalisation des VSV-G-Proteins
bedeutsame RNA-Elemente durch die vorgenommene Codonoptimierung entfernt wurden
und deshalb die Pseudotypisierungseffizienz des Plasmids pCI-Gsyn wie oben beschrieben
unerwartet niedrig ausfiel, wurde die für VSV-G codierende Wildtyp-Sequenz hinter die codonoptimierte Sequenz kloniert und dabei das Start-Codon der Wildtyp-Sequenz mutiert, so
dass bei Transkription von diesem Konstrukt eine VSV-Gsyn-G-Fusions-RNA entsteht, von
der nur die codonoptimierte Sequenz translatiert wird (s. Abb. 3-14 A). Das so erhaltene
pCI-Gsyn-G
führte
bei
Einsatz
zur
Pseudotypisierung
von
SIV-Vektoren
mit
(2,1 ± 0,4) × 103 GFU/ml zu keinen höheren Titern als pCI-Gsyn (2,4 ± 0,1 × 103 GFU/ml) (s.
Abb. 3-14 B).
3 Ergebnisse
53
Abb. 3-14. Einfluss regulatorischer Elemente innerhalb der für VSV-G codierenden Sequenz auf
die Pseudotypisierungseffizienz. – A: Schematische Darstellung der Expressionskassette des
pCI-Gsyn-G. B: Durch Cotransfektion von 293T-Zellen mit 5 µg des SIV-Vektor-Plasmids ViCGΔBH,
5 µg des SIV-gag-pol-Expressionsplasmids SgpΔ2 und 1 µg des angegebenen VSV-G-Expressionsplasmids wurden lentivirale Vektoren produziert und deren Titer als grüne-Fluoreszenz-bildende Einheiten pro ml (GFU/ml) auf 293A-Zellen bestimmt. Gezeigt sind Mittelwert und Standardabweichung
aus drei Experimenten. Kontrollexperimente ohne VSV-G-Expressionsplasmid lieferten Titer < 5
GFU/ml (nicht dargestellt).
3.3.3
Sequenz-Analyse der Wildtyp-VSV-G-DNA aus pCI-G
Um die Ursache für das Mißlingen der Pseudotypisierung mittels pCI-Gsyn zu finden, wurde
die Aminosäure-Sequenz des VSV-Gsyn mit der des verwendeten Wildtyp-VSV-G verglichen.
Dazu wurde die Wildtyp-VSV-G-DNA aus pCI-G in Zusammenarbeit mit Dr. Dennis Hoffmann sequenziert und die erhaltene Sequenz in die entsprechende Aminosäure-Sequenz übersetzt. Der Vergleich dieser Sequenz mit der, auf der die Codonoptimierung beruhte, zeigt
zwei Unterschiede auf (s. Abb. 3-15): An Position 57 befindet sich in VSV-Gsyn ein Isoleucin
statt eines Leucins und an Position 96 ein Glutamin statt eines Histidins.
3 Ergebnisse
54
VSV-G
VSV-Gsyn
1
60
MKCLLYLAFLFIGVNCKFTIVFPHNQKGNWKNVPSNYHYCPSSSDLNWHNDLIGTALQVK
MKCLLYLAFLFIGVNCKFTIVFPHNQKGNWKNVPSNYHYCPSSSDLNWHNDLIGTAIQVK
VSV-G
VSV-Gsyn
61
120
MPKSHKAIQADGWMCHASKWVTTCDFRWYGPKYITHSIRSFTPSVEQCKESIEQTKQGTW
MPKSHKAIQADGWMCHASKWVTTCDFRWYGPKYITQSIRSFTPSVEQCKESIEQTKQGTW
VSV-G
VSV-Gsyn
121
180
LNPGFPPQSCGYATVTDAEAVIVQVTPHHVLVDEYTGEWVDSQFINGKCSNYICPTVHNS
LNPGFPPQSCGYATVTDAEAVIVQVTPHHVLVDEYTGEWVDSQFINGKCSNYICPTVHNS
VSV-G
VSV-Gsyn
181
240
TTWHSDYKVKGLCDSNLISMDITFFSEDGELSSLGKEGTGFRSNYFAYETGGKACKMQYC
TTWHSDYKVKGLCDSNLISMDITFFSEDGELSSLGKEGTGFRSNYFAYETGGKACKMQYC
VSV-G
VSV-Gsyn
241
300
KHWGVRLPSGVWFEMADKDLFAAARFPECPEGSSISAPSQTSVDVSLIQDVERILDYSLC
KHWGVRLPSGVWFEMADKDLFAAARFPECPEGSSISAPSQTSVDVSLIQDVERILDYSLC
VSV-G
VSV-Gsyn
301
360
QETWSKIRAGLPISPVDLSYLAPKNPGTGPAFTIINGTLKYFETRYIRVDIAAPILSRMV
QETWSKIRAGLPISPVDLSYLAPKNPGTGPAFTIINGTLKYFETRYIRVDIAAPILSRMV
VSV-G
VSV-Gsyn
361
420
GMISGTTTERELWDDWAPYEDVEIGPNGVLRTSSGYKFPLYMIGHGMLDSDLHLSSKAQV
GMISGTTTERELWDDWAPYEDVEIGPNGVLRTSSGYKFPLYMIGHGMLDSDLHLSSKAQV
VSV-G
VSV-Gsyn
421
480
FEHPHIQDAASQLPDDESLFFGDTGLSKNPIELVEGWFSSWKSSIASFFFIIGLIIGLFL
FEHPHIQDAASQLPDDESLFFGDTGLSKNPIELVEGWFSSWKSSIASFFFIIGLIIGLFL
VSV-G
VSV-Gsyn
481
511
VLRVGIHLCIKLKHTKKRQIYTDIEMNRLGK
VLRVGIHLCIKLKHTKKRQIYTDIEMNRLGK
Abb. 3-15. Aminosäure-Sequenzvergleich zwischen VSV-G und VSV-Gsyn. – Die angegebene Aminosäuresequenz des VSV-G ist eine Übersetzung des DNA-Sequenzierungs-Resultats. Die Aminosäuresequenz des VSV-Gsyn entspricht dem Genbankeintrag J02428 und wurde so bei der Codonoptimierung zugrunde gelegt. Unterschiede der Sequenzen sind orange markiert.
3.3.4
Korrektur der codonoptimierten VSV-G-Sequenz
Die codonoptimierte VSV-G-Sequenz wurde so verändert, dass sie für ein Protein mit tatsächlich identischer Sequenz zum verwendetetn Wildtyp-VSV-G codiert. Zunächst wurde untersucht, ob diese Veränderung der codonoptimierten VSV-G-Sequenz eine Pseudotypisierung
wieder möglich macht. Folglich wurde mittels PCR-Mutagenese-Methoden in pCI-Gsyn das
Codon ATC für Isoleucin an Position 169 der VSV-Gsyn-Sequenz gegen CTG für Leucin und
das Codon CAG für Glutamin an Position 286 der VSV-Gsyn-Sequenz gegen CAC für Hisitidin ausgetauscht und so pCI-Gopt konstruiert (s. Abb. 3-16).
3 Ergebnisse
55
Abb. 3-16. Expressionskassetten der VSV-G-Expressionsplasmide pCI-Gsyn, pCI-Gopt und pCDGopt (schematische Darstellung). – HCMV-Promotor: Promotor/Enhancer-Region der Majorimmediate-early-Gene (MIE-Gene) des humanen Cytomegalievirus; Ex 1: HCMV-MIE-Exon 1; Ex 2:
nicht translatiertes 5’-Ende des HCMV-MIE-Exons 2; Intron: erstes HCMV-MIE-Intron; VSV-Gsyn:
nach Genbankeintrag J02428 codonoptimierte codierende Sequenz für das VSV-G-Protein; VSV-Gopt:
mutierte VSV-Gsyn-DNA-Sequenz (rote Sternchen symbolisieren Mutationen); BGH pAd: Polyadenylierungssignal des Rinder-Wachstumshormons.
Im Gegensatz zu mittels pCI-Gsyn pseudotypisierten SIV-Vektoren ((3,6 ± 2,3) × 103 GFU/ml)
konnten die Vektoren mittels pCI-Gopt genau so effizient pseudotypisiert werden wie mittels
pCI-G ((3,2 ± 1,3) × 105 GFU/ml bzw. (4,3 ± 1,3) × 105 GFU/ml) (s. Abb. 3-17 A).
Abb. 3-17. VSV-G-Expression mittels pCI-Gopt. – Zur Produktion lentiviraler Vektoren wurden
293T-Zellen mit 5 µg ViCGΔBH (SIV-Vektor-Konstrukt), 5 µg SgpΔ2 (SIV-gag-polExpressionsplasmid) und 1 µg (A) bzw. 2 µg (B) des angegebenen VSV-G-Expressionsplasmids
cotransfiziert. A: Die Titer der Vektoren wurden als grüne-Fluoreszenz-bildende Einheiten pro ml
(GFU/ml) auf 293A-Zellen bestimmt. Gezeigt sind Mittelwert und Standardabweichung aus drei Experimenten. Kontrollexperimente ohne VSV-G-Expressionsplasmid lieferten Titer < 5 GFU/ml (nicht
dargestellt). B: Die transfizierten Zellen wurden lysiert und einer Westernblot-Analyse unter Verwendung monoklonaler Antikörper gegen VSV-G und HIV-1 p24 unterzogen. CA: Capsidprotein.
3 Ergebnisse
56
In Lysaten von 293T-Zellen, die pseudotypisierte SIV-Vektoren produzierten, wurde durch
Westernblot-Analyse etwas weniger aus pCI-Gopt als aus pCI-G resultierendes VSV-G-Protein
nachgewiesen (s. Abb. 3-17 B), während dagegen durch Northernblot-Analyse von 293TZellen, die SIV-Vektoren produzierten, die unter Verwendung eines HIV-gag-polExpressionsplasmids verpackt und mittels pCI-Gopt oder pCI-G pseudotypisiert waren, im
Verhältnis zur gag-pol-RNA doppelt so viel von pCI-Gopt wie von pCI-G stammende VSV-GmRNA nachgewiesen wurde (s. Abb. 3-18).
Abb. 3-18. pCI-Gopt: Nachweis von VSV-G-mRNA. – A: Aus mit ViCGΔBH (SIVVektorkonstrukt), Hgpsyn (HIV-1-gag-pol-Expressionsplasmid) und dem angegebenen VSV-GExpressionsplasmid cotransfizierten 293T-Zellen wurde zwei Tage nach Transfektion die mRNA isoliert und diese einer Northernblot-Analyse unterzogen. Die DNA-Sonde war gegen die 130 b 5’ des
AAUAAA- Motivs des Rinder-Polyadenylierungssignals in den gag-pol- und VSV-G-Transkripten
gerichtet. B: Von der Intensität der Banden wurde die Intensität des Hintergrundes der jeweiligen
Bahn subtrahiert und die so bereinigten VSV-G-Banden-Intensitäten zu den bereinigten gag-polBanden-Intensitäten ins Verhältnis gesetzt.
Zur Untersuchung des Effektes, der einzig auf die Codonoptimierung der für VSV-G codierenden Sequenz beruht, wurde pCD-Gopt konstruiert (s. Abb. 3-16); dazu wurde die nicht optimierte Sequenz für VSV-G in pCD-G gegen die VSV-Gopt-Sequenz aus pCI-Gopt ausgetauscht. Die Pseudotypisierungseffizienzen der Plasmide pCI-G, pCI-GΔI und pCD-Gopt liegen in derselben Größenordnung: die Titer von SIV-Vektoren, die mittels eines HIV-1-gagpol-Expressionsplasmids verpackt und mittels eines der VSV-G-Expressionsplasmide pCI-G,
pCI-GΔI oder pCD-Gopt pseudotypisiert worden waren, lagen bei (4,3 ± 0,9) × 105,
3 Ergebnisse
57
(2,0 ± 0,5) × 105 und (1,3 ± 0,2) × 105 GFU/ml, während die mittels pCD-G pseudotypisierter
Vektoren bei (790 ± 130) GFU/ml lagen (s. Abb. 3-19 A).
Abb. 3-19: VSV-G-Expression mittels pCD-Gopt. – A: Zur Produktion lentiviraler Vektoren wurden
293T-Zellen mit 5 µg ViCGΔBH (SIV-Vektor-Konstrukt), 5 µg Hgpsyn (HIV-1-gag-polExpressionsplasmid) und 2 µg des angegebenen VSV-G-Expressionsplasmids cotransfiziert. Die Titer
der Vektoren wurden als grüne-Fluoreszenz-bildende Einheiten pro ml (GFU/ml) auf 293A-Zellen
bestimmt. Gezeigt sind Mittelwert und Standardabweichung aus drei Experimenten. Kontrollexperimente ohne VSV-G-Expressionsplasmid lieferten Titer < 5 GFU/ml (nicht dargestellt). B: 293TZellen wurden mit 5 µg ViCGΔBH (SIV-Vektor-Konstrukt), 5 µg SgpΔ2 (SIV-gag-polExpressionsplasmid) und 2 µg des angegebenen VSV-G-Expressionsplasmids cotransfiziert. Die
transfizierten Zellen wurden lysiert und einer Westernblot-Analyse unter Verwendung monoklonaler
Antikörper gegen VSV-G und HIV-1 p24 unterzogen. CA: Capsidprotein. C: 293T-Zellen wurden mit
ViCGΔBH (SIV-Vektorkonstrukt), Hgpsyn (HIV-1-gag-pol-Expressionsplasmid) und dem angegebenen VSV-G-Expressionsplasmid cotransfiziert. Die nach zwei Tagen aus den transfizierten Zellen
isolierte mRNA wurde einer Northernblot-Analyse unterzogen. Die DNA-Sonde war gegen die 130 b
5’ des AAUAAA- Motivs des Rinder-Polyadenylierungssignals in den gag-pol- und VSV-GTranskripten gerichtet.
3 Ergebnisse
58
Außerdem konnte in Lysaten von 293T-Zellen, die SIV-Vektoren produzierten, welche mittels pCD-Gopt oder pCI-G pseudotypisiert worden waren, bzw. in der mRNA von 293TZellen, die SIV-Vektoren produzierten, die mittels eines HIV-1-gag-pol-Expressionsplasmids
verpackt und mittels pCD-Gopt oder pCI-G pseudotypisiert worden waren, durch Westernbzw. Northernblot-Analyse VSV-G-Protein bzw. -mRNA nachgewiesen werden – aus pCD-G
resultierende VSV-G-mRNA bzw. resultierendes -Protein konnte im Gegensatz dazu nicht
nachgewiesen werden (s. Abb. 3-19).
3.3.5
Kombination von HCMV-MIE-5’-UTR mit codonoptimierter VSV-G-Sequenz
Zuletzt wurde geprüft, ob codonoptimierte Konstrukte, die zusätzlich die unter 3.1 und 3.2
beschriebenen HCMV-Sequenzen enthalten, besser zur Pseudotypisierung geeignet sind als
Konstrukte, die entweder nur die codonoptimierte VSV-G-Sequenz ohne HCMV-Sequenzen
in der 5’-UTR oder diese HCMV-Sequenzen in Verbindung mit der Wildtyp-VSV-G-Sequenz
enthalten. Dazu wurden pCI-G, pCD-Gopt und pCI-Gopt miteinander verglichen.
Da nur geringe Unterschiede in der Pseudotypisierungseffizienz erwartet wurden, wurde diese
in Abhängigkeit unterschiedlicher transfizierter Mengen dieser Konstrukte betrachtet. Es
wurden die Titer von HIV-1-Vektoren bestimmt, die unter Verwendung von 0,03, 0,1, 0,3
oder 1 µg der Plasmide pCI-G, pCD-Gopt oder pCI-Gopt pseudotypisiert worden waren
(s. Abb. 3-20 A).
Bei der Produktion der HIV-1-Vektoren wurde auch das Expressionsplasmid für die Sekretierte Alkalische Phosphatase (SEAP) cotransfiziert, welches üblicherweise zum Vergleich
von Transfektionseffizienzen eingesetzt wird, und die SEAP in den Vektorpräparaten durch
eine Chemilumineszenz-Reaktion quantifiziert. Die dabei gemessene relative Licht-Einheit
pro Sekunde (RLU/s) ist ein Maß für die SEAP-Aktivität im Vektorpräparat (s. Abb. 3-20 B).
3 Ergebnisse
59
Abb.
3-20.
Dosisabhängigkeit
der
Pseudotypisierungseffizienzen
der
VSV-GExpressionsplasmide pCI-G, pCD-Gopt und pCI-Gopt. – Zur Produktion lentiviraler Vektoren wurden 293T-Zellen mit 5 µg HIV-CS-CG (HIV-1-Vektor-Konstrukt), 5 µg Hgpsyn (HIV-1-gag-polExpressionsplasmid), 2 µg pcTat, 2 µg pcRev (Tat- und Rev-Expressions-plasmide), der angegebenen
Menge des angegebenen VSV-G-Expressionsplasmids und 0,1 µg pSEAP (Sekretierte-AlkalischePhosphatase-Expressionsplasmid) cotransfiziert. A: Die Titer der Vektoren wurden als grüneFluoreszenz-bildende Einheiten pro ml (GFU/ml) auf 293A-Zellen bestimmt. Kontrollexperimente
ohne VSV-G-Expressionsplasmid lieferten Titer < 5 GFU/ml (nicht dargestellt). B: Die SEAP in den
Vektorpräparaten wurde durch eine Chemilumineszenz-Reaktion quantifiziert. RLU: Relative LichtEinheit. Gezeigt sind Mittelwert und Standardabweichung aus drei Experimenten. *: Mittelwert und
Standardabweichung aus zwei Experimenten.
4 Diskussion
4.1 Intronunabhängige Expression von VSV-G
Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit zeigen, dass es möglich ist, VSV-G unter Verwendung des HCMV-major-immediate-early-(MIE)-Promotors auch ohne das erste Intron der
HCMV-MIE-Gene effizient zu exprimieren und zur Pseudotypisierung von SIV-, HIV-1- sowie SIV-Vektoren, die mit Hilfe eines HIV-1 gag-pol-Expressionsplasmids verpackt wurden,
einzusetzen. Das Intron mit flankierenden nicht translatierten exonischen HCMV Sequenzen –
insgesamt 965 Nukleotide – kann auf die ersten 106 Nukleotide des ersten Exons der HCMVMIE-Gene reduziert werden, um einen vergleichbaren Effekt zu erzielen. Auf HCMVSequenzen in der 5’-UTR kann völlig verzichtet werden, wenn statt der Wildtyp-VSV-GSequenz eine codonoptimierte Sequenz eingesetzt wird.
4.2 Das HCMV-MIE-Intron und Spleißen als Expressionsverstärker
In der vorliegenden Arbeit wurde der Effekt des ersten HCMV-MIE-Introns auf die HCMVMIE-Promotor/Enhancer gesteuerte Expression des Glykoproteins G des Vesicular-Stomatitis-Virus und auf die Effizienz, mit der lentivirale Vektoren VSV-G-pseudotypisiert werden,
untersucht. Diese Untersuchungen wurden ausgehend vom Plasmid pHIT-G mit
pCDNA3.1(+)-basierten VSV-G-Expressionsplasmiden durchgeführt.
Dem pHIT-G entspricht das pCDNA3.1(+)-basierte Plasmid pCI-G: Bis auf die 3’-UTR und
das Polyadenylierungssignal stimmen die Expressionskassetten überein (s. Abb. 3-1), die
Westernblot-Analyse der Lysate entsprechend transfizierter 293T-Zellen zeigt keine Unterschiede im VSV-G-Expressionsvermögen (s. Abb. 3-2 B), und Lentiviren können mit beiden
Plasmiden gleich gut pseudotypisiert werden (s. Abb. 3-2 A). pHIT-G enthält die 5’-UTR der
HCMV-MIE-Gene mitsamt des ersten Introns [91,92], da gezeigt wurde, dass dieses Intron
die heterologe Expression in Säugerzellen positiv regulieren kann: Chapman et al. haben die
HCMV-Promotor getriebene Expression des Gewebe-Plasminogenaktivators, des humanen
Gerinnungsfaktors VIII und des HIV-gp120 jeweils mit und ohne HCMV-Intron in der
4 Diskussion
61
5’-UTR verglichen, dabei wurde für die beiden letztgenannten Glykoproteine ohne das Intron
eine Expressionsstärke von 74 % bzw. 2 % der Expressionsstärke mit Intron erhalten, für das
erstgenannte Glykoprotein ergab sich kein Unterschied in den Expressionsstärken [61].
Innerhalb dieser Spanne liegen auch die hier präsentierten Ergebnisse: Die Pseudotypisierungseffizienz des pCI-GΔI (ohne Intron, s. Abb. 3-4) beträgt 46 % der des pCI-G (mit Intron,
s. Abb. 3-4) und es wird laut Westernblot-Analyse durch pCI-GΔI etwas weniger VSV-G
exprimiert als durch pCI-G (s. Abb. 3-5). Dieser Unterschied zeigt sich bereits prätranslational: Aus pCI-GΔI resultieren im Verhältnis zur gag-pol-RNA 58 % der VSV-G-mRNA, die
aus pCI-G resultieren (s. Abb. 3-6). Es wird also auch für das hier verwendete Expressionssystem bestätigt, dass das erste HCMV-MIE-Intron die durch den HCMV-MIEPromotor/Enhancer gesteuerte Expression positiv reguliert und dass diese Regulation vor der
Translation erfolgt. Diese Wirkung des Introns beruht auf einer in dem Intron enthaltenen
Enhancer-Sequenz, die der Enhancer-Sequenz im ersten Intron des Gens für Troponin I der
Wachtel homolog ist [61,81].
Die Verwendung des ersten HCMV-MIE-Introns in VSV-G-Expressionsplasmiden, die zur
Pseudotypisierung lentiviraler Vektoren eingesetzt werden, wird an dieser Stelle als durchaus
entbehrlich eingestuft. Ein Vektortiter, der um die Hälfte reduziert ist und sich noch in derselben Größendordnung befindet, ist immer noch sehr gut. Ist es etwa. erforderlich, die VSV-GExpressionskassette in ein Gefüge zu klonieren, in dem der Platz beschränkt ist, so kann ohne
große Verluste in der Pseudotypisierungseffizienz auf die 827 bp umfassende Intron-Sequenz
verzichtet werden.
Im Gegensatz dazu führt der Verzicht auf die verbleibenden exonischen Sequenzen der
HCMV-MIE-5’-UTR in VSV-G-Expressionsplasmiden zu einer drastischen Reduktion des
Titers der lentiviralen Vektoren, die mittels dieser Plasmide pseudotypisiert wurden. Die
Pseudotypisierungseffizienz des pCD-G (keine HCMV-MIE-Sequenzen in der 5’-UTR, s.
Abb. 3-4) beträgt nur 0,4 % der des pCI-GΔI (s. Abb. 3-5 A). Weniger drastisch ist der Unterschied zwar auf mRNA-Ebene – im Verhältnis zur gag-pol-RNA ergeben sich aus pCD-G
10 % der VSV-G-mRNA, die sich aus pCI-GΔI ergeben (s. Abb. 3-6). Durch pCD-G exprimiertes VSV-G-Protein konnte jedoch durch Westernblot-Analyse nicht nachgewiesen werden (s. Abb. 3-5 B).
Nun wäre denkbar, dass in pCI-GΔI kryptische Spleißstellen aktiviert wurden [102]. Dann
würden der herausragenden VSV-G-Expression mittels pCI-GΔI die gleichen Mechanismen
zugrunde liegen wie der mittels pCI-G. Daher wurde die gesamte RNA entsprechend transfi-
4 Diskussion
62
zierter Zellen hinsichtlich VSV-G-Primär-Transkripte und Spleißprodukte untersucht. Die
RT-PCR vom Transkriptionsstart bis zur 132. Base der für VSV-G codierenden Sequenz erbringt für die pCI-GΔI-Probe nur ein einziges 302 bp umfassendes Amplifikat, das sich auch
in der pCI-G-Probe wieder findet (s. Abb 3-7). Dies ist der Nachweis für das aus pCI-GΔI
resultierende Primärtranskript und die aus pCI-G resultierende regulär gespleißte VSV-GmRNA und wird auch durch die Sequenzanalyse der Amplifikate bestätigt (s. Abb. 3-8). Da
die RT-PCR der pCI-GΔI-Probe keine weiteren Amplifikate erzeugt, läßt sich folgern, dass
das aus pCI-GΔI resultierende Transkript tatsächlich nicht gespleißt wird. Es sind also andere
Mechanismen für die im Vergleich zu pCD-G überragende VSV-G-Expression durch pCIGΔI verantwortlich als durch Introns und Spleißen bewirkte.
Somit ist auch die expressionsfördernde Wirkung der vollständigen, aus Exon- und Intronsequenzen bestehenden HCMV-MIE-5’-UTR – wie sie im Plasmid pCI-G vorliegt – überwiegend auf die Exons und nur mäßig auf das Intron zurückzuführen.
Für pCI-G wurde neben dem regulären Spleißprodukt durch ein 1,13 kb grosses Amplifikat
das Primärtranskript und durch ein 713 bp grosses Amplifikat in geringen Mengen eine weitere, nicht erwartete RNA nachgewiesen (s. Abb. 3-7). Aus der erhaltenen Sequenz des unerwarteten Amplifikats (s. Abb. 3-8) läßt sich schließen, dass es sich um ein – bisher noch nicht
beschriebenes – alternatives Spleißprodukt handelt und das erste HCMV-MIE-Intron demzufolge ein optionales Exon enthält [103]. Diese Schlußfolgerung wird auch dadurch gestützt,
dass die Sequenz an den entsprechenden Stellen die von Yeo et al. [99] beschriebenen Konsensussequenzen für die 5’- und 3’-Spleiß- sowie für die Verzweigungsstelle aufweist
(s. Abb. 3-8).
4.3 Exonische HCMV-Sequenzen in der 5’-UTR als Expressionsverstärker
Die HCMV-MIE-Exon-Sequenzen in der 5’-UTR der VSV-G-Expressionskassette, die die
oben beschriebene positive Regulation der Expression bewirken, können weiter eingeschränkt
und aufgegliedert werden. Die Sekundärstruktur-Vorhersage für die 5’-UTR in der mRNA
zeigt eine Stemloop-Struktur, die von 15 Nukleotiden des 3’-Endes des Exons 1 und von den
gesamten 17 Nukleotiden der nichttranslatierten Sequenz des Exons 2 gebildet wird; fast an
der Spitze dieser Struktur steht also die Fusionsstelle der beiden Exone (s. Abb. 3-9). Das
VSV-G-Expressionsplasmid pCSL-G enthält aus der HCMV-MIE-5’-UTR nur diese stemloop
4 Diskussion
63
bildende Sequenz (s. Abb. 3-10 A). Auch wenn der Nachweis der VSV-G-mRNA und des
Proteins nicht gelang (s. Abb. 3-11) und die Titer der lentiviralen Vektoren, die mit Hilfe dieses Plasmids pseudotypisiert wurden, nur 4 % der Titer der mit pCI-GΔI pseudotypisierten
Vektoren erreichen, so sind diese Titer immer noch 10mal höher als die der mit pCD-G pseudotypisierten Vektoren (s. Abb. 3-10 B). Das VSV-G-Expressionsplasmid pCI-GΔIΔSL enthält aus der HCMV-MIE-5’-UTR nur die Sequenz des Exons 1 5’ der stemloop bildenden
Sequenz (s. Abb. 3-10 A). Die aus diesem Plasmid resultierende VSV-G-mRNA und das Protein konnten nachgewiesen werden, die Titer der mit diesem Plasmid pseudotypisierten Vektoren erreichen 52 % der Titer der mit pCI-GΔI pseudotypisierten Vektoren.
Die stemloop bildende Sequenz hat folglich einen positiven Einfluss auf die VSV-GExpression, dieser ist aber vergleichsweise gering, so dass die Reduktion der HCMVSequenzen in der 5’-UTR auf die bloße stemloop bildende Sequenz für die effiziente Pseudotypisierung lentiviraler Vektoren nicht ausreicht. Da diese Sequenz eine Spleißstelle umspannt, resultiert sie aus pCI-G erst nach dem Spleißen der prä-mRNA, ihre Funktion entfaltet
sie also auch erst als gespleißte RNA. Regulatorische Elemente in nicht translatierten Regionen von mRNAs, wie z.B. (1) das Iron-responsive-Element (IRE) in der 5’- bzw. 3’-UTR der
mRNA der Ferritin-H- und -L-Kette bzw. des Transferrinrezeptors [104], (2) die Akut-Box
(AB) in der 5’-UTR der mRNA der Ferritin-H- und -L-Kette und des Amyloid Vorläuferproteins [105,106], (3) ein Translationsverstärker-Element in der 5’-UTR der humanen Hsp70
mRNA [107] und (4) die interne Ribosomeneintrittsstelle (IRES) in einigen viralen RNAs und
eukaryotischen mRNAs [108] sind bereits bekannt. Die positive Regulation der Expression
durch die in der vorliegenden Arbeit angeführte stemloop bildenden Sequenz sowie zugrunde
liegende Mechanismen sind jedoch bisher noch nicht beschrieben. Die vorhergesagte Stemloop-Struktur ist mit ΔG = - 42 kJ/mol etwas weniger stabil als die Stemloop-Struktur der Akut-Box der mRNA der Ferritin-L-Kette mit ΔG = - 67 kJ/mol [105]. Es sind weitere Experimente nötig, um zu klären, ob die Sekundärstruktur der RNA in diesem Sequenzabschnitt
tatsächlich von Bedeutung ist, sowie ob und welche zellulären Proteine an die StemloopStruktur in der 5’-UTR der mRNA binden.
Beinahe der gesamte VSV-G-Expressions-fördernde Effekt der exonischen nichttranslatierten
HCMV-MIE-Exon-Sequenzen kann mithin allein der Sequenz des Exons 1 5’ der stemloop
bildenden Sequenz zugeschrieben werden. In diesem Abschnitt liegt auch die von Ghazal und
Nelson beschriebene positive Transkriptions-Kontroll-Domäne, die wiederum eine Sequenz
4 Diskussion
64
enthält, die in Cytomegalieviren verschiedener Spezies konserviert ist und eine Bindestelle für
zwei Zellkernproteine darstellt [62].
Es fällt auf, dass die in der vorliegenden Arbeit durchgeführten Western- und Northernblots
bei der Untersuchung der unter der Verwendung der Plasmide pCD-G und pCSL-G gewonnenen Proben an ihre untere Nachweisgrenze gestoßen sind. Das erklärt die folgenden scheinbaren Widersprüche: (1) Obwohl für die genannten Proben kein VSV-G im Westernblot nachgewiesen wird, werden infektiöse, pseudotypisierte lentivirale Vektoren nachgewiesen
(s. Abb. 3-2, Abb. 3-5, Abb. 3-10 B, Abb. 3-11 A). (2) In Abb. 3-6 wird VSV-G-mRNA, die
sich aus pCD-G ergibt, nachgewiesen, in Abb. 3-3 dagegen nicht. (3) Obwohl die Verwendung von pCD-G zu 10fach niedrigeren Titern führt als die Verwendung von pCSL-G
(s. Abb. 3-10 B), kann aus pCI-G resultierende VSV-G-mRNA nachgewiesen werden
(s. Abb. 3-6), die aus pCSL-G resultierende jedoch nicht (s. Abb. 3-11 B).
4.4 Expression eines codonoptimierten, mutierten VSV-G
Das VSV-G-Protein, das durch die Sequenz codiert wird, die nach dem Genbankeintrag
J02428 codonoptimiert wurde, erwies sich als eine VSV-G-Mutante, bei der im Vergleich zur
Wildtyp-Aminosäuresequenz an der Position 57 Leucin gegen Isoleucin und an der Position
96 Histidin gegen Glutamin ausgetauscht ist (s. Abb. 3-15). Es wird zwar intrazellulär exprimiert, ist aber nicht für die Pseudotypisierung von lentiviralen Vektoren geeignet, weil es
nicht in ausreichender Menge in die Virushülle gelangt: Lentivirale Vektoren, die mit Hilfe
des Plasmids pCI-Gsyn pseudotypisiert sind, erreichen kaum 0,4 % der Titer, die mittels pCI-G
pseudotypisierte lentivirale Vektoren erreichen (s. Abb. 3-13 A). In Lysaten entsprechend
transfizierter 293T-Zellen kann sowohl das von pCI-G stammende Wildtyp- als auch das von
pCI-Gsyn stammende mutierte VSV-G durch Westernblot-Analyse nachgewiesen werden – das
mutierte VSV-G scheint sogar akkumulierter zu sein als das Wildtyp-VSV-G. In den untersuchten Viruspartikeln bleibt das mutierte VSV-G jedoch im Gegensatz zum Wildtyp-VSV-G
unter der Nachweisgrenze (s. Abb. 3-13 B). Das mutierte Protein wird also offensichtlich
exprimiert, aber wahrscheinlich nicht in dem Maße wie das Wildtyp-Protein zur Cytoplasmamembran transportiert und infolgedessen auch nur unzureichend in die Virushülle eingebaut.
4 Diskussion
65
Die Aminosäuresequenzen von mutiertem VSV-G und Wildtyp-VSV-G unterscheiden sich an
zwei Positionen, die Nukleinsäuresequenzen unterscheiden sich im vorliegenden Fall jedoch
im Mittel an jeder vierten Position, da für das Wildtyp-VSV-G eine Wildtyp-DNA codiert
und für das mutierte VSV-G eine codonoptimierte DNA. Führen nun die beiden Mutationen
der Aminosäuresequenz oder die vielen (stillen) Mutationen auf Nukleinsäureebene zu dem
mangelhaften Transport des VSV-G zur Plasmamembran?
Es wäre z. B. möglich, dass die Wildtyp-VSV-G-mRNA Signale für die Lokalisation der
mRNA enthält, ähnlich wie die zip codes, die bei lokalisierten mRNAs meist in der 3’-UTR
enthalten sind, und die Lokalisation der mRNA Voraussetzung ist für die richtige Lokalisation des resultierenden Proteins [109]. Dann müssten bei der Pseudotypisierung mit dem Konstrukt pCI-Gsyn-G ähnlich hohe lentivirale Vektor-Titer erzielt werden wie bei der Pseudotypisierung mit pCI-G bzw. deutlich höhere Titer als bei der Verwendung von pCI-Gsyn. In pCIGsyn-G ist die Wildtyp-VSV-G-Sequenz mit deletiertem Startcodon hinter die codonoptimierte
Sequenz – unter Erhalt des Stop-Codons der codonoptimierten Sequenz – eingefügt, so dass
aus dieser Fusions-DNA eine Fusions-RNA, aber weder ein Fusions-Protein noch ein Wildtyp-Protein entsteht. Die Titer der mit pCI-Gsyn-G pseudotypisierten Vektoren waren jedoch
genauso niedrig wie die der mit pCI-Gsyn pseudotypisierten.
Einen weiteren Befund, der gegen die Mutationen auf Nukleinsäureebene als Ursache für den
gestörten VSV-G-Transport zur Plasmamembran spricht, liefern Experimente mit dem
VSV-G-Expressionsplasmid pCI-Gopt, bei dem die VSV-Gsyn-Sequenz so verändert wurde,
dass es sich nach wie vor um eine codonoptimierte Sequenz handelt, die aber tatsächlich für
dieselbe Aminosäuresequenz codiert wie die Wildtyp-VSV-G-Sequenz: Mittels pCI-Gopt
pseudotypisierte lentivirale Vektoren erreichen im Gegensatz zu denen, die mittels pCI-Gsyn
pseudotypisiert sind, gleichhohe Titer wie mittels pCI-G pseudotypisierte Vektoren (s. Abb.
3-17 A). Außerdem zeigt die Westernblot-Analyse kein angereicherteres von pCI-Gopt als von
pCI-G stammendes VSV-G in den Zellen (s. Abb. 3-17 B). Es ist also mindestens eine der
beiden Mutationen in der Aminosäuresequenz des VSV-G, das aus pCI-Gsyn resultiert, die
eine effiziente Pseudotypisierung lentiviraler Vektoren mittels dieses Plasmids verhindert.
Die Aminosäuresequenz der VSV-G-Mutante entspricht der im Genbankeintrag J02428 wiedergegebenen Sequenz, die Rose und Gallione 1981 publiziert haben. Diese Sequenz war jedoch noch mit Unsicherheiten behaftet [110]. In einer Veröffentlichung derselben Autoren
aus dem Jahre 1985 findet sich eine korrigierte Sequenz für VSV-G desselben Virusstammes
(San Juan): hier ist nun an Position 96 die Aminosäure Histidin und nicht mehr Glutamin an-
4 Diskussion
66
gegeben, an Position 57 ist nach wie vor die Aminosäure Isoleucin genannt, andererseits sind
die VSV-G-Sequenzen anderer Virusstämme aufgeführt, die an der Position ein Leucin aufweisen, an anderen Stellen aber weiter abweichen [111]. Im Unterschied zu Rose und Gallione und in Übereinstimmung mit den Daten in der vorliegenden Arbeit fanden Bilsel und Nichol an der Position 57 der Aminosäuresequenz des VSV-G des Stammes San Juan die Aminosäure Leucin, allerdings weicht deren Sequenz wiederum an zwei anderen Stellen von der
von Rose und Gallione sowie von der Wildtyp-Sequenz in der vorliegenden Arbeit ab [33].
Da es sowohl VSV-Stämme gibt, deren Glykoprotein G an der Position 57 ein Leucin aufweist, als auch solche die eben dort ein Isoleucin tragen, aber keine mit einem Glutamin statt
eines Histidins an Position 96, ist die Akkumulation der VSV-G-Mutante in der Zelle auf die
Mutation an Position 96 zurückzuführen. Es ist bekannt, dass VSV-G-Mutanten, die gar nicht
oder wenig effektiv zur Plasmamembran transportiert werden und die Mutation wie die Mutante in der vorliegenden Arbeit in der Ectodomäne tragen, sich initial nicht richtig falten, infolgedessen nicht trimerisieren, im Endoplasmatischen Retikulum akkumulieren und aggregieren [112].
4.5 Pseudotypisierung mit optimierter für VSV-G codierender Sequenz
Mit Hilfe des HCMV-MIE-Promotors läßt sich VSV-G von der Wildtyp-DNA-Sequenz nur
dann ausreichend exprimieren, wenn die 5’-UTR mindestens die oben beschriebene Region
aus dem HCMV-MIE-Exon 1 enthält, die sich 5’ der stemloop bildende Sequenz befindet.
Erfolgt die Expression dagegen von einer codonoptimierten Sequenz, kann auf HCMVSequenzen in der 5’-UTR gänzlich verzichtet werden. So beträgt die Pseudotypisierungseffizienz des VSV-G-Expressionsplasmids pCD-Gopt (codonoptimierte VSV-G-Sequenz, keine
HCMV-Sequenzen in der 5’ UTR, s. Abb. 3-16) immerhin 30 % der Pseudotypisierungseffizienz des pCI-G (Wildtyp-VSV-G-Sequenz, enthält Exon 1, erstes Intron, nichttranslatierte
Region des Exons 2 der HCMV-MIE-Gene, s. Abb. 3-4) und 65 % der Pseudotypisierungseffizienz des pCI-GΔI (wie pCI-G, aber ohne das erste HCMV-MIE-Intron, s. Abb. 3-4); dagegen beträgt die Pseudotypisierungseffizienz des pCD-G nur 0,6 % der des pCD-Gopt (s. Abb.
3-19 A). Im Gegensatz zur VSV-G-Expression mittels pCD-G ist die VSV-G-Expression mittels pCD-Gopt durch Westernblot-Analyse ebenso gut nachweisbar wie die mittels pCI-G
4 Diskussion
67
(s. Abb. 3-19 B). Auch die aus pCD-Gopt resultierende mRNA zeigt sich wie die aus pCI-G
resultierende mRNA deutlich in der Northernblot-Analyse, während der Nachweis einer aus
pCD-G resultierenden mRNA im selben Experiment nicht gelingt (s. Abb. 3-19 C).
Die Wirkungsebene der Codonoptimierung wird in der Literatur kontrovers diskutiert [86-88].
Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit zeigen einen deutlichen Effekt auf Prätranslationsebene: Bei jeweils gleicher 5’-UTR resultiert – im Vergleich zur gag-pol-RNA – deutlich
mehr mRNA aus den codonoptimierten VSV-G-Sequenzen als aus den Wildtyp-Sequenzen
(s. Abb. 3-18, Abb. 3-19 C). Durch die Codonoptimierung hat sich der GC-Gehalt der für
VSV-G codierenden Sequenz von 43,8 % auf 62,9 % erhöht, damit ist auch die codonoptimierte VSV-G-mRNA stabiler als die Wildtyp-mRNA [90].
4.6 Codonoptimierung in Verbindung mit der HCMV-5’-UTR
Das Plasmid pCI-Gopt, das als Kombination der expressionsfördernden Maßnahmen die nicht
translatierten HCMV-Sequenzen und die codonoptimierte VSV-G-Sequenz enthält (s. Abb.
3-16), kann nicht eingesetzt werden, um eine absolute Steigerung der Titer der pseudotypisierten Vektoren zu erreichen. Sollte – was im Allgemeinen nicht von Bedeutung ist – für
bestimmte Experimente die Reduktion der Plasmid-Dosis essentiell sein, so könnten dann bei
Verwendung des pCI-Gopt höhere Titer erzielt werden als bei Verwendung des pCI-G (nicht
translatierte HCMV-Sequenzen in der 5’-UTR, Wildtyp-VSV-G-Sequenz, s. Abb. 3-12) oder
pCD-Gopt (nur codonoptimierte VSV-G-Sequenz, s. Abb. 3-16).
Bei Variation der Menge des VSV-G-Expressionsplasmids, das zur Produktion von Lentiviren transfiziert wird, steigt der Titer der pseudotypisierten Lentiviren mit zunehmender Menge des VSV-G-Expressionsplasmids bis zum Erreichen einer Obergrenze an. Beim Vergleich
dieser Dosisabhängigkeit der Pseudotypisierungseffizienz der Plasmide pCI-G, pCD-Gopt und
pCI-Gopt, wird mit pCI-Gopt die Obergrenze schon mit geringerer Menge des Plasmids erreicht
als mit pCI-G oder pCD-Gopt. Bei Transfektion hoher Mengen VSV-G-Expressionsplasmids
führt die Verwendung des Plasmids pCI-Gopt zu etwas geringeren Pseudotypisierungseffizienzen als die der Plasmide pCI-G oder pCD-Gopt, bei Transfektion niedriger Mengen VSV-GExpressionsplasmids dagegen zu deutlich höheren Pseudotypisierungseffizienzen (s. Abb.
3-20 A).
4 Diskussion
68
Darüber hinaus gehen höhere Titer einher mit geringeren Aktivitäten der Sekretierten Alkalischen Phosphatase (SEAP), die von einem cotransfizierten Plasmid exprimiert wird (s. Abb.
3-20 B). In der Regel wird die SEAP benutzt, um Transfektionseffizienzen zu beurteilen. Im
vorliegenden Fall sind dagegen niedrigere SEAP-Aktivitäten nicht mit niedrigeren Transfektionseffizienzen gleich zu setzen, die Korrelation sinkender SEAP-Aktivitäten mit steigenden
Mengen VSV-G-Expressionsplasmids kann durch die Toxizität des VSV-G erklärt werden
[48]. Die Toxizität des VSV-G ist wahrscheinlich auch die Ursache dafür, dass die Titer
pseudotypisierter Lentiviren unabhängig vom eingesetzten VSV-G-Expressionsplasmid immer ein annähernd gleiches Maximum erreichen.
Folglich wird die Additivität der expressionsfördernden Effekte der Codonoptimierung und
der nicht translatierten HCMV-Sequenzen durch die Toxizität des VSV-G maskiert. Erst bei
Transfektion niedrigerer Plasmid-Dosen und submaximalen Titern wird ein Vorteil des pCIGopt gegenüber den Plasmiden pCD-Gopt und pCI-G deutlich.
5 Zusammenfassung
Lentivirale Vektoren werden zur Erweiterung ihres Wirtszellspektrums pseudotypisiert, d. h.
mit einem heterologen Glykoprotein in der Hüllmembran ausgestattet. Bei der Herstellung
pseudotypisierter lentiviraler Vektoren mit Hilfe eines 3-Plasmid-Verpackungssystems wird
das heterologe Hüllprotein mittels eines Plasmids exprimiert. Ein hohes Expressionsvermögen
und damit eine hohe Pseudotypisierungseffizienz dieses Plasmids sind eine Voraussetzung für
hochtitrige Vektorpräparate, die von großer Bedeutung in der Gentherapie sind.
Gegenstand der vorliegenden Arbeit ist die Pseudotypisierung lentiviraler Vektoren mit
VSV-G. Ausgangspunkt war die Notwendigkeit einer 965 bp langen aus dem nicht translatierten Exon 1, dem ersten Intron und dem nicht translatiertern 5’-Ende des Exons 2 der Majorimmediate-early-Gene des humanen Cytomegalievirus (HCMV-MIE-Gene) bestehenden Sequenz zwischen HCMV-MIE-Promotor und der für VSV-G codierenden Sequenz in der Expressionskassette des VSV-G-Expressionsplasmids für die Pseudotypisierung lentiviraler
Vektoren.
Die vorliegende Arbeit belegt, dass das 827 bp umfassende Intron, dessen positiver Effekt auf
die heterologe Genexpression in der Literatur beschrieben ist, eine vergleichsweise geringe
Wirkung auf die Pseudotypisierungseffizienz der untersuchten VSV-G-Expressionsplasmide
ausübt und daher verzichtbar ist. Erstmals beschrieben wird hier eine Sequenz, die als RNA
vermutlich eine Stemloop-Struktur bildet und aus dem 3’-Ende des HCMV-MIE-Exons 1 und
dem 5’-Ende des Exons 2 besteht, aber auch nur geringfügig zur Steigerung der VSV-GExpression und der Pseudotypisierungseffizienz beiträgt. Den entscheidenden positiven Effekt
liefert ein Sequenzabschnitt des Exons 1, der auch die in der Literatur beschriebene konservierte Box umfasst. Die HCMV-Sequenz, die für die Expression der für VSV-G codierenden
Wildtyp-Sequenz in der 5’-nicht-translatierten-Region (5’-UTR) unverzichtbar ist, wurde auf
die 106 bp 5’ der Stemloop-Struktur eingegrenzt. Darüber hinaus ist ein bisher nicht beschriebenes optionales Exon im ersten HCMV-MIE-Exon aufgefallen.
Eine weitere Technik zur Verstärkung der Expression viraler Gene ist die Codonoptimierung.
Die Expression einer codonoptimierten VSV-G-Sequenz zur Pseudotypisierung lentiviraler
Vektoren führt in der vorliegenden Arbeit zur völligen Entbehrlichkeit von HCMVSequenzen in der 5’-UTR. Die Codonoptimierung entfaltet hier ihre Wirkung auf Prätranslationsebene, dies wird in der Literatur kontrovers diskutiert.
Eine absolute Steigerung der Titer VSV-G-pseudotypisierter lentiviraler Vektoren kann aufgrund der Cytotoxizität des VSV-G weder durch die Codonoptimierung der VSV-G-Sequenz
noch durch die Kombination der Codonoptimierungs- mit der HCMV-MIE-5’-UTR-Strategie
erreicht werden.
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structure, and intracellular transport of vesicular stomatitis virus G protein. J. Cell Biol. 107: S. 89-99
Dissertationsbezogene Publikation
Kuate, S., Stefanou, D., Hoffmann, D., Wildner, O. und Überla, K. 2004. Production of
lentiviral vectors by transient expression of minimal packaging genes from recombinant adenoviruses. J. Gene Med. 6: S. 1197-205.
Danksagung
Ich danke Herrn Prof. Dr. Klaus Überla sehr herzlich für die Aufnahme in seine Arbeitsgruppe, für die Möglichkeit, an verschiedenen Projekten mitwirken und so vielfältige Methoden
erlernen zu dürfen, und für die unzähligen Diskussionen, aus denen ich immer neue Motivation schöpfte und die mir halfen, das Ziel nicht aus den Augen zu verlieren.
Herrn Prof. Dr. Bernd-Joachim Benecke und Herrn Prof. Dr. William S. Sheldrick danke ich
für die Bereitschaft, als Koreferent bzw. dritter Prüfer der Promotionskommission beizutreten.
Dr. Susann Lucke teilte drei Jahre mit mir die Laborbank, vielen Dank für die tolle TeamArbeit!
Dr. Thomas Grunwald möchte ich meinen Dank für seine ständige Hilfsbereitschaft und für
die Einführung in wesentliche Methoden aussprechen.
Dr. Dennis Hoffmann danke ich für die Hilfe beim Sequenzieren für die vielen wertvollen
Ratschläge und interessanten Diskussionen.
Dr. Alexander Stang gilt mein Dank für viele fachliche Diskussionen und lustige Hörspieldialoge.
Das Ende meiner Labortätigkeit überschnitt sich mit dem Anfang meiner Schwangerschaft, in
dieser Zeit war ich auf die selbstlose technische Assistenz meiner Kollegen angewiesen. Besonders häufig (aber nicht ausschließlich) halfen mir Dr. Hella Monse, Matthias Tenbusch
und Dr. Susann Lucke. Herzlichen Dank!
Ich möchte die Gelegenheit nutzen, jener kleinen Gruppe zu danken, ohne die kein Labor
wirklich funktioniert. Ich spreche von den Kollegen, die nicht nur ihren eigenen Kram aufgeräumt haben, sondern darüber hinaus tatkräftig dem Bestreben des Universums nach Unordnung entgegengewirkt sowie organisatorische Verantwortung übernommen haben. Dafür danke ich Bettina Tippler, Dr. Dennis Hoffmann, Dr. Susann Lucke, Dr. Hella Monse und Dr.
Thomas Grunwald.
Für das Engagement bei dem für das Arbeitsklima so wichtigen „Drumherum“ (Weihnachtsfeier, Betriebsausflug usw..) danke ich allen damaligen Mitarbeitern der Abteilung für Molekulare und Medizinische Virologie. Hierzu gehören auch: Andreia Fernandes, Annika Mühlenkamp, Bärbel Rölleke, Ph.D. Charles Esimone, Claudius Grossmann, Dr. Godwin Nchinda, Heike Seidenstücker, Klaus Sure, Manuela Günther, Nicola Ternette, Regina Bütermann,
Rosemarie Bohr, Sabine Brandt, Dr. Seraphin Kuate, Dr. Uli Heindel, Uli Schumacher, Ulla
Vogel, Vera Siegmund und Yvonne Klingen.
Ich bedanke mich bei Susi, Vera, Dennis und Alexios für das Korrekturlesen meiner Arbeit.
Meinen Eltern danke ich für die Ermöglichung meiner Ausbildung und vor allem für die liebevolle Betreuung meines Sohnes Elias.
Ich danke meinem Mann Alexios für seine Unterstützung und meinem Sohn Elias für die vielen fröhlichen Stunden.
Lebenslauf
Name:
Daniela Stefanou
Geburtsdatum:
13. April 1975
Geburtsort:
Rheinberg
Familienstand:
verheiratet
Kinder:
ein Sohn (21 Monate)
1981 – 1985
Städt. Gemeinschaftsgrundschule St. Hubert
1985 – 1994
Städt. Gymnasium Thomaeum, Kempen
Abitur im Mai 1994
WS 1994 – SS 1999
Studium der Biochemie an der Universität Leipzig
Diplom im September 1999
März 1999 – September 1999
Diplomarbeit: „Studien zur Profilin-Polyprolin-Interaktion
mittels Fluoreszenz-Korrelations-Spektroskopie“
am Institut für Biochemie (Prof. Dr. U. Hahn),
Fakultät für Biowissenschaften, Pharmazie und Psychologie,
Universität Leipzig
November 1999 – März 2000
Wissenschaftliche Hilfskraft
am Institut für Biochemie (Prof. Dr. U. Hahn),
Fakultät für Biowissenschaften, Pharmazie und Psychologie,
Universität Leipzig
April 2000 – Dezember 2000
Wissenschaftliche Hilfskraft
am Institut für Virologie
(Prof. Dr. U. G. Liebert, Dr. J. Hofmann),
Medizinische Fakultät, Universität Leipzig
Seit April 2001
Promotionsstudiengang Chemie, Ruhr-Universität Bochum
April 2001 – März 2004
Wissenschaftliche Mitarbeiterin
in der Abteilung für Molekulare und Medizinische Virologie
(Prof. Dr. K. Überla),
Medizinische Fakultät, Ruhr-Universität Bochum,
mit Möglichkeit zur Promotion
Seit April 2004
Schreiben der Dissertation
31.05.2004 – 15.09.2004
Mutterschutz

Gebrauchsanleitung A4 modifizierter Hebel Beck

1:1 Zuordnungsaufgaben

ABB Kaufel Neuer Gebietsverkaufsleiter

Wurzeln

www.bio-rasenkante.de

Stellung gehalten

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ABB Selfie-Wettbewerb Teilnahmebedingungen

WLAN-Verbindung einschalten und zwischen WLAN