Molekularbiologische Charakterisierung von Trichophyton rubrum und Trichophyton interdigitale isoliert von Patienten mit Onychomykose – Identifizierung der Dermatophyten mit PCR und Sequenzierung der ITS-Region der rRNA sowie MALDI-TOF Massenspektroskopie Mehlhorn C.1, Uhrlaß S. 1, Schroedl W.2, Bartosch T.2, Maier T.3, Krüger C.1, Paasch U. 4, Simon J.-C.4, Nenoff P.1 1Labor für medizinische Mikrobiologie, Partnerschaft Dr. C. Krüger & Prof. P. Nenoff, Mölbis 2Veterinärmedizinische Fakultät, Universität Leipzig, Institut für Bakteriologie und Mykologie, Leipzig 3Bruker Daltonik GmbH, Microbiological Laboratory/R&D Bioanalytics, Bremen 4Universitätsklinikum Leipzig AöR und Medizinische Fakultät der Universität Leipzig, Klinik und Poliklinik für Dermatologie, Venerologie und Allergologie, Leipzig Fragestellung Kultur Mikroskopie und Nativpräparat Die Diagnostik der Onychomykose mit Nativpräparat und Pilzkulturen wird heute durch molekularbiologische Methoden ergänzt. Die Validität des molekularbiologischen DermatophytenDNA-Nachweises direkt im Nagelmaterial mit PCR wurde mit 1) molekularen Methoden überprüft. Patientenkollektiv: Luftmyzelpigmentierung 16% 3) 2) Durchschnittsalter der Patienten: 62 Jahre Trichophyton interdigitale 23 (+1.T.men+1T.ton) Trichophyton rubrum 34 Trichophyton interdigitale 19 Anzahl der Proben 35 Trichophyton rubrum 31 30 25 20 15 10 5 0 keine wenig mäßig 34% 4) Abb. 1 Charakteristische Mikromorphologie von Trichophyton interdigitale: 1) zylinderförmige Makrokonidien 2) Mikrokonidien Ergebnis Nativpräprat (Botrytisform) 3) Mikrokonidien (baumartig 34% verzweigt) 4) Spiralhyphen 66% Verteilung mikromorphologischer Merkmale zwischen TR und TI Kulturnegativ 53 häufig positiv weiß/ bräunlich - rosa Kolonietextur 14% 9% 61% Pigmentierungen der Kolonieunterseite 30% negativ 18% 7% 1) 2) 3) 4) 1) 2) 3) 4) 5) 6) 7) 8) 5) 6) 7) 8) Abb. 3 Vorder (1-4) - und Rückseiten (5-8) ausgewählter Kulturen von Trichophyton rubrum auf Sabouraudagar Material: 109 Nagelproben, TR oder TI mit Kultur und/oder PCR nachweisbar konventionell: BlancophorPräparat und kulturelle Diagnostik molekularbiologisch: PCRELISA und Sequenzierung der Dermatophyten-ITS-Region (18S rRNA, ITS1, 5.8S rRNA, ITS2, 28S rRNA) zusätzlich: Analyse mit Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionisation Time-OfFlight Massenspektrometrie (MALDI-TOF MS) Schlussfolgerung 100 Ergebnisse 100% 90% 80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0% MALDI-TOF MS Vergleich der verschiedenen Methoden zur Dermatophytenbestimmung 100% 99,08% 97,17% 95,24% 66% Gruppe der Trichophyton interdigitale (anthropophil, TI) 97 9% unpigmentiert gelb gelbbraun orange braun rotschwarz Abb. 4 Vorder (1-4) - und Rückseiten (5-8) ausgewählter Kulturen von Trichophyton interdigitale auf Sabouraudagar Phylogenie ITS 2-Region rRNA Gruppe der Trichophyton rubrum (TR) wattig/wollig/ flauschig granulär/pudrig/ gipsig gemischtes Wachstum 25% 27% Vielfalt der Dermatophytenkulturen Methoden weiß/ creme 50% 109 Nagelproben Kulturpositiv 56 weiß Trichophyton tonsurans (T.ton) Die molekularen Methoden Trichophyton mentagrophytes sind sehr gut geeignet, die (sensu strictu, zoophil, T.men) Dermatophyten bei Abb. 4 Phylogenetischer Baum (NeighborOnychomykose direkt im Joining Methode, Jalview 2.9, Bootstrap- TI_ TI_ Nagelmaterial, ohne vorherige Werte kalkuliert mit MEGA) TI_ TI_ Kultivierung, mit hoher TI_ TI_ Zuverlässigkeit zu identifizieren. TI_ Abb. 6 Ausschnitte des T.tons_ Insbesondere bei Kultur-negativen T.ment_ Multiplen Alignments der TR_ Proben hat sich die PCR zum DNAITS 2-Region der rRNA TR_ TR_ Dermatophyten-Nachweis als eine (Jalview 2.9), identische TR_ Säulen nicht gezeigt TR_ hochspezifische und empfindliche Methode erwiesen. Mit MALDI-TOF MS waren TR und TI sehr gut voneinander zu unterscheiden, trotz großer Ähnlichkeit der Spektren. Innerhalb der Spezies ließen sich klonale Unterschiede feststellen. Abb. 5 MALDI-TOF MS Spektren von Trichophyton rubrum Sequenzierung der ITS 2-Region rRNA Korrespondenzadresse: Carolin Mehlhorn, Labor für medizinische Mikrobiologie, Mölbiser Hauptstraße 8, 04571 Rötha, OT Mölbis, Deutschland, Tel. 034347-50 323 www.mykologie-experten.de
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