Identifizierung und Charakterisierung von
Yang-Zyklus-Enzymen in Arabidopsis thaliana
Der Naturwissenschaftlichen Fakultät
der Friedrich-Alexander-Universität
Erlangen-Nürnberg
zur
Erlangung des Doktorgrades Dr. rer. nat.
vorgelegt von
Wolfgang Ulrich Zierer
aus Vilsbiburg
Als Dissertation genehmigt von der Naturwissenschaftlichen Fakultät
der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg
Tag der mündlichen Prüfung:
11. 12. 2015
Vorsitzender der Prüfungskommission:
Prof. Dr. Jörn Wilms
Gutachter:
Prof. Dr. Norbert Sauer
PD Dr. Lars Voll
INHALTSVERZEICHNIS
1
1.1
1.2
2
ZUSAMMENFASSUNG
Physiologische Funktion des Yang-Zyklus im Leitgewebe
Suche nach Yang-Zyklus-Transaminasen in A. thaliana
EINLEITUNG
Funktion von Schwefel im pflanzlichen Metabolismus
Aufnahme und Transport von Sulfat
Synthese von Cystein und Methionin
Methioninstoffwechsel
2.4.1
Aktivierung von Methionin
2.4.2
Recycling von Methionin im S-Adenosylhomocystein-Zyklus
2.4.3
Recycling von Methionin im S-Methylmethionin-Zyklus
2.4.4
Recycling von Methionin im Yang-Zyklus
2.4.4.1
Entdeckung des Yang-Zyklus
2.4.4.2
MTA entsteht als Nebenprodukt der Ethylensynthese
2.4.4.3
MTA entsteht als Nebenprodukt der Nicotianaminsynthese
2.4.4.4
MTA entsteht als Nebenprodukt der Polyaminsynthese
2.4.4.5
Expression des Yang-Zyklus im Leitgewebe
2.5
Zielsetzung dieser Arbeit
3
3
3
4
5
5
6
7
8
8
10
11
12
13
14
ERGEBNISSE
3.1
Physiologische Funktion des Yang-Zyklus im Leitgewebe
3.1.1
Etablierung von mti1- und dep1-Mutantenallelen
3.1.2
Charakterisierung von MTI1 und DEP1 als Yang-Zyklus-Enzyme
3.1.3
Wachstumsdefekte von mti1- und dep1-Pflanzen bei Schwefelmangel
3.1.3.1
Hydroponische Anzucht von mti1- und dep1-Pflanzen
3.1.3.2
Akkumulation von Anthocyanen in mti1- und dep1-Pflanzen
3.1.3.3
Reproduktive Defekte in mti1- und dep1-Pflanzen
3.1.4
Auswirkungen des Schwefelmangels auf transkriptioneller Ebene
3.1.5
Auswirkungen des Schwefelmangels auf metabolischer Ebene
3.1.5.1
Schwefelassimilation in Abhängigkeit der Sulfatkonzentration
3.1.5.2
Aminosäurekonzentrationen in Abhängigkeit der Sulfatkonzentration
3.1.5.3
Metaboliten des Methioninstoffwechsels in Abhängigkeit der
Sulfatkonzentration
3.1.6
Gewebespezifität des Yang-Zyklus
3.1.6.1
Expressionsmuster von MTI1 und DEP1
3.1.6.2
Subzelluläre Lokalisation von MTI1 und DEP1
3.1.6.3
Phloemspezifische Komplementation von mti1- und dep1-Pflanzen
3.1.6.4
Expressionsmuster der NAS-Gene
3.1.6.5
Expressionsmuster von Genen der Polyaminsynthese
3.1.7
Auswirkungen von Yang-Zyklus-Defekten auf die Nicotianaminsynthese
3.1.7.1
Nicotianaminkonzentration in Abhängigkeit von der Sulfatkonzentration
3.1.7.2
NAS-Expression in Abhängigkeit von der Sulfatkonzentration
3.1.7.3
Konzentrationen von Eisen-, Zink- und Kupferionen in Abhängigkeit
von der Sulfatkonzentration
3.1.8
Auswirkungen von Yang-Zyklus-Defekten auf die Synthese
von Putrescin, Spermidin und Spermin
3.1.8.1
Putrescinkonzentration in Abhängigkeit von der Sulfatkonzentration
3.1.8.2
Spermidinkonzentration in Abhängigkeit von der Sulfatkonzentration
3.1.8.3
Sperminkonzentration in Abhängigkeit von der Sulfatkonzentration
15
15
15
16
18
18
21
22
24
25
25
27
2.1
2.2
2.3
2.4
3
1
1
2
28
29
29
31
32
34
35
37
37
38
39
40
41
42
43
INHALTSVERZEICHNIS
4
3.1.8.4
Expression von SPDS1 in Abhängigkeit von der Sulfatkonzentration
3.1.9
Auswirkungen von Yang-Zyklus-Defekten auf die Tspm-Synthese
3.1.9.1
Expression von BUD2 und ACL5 in Abhängigkeit von der Sulfatkonzentration
3.1.9.2
Leitgewebeanatomie von mti1- und dep1-Infloreszenzen
3.1.10
Chemische Komplementation von mti1- und dep1-Pflanzen
3.1.10.1
Externe Applikation von ACC oder Nicotianamin
3.1.10.2
Externe Applikation von Putrescin
3.1.10.3
Externe Applikation von Spermidin
3.1.10.4
Externe Applikation von Spermin
3.2
Suche nach Yang-Zyklus-Transaminasen in A. thaliana
3.2.1
Homologieanalyse mit bekannten Yang-Zyklus-Transaminasen
3.2.2
Expressionsanalyse der Gene putativer Yang-Zyklus-Transaminasen
3.2.3
Analyse von T-DNA Insertionslinien putativer Yang-Zyklus-Transaminasen
3.2.4
Transaminaseaktivitätstest mit putativen Yang-Zyklus-Transaminasen
43
44
44
45
46
46
47
49
51
53
54
57
62
65
DISKUSSION
4.1
Physiologische Funktion des Yang-Zyklus im Leitgewebe
4.1.1
MTI1 und DEP1 sind Yang-Zyklus-Einzelgene in A. thaliana
4.1.2
Yang-Zyklus-Mutanten zeigen Wachstumsdefekte bei Schwefelmangel
4.1.2.1
Phänotypen sind von den Anzuchtbedingungen abhängig
4.1.2.2
Phänotypen sind vom Analysezeitpunkt abhängig
4.1.3
Yang-Zyklus-Mutanten leiden an stärkerem Schwefelmangel
4.1.3.1
Schwefelmangel wird auf transkriptioneller Ebene wahrgenommen
4.1.3.2
Die Assimilation von Sulfat ist von der Konzentration im Medium abhängig
4.1.3.3
Die Aminosäureprofile zeigen Anpassungen an Schwefelmangel an
4.1.3.4
Die Metaboliten des Methioninstoffwechsels sind in den
Yang-Zyklus-Mutanten reduziert
4.1.4
Yang-Zyklus-Aktivität im Phloem ist ausreichend um den durch
Schwefelmangel induzierten Wachstumsdefekt der Mutanten zu beheben
4.1.5
In adulten Arabidopsis-Pflanzen entsteht MTA im Leitgewebe hauptsächlich
duch die Nicotianamin- und Polyaminsynthese
4.1.5.1
Ethylenmangel ist nicht für die durch Schwefelmangel induzierten
Wachstumsdefekte verantwortlich
4.1.5.2
Nicotianamin- und Polyaminsynthese findet im Leitgewebe statt
4.1.6
Die durch Schwefelmangel induzierten Wachstumsdefekte der
Yang-Zyklus-Mutanten sind nicht auf Nicotianaminmangel zurückzuführen
4.1.7
Schwefelmangel führt zu Polyaminmangel in den Yang-Zyklus-Mutanten
4.1.7.1
Schwefelmangel führt zu Spermidin- und Sperminmangel in den Mutanten
4.1.7.2
Die mti1- und dep1-Mutanten leiden nicht an Thermosperminmangel
4.1.8
SAM-Mangel, nicht MTA-Akkumulation, verursacht den Polyaminmangel
4.2
Suche nach Yang-Zyklus-Transaminasen in A. thaliana
4.2.1
Homologe Proteine zu B. subtilis YkrV und S. cerevisiae Aro8p/Aro9p
4.2.2
Homologe Proteine zu B. subtilis YbgE und S. cerevisiae Bat1p/Bat2p
4.2.3
Homologe Proteine zu K. pneumoniae TyrB
4.2.4
Expressionsanalysen mit putativen KMTB-Transaminasen
4.2.5
Funktionelle Analysen mit putativen KMTB-Transaminasen
68
68
68
68
68
69
69
69
70
70
5
5.1
M ATERIAL UND METHODEN
Material
5.1.1
Bakterienstämme
71
71
72
72
73
74
75
75
76
76
78
78
79
79
79
79
81
81
81
INHALTSVERZEICHNIS
5.1.2
Oligonukleotide
5.1.3
Vektoren
5.1.4
Pflanzenlinien
5.1.5
Medien
5.1.5.1
Medien zur Anzucht von Bakterien
5.1.5.2
Medien zur Anzucht von A. thaliana
5.1.5.3
Medienzusätze
5.1.6
Lösungen
5.1.7
Antikörper, Enzyme und Kits
5.1.8
Chemikalien
5.1.9
Verbrauchsmaterialien
5.1.10
Geräte
5.1.11
Software
5.2
Methoden
5.2.1
Methoden zur Anzucht von Lebewesen
5.2.1.1
Anzucht von Bakterien
5.2.1.2
Anzucht von A. thaliana unter Standardbedingungen
5.2.2
Allgemeine molekularbiologische Methoden
5.2.2.1
Herstellung kompetenter E. coli-Zellen
5.2.2.2
Herstellung kompetenter A. tumefaciens-Zellen
5.2.2.3
Transformation von E. coli
5.2.2.4
Transformation von A. tumefaciens
5.2.2.5
Herstellung von Dauerkulturen
5.2.2.6
Extraktion von Plasmid-DNA
5.2.2.7
Amplifikation von DNA durch Polymerasekettenreaktion
5.2.2.8
Extraktion von DNA aus Agarosegelen
5.2.2.9
Extraktion von genomischer DNA aus A. thaliana
5.2.2.10
Extraktion von RNA aus A. thaliana mittels TRIzol® -Methode
5.2.2.11
Synthese von cDNA
5.2.2.12
Quantitative RT-PCR
5.2.2.13
Stabile Transformation von A. thaliana
5.2.2.14
Transiente Transformation von Arabidopsis-Mesophyllprotoplasten
5.2.3
Mikroskopie und Histologie
5.2.3.1
GUS-Färbung
5.2.3.2
Histologische Schnitte
5.2.3.3
Propidiumiodidfärbung
5.2.3.4
Konfokal- und Lichtmikroskopie
5.2.4
Schwefelmangelexperimente
5.2.4.1
Schwefelmangelexperimente auf ½MS-Platten
5.2.4.2
Schwefelmangelexperimente im hydroponischen System
5.2.4.3
Chemische Komplementation
5.2.5
Metabolitenanalytik
5.2.5.1
Elementanalysen mittels ICP-OES
5.2.5.2
Aminosäuremessungen mittels UPLC
5.2.5.3
Schwefelmetabolitenmessungen mittels UPLC-LC-MS/MS
5.2.5.4
Nicotianaminmessungen mittels UPLC-LC-MS/MS
5.2.5.5
Polyaminmessungen mittels UPLC
5.2.5.6
Messungen der Anthocyankonzentration
5.2.6
Proteinchemische Methoden
81
84
86
87
87
88
88
88
91
92
93
93
94
94
94
94
94
95
95
95
95
95
96
96
96
96
97
97
97
97
97
98
98
98
98
98
98
99
99
99
100
100
100
100
101
101
102
102
102
INHALTSVERZEICHNIS
5.2.6.1
5.2.6.2
5.2.6.3
5.2.6.4
5.2.6.5
5.2.7
Herstellung von Proteinen in E. coli
Extraktion löslicher Proteine
Aufreinigung von Proteinen
Immunologische Nachweise mittels Westernblot
KMTB-Transaminaseaktivitätstest
Klonierungsstrategien
102
103
103
103
103
103
6
LITERATURVERZEICHNIS
110
7
ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS
120
8
SUMMARY
124
ANHANG
Aminosäurekonzentrationen in den mti1- und dep1-Infloreszenzen
in Abhängigkeit von der Sulfatkonzentration
Hergestellte Gateway®-Zielvektoren
Arabidopsis-Genloci
126
9
9.1
9.2
9.3
126
127
127
ZUSAMMENFASSUNG
1
ZUSAMMENFASSUNG
1.1
Physiologische Funktion des Yang-Zyklus im Leitgewebe
Der Yang-Zyklus ist ein weit verbreiteter Stoffwechselweg, in dem das schwefelhaltige
Nebenprodukt 5-Methylthioadenosin (MTA) über mehrere enzymatische Umwandlungen zur
Aminosäure Methionin regeneriert wird. In Pflanzen entsteht MTA bei der Synthese des
Phytohormons Ethylen, des Metallionenchelators Nicotianamin, sowie der Stress- und
Entwicklungsfaktoren Polyamine. In früheren Arbeiten konnte gezeigt werden, dass YangZyklus-Gene in den Blättern der Ackerschmalwand (Arabidopsis thaliana) und des
Breitwegerichs (Plantago major) hauptsächlich im Leitgewebe exprimiert werden. Diese
Erkenntnis war überraschend, da der Yang-Zyklus bis zu diesem Zeitpunkt vor allem als
unterstützender Stoffwechselweg der Ethylensynthese bekannt war. Da die Ethylensynthese
jedoch nicht vorwiegend im Leitgewebe stattfindet, stellte sich die Frage, welche Funktion der
Yang-Zyklus in diesem Gewebe erfüllt. Durch die funktionelle Analyse der beiden neu
entdeckten Yang-Zyklus-Gene 5-METHYLTHIORIBOSE ISOMERASE 1 (MTI1) und
DEHYDRATASE-ENOLASE-PHOSPATASE-COMPLEX 1 (DEP1) sollte diese Frage geklärt
werden.
Zunächst wurden Mutantenlinien mit fehlender bzw. verringerter Genexpression von MTI1 oder
DEP1 etabliert und ihr Wachstum auf MTA-haltigen Medien analysiert. Die Beteiligung von
MTI1 und DEP1 am Yang-Zyklus in Arabidopsis konnte im Rahmen dieser
Wachstumsexperimente bewiesen werden, da Pflanzen ohne funktionelles MTI1- bzw. DEP1Allel, im Gegensatz zum Wildtyp (WT), nicht in der Lage waren, MTA als Schwefelquelle zu
nutzen. Um das Verhalten von mti1- und dep1-Pflanzen bei verschiedenen
Schwefelkonzentrationen zu untersuchen, wurden Wachstumsexperimente in einem
hydroponischen System durchgeführt. Während das Wachstum von mti1- und dep1-Pflanzen
bei ausreichender Schwefelversorgung nicht vom Wachstum der WT-Pflanzen zu
unterscheiden war, zeigten mti1- und dep1-Pflanzen einen Wachstumsdefekt bei
Schwefelmangel. Diese äußerte sich vor allem in geringem Infloreszenzwachstum, starken
Stresssymptomen und reproduktiven Defekten, die zur Sterilität der Mutanten führten.
Metabolitmessungen zeigten, dass Pflanzen mit defektem Yang-Zyklus, im Gegensatz zu WTPflanzen, bei Schwefelmangel einen verringerten Methioninstoffwechsel aufwiesen. Vor allem
waren die Konzentrationen von S-Adenosylmethionin (SAM) und dem phloemlokalisierten
Metabolit S-Methylmethionin in den Mutanten bei Schwefelmangel deutlich reduziert.
Die Expression des Yang-Zyklus wurde am Beispiel von MTI1 und DEP1 mittels PromotorReporterlinien in allen adulten Pflanzengeweben untersucht. Dabei konnte gezeigt werden,
dass der Yang-Zyklus zusätzlich zum Blattleitgewebe, im Leitgewebe der Wurzeln, Blüten und
Schoten exprimiert war. Zusätzlich fand auch Expression in Zellen mit hoher Teilungsaktivität,
wie den Wurzelmeristemen, den Antheren und den Embryos statt. Expressionsanalysen von
Genen der Nicotianamin- und Polyaminsynthese zeigten, dass diese ebenfalls zu großen
Teilen im Leitgewebe, den Wurzelmeristemen, sowie den reproduktiven Pflanzenteilen
exprimiert waren. Phloemspezifische Expression von MTI1 oder DEP1 im jeweiligen
Mutantenhintergrund mit Hilfe des SUCROSE TRANSPORTER 2 (SUC2)-Promotors führte zur
-1-
ZUSAMMENFASSUNG
nahezu vollständigen Wiederherstellung des WT-Phänotyps. Dies wies darauf hin, dass der
Wachstumsdefekt der Mutanten bei Schwefelmangel mit dem Phloem assoziiert war.
Die Analyse der schwefelabhängigen Regulation der Nicotianamin- und Polyaminsynthese
zeigte, dass beide Stoffwechselwege von der verfügbaren Schwefelmenge beeinflusst wurden.
Sowohl die Expression der NICOTIANAMIN SYNTHASE (NAS)-Gene, als auch die
Nicotianaminkonzentration
nahm
bei
Schwefelmangel
ab.
Die
niedrige
Nicotianaminkonzentration hatte allerdings keinen Einfluss auf die Eisen-, Zink- und
Kupferversorgung der Pflanzen. Die erhöhte Sensitivität der Mutanten gegenüber
Schwefelmangel konnte auch durch die externe Zugabe von Nicotianamin nicht gelindert
werden. Im Gegensatz zur Expression der NAS-Gene war die Expression der SPERMIDIN
SYNTHASE 1 (SPDS1) bei Schwefelmangel überwiegend unverändert. Trotzdem wurden in
den Infloreszenzen der Mutanten niedrigere Konzentrationen an Putrescin und Spermidin
gemessen. Obwohl sich die Konzentrationen von Spermin in den Mutanten im Rahmen der
Metabolitenmessungen nicht signifikant von der Sperminkonzentration der WT-Pflanzen
unterschieden, litten die Mutanten offenbar dennoch an einem Sperminmangel. Im Gegensatz
zur externen Applikation von Putrescin und Spermidin führte nur die Zugabe von Spermin zu
einer Linderung der durch Schwefelmangel verursachten Defekte in den Mutanten. Spermin
steigerte dabei vor allem das Infloreszenzwachstum und linderte die Stresssymptome, hatte
auf die Reproduktionsfähigkeit allerdings nur einen geringen Einfluss.
Insgesamt deuten die Ergebnisse darauf hin, dass der Yang-Zyklus im Leitgewebe adulter
Pflanzen vor allem zur Aufrechterhaltung der Polyaminsynthese benötigt wird. Diese Aufgabe
gewinnt bei schlechter Schwefelversorgung zunehmend an Bedeutung. Die Umwandlung des
schwefelhaltigen Nebenprodukts MTA zu Methionin bzw. SAM, durch den Yang-Zyklus im
Phloem, verhindert eine Verringerung der Verfügbarkeit von Methionin bzw. SAM durch die
Polyaminsynthese. Bei Schwefelmangel leistet der Yang-Zyklus damit einen wichtigen Beitrag
zum Überleben und zur Reproduktion der Pflanzen.
1.2
Suche nach Yang-Zyklus-Transaminasen in A. thaliana
In Arabidopsis sind mittlerweile fast alle Enzyme des Yang-Zyklus bekannt. Lediglich der letzte
Schritt, die Transaminierung von 4-Ketomethylthiobutyrat (KMTB) zu Methionin, ist noch
unbekannt. Der zweite Teil dieser Arbeit beschreibt die Ergebnisse zur Identifizierung dieser
unbekannten Yang-Zyklus-Enzyme. Homologieanalysen mit bekannten Yang-ZyklusTransaminasen aus anderen Organismen identifizierten zahlreiche Kandidatengene in
Arabidopsis. Durch die Analyse von Promotor-Reporterlinien wurde das Expressionsmuster
der Kandidatengene bestimmt und mit dem Expressionsmuster der Yang-Zyklus-Gene MTI1
und DEP1 verglichen. Kandidatengene mit ähnlicher Lokalisation wurden mit Hilfe von T-DNAInsertionslinien und enzymatischen Tests auf ihre Beteiligung am Yang-Zyklus untersucht.
Dabei konnte das Gen At1g77670 als Yang-Zyklus-Transaminase identifiziert werden. Die
Expression von At1g77670 deckt sich mit der Lokalisation des Yang-Zyklus und das gereinigte
Protein ist in der Lage KMTB in Methionin umzuwandeln. Pflanzen ohne funktionelles
At1g77670-Gen sind allerdings weiter in der Lage MTA als Schwefelquelle zu nutzen. Dies
weist darauf hin, dass noch weitere, bisher unbekannte Yang-Zyklus-Transaminasen zu
entdecken sind.
-2-
EINLEITUNG
2
EINLEITUNG
2.1
Funktion von Schwefel im pflanzlichen Metabolismus
Als phototrope Organsimen sind Pflanzen für ihr Wachstum auf eine ausreichende Versorgung
mit Licht, sowie Makro- und Mikronährstoffe angewiesen. Das Element Schwefel zählt
zusammen mit Stickstoff, Phosphat, Kalium, Calcium und Magnesium zu den
Makronährstoffen. Obwohl Schwefel im Vergleich zu Stickstoff nur in geringen Mengen benötigt
wird, ist er dennoch unverzichtbar für die pflanzliche Ernährung. Schwefel ist in Pflanzen
hauptsächlich in den Seitenketten der Aminosäuren Cystein und Methionin und damit in
Proteinen zu finden. Durch ihre Thiolgruppen sind Cysteine von großer Bedeutung für die
tertiäre Proteinstruktur, da sich zwischen ihnen kovalente Bindungen, so genannte
Disulfidbrücken, ausbilden können. Außerdem können Thiolgruppen sowohl in reduzierter, als
auch in oxidierter Form vorliegen, wodurch Cystein eine Schlüsselrolle bei der zellulären
Redox-Kontrolle zukommt (Buchanan et al., 2010; Takahashi et al., 2011). Cystein und
Methionin werden auch zur Synthese von zahlreichen schwefelhaltigen Metaboliten benötigt.
Cystein wird z.B. für die Synthese des Tripeptids Glutathion verwendet. Glutathion dient
Pflanzen als Speicher- und Transportform für Cystein und leistet einen wichtigen Beitrag zur
zellulären Redox-Kontrolle. Glutathion dient auch zur Synthese von Phytochelatinen und hilft
damit indirekt bei der Entgiftung von Schwermetallen (Rennenberg, 1982; Buchanan et al.,
2010; Takahashi et al., 2011). Cystein und Methionin wird auch für die Synthese von
Cofaktoren und Coenzymen wie z.B. Thiamin, Coenzym A oder Thioredoxin benötigt
(Buchanan et al., 2010). Die aktivierte Form von Methionin, SAM, dient der pflanzlichen Zelle
als Substrat für zahlreiche Methylierungsreaktionen und wird für die Synthese von SMethylmethionin, Biotin, Ethylen, Nicotianamin und Polyaminen benötigt (Buchanan et al.,
2010; Sauter et al., 2013). Manche Pflanzenfamilien akkumulieren zusätzlich schwefelhaltige,
sekundäre Pflanzenstoffe zum Schutz vor Fraßfeinden. So können Pflanzen der Unterfamilie
der Lauchgewächse (Allioideae) aus Cystein die nicht-proteinogene Aminosäure Alliin
synthetisieren (Buchanan et al., 2010). Pflanzen der Familie der Kreuzblütler (Brassicaceae)
können so genannte Senfölglykoside (Glukosinolate) synthetisieren, welche größtenteils von
Methionin abstammen (Windsor et al., 2005).
2.2
Aufnahme und Transport von Sulfat
Pflanzen nehmen Schwefel vor allem in Form von Sulfat über die Wurzeln aus dem Boden auf.
Um den Schwefel des Sulfats nutzen zu können, müssen sie es erst mehrfach reduzieren und
in organische Verbindungen einbauen. Diese Vorgänge finden größtenteils in den Chlorplasten
der grünen Pflanzenteile statt. Sulfat muss also über weite Strecken und mehrere Membranen
transportiert werden. In Arabidopsis erfolgt die Aufnahme von Sulfat an den äußeren
Wurzelschichten
(Epidermis/Cortex)
als
Protonen/Sulfat
Symport
mittels
der
plasmamembranständigen Transportproteine SULFATE TRANSPORTER 1;1 (SULTR1;1) und
SULFATE TRANSPORTER 1;2 (SULTR1;2) in den pflanzlichen Symplast (Takahashi et al.,
2000; Shibagaki et al., 2002). Sulfat im Symplast gelangt über Plasmodesmata bis in den
Wurzelzentralzylinder. Über einen bisher unbekannten Mechanismus gelangt ein Teil des
Sulfats dort wieder in den Apoplasten und wird durch die Transportproteine SULFATE
-3-
EINLEITUNG
TRANSPORTER 2;1 (SULTR2;1) und SULFATE TRANSPORTER 3;5 (SULTR3;5) in
Xylemparenchymzellen akkumuliert (Takahashi et al., 2011). Hohe Sulfatkonzentrationen im
Cytosol der Xylemparenchymzellen sind eine Voraussetzung für den effizienten Transport von
Sulfat von der Wurzel zum Spross. Die Transportproteine SULFATE TRANSPORTER 4;1
(SULTR4;1) und SULFATE TRANSPORTER 4;2 (SULTR4;2) in den Tonoplasten der
Xylemparenchymzellen können Sulfat ins Cytosol importieren und sorgen im Bedarfsfall für
eine Erhöhung der symplastischen Sulfatkonzentration (Kataoka et al., 2004). Sulfat wird aus
den Xylemparenchymzellen durch bisher unbekannte Transporter in die Xylemgefäße
exportiert und anschließend von der Wurzel in den Spross transportiert (Takahashi et al.,
2011). Im Spross wird Sulfat in Chloroplasten aufgenommen und dort assimiliert. Erst kürzlich
konnte das Protein SULFATE TRANSPORTER 3;1 (SULTR3;1) als Sulfatexporter in die
Chloroplasten charakterisiert werden (Cao et al., 2013). Die Versorgung der Sink-Organe über
das Phloem wird durch den SULFATE TRANSPORTER 1;3 (SULTR1;3) ermöglicht
(Yoshimoto et al., 2003).
2.3
Synthese von Cystein und Methionin
Die Reduktion und Assimilation von Sulfat findet im Chlorplastenstroma statt (Abb. 1). Im
ersten Schritt wird Sulfat durch eine ATP-abhängige Sulfurylase in Adenosin-5´-phosphosulfat
umgewandelt, das wiederrum durch die glutathionabhängige Adenosin-5´-phosphosulfatReduktase zu Sulfit reduziert wird. Sulfit wird anschließend durch die ferredoxinabhängige
Sulfit-Reduktase zu Sulfid weiter reduziert. Die Aminosäure Serin wird durch die Tätigkeit einer
Acetyl-CoA-abhängigen Acetyltransferase in O-Acetylserin umgewandelt. Im letzten Schritt
werden Sulfid und O-Acetylserin, durch die O-Acetylserin-(thiol)lyase zu Cystein verknüpft
(Abb. 1). Cystein kann zusätzlich zu den Chlorplasten, auch in Mitochondrien und im Cytosol
synthetisiert werden. Sowohl Chloroplasten, als auch Mitochondrien und das Cytosol enthalten
die Enzyme Serin-Acetyltransferase und O-Acetylserin-(thiol)lyase und Sulfid kann offenbar
zwischen allen drei Kompartimenten ausgetauscht werden. Das meiste Cystein wird jedoch im
Cytosol synthetisiert (Takahashi et al., 2011). Methionin, die zweite schwefelhaltige
Aminosäure, wird über drei weitere enzymatische Umwandlungen aus Cystein hergestellt.
Dieser Prozess wird auch als Transsulfurylierung bezeichnet und findet in den Chloroplasten
statt (Abb. 1). Im ersten Schritt stellt die Cystathionin-ɣ-Synthase aus Cystein und OPhosphohomoserin Cystathionin her. Dieses wird durch die Cystathionin-β-Lyase in
Homocystein umgewandelt. Aus Homocystein stellt die Methioninsynthase schließlich
Methionin her (Takahashi et al., 2011).
-4-
EINLEITUNG
Abb. 1: Schema der Cystein- und Methioninsynthese in einer Arabidopsis-Mesophyllzelle.
Das Cytosol ist in weiß dargestellt. Enzyme und Transporter sind rot dargestellt. Gestrichelte Linien
deuten bisher unbekannte Transportwege an. Abkürzungen: APR = APS REDUCTASE, APS = Adenosin
5´-phosphosulfat, ATPS = ATP SULFURYLASE, CBL = CYSTATHIONINE β-LYASE, CGS =
CYSTATHIONINE ɣ-SYNTHASE, Cys = Cystein, Cyst = Cystathionin, Hcy = Homocystein, Met =
Methionin, MS = METHIONINE SYNTHASE, OAS = O-Acetylserin, OAS-TL = OAS(THIOL)LYASE, SAT
= SERINE ACETYLTRANSFERASE, Ser = Serin, SiR = SULFITE REDUCTASE, SULTR = SULFATE
TRANSPORTER. Abbildung modifiziert nach Takahashi et al. (2011).
2.4
Methioninstoffwechsel
2.4.1
Aktivierung von Methionin
Methionin wird neben der Proteinbiosynthese auch für die Synthese zahlreicher Metaboliten
benötigt. Bei diesen Synthesereaktionen wird Methionin in seiner aktivierten Form verwendet.
Methionin kann im Cytosol durch die Tätigkeit von ATP-abhängigen SAM-Synthetasen (MAT)
in SAM umgewandelt werden (Abb. 2). In Arabidopsis gibt es 4 MAT-Isoformen. Die verringerte
Expression von MAT-Genen führt in Arabidopsis zu einer massiven Methioninakkumulation in
Rosettenblättern und deutet einen starken Fluss in Richtung SAM an (Sauter et al., 2013).
Untersuchungen von Giovanelli et al. (1985) in Wasserlinsen (Lemna) zeigten außerdem, dass
Methionin zu 80% in SAM umgewandelt wird.
Die Schwefelfixierung ist ein energieintensiver Prozess. Im Vergleich zur Stickstoff- oder
Kohlenstofffixierung wird für die Schwefelfixierung ca. doppelt so viel Energie benötigt
-5-
EINLEITUNG
(Buchanan et al., 2010). Dieser hohe Energieaufwand macht bereits reduzierte
Schwefelverbindungen für die Pflanze besonders wertvoll. Die hohen Kosten der
Schwefelfixierung auf der einen Seite und der hohe Bedarf an SAM auf der anderen Seite
verdeutlichen den Nutzen von Stoffwechselwegen zum Recycling von Methionin bzw. SAM. Im
pflanzlichen Cytosol gibt es insgesamt drei dieser Stoffwechselwege: den SAdenosylhomocystein-Zyklus, den S-Methylmethionin-Zyklus und den Yang-Zyklus.
Abb. 2: Aktivierung von Methionin.
Enzyme sind in grauen Boxen dargestellt. Abkürzungen: ATP = Adenosintriphosphat, Pi =
Monophosphat, PPi = Bisphosphat.
2.4.2
Recycling von Methionin im S-Adenosylhomocystein-Zyklus
In pflanzlichen Zellen werden ständig Metaboliten, Zellwandkomponenten und Nukleinsäuren
methyliert. Die Methylierung von DNA beispielsweise stellt eine der wichtigsten epigenetischen
Veränderung der Zelle dar. Methylierungsreaktionen werden von Methyltransferasen
durchgeführt, wobei ca. 90% der Methyltransferasen SAM als Methylgruppendonor verwenden
(Sauter et al., 2013). Bei dieser Reaktion wird SAM in S-Adenosylhomocystein umgewandelt.
Im S-Adenosylhomocystein-Zyklus (Abb. 3) wird S-Adenosylhomocystein durch die Tätigkeit
einer Hydrolase in Homocystein überführt und anschließend durch eine Methioninsynthase zu
Methionin regeneriert. Durch erneute Methioninaktivierung entsteht wieder SAM, welches
erneut als Methylgruppendonor genutzt werden kann.
-6-
EINLEITUNG
Abb. 3. Schema des S-Adenosylhomocystein-Zyklus im pflanzlichen Cytosol.
Enzyme sind in grauen Boxen dargestellt. Abkürzungen: ATP = Adenosintriphosphat, Pi =
Monophosphat, PPi = Bisphosphat, (M)THF = (Methyl)Tetrahydrofolat.
2.4.3
Recycling von Methionin im S-Methylmethionin-Zyklus
Im S-Methylmethionin-Zyklus (Abb. 4) kann aus SAM und Methionin, S-Adenosylhomocystein
und S-Methylmethionin gebildet werden. Diese Reaktion wird von der Methionin-SMethyltransferase
durchgeführt.
S-Adenosylhomocystein
wird
analog
zum
SAdenosylhomocystein-Zyklus über eine Hydrolase in Homocystein umgewandelt. Aus
Homocystein und S-Methylmethionin kann durch die Tätigkeit der Homocystein-SMethyltransferase wieder Methionin gebildet werden. Die temporäre Bildung von SMethylmethionin dient der Pflanze einerseits als Schwefelspeicher und erhöht andererseits die
Mobilität von reduziertem Schwefel, da S-Methylmethionin über das Phloem transportiert
werden kann (Bourgis et al., 1999). Das Fehlen des S-Methylmethionin-Zyklus in Arabidopsis
und Mais (Zea mays) scheint zumindest unter Standardbedingungen keine Nachteile für das
Pflanzenwachstum zu bringen (Kocsis et al., 2003). In der Erbse (Pisum sativum) konnte durch
die Expression eines Hefe (Saccaromyces cerevisiae)-Transporters für S-Methylmethionin
jedoch gezeigt werden, dass erhöhter Transport im Phloem zu einem gesteigerten
Proteingehalt im Samen führt (Tan et al., 2010).
-7-
EINLEITUNG
Abb. 4: Schema des S-Methylmethionin-Zyklus im pflanzlichen Cytosol.
Enzyme sind in grauen Boxen dargestellt. Abkürzungen: ATP = Adenosintriphosphat, Pi =
Monophosphat, PPi = Bisphosphat.
2.4.4
Recycling von Methionin im Yang-Zyklus
Zusätzlich zur Synthese von Biotin und S-Methylmethionin wird SAM auch zur Synthese von
Ethylen, Nicotianamin und Polyaminen benötigt. Bei allen drei Synthesereaktionen wird die
Aminobutyratgruppe des SAM-Moleküls verwendet und es fällt das schwefelhaltige
Nebenprodukt MTA an (Kende, 1993; Roje, 2006). Im Yang-Zyklus wird die schwefelhaltige
CH3S-Gruppe von MTA durch mehrere enzymatische Umwandlungen wieder zu Methionin
regeneriert.
2.4.4.1
Entdeckung des Yang-Zyklus
Während ihrer Forschung zur Ethylenproduktion im Apfel (Malus pumila) entdeckten Baur und
Yang (1972), dass der Gehalt des Ethylen-Ausgangsmoleküls Methionin deutlich geringer war,
als die Konzentration von Ethylen selbst und postulierten daraufhin die Existenz eines
Stoffwechselweges zum Methioninrecycling. Drei Jahre später konnten Murr und Yang (1975)
die Beteiligung von SAM und die Entstehung von MTA bei dieser Reaktion beweisen. Durch
radioaktive Markierungsexperimente konnten gezeigt werden, dass die CH3S-Gruppe von MTA
letztlich wieder in Methionin eingebaut wird (Adams und Yang, 1977). Die enzymatischen
Reaktionen die an der Umwandlung von MTA zu Methionin beteiligt sind, werden als YangZyklus bezeichnet (Abb. 5). Als Synonyme haben sich auch die Begriffe MTA Zyklus oder
Methionin Zyklus etabliert. In Bakterien wird der Zyklus auch als Met Salvage Pathway
bezeichnet.
-8-
EINLEITUNG
Die erste pflanzliche Yang-Zyklus-Enzymaktivität wurde in Extrakten von Lupinensamen
(Lupinus luteus) nachgewiesen. Guranowski (1983) konnte die 5-METHYLTHIORIOSE
KINASE anreichern und die Phosphorylierung von 5-Methylthioribose zu 5-Methylthioribose-1Phosphat beweisen. Durch Homologieanalysen zu bakteriellen Yang-Zyklus-Enzymen konnte
21 Jahre später schließlich mit METHYLTHIORIBOSE KINASE (MTK) das erste Gen des
Yang-Zyklus in Pflanzen identifiziert werden (Sauter et al., 2004). Pflanzen ohne funktionelles
MTK-Gen waren im Gegensatz zum WT nicht in der Lage auf einem Medium mit MTA als
Schwefelquelle zu wachsen. Bei der Suche nach differenziell regulierten Genen während der
submergence Antwort im Reis (Oryza sativa) wurden zwei ACIDOREDUCTONE
DIOXYGENASE (ARD)-Gene gefunden. Es konnte gezeigt werden, dass die ARD-Enzyme
1,2-Dihydroxy-3-keto-5-methylthiopenten zu KMTB umwandeln können (Sauter et al., 2005).
Über Homologieanalysen konnten in Arabidopsis 4 Isoformen des ARD-Gens identifiziert
werden (Bürstenbinder et al., 2007). Das METHYLTHIORIBOSE NUCLEOSIDASE (MTN)-Gen
wurde ebenfalls über die differentielle Regulation bei der submergence Antwort im Reis
entdeckt und Rzewuski et al. (2007) konnten zeigen, dass MTN die Spaltung von MTA in
Methylthioribose und Adenosin katalysiert. Über Homologieanalysen konnten in Arabidopsis
zwei MTN-Isoformen identifiziert werden, wobei MTN1 für ca. 80% der enzymatischen MTNAktivität verantwortlich ist (Bürstenbinder et al., 2010). Die Identifizierung der
METHYLTHIORIBOSE-1-PHOSPHAT ISOMERASE 1 (MTI1) wurde durch deren hohe
Homologie zum eukaryotischen Translation-Initiations-Faktor eIF-2B erschwert. Die
Kristallisierung und Strukturanalyse einer Bacillus subtilis Methylthioribose-1-phosphat (MTR1-P)-Isomerase (Bumann et al., 2004) ermöglichte allerdings die Identifizierung der Arabidopsis
MTI1-Sequenz. Durch Komplementation der Hefemutante mri1 mit der Arabidopsis MTR-1-P
Isomerase konnte die Identität von MTI1 bestätigt werden (Pommerrenig et al., 2011). Die
Umwandlung von Methylthioribulose-1-Phosphat zu 1,2-Dihydroxy-3-keto-5-methylthiopenten
wird in Hefe und Bakterien von 2 bzw. 3 verschiedenen Enzymen durchgeführt. Durch
gründliche phylogenetische Analysen und Komplementationsexperimenten mit Hefe konnte
gezeigt werden, dass diese Schritte in Arabidopsis von einem einzigen Enzym katalysiert
werden. Dieses Enzym wurde DEHYDRATASE-ENOLASE-PHOSPHATASE-COMPLEX 1
(DEP1) genannt (Pommerrenig et al., 2011). Damit sind in Arabidopsis mittlerweile alle Gene
für die enzymatische Umwandlung von 5-Methylthioribose bis zu KMTB bekannt.
Um den biochemischen Kreislauf zu schließen muss auf KMTB allerdings noch eine
Aminogruppe übertragen werden. In B. subtilis wird diese Transaminierung von YkrV und YbgE
durchgeführt. Während es sich bei YkrV um eine glutaminabhängige KMTB-Transaminase
handelt, benutzt YbgE verzweigtkettige Aminosäuren als Aminogruppendonor für die
Transaminierung von KMTB (Berger et al., 2003). In der Hefe sind mit Aro8p, Aro9p, Bat1p und
Bat2p vier KMTB-Transaminasen bekannt. Aro8p und Aro9p benutzen aromatische
Aminosäuren für die Transaminierung von KMTB, während Bat1p und Bat2p verzweigtkettige
Aminosäuren benutzen (Pirkov et al., 2008). Von welchem Enzym oder Enzymen diese
Transaminierung in Pflanzen durchgeführt wird ist allerdings immer noch unbekannt.
-9-
EINLEITUNG
Abb. 5: Schema des Yang-Zyklus in Bakterien, Hefe und Pflanzen.
Gene des Yang-Zyklus in B. subtilis (blaue, kursive Kleinbuchstaben), S. cerevisiae (blaue
Großbuchstaben) und Pflanzen (grüne, kursive Großbuchstaben). Grüne Pfeile zeigen pflanzliche
Reaktionen. Blaue Pfeile zeigen B. subtilis bzw. S. cerevisiae Reaktionen. A. thaliana Gene: ARD1-4 =
ACIDOREDUCTONE DIOXYGENASE 1-4, DEP1 = DEHYDRATASE-ENOLASE-PHOSPHATASECOMPLEX 1, MTI1 = METHYLTHIORIBOSE-1-PHOSPHATE ISOMERASE 1, MTK =
METHYLTHIORIBOSE KINASE, MTN1/2 = METHYLTHIOADENOSINE NUCLEOSIDASE 1/2. S.
cerevisiae Gene: ARO8/9 = aromatic amino acid transferase 8/9, BAT1/2 = branched-chain amino acid
transaminase 1/2, MDE1 = methylthioribulose-1-phosphate dehydratase 1, MEU1 =
methylthioadenosine phosphorylase 1, MRI1 = methylthioribose-1-phosphate isomerase 1, UTR4 =
enolase-phosphatase complex 4. B. subtilis Gene = mtnA: methylthioribose-1-phosphate isomerase,
mtnB = methylthioribose-1-phosphate dehydratase, mtnC = 2,3-diketo-5-methylthiopentenyl-1phosphate enolase-phosphatase, mtnD = acidoreductone dioxygenase, mtnK = methylthioribose kinase,
mtnN = methylthioadenosine/S-adenosylhomocysteine nucleosidase, mtnP = methylthioadenosine
phosphorylase, mtnW = 2,3-diketo-5-methylthiopentenyl-1-phosphate enolase, mtnX = 2-hydroxy-3keto-5-methylpentenyl-1-phosphat
phosphatase,
ykrV/ybgE
=
2-keto-4-methyl-thiobutyrate
transaminase. Abkürzungen = ATP: Adenosintriphosphat. Abbildung modifiziert nach Pommerrenig et
al. (2011).
2.4.4.2
MTA entsteht als Nebenprodukt der Ethylensynthese
Ethylen ist ein gasförmiges Pflanzenhormon mit einer Vielzahl physiologischer Funktionen. Es
kann das Wachstum und die Morphologie von Pflanzen, sowie die Seneszenz pflanzlicher
Organe beeinflussen. So fördert Ethylen beispielsweise das Sprosswachstum semiaquatischer
- 10 -
EINLEITUNG
Pflanzen und die Bildung von Adventivwurzeln. Es fördert die Fruchtreife in klimakterischen
Früchten und trägt zum Blattabwurf bei. Außerdem spielt es eine Rolle bei biotischen und
abiotischen Stressreaktionen, sowie bei der Kurz- und Langstreckenkommunikation innerhalb
und zwischen Pflanzen (Bleecker und Kende, 2000; McManus, 2012; Sauter et al., 2013).
Ethylen wird in zwei enzymatischen Schritten aus SAM synthetisiert (Abb. 6). Im ersten Schritt
wird SAM zu 1-Aminocyclopropan-1-carbonsäure (ACC) und dem Nebenprodukt MTA
umgewandelt. Diese Umwandlung wird von ACC-Synthasen (ACS) katalysiert und stellt den
geschwindigkeitsbestimmenden Schritt in der Ethylensynthese dar (Wen, 2014). In Arabidopsis
gibt es insgesamt 9 ACS-Isoformen, die sowohl individuelle als auch überlappende Funktionen
besitzen. Die ACS-Isoformen können Homo- und Heterodimere bilden und das Verhältnis der
Dimere beeinflusst die Ethylensynthese (Tsuchisaka et al., 2009). Im zweiten Schritt wird ACC
durch die ACC-Oxidase zu Ethylen oxidiert. Das im ersten Schritt der Ethylensynthese
anfallende MTA wird anschließend im Yang-Zyklus zu Methionin regeneriert.
Abb. 6: Schema der Ethylensynthese in A. thaliana.
Enzyme sind in grauen Boxen dargestellt.
2.4.4.3
MTA entsteht als Nebenprodukt der Nicotianaminsynthese
Nicotianamin ist eine pflanzliche, nicht-proteinogene Aminosäure. In einkeimblättrigen
Pflanzen wird Nicotianamin für die Synthese so genannter Phytosiderophore benötigt.
Phytosiderophore werden von den Wurzeln ausgeschieden um Eisen- und Zinkionen zu
binden, damit diese in die Pflanze aufgenommen werden können (Palmer und Guerinot, 2009).
In zweikeimblättrigen Pflanzen dient Nicotianamin als wichtiges Chelatormolekül für Eisen-,
Zink- und Kupferionen. Es fördert die Speicherung, Mobilität und den phloembasierten
Langstreckentransport zur Versorgung von Blüten und Samen (Klatte et al., 2009; Deinlein et
al., 2012; Haydon et al., 2012; Schuler et al., 2012; Zheng et al., 2012). Bei der Synthese von
Nicotianamin werden 3 Moleküle SAM durch eine NICOTIANAMINE SYNTHASE (NAS) zu
einem Molekül Nicotianamin kondensiert und dabei 3 Moleküle MTA erzeugt (Abb. 7). In
Arabidopsis thaliana gibt es 4 NAS-Isoformen. Das anfallende MTA wird anschließend im
Yang-Zyklus recycelt.
- 11 -
EINLEITUNG
Abb. 7: Schema der Nicotianaminsynthese in A. thaliana.
Enzyme sind in grauen Boxen dargestellt. Abkürzung: NAS = NICOTIANAMINE SYNTHASE
2.4.4.4
MTA entsteht als Nebenprodukt der Polyaminsynthese
Polyamine sind niedrigmolekulare Polykationen, die in allen Lebewesen zu finden sind. Am
meisten verbreitetet sind Putrescin, Spermidin und Spermin. Polyamine erfüllen eine Vielzahl
von Aufgaben im pflanzlichen Metabolismus. Sie schützen die Pflanze vor biotischem und
abiotischem Stress (Jimenez-Bremont et al., 2014; Minocha et al., 2014) und sind an der
pflanzlichen Entwicklung beteiligt (Imai et al., 2004b; Deeb et al., 2010). Das
pflanzenspezifische Polyamin Thermospermin spielt eine wichtige Rolle bei der
Xylementwicklung der Gefäßpflanzen (Takano et al., 2012). In Arabidopsis startet die Synthese
der Polyamine bei der Aminosäure Arginin (Abb. 8). Durch eine Arginin-Decarboxylase wird
aus Arginin Agmatin gebildet. Agmatin wird durch eine Agmatin-Iminohydrolase in NCarbamoylputrescin überführt, welches anschließend durch eine N-CarbamoylputrescinAmidohydrolase in Putrescin umgewandelt wird. Die Spermidinsynthase kann durch
Verknüpfung von Putrescin mit einem decarboxylierten SAM-Molekül das Polyamin Spermidin
synthetisieren. Die Decarboxylierung von SAM wird von den SAM-Decarboxylasen
durchgeführt. In Arabidopsis gibt es 4 Isoformen dieser Enzyme. Die Sperminsynthase kann
durch Verknüpfung von Spermidin mit einem decarboxylierten SAM-Molekül das Polyamin
Spermin erzeugen. Thermospermin wird durch das Enzym ACAULIS5 aus Spermidin erzeugt.
Bei der Synthese eines Moleküls Spermidin, Spermin oder Thermospermin entsteht jeweils ein
Molekül MTA, das anschließend im Yang-Zyklus recycelt werden muss.
- 12 -
EINLEITUNG
Abb. 8: Schema der Polyaminsynthese in A. thaliana.
Enzyme sind in grauen Boxen dargestellt. Putrescinstruktur in Grün. Aminopropyllgruppen in Orange.
Abkürzungen: ACL5 = ACAULIS 5, ADC = ARGININE DECARBOXYLASE, Agm = Agmatin, AIH =
AGMATINE IMINOHYDROLASE, Arg = Arginin, CPA = N-CARBAMOYLPUTRESCINE
AMINOHYDROLASE, dSAM = Deoxy-S-Adenosylmethionin, MTA = 5-Methylthioadenosin, Ncp = NCarbamoylputrescin, Put = Putrescin, SAM = S-Adenosylmethionin, SAMDC = SADENOSYLMETHIONINE DECARBOXYLASE, Spd = Spermidin, SPDS = SPERMIDINE SYNTHASE,
Spm = Spermin, SPMS = SPERMINE SYNTHASE, Tspm = Thermospermin.
2.4.4.5
Expression des Yang-Zyklus im Leitgewebe
Im Breitwegerich kann das Blattleitgewebe mechanisch vom umgebenden Mesophyllgewebe
getrennt werden. Mittels vergleichender Transkriptomanalysen wurden Transkripte gesucht,
die im Blattleitgewebe verstärkt oder spezifisch exprimiert wurden. Im Rahmen dieser Analysen
wurde unter anderem die Sequenz eines Plantago METHYLTHIORIBOSE KINASE (MTK)
Gens (74,8% Aminosäure Identität mit AtMTK1) spezifisch im Blattleitgewebe gefunden
(Pommerrenig et al., 2006). MTK ist ein Enzym des Yang-Zyklus (Sauter et al., 2004). Die
leitbündelspezifische Expression von PmMTK bzw. AtMTK wurde zusätzlich mittels
vergleichenden qRT-PCR-Analysen bzw. Promotor-GUS-Analysen bestätigt (Pommerrenig et
al., 2006). Die leitgewebespezifische Expression von MTK war überraschend, da bisher
allgemein angenommen wurde, dass der Yang-Zyklus in allen Geweben aktiv ist. Es wurde die
Hypothese aufgestellt, dass auch alle anderen Yang-Zyklus-Enzyme im Leitgewebe lokalisiert
sind. Mittels Promotor-GUS-Analysen mit den Yang-Zyklus-Genen aus Arabidopsis und
vergleichenden qRT-PCR-Analysen mit den Plantago-Genen konnten Pommerrenig et al.
(2011) zeigen, dass die Gene für MTN1, ARD1/2/4, sowie die neu entdeckten MTI1- und DEP1Gene ebenfalls spezifisch im Leitgewebe exprimiert werden. Bis zu diesem Zeitpunkt wurde
angenommen, dass der Yang-Zyklus in Pflanzen vor allem der Aufrechterhaltung der
Ethylensynthese dient. Da die Ethylensynthese allerdings nicht leitbündelspezifisch ist, stellte
sich die Frage, welche physiologische Rolle der Yang-Zyklus im pflanzlichen Leitgewebe erfüllt.
- 13 -
EINLEITUNG
2.5
Zielsetzung dieser Arbeit
In der vorliegenden Arbeit sollte die Frage geklärt werden, ob und warum der Yang-Zyklus in
adulten Arabidopsis thaliana-Pflanzen hauptsächlich im Leitgewebe zu finden ist. Um
festzustellen in welchen Geweben der MTA-Metabolismus stattfindet, sollte sowohl die
Expression der beiden neu entdeckten Yang-Zyklus-Gene MTI1 und DEP1, sowie die
Expression von Genen der Nicotianamin- und Polyaminsynthese analysiert werden. Mit Hilfe
der Yang-Zyklus-Mutanten mti1 und dep1 sollte die Beteiligung von MTI1 und DEP1 am YangZyklus in Arabidopsis überprüft und die physiologische Funktion des Yang-Zyklus untersucht
werden. Dazu sollten Wachstumsexperimente mit verschiedenen Schwefelquellen und
Schwefelkonzentrationen durchgeführt und die Auswirkungen auf die MTA-produzierenden
Stoffwechselwege untersucht werden.
In dieser Arbeit sollte außerdem versucht werden, Enzyme zu identifizieren, die den letzten
Schritt des Yang-Zyklus in Arabidopsis katalysieren. Über vergleichende Sequenzanalysen
sollten die Gene putativer Yang-Zyklus-Transaminasen identifiziert und ihr Expressionsmuster
mit Hilfe von Promotor-Gen-Reporterlinien analysiert werden. Putative KMTB-Transaminasen,
deren Genexpression mit der Genexpression von MTI1 bzw. DEP1 übereinstimmt, sollten mit
Hilfe von Mutantenanalysen und enzymatischen Tests funktionell charakterisiert werden.
- 14 -
ERGEBNISSE
3
ERGEBNISSE
3.1
Physiologische Funktion des Yang-Zyklus im Leitgewebe
3.1.1
Etablierung von mti1- und dep1-Mutantenallelen
Zur physiologischen Analyse der MTI1- bzw. DEP1-Proteinfunktion wurden homozygote TDNA-Insertionsmutanten in den entsprechenden Genen aus verschiedenen T-DNAKollektionen isoliert. mti1-1 (FLAG_154B05) weist eine T-DNA-Insertion im 8. Exon des MTI1Gens auf (Abb. 9 A). Im Gegensatz zum Wassilewskija (Ws)-WT und der
Komplementationslinie MM (mti1-1 + pMTI1::MTI1-GFP) konnte für mti1-1 kein MTI1Transkript amplifiziert werden (Abb 9 B). Da keine zweite T-DNA-Insertionsmutante für MTI1
isoliert werden konnte, wurde eine MTI1-amiRNA unter der Kontrolle des CaMV35S-Promotors
hergestellt (siehe 5.2.7 Klonierungsstrategien) und in den Columbia (Col)-WT transformiert. In
10 analysierten T1-Linien schwankte die Expression von MTI1 zwischen 10 und 42% des WTTranskripts. Die Linie mit der geringsten MTI1-Expression wurde ausgewählt und mti1-2
genannt. In homozygoten mti1-2-Pflanzen der T2-Generation konnten ebenfalls nur 10% der
MTI1-Transkriptmenge von WT-Pflanzen festgestellt werden (Abb. 9 C). Die dep1Mutantenallele weisen eine T-DNA-Insertion im 6. Exon (dep1-1, SALK_091578C) bzw. 8.
Exon (dep1-2, WiscDsLox489-492G6) des DEP1-Gens auf (Abb. 9 A). Im Gegensatz zum ColWT und der Komplementationslinie DD (dep1-1 + pDEP1::DEP1-GFP) konnte weder für dep11 noch für dep1-2 ein DEP1-Transkript amplifiziert werden (Abb. 9 B).
Abb. 9: Charakterisierung von mti1- und dep1-Allelen.
(A) Schema des MTI1- bzw. DEP1-Genlokus, Rechtecke = Exons, Linien zwischen den Rechtecken =
Introns, Dreiecke = Positionen der T-DNA-Insertionen, LB = left border, Pfeile a – d = für den
Transkriptnachweis verwendeten Primer (siehe 5.1.2 Oligonukleotide), Stern = amiRNA-Bindestelle auf
der MTI1-mRNA in der mti1-2-Mutante. (B) RT-PCR-Analyse der T-DNA-Insertionsmutanten, der
jeweiligen Komplementationslinie (MM = mti1-1 + pMTI1::MTI1-GFP, DD = dep1-1 + pDEP1::DEP1GFP) und des jeweiligen WT. ACT2 = ACTIN 2 (C) qRT-PCR-Analyse der amiRNA- T2-Linie mti1-2. Das
- 15 -
ERGEBNISSE
Balkendiagramm zeigt die errechneten Durchschnittswerte und Standardfehler mit Daten von drei
unabhängigen qRT-PCR-Experimenten.
3.1.2
Charakterisierung von MTI1 und DEP1 als Yang-Zyklus-Enzyme
Bei der Synthese von Ethylen, Nicotianamin und Polyaminen entsteht das schwefelhaltige
Nebenprodukt MTA. Nur Pflanzen mit einem funktionellen Yang-Zyklus können diese
reduzierte Schwefelverbindung wieder in Methionin umwandeln (Sauter et al., 2004). Um
herauszufinden, ob mti1- bzw. dep1-Pflanzen MTA als Schwefelquelle nutzen können wurde
zuerst ihr Wachstum bei Schwefelmangel analysiert. Dazu wurden Mutanten- und WT-Pflanzen
auf ½MS-Platten mit 500 oder 50 µM Sulfat analysiert (Abb. 10). Dem Wachstum auf Erde
entsprechend, zeigten alle untersuchten Genotypen bei Wachstum auf 500 µM Sulfat den
gleichen Phänotyp ohne besondere Auffälligkeiten (Abb. 10, oben). Bei Wachstum auf 50 µM
Sulfat dagegen, waren die Pflanzen sehr klein und akkumulierten Anthocyane. Im Vergleich
zum WT war das Wachstum der mti1- und dep1-Pflanzen allerdings noch stärker beeinträchtigt.
Die Mutanten waren noch kleiner, weniger grün und zeigten teilweise chlorotische Blätter (Abb.
10, unten).
Abb.10: Wachstum von mti1- und dep1-Pflanzen auf Platten mit 500 bzw. 50 µM Sulfat.
Wachstum von 3 Wochen alten Arabidopsis-Pflanzen auf ½MS-Platten mit 500 µM Sulfat (oben) oder
50 µM Sulfat (unten). Maßstab = 1 cm.
Im nächsten Schritt wurden die mti1- und dep1-Pflanzen auf ½MS-Platten mit 500 bzw. 50 µM
Sulfat, sowie 500 µM MTA als zusätzlicher Schwefelquelle angezogen (Abb. 11). Auf Platten,
die jeweils 500 µM der beiden Schwefelquellen enthielten (Abb. 11, linke Hälfte), ähnelte sich
das Wachstum der verschiedenen Genotypen und entsprach in etwa dem Wachstum von
Pflanzen auf Platten mit 500 µM Sulfat (Abb. 10, oben). Auf Platten, die 50 µM Sulfat und 500
µM MTA enthielten, waren das Sproß- und Wurzelwachstum der mti1- bzw. dep1-Mutanten im
Vergleich zum WT allerdings stark reduziert. Außerdem erschienen die Blätter der Mutanten
deutlich heller als die Blätter von WT-Pflanzen und waren teilweise chlorotisch (Abb. 11, rechte
Hälfte). Das Wachstum der Mutanten ähnelte dem Wachstum der Pflanzen bei
- 16 -
ERGEBNISSE
Schwefelmangel (Abb. 10, unten). Diese Ergebnisse zeigen, dass die mti1- und dep1Pflanzen, im Gegensatz zum WT, MTA nicht als Schwefelquelle nutzen können.
Abb. 11: Wachstum von mti1- und dep1-Pflanzen auf MTA.
Wachstum von 3 Wochen alten Arabidopsis-Pflanzen auf ½MS-Platten mit 500 µM Sulfat und 500 µM
MTA (linke Hälfte) bzw. mit 50 µM Sulfat und 500 µM MTA (rechte Hälfte). Maßstab: 1 cm.
Um wieder ein funktionelles MTI1- bzw. DEP1-Allel zu erhalten wurden mti1-1 bzw. dep1-1 mit
pMTI1::MTI1-GFP bzw. pDEP1::DEP1-GFP transformiert. Das Wachstum der
Komplementationslinien MM (mti1-1 + pMTI1::MTI1-GFP) und DD (dep1-1 + pDEP1::DEP1GFP) wurde auf ½MS-Platten mit 50 µM Sulfat und 500 µM MTA analysiert (Abb. 12). Während
- 17 -
ERGEBNISSE
das Wachstum der mti1-1- bzw. dep1-1-Mutanten gegenüber dem WT stark reduziert war,
zeigten die Komplementationspflanzen keinen phänotypischen Unterschied zum WT.
Abb. 12: Komplementation von mti1- und dep1-Pflanzen.
Wachstum von 3 Wochen alten Arabidopsis-Pflanzen auf ½MS-Platten mit 50 µM Sulfat und 500 µM
MTA. MM = mti1-1 + pMTI1::MTI1-GFP, DD = dep1-1 + pDEP1::DEP1-GFP. Maßstab: 1 cm.
Diese Ergebnisse zeigen, dass Pflanzen mit defekten MTI1- bzw. DEP1-Allelen MTA nicht als
Schwefelquelle nutzen können. Daraus folgt, dass MTI1 und DEP1 am Yang-Zyklus in
Arabidopsis beteiligt sind. Außerdem konnte gezeigt werden, dass es für diese beiden Enzyme
in Arabidopsis keine weiteren funktionellen Isoformen gibt.
3.1.3
Wachstumsdefekte von mti1- und dep1-Pflanzen bei Schwefelmangel
Im Vergleich zu WT-Pflanzen, zeigten die mti1- und dep1-Pflanzen einen Wachstumdefekt bei
Schwefelmangel (Abb. 10). Um mehr über die Bedeutung des Yang-Zyklus bei
Schwefelmangel zu lernen, wurden die mti1- bzw. dep1-Pflanzen und die jeweiligen WTPflanzen bei verschiedenen Sulfatkonzentrationen angezogen.
3.1.3.1
Hydroponische Anzucht von mti1- und dep1-Pflanzen
Die Mangelexperimente wurden in einem hydroponischem Wachstumssystem durchgeführt,
da dieses eine präzise Einstellung der Sulfatkonzentration erlaubt und das Wachstum der
Pflanzen über den gesamten Lebenszyklus beobachtet werden kann. Obwohl auf Platten mit
50 µM Sulfat deutliche Schwefelmangeleffekte zu beobachten waren, traten im hydroponischen
System Schwefelmangeleffekte erst bei niedrigeren Konzentrationen auf. Offenbar ist die
Verfügbarkeit von Nährstoffen hier höher als bei dem Wachstum auf Platte. Wahrscheinlich ist
dies auf die erhöhte Nährstoffdiffusion und das ausgeprägtere Wurzelgeflecht im
hydroponischen System zurückzuführen. Deutliche Schwefelmangeleffekte waren erst bei 10
bzw. 20 µM Sulfat zu sehen. Eine Erhöhung der Sulfatkonzentration über 40 µM hinaus,
brachte keine weitere Verbesserung des Pflanzenwachstums. Das Wachstum der
verschiedenen Genotypen wurde deshalb zwischen 10 und 40 µM Sulfat analysiert (Abb. 13).
Geringe Sulfatkonzentrationen wirkten sich vor allem negativ auf das Wachstum der
Infloreszenzen aus. Während sich die Infloreszenzhöhe aller Genotypen zwischen 40 und 30
µM Sulfat nur wenig änderte, nahm sie von 30 bis 10 µM Sulfat stark abnahm (Abb. 14). Im
Vergleich zu den WT-Pflanzen fiel die Wachstumsreduktion der Mutanten bei sinkender
Sulfatkonzentration zunehmend stärker aus. Bei Wachstum in 40 µM Sulfat war die
Infloreszenzhöhe von mti1-1, dep1-1 und dep1-2 um 7, 15 bzw. 8% und bei Wachstum in 30
µM Sulfat um 20,17 bzw. 15% geringer als im WT. Bei Wachstum in 20 µM Sulfat war die
- 18 -
ERGEBNISSE
Infloreszenzhöhe von mti1-1, mti1-2, dep1-1 und dep1-2 um 52, 20, 62 bzw. 57% und bei
Wachstum in 10 µM Sulfat bereits um 65, 41, 83 bzw. 86% geringer als im WT (Abb. 14).
Abb. 13: Wachstum von mti1- und dep1-Pflanzen bei verschiedenen Sulfatkonzentrationen.
Wachstum von 5 Wochen alten Arabidopsis-Pflanzen in Hoagland Medium mit 10, 20, 30 oder 40 µM
Sulfat (links nach rechts). Maßstab: 1 cm.
Abb. 14: Infloreszenzhöhe bei verschiedenen Sulfatkonzentrationen.
Infloreszenzhöhe von 5 Wochen alten Arabidopsis-Pflanzen in Hoagland Medium mit 10, 20, 30 oder 40
µM Sulfat. Das Balkendiagramm zeigt die errechneten Durchschnittswerte und Standardfehler mit Daten
von jeweils 8 Pflanzen.
- 19 -
ERGEBNISSE
Das Wachstum von Mutanten- und WT-Pflanzen in Hoagland Medium mit 10 µM Sulfat wurde
in einem Zeitverlaufsexperiment analysiert (Abb. 15). Das Wachstum der Mutanten war ca. 26
(Ws-Ökotypen) bzw. 29 (Col-Ökotypen) Tage lang nicht vom Wachstum der WT-Pflanzen zu
unterscheiden. Erst nach dieser Zeit wurden phänotypische Unterschiede in den Mutanten
zunehmend deutlich. Während die Infloreszenzen der WT-Pflanzen weiter wuchsen, stoppte
das Infloreszenzwachstum in den mti1- bzw. dep1-Pflanzen. Obwohl das
Infloreszenzwachstum der Mutanten bei Schwefelmangel stärker zurückging als im WT,
bildeten alle Genotypen des selben Ökotyps eine ähnliche Wurzelmasse aus (Abb. 16 A). Zum
Zeitpunkt der Blüte besaßen alle Genotypen des selben Ökotyps die gleiche Anzahl an
Rosettenblättern (Abb. 16 B). Dies weist auf einen identischen Entwicklungszustand hin,
weshalb die Unterschiede in der Infloreszenzhöhe nicht auf einen verspäteten Blühzeitpunkt,
sondern auf einen zunehmenden Schwefelmangel zurückzuführen sind.
Abb. 15: Entwicklung des Schwefelmangelphänotyps von mti1- und dep1-Pflanzen.
(A) Zeitverlauf des Wachstums von mti1-1 und Ws in Hoagland Medium mit 10 µM Sulfat von Tag 26
bis Tag 30. (B) Zeitverlauf des Wachstums von mti1-2, dep1-1, dep1-2 und Col in Hoagland Medium mit
10 µM Sulfat von Tag 29 bis Tag 33. Maßstab: 1 cm.
- 20 -
ERGEBNISSE
Abb. 16: Rosettenblätter und Wurzeltrockengewicht bei verschiedenen Sulfatkonzentrationen.
(A) Anzahl der Rosettenblätter 5 Wochen alter Arabidopsis-Pflanzen, gewachsen in Hoagland Medium
mit 10 – 40 µM Sulfat. Die Balkendiagramme zeigen die errechneten Durchschnittswerte und
Standardfehler mit Daten von mindestens 20 Pflanzen. (B) Wurzeltrockengewicht 5 Wochen alter
Arabidopsis-Pflanzen in Hoagland Medium mit 10 – 40 µM Sulfat. Die Balkendiagramme zeigen die
errechneten Durchschnittswerte und Standardfehler mit Daten aus drei Pools mit jeweils mindestens 10
Wurzeln.
3.1.3.2
Akkumulation von Anthocyanen in mti1- und dep1-Pflanzen
Bei Wachstum in 10 bzw. 20 µM Sulfat akkumulierten die Blätter und Infloreszenzen der mti1bzw. dep1-Pflanzen deutlich mehr Anthocyane. Dies wurde durch eine stärkere violette
Färbung gegenüber dem WT deutlich (Abb. 17 A, Abb. 18 A, E). In 5 Wochen alten Pflanzen,
die in Hoagland Medium mit 10 µM Sulfat wuchsen, war der relative Anthocyangehalt in den
Rosettenblättern von mti1-1 bzw. dep1-1 gegenüber den Rosettenblättern von Ws bzw. Col 3
bzw. 2,1 mal höher (Abb. 17 B).
- 21 -
ERGEBNISSE
Abb. 17: Akkumulation von Anthocyanen in mti1- und dep1-Pflanzen.
(A) Blattrosetten von 5 Wochen alten Arabidopsis-Pflanzen, gewachsen in Hoagland Medium mit 10 µM
Sulfat. (B) Relative Anthocyankonzentration (Absorption/g Frischgewicht) in Blattrosetten. Die
Balkendiagramme zeigen errechnete Durchschnittswerte und Standardfehler mit Daten aus drei
unabhängigen Experimenten. Maßstab: 5 mm.
3.1.3.3
Reproduktive Defekte in mti1- und dep1-Pflanzen
Schwefelmangel verursachte in den Mutanten neben reduziertem Infloreszenzwachstum und
der Akkumulation von Anthocyanen auch Defekte in der Blüten- und Samenentwicklung (Abb.
18). Bei Wachstum der Mutanten in Hoagland Medium mit 10 bzw. 20 µM Sulfat wurden Blüten
mit gestörten Proportionen beobachtet. Häufig waren dabei die Kelchblätter länger als die
Blütenblätter und die Antheren auffällig kurz. Außerdem bildeten die Antheren keinen Pollen
aus (siehe Pfeilspitze in Abb. 18 B, F). Teilweise waren auch deformierte Fruchknoten zu
beobachten (Abb. 18 A, B). Im Gegensatz zu den WT-Pflanzen, produzierten die mti1- bzw.
dep1-Pflanzen, bei Wachstum in Hoagland Medium mit 10 bzw. 20 µM Sulfat, keine oder nur
sehr kurze Schoten (Abb. 18 O). Diese kurzen Schoten enthielten keine oder abgebrochene
Samen (Abb. 18 K, L). Insgesamt waren mti1- und dep1-Pflanzen bei Wachstum in Hoagland
Medium mit 10 bzw. 20 µM Sulfat, im Gegensatz zum WT, nicht zur Reproduktion fähig.
- 22 -
ERGEBNISSE
Abb. 18: Reproduktive Defekte von mti1- und dep1-Pflanzen.
(A-H) Blüten 5 Wochen alter Arabidopsis-Planzen, gewachsen in Hoagland Medium mit 10 µM Sulfat:
(A) Blütenstand von mti1-1, (B) Blüte von mti1-1, (C) Blütenstand von Ws, (D) Blüte von Ws, (E)
Blütenstand von dep1-1, (F) Blüte von dep1-1, (G) Blütenstand von Col, (H) Blüte von Col. (I-N) Schoten
und Samen von 5 Wochen alten Arabidopsis Pflanzen, gewachsen in Hoagland Medium mit 10 µM
Sulfat: (I) Schoten von mti1-1 und Ws, (J) Schoten von dep1-1 und Col, (K) Geöffnete Schote von mti11, (L) Geöffnete Schote von dep1-1, (M) Geöffnete Schote von Ws, (N) Geöffnete Schote von Col. (O)
Vergleich der Schoten von 5 Wochen alten Arabidopsis-Pflanzen, gewachsen in Hoagland Medium mit
- 23 -
ERGEBNISSE
10 – 40 µM Sulfat. Das Balkendiagramm zeigt die errechneten Durchschnittswerte und Standardfehler
mit Daten von jeweils 8 Pflanzen. Maßstäbe: 2 mm in I und J, 1 mm in M und N, 500 µm in A-D, 200 µm
in E-H und 100 µm in K und L.
3.1.4
Auswirkungen des Schwefelmangels auf transkriptioneller Ebene
Um sicher zu stellen, dass die Pflanzen tatsächlich einem Schwefelmangel ausgesetzt waren,
wurde die Expression bekannten Schwefelmarkergene mittels quantitativer RT-PCR in den
Wurzeln der Pflanzen untersucht. SULTR1;1 und SULTR1;2 kodieren für Sulfattransporter in
der Wurzelepidermis und sind der Haupteintrittsweg für Sulfat in den pflanzlichen Symplast
(Takahashi et al., 2000; Shibagaki et al., 2002; Takahashi et al., 2011). ADENOSINE 5´PHOSPHOSULFATE REDUCTASE 3 (APR3) kodiert eine Reduktase, die Adenosin-5´phosphosulfat zu Sulfit reduziert und damit massgeblich an der Schwefelassimilation beteiligt
ist. Alle drei Gene zeigen eine sulfatabhängige Regulation (Takahashi et al., 2000; Vauclare et
al., 2002; Yoshimoto et al., 2002; Yoshimoto et al., 2007; Scheerer et al., 2010) und ihre
Expression gibt deshalb Auskunft über den Schwefelstatus der Pflanze. Die Expression von
SULTR1;1, SULTR1;2 und APR3 nahm mit sinkender Sulfatkonzentration annähernd linear zu
(Abb. 19). Die Expression von SULTR1;1, SULTR1;2 und APR3 war in den Pflanzen der
Columbia-basierten Ökotypen (mti1-2, dep1-1, dep1-2, Col) bei 10 µM Sulfat 3 – 4, 3 – 5 bzw.
4 – 5 mal höher als in Pflanzen bei 40 µM Sulfat. In den Wassilewskija-basierten Ökotypen
(mti1-1, Ws), stieg die Expression von SULTR1;1, SULTR1;2 und APR3 bei sinkender
Sulfatkonzentration dagegen nur leicht an. Zwischen den Genotypen der selben Ökotypen
waren keine Unterschiede in der Expression der Schwefelmarkergene zu beobachten. Diese
Ergebnisse zeigen, dass alle Genotypen transkriptionell auf Schwefelmangel reagierten und
dass die Regulation der Schwefelaufnahme und Assimilation nicht durch Mutationen im YangZyklus beeinflusst war.
- 24 -
ERGEBNISSE
Abb. 19: qRT-PCR-Analyse von Schwefelmarkergenen.
(A-C) qRT-PCR-Analyse mit Wurzel-cDNA aus 5 Wochen alten Arabidopsis-Pflanzen, gewachsen in
Hoagland Medium mit 10 – 40 µM Sulfat: (A) Relative Expression von SULTR1;1, (B) Relative
Expression von SULTR1;2, (C) Relative Expression von APR3. Die Balkendiagramme zeigen die
errechneten Durchschnittswerte und Standardfehler mit Daten aus jeweils drei unabhängigen
Experimenten. Die Expression des jeweiligen WT bei 40 µM Sulfat wurde auf 1 gesetzt und alle anderen
Werte darauf bezogen.
3.1.5
Auswirkungen des Schwefelmangels auf metabolischer Ebene
3.1.5.1
Schwefelassimilation in Abhängigkeit der Sulfatkonzentration
Im Rahmen der Schwefelassimilation wird Sulfat zu Sulfid reduziert und mit dem reduzierten
Schwefel die Aminosäure Cystein synthetisiert. Damit dies geschehen kann muss zuerst die
Aminosäure Serin durch die Tätigkeit der Serin-Acetyltransferase zu O-Acetylserin
umgewandelt werden. Die Acetylgruppe von O-Acetylserin wird durch die OAcetylserin(thiol)lyase durch Sulfid ersetzt und damit die Aminosäure Cystein synthetisiert
(Abb. 20 A). Serin-Acetyltransferase und O-Acetylserin(thiol)lyase sind Teil des
Cysteinsynthasekomplexes. Im Fall schlechter Schwefelversorgung mangelt es an Sulfid und
die Aminosäuren Serin und O-Acetylserin akkumulieren (Speiser et al., 2014).
Die Konzentrationen von Serin und O-Acetylserin in den Infloreszenzen von Mutanten- und
WT-Pflanzen, die in Hoagland Medium mit 10 – 40 µM Sulfat wuchsen, wurden mittels UPLC
bestimmt (Abb. 20 B, C). Die Serinkonzentrationen lagen zwischen 1 und 4 nmol/mg
Frischgewicht und waren von der Sulfatkonzentration im Medium abhängig. Je geringer die
Sulfatkonzentration, desto höher waren die Serinkonzentration. Pflanzen, die in Hoagland
Medium mit 10 µM bzw. 20 µM Sulfat wuchsen zeigten eine 4- bzw. 2-fach höhere
- 25 -
ERGEBNISSE
Serinkonzentration im Vergleich zu Pflanzen, die in Hoagland Medium mit 30 bzw. 40 µM Sulfat
wuchsen. Die Konzentrationen von O-Acetylserin lagen zwischen 0 und 20 pmol/mg
Frischgewicht und zeigten ebenfalls eine deutliche Abhängigkeit von der Sulfatkonzentration.
Während O-Acetylserin in Pflanzen, die in Hoagland Medium mit 40 µM Sulfat wuchsen, kaum
detektierbar war, zeigte sich in Pflanzen, die in Hoagland Medium mit 10 µM Sulfat wuchsen,
eine starke Akkumulation von O-Acetylserin. Sowohl die Serin- als auch die OAcetylserinkonzentrationen waren in den Columbia-basierten Mutanten, die in Hoagland
Medium mit 10 µM Sulfat wuchsen, tendentiell höher als im Columbia-WT. Die
Cysteinkonzentrationen in den Infloreszenzen von Mutanten- und WT-Pflanzen, die in
Hoagland Medium mit 10 – 40 µM Sulfat wuchsen, wurden mittels LC-MS/MS bestimmt (Abb.
20 D). Die Cysteinkonzentrationen lagen bei ca. 5 pmol/mg Frischgewicht und waren zwischen
den verschiedenen Sulfatkonzentrationen relativ konstant. Passend zur Erhöhung der
Vorstufen Serin und O-Acetylserin, waren die Cysteinkonzentration in den Columbia-basierten
Mutanten, die mit 10 bzw. 20 µM Sulfat wuchsen, 20 bzw. 30% niedriger als in Columbia-WTPflanzen.
Diese Ergebnisse zeigen, dass Pflanzen, die in Hoagland Medium mit weniger als 40 µM Sulfat
wuchsen, offenbar in ihrer Schwefelassimilation limitiert waren, während sich Pflanzen, die in
Hoagland Medium mit 40 µM Sulfat wuchsen, offenbar ausreichend versorgt konnten.
Außerdem scheinen die mti1- und dep1-Pflanzen einen stärkeren Schwefelmangel
wahrzunehmen.
Abb. 20: Metaboliten der Cysteinsynthese bei verschiedenen Sulfatkonzentrationen.
(A) Schematische Darstellung der Cysteinsynthese. Enzyme sind in grauen Boxen dargestellt. (B-D)
Metabolitmessungen in den Infloreszenzen 5 Wochen alter Arabidopsis-Pflanzen bei Wachstum in
Hoagland Medium mit 10 – 40 µM Sulfat: (B) Serinkonzentration, (C) O-Acetylserinkonzentration, (D)
Cysteinkonzentration. Abkürzungen: Cys = Cystein, OAS = O-Acetylserin, OAS-TL = OAS(thiol)lyase,
SAT = Serin O-Acetyltransferase, Ser = Serin.
- 26 -
ERGEBNISSE
3.1.5.2
Aminosäurekonzentrationen in Abhängigkeit von der Sulfatkonzentration
Im Rahmen von Aminosäuremessungen waren die Aminosäurekonzentrationen von Alanin,
Asparagin, Glutamin, Glycin, Histidin, Isoleucin, Leucin, Phenylalanin, Serin und Valin waren
in Pflanzen, die mit 10 µM Sulfat wuchsen, oft um das 2 – 4 fache höher als in Pflanzen, die
mit 40 µM Sulfat wuchsen (siehe Anhang 9.1). Der Anstieg von Asparagin, Glutamin, Glycin,
Isoleucin, Leucin und Serin stellt dabei eine typische Anpassung an Schwefelmangel dar
(Nikiforova et al., 2005). Aber auch zwischen den Genotypen konnten Unterschiede festgestellt
werden. So waren die Aminosäurekonzentrationen von Alanin, Asparagin, Glycin, Isoleucin,
Leucin, Serin und Valin in den Mutanten, die bei 10 bzw. 20 µM Sulfat wuchsen, deutlich höher
als im WT. Dabei fällt auf, dass mit Alanin, Isoleucin, Leucin und Valin, 4 dieser 7 Aminosäuren
an der Synthese aliphatischer Glukosinolate beteiligt sind. Abb. 21 zeigt die Konzentrationen
von Alanin und der verzweigtkettigen Aminosäuren Isoleucin, Leucin und Valin in den
Infloreszenzen von Pflanzen, die in Hoagland Medium mit 10 – 40 µM Sulfat wuchsen. Die
Alaninkonzentration war in den Mutanten, die mit 10 – 30 µM Sulfat wuchsen, größtenteils um
das 1,5 – 2 fache erhöht (Abb. 21 A). Isoleucin (Abb. 21 B) und Leucin (Abb. 21 C) waren
tendentiell in allen Mutanten erhöht, die in 10 bzw. 20 µM Sulfat wuchsen. Besonders deutlich
war der Anstieg allerdings in den dep-Pflanzen. Dort waren die Isoleucin- und
Leucinkonzentrationen im Vergleich zum Columbia-WT um das 3 – 4 fache erhöht. Auch Valin
(Abb. 21 D) war bei Wachstum in 10 bzw. 20 µM Sulfat in diesen Mutanten um das 2 – 3 fache
höher.
Der starke Anstieg von Alanin, Isoleucin, Leucin und Valin bei Schwefelmangel könnte eine
Reduktion der Glukosinolatkonzentration widerspiegeln. Glukosinolate sind schwefelhaltige
Metabolite. Die Glukosinolatsynthese wird bei Schwefelmangel verringert und der
Glukosinolatabbau erhöht (Falk et al., 2007). Die Tatsache, dass die Konzentrationen dieser 4
Aminosäuren in den Mutanten bei Schwefelmangel größtenteils deutlich höher waren als im
WT, deutet an, dass die Yang-Zyklus-Mutanten weniger Glukosinolate synthetisieren und/oder
mehr Glukosinolate abbauen um reduzierten Schwefel zu erhalten. Insgesamt zeigen die
Aminosäureprofile metabolische Anpassungen an Schwefelmangel an und deuten auf
stärkeren Schwefelmangel in den mti1- und dep1-Mutanten hin.
- 27 -
ERGEBNISSE
Abb. 21: Alanin, Isoleucin, Leucin und Valin bei verschiedenen Sulfatkonzentrationen.
(A-D) Aminosäuremessungen mit den Infloreszenzen 5 Wochen alter Arabidopsis-Pflanzen bei
Wachstum in Hoagland Medium mit 10 – 40 µM Sulfat: (A) Alaninkonzentration, (B)
Isoleucinkonzentration, (C) Leucinkonzentration, (D) Valinkonzentration. Abkürzungen: Ala = Alanin, Ile
= Isoleuchin, Leu = Leucin, Val = Valin.
3.1.5.3
Metaboliten des Methionstoffwechsels
Sulfatkonzentration
in
Abhängigkeit
von
der
Da der Yang-Zyklus MTA zu Methionin umwandelt, sollten sich Defekte im Yang-Zyklus auf
den Methioninstoffwechsel auswirken. Mit Hilfe von LC-MS/MS-Messungen wurden die
Konzentrationen von Methionin, SAM, S-Adenosylhomocystein und S-Methylmethionin in den
Infloreszenzen von Pflanzen, die in Hoagland Medium mit 10 – 40 µM Sulfat wuchsen, ermittelt
(Abb. 22). Die Konzentrationen von Methionin und SAM lagen zwischen ca. 20 – 40 pmol/mg
Frischgewicht und waren bei den verschiedenen Sulfatkonzentrationen relativ konstant (Abb.
22 A, B). In dep1-1 und dep1-2 Pflanzen, die in 10 µM Sulfat wuchsen, war die
Methioninkonzentration allerdings ca. 25% geringer als im Columbia-WT. Bei Wachstum mit
20 bzw. 30 µM Sulfat war sie ebenfalls leicht reduziert (Abb. 22 A). SAM war in den Columbiabasierten Mutanten mti1-2, dep1-1 und dep1-2, die in Hoagland Medium mit 10 – 30 µM Sulfat
wuchsen, ebenfalls reduziert. Bei Wachstum mit 10 bzw. 20 µM Sulfat war die SAMKonzentration gegenüber dem Columbia-WT um ca. 40% niedriger. Die Konzentrationen von
S-Adenosylhomocystein lagen zwischen 4 und 10 pmol/mg Frischgewicht (Abb. 22 C).
Zwischen den verschiedenen Sulfatbedingungen zeigten sich wieder nur geringe
Unterschiede. Auch die S-Adenosylhomoysteinkonzentrationen waren bei Wachstum mit 10
µM Sulfat in den Columbia-basierten Mutanten reduziert. Gegenüber dem WT war sie um
mindestens 20% verringert. Bei Schwefelmangel zeigte der Metabolit S-Methylmethionin die
deutlichsten Effekte. S-Methylmethionin dient der Pflanze als Speicher- und Transportform von
Methionin (Bourgis et al., 1999). Im Ws-WT entsprachen die Konzentrationen von SMethylmethionin, bei Wachstum mit 30 bzw. 40 µM Sulfat, dem Columbia-WT. Beide zeigten
ca. 130 pmol/mg Frischgewicht. Im Gegensatz zu Col-Pflanzen, gingen die Konzentrationen in
Ws-Pflanzen, bei Wachstum mit 10 bzw. 20 µM Sulfat, stark zurück und lagen nur noch bei ca.
- 28 -
ERGEBNISSE
40 pmol/mg Frischgewicht. Die Yang-Zyklus-Mutante mti1-1 zeigte im Verleich zum Ws-WT
allerdings immer deutlich niedrigere Werte. Die S-Methylmethioninkonzentration war in
Pflanzen, die in 10, 20, 30 bzw. 40 µM Sulfat wuchsen, jeweils um 40, 20, 85 bzw. 40%
geringer. Auch die Columbia-basierten Mutanten dep1-1 und dep1-2 zeigten bei Wachstum mit
10 bzw. 20 µM Sulfat einen deutlichen Rückgang der Konzentration. Im Gegensatz zum ColWT, dessen Werte stabil bei ca. 130 pmol/mg Frischgewicht lagen, verringerte sich die SMethylmethioninkonzentration in diesen beiden Mutanten auf ca. 50 pmol/mg Frischgewicht.
Dies entspricht einem Rückgang um ca. 60%. Alle genannten Unterschiede zwischen den
Bedingungen innerhalb einer S-Bedingung waren signifikant (t-test, p<0,05).
Diese Ergebnisse zeigen, dass Defekte im Yang-Zyklus bei Schwefelmangel zur Verringerung
von Methionin, sowie Metaboliten die von Methionin abstammen, führen. Vor allem die
Konzentrationen von SAM und dem phloemlokalisierten Metabolit S-Methylmethionin waren in
den Mutanten bei Schwefelmangel deutlich reduziert.
Abb. 22: Metaboliten des Methioninstoffwechsels bei verschiedenen Sulfatkonzentrationen.
(A-D) Metaboliten des Methioninstoffwechsels in den Infloreszenzen 5 Wochen alter ArabidopsisPflanzen bei Wachstum in Hoagland Medium mit 10 – 40 µM Sulfat: (A) Methioninkonzentration, (B)
SAM-Konzentration, (C) S-Adenosylhomocysteinkonzentration, (D) S-Methylmethionin-konzentration.
Abkürzungen: SAM = S-Adenosylmethionin, Met = Methionin, SAH = S-Adenosylhomocystein, SMM =
S-Methylmethionin.
3.1.6
Gewebespezifität des MTA-Stoffwechsels
3.1.6.1
Expressionsmuster von MTI1 und DEP1
Die Expression der MTI1- und DEP1-Gene wurde mit Hilfe von Promotor-GenReporterpflanzen analysiert. Diese exprimierten eine Fusion der genomischen Sequenz des
MTI1- bzw. DEP1-Gens mit dem GUS- bzw. GFP-Reportergen, unter der Kontrolle des 1925
bp MTI1- bzw. 1649 bp DEP1-Promotors (siehe 5.2.7 Klonierungsstrategien). Die Analysen der
GUS- und GFP-Reporterpflanzen lieferten ein übereinstimmendes Ergebnis. Beide Gene
waren sowohl in vegetativen (Abb. 23), als auch in reproduktiven Geweben (Abb. 24)
- 29 -
ERGEBNISSE
exprimiert. In den vegetativen Pflanzenteilen war MTI1- und DEP1-Expression in den
Leitgeweben der Rosettenblätter (Abb. 23 A-D) und im Zentralzylinder der Wurzel (Abb. 23 E,
F, H, I, K, L, N, O) vorhanden. Zusätzlich waren beide Gene in allen Zellen der Wurzelspitze
(Abb. 23 F, G, I, J, K, M, N, P) exprimiert.
Abb. 23: Expression von MTI1 und DEP1 in vegetativen Geweben.
(A-J) GUS-Färbung von pMTI1::MTI1-GUS- bzw. pDEP1::DEP1-GUS-Geweben: (A, C) Ausschnitt
eines Rosettenblatts, (B, D) 25 µm dicker Querschnitt eines Rosettenblatts, (E, H) 25 µm dicker
Querschnitt durch die Wurzeldifferenzierungszone, (F, I) 10 Tage alter Keimling, (G, J) 25 µm dicker
Querschnitt durch die Wurzelspitze. (K-P) KLSM-Aufnahmen von 10 Tage alten pMTI1::MTI1-GFP- bzw.
pDEP1::DEP1-GFP-Wurzeln: (K, N) Konfokaler Stapel im Bereich der Wurzeldifferenzierungszone mit
hervortretender
Seitenwurzel,
(L,
O)
Konfokaler
Einzelschnitt
im
Bereich
der
Wurzeldifferenzierungszone, (M, P) Konfokaler Einzelschnitt im Bereich der Wurzelspitze. Grün = GFPFluoreszenz, Rot = Propidiumiodidfärbung, Maßstab: 5 mm in A und C, 50 µm in F, I und K-P, 1 µm in
B, D, E, G, H und J.
In den reproduktiven Geweben waren MTI1 und DEP1 in den Leitbündeln der Kelch- und
Blütenblätter, den Leitbündeln der Antheren, sowie in Pollen und im Fruchtknoten exprimiert
(Abb. 24 A-D). Außerdem waren beide Gene in Schoten (Abb. 24 E, G), in reifenden Samen
(Abb. 24 F, H) und in allen Stadien der Embryonalentwicklung exprimiert (Abb. 24 I-P).
- 30 -
ERGEBNISSE
Abb. 24: Expression von MTI1 und DEP1 in reproduktiven Geweben.
(A-P) GUS-Färbungen bzw. fluoreszenzmikroskopische Aufnahmen von pMTI1::MTI1-GUS-,
pDEP1::DEP1-GUS-, pMTI1::MTI1-GFP- bzw. pDEP1::DEP1-GFP-Geweben: (A-D) Blüten, (E, G)
Geschlossene Schoten, (F, H) Reifende Samen, (I, M) Embryo im globulären Stadium innerhalb der
Samenhülle, (I, M) Embryo im globulären Stadium, (K, O) Embryo im Herzstadium, (L, P) Embryo im
Torpedostadium. Grün = GFP-Fluoreszenz, Rot = Chlorophyll-Autofluoreszenz. Maßstab: 1 mm in A-D,
F und G, 50 µm in F und H, 10 µm in I, L, M und P, 1 µm in J, K, N und O.
3.1.6.2
Subzelluläre Lokalisation von MTI1 und DEP1
Um die subzelluläre Lokalisation von MTI1 und DEP1 bestimmen zu können wurden N- und Cterminale GFP-Fusionen mit den kodierenden Sequenzen der Gene unter der Kontrolle des
CaMV35S-Promotors hergestellt (siehe 5.2.7 Klonierungsstrategien). Jedes dieser 4
Konstrukte wurden zusammen mit einer cytoplasmatischen Kontrolle in Arabidopsis
Mesophyllprotoplasten transformiert. Als Kontrollkonstrukt wurde pCaMV35S::CaM2-mCherry
verwendet, für das Fischer et al. (2013) eine cytoplasmatische Lokalisation zeigten. Die
transformierten Protoplasten wurden mittels konfokaler Laserscanningmikroskopie analysiert.
Die subzelluläre Lokalisation von MTI1 bzw. DEP1 war identisch mit der subzellulären
Lokalisation der cytoplasmatischen Kontrolle (Abb. 25 C, F, I, L) und die Position des
Fluorophors hatte darauf keinen Einfluss. Dies zeigt, dass MTI1 und DEP1 im Cytoplasma
lokalisiert sind.
- 31 -
ERGEBNISSE
Abbildung 25: Subzelluläre Lokalisation von MTI1 und DEP1.
(A-L) Kolokalisation von C- und N-terminalen MTI1- bzw. DEP1-GFP-Fusionen mit cytosolischem
mCherry in Arabidopsis-Mesophyllprotoplasten: (A, D, G, J) GFP-Kanal, (B, E, H, K) mCherry-Kanal,
(C, F, I, L) Fluoreszenzüberlagerung. Grün = GFP-Fluoreszenz, Rot = mCherry-Fluoreszenz, Gelb =
Fluoreszenzüberlagerung, Blau = Chloroplasten. Alle Bilder zeigen konfokale Einzelschnitte. Maßstab:
5 µm.
3.1.6.3
Phloemspezifische Komplementation von mti1- und dep1-Pflanzen
Wachstum bei Schwefelmangel verursachte reproduktive Defekte in den Yang-ZyklusMutanten mti1 und dep1. Die Gene des Yang-Zyklus werden hauptsächlich im Leitgewebe
exprimiert. Um zu überprüfen ob Yang-Zyklus-Aktivität im Phloem ausreicht um den
Schwefelmagelphänotyp von mti1 bzw dep1 zu komplementieren, wurden phloemspezifische
Komplementationsexperimente durchgeführt. Dazu wurden Konstrukte erstellt, welche die
kodierenden Sequenzen von MTI1 bzw. DEP1 unter der Kontrolle des geleitzellspezifischen
SUC2-Promotors (Truernit und Sauer, 1995; Stadler und Sauer, 1996; Imlau et al., 1999)
exprimierten (siehe 5.2.7 Klonierungsstrategien). Das pSUC2::MTI1-Konstrukt wurde in die
mti1-1 Mutante eingebracht und die resultierende Komplementationslinie wurde SM genannt.
Das pSUC2::DEP1-Konstrukt wurde in die dep1-1 Mutante eingebracht und die resultierende
Komplementationslinie wurde SD genannt. Zusätzlich wurden die Komplementationslinien MM
und DD, welche MTI1 bzw. DEP1 unter der Kontrolle des jeweils eigenen Promotors
exprimieren, als Kontrolle verwendet. Bei Wachstum in Hoagland Medium mit 10 µM Sulfat
zeigten die mti1-1- und dep1-1-Mutanten, die durch Schwefelmangel induzierten
Wachstumsdefekte. Die Mutanten bildeten gegenüber dem WT eine kürzere Infloreszenz
(Abb. 26 A-D) und kürzere Schoten ohne Samen (Abb. 26 E-H). Im Gegensatz dazu, zeigten
alle Komplementationslinien den WT-Phänotyp. Weder die Infloreszenzhöhe (Abb. 26 A-D),
noch die Länge und Anzahl der Schoten (Abb. 26 E-H) war in SM bzw. SD gegenüber dem
WT verändert. Sowohl die WT-Pflanzen, als auch die SM- bzw. SD-Pflanzen produzierten reife
und fertile Samen. Die Keimungsrate glich mit 91 bzw. 109 % der Keimungsrate von WTPflanzen.
Diese Ergebnisse zeigen, dass Yang-Zyklus-Aktivität im Phloem ausreichend ist um den durch
Schwefelmangel induzierten Wachstumsdefekt von mti1 bzw. dep1 zu beheben. Die erhöhte
Sensitivität der Mutanten bei Schwefelmangel wird offensichtlich durch einen
phloemlokalisierten Faktor, vermutlich Nicotianamin und/oder Polyamine verursacht.
- 32 -
ERGEBNISSE
Abb. 26: Phloemspezifische Komplementation von mti1- und dep1-Pflanzen.
(A-J) Auswertungen von 5 Wochen alten Arabidopsis-Pflanzen, gewachsen in Hoagland Medium mit 10
µM Sulfat: (A-B) Habitus, (C-D) Quantifikation der Infloreszenzhöhe, (E-F) Schoten, (G-H) Quantifikation
der Schotenlänge und Schotenanzahl, (I-J) Reife Samen. MM = mti1-1 + pMTI1::MTI1-GFP, SM = mti11 + pSUC2::MTI1, DD = dep1-1 + pDEP1::DEP1-GFP, SD = dep1-1 + pSUC2::DEP1. Die
Balkendiagramme zeigen die errechneten Durchschnittswerte und Standardfehler mit Daten von jeweils
5 Pflanzen. Maßstab: 1 cm in A, B, E und F, 500 µm in I und J.
- 33 -
ERGEBNISSE
3.1.6.4
Expressionsmuster der NAS-Gene
Der Yang-Zyklus dient unter anderem der Unterstützung der Nicotianaminsynthese. Um
herauszufinden in welchen Geweben Nicotianamine produziert werden, wurde die Expression
der vier Arabidopsis-NAS-Gene mit Hilfe von Promotor-Gen-Reporterpflanzen untersucht.
Diese exprimierten jeweils eine Fusion der genomischen Sequenz des NAS1-, NAS2-, NAS3bzw. NAS4-Gens mit dem GUS-Reportergen, unter der Kontrolle des NAS1- (1770 bp), NAS2(1771 bp), NAS3- (1844 bp ) bzw. NAS4- (2350 bp) Promotors (siehe 5.2.7
Klonierungsstrategien). NICOTIANAMINE SYNTHASE 1 (NAS1) war sowohl im oberirdischen
Teil der Pflanzen als auch in den Wurzeln exprimiert. Während NAS1 in den Kelch- und
Blütenblätter (Abb. 27 A), den Antheren, sowie den Rosettenblätter (Abb. 27 B) und Schoten
(Abb. 27 D) im Leitgewebe exprimiert war, war es in der Wurzel in Cortex und Endodermis
(Abb. 27 C) exprimiert. NICOTIANAMINE SYNTHASE 2 (NAS2) war nur in der Wurzel
exprimiert (Abb. 27 E-H) und war dort ebenfalls in Cortex und Endodermis zu finden (Abb. 27
G). NICOTIANAMINE SYNTHASE 3 (NAS3) war nur in den oberirdischen Pflanzenteilen
exprimiert. NAS3 war in den Leitbündeln der Kelch- und Blütenblätter, der Antheren (Abb. 27
I), der Rosettenblättern (Abb. 27 J) und in den Schoten (Abb. 27 L) exprimiert. Zusätzlich war
NAS3 auch im Pollen exprimiert (Abb. 27 I). NICOTIANAMINE SYNTHASE 4 (NAS4) war
hauptsächlich an der Basis von Seitenwurzeln exprimiert (Abb. 27 O). Bei längerer GUSFärbung (über Nacht) von pNAS4::NAS4-GUS-Geweben konnte auch eine Färbung in den
Leitbündeln der Rosettenblätter (Abb. 27 N) und im Zentralzylinder der Wurzel (Abb. 27 O),
nie jedoch in Wurzelspitzen, beobachtet werden. Die schnellste und stärkste Färbung war
jedoch immer an der Basis von Seitenwurzeln zu finden. Diese Ergebnisse zeigen, dass die
Nicotianaminsynthese neben der Cortex- und Endodermisschicht der Wurzel hauptsächlich
entlang dem Leitgewebe stattfindet.
- 34 -
ERGEBNISSE
Abb. 27: Expression der NAS-Gene.
(A-D) Expression der NICOTIANAMINE SYNTHASE 1: (A) Blüte, (B) Rosettenblatt, (C)
Wurzeldifferenzierungszone mit hervortretender Seitenwurzel, (D) Schote. (E-H) Expression der
NICOTIANAMINE SYNTHASE 2: (E) Blüte, (F) Rosettenblatt, (G) Wurzeldifferenzierungszone mit
hervortretender Seitenwurzel, (H) Schote. (I-L) Expression der NICOTIANAMINE SYNTHASE 3: (I)
Blüte, (J) Rosettenblatt, (K) Wurzeldifferenzierungszone mit hervortretender Seitenwurzel, (L) Schote.
(M-P) Expression der NICOTIANAMINE SYNTHASE 4: (M) Blüte, (N) Rosettenblatt, (O)
Wurzeldifferenzierungszone mit hervortretender Seitenwurzel, (P) Schote. Maßstab: 1 cm in B, F, J und
N, 1 mm in A, D, E, H, I, L, M und P, 10 µm in C, G, K und O.
3.1.6.5
Expressionsmuster von Genen der Polyaminsynthese
Auch bei der Synthese von Polyaminen fällt MTA an. Um herauszufinden in welchen Geweben
Polyamine produziert werden, wurde die Expression der Arabidopsis Polyaminsynthesegene
N-CARBAMOYLPUTRESCINE AMINOHYDROLASE (CPA), SPERMIDINE SYNTHASE 1
(SPDS1), SPERMIDINE SYNTHASE 2 (SPDS2) und SPERMINE SYNTHASE (SPMS) mit
Hilfe von Promotor-Gen-Reporterpflanzen untersucht. Diese exprimierten jeweils eine Fusion
der genomischen Sequenz des CPA, SPDS1, SPDS2 oder SPMS Gens mit dem GUSReportergen, unter der Kontrolle des CPA (1326 bp), SPDS1 (1968 bp), SPDS2 (1428 bp) bzw.
SPMS (1982 bp) Promotors (siehe 5.2.7 Klonierungsstrategien). CPA kodiert eine
- 35 -
ERGEBNISSE
Putrescinsynthase (Piotrowski et al., 2003), SPDS1 und SPDS2 kodieren Spermidinsynthasen
(Hanzawa et al., 2002; Imai et al., 2004b) und SPMS kodiert eine Sperminsynthase (Hanzawa
et al., 2002; Imai et al., 2004a). Alle 4 Promotor-Gen-Reporterpflanzen zeigten GUS-Färbung
in denselben Geweben (Abb. 28). Alle 4 Gene waren in den Leitgeweben der Kelch- und
Blütenblättern, der Antheren (Abb. 28 A, E, I, M) und der Schoten (Abb. 28 D, H, L, P)
exprimiert. Die Promotor-Gen-GUS Linien zeigten stets starke Färbung im Pollen, in der Narbe
(Abb. 28 A, E, I, M), im Zentralzylinder der Wurzel und in den Wurzelspitzen (Abb. 28 C, G, K,
O). In gesunden Rosettenblätter war keine GUS-Färbung zu sehen (Abb. 28 B, F, J, N),
während gestresste oder verwundete Rosettenblätter eine starke Färbung zeigten (nicht
gezeigt).
Abb. 28: Expression von Genen der Polyaminsynthese.
(A-D) Expression von CPA: (A) Blüte, (B) Junges Blatt, (C) Wurzeldifferenzierungszone mit
hervortretender Seitenwurzel, (D) Schote. (E-H) Expression von SPDS1: (E) Blüte, (F) Junges Blatt, (G)
Wurzeldifferenzierungszone mit hervortretender Seitenwurzel, (H) Schote. (I-L) Expression von SPDS2:
(I) Blüte, (J) Junges Blatt, (K) Wurzeldifferenzierungszone mit hervortretender Seitenwurzel, (L) Schote.
(M-P) Expression von SPMS: (M) Blüte, (N) Junges Blatt, (O) Wurzeldifferenzierungszone mit
hervortretender Seitenwurzel, (P) Schote. Maßstab: 1 mm in A, D, E, H, I, L, M und P, 100 µm in B, F,
J und N, 10 µm in C, G, K und O.
- 36 -
ERGEBNISSE
Diese Ergebnisse zeigen, dass die Polyaminsynthese hauptsächlich im Leitgewebe und den
reproduktiven Organen stattfindet.
3.1.7
Auswirkungen von Yang-Zyklus-Defekten auf die Nicotianaminsynthese
Da der durch Schwefelmangel induzierte Wachstumsphänotyp der mti1- und dep1-Mutanten
mit dem Phloem assoziiert war und die Nicotianaminsynthese zu großen Teilen im Leitgewebe
stattfand, wurde der Einfluss von Schwefelmangel auf die Nicotianaminsynthese untersucht.
3.1.7.1
Nicotianaminkonzentration in Abhängigkeit von der Sulfatkonzentration
Die Nicotianaminkonzentrationen wurden in den Infloreszenzen, Blättern und Wurzeln von
Mutanten- und WT-Pflanzen bei verschiedenen Sulfatkonzentrationen gemessen. Die
gemessenen Werte bewegen sich im Vergleich zu früheren Studien in einem ähnlichen
Konzentrationsbereich (Klatte et al., 2009; Waduwara-Jayabahu et al., 2012). Die gemessenen
Nicotianaminkonzentration in den Infloreszenzen (Abb. 29 A) und Wurzeln (Abb. 29 C) war
ca. viermal höher, als in den Rosettenblättern (Abb. 29 B). Die Nicotianaminkonzentration von
Pflanzen, die in 10 bis 30 µM Sulfat wuchsen, war in allen Geweben von der
Sulfatkonzentration abhängig. Pflanzen, die in 10 µM Sulfat wuchsen, hatten nur ca. 50% der
Nicotianaminkonzentration von Pflanzen, die in 30 oder 40 µM Sulfat wuchsen. Zwischen 30
und 40 µM Sulfat waren die Werte meist ähnlich. Dies deutet darauf hin, das die maximale
Nicotianminkonzentration bereits bei Wachstum in 30 µM Sulfat erreicht werden konnte.
Zwischen den Genotypen des selben Ökotyps konnten in den Rosettenblättern und
Infloreszenzen keine signifikanten Unterschiede zum WT gemessen werden. Nur in den
Wurzelproben der Col-basierten Mutanten fanden sich signifikante Unterschiede (t-test,
p<0,05) zum WT. Bei Wachstum in 10 µM Sulfat war die Nicotianminkonzentration von dep11 bzw. dep1-2 um 45 bzw. 35% geringer als im WT. Auch bei Wachstum in 20 µM Sulfat war
die Nicotianminkonzentration von mti1-2, dep1-1 bzw. dep1-2 gegenüber dem WT um 38, 50
bzw. 48% geringer.
Diese Ergebnisse zeigen, dass die Nicotianaminkonzentration bei Schwefelmangel abnimmt.
Obwohl sich die Wurzelkonzentration in den Mutanten bei Schwefelmangel verringert,
scheinen
Mutationen
im
Yang-Zyklus
allerdings
kaum
Einfluss
auf
die
Nicotianaminkonzentration in den Infloreszenzen zu haben.
- 37 -
ERGEBNISSE
Abb. 29: Nicotianaminkonzentration in Abhängigkeit der Sulfatkonzentration
(A-C) Nicotianaminkonzentration (ng/mg Frischgewicht) in Geweben von Pflanzen, die in Hoagland
Medium mit 10 – 40 µM Sulfat wuchsen: (A) Infloreszenz, (B) Rosette, (C) Wurzel. Die Balkendiagramme
zeigen die errechneten Durchschnittswerte und Standardfehler mit Daten aus jeweils drei unabhängigen
Experimenten.
3.1.7.2
NAS-Expression in Abhängigkeit von der Sulfatkonzentration
Zur Analyse der NAS-Genexpression wurde quantitative RT-PCR mit cDNA von Mutanten- und
WT-Pflanzen durchgeführt, die in Hoagland Medium mit 10 – 40 µM Sulfat wuchsen (Abb. 30).
Da bei den Nicotianaminmessungen die stärksten Unterschiede in der Wurzel gefunden
wurden, wurde Wurzel-cDNA für die qRT-PCR verwendet und die Expression von NAS1, NAS2
und NAS4 analysiert. NAS3 wurde nicht analysiert, da dieses Gen nicht in Wurzeln exprimiert
wird (siehe Abb. 27). Während die Expression von NAS1 größtenteils unverändert schien, war
die Expression von NAS2 und NAS4 abhängig von der Sulfatkonzentration. Bei abnehmender
Sulfatkonzentration nahm die Expression dieser Gene ab. Für Änderungen zwischen den
Genotypen des selben Ökotyps wurden im folgenden nur signifikante Werte (t-test, p<0,05) mit
einer Änderung um den Faktor 2 oder höher berücksichtigt. In mit1-1 mit 20 bzw. 30 µM Sulfat
war die Expression von NAS2 27 bzw. 48% von WT-Pflanzen. Die Expression von NAS4 war
- 38 -
ERGEBNISSE
für mti1-2 und dep1-1 bei 10 µM Sulfat 26 bzw. 37% von WT-Pflanzen, für dep1-1 und dep1-2
bei 20 µM Sulfat 22 bzw. 41% von WT-Pflanzen, für dep1-1 bei 30 µM Sulfat 27% von WTPflanzen und für dep1-1 bei 40 µM Sulfat 50% von WT-Pflanzen. Diese Ergebnisse deuten
eine Verringerung der NAS-Expression bei Schwefelmangel, sowie einen tendentielle
stärkeren Rückgang der NAS-Expression in den mti1- und dep1-Mutanten an.
Abb. 30: Expression der NAS-Gene in Abhängigkeit der Sulfatkonzentration.
(A-C) qRT-PCR Analyse mit Wurzel cDNA aus 5 Wochen alten Arabidopsis-Pflanzen, gewachsen in
Hoagland Medium mit 10 – 40 µM Sulfat: (A) NAS1-Expression, (B) NAS2-Expression, (C) NAS4Expression. Die Balkendiagramme zeigen die errechneten Durchschnittswerte und Standardfehler mit
Daten aus jeweils drei unabhängigen Experimenten. Die 10 µM Sulfatwerte der WT Pflanzen wurden
auf 1 gesetzt und alle anderen Werte darauf bezogen.
3.1.7.3
Konzentrationen von Eisen-, Zink- und Kupferionen in Abhängigkeit
von der Sulfatkonzentration
Nicotianamin ist ein pflanzlicher Metallionenchelator der maßgeblich zur Mobilität von Eisen-,
Zink- und Kupferionen im Phloem beiträgt. Um zu testen, ob sich die reduzierten
Nicotianaminkonzentrationen bei Schwefelmangel auch auf die Konzentrationen von Eisen-,
Zink- und Kupferionen auswirken, wurde mit den Infloreszenzen von Mutanten- und WTPflanzen eine Elementanalyse durchgeführt (Abb. 31). Die Konzentrationen der Eisenionen
schwankten zwischen 60 – 80 µg/mg Trockengewicht und waren nicht vom Schwefelstatus
abhängig. Sie zeigten keine signifikanten Änderungen (t-test, p<0,05) zwischen allen
Genotypen und Bedingungen. Die Konzentration der Zinkionen war ebenfalls bei allen
Genotypen unverändert. Jedoch lag sie in Pflanzen, die mit 10 µM Sulfat wuchsen bei ca. 40
- 39 -
ERGEBNISSE
µg/mg Trockengewicht, bei Pflanzen, die mit 20 – 40 µM Sulfat wuchsen nur bei ca. 30 µg/mg
Trockengewicht. Die Konzentrationen der Kupferionen schwankten zwischen 2 und 8 µg/mg
Trockengewicht und waren nicht vom Schwefelstatus abhängig. Diese Ergebnisse zeigen,
dass die Versorgung der Infloreszenzen mit Eisen-, Zink und Kupferionen in den Mutanten,
trotz sinkender Nicotianaminkonzentrationen bei Schwefelmangel, nicht beeinflusst war.
Abb. 31: Konzentration von Eisen-, Zink- und Kupferionen in Abhängigkeit der
Sulfatkonzentration.
(A-C) Konzentrationen (µg/mg Trockengewicht) von Metallionen in den Infloreszenzen 5 Wochen alter
Arabidopsis-Pflanzen, gewachsen in Hoagland Medium mit 10 – 40 µM Sulfat: (A) Konzentration der
Eisenionen, (B) Konzentration der Zinkionen, (C) Konzentrationen der Kupferionen. Die
Balkendiagramme zeigen die errechneten Durchschnittswerte und Standardfehler mit Daten aus jeweils
drei unabhängigen Experimenten.
3.1.8
Auswirkungen von Yang-Zyklus-Defekten auf die Synthese von Putrescin,
Spermidin und Spermin
Neben den Genen der Nicotianaminsynthese sind auch die Gene der Polyaminsynthese im
Leitgewebe zu finden. Der durch Schwefelmangel induzierte Wachstumsdefekt der mti1- und
dep1-Mutanten könnte also auch auf gestörten Polyaminstoffwechsel zurückzuführen sein. Um
den Einfluss des Yang-Zyklus auf die Polyaminsynthese bei Schwefelmangel beurteilen zu
können, wurden die Putrescin-, Spermidin- und Sperminkonzentrationen bei verschiedenen
Sulfatkonzentrationen gemessen.
- 40 -
ERGEBNISSE
3.1.8.1
Putrescinkonzentration in Abhängigkeit von der Sulfatkonzentration
Die Putrescinkonzentrationen wurden in den Infloreszenzen (Abb. 32 A), Rosettenblättern
(Abb. 32 B) und Wurzeln (Abb. 32 C) von Mutanten- und WT-Pflanzen, die in Hoagland
Medium mit 10 – 40 µM Sulfat wuchsen, bestimmt. Die gemessenen Werte bewegten sich im
Vergleich zu früheren Studien in einem ähnlichen Konzentrationsbereich (Naka et al., 2010;
Waduwara-Jayabahu et al., 2012). Die Putrescinkonzentrationen lagen in den Rosettenblättern
zwischen ca. 25 und 100 nmol/g Frischgewicht, in den Infloreszenzen zwischen ca. 75 und 150
nmol/g Frischgewicht und in den Wurzeln zwischen 100 und maximal 300 nmol/g
Frischgewicht. Tendentiell waren die Putrescinkonzentration bei 10 bzw. 20 µM Sulfat niedriger
als bei 30 bzw. 40 µM Sulfat. Obwohl in den Wurzeln die höchsten Putrescinwerte gemessen
wurden fanden sich dort jedoch keine signifikanten Änderungen (t-test, p<0,05) zwischen den
Mutanten- und WT-Pflanzen. In den Blattrosetten war die Putrescinkonzentration in dep1-2 bei
10 bzw. 20 µM Sulfat um 23 bzw. 59% im Vergleich zum WT reduziert. In den Infloreszenzen
waren die Putrescinkonzentrationen in mti1-1 bei 10 µM Sulfat um 35% und in dep1-1 bzw.
dep1-2 jeweils um 40% reduziert. Diese Erbebnisse zeigen, dass die Putrescinkonzentration
von der Sulfatkonzentration abhängig und in den oberirdischen Geweben bei Schwefelmangel
reduziert war.
Abb. 32: Putrescinkonzentration in Abhängigkeit der Sulfatkonzentration.
(A-C) Konzentration von Putrescin (Put) in Geweben von 5 Wochen alten Arabidopsis-Pflanzen,
gewachsen in Hoagland Medium mit 10 – 40 µM Sulfat: (A) Infloreszenz, (B) Rosette, (C) Wurzel. Die
Balkendiagramme zeigen die errechneten Durchschnittswerte und Standardfehler mit Daten aus jeweils
drei unabhängigen Experimenten.
- 41 -
ERGEBNISSE
3.1.8.2
Spermidinkonzentration in Abhängigkeit von der Sulfatkonzentration
Die Spermidinkonzentrationen wurden ebenfalls in den Infloreszenzen (Abb. 33 A),
Rosettenblättern (Abb. 33 B) und Wurzeln (Abb. 33 C) von Mutanten- und WT-Pflanzen, die
in Hoagland Medium mit 10 – 40 µM Sulfat wuchsen, bestimmt. Die gemessenen Werte
bewegten sich im Vergleich zu früheren Studien in ähnlicher Höhe (Naka et al., 2010;
Waduwara-Jayabahu et al., 2012). Die Spermidinkonzentrationen lagen in den
Rosettenblättern zwischen ca. 20 und 35 nmol/g Frischgewicht und in den Wurzeln zwischen
125 und maximal 300 nmol/g Frischgewicht. Weder in den Rosettenblättern noch in den
Wurzeln waren signifikante Unterschiede (t-test, p<0,05) zwischen den Genotypen des selben
Ökotyps erkennbar. In den Infloreszenzen lag die Spermidinkonzentration bei ca. 80 nmol/g
Frischgewicht in allen Ökotypen und Bedingungen, mit Ausnahme von dep1-1 und dep1-2 bei
10 µM Sulfat. Die Spermidinkonzentration von dep1-1 und dep1-2 bei 10 µM Sulfat war im
Vergleich zum WT um 80 bzw. 73% reduziert. Diese Ergebnisse zeigen einen starken
Rückgang der Spermidinkonzentration in den Inflorszenzen der Columbia-basierten Mutanten
an.
Abb. 33: Spermidinkonzentration in Abhängigkeit der Sulfatkonzentration.
(A-C) Konzentration von Spermidin (Spd) in Geweben von 5 Wochen alten Arabidopsis-Pflanzen,
gewachsen in Hoagland Medium mit 10 – 40 µM Sulfat: (A) Infloreszenz, (B) Rosette, (C) Wurzel. Die
Balkendiagramme zeigen die errechneten Durchschnittswerte und Standardfehler mit Daten aus jeweils
drei unabhängigen Experimenten.
- 42 -
ERGEBNISSE
3.1.8.3
Sperminkonzentration in Abhängigkeit von der Sulfatkonzentration
Neben der Putrescin- und Spermidinkonzentration wurde auch die Sperminkonzentration in
den Infloreszenzen (Abb. 34 A), Rosettenblättern (Abb. 34 B) und Wurzeln (Abb. 34 C) von
Mutanten- und WT-Pflanzen, die in Hoagland Medium mit 10 – 40 µM Sulfat wuchsen,
bestimmt. Die gemessenen Werte bewegten sich im Vergleich zu früheren Studien in einem
ähnlichen Konzentrationsbereich (Naka et al., 2010; Waduwara-Jayabahu et al., 2012). In den
Rosettenblättern lag die Sperminkonzentration bei ca. 5 nmol/g Frischgewicht, in der
Infloreszenz und in der Wurzel bei ca. 30 bzw. 40 nmol/g Frischgewicht. Die Konzentrationen
waren zwischen den Genotypen und Bedingungen konstant. Einzig die Sperminkonzentration
von Col in der Infloreszenz bei 10 µM Sulfat war verändert. Im Gegensatz zu 20 – 40 µM Sulfat
war die Sperminkonzentration bei 10 µM Sulfat um mindestens 60% niedriger. Die
Sperminmessungen deuten darauf hin, dass die Konzentration zwischen den verschiedenen
Genotypen und Bedingungen größtenteils unbeeinflusst ist.
Abb. 34: Sperminkonzentration in Abhängigkeit der Sulfatkonzentration.
(A-C) Konzentration von Spermin (Spm) in Geweben von 5 Wochen alten Arabidopsis-Pflanzen,
gewachsen in Hoagland Medium mit 10 – 40 µM Sulfat: (A) Infloreszenz, (B) Rosette, (C) Wurzel. Die
Balkendiagramme zeigen die errechneten Durchschnittswerte und Standardfehler mit Daten aus jeweils
drei unabhängigen Experimenten.
3.1.8.4
Expression von SPDS1 in Abhängigkeit von der Sulfatkonzentration
Um zu überprüfen, ob der starke Rückgang der Spermidinkonzentration in den Infloreszenzen
der Mutanten bei Schwefelmangel mit einer verringerten Expression des SPDS1-Gens
- 43 -
ERGEBNISSE
einherging, wurden qRT-PCR-Analysen mit cDNA aus den Infloreszenzen von Mutanten- und
WT-Pflanzen bei verschiedenen Sulfatkonzentrationen durchgeführt. Die Expression von
SPDS1 war zwischen allen Genotypen und Bedingungen konstant (Abb. 35).
Abb. 35: Expression von SPDS1 in Abhängigkeit von der Sulfatkonzentration.
Die Expression von SPDS1 wurde mittels qRT-PCR-Analysen in den Infloreszenz von 5 Wochen alten
Arabidopsis-Pflanzen, gewachsen in Hoagland Medium mit 10 – 40 µM Sulfat, bestimmt. Das
Balkendiagramm zeigt die errechneten Durchschnittswerte und Standardfehler mit Daten aus jeweils
drei unabhängigen Experimenten. Die Werte der WT-Pflanzen, die mit 10 µM Sulfat wuchsen, wurden
auf 1 gesetzt und alle anderen Werte darauf bezogen.
3.1.9
Auswirkungen von Yang-Zyklus-Defekten auf die Tspm-Synthese
Thermospermin ist das pflanzenspezifische Isomer des Tetramins Spermin. Da sich
Thermospermin leider mit gängigen, quantitativen Analyseverfahren nicht von Spermin
unterscheiden lässt, konnten die Auswirkungen von Schwefelmangel auf die
Thermosperminkonzentration nicht gemessen werden.
3.1.9.1
Expression von BUD2 und ACL5 in Abhängigkeit von der Sulfatkonzentration
Um die Auswirkungen von Schwefelmangel auf die Thermosperminsynthese zu untersuchen,
wurde die Expression von BUSHY AND DWARF 2 (BUD2) und ACAULIS 5 (ACL5) in den
Infloreszenzen von Mutanten und WT-Pflanzen, die in Hoagland Medium mit 10 – 40 µM Sulfat
wuchsen, untersucht. Für beide Gene wurde eine Beteiligung an der Synthese von
Thermospermin nachgewiesen (Clay und Nelson, 2005; Ge et al., 2006; Muniz et al., 2008).
Die Expression von BUD2 und ACL5 war zwischen den Genotypen und Bedingungen
weitgehend konstant, allerdings verringerte sich die Expression in dep1-1- und dep1-2Pflanzen bei 10 µM Sulfat um ca. 50% (Abb. 36). Die Verringerung der BUD2 und ACL5
Expression bei 10 µM Sulfat könnte eine Verringerung der Thermosperminsynthese bei
starkem Schwefelmangel andeuten.
- 44 -
ERGEBNISSE
Abb. 36: Expression von BUD2 und ACL5 in Abhängigkeit von der Sulfatkonzentration.
qRT-PCR-Analysen in den Infloreszenz von 5 Wochen alten Arabidopsis-Pflanzen, gewachsen in
Hoagland Medium mit 10 – 40 µM Sulfat: (A) Expression von BUD2, (B) Expression von ACL5. Die
Balkendiagramm zeigen die errechneten Durchschnittswerte und Standardfehler mit Daten aus jeweils
drei unabhängigen Experimenten. Die Werte der WT-Pflanzen, die mit 10 µM Sulfat wuchsen, wurden
auf 1 gesetzt und alle anderen Werte darauf bezogen.
3.1.9.2
Leitgewebeanatomie von mti1- und dep1-Infloreszenzen
Da sich mit Thermospermin-assoziierte Defekte stark auf die Leitgewebeanatomie auswirken,
wurde diese in mti1- und dep1-Pflanzen unter Schwefelmangel untersucht. Pflanzen mit
Thermosperminmangel zeigen eine Überproliferation der Xylemgefäße (Clay und Nelson,
2005; Ge et al., 2006; Muniz et al., 2008; Waduwara-Jayabahu et al., 2012). Das Xylem in den
Stängeln der mti1- und dep1-Pflanzen, die in Hoagland Medium mit 10 µM Sulfat wuchsen,
schien gegenüber dem jeweiligen WT nicht verändert zu sein (Abb. 37). Diese Ergebnisse
weisen darauf hin, dass mti1 und dep1 nicht an Thermosperminmangel litten.
Abb. 37: Autofluoreszenz der Xylemgefäße.
Stängelquerschnitte von 5 Wochen alten Arabidopsis-Pflanzen, gewachsen in Hoagland Medium mit 10
µM Sulfat. Die Anregung der Querschnitte erfolgte mit UV-Licht. Das Emissionlicht wurde mit einem
DAPI-Filter (440 – 490 nm) gefiltert. Blau = Autofluoreszenz von Lignin im Xylem, Rot = Autofluoreszenz
von Chlorophyll. Maßstab = 20 µm.
- 45 -
ERGEBNISSE
3.1.10
Chemische Komplementation von mti1- und dep1-Pflanzen
Das Wachstum der mti1- bzw. dep1-Mutanten ist bei Schwefelmangel, gegenüber dem WT,
stärker beeinträchtigt. Mutationen im Yang-Zyklus könnten theoretisch zu einem Mangel an
Ethylen, Nicotianamin und/oder Polyaminen führen. Es wurde deshalb versucht, die durch
Schwefelmangel induzierten Wachstumsdefekte durch externe Applikation von ACC,
Nicotianamin oder Polyaminen zu lindern.
3.1.10.1
Externe Applikation von ACC oder Nicotianamin
Um festzustellen, ob die mti1- und dep1-Pflanzen an einem Mangel von Ethylen- oder
Nicotianamin litten, wurden die Pflanzen auf ½MS-Platten mit entweder 50 µM Sulfat, 50 µM
Sulfat + 10 µM ACC oder 50 µM Sulfat + 10 µM Nicotianamin angezogen (Abb. 38). Beide
Substanzen können aus dem Medium aufgenommen werden und wurden bereits in ähnlicher
Konzentration zur Komplementation eingesetzt (Waduwara-Jayabahu et al., 2012; Shin et al.,
2015). Interessanterweise zeigten alle Pflanzen, die mit 10 µM ACC wuchsen, ein satteres
Grün im Vergleich zu Pflanzen, die ohne ACC wuchsen. Weder die Zugabe von 10 µM ACC,
noch die Zugabe von 10 µM Nicotianamin, war allerdings in der Lage den durch
Schwefelmangel induzierten Wachstumsdefekt der Mutanten zu lindern. Diese Ergebnisse
weisen darauf hin, dass der durch Schwefelmangel induzierte Wachstumsdefekt von mti1- und
dep1-Pflanzen nicht durch ACC- oder Nicotianaminmangel verursacht wurde.
Abb. 38: Komplementation von mti1 und dep1 Pflanzen mit ACC bzw. NA.
Phänotyp von 3 Wochen alten mti1- bzw. dep1-Pflanzen auf ½MS-Platten mit 50 µM Sulfat (links), 50
µM Sulfat + 10 µM ACC (Mitte) oder 50 µM Sulfat + 10 µM NA (rechts). Maßstab = 1cm.
- 46 -
ERGEBNISSE
3.1.10.2
Externe Applikation von Putrescin
Die Polyaminmessungen ergaben teilweise geringere Konzentrationen in den Infloreszenzen
der Mutanten. Um zu prüfen, ob die verringerten Polyaminkonzentrationen bei Schwefelmangel
für das verschlechterte Wachstum von mti1- und dep1-Pflanzen ausschlaggebend sind,
wurden chemische Komplementationsexperimente durchgeführt. Dazu wurden 1, 10 bzw. 100
µM Putrescin, Spermidin oder Spermin zu Mutanten- und WT-Pflanzen gegeben, die in
Hoagland Medium mit 10 µM Sulfat wuchsen. Die Zugabe erfolgte dabei ab dem Start der
Infloreszenzentwicklung direkt in das Hoagland Medium. Die Zugabe von 100 µM Putrescin,
Spermidin oder Spermin wirkte sich stark negativ auf das Pflanzenwachstum aller Genotypen
aus, weshalb nur die Zugaben von 1 bzw. 10 µM weiter analysiert wurden.
Die Ergebnisse der Zugabe von 0, 1 bzw. 10 µM Putrescin zu Pflanzen, die in Hoagland
Medium mit 10 µM Sulfat wuchsen, sind in Abb. 39 und 40 dargestellt. Die mti1- bzw. dep1Mutanten zeigten den typischen, durch Schwefelmangel induzierten Wachstumsdefekt. Weder
die Infloreszenzhöhe (Abb. 39), noch die Anzahl und Länge der Schoten (Abb. 40) veränderte
sich durch die Zugabe von Putrescin. Diese Ergebnisse zeigen, dass die externe Zugabe von
Putrescin den negativen Effekt von Schwefelmangel auf das Wachstum der Pflanzen nicht
verringern kann.
- 47 -
ERGEBNISSE
Abb. 39: Komplementation von mti1- und dep1-Pflanzen mit Putrescin – Habitus.
(A-F) Habitus von 5 Wochen alten Arabidopsis-Pflanzen, gewachsen in Hoagland Medium mit 10 µM
Sulfat: (A) Habitus von mti1-1 und Ws nach Zugabe von 0 µM Putrescin, (B) Habitus von mti1-1 und Ws
nach Zugabe von 1 µM Putrescin, (C) Habitus von mti1-1 und Ws nach Zugabe von 10 µM Putrescin,
(D) Habitus von dep1-1 und Col nach Zugabe von 0 µM Putrescin, (E) Habitus von dep1-1 und Col nach
Zugabe von 1 µM Putrescin, (F) Habitus von dep1-1 und Col nach Zugabe von 10 µM Putrescin. (G-H)
Vergleich der Infloreszenzhöhe von 5 Wochen alten Arabidopsis-Pflanzen, gewachsen in Hoagland
Medium mit 10 µM Sulfat: (G) mti1-1 und Ws, (H) dep1-1 und Col. Die Balkendiagramme zeigen die
errechneten Durchschnittswerte und Standardfehler mit Daten von jeweils 5 Pflanzen. Maßstab: 1 cm.
- 48 -
ERGEBNISSE
Abb. 40: Komplementation von mti1- und dep1-Pflanzen mit Putrescin – Schoten.
(A-F) Schoten von 5 Wochen alten Arabidopsis-Pflanzen, gewachsen in Hoagland Medium mit 10 µM
Sulfat: (A) Schoten von mti1-1 und Ws nach Zugabe von 0 µM Putrescin, (B) Schoten von mti1-1 und
Ws nach Zugabe von 1 µM Putrescin, (C) Schoten von mti1-1 und Ws nach Zugabe von 10 µM Putrescin,
(D) Schoten von dep1-1 und Col nach Zugabe von 0 µM Putrescin, (E) Schoten von dep1-1 und Col
nach Zugabe von 1 µM Putrescin, (F) Schoten von dep1-1 und Col nach Zugabe von 10 µM Putrescin.
(G-H) Vergleich von Schotenlänge und Schotenanzahl: (G) mti1-1 und Ws, (H) dep1-1 und Col. Die
Balkendiagramme zeigen die errechneten Durchschnittswerte und Standardfehler mit Daten von jeweils
5 Pflanzen. Maßstab: 1 mm.
3.1.10.3
Externe Applikation von Spermidin
Die Ergebnisse der Zugabe von 0, 1 bzw. 10 µM Spermidin zu Pflanzen, die in Hoagland
Medium mit 10 µM Sulfat wuchsen sind in Abb. 41 und 42 dargestellt. Die mti1- und dep1Mutanten zeigten den typischen, durch Schwefelmangel induzierten Wachstumsdefekt. Die
Zugabe von 0, 1 bzw. 10 µM Spermidin hatte keinen Einfluss auf die Infloreszenzhöhe der
Pflanzen (Abb. 41). Während die Zugabe von 1 µM Spermidin keinen Einfluss auf die Anzahl
und Länge der Schoten (Abb. 42) hatte, verringerte die Zugabe von 10 µM Spermidin sogar
die Anzahl der Schoten in mti1-1, Ws und Col. Diese Ergebnisse zeigen, dass die externe
Zugabe von Spermidin den negativen Einfluss von Schwefelmangel auf das Wachstum der
Pflanzen nicht verringern kann.
- 49 -
ERGEBNISSE
Abb. 41: Komplementation von mti1 und dep1 Pflanzen mit Spermidin – Habitus.
(A-F) Habitus von 5 Wochen alten Arabidopsis-Pflanzen, gewachsen in Hoagland Medium mit 10 µM
Sulfat: (A) Habitus von mti1-1 und Ws nach Zugabe von 0 µM Spermidin, (B) Habitus von mti1-1 und
Ws nach Zugabe von 1 µM Spermidin, (C) Habitus von mti1-1 und Ws nach Zugabe von 10 µM
Spermidin, (D) Habitus von dep1-1 und Col nach Zugabe von 0 µM Spermidin, (E) Habitus von dep1-1
und Col nach Zugabe von 1 µM Spermidin, (F) Habitus von dep1-1 und Col nach Zugabe von 10 µM
Spermidin. (G-H) Vergleich der Infloreszenzhöhe von 5 Wochen alten Arabidopsis-Pflanzen, gewachsen
in Hoagland Medium mit 10 µM Sulfat: (G) mti1-1 und Ws, (H) dep1-1 und Col. Die Balkendiagramme
zeigen die errechneten Durchschnittswerte und Standardfehler mit Daten von jeweils 5 Pflanzen.
Maßstab: 1 cm.
- 50 -
ERGEBNISSE
Abb. 42: Komplementation von mti1- und dep1-Pflanzen mit Spermidin – Schoten.
(A-F) Schoten von 5 Wochen alten Arabidopsis-Pflanzen, gewachsen in Hoagland Medium mit 10 µM
Sulfat: (A) Schoten von mti1-1 und Ws nach Zugabe von 0 µM Spermidin, (B) Schoten von mti1-1 und
Ws nach Zugabe von 1 µM Spermidin, (C) Schoten von mti1-1 und Ws nach Zugabe von 10 µM
Spermidin, (D) Schoten von dep1-1 und Col nach Zugabe von 0 µM Spermidin, (E) Schoten von dep11 und Col nach Zugabe von 1 µM Spermidin, (F) Schoten von dep1-1 und Col nach Zugabe von 10 µM
Spermidin. (G-H) Vergleich von Schotenlänge und Schotenanzahl: (G) mti1-1 und Ws, (H) dep1-1 und
Col. Die Balkendiagramme zeigen die errechneten Durchschnittswerte und Standardfehler mit Daten
von jeweils 5 Pflanzen. Maßstab: 1 mm.
3.1.10.4
Externe Applikation von Spermin
Während die Zugabe von Putrescin oder Spermidin das Pflanzenwachstum bei
Schwefelmangel nicht verbesserte, führte die Zugabe von Spermin zu einer
konzentrationsabhängigen Steigerung des Wachstums (Abb. 43) und zur teilweisen
Wiederherstellung der Fertilität (Abb. 44). Bereits die Zugabe von 1 µM Spm steigert das
Infloreszenzwachstum von mti1-1 bzw. dep1-1 um das 1,5 bzw. 3,3 fache gegenüber dem
Wachstum ohne Spermin. Auch die Schotenanzahl von mti1-1 bzw. dep1-1 erhöhte sich durch
die Zugabe von Spermin um das 2,6 bzw. 4,8 fache. Die Zugabe von 10 µM Spm steigert das
Infloreszenzwachstum der Mutanten um das 2,9 bzw. 4,5 fache und die Schotenanzahl um das
6,5 bzw. 6,6 fache. Die Zugabe von Spm verbesserte sogar das Wachstum der WT-Pflanzen
bei Schwefelmangel. Die Infloreszenzhöhe von Ws verbesserte sich durch Zugabe von 1 bzw.
10 µM Spm um das 1,3 bzw. 1,1 fache (Abb. 43 B, E). Die Infloreszenzhöhe von Col
verbesserte sich durch Zugabe von 1 bzw. 10 µM Spm um das 1,4 bzw. 1,7 fache (Abb. 43 D,
F). Auch die Schotenanzahl von Col nahm bei Zugabe von 1 bzw. 10 µM Spm um das 1,2 bzw.
1,5 fache zu und sowohl bei Ws als auch Col waren die Schoten tendenziell länger (Abb. 44
E, F). Die Schoten von mti1- bzw. dep1-Pflanzen, die in Hoagland Medium mit 10 µM Sulfat
wuchsen, konnten keine Samenansätze produzieren (Abb. 18 K, L). Die Schoten von mti1bzw. dep1-Pflanzen, die in Hoagland Medium mit 10 µM Sulfat und 10 µM Spermin wuchsen,
- 51 -
ERGEBNISSE
enthielten dagegen wieder größtenteils reifende Samen, die phänotypisch unauffällig waren
(Abb. 44 G-J). Die reifen Samen von mti1- bzw. dep1-Pflanzen, die in Hoagland Medium mit
10 µM Sulfat und 10 µM Spermin wuchsen, sahen im Gegensatz zu WT-Samen allerdings
schrumpelig aus und keimten nur zu 7 bzw. 12%. Diese Ergebnisse zeigen, dass der durch
Schwefelmangel induzierte Wachstumsdefekt der mti1- und dep1-Mutanten zumindest zum
Teil durch einen Sperminmangel verursacht wird.
Leider konnte der Einfluss von Thermospermin auf die Wachstumsdefekte von mti1- und dep1Pflanzen bei Schwefelmangel nicht mit Hilfe von chemischen Komplementationsexperimenten
untersucht werden, da Thermospermin kommerziell nicht erhältlich war.
Abb. 43: Komplementation von mti1- und dep1-Pflanzen mit Spermin - Habitus.
(A-F) Habitus von 5 Wochen alten Arabidopsis-Pflanzen, gewachsen in Hoagland Medium mit 10 µM
Sulfat: (A) Habitus von mti1-1 nach Zugabe von 0, 1 oder 10 µM Spm, (B) Habitus von Ws nach Zugabe
von 0, 1 oder 10 µM Spm, (C) Habitus von dep1-1 nach Zugabe von 0, 1 oder 10 µM Spm, (D) Habitus
von Col nach Zugabe von 0, 1 oder 10 µM Spm. (E) Vergleich der Infloreszenzhöhen von mti1-1 und Ws
nach Zugabe von 0, 1 oder 10 µM Spm, (F) Vergleich der Infloreszenzhöhen von dep1-1 und Col nach
Zugabe von 0, 1 oder 10 µM Spm. Die Balkendiagramme zeigen die errechneten Durchschnittswerte
und Standardfehler mit Daten von jeweils 5 Pflanzen. Maßstab: 1 cm.
- 52 -
ERGEBNISSE
Abb. 44: Komplementation von mti1- und dep1-Pflanzen mit Spermin – Schoten.
(A-N) Schoten und Samen von 5 Wochen alten Arabidopsis-Pflanzen, gewachsen in Hoagland Medium
mit 10 µM Sulfat: (A) Schoten von mti1-1 nach Zugabe von 0, 1 oder 10 µM Spm, (B) Schoten von Ws
nach Zugabe von 0, 1 oder 10 µM Spm, (C) Schoten von dep1-1 nach Zugabe von 0, 1 oder 10 µM Spm,
(D) Schoten von Col nach Zugabe von 0, 1 oder 10 µM Spm, (E) Anzahl und Länge von mti1-1 und Ws
Schoten nach Zugabe von 0, 1 oder 10 µM Spm, (F) Anzahl und Länge von dep1-1 und Col Schoten
nach Zugabe von 0, 1 oder 10 µM Spm. (G, I) Reifende mti1-1 Samen nach Zugabe von 10 µM Spm,
(H, J) Reifende dep1-1 Samen nach Zugabe von 10 µM Spm, (K) Reife mti1-1 Samen nach Zugabe von
10 µM Spm, (L) Reife Ws Samen nach Zugabe von 10 µM Spm, (M) Reife dep1-1 Samen nach Zugabe
von 10 µM Spm, (N) Reife Col Samen nach Zugabe von 10 µM Spm. Die Balkendiagramme zeigen die
errechneten Durchschnittswerte und Standardfehler mit Daten von jeweils 5 Pflanzen. Maßstab: 1 mm
in A-D, G und H und 500 µm in I-N.
3.2
Suche nach Yang-Zyklus-Transaminasen in A. thaliana
Bei der Synthese von Ethylen, Nicotianamin und Polyaminen fällt das Nebenprodukt MTA an.
MTA wird im Yang-Zyklus durch mehrere enzymatische Schritte wieder in Methionin
umgewandelt. In A. thaliana werden für diesen Prozess insgesamt 6 verschiedene Enzyme
benötigt (Abb. 5). Im letzten Schritt dieses Prozesses wird eine Aminogruppe von einem
Aminosäuredonor auf den Metabolit KMTB übertragen und damit Methionin regeneriert. Diese
- 53 -
ERGEBNISSE
Übertragung wird von einer Transaminase vorgenommen. Mit Ausnahme dieser Yang-ZyklusTransaminase(n) sind in Arabidopsis alle Gene des Yang-Zyklus bekannt. Der zweite Teil
dieser Arbeit zeigt die Ergebnisse zur Identifikation dieser KMTB-Transaminase(n).
3.2.1
Homologieanalyse mit bekannten Yang-Zyklus-Transaminasen
Zur Identifizierung von Yang-Zyklus-Transaminasen wurden mit den Aminosäuresequenzen
bereits bekannter Yang-Zyklus-Transaminasen aus anderen Organismen WU-BLASTAnalysen durchgeführt um ähnliche Proteine in Arabidopsis zu identifizieren. Tabelle 1 zeigt
alle für die WU-BLAST-Analyse verwendeten Proteine, sowie deren Arabidopsis-Alignments
mit einer Wahrscheinlichkeit von mindestens e-10 bzw. die besten 3 Alignments. B. subtilis ykrV
kodiert eine pyriodoxalphosphatabhängige KMTB-Transaminase, die Glutamin als
Aminosäuredonor benutzt (Sekowska und Danchin, 2002; Berger et al., 2003; Sekowska et al.,
2004). Der WU-BLAST-Algorithmus fand insgesamt 8 verschiedene Alignments. Das
Arabidopsis Protein mit dem besten Alignment wird vom Genlokus At1g77670 kodiert und ist
bisher nicht charakterisiert. B. subtilis ybgE kodiert eine KMTB-Transaminase, die
verzweigtkettige oder aromatische Aminosäuren als Aminosäuredonor benutzt (Berger et al.,
2003; Sekowska et al., 2004). Eine von B. subtilis ybgE kodierte KMTB-Transaminase ähnelt
einer Gruppe von BRANCHED-CHAIN-AMINOACID TRANSFERASE (BCAT)-Isoformen,
sowie zwei weiteren unbekannten Proteinen in Arabidopsis. Für ein von Klebsiella pneumoniae
TyrB kodiertes Protein konnte ebenfalls KMTB-Transaminaseaktivität gezeigt werden
(Heilbronn et al., 1999). In Arabidopsis ähnelt es einer Gruppe von ASPARTATE
AMINOTRANSFERASE (ASP) Isoformen. In S. cerevisiae sind mit Aro8p, Aro9p, Bat1p und
Bat2p insgesamt 4 Proteine mit Yang-Zyklus-Transaminaseaktivität bekannt. Die BLASTAnalyse mit Aro8p und Aro9p ergab Treffer mit sehr niedriger Alignment-Wahrscheinlichkeit,
allerdings
wurden
die
Proteine
At1g80360,
At1g77670
und
ASPARTATE
AMINOTRANSFERASE bereits in den BLAST-Analysen mit dem von B. subtilis ykrV kodiertem
Protein gefunden. Die BLAST-Analyse von Bat1p bzw. Bat2p ergab in Arabidopsis erneut die
Gruppe der BCAT-Isoformen.
- 54 -
Tabelle 1: WU–BLAST-Ergebnisse mit bekannten Yang-Zyklus-Transaminasen
WU-BLAST-Ergebnisse mit den Aminosäuresequenzen von B. subtilis YkrV bzw. YbgE, K. pneumoniae TyrB bzw. S. cerevisiae Aro8p, Aro9p, Bat1p
bzw. Bat2p. Der Ähnlichkeitswert spiegelt die durch den WU-BLAST-Algorithmus ermittelte Ähnlichkeit zwischen zwei Aminosäuresequenzpaaren
wider. Der P-Wert entspricht der statistischen Wahrscheinlichkeit, dass die jeweilige Aminosäuresequenzpaarung nicht auf dem Zufall beruht. Es
sind jeweils die Ergebnisse mit einem P-Wert höher als e-10 bzw. die besten 3 Ergebnisse dargestellt.
MIPS
At1g77670
At2g22250
At4g33680
At2g13810
At5g36160
At5g53970
At4g08040
At1g80360
- 55 -
MIPS
At3g49680
At1g10070
At1g50090
At1g50110
At3g19710
At1g10060
At5g27410
At3g05190
MIPS
At4g31990
At5g19550
At5g11520
At2g30970
At1g62800
B. subtilis YkrV
Name
Pyridoxal phosphate-dependent transferases superfamily protein
ASPARTATE AMINOTRANSFERASE, MATERNAL EFFECT EMBRYO ARREST 17
ABERRANT GROWTH AND DEATH 2
AGD2-LIKE DEFENSE RESPONSE PROTEIN 1, EDS TWO SUPPRESSOR 5
L-tyrosine aminotransferase
TYROSINE AMINOTRANSFERASE 7
1-AMINOCYCLOPROPANE-1-CARBOXYLATE SYNTHASE 11
Pyridoxal phosphate-dependent transferases superfamily protein
B. subtilis YbgE
Name
BRANCHED-CHAIN AMINO ACID TRANSFERASE 3
BRANCHED-CHAIN AMINO ACID TRANSFERASE 2
BRANCHED-CHAIN AMINO ACID TRANSFERASE 7
BRANCHED-CHAIN AMINO ACID TRANSFERASE 6
BRANCHED-CHAIN AMINO ACID TRANSFERASE 4
BRANCHED-CHAIN AMINO ACID TRANSFERASE 1
D-aminoacid aminotransferase-like PLP-dependent enzymes superfamily protein
D-aminoacid aminotransferase-like PLP-dependent enzymes superfamily protein
K. pneumoniae TyrB
Name
ASPARTATE AMINOTRANSFERASE 5
ASPARTATE AMINOTRANSFERASE 2
ASPARTATE AMINOTRANSFERASE 3
ASPARTATE AMINOTRANSFERASE 1
ASPARTATE AMINOTRANSFERASE 4
Ähnlichkeit
332
280
280
239
178
170
175
173
P-Wert
4,7e-31
2,2e-25
3,7e-25
6,5e-19
6,8e-19
6,9e-12
1,8e-11
2,2e-11
Ähnlichkeit
696
679
627
591
555
546
155
151
P-Wert
1,2e-69
2,6e-62
1,3e-58
1,7e-58
1,1e-54
9,8e-54
9,7e-12
7,1e-11
Ähnlichkeit
810
809
803
723
715
P-Wert
1,0e-81
1,3e-81
5,7e-81
1,7e-72
1,2e-71
ERGEBNISSE
MIPS
At1g80360
At1g77670
At2g22250
MIPS
At1g80360
At5g53970
At1g64220
- 56 -
MIPS
At1g50090
At5g65780
At1g10070
At3g49680
At1g50110
At1g10060
At3g19710
MIPS
At1g50090
At3g49680
At5g65780
At1g50110
At1g10070
At3g19710
At1g10060
S. cerevisiae Aro8p
Name(n)
Pyridoxal phosphate (PLP)-dependent transferases superfamily protein
Pyridoxal phosphate (PLP)-dependent transferases superfamily protein
ASPARTATE AMINOTRANSFERASE, MATERNAL EFFECT EMBRYO ARREST 17
S. cerevisiae Aro9p
Name
Pyridoxal phosphate (PLP)-dependent transferases superfamily protein
TYROSINE AMINOTRANSFERASE 7
TRANSLOCASE OF OUTER MEMBRANE 7 KDA SUBUNIT 2
S. cerevisiae Bat1p
Name
BRANCHED-CHAIN AMINO ACID TRANSFERASE 7
BRANCHED-CHAIN AMINO ACID TRANSFERASE 5
BRANCHED-CHAIN AMINO ACID TRANSFERASE 2
BRANCHED-CHAIN AMINO ACID TRANSFERASE 3
BRANCHED-CHAIN AMINO ACID TRANSFERASE 6
BRANCHED-CHAIN AMINO ACID TRANSFERASE 1
BRANCHED-CHAIN AMINO ACID TRANSFERASE 4
S. cerevisia Bat2p
Name
BRANCHED-CHAIN AMINO ACID TRANSFERASE 7
BRANCHED-CHAIN AMINO ACID TRANSFERASE 3
BRANCHED-CHAIN AMINO ACID TRANSFERASE 5
BRANCHED-CHAIN AMINO ACID TRANSFERASE 6
BRANCHED-CHAIN AMINO ACID TRANSFERASE 2
BRANCHED-CHAIN AMINO ACID TRANSFERASE 4
BRANCHED-CHAIN AMINO ACID TRANSFERASE 1
Ähnlichkeit
124
95
85
P-Wert
1,1e-05
0,02
0,22
Ähnlichkeit
88
64
58
P-Wert
0,10
0,29
0,48
Ähnlichkeit
440
429
412
407
406
381
367
P-Wert
1,0e-42
2,5e-41
1,6e-39
5,3e-39
6,7e-39
3,0e-36
9,1e-35
Ähnlichkeit
434
419
419
392
390
373
365
P-Wert
7,2e-42
2,8e-40
2,8e-40
2,0e-37
3,3e-33
2,1e-35
1,5e-34
ERGEBNISSE
ERGEBNISSE
Zur weiteren Analyse wurden die Gene At1g77670, At1g80360, die BCAT-Genfamilie, sowie
die ASP-Genfamilie ausgewählt. Innerhalb der BCAT-Genfamilie wurde BCAT4 und BCAT7
nicht analysiert, da BCAT4 bereits eine Funktion bei der Glukosinolatsynthese zugeordnet
wurde (Schuster et al., 2006) und es sich bei BCAT7 um ein Pseudogen handelt (Binder, 2010).
3.2.2
Expressionsanalyse der Gene putativer Yang-Zyklus-Transaminasen
Um zu prüfen welche der putativen Yang-Zyklus-Transaminasen ein ähnliches
Expressionsmuster wie MTI1 bzw. DEP1 aufweisen, wurden Promotor-Gen-Reporterpflanzen
bzw. Promotor-Reporterpflanzen analysiert. Die Promotor-Gen-Reporterpflanzen exprimieren
eine Fusion der genomischen Sequenz von At1g77670, At1g80360 bzw. BCAT2 mit dem GUS
Reportergen unter der Kontrolle des At1g77670- (1750 bp), At1g80360- (1735 bp) bzw.
BCAT2- (1929 bp) Promotors. Die Promotor-Reporterpflanzen zur Analyse von BCAT1,3,5 und
6 exprimierten das GUS-Reportergen unter der Kontrolle des BCAT1- (1716 bp), BCAT3(1719 bp), BCAT5- (1714 bp) bzw. BCAT6- (1741 bp ) Promotors (siehe 5.2.7
Klonierungsstrategien). Die Promotor-Reporterpflanzen zur Analyse der ASP-Genfamilie
exprimierten das GUS-Reportergen unter der Kontrolle des ASP1- (1994 bp), ASP2- (1976 bp),
ASP3- (2055 bp), ASP4- (2075 bp ) bzw. ASP5- (2139 bp ) Promotors (siehe 5.2.7
Klonierungsstrategien).
At1g77670 war in den Leitgeweben der Kelchblätter (Abb. 45 A, B), in den Antheren (Abb. 45
B), im Stigma (Abb. 45 B), in den Leitbündeln der Rosettenblätter (Abb. 45 C), im Leitgewebe
der Wurzel, sowie in Wurzelspitzen und hervortretenden Seitenwurzeln (Abb. 45 D) exprimiert.
Das Expressionsmuster von At1g77670 ähnelte damit dem Expressionsmuster von MTI1 bzw.
DEP1 (Abb. 24 und 25). At1g80360 war im Fruchtknoten (Abb. 45 E, F), im Leitgewebe der
Rosettenblätter (Abb. 45 G), im Leitgewebe der Wurzel, sowie in Wurzelspitzen und
hervortretenden Seitenwurzeln (Abb. 45 H) exprimiert. Da At1g80360 in der Blüte nur im
Fruchtknoten exprimiert war, unterschied sich das Expressionsmuster geringfügig von MTI1
bzw. DEP1 (Abb. 23 und 24).
- 57 -
ERGEBNISSE
Abb. 45: Expressionsmuster von At1g776070 und At1g80360.
(A-D) GUS-Färbung von pAt1g77670::At1g77670-GUS Geweben: (A) Blütenstand, (B) Blüte, (C)
Rosettenblatt, (D) Wurzeldifferenzierungszone mit hervortretender Seitenwurzel. (E-H) GUS-Färbung
von pAt1g80360::At1g80360-GUS Geweben: Blütenstand (E), Blüte (F), Rosettenblatt (G),
Wurzeldifferenzierungszone mit hervortretender Seitenwurzel (H). Maßstab: 500 µm in A, C, E und G,
250 µm in B und F, 5 µm in D und H.
Die Promotoraktivitäten der BCAT-Gene sind in Abb. 46 dargestellt. In den Blütenständen von
pBCAT1::GUS-Reporterlinien wurde eine starke GUS-Färbung im Stängel beobachtet (Abb.
46 A). In der Blüte war die GUS-Färbung hauptsächlich in den Antheren zu beobachten (Abb.
46 B). In den Rosettenblätter von pBCAT1::GUS-Linien waren die Stomata gefärbt (Abb. 46 C
+ Inlay). In der Wurzel konnte keine BCAT1-Promotoraktivität festgestellt werden (Abb. 46 D).
Die pBCAT2::BCAT2-GUS-Reporterlinien zeigten GUS-Färbung in den Leitgeweben der
Kelch- und Blütenblätter (Abb. 46 E, F), in den Antheren (Abb. 46 F), im Stigma (Abb. 46 F),
in den Leitbündeln der Rosettenblätter (Abb. 46 G), im Wurzelleitgewebe, sowie in der
Wurzelspitze und entstehenden Seitenwurzeln (Abb. 46 H). pBCAT3::GUS Reporterlinien
zeigten GUS-Färbung in den Leitbündeln der Kelch- (Abb. 46 I, J) und Rosettenblätter (Abb.
46 K). In der Wurzel war keine GUS-Färbung zu sehen (Abb. 46 L). BCAT5-PromotorReporterlinien zeigten eine GUS-Färbung in den Pollensäcken (Abb. 46 M, N), in den
Leitgeweben der Rosettenblätter (Abb. 46 O) und an der Seitenwurzelbasis (Abb. 46 P).
pBCAT6::GUS zeigte eine GUS-Färbung in Pollensäcken (Abb. 46 Q, R), im
Wurzelleitgewebe, sowie in Wurzelspitzen und entstehenden Seitenwurzeln (Abb. 46 T). Von
den untersuchten BCAT-Genen, zeigte nur BCAT2 ein mit den Yang-Zyklus-Genen MTI1 und
DEP1 (Abb. 23 und 24) übereinstimmendes Expressionsmuster.
- 58 -
ERGEBNISSE
Abb. 46: Expressionsmuster von BCAT1, BCAT2, BCAT3, BCAT5 und BCAT6.
(A-D) GUS-Färbung von pBCAT1::GUS-Geweben: (A) Blütenstand, (B) Blüte, (C) Rosettenblatt, (D)
Wurzeldifferenzierungszone mit hervortretender Seitenwurzel. (E-H) GUS-Färbung von
pBCAT2::BCAT2-GUS-Geweben:
(E)
Blütenstand,
(F)
Blüte,
(G)
Rosettenblatt,
(H)
Wurzeldifferenzierungszone mit hervortretender Seitenwurzel. (I-L) GUS-Färbung von pBCAT3::GUSGeweben: (I) Blütenstand, (J) Blüte, (K) Rosettenblatt, (l) Wurzeldifferenzierungszone mit
hervortretender Seitenwurzel. (M-P) GUS-Färbung von pBCAT5::GUS-Geweben: (M) Blütenstand, (N)
- 59 -
ERGEBNISSE
Blüte, (O) Rosettenblatt, (P) Wurzeldifferenzierungszone mit hervortretender Seitenwurzel. (Q-T) GUSFärbung von pBCAT6::GUS-Geweben: Blütenstand (Q), Blüte (R), Rosettenblatt (S),
Wurzeldifferenzierungszonen mit hervortretender Seitenwurzel (T). Maßstab: 250 µm in A-C, E-G, I-K,
M-O und Q-S, 5 µm in D, H, L, P und T, 2 µm im Inlay in C.
GUS-Färbungen von pASP1::GUS-Linien zeigten ASP1-Promotoraktivität in den Leitbündeln
der Kelchblätter (Abb. 47 A, B), in den Leitbündeln der Rosettenblätter (Abb. 47 C), sowie in
Wurzelspitzen und hervortretenden Seitenwurzeln (Abb. 47 D). ASP2-Promotoraktivität war in
den Leitbündeln der Rosettenblätter (Abb. 47 G) und im Zentralzylinder der Wurzel (Abb. 47
H) zu finden. Für ASP3 wurde in den untersuchten Geweben keine Expression festgestellt
(Abb. 47 I – L). pASP4::GUS Linien zeigten GUS-Färbung in den Leitbündeln der Kelchblätter
(Abb. 47 M, N), der Antheren (Abb. 47 N) und der Rosettenblätter (Abb. 47 O), sowie im
Zentralzylinder der Wurzel (Abb. 47 P). pASP5::GUS Linien zeigten ebenfalls GUS-Färbung
in den Leitbündeln der Kelchblätter (Abb. 47 Q, R), der Antheren (Abb. 47 R) und der
Rosettenblätter (Abb. 47 S), sowie im Zentralzylinder der Wurzel (Abb. 47 T). Von den ASPGenen ähnelten die Expressionsmuster von ASP4 und ASP5 am ehesten dem
Expressionsmuster der Yang-Zyklus-Gene MTI1 und DEP1 (Abb. 23 und 24).
- 60 -
ERGEBNISSE
Abb. 47: Expressionsmuster von ASP1, ASP2, ASP3, ASP4 und ASP5.
(A-D) GUS-Färbung von pASP1::GUS-Geweben: (A) Blütenstand, (B) Blüte, (C) Rosettenblatt, (D)
Wurzeldifferenzierungszone mit hervortretender Seitenwurzel. (E-H) GUS-Färbung von pASP2::GUSGeweben: (E) Blütenstand, (F) Blüte, (G) Rosettenblatt, (H) Wurzeldifferenzierungszone. (I-L) GUSFärbung von pASP3::GUS-Geweben: (I) Blütenstand, (J) Blüte, (K) Rosettenblatt, (L)
Wurzeldifferenzierungszone mit hervortretender Seitenwurzel. (M-P) GUS-Färbung von pASP4::GUSGeweben: (M) Blütenstand, (N) Blüte, (O) Rosettenblatt, (P) Wurzeldifferenzierungszone. (Q-T) GUS-
- 61 -
ERGEBNISSE
Färbung von pASP5::GUS-Geweben: Blütenstand (Q), Blüte (R), Rosettenblatt (S),
Wurzeldifferenzierungszone (T). Maßstab: 1 mm in A, E, I, M und Q, 500 µm in C, G, H, O und S, 250
µm in B, F, J, N und R.
3.2.3
Analyse von T-DNA-Insertionslinien putativer Yang-Zyklus-Transaminasen
Um die Beteiligung putativer Yang-Zyklus-Transaminasen am Yang-Zyklus zu prüfen, wurde
das Wachstum von T-DNA-Insertionsmutanten auf verschiedenen Schwefelquellen überprüft.
Die At1g77670 T-DNA-Insertionslinie WiscDsLox334E04 stammte aus der WiscDsLox
Kollektion (Woody et al., 2007). Die Sequenzierung der Insertionsbande (amplifiziert mit den
Primern At1g77670-f und LB-WiscDsLox, siehe 5.1.2 Oligonukleotide) ermittelte die T-DNAInsertion vor der Base 986 nach dem Start-ATG, im 2. Exon des At1g77670-Gens (Abb. 48 A).
Im Gegensatz zum WT konnte für homozygote WiscDsLox334E04-Pflanzen kein At1g77670Transkript amplifiziert werden, wenn die verwendeten Primer die Insertion überspannten (Abb.
48 B). Bei Wachstum auf Erde war zwischen den beiden Genotypen kein phänotypischer
Unterschied erkennbar (Abb. 48 C). Da Pflanzen ohne funktionellen Yang-Zyklus bei
Wachstum auf MTA als Schwefelquelle bzw. bei Schwefelmangel Wachstumsdefekte
gegenüber dem WT zeigen, wurde das Wachstum von WiscDsLox334E04 unter diesen
Bedingungen getestet. Weder bei Wachstum auf ½MS-Platten mit 50 µM Sulfat und 500 µM
MTA (Abb. 48 D), noch bei Wachstum in Hoagland Medium mit 10 µM Sulfat (Abb. 48 E),
konnte jedoch ein phänotypischer Unterschied festgestellt werden.
Abb. 48: Untersuchung einer T-DNA-Insertionsmutante von At1g77670.
(A) Schema des At1g77670-Genlokus. Rechtecke = Exons, Linie zwischen den Rechtecken = Intron,
Dreieck = Position der T-DNA-Insertion, LB = left border, Pfeile e und f = für den Transkriptnachweis
verwendete Primer (siehe 5.1.2 Oligonukleotide). (B) RT-PCR-Analyse der at1g77670-T-DNAInsertionsmutante und des Col-WT. (C) Wachstum von at1g77670 und Col auf Erde. (D) Wachstum von
- 62 -
ERGEBNISSE
at1g77670 und Col auf ½MS-Platten mit 50 µM Sulfat und 500 µM MTA. (E) Wachstum von at1g77670
und Col in Hoagland Medium mit 10 µM Sulfat. Maßstab: 1 cm.
Die SALK_037854-T-DNA-Insertionslinie für BCAT2 stammte aus der SALK-Kollektion (Alonso
et al., 2003) und weist eine Insertion im 3. Exon des Gens auf (Abb. 49 A). Im Gegensatz zum
WT konnte für homozygote SALK_037854-Pflanzen kein BCAT2-Transkript amplifiziert
werden, wenn die verwendeten Primer die Insertion überspannten (Abb. 49 B). Weder bei
Wachstum auf Erde (Abb. 49 C) oder ½MS-Platten mit 50 µM Sulfat und 500 µM MTA (Abb.
49 D), noch bei Wachstum in Hoagland Medium mit 10 µM Sulfat (Abb. 49 E) waren
phänotypischen Unterschiede zwischen den Genotypen erkennbar.
Abb. 49: Untersuchung einer T-DNA-Insertionsmutante von BCAT2.
(A) Schema des BCAT2-Genlokus. Rechtecke = Exons, Linien zwischen den Rechtecken = Introns,
Dreieck = Position der T-DNA-Insertion, LB = left border, Pfeile g und h = für den Transkriptnachweis
verwendete Primer (siehe 5.1.2 Oligonukleotide). (B) RT-PCR-Analyse der bcat2-T-DNA
Insertionsmutante und des Col-WT. (C) Wachstum von bcat2 und Col auf Erde. (D) Wachstum von bcat2
und Col auf ½MS-Platten mit 50 µM Sulfat und 500 µM MTA. (E) Wachstum von bcat2 und Col in
Hoagland Medium mit 10 µM Sulfat. Maßstab: 1 cm.
Die ASP4-T-DNA-Insertionslinie WiscDsLox453-456D4 stammt aus der WiscDsLox-Kollektion
(Woody et al., 2007). Die Sequenzierung der Insertionsbande (amplifiziert mit den Primern LBWiscDsLox und ASP4-r, siehe 5.1.2 Oligonukleotide) ermittelte die T-DNA-Insertion vor der
Base 1206 nach dem Start-ATG, im 6. Exon des ASP4-Gens (Abb. 50 A). Im Gegensatz zum
WT konnte für homozygote WiscDsLox453-456D4-Pflanzen kein ASP4-Transkript amplifiziert
werden, wenn die verwendeten Primer die Insertion überspannten (Abb. 50 B). Bei Wachstum
auf Erde war zwischen den beiden Genotypen kein phänotypischer Unterschied erkennbar
(Abb. 50 C). Weder bei Wachstum auf ½MS-Platten mit 50 µM Sulfat und 500 µM MTA (Abb.
- 63 -
ERGEBNISSE
50 D), noch bei Wachstum in Hoagland Medium mit 10 µM Sulfat (Abb. 50 E), konnte jedoch
ein phänotypischer Unterschied festgestellt werden.
Abb. 50: Untersuchung einer T-DNA-Insertionsmutante von ASP4.
(A) Schema des ASP4-Genlokus. Rechtecke = Exons, Linien zwischen den Rechtecken = Introns,
Dreieck = Position der T-DNA-Insertion, LB = left border, Pfeile o und p = für den Transkriptnachweis
verwendete Primer (siehe 5.1.2 Oligonukleotide). (B) RT-PCR-Analyse der asp4-T-DNAInsertionsmutante und des Col-WT. (C) Wachstum von asp4 und Col auf Erde. (D) Wachstum von asp4
und Col auf ½MS-Platten mit 50 µM Sulfat und 500 µM MTA. (E) Wachstum von asp4 und Col in
Hoagland Medium mit 10 µM Sulfat. Maßstab: 1 cm.
Die ASP5-T-DNA-Insertionslinie FLAG280A06 stammt aus der INRA-Kollektion (Samson et al.,
2002). Die Sequenzierung der Insertionsbande (amplifiziert mit den Primern LB-FLAG und
ASP5-r, siehe 5.1.2 Oligonukleotide) ermittelte die T-DNA-Insertion vor der Base 1068 nach
dem Start-ATG, im 6. Intron des ASP5-Gens (Abb. 51 A). Im Gegensatz zum WT konnte für
homozygote FLAG280A06-Pflanzen kein ASP5-Transkript amplifiziert werden, wenn die
verwendeten Primer die Insertion überspannten (Abb. 51 B). Bei Wachstum auf Erde war
zwischen den beiden Genotypen kein phänotypischer Unterschied erkennbar (Abb. 51 C).
Weder bei Wachstum auf ½MS-Platten mit 50 µM Sulfat und 500 µM MTA als einziger
Schwefelquelle (Abb. 51 D), noch bei Wachstum in Hoagland Medium mit 10 µM Sulfat (Abb.
51 E), konnte ein phänotypischer Unterschied festgestellt werden.
- 64 -
ERGEBNISSE
Abb. 51: Untersuchung einer T-DNA-Insertionsmutante von ASP5.
(A) Schema des ASP5-Genlokus. Rechtecke = Exons, Linien zwischen den Rechtecken = Introns,
Dreieck = Position der T-DNA-Insertion, LB = left border, Pfeile q und r = für den Transkriptnachweis
verwendete Primer (siehe 5.1.2 Oligonukleotide). (B) RT-PCR-Analyse der asp5-T-DNA
Insertionsmutante und des Col-WT. (C) Wachstum von asp5 und Col auf Erde. (D) Wachstum von asp5
und Col auf ½MS-Platten mit 50 µM Sulfat und 500 µM MTA. (E) Wachstum von asp5 und Col in
Hoagland Medium mit 10 µM Sulfat. Maßstab: 1 cm.
3.2.4
Transaminaseaktivitätstest mit putativen Yang-Zyklus-Transaminasen
Um die putativen Yang-Zyklus-Transaminasen direkt auf ihre KMTB-Transaminaseaktivität zu
untersuchen, wurde ein enzymatischer Test mit den gereinigten bzw. partiell gereinigten
Proteinen durchgeführt. Zur Proteinsynthese wurde ein IPTG-induzierbares E. coli
Expressionssystem verwendet. Es wurden N-terminale 6xHis-Tag-Fusionen mit den
kodierenden Sequenzen von ykrV, At1g77670, BCAT2, ASP4 bzw. ASP5 unter der Kontrolle
des T7-Promotors und Lac-Operators hergestellt (siehe 5.2.7 Klonierungsstrategien). Die
Expression wurde im E. coli Stamm Rosetta2/pLysS durch die Zugabe von IPTG induziert.
Nach Induktion der Expression wurde der Rohextrakt gewonnen und mittels einer NickelAgarose-Säule das 6xHis-Fusionsprotein gereinigt. Die gewonnen Elutionsfraktionen wurden
auf SDS-Gelen aufgetrennt und anschließend entweder einer Coomassiefärbung oder einem
Westernblot mit Antikörpern gegen den 6xHis-Tag unterzogen (Abb. 52). Die YkrV
Elutionsfraktion zeigte eine einzige, klare Bande auf der erwarteten Höhe von ca. 44 kDa. Die
Elutionsfraktion von At1g77670 enthielt neben der erwarteten Bande bei ca. 48 kDa noch 4
weitere Banden bei ca. 70, 55, 45 und 25 kDa. Die Elutionsfraktion von BCAT2 wies neben der
erwarteten Bande bei ca. 42 kDa ebenfalls 4 weitere, schwache Banden auf. Zwei dieser
Banden befanden sich bei ca. 70 kDa, die anderen bei ca. 50 und 25 kDa. Die Elutionsfraktion
von ASP4 zeigte eine einzige, klare Bande auf der erwarteten Höhe von ca. 45 kDa. In der
- 65 -
ERGEBNISSE
Elutionsfraktion von ASP5 waren ebenfalls mehrere Banden zu sehen. Aufgrund der
Aminosäuresequenz wurde ASP5 bei ca. 49 kDa erwartet. Die deutlichste Bande liegt
allerdings etwas tiefer, bei ca. 44 kDa. Zusätzlich sind Banden bei ca. 70, 40 und 25 kDa zu
sehen. Der Westernblot mit Antikörpern gegen den 6xHis-Tag zeigte, dass jede
Elutionsfraktion
ein
6xHis-Tag-Fusionsprotein
enthielt.
Außerdem
stimmt
das
Westernblotsignal in jeder Elutionsfraktion mit der Position der jeweils stärksten Bande überein.
Dies deutet darauf hin, dass alle Kandidatenproteine gewonnen werden konnten. Während das
YkrV und ASP4 Protein in großer Menge und Reinheit gewonnen werden konnten, waren in
den Elutionsfraktionen von At1g77670, BCAT2 und ASP5 noch andere Proteine enthalten,
auch wenn ihr Anteil gering war.
Abb. 52: Reinigung putativer Yang-Zyklus-Transaminasen.
Reinigung putativer Yang-Zyklus-Transaminasen mittels N-terminalem 6xHis-Tag und NickelAffinitätschromatographie. Erwartete Proteingrößen: YkrV = 44 kDa, At1g77670 = 48 kDa, BCAT2 = 42
kDa, ASP4 = 45 kDa, ASP5 = 49 kDa. Linke Hälfte = Coomassiefärbung, Rechte Hälfte = Westernblot
mit monoklonalem Anti-Polyhistidin-POD-gekoppeltem Antikörper, Expositionszeit = 1 s.
Eine Mischung aus einem methioninfreien Aminosäuremix, dem Cofaktor Pyridoxalphosphat
und dem Edukt KMTB wurde mit jeweils 10 µg Protein aus der jeweiligen Elutionsfraktion
versetzt. Die Zugabe einer Yang-Zyklus-Transaminase zu dieser Mischung sollte zur
Transaminierung von KMTB und damit zur Produktion von Methionin führen. Die Yang-ZyklusTransaminase YkrV von B. subtilis wurde als Positivkontrolle verwendet. Berger et al. (2003)
hatten gezeigt, dass YkrV KMTB in Methionin umwandeln kann. Um festzustellen, ob die
getesteten Enzyme Methionin produzierten wurde die Reaktion nach 30 minütiger Inkubation
bei 37°C gestoppt und die Aminosäurekonzentrationen in den Proben mittels UPLC bestimmt
(Abb. 53). Alle proteinogenen Aminosäuren außer Tryptophan konnten gemessen werden. Bei
Zugabe eines Proteins ohne Transaminaseaktivität wie BSA, entstand in der Reaktion kein
Methionin. Bei Zugabe der glutaminabhängigen B. subtilis Yang-Zyklus-Transaminase ykrV
verringerte sich die Glutaminkonzentration im Vergleich zur BSA-Kontrolle von 52 nmol/µl auf
35 nmol/µl. Die Methioninkonzentration dagegen stieg von 0,3 nmol/µl auf 24,1 nmol/µl. Dies
zeigt, dass KMTB in dieser Reaktion durch die Aktivität einer KMTB-Transaminase zu
Methionin umgewandelt werden konnte. Die Zugabe von BCAT2, ASP4 bzw. ASP5 führte
lediglich zu einer minimalen Zunahme von Methionin. Im Vergleich zur BSA-Kontrolle stieg die
Methionin Konzentration von 0,3 nmol/µl auf 2,4, 2,8 bzw. 3,4 nmol/µl. Bei Zugabe von
At1g77670 zur Reaktion waren die gemessenen Aminosäurekonzentrationen ähnlich der
- 66 -
ERGEBNISSE
Zugabe der Positivkontrolle YkrV. Während die Messwerte des At1g77670-Ansatzes im
Vergleich zur BSA-Kontrolle durchschnittlich fast 30% höher ausfielen, sank die
Glutaminkonzentration von 52 nmol/µl auf 38 nmol/µl. Die Methioninkonzentration dagegen
stieg von 0,3 nmol/µl auf 27,1 nmol/µl an. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass es sich
bei At1g77670 ebenfalls um eine glutaminabhängige KMTB-Transaminase handelt, während
BCAT2, ASP4 und ASP5 keine Yang-Zyklus-Transaminasen sind.
Abb. 53: Transaminaseaktivitätstest mit putativen Yang-Zyklus-Transaminasen.
Aminosäurekonzentrationen (nmol/µl) in den KMTB-Transaminasetests bei Zugabe von 10 µg BSA,
YkrV, At1g77670, BCAT2, ASP4 oder ASP5. Die Balkendiagramme zeigen die errechneten
Durchschnittswerte und Standardfehler mit Daten aus jeweils vier unabhängigen Experimenten.
Abkürzungen: Ala = Alanin, Arg = Arginin, Asn = Asparagin, Asp = Aspartat, Cys = Cystein, Gln =
Glutamin, Glu = Glutamat, Gly = Glycin, His = Histidin, Ile = Isoleucin, Leu = Leucin, Lys = Lysin, Met =
Methionin, Phe = Phenylalanin, Pro = Prolin, Ser = Serin, Thr = Threonin, Tyr = Tyrosin, Val = Valin.
- 67 -
DISKUSSION
4
DISKUSSION
4.1
Physiologische Funktion des Yang-Zyklus im Leitgewebe
4.1.1
MTI1 und DEP1 sind Yang-Zyklus-Einzelgene in A. thaliana
Die Yang-Zyklus-Enzyme MTI1 und DEP1 aus Arabidopsis thaliana konnten über ihre
Homologie zu Yang-Zyklus-Enzymen aus Bakterien und Hefen identifiziert werden. Durch
Komplementation von Funktionsverlustmutanten der Hefehomologen mri1 bzw. mde1/utr4
konnte die biochemische Aktivität von MTI1 bzw. DEP1 bestätigt werden (Pommerrenig et al.,
2011). Um die Beteiligung von MTI1 und DEP1 am Yang-Zyklus direkt in Arabidospis zu
überprüfen wurden mti1- und dep1-Mutanten analysiert. Während die mti1-2-amiRNA-Linie
noch 10% MTI1-Transkript aufwies, konnte in den untersuchten T-DNA-Mutanten von mti1 und
dep1 kein vollständiges MTI1- bzw. DEP1-Transkript nachgewiesen werden (Abb. 9). Da nur
Pflanzen mit einem funktionellen Yang-Zyklus in der Lage sind MTA als Schwefelquelle zu
nutzen (Sauter et al., 2004; Bürstenbinder et al., 2007), wurde das Wachstum der mti1- und
dep1-Mutanten auf MTA-haltigen Medien analysiert. Die mti1- und dep1-Mutanten waren im
Gegensatz zum WT nicht in der Lage MTA zu verstoffwechseln und ähnelten Pflanzen die mit
Sulfatmangel angezogen wurden (Abb. 10, oben). Wurden den Mutanten zusätzlich zu MTA
noch entsprechend hohe Sulfatmengen angeboten, war ihr Wachstum dem WT ähnlich, da sie
statt MTA Sulfat als Schwefelquelle nutzen konnten (Abb. 11, links). Mutanten, die mit einem
funktionellen MTI1- bzw. DEP1-Gen komplementiert wurden, konnte MTA wieder
verstoffwechseln (Abb. 12). Die Fähigkeit MTA als Schwefelquelle zu nutzen, hängt damit von
einem funktionellem MTI1- bzw. DEP1-Genlokus ab, was die Beteiligung von MTI1 und DEP1
am Yang-Zyklus in Arabidopsis thaliana beweist.
4.1.2
Yang-Zyklus-Mutanten zeigen Wachstumsdefekte bei Schwefelmangel
4.1.2.1
Phänotypen sind von den Anzuchtbedingungen abhängig
Die durch Schwefelmangel induzierten Wachstumsdefekte der Yang-Zyklus-Mutanten waren
sowohl auf ½MS-Platten mit 50 µM Sulfat, als auch im hydroponischen System bei 10 – 30 µM
Sulfat zu beobachten. Die Ausprägung des Phänotyps ist jedoch sehr unterschiedlich. Bei
Wachstum auf ½MS-Platten mit 50 µM Sulfat blieben alle Pflanzen sehr klein und waren stark
gestresst. Wachstumsunterschiede zwischen Mutanten- und WT-Pflanzen waren meist, aber
nicht immer klar zu erkennen. Generell sind Nährstoffmangelexperimente auf Platten
problematisch, da Nährstoffkontaminationen, die vor allem durch die Zugabe eines
Geliermittels entstehen, nicht vermieden werden können und deshalb die Konzentration nicht
präzise eingestellt werden kann. Gruber et al. (2013) stellten in 1% Agarlösungen von 7
verschiedenen Agarsorten Schwefelkonzentrationen von 1130 – 1840 µM fest, was in etwa der
Schwefelkonzentration eines vollwertigen MS-Mediums entspricht. Um dieses Problem zu
umgehen, wurde in dieser Arbeit für alle Wachstumsexperimente auf Platten Agarose benutzt.
Die Schwefelkonzentrationen von drei getesteten Agaroselösungen waren mit 46 – 66 µM zwar
deutlich niedriger (Gruber et al., 2013), denoch entspricht dies ca. einer Verdoppelung der
effektiven Schwefelkonzentration in ½MS-Platten mit 50 µM Sulfat. Um eine präzise Einstellung
der Sulfatkonzentration zu ermöglichen, sowie um die Pflanzen über ihren gesamten
- 68 -
DISKUSSION
Lebenszyklus beobachten zu können, wurde ein hydroponisches System etabliert. Im
hydroponischen System, besonders bei 10 und 20 µM Sulfat, wuchsen die mti1- und dep1Mutanten immer deutlich schlechter als der WT (Abb. 13). Während Wurzelmasse, Blattanzahl
und Blühzeitpunkt zwischen den Genotypen und Bedingungen unverändert blieben (Abb. 16),
war das Wachstum der Infloreszenzen (Abb. 14) deutlich beeinträchtigt. Die Infloreszenzlänge
war dabei linear abhängig von der Sulfatkonzentration und zeigte gegenüber dem WT bei
abnehmender Sulfatkonzentration eine verstärkte Wachstumsreduktion in den mti- und dep1Mutanten. Zusätzlich waren bei Wachstum in 10 und 20 µM Sulfat Entwicklungsdefekte und
Sterilität zu beobachten (Abb. 18).
4.1.2.1
Phänotypen sind vom Analysezeitpunkt abhängig
Während mti1- und dep1-Pflanzen bei niedrigen Sulfatkonzentationen deutliche phänotypische
Unterschiede zu den WT-Pflanzen aufwiesen, wurden bei der Analyse der mtk-Mutanten keine
oder nur geringfügige phänotypischen Unterschiede gefunden. Metabolische Analysen
deuteten jedoch auf eine veränderte SAM-Homeostase hin (Sauter et al., 2004; Bürstenbinder
et al., 2007). Der Verlust der MTK-, MTI1- bzw. DEP1-Genfunktion führt letztlich zu einem
Verlust der Yang-Zyklus-Aktivität. Die Mutanten der Genotypen mtk, mti1 bzw. dep1 sollten
daher den gleichen Phänotyp bei Schwefelmangel aufweisen. Die phänotyptischen
Unterschiede zwischen mtk und mti1 bzw. dep1 bei Schwefelmangel, lassen sich jedoch durch
den Analysezeitpunkt erklären. Die Analysen zur mtk-Mutante wurden vor allem im
Keimlingsstadium oder im vegetativen Stadium analysiert. Die deutlichsten Unterschiede traten
in den mti1- und dep1-Mutanten allerdings in den Infloreszenzen auf. Im hydroponischen
System waren Wachstumsunterschiede erst nach ca. 4 Wochen zu beobachten, wonach sie
progressiv zunehmen (Abb. 15). Auch bei Wachstum auf ½MS-Platten mit 50 µM Sulfat
dauerte es über 2 Wochen, bis sich sichtbare Unterschiede einstellten. In den Samen von
Arabidopsis befinden sich cysteinreiche Speicherproteinen wie Napine und Prolamine (Shewry
et al., 1995; Shewry und Casey, 1999), die Keimlinge bzw. jungen Pflanzen mit Schwefel
versorgen können. Außerdem ist die Aufnahme und der Bedarf an Nährstoffen vom
Entwicklungszustand und der Biomasse abhängig. In Maispflanzen konnte gezeigt werden,
dass sich die Aufnahme von Nährstoffen erst in der letzten Phase des vegetativen Wachstums
(V10), kurz vor Übergang in die reproduktive Phase, drastisch erhöht. Ungefähr 75% der
gesamten Schwefelaufnahme erfolgen erst ab dieser Phase (Bender et al., 2013). Man kann
annehmen, dass sich auch in Arabidopsis der Nährstoffbedarf in der reproduktiven Phase
deutlich erhöht. Die Entstehung des differentiellen Phänotys der Yang-Zyklus-Mutanten ging
oft mit dem Übergang von der vegetativen Phase zur reproduktiven Phase einher. Die Wahl
des Analysezeitpunkts hat deshalb deutliche Auswirkungen auf den differentiellen Phänotyp
zwischen Mutanten- und WT-Pflanzen.
4.1.3
Yang-Zyklus-Mutanten leiden an stärkerem Schwefelmangel
4.1.3.1
Schwefelmangel wird auf transkriptioneller Ebene wahrgenommen
Um zu belegen, dass mti1- und dep1-Planzen, sowie die jeweiligen WT-Pflanzen, tatsächlich
auf einen Schwefelmangel reagierten, wurde die Expression von Genen der primären
Schwefelassimilation
unter
verschiedenen
Sulfatkonzentrationen
analysiert.
Die
Schwefelassimilation wird hauptsächlich über die Sulfataufnahme und die APS-Reduktion
- 69 -
DISKUSSION
kontrolliert. Die Transkriptmengen der beteiligten Gene korrelieren dabei mit der Verfügbarkeit
von Sulfat (Takahashi et al., 2011). So konnte gezeigt werden, dass sich die Expression der
Sulfattransportergene SULR1;1 und SULTR1;2, sowie des APS-Reduktasegens APR3 bei
Schwefelmangel erhöht (Shibagaki et al., 2002; Maruyama-Nakashita et al., 2003; MaruyamaNakashita et al., 2005). Die Expression von SULTR1;1, SULTR1;2 und APR3 zeigte in den
mti1- und dep1-Mutanten, sowie der jeweiligen WT-Pflanzen, eine lineare Abhängigkeit von
der Sulfatkonzentration. Mit sinkender Sulfatkonzentration stieg in allen Genotypen die
Transkriptmenge an (Abb. 19). Dies zeigt, dass alle Genotypen auf sinkende
Sulfatkonzentrationen mit einer trankriptionellen Schwefelmangelantwort reagierten.
4.1.3.2
Die Assimilation von Sulfat ist von der Konzentration im Medium abhängig
Serin und O-Acetylserin sind an der Cysteinsynthese beteiligt (Abb. 20 A). Im Fall von
Schwefelmangel sinkt die Sulfidkonzentration. Als Konsequenz kann nur wenig Cystein
gebildet werden und Serin und O-Acetylserin akkumulieren (Hawkesford, 2000). Bei
Schwefelmangel war in allen Genotypen sowohl die Serin- als auch die OAcetylserinkonzentration stark erhöht (Abb. 20 B, C). Obwohl in Pflanzen, die mit 40 µM Sulfat
wuchsen, im Gegensatz zu Pflanzen die mit 10 – 30 µM Sulfat wuchsen, die
Schwefelassimilation offensichtlich nicht limitiert war, waren die Cysteinkonzentrationen
zwischen allen Genotypen und Bedingungen überraschend konstant. Wahrscheinlich wurde
gebildetes Cystein rasch zu Proteinen, Glutathion oder Methionin weiter verstoffwechselt. Zu
dieser Schlussfolgerung kamen auch Speiser et al. (2014), die im Rahmen ihrer
Untersuchungen zum Zusammenhang zwischen den Lichtverhältnissen und der
Cysteinsynthese, bei Hochlicht eine Akkumulation von O-Acetylserin, aber keine Änderung der
Cysteinkonzentration festellen konnten. Die Tatsache, dass alle Genotypen bei 40 µM Sulfat
kein O-Acetylserin enthielten, zeigt, dass die Pflanzen bei dieser Bedingung keinem
Schwefelmangel ausgesetzt waren. Die starke bzw. moderate Akkumulation von Serin und OAcetylserin in Pflanzen, die mit 10 bzw. 20 oder 30 µM Sulfat wuchsen, weist dagegen auf
geringe Schwefelassimilation und Schwefelmangel hin.
4.1.3.3
Die Aminosäureprofile zeigen Anpassungen an Schwefelmangel an
Im Rahmen der Aminosäuremessungen wurden zahlreiche Aminosäuren gefunden, die von
der Sulfatkonzentration abhängig waren. In Mutanten- und WT-Pflanzen, stieg die
Konzentration der Aminosäuren Glycin, Serin, Glutamin, Isoleucin und Asparagin mit sinkender
Sulfatkonzentration stark an. Dies stellt eine typische metabolische Anpassung an
Schwefelmangel dar (Nikiforova et al., 2005). Signifikante Unterschiede zwischen Mutantenund WT-Pflanzen fanden sich unter anderem in den Konzentrationen von Alanin und der
verzweigtkettigen Aminosäuren Isoleucin, Leucin und Valin (Abb. 21). Interessanterweise
waren die Konzentration dieser vier Aminosäuren in den mti1- und dep1-Mutanten unter
Schwefelmangel höher als im WT. Als Mitglied der Pflanzenfamilie Brassicaceae enthält A.
thaliana die schwefelhaltigen Glucosinolate. Arabidopsis besitzt neben den aromatischen und
indolischen Glucosinolaten, hauptsächlich aliphatische Glukosinolate. Aliphatische
Glukosinolate stammen von den Aminosäuren Methionin, Alanin, Isoleucin, Leucin und Valin
ab, wobei die Methionin-stämmigen Glucosinolate am häufigsten sind (Kliebenstein et al.,
2001; Wittstock und Halkier, 2002). Im Rahmen der Glucosinolatsynthese werden mehrere
- 70 -
DISKUSSION
reduzierte Schwefelverbindungen verbraucht. So wird für die Synthese der
Glucosinolatkernstruktur neben Methionin, für Methionin-stämmige Glucosinolate, immer auch
Cystein und 3-Phosphoadenosin-5-Phosphosulfat (PAPS) benötigt (Wittstock und Halkier,
2002). Die Zunahme von Alanin, Isoleucin, Leucin und Valin in mti1 und dep1 bei
Schwefelmangel deutet einen veränderten Glukosinolatstoffwechsel an. Wahrscheinlich wurde
die Glucosinolatsynthese gegenüber dem WT verringert um reduzierte Schwefelverbindungen
zu sparen oder Glukosinolate wurden verstärkt abgebaut um reduzierte Schwefelverbindungen
zu gewinnen. Diese beiden Prozesse sind typisch für Pflanzen mit Schwefelmangel (Falk et al.,
2007). Insgesamt machen die Aminosäureprofile metabolische Anpassung der Pflanzen an
steigenden Schwefelmangel deutlich und deuten einen verstärkten Schwefelmangel in den
Mutanten an.
Ein erhöhter Schwefelmangel in mti1- und dep1-Pflanzen wird zusätzlich durch die erhöhte
Anthocyanakkumulation der Mutanten belegt. Die Akkumulation von Anthocyanen ist eine
typische pflanzliche Reaktion auf Schwefelmangel (Nikiforova et al., 2003; Nikiforova et al.,
2005). Die mti1- und dep1-Pflanzen akkumulieren ca. doppelt so viel Anthocyane wie die
jeweiligen WT-Pflanzen (Abb. 17).
4.1.3.4
Die Metaboliten des Methioninstoffwechsels sind in den Yang-ZyklusMutanten reduziert
In MTA produzierenden Geweben trägt der Yang-Zyklus durch das MTA Recycling letztendlich
zum Methionin- bzw. SAM-Pool bei. Die Messungen von Methionin und SAM, sowie der
verwandten Metaboliten S-Adeonsylhomocystein und S-Methylmethionin zeigten, dass
Pflanzen ohne funktionellen Yang-Zyklus bei Schwefelmangel weniger dieser Metaboliten
aufwiesen (Abb. 22). Bei Schwefelmangel waren besonders die Konzentrationen von SAM und
S-Methylmethionin verringert. SAM wird durch SAM-Synthetase aus Methionin hergestellt. In
Arabidopsis gibt es 4 Isoformen dieses Enzyms. Laut dem zelltypspezifischen eFP-Browser
sind MAT3 und MAT4 hauptsächlich in der Blattepidermis exprimiert und Untersuchungen von
Wienkoop et al. (2004) ergaben eine spezifische Expression in Trichomen. Die MAT1 und
MAT2 Isoformen sind laut dem zelltypspezifischen eFP-Browser jedoch im Phloem exprimiert.
Peleman et al. (1989) konnten mit Hilfe von Promotor-GUS Pflanzen zeigen, dass MAT1 im
Leitgewebe exprimiert wird. Leitbündelspezifische Proteomstudien in A. thaliana und
Proteomstudien mit B. napus Phloemsaft identifizierten außerdem sowohl MAT1, als auch
MAT2 als phloemspezifisches Protein (Schad et al., 2005; Giavalisco et al., 2006). Zusätzlich
identifizierten Bourgis et al. (1999) SAM als eine wesentliche Komponente des Phloemsafts in
Arabidopsis. S-Methylmethionin wird in Pflanzen als phloemmobile Transportform von
Methionin benutzt und spielt eine wichtige Rolle bei der Schwefelversorgung von Sinkgeweben
(Bourgis et al., 1999; Tan et al., 2010). Der Rückgang von SAM und S-Methylmethionin in den
Yang-Zyklus-Mutanten bei Schwefelmangel deutet daher vor allem auf einen Mangel an
reduzierten Schwefelverbindungen im Phloem hin.
4.1.4
Yang-Zyklus-Aktivität im Phloem ist ausreichend um den durch
Schwefelmangel induzierten Wachstumsdefekt der Mutanten zu beheben
Analysen zur Genexpression des Yang-Zyklus in Plantago major und Arabdidopsis thaliana mit
Hilfe vergleichender qRT-PCR-Analysen und Promotor-Gen-Reporterlinien zeigten eine
- 71 -
DISKUSSION
überraschende Anreicherung von Yang-Zyklus-Transkripten im Blattleitgewebe (Pommerrenig
et al., 2006; Pommerrenig et al., 2011). Die in dieser Arbeit durchgeführten Expressionsstudien
mit Hilfe von MTI1- und DEP1-Promotor-Gen-Reporterlinien zeigten, dass die Yang-ZyklusGene, zusätzlich zum Blattleitgewebe, auch im Leitgewebe der Sink-Organe exprimiert
werden. Neben dem Leitgewebe war MTI1- und DEP1-Expression auch in Zellen mit hoher
Teilungsaktivität, wie Wurzelspitzen und Embryonen, zu finden (Abb. 23 und 24). Um die
Bedeutung des Yang-Zyklus für das Phloem weiter zu untersuchen, wurden Pflanzen
hergestellt, die nur in Phloemgeleitzellen einen funktionellen Yang-Zyklus besassen. Dazu
wurden die mti1- bzw. dep1-Mutanten mit einem pSUC2::MTI1- bzw. pSUC2::DEP1-Konstrukt
komplementiert. Der SUC2-Promotor ist spezifisch in Phloemgeleitzellen, entlang dem
gesamten Phloem aktiv (Truernit und Sauer, 1995; Stadler und Sauer, 1996; Imlau et al., 1999).
Im Gegensatz zu den mti1- und dep1-Mutanten, zeigten Pflanzen mit geleitzellspezifischer
Yang-Zyklus-Aktivität keinen Wachstumsdefekt bei Schwefelmangel. Die Infloreszenzhöhe,
Schotenanzahl und Keimungsrate der Komplementationspflanzen gleich dem WT. Lediglich
die Schotenlange war im Vergleich zum WT geringfügig reduziert (Abb. 26). Diese Ergebnisse
zeigten, dass Yang-Zyklus-Aktivität im Phloem ausreichend ist um die erhöhte
Schwefelmangelsensivität von mti1 und dep1 zu komplementieren. Die Wachstumsdefekte der
Mutanten bei Schwefelmangel werden daher wahrscheinlich von einem Phloemmetaboliten
verursacht.
4.1.5
In adulten Arabidopsis-Pflanzen entsteht MTA im Leitgewebe hauptsächlich
durch die Nicotianamin- und Polyaminsynthese
4.1.5.1
Ethylenmangel ist nicht für die durch Schwefelmangel induzierten
Wachstumsdefekte verantwortlich
Zur Synthese von Ethylen wird die Vorstufe ACC benötigt, die durch die ACC-Synthase aus
SAM hergestellt wird. Sollte unzureichender Ethylenstoffwechsel der Grund für die
reproduktiven Defekte der Mutanten bei Schwefelmangel sein, so müsste die ACC-Synthese
im Phloem stattfinden, da die erhöhte Sensitivität der mti1- und dep1-Mutanten bei
Schwefelmangel mit dem Phloem assoziiert war. Tsuchisaka und Theologis (2004)
analysierten die Promotoraktivitäten aller 9 Arabiodpsis ACC-Synthasegene mittels PromotorGUS Pflanzen und fanden dabei übereinstimmende und spezifische Expressionsmuster. Alle
ACS-Gene, mit Ausnahme von ACS9, waren in Keimlingen exprimiert. In erwachsenen
Pflanzen zeigten ACS1 und ACS11 ein spezifisches, ACS2, 4, 5, 6, 7 und 8 ein überlappendes
Expressionsmuster. ACS9 war dagegen kaum exprimiert. ACS1 war im Blattleitgewebe und
Blütenstängeln exprimiert, während ACS11 Expression in Wurzeln, jungen Blättern,
Tragblättern und Blütenstängeln zeigte. Die Gene ACS2, 4, 5, 6, 7 und 8 waren in Wurzeln,
jungen Blättern, Blütenstängeln und Schoten exprimiert. Diese Ergebnisse zeigen, dass ACCSynthasegene abhängig von der jeweiligen Isoform und vom Entwicklungszustand exprimiert
werden, wobei sie allerdings nicht gehäuft im Leitgewebe exprimiert werden.
Während der pflanzlichen Entwicklung findet man die meiste Ethylensynthese in jungen
Geweben mit hoher Zellteilungsrate. Während der darauf folgenden Zellexpansion und
Elongation nimmt die Ethylensyntheserate ab (Wang et al., 2002). Im Gegensatz zum
Keimlingsstadium ist die Ethylensynthese in erwachsenen Arabiodpsis-Pflanzen um ein
- 72 -
DISKUSSION
vielfaches geringer (Rodrigues-Pousada et al., 1993; Bürstenbinder et al., 2007). Außerdem
konnte ACC, weder mit UPCL, noch mit LC-MS/MS, in den Infloreszenzen von Pflanzen, die in
10 – 40 µM Sulfat wuchsen, detektiert werden. Es scheint daher unwahrscheinlich, dass im
Leitgewebe erwachsener Arabidopsis-Pflanzen große Mengen MTA durch die
Ethylensynthese produziert werden.
Desweiteren konnten die reproduktiven Defekte der mti1- und dep1-Mutanten bei
Schwefelmangel nicht durch die externe Applikation von ACC komplementiert werden (Abb.
38), obwohl Shin et al. (2015) bei der Charakterisierung des ACC Transporters ACR2 zeigen
konnten, dass extern appliziertes ACC von Pflanzen aufgenommen wird und 10 µM ACC
deutliche physiologische Effekte hervorrufen. Diese Ergebnisse deuten an, dass die erhöhte
reproduktiven Defekte der Mutanten nicht durch einen ACC-Mangel bzw. unzureichende
Ethylensynthese verursacht wurden.
4.1.5.2
Nicotianamin- und Polyaminsynthese finden im Leitgewebe statt.
Um die Expression von Genen der Nicotianamin- und Polyaminsynthese zu untersuchen
wurden Promotor-Gen-Reporterlinien hergestellt. Da Nicotianamin bereits in mehreren Studien
als phloembasiertes Chelator- und Transportmolekül für Eisen-, Zink- und Kupferionen
beschrieben wurde und Nicotianamintransporter im Phloem lokalisiert sind, wurde eine
phloemspezifische Expression der NAS-Gene erwartet (Koike et al., 2004; Klatte et al., 2009;
Chu et al., 2010; Deinlein et al., 2012; Haydon et al., 2012; Schuler et al., 2012; Zheng et al.,
2012). Die NAS-Gene waren tatsächlich hauptsächlich im Leitgewebe exprimiert.
Überraschend war jedoch die Expression von NAS1 und NAS2 in den Cortex- und
Endodermisschichten der Wurzel (Abb. 27). Aus dem Boden aufgenommene Metallionen
werden in den Wurzelsymplast importiert und über Plasmodesmata in den Zentralzylinder
transportiert. Cytosolisches Nicotianamin in Cortex und Endodermis wäre physiologisch
sinnvoll, da es sowohl die Bindung von Metallionen, als auch den Transport von Metall-NAKomplexen in den Zentralzylinder unterstüzten könnte. Jedoch wurde in den Cortex- und
Endodermisschichten der Wurzel keine MTI1- und DEP1-Expression gefunden. Daher stellt
sich die Frage, wie und ob das durch NAS1 und NAS2 produzierte MTA in den Cortex- und
Endodermisschichten recycelt wird. Von der Expression in den Cortex- und
Endodermisschichten abgesehen, fand die NAS-Expression allerdings entlang dem
Leitgewebe statt.
Nahezu alle an der Polyaminsynthese beteiligten Gene (ADC1, AIH, CPA, SPDS1, SPDS2,
SPMS, SAMDC1-4) werden laut dem zelltypspezifischen eFP-Browser im Phloem von
Arabidopsis exprimiert (Mustroph et al., 2009). Zur Überprüfung dieser Vorhersagen wurden
Promotor-Gen-Reporterlinien von CPA, SPDS1, SPDS2 und SPMS hergestellt und analysiert.
Alle vier Reporterlinien zeigten dabei ein übereinstimmendes Expressionsmuster. Die Gene
der Polyaminsynthese wurden im Leitgewebe, sowie in teilungsaktiven Zellen, wie
Wurzelspitzen oder Antheren, exprimiert (Abb. 28). Die Expression von Arabidopsis SPDS2
und SAMDC2 wurde, genau wie die Expression der Spermidin Synthase aus Kartoffel
(Solanum tuberosum), im Leitgewebe beschrieben (Hewezi et al., 2010; Pommerrenig et al.,
2011; Sichhart und Dräger, 2013). In Funktionsverlustmutanten für Polyaminsynthesegene
- 73 -
DISKUSSION
wurden aussdem Defekte in der Leitgewebe Entwicklung entdeckt (Clay und Nelson, 2005; Ge
et al., 2006).
Zusammen deuten die Expressionsdaten der MTA-produzierenden Enzyme darauf hin, dass
MTA im Leitgewebe erwachsener Arabidopsis-Pflanzen hauptsächlich durch die Synthese von
Nicotianamin und Polyaminen produziert wird.
4.1.6
Die durch Schwefelmangel induzierten Wachstumsdefekte der Yang-ZyklusMutanten sind nicht auf Nicotianaminmangel zurückzuführen
Bereits der Phänotyp der mti1- und dep1-Pflanzen gab erste Hinweise darauf, dass die
reproduktiven Defekte der Mutanten nicht von einem Nicotianaminmangel verusacht wurde.
Pflanzen mit ungenügendem Nicotianaminstoffwechsel zeigen einen charakteristischen
Blattphänotyp. Dieser zeichnet sich durch chlorotische Blätter aus, in denen lediglich die
Blattvenen grün bleiben. Dieser Phänotyp wurde zum ersten Mal in der Tomatenmutante
chloronerva entdeckt, bei der die Funktion einer Nicotianaminsynthase beeinträchtigt war
(Scholz et al., 1992; Ling et al., 1999). In mti1- und dep1-Pflanzen war ein solcher Phänotyp
nicht erkennbar.
Um die Nicotianaminversorgung der Pflanzen bei Schwefelmangel zu überprüfen, wurden die
Konzentrationen mittels LC-MS/MS bestimmt. Da Nicotianamin an der Versorgung der Pflanze
mit Metallionen beteiligt ist, führt Nicotianaminmangel letztendlich auch zu einem Mangel an
Eisen-, Zink- und Kupferionen. Es wurden deshalb auch die Konzentrationen von Eisen-, Zinkund Kupferionen bestimmt. Die Messungen der Nicotianaminkonzentration in den
Infloreszenzen zeigten, dass die Mutanten gegenüber dem WT, keine verringerte
Nicotianaminkonzentrationen aufwiesen. Die Nicotianaminkonzentration nahm zwar bei
abnehmender Schwefelkonzentration ab, sank aber selbst bei 10 µM Sulfat nicht unter eine
bestimmte Mindestmenge (Abb. 29). Gleichzeitig ging die NAS-Genexpression bei
Schwefelmangel zurück (Abb. 30). Dies deutet auf eine planvolle Reduktion der
Nicotianaminsynthese hin. Schuler et al. (2012) analysierten die physiologische Funktion von
Nicotianamin mit Hilfe kompletter Nicotianaminverlustmutanten. Eine der untersuchten
Vierfachmutanten, nas4x-1, wies dabei noch eine geringfügige Expression des NAS2-Allels
und geringe Nicotianaminmengen auf. Im Gegensatz zur kompletten Funktionsverlustmutante
nas4x-2, war nas4x-1 nicht chlorotisch und steril, sondern in der Lage seinen Lebenszyklus
abzuschliessen. Dies weist darauf hin, dass bereits geringe Nicotianaminmengen ausreichend
sind um die Versorgung der Pflanze mit Metallionen sicher zu stellen. Passend dazu, sind die
Konzentrationen von Eisen-, Zink- und Kupferionen in den mti1- und dep1-Pflanzen mit dem
WT identisch (Abb. 31). Außerdem wurde versucht, die Schwefelmangel induzierten
Wachstumsdefekte der mti1- und dep1-Mutanten durch Zugabe von Nicotianamin chemisch zu
komplementieren (Abb. 38). Nicotianaminmangelphänotypen konnten bereits durch die
externe Zugabe von Nicotianamin erfolgreich komplementiert werden (Waduwara-Jayabahu et
al., 2012). Trotz Zugabe vergleichbarer Nicotianaminmengen, konnte die erhöhte Sensitivität
der mti1- und dep1-Mutanten bei Schwefelmangel nicht gemildert werden.
Insgesamt zeigen diese Ergebnisse, dass Pflanzen bei Schwefelmangel die Synthese von
Nicotianamin zwar reduzieren, die Wachstumsdefekte der mti1- und dep1-Mutanten bei
- 74 -
DISKUSSION
Schwefelmangel jedoch nicht auf unzureichenden Nicotianaminstoffwechsel zurückgeführt
werden können.
4.1.7
Schwefelmangel führt zu Polyaminmangel in den Yang-Zyklus-Mutanten
Polyaminmessungen der oberirdischen Arabidopsis-Pflanzenteile zeigten, dass die mit
Abstand höchsten Polyaminkonzentrationen in den Blüten zu finden sind. Die Konzentrationen
im Stängel waren deutlich niedriger, lagen aber noch über den Konzentrationen der
Rosettenblätter (Naka et al., 2010). Die in der vorliegenden Arbeit durgeführten
Polyaminmessungen ergaben ebenfalls nur geringe Konzentrationen in den Rosettenblättern.
Höhere Konzentrationen wurden in den Wurzeln und Infloreszenzen gefunden (Abb. 32, 33
und 34). Analysen von Genen der Polyaminsynthese mittels Promotor-Gen-Reporterpflanzen
zeigten ausserdem, dass diese hauptsächlich im Wurzelleitgewebe und in den Blüten, nicht
jedoch in Rosettenblättern, exprimiert wurden (Abb. 28). Die Wachstumsdefekte der mti1- und
dep1-Mutanten bei Schwefelmangel betreffen vor allem das Infloreszenzwachstum und die
Reproduktionsfähigkeit (Abb. 13, 14 und 18). Passend zur Expression der
Polyaminsynthesegene und den Mutantenphänotypen, wurden die deutlichsten
Konzentrationsunterschiede in den Infloreszenzproben gemessen. Bei niedriger
Sulfutkonzentration nahm die Putrescinkonzentration in den Infloreszenzen der Mutanten
leicht, die Spermidinkonzentration stark ab. Die Sperminkonzentration war im Vergleich zum
WT nicht signifikant verändert. Die mti1- und dep1-Pflanzen bilden unter starkem
Schwefelmangel eine deutlich kürzere Infloreszenz als die WT-Pflanzen. Für die Messungen
wurden die Polyamine aus gesamten Infloreszenzen extrahiert und die Konzentration
bestimmt. Die im Vergleich zum WT verringerte Größe der Mutanteninfloreszenzen dürfte zu
einer unterschiedliche Probenzusammensetzung geführt haben. Der relative Anteil von Blüten
im geernteten Pflanzengewebe dürfte in den Mutanten höher sein als im WT. Nach Naka et al.
(2010) sind die Polyaminkonzentrationen in den Blüten deutlich höher als die
Polyaminkonzentrationen im Stängel. Dies könnte zu einer künstlichen Erhöhung der
Polyaminkonzentration in den Infloreszenzproben der Mutanten unter 10 bzw. 20 µM Sulfat
geführt haben. Die tatsächlichen Polyaminkonzentration in mti1 und dep1 unter 10 bzw. 20 µM
Sulfat sollten im Vergleich zum WT tendentiell also noch niedriger sein als die gemessenen
Konzentrationen.
4.1.7.1
Schwefelmangel führt zu Spermidin- und Sperminmangel in den Mutanten
Um zu überprüfen, ob die reproduktiven Defekte der Mutanten bei Schwefelmangel auf
unzureichenden
Polyaminstoffwechsel
zurückzuführen
ist,
wurden
chemische
Komplementationsexperimente durchgeführt. Extern applizierte Polyamine konnen von den
Wurzeln mit Hilfe von Polyamintransportern aus dem Medium aufgenommen werden (Mulangi
et al., 2011; Fujita et al., 2012; Mulangi et al., 2012; Waduwara-Jayabahu et al., 2012). Obwohl
die Putrescin- und Spermidinkonzentrationen in den mti1- und dep1-Mutanten verringert
waren, führte die Zugabe dieser beiden Polyamine zu keiner Verbesserung des Wachstums.
Die Zugabe von Spermins war jedoch in der Lage, die durch Schwefelmangel induzierte
Wachstumsreduktion der Mutanteninfloreszenzen stark abzuschwächen (Abb. 43 und 44).
Offensichtlich leiden die mti1- und dep1-Pflanzen vor allem an einem Sperminmangel, obwohl
dieser nicht messbar war. Obwohl das steady state Level von löslichem Spermin gering war,
- 75 -
DISKUSSION
könnte es trotzdem in großen Mengen gebraucht werden. Neben den gemessenen, löslichen
Polyaminen, liegen Polyamine v.a. in konjugierter Form in Pflanzen vor. So wurde z.B. in den
Blüten und Früchten von Olivenbäumen entdeckt, dass 90% der Polyamine in konjugierter
Form vorliegen (Gomez-Jimenez et al., 2010). Desweiteren berichten Alcázar et al. (2011) und
Do et al. (2013) von erhöhtem Sperminbedarf unter Salz- bzw. Trockenstress. Obwohl die
Konzentration des löslichen Spermins in diesen Arbeiten nicht verändert war, deuteten die
Daten eine metabolische Kanalisierung in Richtung Spermin an. Ein ähnlicher Vorgang könnte
bei Schwefelmangel in den mti1- und dep1-Mutanten stattgefunden haben.
Obwohl nur die Zugabe von Spermin das Wachstum der Mutanten bei Schwefelmangel
verbessern konnte, ist eine Beteiligung der anderen Polyamine nicht auszuschliesen. Trotz
Linderung des Wachstumsdefekts von mti1 und dep1 bei starkem Schwefelmangel, führte die
Zugabe von Spermin zu keiner nennenswerten Produktion überlebensfähiger Samen. Imai et
al. (2004b) konnten zeigen, dass Spermidin für das Überleben von Arabidopsis essentiell ist.
Mutanten ohne funktionelle SPDS-Gene waren steril. Pflanzen ohne funktionelles SPMS-Gen
dagegen, schienen unter Standardbedingungen unbeeinflusst. In den mti1- und dep1-Mutanten
ist die Spermidinkonzentration in den Blüten bei niedriger Sulfatkonzentration stark reduziert.
Diese Sterilität der Mutanen bei Schwefelmange ist wahrscheinlich auch auf die drastische
Reduktion der Spermidinkonzentration in den Blüten zurückzuführen.
4.1.7.2
Die mti1- und dep1-Mutanten leiden nicht an Thermosperminmangel
Das Sperminisomer Tspm ist mit den gängigen Polyaminmessmethoden leider nicht von
Spermin zu unterscheiden und konnte deshalb nicht quantifiziert werden. Da Tspm von den
gängigen Chemikalienlieferanten nicht lieferbar war, konnte es leider auch nicht zur
chemischen Komplementation verwendet werden. Theoretisch wäre im Rahmen der
Komplemtationsexperimente des Schwefelmangelphänotyps mit Spermin eine Umwandlung
des extern applizierten Spermins in Thermospermin durch eine Spm-Isomerase denkbar,
allerdings zeigten Kakehi et al. (2008), dass die Thermosperminsynthasemutante acl5 nicht
durch Spermin komplementiert werden konnte. Tspm ist an der Repression der
Xylemdifferenzierung beteiligt. Mutanten mit Thermosperminmangel zeigen Zwergwuchs und
starke Defekte in der Leitgewebeentwicklung (Takano et al., 2012). Zwar bleiben mti1- und
dep1-Pflanzen bei starkem Schwefelmangel ziemlich klein, jedoch konnte keine deutliche
Veränderung der Leitgewebe Anatomie festgestellt werden (Abb. 37).
4.1.8
SAM-Mangel, nicht MTA-Akkumulation, verursacht den Polyaminmangel
In der mtn1/mtn2 Mutante wird durch fehlende MTN-Aktivität MTA akkumuliert, da es nicht
mehr gespalten werden kann. Die hohe MTA-Konzentration in der mtn1/mtn2-Mutante führt zu
einer Produktinhibition der Nicotianamin- und Polyaminsynthese. Die Inhibition der
Polyaminsynthese wirkt sich dabei vor allem auf die Synthese von Spermidin und
Thermospermin aus und äußert sich in einem Phänotyp der den Thermospermin-assoziierten
Mutanten bud2 und acl5 ähnelt (Clay und Nelson, 2005; Ge et al., 2006; Muniz et al., 2008;
Waduwara-Jayabahu et al., 2012). Pflanzen mit fehlender MTN-Aktivität zeigen im Vergleich
zum WT ein kleineres Wachstum mit zahlreichen zusätzlichen Infloreszenzen und starke
Leitgewebe und reproduktive Defekte. Mutanten mit fehlender Enzymaktivität in nachfolgenden
Schritten des Yang-Zyklus könnten durch Rückkopplungseffekte theoretisch ebenfalls eine
- 76 -
DISKUSSION
erhöhte MTA-Konzentration aufweisen. So wäre es denkbar, dass der Phänotyp der mti1- bzw.
dep1-Mutanten bei starkem Schwefelmangel letztlich auf die inhibitorische Wirkung einer
erhöhten MTA-Konzentration zurückzuführen ist. Im Gegensatz zur mtn1/mtn2-Mutante haben
mti1 und dep1 bei ausreichender Schwefelversorgung allerdings keinerlei Wachstumsdefekte.
Zwar weisen mti1- bzw. dep1-Pflanzen bei Schwefelmangel ebenfalls reproduktive Defekte auf,
jedoch konnte weder eine deutliche Erhöhung in der Anzahl der Infloreszenzen, noch ein vom
WT abweichende Leitgewebeanatomie festgestellt werden. Auch die externe Zugabe von
Spermidin führt im Gegensatz zur mtn1/mtn2-Mutante nicht zu einer Verbesserung des
Wachstums (Abb. 41 und 42). Die unterschiedlichen Phänotypen der Mutanten weisen auf
eine unterschiedliche Ursache hin. Außerdem zeigten Bürstenbinder et al. (2007), dass
Pflanzen ohne MTK-Aktivität, dem nachfolgenden Enzym von MTN, kein MTA akkumulierten.
Es ist deshalb unwahrscheinlich, dass Pflanzen mit Defekten in nachfolgenden Genen wie
MTI1 oder gar DEP1 erhöhte MTA-Konzentrationen aufweisen.
Insgesamt deuten die Daten darauf hin, dass der Polyaminmangel, der die Wachstumsdefekte
in den Yang-Zyklus-Mutanten bei Schwefelmangel verursacht, durch die geringe Verfügbarkeit
von Methionin bzw. SAM verursacht wird (Abb. 54). Aufgrund von Schwefelmangel ist die
primäre Schwefelassimilation gering und damit auch die generelle Verfügbarkeit von
Schwefelmetaboliten. Auch bei Schwefelmangel mussen die Pflanzen jedoch Nicotianamine
und vor allem Polyamine produzieren. Durch das fehlende MTA-Recycling aufgrund des
defekten Yang-Zyklus in den mti1- und dep1-Mutanten verringert sich die Konzentration von
Methionin und SAM noch weiter. Bei anhaltendem Schwefelmangel führt dies letztendlich zum
Zusammenbruch der Polyaminsynthese und einem Mangel an Spermidin und Spermin. Der
Mangel dieser beiden Polyamine führt zu Defekten im Wachstum und der Reproduktion. Der
Sperminmangel scheint dabei vor allem das Infloreszenzwachstum, sowie die Sensitivität
gegenüber Stress zu beeinflussen, während der Spermidinmangel wahrscheinlich die
reproduktiven Defekten der Mutanten bei Schwefelmangel verursacht.
Abb. 54: Model der metabolischen Vorgänge in mti1- und dep1-Mutanten bei Schwefelmangel.
Abkürzungen: Met = Methionin, MTA = 5-Methylthioadenosin, NA = Nicotianamin, PA = Polyamine, SAM
= S-Adenosylmethionin.
- 77 -
DISKUSSION
4.2
Suche nach Yang-Zyklus-Transaminasen in A. thaliana
In Arabidopsis sind mittlerweile für fast alle Schritte des Yang-Zyklus die katalysierenden
Enzyme bekannt. Lediglich der letzte Schritt, die Transaminierung von 4-Ketomethylthiobutyrat
zu Methionin ist bislang noch unbekannt. In anderen Organismen wurden solche KMTBTransaminasen jedoch bereits identifiziert. So kennt man bisher mit YkrV und YbgE zwei
KMTB-Transaminasen in Bacillus subtilis und mit Aro8p, Aro9p, Bat1p und Bat2p vier solche
Enzyme in Saccaromyces cerevisiae (Berger et al., 2003; Pirkov et al., 2008). Im
gramnegativen Stäbchen Bakterium Klebsiella pneumoniae ist mit TyrB ebenfalls eine KMTBTransaminase bekannt (Heilbronn et al., 1999). In der vorliegenden Arbeit wurde versucht die
KMTB-Transaminasen von Arabidopsis thaliana zu identifizieren. Da keine der bekannten
KMTB-Transaminasemutanten einen sichtbaren Phänotyp aufweist, konnten leider keine
heterologen Komplementationsexperimente durchgeführt werden. Statt dessen wurden über
Sequenzhomologie Kandidatengene identifiziert und deren Expression mit der Expression des
Yang-Zyklus vergleichen. Kandidatengene mit passender Lokalisation wurden mit Hilfe von
Funktionsverlustmutanten und enzymatischen Test weiter untersucht.
4.2.1
Homologe Proteine zu B. subtilis YkrV und S. cerevisiae Aro8p/Aro9p
WU-BLAST-Analysen mit der Bacillus subtilis YkrV Aminosäuresequenz ergaben 8
verschiedenen Proteine mit einem P-Wert höher als e-10. Von diesen 8 konnte bereits 6
Proteinen eine Funktion zugeordnet werden. At2g22250 kodiert für eine AspartatAminotransferase, die in den Chlorplasten lokalisiert und am Stickstoffmetabolismus beteiligt
ist (de la Torre et al., 2006). At4g33680 und At2g13810 kodieren die Aminotransferasen
ABERRANT GROWTH AND DEATH2 (AGD2) und AGD2-LIKE DEFENSE RESPONSE
(ALD1). In agd2 Mutanten wurde ein erhöhtes Salicylsäurelevel, sowie veränderte
Blattmorphologie und Zwergwuchs gefunden. In ald1 Mutanten wurde dagegen ein verringertes
Salicylsäurelevel und eine erhöhte Krankheitsanfälligkeit entdeckt. Beide Enzyme scheinen
gegensätzliche Rollen zu erfüllen. Während AGD2 die Entwicklung fördert und die Abwehr
unterdrückt, fördert ALD1 die Abwehr (Song et al., 2004). At5g36160 kodiert eine TyrosinAminotransferase, die an der Umwandlung von Tyrosin und 4-Hydroxyphenylpyruvat sowie
Phenylalanin und Phenylpyruvat beteiligt ist (Prabhu und Hudson, 2010). At5g53970 kodiert
ebenfalls eine Tyrosin-Aminotransferase. Für dieses Enzym konnte eine Beteiligung an der
Tocopherolsynthese gezeigt werden (Riewe et al., 2012). At4g08040 kodiert die ACCSynthase 11. Dieses Enzym ist an der Ethylensynthese beteiligt (Yamagami et al., 2003).
WU-BLAST-Analysen mit S. cerevisiae Aro8p und Aro9p lieferten nur wenige Treffer mit
niedriger Ähnlichkeit und P-Wert. Die homologen Proteine At1g77670, At1g80360, At2g22250
und At5g53970 wurden allerdings bereits bei der Analyse von YkrV entdeckt. Als einziger neuer
Treffer wurde At1g64220 gefunden. Da es sich bei At1g64220 allerdings um ein Bestandteil
des mitochondriellen Proteinimportkomplexes TOM/TIM handelt, kann eine Beteiligung am
Yang-Zyklus ausgeschlossen werden.
Lediglich für die Gene At1g77670 und At1g80360 war zu diesem Zeitpunkt keine Funktion
bekannt. Beide Gene wurden deshalb zur weiteren Analyse ausgewählt.
- 78 -
DISKUSSION
4.2.2
Homologe Proteine zu B. subtilis YbgE und S. cerevisiae Bat1p/Bat2p
Homologieanalysen mit den Aminosäuresequenzen von B. subtilis YbgE und S. cerevisiae
Bat1p/Bat2p ergaben hauptsächlich Treffer innerhalb der BRANCHED-CHAIN AMINO ACID
TRANSFERASE (BCAT)-Familie in Arabidopsis. Mitglieder der BCAT-Familie spielen eine
wichtige Rolle im Metabolismus von Leucin, Isoleucin und Valin (Diebold, 2002). Die BCATFamilie umfasst 7 Gene, von den aber nur 6 transkribiert werden. BCAT7 wird trotz intaktem
Leseraster nicht abgelesen (Binder et al., 2007). Im Rahmen enzymatischer Test mit BCAT1
wurden unter anderem Hinweise auf eine mögliche Beteiligung am Yang-Zyklus gefunden. Die
BCAT-Isoformen wurden deshalb zur weiteren Analyse ausgewählt.
Neben den Proteinen der BCAT-Familie wurden mit At5g27410 und At3g05190 noch zwei
weitere Homologe von YbgE gefunden. Beide Proteine sind in Chlorplasten lokalisiert und an
der Folatsynthese beteiligt (Basset et al., 2004). Sie können deshalb als Yang-Zyklus-Gene
ebenfalls ausgeschlossen werden.
4.2.3
Homologe Proteine zu K. pneumoniae TyrB
Die Aminosäuresequenz von K. pneumoniae TyrB hat große Ähnlichkeit zur ASPARTATE
AMINOTRANSFERASE (ASP)-Familie. Schultz et al. (1998) konnten zeigen, dass ASP2 an
der Aspartatsynthese im Phloem beteiligt ist. Die übrigen Mitglieder der Familie wurden jedoch
bisher nicht weiter untersucht. Die Mitglieder der ASP-Genfamilie wurden deshalb ebenfalls für
die weitere Analyse ausgewählt.
4.2.4
Expressionsanalysen mit putativen KMTB-Transaminasen
Am Yang-Zyklus beteiligte Aminotransferasen sollten auch die für den Yang-Zyklus typische
Lokalisation im Leitgewebe zeigen. Um die Auswahl der putativen KMTB-Transaminasen
weiter einzugrenzen wurden deshalb Promotor-(Gen)-Reporterpflanzen für alle putativen
KMTB-Transaminasen hergestellt. Von den 12 untersuchten putativen KMTB-Transaminasen
besaßen 5 ein Expressionsmuster, das dem Expressionsmuster der Yang-Zyklus-Gene MTI1
bzw. DEP1 ähnlich war. Während das Expressionsmuster von BCAT1, 3, 5 und 6, sowie ASP1,
2 und 3 nicht mit dem Expressionsmuster von MTI1 bzw. DEP1 übereinstimmte, waren
At1g77670, At1g80360, BCAT2, ASP4 und ASP5 jeweils in Wurzel- und Blattleitgewebe, sowie
in den Blüten lokalisiert (Abb. 44, 45 und 46). Da Zheng et al. (2013) dem Gen At1g80360 zu
diesem Zeitpunkt eine Funktion bei der Koordination der Ethylen- und Auxinsynthese zuordnen
konnten, verblieben die Gene At1g77670, BCAT2, ASP4 und ASP5 als putative KMTB
Transaminasen.
4.2.5
Funktionelle Analysen mit putativen KMTB-Transaminasen
Pflanzen ohne funktionelles MTI1- bzw. DEP1-Gen sind nicht in der Lage MTA als
Schwefelquelle zu nutzen und zeigen bei starkem Schwefelmangel reproduktive Defekte. Bei
der Untersuchung von at1g77670, bcat2, asp4 und asp5 Mutanten zeigte sich allerdings, dass
keine dieser Mutanten einen derartigen Phänotyp besitzt. Zusätzlich zur Analyse von T-DNAInsertionslinien wurden die putativen KMTB-Transaminasen mittels enzymatischer Tests
untersucht. Dabei wurde die Fähigkeit gereinigter bzw. partiell gereinigter Proteine untersucht,
KMTB in Methionin umzuwandeln. Neben der Positivkontrolle YkrV war von den getesteten
- 79 -
DISKUSSION
Proteinen nur At1g77670 in der Lage KMTB zu transaminieren. Aufgrund einer zum YangZyklus passenden Lokalisation und der biochemischen Fähigkeit KMTB in Methionin
umzusetzen handelt es sich bei At1g77670 mit großer Wahrscheinlichkeit um eine YangZyklus-Transaminase. Erst kürzlich veröffentlichten Ellens et al. (2014) Hinweise darauf, dass
es sich bei At1g77670 tatsächlich um eine Aminotransferase des Yang-Zyklus handelt. Die
Tatsache, dass Pflanzen ohne funktionelles At1g77670 Gen immer noch in der Lage sind MTA
als Schwefelquelle zu nutzen und keine Defekte bei Schwefelmangel aufweisen, deutet auf
weitere Yang-Zyklus-Transaminasen hin. Erst kürzlich veröffentlichten Lachler et al. (2015),
dass die cytosolischen BCATs, BCAT4 und BCAT6 am Yang-Zyklus beteiligt sein könnten.
BCAT6 könnte auf Grund seiner Lokalisation allerdings nur in den Blüten von Bedeutung sein.
BCAT4 allerdings besitzt eine mit dem Yang-Zyklus übereinstimmendes Expressionsmuster.
Für BCAT4 wurde gezeigt, dass es unter Standardbedingungen an der Deaminierung von
Methionin zu KMTB und damit an der Glukosinolatsynthese beteiligt ist (Schuster et al., 2006).
BCAT4 katalysiert damit genau die Gegenreaktion der gesuchten KMTB-Transaminase. Es
wäre allerdings denkbar, dass BCAT4 unter bestimmten Umständen auch in der Lage ist die
Transaminierung von KMTB zu Methionin zu katalysieren. Das Umschalten zwischen KMTBTransaminierung und der Deaminierung von Methionin könnte evtl. sogar einen Beitrag zur
schwefelabhängigen Regulation der Glukosinolatsynthese leisten. Es ist bekannt, dass die
Glukosinolatsynthese bei Schwefelmangel verringert wird (Falk et al., 2007). Die
Konzentrationen von KMTB und Methionin könnten evtl. über die Umsatzrichtung von BCAT4
entscheiden. Leider wurden in der vorliegenden Arbeit keine enzymatischen Tests mit BCAT4
zur KMTB-Transaminierung durchgeführt. Diese Tests könnten zusammen mit der Analyse von
at1g77670 x bcat4-Doppelmutanten Aufschluss über weiter Transaminasen des Yang-Zyklus
liefern.
- 80 -
MATERIAL UND METHODEN
5
MATERIAL UND METHODEN
5.1
Material
5.1.1
Bakterienstämme
Tabelle 2: Verwendete E. coli-Stämme
Stamm
Genotyp
DB3.1
F- gyrA462 endA1 glnV44 Δ(sr1-recA) mcrB mrr
hsdS20(rB-, mB-) ara14 galK2 lacY1 proA2
rpsL20(Smr) xyl5 Δleu mtl1
DH5α
F- endA1 glnV44 thi-1 recA1 relA1 gyrA96 deoR
nupG Φ80dlacZΔM15 Δ(lacZYA-argF)U169,
hsdR17(rK- mK+), λ–
Rosetta 2(DE3)pLysS
F- ompT hsdSB(RB- mB-) gal dcm λ(DE3 [lacI
lacUV5-T7 gene 1 ind1 sam7 nin5]) pLysSRARE
(CamR)
Tabelle 3: Verwendete A. tumefaciens-Stämme
Stamm
Resistenz
C58C1
--GV3101::pMP90
GentR, RifR
5.1.2
Referenz
Invitrogen, Carlsbad,
USA
Hanahan (1983)
Novagen, Madison,
USA
Referenz
Deblaere et al. (1985)
Holsters et al. (1980)
Oligonukleotide
Tabelle 4: Primer zur Genotypisierung von T-DNA-Insertionslinien
Primer
Sequenz
MTI1-f (Abb. 9 Pfeil a)
GTTGATGGTGTCATCGTTGG
MTI1-r (Abb. 9 Pfeil b)
TGTCAAATGTATCATTGCCATTC
DEP1-f (Abb. 9 Pfeil c)
GGGATTCAAGGTCACGGATA
DEP1-r (Abb. 9 Pfeil d)
CTCAAAACCTGTTCGCCATA
At1g77670-f (Abb. 47 Pfeil e)
GCTTCAAAGCCTCTCTTCTCC
At1g77670-r (Abb. 47 Pfeil f)
TGATCCATTTCAAACGCAAG
BCAT2-f (Abb. 48 Pfeil g)
GGTTCTACCTCTTCATTTACATATTCG
BCAT2-r (Abb. 48 Pfeil h)
GATCCGGACGAAACAAAAGA
ASP4-f (Abb. 49 Pfeil i)
GAGCAACAGTTAGCCAACGA
ASP4-r (Abb. 49 Pfeil j)
CGAATGTTGGGTCAACTCCT
ASP5-f (Abb. 50 Pfeil k)
TATGACGGTTGCAGTGAAGC
ASP5-r (Abb. 50 Pfeil l)
ATTCCAGTTGGGTTGTGAGC
LB-FLAG
CGTGTGCCAGGTGCCCACGGAATAGT
LBb1.3
ATTTTGCCGATTTCGGAAC
LB-Wisc
AACGTCCGCAATGTGTTATTAAGTTGT
ACT2-fwd
ATTCAGATGCCCAGAAGTCTTGTT
ACT2-rev
GAAACATTTTCTGTGAACGATTCCT
- 81 -
MATERIAL UND METHODEN
Tabelle 5: Primer zur Klonierung von pCaMV35S::MTI1 amiRNA
Primer
Sequenz
amiRNA_I
GATACTCAAACGCTGTAAGCCTGTCTCTCTTTTGTATTCC
amiRNA_II
GACAGGCTTACAGCGTTTGAGTATCAAAGAGAATCAATGA
amiRNA_III
GACAAGCTTACAGCGATTGAGTTTCACAGGTCGTGATATG
amiRNA_IV
GAAACTCAATCGCTGTAAGCTTGTCTACATATATATTCCT
amiRNA_A
CTGCAAGGCGATTAAGTTGGGTAAC
amiRNA_B
GCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAG
Tabelle 6: Primer zur Klonierung von pBasta-GFP und pBasta-GUS
Primer
Sequenz
Gateway+GFP-f-SbfI
CCTGCAGGATTCCCGATCTAGTAACATAGATGACACCG
Gateway+GFP-r-PacI
TTAATTAAGTACCGAGCTCGAATTATCACAAGTTTG
Gateway+GUS-f-XhoI
CTCGAGTGTGGAATTGTGAGCGGATA
Gateway+GUS-r-XhoI
CTCGAGGTTTTCCCAGTCACGACGTT
Tabelle 7: Primer zur Klonierung von Expressionslinien
Primer
Sequenz
MTI1-1925f
CACCTGAAAGAGGCCTAGCGAAGA
MTI1+2078r
ACGAGATGAGTTTCCTGTTATCTTCTTGG
DEP1-1649f
CACCATCTGCGACACAATCTGCTG
DEP1+3660r
GATTTGGGAGAATGATGTGACA
NAS1-1822f
CACCTGTTGACCACTTGACAAGCAC
NAS1+960r
CTCGATGGCACTAAACTCCTC
NAS2-1771f
CACCGATCGTCGCACTCAAACTCA
NAS2+960r
CTCGATGGCACTATACTCCTCG
NAS3-1913f
CACCTCTTTCATCCGTTTCAAAACATT
NAS3+960r
AGACAACTGTTCCTCCCTAGCTC
NAS4-2350f
CACCGTGCACCAACAGTGAGGATG
NAS4+972r
GGTAAGTTGTTCTTCATTAGCACCTGCG
CPA-1326f
CACCAGTTCCACAAAGCGAGCAAT
CPA+1909r
GAGATTACCATCCATAGTAAGAAGCACC
SPDS1-1968f
CACCCAGGGCGATGGTAGTCAAGT
SPDS1+2444r
ATTGGCTTTTGACTCAATGACCTTC
SPDS2-1428f
CACCATTCACGAAGCCAATGAAGG
SPDS2+1853r
GTTGGCTTTCGAATCAATCACCTTC
SPMS-1982f
CACCCAAGGTTTGGTCCAACGTAA
SPMS+2222r
AGAAGCCAGAAGTGAAGCTACTTCTCTC
At1g77670-1750f
CACCGCAAGCTTGGCGTAAGTCTC
At1g77670+1856r
GACTTTTCTCTTAAGCTTCTGCTTCA
At1g80360-1533f
CACCCCGCAGGATCCACTTAGAAA
At1g80360+1905r
CTCCACCATTCCATGGTGA
BCAT1-1716f
CACCATCCCGTTACAATGGGAAATTTAG
BCAT1-1r
ATACGAAGAATGTTGTACGAGCTTT
BCAT2-1929f
CACCCTACGAGCGGAACGATTCTC
BCAT2+1907r
GTTGATATCTGTGACCCATCCC
BCAT3-1719f
CACCATTGCGGTTGAATTTTGCAT
- 82 -
MATERIAL UND METHODEN
BCAT3-1r
BCAT5-1538f
BCAT5-1r
BCAT6-1741f
BCAT6-1r
ASP1-1994f
ASP1-1r
ASP2-1977f
ASP2-1r
ASP3-2055f
ASP3-1r
ASP4-2075f
ASP4-1r
ASP5-2139f
ASP5-1r
TTTTTTCTATCTTCACAATGTGTCTAGTG
CACCTACTGGAAATGTTGACTGCTTC
AGTCTCTCCCAATATCACAATTACG
CACCTTCGTGATAAGAGAGCCGAGA
CTATGGAGAAATAGAGAAAGCAGTAGTGA
CACCCAACAACGACAACTCCAGCA
AACTCTATCTCTCTATCTCTCTCTGTTTCTATC
CACCTGAGTCTTTCTTCTATTGCTCGT
GACGAGACAAGGGATTGAAA
CACCACTATTAGAGCTCAAACACGACA
TTTTGTTTTTGCTTCGTGTG
CACCCTGGTTTGATTCGGACTGGT
GAGAATTGATTGAATCAGTTGAAATG
CACCTTGAGCAAGATTCACCACCC
GGAATCGCTATGGAGCACAA
Tabelle 8: Primer zur Klonierung von subzellulären Lokalisationsvektoren
Primer
Sequenz
MTI1_CDS+1f
CACCATGTCCGGCGAAGGAGACACG
MTI1_CDS+1122r
ACGAGATGAGTTTCCTGTTATCTTCTTGGCA
MTI1_CDS+1125r
TCAACGAGATGAGTTTCCTGTTATCTTCTTG
DEP1_CDS+1f
CACCATGGCGGTGGCTGCAGCG
DEP1_CDS+1521r
GATTTGGGAGAATGATGTGACAGTCTTGAAC
DEP1_CDS+1524r
CTAGATTTGGGAGAATGATGTGACAGTCTT
Tabelle 9: Primer für qRT-PCR-Analysen
Primer
Sequenz
MTI1_qPCR-f
GCAGGAATCATAACCGAGAAAGGG
MTI1_qPCR-r
GGAACATCCGCAAGTCGCAATG
UBI10_qPCR-f
GATGGTCGTACTTTGGCGGATTAC
UBI10_qPCR-r
AGACGCAACACCAAGTGAAGGG
SULTR1;1_qPCR-f
AGATCGGTCTCTTGATCGCTGTG
SULTR1;1_qPCR-r
AACCGTGGTTCTTGGTCTCGTC
SULTR1;2_qPCR-f
GCCTGTATTGGAGCATTCTTTGGC
SULTR1;2_qPCR-r
ATCTTAGCAAACGAGATCGAGACG
APR3_qPCR-f
CAGAGAAGCTAGATGTGGTGGAAG
APR3_qPCR-r
AACATCTTCAGCTCCACTAAAGGC
NAS1_qPCR-f
TTTCTTAGCGGCGCTTGTAGGG
NAS1_qPCR-r
TGTTTCTCCAAGTGCTCGATGGC
NAS2_qPCR-f
ATCGGACGGTGTGTGGTTATGC
NAS2_qPCR-r
CGATTGTTCAAGATCGCGTGGAC
NAS4_qPCR-f
ATGCTGAGAAGCGCTCATGGAC
NAS4_qPCR-r
CCTTCGAGATCACAAGGCTCAACG
SPDS1_qPCR-f
CACCCACTGAACCCAATTGACG
SPDS1_qPCR-r
GCAGAATGCAGCTGAATGAATCTC
BUD2_qPCR-f
AAAGAGATGACGCGGCTCAGTG
BUD2_qPCR-r
CCGCAAGGATCAAACGCGAAATC
- 83 -
MATERIAL UND METHODEN
ACL5_qPCR-f
ACL5_qPCR-r
CAAGTACGTGAAGGCTTACACAGC
ACGTCAAACTCGTGGTCCGATG
Tabelle 10: Primer zur Klonierung von pSUC2 Komplementationsvektoren
Primer
Sequenz
MTI1_cds+1f
CACCATGTCCGGCGAAGGAGACACG
MTI1_cds+1125r
TCAACGAGATGAGTTTCCTGTTATCTTCTTG
DEP1_cds+1f
CACCATGGCGGTGGCTGCAGCG
DEP1_cds+1524r
CTAGATTTGGGAGAATGATGTGACAGTCTT
hpt/KpnI-f
CACCGGTACCGCGTTCGTGGTCTATTTGCT
hpt/KpnI-r
GGTACCGTTTTCCCAGTCACGACGTT
Tabelle 11: Primer zur Klonierung von Expressionsvektoren für die Proteinsynthese
Primer
Sequenz
YkrV+1f_XhoI
ATACTCGAGATGAAATTTGAACAGTCTCATGTATTG
YkrV+1197r_XhoI
TCACTCGAGTTATAAGGTCTTGTCAATGCTTTTTTG
At1g77670+1f_NdeI
GCATTACATATGTACCTGGACATAAATGGTGTG
At1g77670+1323r_NdeI
TACTAACATATGCTAGACTTTTCTCTTAAGCTTCTGCTTC
BCAT2+1f_NdeI
GCATTACATATGATCAAAACAATCACATCTCTACG
BCAT2+1167r_NdeI
TACTAACATATGCTAGTTGATATCTGTGACCCATCCC
ASP4+1f_NdeI
GCATTACATATGAATTCCATCTTGTCAAGCG
ASP4+1218r_NdeI
TACTAACATATGCTAGGCGATGCGAGTAACAACA
ASP5+1f_NdeI
GCATTACATATGGCTTCTTTAATGTTATCTCTCGG
ASP5+1362r_NdeI
TACTAACATATGCTAGCTTACGTTATGGTATGAGTCGATGA
Alle Oligonukleotide wurden von Sigma-Aldrich (Schnelldorf) bezogen.
5.1.3
Vektoren
Tabelle 12: Gateway®-Eingangsvektoren (in pENTR/D-TOPO®)
Name/Konstrukt
Resistenz
DEP1-CDS ohne Stp
KanR
DEP1-CDS
KanR
MTI1-amiRNA
KanR
MTI1-CDS ohne Stp
KanR
MTI1-CDS
KanR
pASP1
KanR
pASP2
KanR
pASP3
KanR
pASP4
KanR
pASP5
KanR
pAt1g77670::At1g77670
KanR
pAt1g80360::At1g80360
KanR
pBCAT1
KanR
pBCAT2::BCAT2
KanR
pBCAT3
KanR
pBCAT5
KanR
- 84 -
Referenz
diese Arbeit
diese Arbeit
diese Arbeit
diese Arbeit
diese Arbeit
diese Arbeit
diese Arbeit
diese Arbeit
diese Arbeit
diese Arbeit
diese Arbeit
diese Arbeit
diese Arbeit
diese Arbeit
diese Arbeit
diese Arbeit
MATERIAL UND METHODEN
pBCAT6
pDEP1::DEP1
pMTI1::MTI1
pNAS1::NAS1
pNAS2::NAS2
pNAS3::NAS3
pNAS4::NAS4
pCPA::CPA
pSPDS1::SPDS1
pSPDS2::SPDS2
pSPMS::SPMS
KanR
KanR
KanR
KanR
KanR
KanR
KanR
KanR
KanR
KanR
KanR
diese Arbeit
diese Arbeit
diese Arbeit
diese Arbeit
diese Arbeit
diese Arbeit
diese Arbeit
diese Arbeit
diese Arbeit
diese Arbeit
diese Arbeit
Tabelle 13: Zwischenklonierungsvektoren (in pCR®-Blunt II-TOPO®)
Name/Konstrukt
Resistenz
Referenz
ASP4-CDS
KanR
diese Arbeit
R
ASP5-CDS
Kan
diese Arbeit
At1g77670-CDS
KanR
diese Arbeit
R
BCAT2-CDS
Kan
diese Arbeit
hpt-CDS
KanR
diese Arbeit
ykrV-CDS
KanR
diese Arbeit
Tabelle 14: Gateway®-Zielvektoren
Name/Konstrukt
pBasta-GFP
pBasta-GUS
pSUC2-dest
(pGREEN basiert, benötigt pSOUP)
pSUC2-dest+hpt
(pGREEN basiert, benötigt pSOUP)
pEarlygate100
pEarlygate104
pMDC107
pMDC163
pMDC83
Resistenz
KanR, GlufosinatR
KanR, GlufosinatR
KanR, GlufosinatR
Referenz
diese Arbeit
diese Arbeit
Thompson und Wolniak (2008)
KanR, GlufosinatR,
HygR
KanR, GlufosinatR
KanR, GlufosinatR
KanR, HygR
KanR, HygR
KanR, HygR
diese Arbeit
Tabelle 15: Pflanzentransformationsvektoren
Name/Konstrukt
Resistenz
pASP1::GUS
KanR, GlufosinatR
pASP2::GUS
KanR, GlufosinatR
pASP3::GUS
KanR, GlufosinatR
pASP4::GUS
KanR, GlufosinatR
pASP5::GUS
KanR, GlufosinatR
pAt1g77670::At1g77670-GUS
KanR, GlufosinatR
pAt1g80360::At1g80360-GUS
KanR, GlufosinatR
pBCAT1::GUS
KanR, GlufosinatR
pBCAT2::BCAT2-GUS
KanR, GlufosinatR
pBCAT3::GUS
KanR, GlufosinatR
- 85 -
Earley et al. (2006)
Earley et al. (2006)
Curtis und Grossniklaus (2003)
Curtis und Grossniklaus (2003)
Curtis und Grossniklaus (2003)
Referenz
diese Arbeit
diese Arbeit
diese Arbeit
diese Arbeit
diese Arbeit
diese Arbeit
diese Arbeit
diese Arbeit
diese Arbeit
diese Arbeit
MATERIAL UND METHODEN
pBCAT5::GUS
pBCAT6::GUS
pCaMV35S::CaM2-mCherry
pCaMV35S::DEP1-GFP
pCaMV35S::GFP-DEP1
pCaMV35S::GFP-MTI1
pCaMV35S::MTI1-GFP
pDEP1::DEP1-GFP
pDEP1::DEP1-GUS
pMTI1::MTI1-GFP
pMTI1::MTI1-GUS
pNAS1::NAS1-GUS
pNAS2::NAS2-GUS
pNAS3::NAS3-GUS
pNAS4::NAS4-GUS
pCPA::CPA-GUS
pSPDS1::SPDS1-GUS
pSPDS2::SPDS2-GUS
pSPMS::SPMS-GUS
KanR, GlufosinatR
KanR, GlufosinatR
KanR, HygR
KanR, HygR
KanR, GlufosinatR
KanR, GlufosinatR
KanR, HygR
KanR, HygR
KanR, HygR
KanR, HygR
KanR, HygR
KanR, GlufosinatR
KanR, GlufosinatR
KanR, GlufosinatR
KanR, GlufosinatR
KanR, GlufosinatR
KanR, GlufosinatR
KanR, GlufosinatR
KanR, GlufosinatR
diese Arbeit
diese Arbeit
Fischer et al. (2013)
diese Arbeit
diese Arbeit
diese Arbeit
diese Arbeit
diese Arbeit
diese Arbeit
diese Arbeit
diese Arbeit
diese Arbeit
diese Arbeit
diese Arbeit
diese Arbeit
diese Arbeit
diese Arbeit
diese Arbeit
diese Arbeit
Tabelle 16: Expressionsvektoren zur Herstellung von Proteinen
Name/Konstrukt
Resistenz
ASP4-CDS/pET-15b
AmpR
ASP5-CDS/pET-15b
AmpR
At1g77670-CDS/pET-15b
AmpR
BCAT2-CDS/pET-15b
AmpR
ykrV-CDS/pET1-5b
AmpR
Referenz
diese Arbeit
diese Arbeit
diese Arbeit
diese Arbeit
diese Arbeit
Tabelle 17: Sonstige Vektoren
Name/Konstrukt
pET-15b
pSOUP (benötigt für pGREEN)
Referenz
Merck, Darmstadt, Deutschland
Hellens et al. (2000)
5.1.4
Resistenz
AmpR
TetR
Pflanzenlinien
Tabelle 18: Arabidopsis-Ökotypen
Name
Quelle
Col-0 (Col)
Nottingham Arabidopsis Stock Center, Nottingham, UK
Ws-0 (Ws)
Nottingham Arabidopsis Stock Center, Nottingham, UK
Tabelle 19: T-DNA-Insertionslinien
Name
Linienbezeichnung
asp4
WiscDsLox453-456D4
asp5
FLAG280A06
at1g77670 WiscDsLox334E04
bcat2
SALK_037854
dep1-1
SALK_091578C
Ökotyp
Col-0
Ws-0
Col-0
Col-0
Col-0
- 86 -
betroffenes Gen
At1g62800
At4g31990
At1g77670
At1g10070
At5g53850
Referenz
Woody et al. (2007)
Samson et al. (2002)
Woody et al. (2007)
Alonso et al. (2003)
Alonso et al. (2003)
MATERIAL UND METHODEN
dep1-2
mti1-1
WiscDsLox489-492G6
FLAG_154B05
Tabelle 20: Reportergenpflanzen
Name
pASP1::GUS
pASP2::GUS
pASP3::GUS
pASP4::GUS
pASP5::GUS
pAt1g77670::At1g77670-GUS
pAt1g80360::At1g80360-GUS
pBCAT1::GUS
pBCAT2::BCAT2-GUS
pBCAT3::GUS
pBCAT5::GUS
pBCAT6::GUS
pDEP1::DEP1-GFP
pDEP1::DEP1-GUS
pMTI1::MTI1-GFP
pMTI1::MTI1-GUS
pNAS1::NAS1-GUS
pNAS2::NAS2-GUS
pNAS3::NAS3-GUS
pNAS4::NAS4-GUS
pCPA::CPA-GUS
pSPDS1::SPDS1-GUS
pSPDS2::SPDS1-GUS
pSPMS::SPMS-GUS
Col-0
Ws-0
Elternlinie
Col-0
Col-0
Col-0
Col-0
Col-0
Col-0
Col-0
Col-0
Col-0
Col-0
Col-0
Col-0
Col-0
Col-0
Col-0
Col-0
Col-0
Col-0
Col-0
Col-0
Col-0
Col-0
Col-0
Col-0
Tabelle 21: Mutanten- und Komplementationslinien
Name
Elternlinie
mti1-2
Col-0
MM
mti1-1
SM
mti1-1
DD
dep1-1
SD
dep1-1
5.1.5
Medien
5.1.5.1
Medien zur Anzucht von Bakterien
LB-Medium
At5g53850
At2g05830
Alonso et al. (2003)
Samson et al. (2002)
Transformationskonstrukt
pASP1::GUS
pASP2::GUS
pASP3::GUS
pASP4::GUS
pASP5::GUS
pAt1g77670::At1g77670-GUS
pAt1g80360::At1g80360-GUS
pBCAT1::GUS
pBCAT2::BCAT2-GUS
pBCAT3::GUS
pBCAT5::GUS
pBCAT6::GUS
pDEP1::DEP1-GFP
pDEP1::DEP1-GUS
pMTI1::MTI1-GFP
pMTI1::MTI1-GUS
pNAS1::NAS1-GUS
pNAS2::NAS2-GUS
pNAS3::NAS3-GUS
pNAS4::NAS4-GUS
pCPA::CPA-GUS
pSPDS1::SPDS1-GUS
pSPDS2::SPDS1-GUS
pSPMS::SPMS-GUS
Resistenz
Glufosinat
Glufosinat
Glufosinat
Glufosinat
Glufosinat
Glufosinat
Glufosinat
Glufosinat
Glufosinat
Glufosinat
Glufosinat
Glufosinat
Hygromycin
Hygromycin
Hygromycin
Hygromycin
Glufosinat
Glufosinat
Glufosinat
Glufosinat
Glufosinat
Glufosinat
Glufosinat
Glufosinat
Transformationskonstrukt
pCaMV35S::MTI1-amiRNA
pMTI1::MTI1-GFP
pSUC2::MTI1 CDS
pDEP1::DEP1-GFP
pSUC2::DEP1 CDS
Resistenz
Glufosinat
Hygromycin
Hygromycin
Hygromycin
Hygromycin
1,0%
0,5%
1,0%
1,5%
- 87 -
Trypton
Hefeextrakt
NaCl
Agar für Festmedien
MATERIAL UND METHODEN
SOB-Medium
5.1.5.2
2,0%
0,5%
2,5 mM
10 mM
10 mM
10 mM
Trypton
Hefeextrakt
KCl
NaCl
MgCl2
MgSO4
Medien zur Anzucht von A. thaliana
Bodensubstrat
65%
25%
10%
gedämpfte Komposterde
Sand
Lavagrus
1x MS-Medium
0,44%
0,05%
1,5%
0,8%
MSMO
MES
Saccharose
Phytoagar
pH 5,7 (KOH)
5.1.5.3
Medienzusätze
Tabelle 22: Antibiotika zur Selektion transgener Organismen
Name
Abkürzung
Ampicillin
Amp
Chloramphenicol
Chlor
Gentamycin
Gent
Hygromycin
Hyg
Kanamycin
Kan
Rifampicin
Rif
Tetrazyklin
Tet
Endkonzentration
100 µg/ml
50 µg/ml
25 µg/ml
50 µg/ml
100 µg/ml
10 µg/ml
10 µg/ml
Tabelle 23: Chemikalien für A. thaliana Wachstumsexperimente
Name
Abkürzung
1-Aminocyclopropan-1-carbonsäure
ACC
5-Methylthioadenosin
MTA
Nicotianamin
NA
Putrescin
Put
Spermidin
Spd
Spermin
Spm
Endkonzentration
10 µM
500 µM
10 µM
0, 1, 10, 100 µM
0, 1, 10, 100 µM
0, 1, 10, 100 µM
5.1.6
Lösungen
10x Gelelektrophorese-Beladungspuffer
70%
0,25%
0,25%
Glycerin
Bromphenolblau
Xylencyanol
10x TBS-Puffer
0,5 M
Tris-HCl pH 7,5
- 88 -
MATERIAL UND METHODEN
1,5 M
NaCl
3x Trenngelpuffer
1,126 M
0,3%
Tris-HCl pH 8,8
SDS
50x TAE-Puffer
2M
50 mM
Tris-Acetat
EDTA
5x SDS-PAGE Laufpuffer
25 mM
0,1%
192 mM
Tris-HCl pH 7,6
SDS
Glycin
Acrylamid-Stammlösung
30%
0,8%
Acrylamid
Bisacrylamid
Alkalische-Lyse-Puffer I
50 mM
25 mM
10 mM
Glukose
Tris-HCl pH 8,0
EDTA pH 8,0
Alkalische-Lyse-Puffer II
1%
0,2 M
SDS
NaOH
Alkalische-Lyse-Puffer III
3M
NaAc pH 4,8
Blockierungspuffer
50 mM
150 mM
1%
0,1%
Tris-HCl pH 7,5
NaCl
Trockenmilch
Triton X-100
Coomassie-Färbelösung
50%
10%
0,05%
Methanol
Essigsäure
Coomassie Brilliant Blue R-250
DNA-Extraktionspuffer
200 mM
250 mM
25 mM
0,5%
Tris-HCl pH 8,0
HCl
EDTA
SDS
Elutionspuffer für Proteinextraktion
50 mM
300 mM
250 mM
1 mM
NaH2PO4
NaCl
Imidazol
2 PI
pH 8,0
- 89 -
MATERIAL UND METHODEN
Fixierungslösung
4%
10%
10%
Glutaraldehyd 25%
Formaldehyd 37%
Natriumphosphat-Puffer 7,2
GUS-Färbelösung
0,5 mM
0,5 mM
0,1%
10 mM
100 mM
0,5 mg/ml
Kaliumhexacyanoferrat(II)
Kaliumhexacyanoferrat(III)
Triton X-100
EDTA
Natriumphosphatpuffer pH 7,0
X-Gluc
Lysepuffer für Proteinextraktion
50 mM
300 mM
10 mM
1 mM
NaH2PO4
NaCl
Imidazol
2PI
pH 8,0
MaMg-Puffer
400 mM
15 mM
5 mM
Sorbit
MgCl2
MES pH 5,6
MCP 0,5 M Sorbitol
500 mM
1 mM
10 mM
Sorbit
CaCl2
MES pH 5,6 – 6,0
PEG-CMS-Puffer
400 mM
100 mM
40%
Sorbit
Ca(NO3)2
PEG 4000
pH 8,0
Proteaseinhibitor-Mix (2 PI)
100 mM
250 mM
PMSF
p-Aminobenzamidin
gelöst in DMSO
SDS-Probenpuffer
250 mM
40%
0,04%
8%
5%
Tris-HCl pH 6,8
Glycerin
Bromphenolblau
SDS
ß-Mercaptoethanol
SDS-Sammelgelpuffer
0,139 M
0,11%
Tris-HCl pH 6,8
SDS
Sterilisationslösung für Samen
50%
0,05%
Natriumhypochlorit
Tween-20
- 90 -
MATERIAL UND METHODEN
TB-Puffer
10 mM
55 mM
15 mM
250 mM
Pipes
MnCl2
CaCl2
KCl
pH 6,7
TE-Puffer
10 mM
1 mM
Tris-HCl pH 7,5
EDTA
Verdaupuffer
0,03%
0,75%
Pectolyase
Cellulase
gelöst in MCP 0,5 M Sorbit
W5-Puffer
154 mM
125 mM
5 mM
5 mM
1,5 mM
NaCl
CaCl2
Glukose
KCl
MES pH 5,6
Waschpuffer für Proteinextraktion
50 mM
300 mM
40 mM
1 mM
NaH2PO4
NaCl
Imidazol
2PI
pH 8,0
Western-Transfer-Puffer
25 mM
192 mM
0,03%
20%
Tris-HCl pH 7,6
Glyzin
SDS
Methanol
5.1.7
-
Antikörper, Enzyme und Kits
AccQ-Fluor Reagent Kit (Waters GmbH, Eschborn)
Alkaline Phosphatase, Calf Intestinal (New England Biolabs, Frankfurt)
Brilliant III Ultra-Fast SYBR® Green qPCR Master Mix (Agilent, Santa Clara, USA)
Cellulase (Serva-Elektrophoresis, Heidelberg)
Gateway® LR ClonaseTM II Enzym Mix (InvitrogenTM, Darmstadt)
innuPREP Gel Extraction Kit (Analytic Jena AG, Jenna)
Monoklonaler Anti-Poly-Histidin-Peroxidase-Antikörper (Sigma-Aldrich, Schnelldorf)
Nucleobond Plasmidpräperationskit AX 100 (Macherey-Nagel, Düren)
Pectolyase (Sigma-Aldrich, Schnelldorf)
pENTR/D-TOPO Cloning Kit (InvitrogenTM, Darmstadt)
Phire® Hot Start DNA-Polymerase (InvitrogenTM, Darmstadt)
PhusionTM High Fidelity DNA-Polymerase (New England Biolabs, Frankfurt)
QuantiTect Reverse Transcription Kit (Qiagen, Hilden)
Restriktionsenzyme (New England Biolabs, Frankfurt)
- 91 -
MATERIAL UND METHODEN
5.1.8
-
Taq-DNA-Polymerase (New England Biolabs, Frankfurt)
TOPO® Cloning Kit (InvitrogenTM, Darmstadt)
Zero-Blunt®-TOPO®-PCR-Cloning-Kit (Invitrogen™, Darmstadt)
Chemikalien
1-Aminocyclopropan-1-carbonsäure ≥ 98% (TLC) (Sigma-Aldrich, Schnelldorf)
2-(N-Morpholino)ethansulfonsäure (Sigma-Aldrich, Schnelldorf)
2-Keto-4-methylthiobutyrat ≥ 97% (Sigma-Aldrich, Schnelldorf)
5´-Methylthioadenosin (Sigma-Aldrich, Schnelldorf)
6-Aminoquinolyl-N-hydroxysuccinimidyl-carbamat (Waters GmbH, Eschborn)
Acetonitril LC-MS Ultra CHORMASOLV® (Sigma-Aldrich, Schnelldorf)
Acrylamid (Roth, Karlsruhe)
Agar-Agar (Difco Laboratories, Detroit, USA)
Ameisensäure (Biosolve Chimie, Dieuze, Frankreich)
Aminosäuren (Roth, Karlsruhe)
Ammoniumpersulfat (APS) (Sigma-Aldrich, Schnelldorf)
Antibiotika (Roth, Karlsruhe)
Bacto®-Trypton (Difco Laboratories, Detroit, USA)
Bacto®-Yeast Extract (Difco Laboratories, Detroit, USA)
Basta® Herbizid (Bayer Crop Science GmbH, Langenfeld)
Bisacrylamid (Roth, Karlsruhe)
Coomassie Brilliant Blue R-250 (Roth, Karlsruhe)
Dansylchlorid ≥ 99% (HPLC)
Desoxynukleotidtriphosphate (dNTPs) (Fermentas, St. Leon-Roth)
Dimethylsulfoxid (DMSO) (Sigma-Aldrich, Schnelldorf)
HBED Eisenionenchelator (ABCR GmbH, Karlsruhe)
Imidazol (Roth, Karlsruhe)
Isopropyl-ß-D-thiogalaktosid (Roth, Karlsruhe)
LCMS-Wasser (Th.Geyer GmbH & Co. KG, Renningen)
Lumi-Light Western Blotting Substrate (Roche, Mannheim)
MSMO (DUCHEFA, Haarlem, Niederlande)
Natriumhypochlorid (Roth, Karlsruhe)
Nicotianamin (Santa Cruz Biotechnology, Inc., Dallas, USA)
PageRulerTM prestained (Fermentas, St. Leon-Roth)
Phytoagar (DUCHEFA, Haarlem, Niederlande)
Polyethylenglycol (PEG) 4000 (Fluka, Taufkirchen)
Propidiumiodid (Sigma-Aldrich, Schnelldorf)
Putrescin Dihydrochlorid ≥ 98% (TLC) (Sigma-Aldrich, Schnelldorf)
Pyridoxal 5′-phosphat Hydrat ≥ 98% (Sigma-Aldrich, Schnelldorf)
Rinderserumalbumin (New England Biolabs, Frankfurt)
Silwet® (Lehle Seeds, Round Stock, USA)
Spermidin Trihydrochlorid ≥ 99% (AT) (Sigma-Aldrich, Schnelldorf)
Spermin Tetrahydrochlorid ≥ 99% (AT) (Sigma-Aldrich, Schnelldorf)
Technovit 7100 (Heraeus Kulzer, Hanau)
- 92 -
MATERIAL UND METHODEN
-
TEMED (Roth, Karlsruhe)
Toluol ≥ 99,5% (Sigma-Aldrich, Schnelldorf)
Triton X-100 (Serva, Heidelberg)
TRIziol® Reagent (InvitrogenTM, Darmstadt)
UltraPureTM Agarose (InvitrogenTM, Darmstadt)
Waters Eluent A und B (Waters GmbH, Eschborn)
X-Gluc (X-Gluc DIRECT, http://www.x-gluc.com)
5.1.9
-
Verbrauchsmaterialien
ACCQ Tag Ultra C18 Säule, 1.7 µm, 2.1x100 mm (Waters GmbH, Eschborn)
ACQUITY BEH Amide, 1,7 µm, 2,1x100 mm (Waters GmbH, Eschborn)
ACQUITY UPLC BEH C18 Säule 1,7 µm, 2,1x50 mm (Waters GmbH, Eschborn)
ACQUITY UPLC BEH C18 VanGuard, 1,7 µm, 2,1x100 mm (Waters GmbH, Eschborn)
ACQUITY UPLC HSS T3 Säule 1,8 µm, 2,1x150 mm (Waters GmbH, Eschborn)
HisTrap FF Crude Säule 5ml (GE Healthcare, München)
Leukopor® Klebeband (BSN medical, Hamburg)
Multiscreen 10 KD Platten (Merck, Darmstadt)
Nitrocellulosemembran Amersham HybondTMECTM, 0,45 µm (GE Healthcare, München)
PD-10 Einwegsäule zur Entsalzung (GE Healthcare, München)
Nicht speziell genannte Chemikalien und Verbrauchsmaterialien wurden von Roth (Karlsruhe)
oder Sigma-Aldrich (Schnelldorf) bezogen. Verbrauchswaren aus Plastik wurden von Sarstedt
(Nümbrecht) bezogen.
5.1.10
-
Geräte
ACQUITY UPLC H-Class (Waters GmbH, Eschborn)
Agilent UPLC 1290 + Agilent triple Quad MS 6490 (Agilent, Santa Clara, USA)
Äkta purifier (GE Healthcare, München)
Digitalkamera Sony Alpha 200 (Sony, Tokio, Japan)
Entwicklermaschine Optimax (Protec Medizintechnik, Oberstenfeld)
Epifluoreszenzmikroskop Axioskop (Zeiss, Göttingen)
Fluoreszenz-Stereomikroskop MZFLIII (Leica Microsystems, Bensheim)
Homogenisator TissueLyser (Qiagen, Hilden)
iCAP 6500 dual OES spectrometer (Thermo Fischer Scientific, Waltham, USA)
Konfokales Laser Scanning Mikroskop Leica TCS SP5 (Leica Microsystems, Manheim)
Kühlzentrifuge Avanti J-25 (Beckman Instruments, Palo Alto, USA)
Megafuge 1.0 (Heraeus, Heroldsberg)
Mikrotom Leica RM 2135 (Leica Microsystems, Manheim)
Real Time Cycler Rotor Gene Q (Qiagen, Hilden)
Sonicator (B. Braun, Melsungen)
Vakuumkonzentrator Concentrator 5301 (Eppendorf, Hamburg)
Xevo TQ Massenspektrometer (Waters GmbH, Eschborn)
- 93 -
MATERIAL UND METHODEN
Neben den aufgeführten Geräten wurde die Standardausstattung molekularbiologischer
Laboratorien benutzt.
5.1.11
-
Software
Adobe Acrobat Reader XI (Adobe Systems, San Jose/USA)
Adobe Photoshop CS6 (Adobe Systems, San Jose/USA)
Cell^D 2.7 (Olympus Soft Imaging Solutions GmbH, Münster)
EndNote X7 (Thomson, Carlsbad/USA)
Leica Application Suite Advanced Fluorescence 2.4.1 (Leica Microsystems, Manheim)
Mass Hunter B.04.00
Microsoft Office 2013 (Microsoft Corporation, Redmond/USA)
Rotor-Gene 2.0.2.4 (Qiagen, Hilden)
TargetLynx V4.1 SNC 904
Unicorn 5.11
Vektor NTI Advanced 9.1 (InforMax, Frederick/USA)
5.2
Methoden
5.2.1
Methoden zur Anzucht von Lebewesen
5.2.1.1
Anzucht von Bakterien
E. coli bzw. A. tumefaciens wurde bei 37°C bzw. 29°C in flüssigem LB-Medium oder auf LBAgarplatten mit entsprechenden Antibiotika angezogen.
5.2.1.2
Anzucht von A. thaliana unter Standardbedingungen
Anzucht auf Erde
Eine kleine Spatelspitze Samen wurde in einen Topf mit feuchtem Bodensubstrat gegeben. Die
Samen wurden 3 Tage lang im Dunkeln bei 4°C stratifiziert. Die Keimung der Samen erfolgte
bei Kurztagbedingungen (22°C, 60% Luftfeuchtigkeit, 8 h Licht). Junge Pflanzen wurden in
neue Töpfe vereinzelt. Das weitere Wachstum der Pflanzen erfolgte bei Langtagbedingungen
(22°C, 60% Luftfeuchtigkeit, 16 h Licht).
Flüssigsterilisierung von Samen
In ein 1,5 ml Reaktionsgefäß wurde eine kleine Spatelspitze Samen gegeben. Der
natriumhypochloridhaltige Haushaltsreiniger DanKlorix wurde 1:1 mit Wasser gemischt und 5
µl Tween-20 zugegeben. Anschließend wurde 1 ml dieser Mischung auf die Samen pipettiert
und diese 4 min gevortext. Die Samen wurden durch Zentrifugation bei 14.000 rpm pelletiert
und 4 x mit sterilem Wasser gewaschen. Zum Schluss wurden die Samen in 1 ml 0,1% Agarose
aufgenommen und im Dunklen bei 4°C stratifiziert.
Anzucht auf MS-Platten
Flüssigsterilisierte Samen wurden unter der Sterilbank mit Hilfe einer Pipette auf den Platten
ausgebracht. Zur Anordnung der Samen wurde eine Schablone verwendet. Die MS-Platten
- 94 -
MATERIAL UND METHODEN
wurden mit Leukopor-Klebeband verschlossen. Die Anzucht der Pflanzen erfolgte unter
Langtagbedingungen.
5.2.2
Allgemeine molekularbiologische Methoden
Falls nicht anders angegeben wurden die Methoden nach den Angaben der Hersteller oder
nach Anleitung aus dem Buch „Molecular Cloning: A Laboratory Manual“ (Sambrook und
Russell, 2001) durchgeführt.
5.2.2.1
Herstellung kompetenter E. coli Zellen
Kompetente E. coli-Zellen wurden mittels SEM-Methode hergestellt (Inoue et al., 1990). Die E.
coli-Zellen wurden in 250 ml SOB-Medium bei 18°C bis zu einer oD600 von 0,6 inkubiert. Die
Zellsuspension wurde 10 min auf Eis gekühlt und anschließend bei 4°C mit 2500 x g für 10 min
zentrifugiert. Das resultierende Pellet wurde 10 min mit 80 ml kaltem TB-Puffer gewaschen und
anschließend erneut zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und das gewaschene Pellet
vorsichtig mit 20 ml kaltem TB-Puffer gelöst. Zu dieser Zellsuspension wurden 7% DMSO
zugesetzt. Nach 10 minütiger Inkubation auf Eis wurde die Zellsuspension aliquotiert. Die
Aliquots (100 µl) wurden in flüssigem Stickstoff eingefroren und bei -20°C gelagert.
5.2.2.2
Herstellung kompetenter A. tumefaciens Zellen
Kompetente A. tumefaciens-Zellen wurden nach einem Protokoll von Höfgen und Willmitzer
(1988) hergestellt. 100 ml LB-Medium mit entsprechenden Antibiotika wurden mit 100 µl A.
tumefaciens angeimpft. Die Zellen wurden bei 29°C bis zu einer oD600 von 0,5 – 1,0 angezogen
und anschließend mit 2500 x g für 10 min bei 4°C zentrifugiert. Das resultierende Pellet wurde
mit 200 ml kühlem TE-Puffer (pH 7,5) gewaschen und erneut zentrifugiert. Das gewaschene
Pellet wurde mit 20 ml LB-Medium gelöst und aliquotiert. Die Aliquots (500 µl) wurden in
flüssigem Stickstoff eingefroren und bei -20°C gelagert.
5.2.2.3
Transformation von E. coli
Ein Aliquot chemisch kompetenter E. coli-Zellen wurde auf Eis aufgetaut und bis zu 10 µl der
zu transformierende Plasmid-DNA zugegeben. Nach 30 minütiger Inkubation auf Eis wurde der
Ansatz 45 s lang auf 42°C erhitzt und 800 µl LB-Medium zugegeben. Anschließend wurde der
Ansatz 1 h im Heizblock bei 37°C und 800 rpm geschüttelt. Die Zellsuspension wurde bei
14.000 rpm pelletiert und der Überstand bis auf ca. 100 µl abgenommen. Die Zellen wurden in
den verbleibenden 100 µl LB-Medium resuspendiert und auf LB-Platten mit entsprechenden
Antibiotika ausplattiert.
5.2.2.4
Transformation von A. tumefaciens
Ein Aliquot chemisch kompetenter A. tumefaciens Zellen wurde auf Eis aufgetaut und 1,0 – 5,0
µg Plasmid-DNA zugegeben. Nach 5 minütiger Inkubation auf Eis wurde der Ansatz 5 min lang
in flüssigem Stickstoff eingefroren. Anschließend wurden die tiefgefrorenen Zellen 5 min lang
auf dem Heizblock bei 37°C inkubiert. Nach Zugabe von 1 ml LB-Medium wurde der Ansatz 4
Stunden lang bei 29°C geschüttelt. Die Zellsuspension wurde mit 14.000 rpm zentrifugiert und
- 95 -
MATERIAL UND METHODEN
der Überstand bis auf 100 µl abgenommen. Die Zellen wurden in den verbleibenden 100 µl LBMedium resuspendiert und auf LB-Platten mit entsprechenden Antibiotika ausplattiert.
5.2.2.5
Herstellung von Dauerkulturen
In einem 2 ml Schraubdeckelröhrchen wurden 300 µl einer frischen Bakterienkultur mit 300 µl
sterilem 70% Glycerin gemischt. Die Mischung wurde kurz gevortext und anschließend in
flüssigem Stickstoff eingefroren. Die Dauerkulturen wurden bei -70°C gelagert.
5.2.2.6
Extraktion von Plasmid-DNA
Zur Extraktion kleinerer Mengen Plasmid-DNA wurde eine modifizierte alkalische Lyse nach
(Sambrook und Russell, 2001) benutzt. 1,5 ml einer Übernachtkultur wurden durch 1-minütige
Zentrifugation bei 14.000 rpm pelletiert und mit 300 µl Alkalischer-Lyse-Puffer I versetzt. Nach
5-minütiger Inkubation bei Raumtemperatur wurden 300 µl Alkalischer-Lyse-Puffer II
zugegeben und durch Invertieren gemischt. Nach 5-minütiger Inkubation wurden 300 µl
Alkalischer-Lyse-Puffer III zugegeben und durch Invertieren gemischt. Nach erneuter, 5minütiger Inkubation wurde die Mischung für 5 min bei 14.000 rpm zentrifugiert und der
Überstand in ein neues Reaktionsgefäß überführt. Die Plasmid-DNA wurde durch Zugabe von
600 µl Isopropanol gefällt und durch 5-minütige Zentrifugation bei 14.000 rpm pelletiert. Das
Pellet wurde mit 500 µl 70% Ethanol gewaschen, getrocknet und in 50 µl Wasser resuspendiert.
Zur Extraktion größerer Mengen Plasmid-DNA wurde das „NucleoBond® Xtra“ Midi-Kit nach
Angaben des Herstellers benutzt.
5.2.2.7
Amplifizierung von DNA durch Polymerasekettenreaktion
Zur Amplifizierung fehlerfreier DNA-Sequenzen für die Klonierung von Expressionsvektoren
wurde die PhusionTM-DNA-Polymerase verwendet. Für die Überprüfung von
Klonierungsschritten, Colony-PCR oder die Genotypisierung von Pflanzen wurde die Taq-DNAPolymerase oder die Phire®-DNA-Polymerase verwendet. Tabelle 23 zeigt typische PCRProtokolle für die jeweilige Polymerase.
Tabelle 23: Typische PCR-Protokolle
Taq-DNA-Polymerase
Phire®-DNA-Polymerase
Temperatur Zeit
Temperatur Zeit
95°C
5 min
98°C
2 min
95°C
30 s
98°C
5s
60°C
30 s
63°C
5s
68°C
30 s/1000 bp
72°C
10 s/1000 bp
68°C
5 min
72°C
1 min
10°C
∞
10°C
∞
35 – 40 PCR Zyklen
5.2.2.8
PhusionTM-DNA-Polymerase
Temperatur Zeit
98°C
30 s
98°C
10 s
63°C
30 s
72°C
30 s/1000 bp
72°C
5 min
10°C
∞
Extraktion von DNA aus Agarosegelen
Die Isolierung und Aufreinigung von DNA aus Agarosegelen wurde mit Hilfe des „innuPREP
Gel Extraction Kits“ nach Angaben des Herstellers durchgeführt.
- 96 -
MATERIAL UND METHODEN
5.2.2.9
Extraktion von genomischer DNA aus A. thaliana
Ein kleines Rosettenblatt wurde mit flüssigem Stickstoff tiefgefroren und mit Hilfe eines
Homogenisators pulverisiert. Nach Zugabe von 400 µl DNA-Extraktionspuffer wurde die
Mischung gevortext und 10 min mit 14.000 rpm zentrifugiert. Der wässrige Überstand wurde in
ein neues Reaktionsgefäß überführt, mit 10 µl RNAse (10 mg/ml) versetzt und 5 min bei 37°C
inkubiert. Die DNA wurde durch Zugabe von 300 µl Isopropanol und anschließendem Vortexen
gefällt. Die genomische DNA wurde durch 5-minütige Zentrifugation bei 14.000 rpm pelletiert.
Das resultierende Pellet wurde mit 500 µl kaltem 70% Ethanol gewaschen und anschließend
getrocknet. Die pelletierte DNA wurde mit 50 µl Wasser versetzt und 10 min bei 50°C inkubiert.
Nach 5-minütiger Zentrifugation mit 14.000 rpm wird der wässrige Überstand in ein neues
Reaktionsgefäß überführt und bei -20°C gelagert.
5.2.2.10
Extraktion von RNA aus A. thaliana mittels TRIzol® -Methode
Pflanzengewebe wurde mit flüssigem Stickstoff tiefgefroren und mit Hilfe eines
Homogenisators pulverisiert. 20 mg pulverisiertes Pflanzengewebe wurden mit 1 ml TRIzol®
Reagenz und 200 µl Chloroform gemischt. Die Mischung wurde 2 min gevortext und
anschließend 15 min bei Raumtemperatur inkubiert. Nach Zentrifugation bei 4°C mit 4000 x g
wurde der wässrige Überstand in ein neues Reaktionsgefäß überführt. Hierzu wurden 500 µl
Chlorform gegeben und gevortext. Nach erneutem Zentrifugieren bei 4°C mit 4000 x g wurde
der wässrige Überstand in ein neues Reaktionsgefäß überführt. Dieser wurde mit dem gleichen
Volumen Isopropanol versetzt, gevortext und bei 4°C 20 min bei 14.000 rpm zentrifugiert. Die
pelletierte RNA wurde mit 500 µl kaltem 70% Ethanol gewaschen und getrocknet. Die
pelletierte RNA wurde in 50 µl Wasser aufgenommen und bei -20°C aufbewahrt.
5.2.2.11
Synthese von cDNA
Die Synthese von cDNA erfolgte mit Hilfe des „QuantiTect Reverse Transcription Kit“ nach
Angaben des Herstellers. Für die reverse Transkriptasereaktion wurde jeweils 1 µg RNA
eingesetzt. Die synthetisierte cDNA wurde 1:5 mit Wasser verdünnt und bei 4°C aufbewahrt.
5.2.2.12
Quantitative RT-PCR
Das Design der qRT-PCR-Primer erfolgte mit Hilfe von „QuantPrime“ (Arvidsson et al., 2008).
Die Spezifität der Primerpaare wurde durch die Visualisierung amplifizierter PCR-Produkte auf
Agarosegelen überprüft. Als internes Referenzgen wurde UBQ10 benutzt. Die Expression von
UBQ10 bleibt im Laufe der Entwicklung stabil (Czechowski et al., 2005). Für alle Messungen
wurden ein „Rotor-Gene Q cycler“ und der „Brilliant III Ultra Fast SYBR Green QPCR Master
Mix“ benutzt. Die cDNA Proben wurden jeweils in Triplets analysiert. Die Auswertung der Daten
erfolgte mittels der ∆∆Cq Methode.
5.2.2.13
Stabile Transformation von A. thaliana
Arabidopsis thaliana wurde mit Hilfe der „floral dip“-Methode stabil transformiert (Clough und
Bent, 1998). Dazu wurden die transgenen A. tumefaciens-Bakterien in 250 ml LB-Medium mit
den entsprechenden Antibiotika über Nacht zu einer dicht gewachsenen Kultur herangezogen.
- 97 -
MATERIAL UND METHODEN
Diese Kultur wurde mit 7,5 g Saccharose und 100 µl Silwet versetzt. Die Blüten von A. thaliana
wurden für 2 min in dieses Gemisch getaucht und anschließend in Frischhaltefolie eingewickelt.
Die Pflanzen wurden am nächsten Tag wieder aus der Frischhaltefolie ausgepackt und normal
weiter kultiviert. Die Samen wurden geerntet und selektioniert.
5.2.2.14
Transiente Transformation von Arabidopsis-Mesophyllprotoplasten
Die Isolierung und Transformation von Arabidopsis-Mesophyllprotoplasten erfolgte wie bereits
beschrieben (Abel und Theologis, 1994; Drechsel et al., 2011). Alle Konstrukte wurden
zusammen mit pCaMV35S::CaM2-mCherry als cytoplasmatisches Kontrollkonstrukt (Fischer
et al., 2013) transformiert.
5.2.3
Mikroskopie und Histologie
5.2.3.1
GUS-Färbung
Das zu färbende Pflanzengewebe wurde mit der GUS-Färbelösung vakuuminfiltriert bis keine
Luftblasen mehr aufstiegen und bei 37°C für 1 – 24 Stunden inkubiert. Die Reaktion wurde
gestoppt sobald eine deutliche Blaufärbung zu erkennen war. Die Färbelösung wurde durch
70% Ethanol ersetzt und das Pflanzengewebe weiter bei 37°C inkubiert bis das Chlorophyll
vollständig zerstört war.
5.2.3.2
Histologische Schnitte
Zur Herstellung von Wurzel- und Blattquerschnitten wurde das Gewebe in Technovit 7100 nach
Angaben des Herstellers eingebettet. Für Wurzelquerschnitte wurden die Wurzeln mit Hilfe der
„Plättchen“-Methode in die richtige Orientierung gebracht (Scheres et al., 1994). Ausgehärtete
Technovit-Blöcke wurden auf kleine Holzklötze geklebt. Mit Hilfe eines „Leica RM 2135“Mikrotoms wurden 25 µm dicke Schnitte angefertigt. Zur Herstellung von Stängelquerschnitten
wurden die Stängel mit einem Styroporblock fixiert und per Hand mit einer Rasierklinge
möglichst dünn abgeschnitten.
5.2.3.3
Propidiumiodidfärbung
Das Pflanzenmaterial wurde für 1 min in eine 1 mg/ml Propidiumiodid-Färbelösung gelegt und
anschließend mit Wasser gewaschen.
5.2.3.4
Konfokal- und Lichtmikroskopie
Alle konfokalen Aufnahmen wurden an einem „Leica TCS SP5“-Mikroskop angefertigt. Die
Fluorophore wurden mit Hilfe eines Argonlasers bei 488 nm (GFP) bzw. 561 nm (mCherry)
angeregt. Die Fluoreszenzdetektion erfolgte bei 495-545 nm (GFP), 575-600 nm (mCherry)
bzw. 675-700 nm (Chlorophyll, Propidiumiodid). Lichtmikroskopische Aufnahmen wurden an
einem „Zeiss Axioskop HBO 50“-Mikroskop oder an einem „Leica MZFLIII“-FluoreszenzStereomikroskop angefertigt.
- 98 -
MATERIAL UND METHODEN
5.2.4
Schwefelmangelexperimente
5.2.4.1
Schwefelmangelexperimente auf ½MS-Platten
Die Zusammensetzung des ½MS Mediums diente als Basis für das Schwefelmangelmedium.
Um Medien mit verschiedenen Sulfatkonzentrationen herzustellen wurden alle Sulfatsalze
durch Chloridsalze ersetzt und das schwefelhaltige Vitamin Thiamin weggelassen. Zur
Herstellung von FeEDTA wurde FeSO4 verwendet, wodurch das Medium 50 µM Sulfat enthielt.
½MS-Platten mit 50 µM Sulfat
 Mikroelemente
0,055 µM CoCl2, 0,050 µM CuCl2, 50 µM FeEDTA, 50,14 µM H3BO3, 2,5 µM KI, 50 µM
MnCl2, 0,52 µM Na2MoO4, 14,96 µM ZnCl2
 Makroelemente
1,5 mM CaCl2, 0,625 mM KH2PO4, 9,4 mM KNO3, 0,75 mM MgCl2, 10,31 mM NH4NO3
 Vitamine
277,47 µM myo-Inosit, 2,03 µM Nicotinsäure, 1,22 µM Pyridoxin HCl
 Weitere Zusätze
13,32 µM Glyzin, 0,05% MES, 1,5% Saccharose
Durch Zugabe von MgSO4 wurde das Medium auf die gewünschte Sulfatkonzentration
eingestellt. Der pH-Wert wurde mit KOH auf 5,7 eingestellt und das Medium mit 0,8%
UltraPure®-Agarose verfestigt. Chemische Zusätze wurden sterilfiltriert und nach dem
Autoklavieren dem Medium zugesetzt.
5.2.4.2
Schwefelmangelexperimente im hydroponischen System
Die Zusammensetzung des Hoagland Mediums (Hoagland und Arnon, 1938) diente als Basis
für das Schwefelmangelmedium. Um Medien mit verschiedenen Sulfatkonzentrationen
herzustellen wurden alle Sulfatsalze durch Chloridsalze ersetzt.
Hoagland Medium ohne Sulfat
 Mikroelemente
0,032 µM CuCl2, 5 µM Fe-HBED, 4,62 µM H3BO3, 0,92 µM MnCl2, 0,011 µM MoO3,
0,076 µM ZnCl2
 Makroelemente
400 µM Ca(NO3)2, 88 µM (NH4)2HPO4, 600 µM KNO3, 200 µM MgCl2
 Zusätze
0,05% MES
Durch Zugabe von MgSO4 wurde das Medium auf die gewünschte Sulfatkonzentration
eingestellt. Der pH-Wert wurde mit KOH auf 5,7 eingestellt.
Hydroponische Pflanzenanzucht
PCR-Gefäße ohne Deckel wurden in einen leeren Spitzenkasteneinsatz (200 µl Spitzen)
gesteckt. Hoagland Medium ohne Sulfat wurde mit 0,5% Phytoagar autoklaviert und 300 µl des
- 99 -
MATERIAL UND METHODEN
warmen Hoagland Mediums in jedes PCR-Gefäß pipettiert. Nach Aushärtung des Mediums
wurde jedes PCR-Gefäß ca. 2 mm über dem Boden mit einer Rasierklinge aufgeschnitten. Der
Spitzenkasten wurde bis zum Rand mit Hoagland Medium mit definierter Sulfatkonzentration
befüllt und anschließend der Spitzenkasteneinsatz mit den befüllten PCR-Gefäßen darauf
gedrückt. Flüssigsterilisierte, stratifizierte Samen wurden nun einzeln mit Hilfe einer Pipette auf
die befüllten PCR-Gefäße ausgebracht. Der Spitzenkasten wurde mit einem durchsichtigen
Deckel geschlossen. Die Keimung der Samen erfolgte bei Kurztagbedingungen (22°C, 60%
Luftfeuchtigkeit, 8 h Licht). Nach 12 Tagen wurde der Deckel des Spitzenkastens ca. 2 cm
weiter geöffnet damit sich die Pflanzen langsam an eine niedrigere Luftfeuchtigkeit gewöhnen
und eine Kutikula ausbilden konnten. Nach 14 Tagen wurden die Pflanzen vom Spitzenkasten
in 50 ml Röhrchen überführt. In die Deckel der 50 ml Röhrchen wurde ein Loch gebohrt, das
PCR-Gefäß mit der Pflanze hineingesteckt und das Röhrchen mit Hoagland Medium mit
definierter Sulfatkonzentration befüllt. Die weitere Anzucht erfolgte bei Langtagbedingungen
(22°C, 60% Luftfeuchtigkeit, 16 h Licht). Um das Wachstum von Algen zu verhindern wurde
das Medium Dunkel gehalten und wöchentlich erneuert.
5.2.4.3
Chemische Komplementation
Zur chemischen Komplementation mit Polyaminen wurden Pflanzen der Genotypen mti1-1,
Ws, dep1-1 und Col in Hoagland Medium mit 10 µM Sulfat angezogen. Ab dem Zeitpunkt der
Blühinduktion wurde dem Hoagland Medium 0, 1 oder 10 µm Putrescin, Spermidin oder
Spermin zugegeben. Zur chemischen Komplementation mit ACC bzw. NA wurden Pflanzen
der Genotypen mti1-1, Ws, dep1-1 und Col auf ½MS-Platten mit 50 µM Sulfat angezogen. Dem
Medium wurde 0 oder 10 µM ACC bzw. Nicotianamin zugesetzt.
5.2.5
Metabolitenanalytik
5.2.5.1
Elementanalysen mittels ICP-OES
40 mg getrocknetes Pflanzenmaterial wurden in PTFE Röhrchen eingewogen und mit HNO3 in
einem Mikrowellenaufschlussgerät extrahiert. Die Elementanalyse wurde mit einem ICP-OES
Gerät durchgeführt. Zur Kalibrierung der Messung wurde das „Standard Reference Material
1515 Apple Leaves“ (National Institute of Standards and Technology) verwendet.
5.2.5.2
Aminosäuremessungen mittels UPLC
Aminosäuren wurden mit 1 ml 80% Ethanol aus 100 mg gefrorenem Pflanzenpulver für 1 h bei
80°C extrahiert. Der Extrakt wurde zentrifugiert und 800 µl des Überstandes mittels eines
Vakuumkonzentrators eingedampft. Das resultierende Pellet wurde mit 600 µl HPLC-H2O
aufgenommen. Die Lösung wurde 5 min bei 14.000 rpm zentrifugiert und anschließend mit
Multiscreen 10 KD Platten 90 min bei 4°C und 5000 rpm filtriert. Für die Messung wurden die
Proben und Aminosäurestandards mit dem Fluorophor AQC derivatisiert. 3 mg AQC wurden in
1 ml Acetonitril gelöst und genau 10 min bei 55°C inkubiert. 10 µl der Proben bzw.
Aminosäurestandards wurden mit 10 µl AQC-Lösung und 80 µl 0,2 M Borsäure (pH 8,8)
gemischt. Für die Messung wurde eine „ACQUITY H-Class“-UPLC (Waters GmbH, Eschborn)
verwendet. Die Trennung erfolgte auf einer „C18 reversed phase“-Säule mit einer Flussrate
- 100 -
MATERIAL UND METHODEN
von 0,7 ml/min für insgesamt 10,2 min. Die Säule wurde während der Messung auf 50°C
temperiert. Die Anregung und Detektion von AQC erfolgte bei 266 bzw. 473 nm. Der
Lösungsmittelgradient wurde mit Lösung A, B, C und D erzeugt. Lösung A enthielt 100%
Waters Eluent A, Lösung B enthielt 90% HPLC-H2O + 10% Waters Eluent B, Lösung C enthielt
100% Waters Eluent B, Lösung D enthielt 100% HPLC-H2O. Die Säule wurde 30 min mit 10%
Lösung A + 90% Lösung C äquilibriert. Der Gradient lautete wie folgt: 0 – 0,29 min: 9,9% A +
90,1% C, 0,29 – 5,49 min: 9,0% A + 80% B + 11% C, 5,49 – 7,3 min: 8% A + 15,6% B + 57,9
% C + 18,5 % D, 7,3 – 7,69 min: 7,8% A + 70,9% C + 21,3% D, 7,69 – 7,99 min: 4% A + 36,3%
C + 59,7 D, 7,99 – 10,2 min: 10% A + 90% C. Um sicher zu stellen, dass für die jeweilige
Substanz der richtige Peak identifiziert wurde, wurden einzelne Proben mit der jeweiligen
Substanz versetzt und unter denselben Bedingungen erneut gemessen.
5.2.5.3
Schwefelmetabolitenmessungen mittels UPLC-LC-MS/MS
Zur Stabilisierung der Schwefelmetaboliten wurden 100 mg frisch gemörsertes Pflanzenpulver
unverzüglich mit 300 µl einer 45/45/10%igen Acetonitril-/Wasser-/Ameisensäurelösung
versetzt, gründlich gemischt und in flüssigem Stickstoff eingefroren. Die Lagerung der Proben
erfolgte bei -80°C. Der Probenaufschluss erfolgte bei 4°C. Die Proben wurden 5 min mit
Ultraschall behandelt und anschließend 15 min gevortext. Nach 10-minütiger Zentrifugation bei
14.000 rpm wurde der Überstand in ein neues Reaktionsgefäß transferiert. Die Extraktion des
Gewebes wurde mit einer 1%igen Ameisensäurelösung wiederholt. Die Proben wurden 5 min
mit Ultraschall behandelt und 15 min gevortext. Anschließend wurde erneut 0,5 ml der 1%igen
Ameisensäurelösung zugegeben und 5 min gevortext. Nach 10-minütiger Zentrifugation bei
14.000 rpm wurde der Überstand in ein neues Reaktionsgefäß transferiert. Die Überstände der
beiden Extraktionen wurden vereint und mit einem 0,45 µm PVDF-Filter gefiltert. 100 µl der
Probenlösung wurden mit 20 µl internem Standard und 80 µl einer 94,5/94,5/1%igen Acetonitril/Wasser-/Ameisensäurelösung gemischt. Der interne Standard enthielt 500 ng/ml 13C-MET. 10
µl dieser Mischung wurden in eine „ACQUITY H-Class“-UPLC (Waters GmbH, Eschborn),
gekoppelt mit einem „Xevo TQ“-Massenspektrometer (Waters GmbH, Eschborn), injiziert. Die
Trennung erfolgte auf einer „ACQUITY UPLC BEH Amid“-Säule (2,1 x 100 mm, 1,7 µm) mit
einer Flussrate von 0,4 ml/min. Eine „VanGuard BEH Amid“-Säule (2,1 x 100 mm, 1,7 µm)
wurde als Vorsäule benutzt. Beide Säulen wurden auf 40°C temperiert. Als mobile Phasen
wurden Lösung A (H2O + 0,1% Ameisensäure) und Lösung B (Acetonitril + 0,1%
Ameisensäure) benutzt. Der Gradient lautete wie folgt: Lösung A, 15% in 0 – 1,0 min; 15 – 50
% in 1,0 – 7,0 min; 50 – 99 % in 7,5 – 8,5 min; 99 – 15% in 8,5 – 9,0 min; 15 % in 9,0 – 11,0
min. Das „Xevo TQ“-Massenspektrometer wurde im ESI+ Modus betrieben. Die folgenden
Einstellungen wurden benutzt: Kegel- bzw. Desolvatisierungsgas = 20 bzw. 1000 l/h, Quellbzw. Desolvatisierungstemperatur = 150 bzw. 650°C, Kollisionsenergie = 5 und 50 eV. Die
„TargetLynx V4.1 SCN 904“-Software wurde zur Auswertung verwendet. Die Quantifizierung
erfolgte über die Kurvenfläche des Ausgangsions.
5.2.5.4
Nicotianaminmessungen mittels UPLC-LC-MS/MS
Nicotianamin wurde mit 1 ml 80% Ethanol aus 100 mg gefrorenem Pflanzenpulver für 1 h bei
80°C extrahiert. Der Extrakt wurde zentrifugiert und 800 µl des Überstandes mittels eines
- 101 -
MATERIAL UND METHODEN
Vakuumkonzentrators eingedampft. Das resultierende Pellet wurde in 600 µl HPLC-H2O
aufgenommen. Die Lösung wurde 5 min bei 14.000 rpm zentrifugiert und anschließend mit
Multiscreen 10 KD Platten 90 min bei 4°C und 5000 rpm filtriert. Zur Trennung und Detektion
von Nicotianamin wurde ein „Agilent triple Quad MS 6490“-Massenspektrometer eingesetzt. 10
µl der Probe wurden auf einer „UPLC HSS T3“-Säule mit einer Flussrate von 0,4 ml/min
aufgetrennt. Als Lösungsmittel wurden Wasser (A) und Acetonitril (B) benutzt. Beide
Lösungsmittel wurden mit 0,1 % Ameisensäure versetzt. Der benutzte Lösungsmittelgradient
(A:B) lautete: 0 – 0,5 min 99,9:0,1%, 0,5 – 3,1 min 95:5%, 3,1 – 4,5 min 30:70% und 4,5-5 min
99,9:0,1%. Das Massenspektrometer wurde im ESI V+ und „multiple reactions monitoring“
Modus betrieben. Die folgenden Einstellungen wurden benutzt: Stickstoffgasfluss = 12 l/min,
Ionensprühspannung = 3000 V, Hilfsgastemperatur = 300°C. Jeder Übergang hatte eine
Verbleibzeit von 20 ms. Um den Nicotianamin-Peak exakt bestimmen zu können und um
Proben-Matrix-Effekte auszuschließen, wurden verschiedene Proben mit reinstem
Nicotianamin versetzt und unter gleichen Bedingungen gemessen. Die Quantifizierung erfolgte
anhand der rekonstruierten Ionenspuren der protonierten Ionen mit Hilfe des Mass Hunters
(Version B.04.00).
5.2.5.5
Polyaminmessungen mittels UPLC
Polyamine wurden extrahiert (Minocha et al., 1994), dansyliert (Minocha et al., 1990) und
mittels UPLC gemessen. Polyamine wurden auf einer „BEH C18“-Säule (1,7 µm, 2,1x50 mm)
mit einer Flussrate von 0,4 ml/min für 4,5 min aufgetrennt. Die Säulentemperatur betrug 40°C.
Als Lösungsmittel wurden H2O (A) und Acetonitril (B) benutzt. Der benutzte
Lösungsmittelgradient lautete (A:B): 0 – 0,06 min 10:90%, 0,06 – 1,7 min 42:58%, 1,7 – 3,17
min 100:0%, 3,17 – 3,29 min 42:58%, 3,29 – 4,5 min 10:90%. Die Detektion erfolgte bei 254
oder 360 nm.
5.2.5.6
Messungen der Anthocyankonzentration
Pflanzengewebe wurde in flüssigem Stickstoff eingefroren und mit Hilfe eines Homogenisators
pulverisiert. 100 mg Pflanzenpulver wurde mit einen Puffer aus 45% Methanol und 5%
Essigsäure extrahiert. Nach 5-minütiger Extraktion und anschließender Zentrifugation bei
14.000 rpm wurde der wässrige Überstand in ein neues Reaktionsgefäß überführt. Die relative
Anthocyankonzentration wurde mittels einer Absorptionsmethode (Matsui et al., 2004)
bestimmt.
5.2.6
Proteinchemische Methoden
5.2.6.1
Herstellung von Proteinen in E. coli
Zur Synthese von Proteinen, wurden die für die Proteine kodierenden DNA-Sequenzen mit
Hilfe des IPTG induzierbare Expressionsvektors pET-15b in E. coli exprimiert. Transgene E.
coli Rosetta2/pLysS Zellen wurden in 250 ml SOB Medium bei 37°C bis zu einer oD600 von 0,6
angezogen und die Expression durch Zugabe von 0,1 mM IPTG induziert. Die Zellsuspension
wurde über Nacht bei 18°C inkubiert.
- 102 -
MATERIAL UND METHODEN
5.2.6.2
Extraktion löslicher Proteine
Die IPTG induzierten Zellen (siehe 5.2.6.1) wurden durch Zentrifugation bei 4°C und 10000
rpm geerntet. Das resultierende Pellet wurde in 5 ml Proteinextraktionspuffer gelöst und die
Zellen mit Ultraschall aufgeschlossen. Dazu wurden die Zellen 3x 30 s mit 400 W Ultraschall
behandelt und zwischendurch auf Eis gekühlt. Durch Zentrifugation mit 75.000 x g wurde die
lösliche Proteinfraktion isoliert. Alle Arbeitsschritte erfolgten bei 4°C.
5.2.6.3
Aufreinigung von Proteinen
5 ml der löslichen Fraktion wurden in einen „Äkta Purifier“ injiziert. Die Reinigung der 6xHisTag-Proteine erfolgte über eine 5 ml „HisTrap FF crude“-Säule. Nach Bindung der Proteine an
die Säule, wurde die Säule wiederholt mit einem Waschpuffer mit 40 mM Imidazol gewaschen.
Die Proteine wurden mit einem Elutionspuffer mit 250 mM Imidazol von der Säule eluiert und
fraktioniert. Die Fraktionen, die das gewünschte Protein enthielten, wurden mittels SDS-PAGE
und Westernblot identifiziert. Die gewünschten Fraktionen wurden vereint und mittels einer PD10 Einwegsäule in Natriumphosphatpuffer pH 7,0 umgepuffert. Die Bestimmung der
Proteinkonzentration erfolgte mittels Bradford-Assay (Bradford, 1976).
5.2.6.4
Immunologische Nachweise mittels Westernblot
Proteine wurden über SDS-PAGE nach Standardprotokoll (Laemmli, 1970) aufgetrennt und
mittels Westernblot auf eine Nitrocellulosemembran übertragen (Towbin et al., 1979). Der
Westernblot wurde für 25 min bei 400 mA durchgeführt und die Nitrocellulosemembran im
Anschluss mit Blocking-Puffer gesättigt. Die Membran wurde über Nacht mit dem
monoklonalen anti-His-POD-Antikörper inkubiert (1:2000 in Blocking-Puffer). Zur Detektion der
POD-Aktivität wurde die Nitrocellulosemembran mit dem „LumiLight“ Westernblotsubstrat
inkubiert und die POD-Aktivität durch Auflegen und Entwickeln eines Fotofilms sichtbar
gemacht.
5.2.6.5
KMTB-Transaminaseaktivitätstest
Zu einer Mischung aus 100 mM Natriumphosphatpuffer pH 7, 50 µM Pyridoxalphosphat, 1 mM
KMTB und 2 mM Aminosäure-Mix ohne Methionin wurden 10 µg des jeweiligen Testproteins
gegeben. 100 µl Gesamtansatz wurden 30 min bei 25°C inkubiert. Die Reaktion wurde in
flüssigem Stickstoff abgestoppt. Die Proben wurden mit Hilfe einer Multiscreen 10 KD Platte
90 min bei 4°C und 5000 rpm filtriert und die Aminosäuregehalte mittels UPLC bestimmt.
5.2.7
Klonierungsstrategien
Klonierung von pMTI1::MTI1-GFP bzw. pMTI1::MTI1-GUS
Ein 4003 bp langes Promotor-Gen-Fragment (1925 bp Promotor) ohne Stopp-Codon wurde mit
den Primern MTI1-1925f und MTI1+2078r aus genomischer Arabidopsis-DNA amplifiziert. Das
Amplifikat wurde in den Gateway®-Eingangsvektor pENTR/D-TOPO® ligiert und sequenziert.
Durch Rekombination des pMTI1::MTI1-Eingangsvektors mit dem Zielvektor pMDC107 (Curtis
und Grossniklaus, 2003) entstand der Expressionsvektor pMTI1::MTI1-GFP. Durch
- 103 -
MATERIAL UND METHODEN
Rekombination des pMTI1::MTI1 Eingangsvektors mit dem Zielvektor pMDC163 (Curtis and
Grossniklaus, 2003) entstand der Expressionsvektor pMTI1::MTI1-GUS.
Klonierung von pDEP1::DEP1-GFP bzw. pDEP1::DEP1-GUS
Ein 5309 bp langes Promotor-Gen-Fragment (1649 bp Promotor) ohne Stopp-Codon wurde mit
den Primern DEP1-1649f und DEP1+3660r aus genomischer Arabidopsis-DNA amplifiziert.
Das Amplifikat wurde in pENTR/D-TOPO® ligiert und sequenziert. Durch Rekombination des
pDEP1::DEP1-Eingangsvektors mit dem Zielvektor pMDC107 (Curtis und Grossniklaus, 2003)
entstand der Expressionsvektor pDEP1::DEP1-GFP. Durch Rekombination des pDEP1::DEP1
Eingangsvektors mit dem Zielvektor pMDC163 (Curtis und Grossniklaus, 2003) entstand der
Expressionsvektor pDEP1::DEP1-GUS.
Klonierung von pCaMV35S::GFP-MTI1 bzw. pCaMV35S::MTI1-GFP
Die kodierende Sequenz von MTI1 ohne bzw. mit Stopp-Codon wurde mit den Primern
MTI1_CDS+1f und MTI1_CDS+1122r bzw. MTI1_CDS+1125r aus Arabidopsis-cDNA
amplifiziert. Das 1122 bzw. 1125 bp große Amplifikat wurde in pENTR/D-TOPO® ligiert und
sequenziert. Durch Rekombination des MTI1-Eingangsvektors mit Stopp-Codon mit dem
Zielvektor pEarlygate104 (Earley et al., 2006) entstand der Expressionsvektor
pCaMV35S::GFP-MTI1. Durch Rekombination des MTI1-Eingangsvektors ohne Stopp-Codon
mit dem Zielvektor pMDC83 (Curtis und Grossniklaus, 2003) entstand der Expressionsvektor
pCaMV35S::MTI1-GFP.
Klonierung von pCaMV35S::GFP-DEP1 bzw. pCaMV35S::DEP1-GFP
Die kodierende Sequenz von DEP1 ohne bzw. mit Stopp-Codon wurde mit den Primern
DEP1_CDS+1f und DEP1_CDS+1521r bzw. DEP1_CDS+1524r aus Arabidopsis-cDNA
amplifiziert. Das 1521 bzw. 1524 bp große Amplifikat wurde in pENTR/D-TOPO® ligiert und
sequenziert. Durch Rekombination des DEP1-Eingangsvektors mit Stopp-Codon mit dem
Zielvektor pEarlygate104 (Earley et al., 2006) entstand der Expressionsvektor
pCaMV35S::GFP-DEP1. Durch Rekombination des DEP1-Eingangsvektors ohne StoppCodon mit dem Zielvektor pMDC83 (Curtis und Grossniklaus, 2003) entstand der
Expressionsvektor pCaMV35S::DEP1-GFP.
Klonierung von pCaMV35S::MTI1-amiRNA
Die Planung und Klonierung der MTI1-amiRNA (TACTCAAACGCTGTAAGCCTG) erfolgte
nach den Vorgaben des WMD3 – Web MicroRNA Designers (http://wmd3.weigelworld.org/cgibin/webapp.cgi). Mit dem Plasmid pRS300 (Schwab et al., 2006) als PCR-Template und den
Primer Paaren amiRNA_A und amiRNA_IV, amiRNA_III und amiRNA_II, amiRNA_I und
amiRNA_B wurden 3 verschiedene Amplifikate erzeugt. Mittels überlappender PCR wurde
anschließend eine MTI1-amiRNA Vorstufe generiert. Dazu wurden die drei Amplifikate
gemischt und als Template für eine 4. PCR-Reaktion mit den Primern amiRNA_A und
amiRNA_B verwendet. Die MTI1-amiRNA Vorstufe wurde in pENTR/D-TOPO® ligiert und
sequenziert. Durch Rekombination des Eingangsvektors mit dem Zielvektor pEarlygate100
(Earley et al., 2006) entstand der Expressionsvektor pCaMV35S::MTI1-amiRNA.
- 104 -
MATERIAL UND METHODEN
Klonierung von pSUC2-dest+hpt
Der pSUC2-dest-Zielvektor (Thompson und Wolniak, 2008) wurde mit dem Restriktionsenzym
KpnI geöffnet und dephosphoryliert. Das hygromycin phosphotransferase (hpt)-Gen unter der
Kontrolle des CaM35S-Promotors wurde aus dem pGWB1 Vektor (Nakagawa et al., 2007) mit
den Primern hpt/KpnI-f und hpt/KpnI-r amplifiziert. Das 1604 bp große Amplifikat wurde in
pENTR/D-TOPO® ligiert und sequenziert. Über die angefügten KpnI-Schnittstellen wurde das
Amplifikat wieder ausgeschnitten und in pSUC2-dest ligiert.
Klonierung von pSUC2::MTI1
Durch Rekombination des MTI1-Eingangsvektors mit Stopp-Codon mit dem Zielvektor pSUC2dest+hpt entstand der Expressionsvektor pSUC2::MTI1.
Klonierung von pSUC2::DEP1
Durch Rekombination des DEP1-Eingangsvektors mit Stopp-Codon mit dem Zielvektor
pSUC2-dest entstand der Expressionsvektor pSUC2::DEP1.
Klonierung von pBasta-GFP
Der Expressionsvektor AKK1472B wurde mit den Restriktionsenzymen SbfI und PacI geöffnet.
Die Gateway-GFP-Kassette aus pMDC107 wurde mit den Primern Gateway+GFP-f-SbfI und
Gateway+GFP-r-PacI amplifiziert. Das 2796 bp große Amplifikat wurde in pCR®-Blunt IITOPO® ligiert und sequenziert. Über die angefügten SbfI und PacI Schnittstellen wurde das
Amplifikat wieder ausgeschnitten und in AKK1472B ligiert. Dadurch entstand ein binärer,
Glufosinat-resistenter Gateway®-Zielvektor für Proteinlokalisation (kein Promotor, GatewayKassette, GFP).
Klonierung von pBasta-GUS
Der Expressionsvektor AKK1472B wurde mit dem Restriktionsenzym XhoI geöffnet und
dephosporyliert. Die Gateway-GUS-Kassette aus pMDC163 wurde mit den Primern
Gateway+GUS-f-XhoI und Gateway+GUS-r-XhoI amplifiziert. Das 4041 bp große Amplifikat
wurde in pCR®-Blunt II-TOPO® ligiert und sequenziert. Über die angefügten XhoI
Schnittstellen wurde das Amplifikat wieder ausgeschnitten und in AKK1472B ligiert. Dadurch
entstand ein binärer, Glufosinat-resistenter Gateway®-Zielvektor für Proteinlokalisation (kein
Promotor, Gateway-Kassette, GUS).
Klonierung von pNAS1::NAS1-GUS
Ein 2782 bp langes Promotor-Gen-Fragment (1770 bp Promotor) ohne Stopp-Codon wurde mit
den Primern NAS1-1822f und NAS1+960r aus genomischer Arabidopsis-DNA amplifiziert. Das
Amplifikat wurde in den Gateway®-Eingangsvektor pENTR/D-TOPO® ligiert und sequenziert.
Durch Rekombination des pNAS1::NAS1-Eingangsvektors mit dem Zielvektor pBasta-GUS
entstand der Expressionsvektor pNAS1::NAS1-GUS.
Klonierung von pNAS2::NAS2-GUS
Ein 2731 bp langes Promotor-Gen-Fragment (1771 bp Promotor) ohne Stopp-Codon wurde mit
den Primern NAS2-1771f und NAS2+960r aus genomischer Arabidopsis-DNA amplifiziert. Das
Amplifikat wurde in den Gateway®-Eingangsvektor pENTR/D-TOPO® ligiert und sequenziert.
- 105 -
MATERIAL UND METHODEN
Durch Rekombination des pNAS2::NAS2-Eingangsvektors mit dem Zielvektor pBasta-GUS
entstand der Expressionsvektor pNAS2::NAS2-GUS.
Klonierung von pNAS3::NAS3-GUS
Ein 2873 bp langes Promotor-Gen-Fragment (1844 bp Promotor) ohne Stopp-Codon wurde mit
den Primern NAS3-1931f und NAS3+960r aus genomischer Arabidopsis-DNA amplifiziert. Das
Amplifikat wurde in den Gateway®-Eingangsvektor pENTR/D-TOPO® ligiert und sequenziert.
Durch Rekombination des pNAS3::NAS3-Eingangsvektors mit dem Zielvektor pBasta-GUS
entstand der Expressionsvektor pNAS3::NAS3-GUS.
Klonierung von pNAS4::NAS4-GUS
Ein 3322 bp langes Promotor-Gen-Fragment (2350 bp Promotor) ohne Stopp-Codon wurde mit
den Primern NAS4-2350f und NAS4+972r aus genomischer Arabidopsis-DNA amplifiziert. Das
Amplifikat wurde in den Gateway®-Eingangsvektor pENTR/D-TOPO® ligiert und sequenziert.
Durch Rekombination des pNAS4::NAS4-Eingangsvektors mit dem Zielvektor pBasta-GUS
entstand der Expressionsvektor pNAS4::NAS4-GUS.
Klonierung von pCPA::CPA-GUS
Ein 3235 bp langes Promotor-Gen-Fragment (1326 bp Promotor) ohne Stopp-Codon wurde mit
den Primern CPA-1326f und CPA+1909r aus genomischer Arabidopsis-DNA amplifiziert. Das
Amplifikat wurde in den Gateway®-Eingangsvektor pENTR/D-TOPO® ligiert und sequenziert.
Durch Rekombination des pCPA::CPA-Eingangsvektors mit dem Zielvektor pBasta-GUS
entstand der Expressionsvektor pCPA::CPA-GUS.
Klonierung von pSPDS1::SPDS1-GUS
Ein 4412 bp langes Promotor-Gen-Fragment (1968 bp Promotor) ohne Stopp-Codon wurde mit
den Primern SDPS1-1968f und SPDS1+2444r aus genomischer Arabidopsis-DNA amplifiziert.
Das Amplifikat wurde in den Gateway®-Eingangsvektor pENTR/D-TOPO® ligiert und
sequenziert. Durch Rekombination des pSPDS1::SPDS1-Eingangsvektors mit dem Zielvektor
pBasta-GUS entstand der Expressionsvektor pSPDS1::SPDS1-GUS.
Klonierung von pSPDS2::SPDS2-GUS
Ein 3281 bp langes Promotor-Gen-Fragment (1428 bp Promotor) ohne Stopp-Codon wurde mit
den Primern SDPS2-1428f und SPDS2+1853r aus genomischer Arabidopsis-DNA amplifiziert.
Das Amplifikat wurde in den Gateway®-Eingangsvektor pENTR/D-TOPO® ligiert und
sequenziert. Durch Rekombination des pSPDS2::SPDS2-Eingangsvektors mit dem Zielvektor
pBasta-GUS entstand der Expressionsvektor pSPDS2::SPDS2-GUS.
Klonierung von pSPMS::SPMS-GUS
Ein 4204 bp langes Promotor-Gen-Fragment (1982 bp Promotor) ohne Stopp-Codon wurde mit
den Primern SDMS-1982f und SPMS+2222r aus genomischer Arabidopsis-DNA amplifiziert.
Das Amplifikat wurde in den Gateway®-Eingangsvektor pENTR/D-TOPO® ligiert und
sequenziert. Durch Rekombination des pSPMS::SPMS-Eingangsvektors mit dem Zielvektor
pBasta-GUS entstand der Expressionsvektor pSPMS::SPMS-GUS.
- 106 -
MATERIAL UND METHODEN
Klonierung von pAt1g77670::At1g77670-GUS
Ein 3606 bp langes Promotor-Gen-Fragment (1750 bp Promotor) ohne Stopp-Codon wurde mit
den Primern At1g77670-1750f und At1g77670+1856r aus genomischer Arabidopsis-DNA
amplifiziert. Das Amplifikat wurde in den Gateway®-Eingangsvektor pENTR/D-TOPO® ligiert
und sequenziert. Durch Rekombination des pAt1g77670::At1g77670-Eingangsvektors mit dem
Zielvektor pBasta-GUS entstand der Expressionsvektor pAt1g77670::At1g77670-GUS.
Klonierung von pAt1g80360::At1g80360-GUS
Ein 3438 bp langes Promotor-Gen-Fragment (1533 bp Promotor) ohne Stopp-Codon wurde mit
den Primern At1g80360-1533f und At1g80360+1905r aus genomischer Arabidopsis-DNA
amplifiziert. Das Amplifikat wurde in den Gateway®-Eingangsvektor pENTR/D-TOPO® ligiert
und sequenziert. Durch Rekombination des pAt1g80360::At1g80360-Eingangsvektors mit dem
Zielvektor pBasta-GUS entstand der Expressionsvektor pAt1g80360::At1g80360-GUS.
Klonierung von pBCAT1::GUS
Ein 1716 bp langes Promotor-Fragment wurde mit den Primern BCAT1-1716f und BCAT1-1r
aus genomischer Arabidopsis-DNA amplifiziert. Das Amplifikat wurde in den Gateway®
Eingangsvektor pENTR/D-TOPO® ligiert und sequenziert. Durch Rekombination des pBCAT1Eingangsvektors mit dem Zielvektor pBasta-GUS entstand der Expressionsvektor pBCAT1GUS.
Klonierung von pBCAT2::BCAT2-GUS
Ein 3836 bp langes Promotor-Gen-Fragment (1929 bp Promotor) ohne Stopp-Codon wurde mit
den Primern BCAT2-1929f und BCAT2+1907r aus genomischer Arabidopsis-DNA amplifiziert.
Das Amplifikat wurde in den Gateway®-Eingangsvektor pENTR/D-TOPO® ligiert und
sequenziert. Durch Rekombination des pBCAT2::BCAT2-Eingangsvektors mit dem Zielvektor
pBasta-GUS entstand der Expressionsvektor pBCAT2::BCAT2-GUS.
Klonierung von pBCAT3::GUS
Ein 1719 bp langes Promotor-Fragment wurde mit den Primern BCAT3-1719f und BCAT3-1r
aus genomischer Arabidopsis-DNA amplifiziert. Das Amplifikat wurde in den Gateway®Eingangsvektor pENTR/D-TOPO® ligiert und sequenziert. Durch Rekombination des pBCAT3Eingangsvektors mit dem Zielvektor pBasta-GUS entstand der Expressionsvektor pBCAT3GUS.
Klonierung von pBCAT5::GUS
Ein 1714 bp langes Promotor-Fragment wurde mit den Primern BCAT5-1538f und BCAT5-1r
aus genomischer Arabidopsis-DNA amplifiziert. Das Amplifikat wurde in den Gateway®Eingangsvektor pENTR/D-TOPO® ligiert und sequenziert. Durch Rekombination des pBCAT5Eingangsvektors mit dem Zielvektor pBasta-GUS entstand der Expressionsvektor pBCAT5GUS.
Klonierung von pBCAT6::GUS
Ein 1741 bp langes Promotor-Fragment wurde mit den Primern BCAT6-1741f und BCAT6-1r
aus genomischer Arabidopsis-DNA amplifiziert. Das Amplifikat wurde in den Gateway®-
- 107 -
MATERIAL UND METHODEN
Eingangsvektor pENTR/D-TOPO® ligiert und sequenziert. Durch Rekombination des pBCAT6Eingangsvektors mit dem Zielvektor pBasta-GUS entstand der Expressionsvektor pBCAT6GUS.
Klonierung von pASP1::GUS
Ein 1994 bp langes Promotor-Fragment wurde mit den Primern ASP1-1994f und ASP1-1r aus
genomischer Arabidopsis-DNA amplifiziert. Das Amplifikat wurde in den Gateway®Eingangsvektor pENTR/D-TOPO® ligiert und sequenziert. Durch Rekombination des pASP1Eingangsvektors mit dem Zielvektor pBasta-GUS entstand der Expressionsvektor pASP1GUS.
Klonierung von pASP2::GUS
Ein 1977 bp langes Promotor-Fragment wurde mit den Primern ASP2-1977f und ASP2-1r aus
genomischer Arabidopsis-DNA amplifiziert. Das Amplifikat wurde in den Gateway®Eingangsvektor pENTR/D-TOPO® ligiert und sequenziert. Durch Rekombination des pASP2Eingangsvektors mit dem Zielvektor pBasta-GUS entstand der Expressionsvektor pASP2GUS.
Klonierung von pASP3::GUS
Ein 2055 bp langes Promotor-Fragment wurde mit den Primern ASP3-2055f und ASP3-1r aus
genomischer Arabidopsis-DNA amplifiziert. Das Amplifikat wurde in den Gateway®Eingangsvektor pENTR/D-TOPO® ligiert und sequenziert. Durch Rekombination des pASP3Eingangsvektors mit dem Zielvektor pBasta-GUS entstand der Expressionsvektor pASP3GUS.
Klonierung von pASP4::GUS
Ein 2075 bp langes Promotor-Fragment wurde mit den Primern ASP4-2075f und ASP4-1r aus
genomischer Arabidopsis-DNA amplifiziert. Das Amplifikat wurde in den Gateway®Eingangsvektor pENTR/D-TOPO® ligiert und sequenziert. Durch Rekombination des pASP4Eingangsvektors mit dem Zielvektor pBasta-GUS entstand der Expressionsvektor pASP4GUS.
Klonierung von pASP5::GUS
Ein 2139 bp langes Promotor-Fragment wurde mit den Primern ASP5-2139f und ASP5-1r aus
genomischer Arabidopsis-DNA amplifiziert. Das Amplifikat wurde in den Gateway®Eingangsvektor pENTR/D-TOPO® ligiert und sequenziert. Durch Rekombination des pASP5Eingangsvektors mit dem Zielvektor pBasta-GUS entstand der Expressionsvektor pASP5GUS.
Klonierung von pT7-LacO::YkrV
Der Proteinexpressionsvektor pET-15b wurde mit dem Restriktionsenzym XhoI geöffnet und
dephosphoryliert. Die kodierende Sequenz von ykrV wurde mit den Primern YkrV+1f_XhoI und
YkrV+1197r_XhoI aus Bacillus subtilis-DNA amplifiziert. Das 1218 bp lange Amplifikat wurde
in pCR®-Blunt II-TOPO® ligiert und sequenziert. Über die angefügten XhoI Schnittstellen
- 108 -
MATERIAL UND METHODEN
wurde die ykrV CDS wieder ausgeschnitten und in pET-15b ligiert, wodurch der
Proteinexpressionsvektor pT7-LacO::YkrV entstand.
Klonierung von pT7-LacO::At1g77670
Der Proteinexpressionsvektor pET-15b wurde mit dem Restriktionsenzym NdeI geöffnet und
dephosphoryliert. Die kodierende Sequenz von At1g77670 wurde mit den Primern
At1g77670+1f_NdeI und At1g77670+1323r_NdeI aus Arabidopsis-cDNA amplifiziert. Das
1332 bp lange Amplifikat wurde in pCR®-Blunt II-TOPO® ligiert und sequenziert. Über die
angefügten NdeI Schnittstellen wurde die At1g77670-CDS wieder ausgeschnitten und in pET15b ligiert, wodurch der Proteinexpressionsvektor pT7-LacO::At1g77670 entstand.
Klonierung von pT7-LacO::BCAT2
Der Proteinexpressionsvektor pET-15b wurde mit dem Restriktionsenzym NdeI geöffnet und
dephosphoryliert. Die kodierende Sequenz von BCAT2 wurde mit den Primern
BCAT2+1f_NdeI und BCAT2+1167r_NdeI aus Arabidopsis-cDNA amplifiziert. Das 1182 bp
lange Amplifikat wurde in pCR®-Blunt II-TOPO® ligiert und sequenziert. Über die angefügten
NdeI Schnittstellen wurde die BCAT2-CDS wieder ausgeschnitten und in pET-15b ligiert,
wodurch der Proteinexpressionsvektor pT7-LacO::BCAT2 entstand.
Klonierung von pT7-LacO::ASP4
Der Proteinexpressionsvektor pET-15b wurde mit dem Restriktionsenzym NdeI geöffnet und
dephosphoryliert. Die kodierende Sequenz von ASP4 wurde mit den Primern ASP4+1f_NdeI
und ASP4+1218r_NdeI aus Arabidopsis-cDNA amplifiziert. Das 1233 bp lange Amplifikat
wurde in pCR®-Blunt II-TOPO® ligiert und sequenziert. Über die angefügten NdeI
Schnittstellen wurde die ASP4-CDS wieder ausgeschnitten und in pET-15b ligiert, wodurch der
Proteinexpressionsvektor pT7-LacO::ASP4 entstand.
Klonierung von pT7-LacO::ASP5
Der Proteinexpressionsvektor pET-15b wurde mit dem Restriktionsenzym NdeI geöffnet und
dephosphoryliert. Die kodierende Sequenz von ASP5 wurde mit den Primern ASP5+1f_NdeI
und ASP4+1362r_NdeI aus Arabidopsis-cDNA amplifiziert. Das 1377 bp lange Amplifikat
wurde in pCR®-Blunt II-TOPO® ligiert und sequenziert. Über die angefügten NdeI
Schnittstellen wurde die ASP5-CDS wieder ausgeschnitten und in pET-15b ligiert, wodurch der
Proteinexpressionsvektor pT7-LacO::ASP5 entstand.
- 109 -
LITERATURVERZEICHNIS
6
LITERATURVERZEICHNIS
Abel S, Theologis A (1994) Transient transformation of Arabidopsis leaf protoplasts: a
versatile experimental system to study gene expression. Plant J 5: 421-427
Adams DO, Yang SF (1977) Methionine Metabolism in Apple Tissue. Plant Physiol 60: 892896
Alcázar R, Bitrián M, Bartels D, Koncz C, Altabella T, Tiburcio AF (2011) Polyamine
metabolic canalization in response to drought stress in Arabidopsis and the resurrection
plant Craterostigma plantagineum. Plant Signal Behav 6: 243-250
Alonso JM, Stepanova AN, Leisse TJ, Kim CJ, Chen H, Shinn P, Stevenson DK,
Zimmerman J, Barajas P, Cheuk R, Gadrinab C, Heller C, Jeske A, Koesema E,
Meyers CC, Parker H, Prednis L, Ansari Y, Choy N, Deen H, Geralt M, Hazari N,
Hom E, Karnes M, Mulholland C, Ndubaku R, Schmidt I, Guzman P, AguilarHenonin L, Schmid M, Weigel D, Carter DE, Marchand T, Risseeuw E, Brogden D,
Zeko A, Crosby WL, Berry CC, Ecker JR (2003) Genome-Wide Insertional
Mutagenesis of Arabidopsis thaliana. Science 301: 653-657
Arvidsson S, Kwasniewski M, Riano-Pachon DM, Mueller-Roeber B (2008) QuantPrime a flexible tool for reliable high-throughput primer design for quantitative PCR. BMC
Bioinformatics 9: 465
Basset GJ, Ravanel S, Quinlivan EP, White R, Giovannoni JJ, Rebeille F, Nichols BP,
Shinozaki K, Seki M, Gregory JF, 3rd, Hanson AD (2004) Folate synthesis in plants:
the last step of the p-aminobenzoate branch is catalyzed by a plastidial
aminodeoxychorismate lyase. Plant J 40: 453-461
Baur AH, Yang SF (1972) METHIONINE METABOLISM IN APPLE TISSUE IN RELATION TO
ETHYLENE BIOSYNTHESIS. Phytochemistry 11: 3207-3214
Bender RR, Haegele JW, Ruffo ML, Below FE (2013) Modern Corn Hybrids Nutrient Uptake
Pattern. Better Crops 97: 7-10
Berger BJ, English S, Chan G, Knodel MH (2003) Methionine Regeneration and
Aminotransferases in Bacillus subtilis, Bacillus cereus, and Bacillus anthracis. J
Bacteriol 185: 2418-2431
Binder S (2010) Branched-Chain Amino Acid Metabolism in Arabidopsis thaliana. The
Arabidopsis Book 8: e0137
Binder S, Knill T, Schuster J (2007) Branched-chain amino acid metabolism in higher plants.
Physiologia Plantarum 129: 68-78
Bleecker AB, Kende H (2000) ETHYLENE: A Gaseous Signal Molecule in Plants. Annu Rev
Cell Dev Biol 16: 1-18
Bourgis F, Roje S, Nuccio ML, Fisher DB, Tarczynski MC, Li C, Herschbach C,
Rennenberg H, Pimenta MJ, Shen TL, Gage DA, Hanson AD (1999) Smethylmethionine Plays a Major Role in Phloem Sulfur Transport and Is Synthesized
by a Novel Type of Methyltransferase. Plant Cell 11: 1485-1498
Bradford MM (1976) A Rapid and Sensitive Method for the Quantification of Microgram
Quantities of Protein Utilizing the Principle of Protein-Dye Binding. Anal. Biochem. 72:
248-254
- 110 -
LITERATURVERZEICHNIS
Buchanan B, Gruissem W, Jones R (2010) Biochemistry & Molecular Biology of Plants.
WILEY-BLACKWELL
Bumann M, Djafarzadeh S, Oberholzer AE, Bigler P, Altmann M, Trachsel H, Baumann U
(2004) Crystal Structure of Yeast Ypr118w, a Methylthioribose-1-Phosphate Isomerase
Related to Regulatory eIF2B Subunits. J Biol Chem 279: 37087-37094
Bürstenbinder K, Rzewuski G, Wirtz M, Hell R, Sauter M (2007) The role of methionine
recycling for ethylene synthesis in Arabidopsis. Plant J 49: 238-249
Bürstenbinder K, Waduwara I, Schoor S, Moffatt BA, Wirtz M, Minocha SC, Oppermann
Y, Bouchereau A, Hell R, Sauter M (2010) Inhibition of 5’-methylthioadenosine
metabolism in the Yang cycle alters polyamine levels, and impairs seedling growth and
reproduction in Arabidopsis. Plant J 62: 977-988
Cao MJ, Wang Z, Wirtz M, Hell R, Oliver DJ, Xiang CB (2013) SULTR3;1 is a chloroplastlocalized sulfate transporter in Arabidopsis thaliana. Plant J 73: 607-616
Chu HH, Chiecko J, Punshon T, Lanzirotti A, Lahner B, Salt DE, Walker EL (2010)
Successful Reproduction Requires the Function of Arabidopsis YELLOW STRIPELIKE1 and YELLOW STRIPE-LIKE3 Metal-Nicotianamine Transporters in Both
Vegetative and Reproductive Structures. Plant Physiol 154: 197-210
Clay NK, Nelson T (2005) Arabidopsis thickvein Mutation Affects Vein Thickness and Organ
Vascularization, and Resides in a Provascular Cell-Specific Spermine Synthase
Involved in Vein Definition and in Polar Auxin Transport. Plant Physiol 138: 767-777
Clough SJ, Bent AF (1998) Floral dip: a simplified method for Agrobacterium-mediated
transformation of Arabiodpsis thaliana. Plant J 16: 735-743
Curtis MD, Grossniklaus U (2003) A Gateway Cloning Vector Set for High-Throughput
Functional Analysis of Genes in Planta. Plant Physiol 133: 462-469
Czechowski T, Stitt M, Altmann T, Udvardi MK, Scheible WR (2005) Genome-Wide
Identification and Testing of Superior Reference Genes for Transcript Normalization in
Arabidopsis. Plant Physiol 139: 5-17
de la Torre F, De Santis L, Suarez MF, Crespillo R, Canovas FM (2006) Identification and
functional analysis of a prokaryotic-type aspartate aminotransferase: implications for
plant amino acid metabolism. Plant J 46: 414-425
Deblaere R, Bytebier B, De Greve H, Deboeck F, Schell J, Van Montagu M, Leemans J
(1985) Efficient octopine Ti plasmid-derived vectors for Agrobacterium-mediated gene
transfer to plants. Nucleic Acids Res 13: 4777-4788
Deeb F, van der Weele CM, Wolniak SM (2010) Spermidine Is a Morphogenetic Determinant
for Cell Fate Specification in the Male Gametophyte of the Water Fern Marsilea vestita.
Plant Cell 22: 3678-3691
Deinlein U, Weber M, Schmidt H, Rensch S, Trampczynska A, Hansen TH, Husted S,
Schjoerring JK, Talke IN, Kramer U, Clemens S (2012) Elevated Nicotianamine
Levels in Arabidopsis halleri Roots Play a Key Role in Zinc Hyperaccumulation. Plant
Cell 24: 708-723
Diebold R (2002) The Branched-Chain Amino Acid Transaminase Gene Family in Arabidopsis
Encodes Plastid and Mitochondrial Proteins. Plant Physiol 129: 540-550
- 111 -
LITERATURVERZEICHNIS
Do PT, Degenkolbe T, Erban A, Heyer AG, Kopka J, Kohl KI, Hincha DK, Zuther E (2013)
Dissecting Rice Polyamine Metabolism under Controlled Long-Term Drought Stress.
PLoS One 8: e60325
Drechsel G, Bergler J, Wippel K, Sauer N, Vogelmann K, Hoth S (2011) C-terminal
armadillo repeats are essential and sufficient for association of the plant U-box armadillo
E3 ubiquitin ligase SAUL1 with the plasma membrane. J Exp Bot 62: 775-785
Earley KW, Haag JR, Pontes O, Opper K, Juehne T, Song K, Pikaard CS (2006) Gatewaycompatible vectors for plant functional genomics and proteomics. Plant J 45: 616-629
Ellens KW, Richardson LG, Frelin O, Collins J, Ribeiro CL, Hsieh YF, Mullen RT, Hanson
AD (2014) Evidence that glutamine transaminase and omega-amidase potentially act
in tandem to close the methionine salvage cycle in bacteria and plants. Phytochemistry
113: 160-169
Falk KL, Tokuhisa JG, Gershenzon J (2007) The Effect of Sulfur Nutrition on Plant
Glucosinolate Content: Physiology and Molecular Mechanisms. Plant Biology 9: 573581
Fischer C, Kugler A, Hoth S, Dietrich P (2013) An IQ Domain Mediates the Interaction with
Calmodulin in a Plant Cyclic Nucleotide-Gated Channel. Plant Cell Physiol 54: 573-584
Fujita M, Fujita Y, Iuchi S, Yamada K, Kobayashi Y, Urano K, Kobayashi M, YamaguchiShinozaki K, Shinozaki K (2012) Natural variation in a polyamine transporter
determines paraquat tolerance in Arabidopsis. Proc Natl Acad Sci U S A 109: 63436347
Ge C, Cui X, Wang Y, Hu Y, Fu Z, Zhang D, Cheng Z, Li J (2006) BUD2, encoding an Sadenosylmethionine decarboxylase, is required for Arabidopsis growth and
development. Cell Res 16: 446-456
Giavalisco P, Kapitza K, Kolasa A, Buhtz A, Kehr J (2006) Towards the proteome of
Brassica napus phloem sap. Proteomics 6: 896-909
Giovanelli J, Mudd SH, Datko AH (1985) In Vivo Regulation of De Novo Methionine
Biosynthesis in a Higher Plant (Lemna). Plant Physiol 77: 450-455
Gomez-Jimenez MC, Paredes MA, Gallardo M, Fernandez-Garcia N, Olmos E, SanchezCalle IM (2010) Tissue-specific expression of olive S-adenosyl methionine
decarboxylase and spermidine synthase genes and polyamine metabolism during
flower opening and early fruit development. Planta 232: 629-647
Gruber BD, Giehl RF, Friedel S, von Wiren N (2013) Plasticity of the Arabidopsis Root
System under Nutrient Deficiencies. Plant Physiol 163: 161-179
Guranowski A (1983) Plant 5-Methylthioribose Kinase. Plant Physiol 71: 932-935
Hanahan D (1983) Studies on Transformation of Escherichia coli with Plasmids. J Mol Biol
166: 557-580
Hanzawa Y, Imai A, Michael AJ, Komeda Y, Takahashi T (2002) Characterization of the
spermidine synthase-related gene family in Arabidopsis thaliana. FEBS Lett 527: 176180
Hawkesford MJ (2000) Plant response to sulphur deficiency and the genetic manipulation of
sulphate transporters ti improve S-utilization efficiency. J Exp Bot 51: 131-138
- 112 -
LITERATURVERZEICHNIS
Haydon MJ, Kawachi M, Wirtz M, Hillmer S, Hell R, Kramer U (2012) Vacuolar
Nicotianamine has Critical and Distinct Roles under Iron Deficiency and for Zinc
Sequestration in Arabidopsis. Plant Cell 24: 724-737
Heilbronn J, Wilson J, Berger BJ (1999) Tyrosine Aminotransferase Catalyzes the Final Step
of Methionine Recycling in Klebsiella pneumoniae. J Bacteriol 181: 1739-1747
Hellens RP, Edwards EA, Leyland NR, Bean S, Mullineaux PM (2000) pGreen: a versatile
and flexible binary Ti vector for Agrobacterium-mediated plant transformation. Plant Mol
Biol 42: 819-832
Hewezi T, Howe PJ, Maier TR, Hussey RS, Mitchum MG, Davis EL, Baum TJ (2010)
Arabidopsis Spermidine Synthase is Targeted by an Effector Protein of the Cyst
Nematode Heterodera schachtii. Plant Physiol 152: 968-984
Hoagland DR, Arnon DI (1938) The Water-culture Method for Growing Plants Without Soil.
University of California
Höfgen R, Willmitzer L (1988) Storage of competent cells for Agrobacterium transformation.
Nucleic Acids Research 16: 9877
Holsters M, Silva B, Van Vliet F, Genetello C, De Block M, Dhaese P, Depicker A, Inze D,
Engler G, Villarroel R, et al. (1980) The functional organization of the nopaline A.
tumefaciens plasmid pTiC58. Plasmid 3: 212-230
Imai A, Akiyama T, Kato T, Sato S, Tabata S, Yamamoto KT, Takahashi T (2004a)
Spermine is not essential for survival of Arabidopsis. FEBS Lett 556: 148-152
Imai A, Matsuyama T, Hanzawa Y, Akiyama T, Tamaoki M, Saji H, Shirano Y, Kato T,
Hayashi H, Shibata D, Tabata S, Komeda Y, Takahashi T (2004b) Spermidine
Synthase Genes Are Essential for Survival of Arabidopsis. Plant Physiol 135: 15651573
Imlau A, Truernit E, Sauer N (1999) Cell-to-Cell and Long-Distance Trafficking of the Green
Fluorescent Protein in the Phloem and Symplastic Unloading of the Protein into Sink
Tissues. Plant Cell 11: 309-322
Inoue H, Nojima H, Okayama H (1990) High efficiency transformation of Escherichia coli with
plasmids. Gene 96: 23-28
Jimenez-Bremont JF, Marina M, Guerrero-Gonzalez Mde L, Rossi FR, Sanchez-Rangel D,
Rodriguez-Kessler M, Ruiz OA, Garriz A (2014) Physiological and molecular
implications of plant polyamine metabolism during biotic interactions. Front Plant Sci 5:
95
Kakehi J, Kuwashiro Y, Niitsu M, Takahashi T (2008) Thermospermine is required for stem
elongation in Arabidopsis thaliana. Plant Cell Physiol 49: 1342-1349
Kataoka T, Watanabe-Takahashi A, Hayashi N, Ohnishi M, Mimura T, Buchner P,
Hawkesford MJ, Yamaya T, Takahashi H (2004) Vacuolar Sulfate Transporters Are
Essential Determinants Controlling Internal Distribution of Sulfate in Arabidopsis. The
Plant Cell 16: 2693-2704
Kende H (1993) Ethylene Biosynthesis. Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol 44: 283-307
Klatte M, Schuler M, Wirtz M, Fink-Straube C, Hell R, Bauer P (2009) The Analysis of
Arabidopsis Nicotianamine Synthase Mutants Reveals Functions for Nicotianamine in
Seed Iron Loading and Iron Deficiency Responses. Plant Physiol 150: 257-271
- 113 -
LITERATURVERZEICHNIS
Kliebenstein DJ, Kroymann J, Brown P, Figuth A, Pedersen D, Gershenzon J, MitchellOlds T (2001) Genetic Control of Natural Variation in Arabidopsis Glucosinolate
Accumulation. Plant Physiol 126: 811-825
Kocsis MG, Ranocha P, Gage DA, Simon ES, Rhodes D, Peel GJ, Mellema S, Saito K,
Awazuhara M, Li C, Meeley RB, Tarczynski MC, Wagner C, Hanson AD (2003)
Insertional Inactivation of the Methionine S-Methyltransferase Gene Eliminates the SMethylmethionine Cycle and Increases the Methylation Ratio. Plant Physiol 131: 18081815
Koike S, Inoue H, Mizuno D, Takahashi M, Nakanishi H, Mori S, Nishizawa NK (2004)
OsYSL2 is a rice metal-nicotianamine transporter that is regulated by iron and
expressed in the phloem. Plant J 39: 415-424
Lachler K, Imhof J, Reichelt M, Gershenzon J, Binder S (2015) The cytosolic branchedchain aminotransferases of Arabidopsis thaliana influence methionine supply, salvage
and glucosinolate metabolism. Plant Mol Biol 88: 119-131
Laemmli UK (1970) Cleavage of Structural Proteins during the Assembly of the Head of
Bacteriophage T4. Nature 227: 680-685
Ling H-Q, Koch G, Bäumlein H, Ganal MW (1999) Map-based cloning of chloronerva, a gene
involved in iron uptake of higher plants encoding nicotianamine synthase. Proc Natl
Acad Sci U S A 96: 7098-7103
Maruyama-Nakashita A, Inoue E, Watanabe-Takahashi A, Yamaya T, Takahashi H (2003)
Transcriptome Profiling of Sulfur-Responsive Genes in Arabidopsis Reveals Global
Effects of Sulfur Nutrition on Multiple Metabolic Pathways. Plant Physiol 132: 597-605
Maruyama-Nakashita A, Nakamura Y, Watanabe-Takahashi A, Inoue E, Yamaya T,
Takahashi H (2005) Identification of a novel cis-acting element conferring sulfur
deficiency response in Arabidopsis roots. Plant J 42: 305-314
Matsui K, Tanaka H, Ohme-Takagi M (2004) Suppression of the biosynthesis of
proanthocyanidin in Arabidopsis by a chimeric PAP1 repressor. Plant Biotechnol J 2:
487-493
McManus MT (2012) Annual Plant Reviews, Volume 44, The Plant Hormone Ethylene. WILEYBLACKWELL
Minocha R, Majumdar R, Minocha SC (2014) Polyamines and abiotic stress in plants: a
complex relationship. Front Plant Sci 5: 175
Minocha R, Shortle W, Long S, Minocha S (1994) A Rapid and Reliable Procedure for
Extraction of Cellular Polyamines and Inorganic Ions from Plant Tissues. J Plant Growth
Regul 13: 187-193
Minocha SC, Minocha R, Robie CA (1990) High-performance liquid chromatographic method
for the determination of dansyl-polyamines. J Plant Growth Regul 13: 187-193
Mulangi V, Chibucos MC, Phuntumart V, Morris PF (2012) Kinetic and phylogenetic analysis
of plant polyamine uptake transporters. Planta 236: 1261-1273
Mulangi V, Phuntumart V, Aouida M, Ramotar D, Morris P (2011) Functional analysis of
OsPUT1, a rice polyamine uptake transporter. Planta 235: 1-11
Muniz L, Minguet EG, Singh SK, Pesquet E, Vera-Sirera F, Moreau-Courtois CL,
Carbonell J, Blazquez MA, Tuominen H (2008) ACAULIS5 controls Arabidopsis
- 114 -
LITERATURVERZEICHNIS
xylem specification through the prevention of premature cell death. Development 135:
2573-2582
Murr DP, Yang SF (1975) Conversion of 5′-methylthioadenosine to methionine by apple tissue.
Phytochemistry 14: 1291-1292
Mustroph A, Zanetti ME, Jang CJ, Holtan HE, Repetti PP, Galbraith DW, Girke T, BaileySerres J (2009) Profiling translatomes of discrete cell populations resolves altered
cellular priorities during hypoxia in Arabidopsis. Proc Natl Acad Sci U S A 106: 1884318848
Naka Y, Watanabe K, Sagor GH, Niitsu M, Pillai MA, Kusano T, Takahashi Y (2010)
Quantitative analysis of plant polyamines including thermospermine during growth and
salinity stress. Plant Physiol Biochem 48: 527-533
Nakagawa T, Kurose T, Hino T, Tanaka K, Kawamukai M, Niwa Y, Toyooka K, Matsuoka
K, Jinbo T, Kimura T (2007) Development of series of gateway binary vectors, pGWBs,
for realizing efficient construction of fusion genes for plant transformation. J Biosci
Bioeng 104: 34-41
Nikiforova V, Freitag J, Kempa S, Adamik M, Hesse H, Hoefgen R (2003) Transcriptome
analysis of sulfur depletion in Arabidopsis thaliana: interlacing of biosynthetic pathways
provides response specificity. Plant J 33: 633-650
Nikiforova VJ, Kopka J, Tolstikov V, Fiehn O, Hopkins L, Hawkesford MJ, Hesse H,
Hoefgen R (2005) Systems Rebalancing of Metabolism in Response to Sulfur
Deprivation, as Revealed by Metabolome Analysis of Arabidopsis Plants. Plant Physiol
138: 304-318
Palmer CM, Guerinot ML (2009) Facing the challenges of Cu, Fe and Zn homeostasis in
plants. Nat Chem Biol 5: 333-340
Peleman J, Boerjan W, Engler G, Seurinck J, Botterman J, Alliotte T, Van Montagu M,
Inze D (1989) Strong Cellular Preference in the Expression of a Housekeeping Gene of
Arabidopsis thaliana Encoding S-Adenosylmethionine Synthetase. Plant Cell 1: 81-93
Piotrowski M, Janowitz T, Kneifel H (2003) Plant C-N Hydrolases and the Identification of a
Plant N-Carbamoylputrescine Amidohydrolase Involved in Polyamine Biosynthesis. J
Biol Chem 278: 1708-1712
Pirkov I, Norbeck J, Gustafsson L, Albers E (2008) A complete inventory of all enzymes in
the eukaryotic methionine salvage pathway. FEBS J 275: 4111-4120
Pommerrenig B, Barth I, Niedermeier M, Kopp S, Schmid J, Dwyer RA, McNair RJ, Klebl
F, Sauer N (2006) Common Plantain. A Collection of Expressed Sequence Tags from
Vascular Tissue and a Simple and Efficient Transformation Method. Plant Physiol 142:
1427-1441
Pommerrenig B, Feussner K, Zierer W, Rabinovych V, Klebl F, Feussner I, Sauer N (2011)
Phloem-Specific Expression of Yang Cycle Genes and Identification of Novel Yang
cycle Enzymes in Plantago and Arabidopsis. Plant Cell 23: 1904-1919
Prabhu PR, Hudson AO (2010) Identification and Partial Characterization of an L-Tyrosine
Aminotransferase (TAT) from Arabidopsis thaliana. Biochem Res Int 2010: 549572
Rennenberg H (1982) GLUTATHIONINE METABOLISM AND POSSIBLE BIOLOGICAL
ROLES IN HIGHER PLANTS. Phytochemistry 21: 2771-2781
- 115 -
LITERATURVERZEICHNIS
Riewe D, Koohi M, Lisec J, Pfeiffer M, Lippmann R, Schmeichel J, Willmitzer L, Altmann
T (2012) A tyrosine aminotransferase involved in tocopherol synthesis in Arabidopsis.
Plant J 71: 850-859
Rodrigues-Pousada RA, De Rycke R, Dedonder A, Van Caeneghem W, Engler G, Van
Montagu M, Van Der Straeten D (1993) The Arabidopsis 1-Aminocyclopropane-1Carboxylate Synthase Gene 1 Is Expressed during Early Development. Plant Cell 5:
897-911
Roje S (2006) S-Adenosyl-L-methionine: Beyond the universal methyl group donor.
Phytochemistry 67: 1686-1698
Rzewuski G, Cornell KA, Rooney L, Burstenbinder K, Wirtz M, Hell R, Sauter M (2007)
OsMTN encodes a 5'-methylthioadenosine nucleosidase that is up-regulated during
submergence-induced ethylene synthesis in rice (Oryza sativa L.). J Exp Bot 58: 15051514
Sambrook J, Russell DW (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor
Laboratory Press
Samson F, Brunaud V, Balzergue S, Dubreucq B, Lepiniec L, Pelletier G, Caboche M,
Lecharny A (2002) FLAGdb/FST: a database of mapped flanking insertion sites (FSTs)
of Arabidopsis thaliana T-DNA transformants. Nucleic Acids Res 30: 94-97
Sauter M, Cornell KA, Beszteri S, Rzewuski G (2004) Functional Analysis of Methylthioribose
Kinase Genes in Plants. Plant Physiol 136: 4061-4071
Sauter M, Lorbiecke R, Ouyang B, Pochapsky TC, Rzewuski G (2005) The immediate-early
ethylene response gene OsARD1 encodes an acireductone dioxygenase involved in
recycling of the ethylene precursor S-adenosylmethionine. Plant J 44: 718-729
Sauter M, Moffatt B, Saechao MC, Hell R, Wirtz M (2013) Methionine salvage and Sadenosylmethionine: essential links between sulfur, ethylene and polyamine
biosynthesis. Biochem J 451: 145-154
Schad M, Lipton MS, Giavalisco P, Smith RD, Kehr J (2005) Evaluation of two-dimensional
electrophoresis and liquid chromatography-tandem mass spectrometry for tissuespecific protein profiling of laser-microdissected plant samples. Electrophoresis 26:
2729-2738
Scheerer U, Haensch R, Mendel RR, Kopriva S, Rennenberg H, Herschbach C (2010)
Sulphur flux through the sulphate assimilation pathway is differently controlled by
adenosine 5'-phosphosulphate reductase under stress and in transgenic poplar plants
overexpressing gamma-ECS, SO, or APR. J Exp Bot 61: 609-622
Scheres B, Wolkenfelt H, Willemsen V, Terlouw M, Lawson E, Dean C, Weisbeek P (1994)
Embryonic origin of the Arabidopsis primary root and root meristem initials.
Development 120: 2475-2487
Scholz G, Becker R, Pich A, Stephan UW (1992) Nicotianamine ‐ a common constituent of
strategies I and II of iron acquisition by plants: A review. J Plant Nutr 15: 1647-1665
Schuler M, Rellan-Alvarez R, Fink-Straube C, Abadia J, Bauer P (2012) Nicotianamine
Functions in the Phloem-Based Transport of Iron to Sink Organs, in Pollen Development
and Pollen Tube Growth in Arabidopsis. Plant Cell 24: 2380-2400
- 116 -
LITERATURVERZEICHNIS
Schultz CJ, Hsu M, Miesak B, Coruzzi CM (1998) Arabidopsis Mutants Define an in Vivo Role
for Isoenzymes of Aspartate Aminotransferase in Plant Nitrogen Assimilation. Genetics
149: 491-499
Schuster J, Knill T, Reichelt M, Gershenzon J, Binder S (2006) BRANCHED-CHAIN
AMINOTRANSFERSE4 is Part of the Chain Elongation Pathway in the Biosynthesis of
Methionine-Derived Glucosinolates in Arabidopsis. Plant Cell 18: 2664-2679
Schwab R, Ossowski S, Riester M, Warthmann N, Weigel D (2006) Highly Specific Gene
Silencing by Artificial MicroRNAs in Arabidopsis. Plant Cell 18: 1121-1133
Sekowska A, Danchin A (2002) The methionine salvage pathway in Bacillus subtilis. BMC
Microbiol 2: 8
Sekowska A, Dénervaud V, Ashida H, Michoud K, Haas D, Yokota A, Danchin A (2004)
Bacterial variations on the methionine salvage pathway. BMC Microbiol 4: 9
Shewry PR, Casey R (1999) Seed Proteins. Springer Netherlands
Shewry PR, Napier JA, Tatham AS (1995) Seed Storage Proteins: Structures and
Biosynthesis. Plant Cell 7: 945-956
Shibagaki N, Rose A, McDermott JP, Fujiwara T, Hayashi H, Yoneyama T, Davies JP
(2002) Selenate-resistant mutants of Arabidopsis thaliana identify SULTR1;2, a sulfate
transporter required for efficient transport of sulfate into roots. Plant J 29: 475-486
Shin K, Lee S, Song WY, Lee RA, Lee I, Ha K, Koo JC, Park SK, Nam HG, Lee Y, Soh MS
(2015) Genetic Identification of ACC-RESISTANT2 Reveals Involvement of LYSINE
HISTIDINE TRANSPORTER1 in the Uptake of 1-Aminocyclopropane-1-Carboxylic
Acid in Arabidopsis thaliana. Plant Cell Physiol 56: 572-582
Sichhart Y, Dräger B (2013) Immunolocalisation of spermidine synthase in Solanum
tuberosum. Phytochemistry 91: 117-121
Song JT, Lu H, Greenberg JT (2004) Divergent Roles in Arabidopsis thaliana Development
and Defense of Two Homologous Genes, ABERRANT GROWTH AND DEATH2 and
AGD2-LIKE DEFENSE RESPONSE PROTEIN1, Encoding Novel Aminotransferases.
Plant Cell 16: 353-366
Speiser A, Haberland S, Watanabe M, Wirtz M, Dietz KJ, Saito K, Hell R (2014) The
significance of cysteine synthesis for acclimation to high light conditions. Front Plant Sci
5: 776
Stadler R, Sauer N (1996) The Arabidopsis thaliana AtSUC2 Gene is Specifically Expressed
in Companion Cells. Botanica Acta 109: 299-306
Takahashi H, Kopriva S, Giordano M, Saito K, Hell R (2011) Sulfur assimilation in
photosynthetic organisms: molecular functions and regulations of transporters and
assimilatory enzymes. Annu Rev Plant Biol 62: 157-184
Takahashi H, Watanabe-Takahashi A, Smith FW, Blake-Kalff M, Hawkesford MJ, Saito K
(2000) The roles of three functional sulphate transporters involved in uptake and
translocation of sulphate in Arabidopsis thaliana. Plant J 23: 171-182
Takano A, Kakehi J, Takahashi T (2012) Thermospermine is Not a Minor Polyamine in the
Plant Kingdom. Plant Cell Physiol 53: 606-616
Tan Q, Zhang L, Grant J, Cooper P, Tegeder M (2010) Increased Phloem Transport of SMethylmethionine Positively Affects Sulfur and Nitrogen Metabolism and Seed
Development in Pea Plants. Plant Physiol 154: 1886-1896
- 117 -
LITERATURVERZEICHNIS
Thompson MV, Wolniak SM (2008) A Plasma Membrane-Anchored Fluorescent Protein
Fusion Illuminates Sieve Element Plasma Membranes in Arabidopsis and Tobacco.
Plant Physiol 146: 1599-1610
Towbin H, Staehelin T, Gordon J (1979) Electrophoretic transfer of proteins from
polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: Procedure and some applications. Proc
Natl Acad Sci U S A 76: 4350-4354
Truernit E, Sauer N (1995) The promoter of the Arabidopsis thaliana SUC2 sucrose-H+
symporter gene directs expression of beta-glucuronidase to the phloem: evidence for
phloem loading and unloading by SUC2. Planta 196: 564-570
Tsuchisaka A, Theologis A (2004) Unique and Overlapping Expression Patterns Among the
Arabidopsis 1-Amino-Cyclopropane-1-Carboxylate Synthase Gene Family Members.
Plant Physiol 136: 2982-3000
Tsuchisaka A, Yu G, Jin H, Alonso JM, Ecker JR, Zhang X, Gao S, Theologis A (2009) A
Combinatorial Interplay Among the 1-Aminocyclopropane-1-Carboxylate Isoforms
Regulates Ethylene Biosynthesis in Arabidopsis thaliana. Genetics 183: 979-1003
Vauclare P, Kopriva S, Fell D, Suter M, Sticher L, von Ballmoos P, Krahenbuhl U, den
Camp RO, Brunold C (2002) Flux control of sulphate assimilation in Arabidopsis
thaliana: adenosine 5'-phosphosulphate reductase is more susceptible than ATP
sulphurylase to negative control by thiols. Plant J 31: 729-740
Waduwara-Jayabahu I, Oppermann Y, Wirtz M, Hull ZT, Schoor S, Plotnikov AN, Hell R,
Sauter M, Moffatt BA (2012) Recycling of Methylthioadenosine is Essential for Normal
Vascular Development and Reproduction in Arabidopsis. Plant Physiol 158: 1728-1744
Wang KL-C, Li H, Ecker JR (2002) Ethylene Biosynthesis and Signaling Networks. Plant Cell
14: 131-151
Wen CK (2014) Ethylene in Plants. Springer Netherlands
Wienkoop S, Zoeller D, Ebert B, Simon-Rosin U, Fisahn J, Glinski M, Weckwerth W (2004)
Cell-specific protein profiling in Arabidopsis thaliana trichomes: identification of
trichome-located proteins involved in sulfur metabolism and detoxification.
Phytochemistry 65: 1641-1649
Windsor AJ, Reichelt M, Figuth A, Svatoš A, Kroymann J, Kliebenstein DJ, Gershenzon
J, Mitchell-Olds T (2005) Geographic and evolutionary diversification of glucosinolates
among near relatives of Arabidopsis thaliana (Brassicaceae). Phytochemistry 66: 13211333
Wittstock U, Halkier BA (2002) Glucosinolate research in the Arabidopsis era. Trends in Plant
Science 7: 263-270
Woody ST, Austin-Phillips S, Amasino RM, Krysan PJ (2007) The WiscDsLox T-DNA
collection: an Arabidopsis community resource generated by using an improved highthroughput T-DNA sequencing pipeline. J Plant Res 120: 157-165
Yamagami T, Tsuchisaka A, Yamada K, Haddon WF, Harden LA, Theologis A (2003)
Biochemical Diversity Among the 1-Amino-Cyclopropane-1-Carboxylate Synthase
Isozymes Encoded by the Arabidopsis Gene Family. J Biol Chem 278: 49102-49112
Yoshimoto N, Inoue E, Saito K, Yamaya T, Takahashi H (2003) Phloem-Localizing Sulfate
Transporter, SULTR1;3, Mediates Re-Distribution of Sulfur from Source to Sink Organs
in Arabidopsis. Plant Physiol 131: 1511-1517
- 118 -
LITERATURVERZEICHNIS
Yoshimoto N, Inoue E, Watanabe-Takahashi A, Saito K, Takahashi H (2007)
Posttranscriptional Regulation of High-Affinity Sulfate Transporters in Arabidopsis by
Sulfur Nutrition. Plant Physiol 145: 378-388
Yoshimoto N, Takahashi H, Smith FW, Yamaya T, Saito K (2002) Two distinct high-affinity
sulfate transporters with different inducibilities mediate uptake of sulfate in Arabidopsis
roots. Plant J 29: 465-473
Zheng L, Yamaji N, Yokosho K, Ma JF (2012) YSL16 is a Phloem-Localized Transporter of
the Copper-Nicotianamine Complex that is Responsible for Copper Distribution in Rice.
Plant Cell 24: 3767-3782
Zheng Z, Guo Y, Novak O, Dai X, Zhao Y, Ljung K, Noel JP, Chory J (2013) Coordination
of auxin and ethylene biosynthesis by the aminotransferase VAS1. Nat Chem Biol 9:
244-246
- 119 -
ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS
7
ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS
(d)SAM
(M)THF
(q)RT
(WU)-BLAST
µm
µM
A. thaliana
A. tumefaciens
Abb.
Abs.
ACC
ACL
ACR
ADC
Agm
AIH
Ala
amiRNA
AmpR
APR
APS
ARD
Arg
ARO
Asn
Asp
ASP
ATP
ATPS
B. subtilis
BAT
BCAT
bp
BSA
BUD
CaM
CaMV
CBL
cDNA
CDS
CGS
ChlorR
cm
Col
CPA
Cys
(Desoxy-)S-Adenosylmethionin
(Methyl)Tetrahydrofolat
(Quantitative) Reverse Transkriptase
(Washington University) Basic Local Alignment Search Tool
Mikrometer
Mikromolar
Arabidopsis thaliana
Agrobacterium tumefaciens
Abbildung
Absorption
Aminocyclopropan-1-Carbonsäure
ACAULIS
ACC-RESISTANT
ARGININE DECARBOXYLASE
Agmatin
AGMATINE IMINOHYDROLASE
Alanin
artificial micro ribonucleic acid
Ampicillin-Resistenz
ADENOSINE-5-PHOSPHOSULFATE REDUCTASE
Adenosin-5-Phosphosulfat
ACIDOREDUCTONE DIOXYGENASE
Arginin
AROMATIC AMINO ACID TRANSAMINASE
Asparagin
Aspartat
ASPARTATE AMINOTRANSFERASE
Adenosintriphosphat
ATP SULFURYLASE
Bacillus subtilis
BRANCHED-CHAIN AMINO ACID TRANSAMINASE
BRANCHED-CHAIN AMINO ACID TRANSFERASE
Basenpaare
Rinderserumalbumin
BUSHY AND DWARF
Calmodulin
Cauliflower Mosaic Virus
CYSTATHIONINE β-LYASE
copy desoxy ribonucleotid acid
kodierende Sequenz
CYSTATHIONINE ɣ-SYNTHASE
Chloramphenicol-Resistenz
Zentimeter
Columbia
N-CARBAMOYLPUTRESCIN AMINOHYDROLASE
Cystein
- 120 -
ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS
Cyst
DAPI
DEP
DHKMP
DKP-1-P
DMSO
DNA
dNTP
E. coli
EDTA
ESI
EtOH
FG
g
GentR
GFP
Gln
Glu
Gly
GUS
h
HBED
HCN
HCy
His
HKMP-1-P
HPLC
HygR
ICP-OES
Ile
IPTG
K. pneumoniae
KanR
kDa
KLSM
KMTB
LB
LB
LC-MS/MS
Leu
Lys
M
MDE
MES
Met
MEU
mg
min
mm
Cystathionin
4, 6-Diamidin-2-phenylindol
DEHYDRATASE-ENOLASE-PHOSPHATASE-COMPLEX
1,2-Dihydroxy-3-keto-5-methylthiopenten
2,3-Diketo-5-pentenyl-1-phosphat
Dimethylsulfoxid
Desoxyribonukleotidsäure
Desoxynukleosidtriphosphat
Escherichia coli
Ethylendiamintetraessigsäure
Elektrosprayionisation
Ethanol
Frischgesicht
Gramm
Gentamycin-Resistenz
Grün fluoreszierendes Protein
Glutamin
Glutamat
Glycin
β-GLUCURONIDASE
Stunde
Hydroxybenzylethylendiamin
Blausäure
Homocystein
Histidin
2-Hydroxy-3-keto-5-methylpentenyl-1-phosphat
High Pressure Liquid Chromatography
Hygromycin-Resistenz
Induktiv gekoppeltes Plasma – optische Emissionsspektrometrie
Isoleucin
Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid
Klebsiella pneumoniae
Kanamycin-Resistenz
Kilodalton
Konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie
2-Keto-4-methylthiobutyrat
left boarder
lysogeny broth
Flüssigchromatographie mit Massenspektrometrie-Kopplung
Leucin
Lysin
Molar
METHYLTHIORIBULOSE-1-PHOSPHATE DEHYDRATASE
2-(N-Morpholino)ethansulfonsäure
Methionin
METHYLTHIOADENOSINE PHOSPHORYLASE
Milligram
Minute
Millimeter
- 121 -
ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS
MRI
MS
ms
MSMO
MTA
MTI
MTK
MTN
MtnA
MtnB
MtnC
MtnD
MtnK
MtnN
MtnP
MtnW
MtnX
MTR
MTR-1-P
MTRu-1-P
NA
NaAc
NAS
Ncp
ng
nm
nmol
OAS
OAS-TL
oD
PA
PAGE
PCR
PEG
Phe
Pi
PI
pmol
PMSF
POD
PPi
Pro
Put
PVDF
RifR
rpm
s
S. cerevisiae
SAH
METHYLTHIORIBOSE-1-PHOSPHATE ISOMERASE
METHIONIN SYNTHASE
Millisekunde
Murashige & Skoog Minimal Organics
5-Methylthioadenosin
METHYLTHIORIBOSE ISOMERASE
METHYLTHIORIBOSE KINASE
METHYLTHIOADENOSINE NUCLEOSIDASE
Methylthioribose-1-phosphate Isomerase
Methylthioribose-1-phosphate Dehydratase
2,3-Diketo-5-methylthiopentenyl-1-phosphate Enolase-phosphatase
Acidoreductone Dioxygenase
Methylthioribose Kinase
Methylthioadenosine Nucleosidase
Methylthioadenosine Phosphorylase
2,3-Diketo-5-methylthiopentenyl-1-phosphate Enolase
2-Hydroxy-3-keto-5-methylpentenyl-1-phosphat Phosphatase
Methylthioribose
Methylthioribose-1-phosphat
Methylthioribulose-1-phosphat
Nicotianamin
Natriumacetat
NICOTIANAMIN SYNTHASE
N-Carbamoylputrescin
Nanogramm
Nanometer
Nanomol
O-Acetylserin
OAS-(THIO)LYASE
optische Dichte
Polyamine
Polyacrylamidgelelektrophorese
Polymerasekettenreaktion
Polyethylenglykol
Phenylalanin
Monophosphat
Proteaseinhibitor
Pikomol
Phenylmethylsulfonylfluorid
Peroxidase
Bisphosphat
Prolin
Putrescin
Polyvinyidenfluorid
Rifampicin-Resistenz
Umdrehungen pro Minute
Sekunde
Saccharomyces cerevisiae
S-Adenosylhomocystein
- 122 -
ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS
SAM
SAMDC
MAT
SAT
SDS
Ser
SiR
SMM
SOB
Spd
SPDS
Spm
SPMS
SUC
SUC
SULTR
T-DNA
TetR
TG
Thr
Tspm
Tyr
TyrB
UBQ
UPLC
UTR
UV
V
Val
W
Ws
WT
xg
YbgE
YkrV
S-Adenosylmethionin
S-ADENOSYLMETHIONIN DECARBOXYLASE
S-ADENOSYLMETHIONIN SYNTHETASE
SERINE ACETYLTRANSFERASE
Natriumdodecylsulfat
Serin
SULFITE REDUCTASE
S-Methylmethionin
super optimal broth
Spermidin
SPERMIDIN SYNTHASE
Spermin
SPERMINE SYNTHASE
Saccharose
SUCROSE TRANSPORTER
SULFATE TRANSPORTER
Transfer-DNA
Tetrazyklin-Resistenz
Trockengewicht
Threonin
Thermospermin
Tyrosin
Aromatische Aminosäure Aminotransferase
UBIQUITIN
Ultra Performance Liquid Chromatography
ENOLASE-PHOSPHATASE COMPLEX
Ultraviolett
Volt
Valin
Watt
Wassilewskija
Wildtyp
Vielfaches der Erdbeschleunigung
KMTB-Transaminase
KMTB-Transaminase
- 123 -
SUMMARY
8
Summary
8.1
Physiological role of the Yang Cycle in the vascular tissue
The Yang Cycle is a widespread metabolic pathway, which recycles the sulfur containing byproduct 5-methylthioadenosine (MTA) to methionine via several enzymatic reactions. In plants,
MTA is produced during the synthesis of the phytohormon ethylene, the metal ion chelator
nicotianamine and the stress and developmental factors polyamines. Recent studies have
shown that Yang Cycle genes are primarily expressed in the vasculature of rosette leaves in
tale cress (Arabidopsis thaliana) and common plantain (Plantago major). These results were
surprising since the Yang Cycle was mostly viewed as a pathway supporting sustained ethylene
synthesis. However, since ethylene synthesis is not vascular specific, the question of Yang
Cycle function in this tissue emerged. To investigate the physiological function of the Yang
Cycle in the vascular tissue, two newly discovered Yang Cycle genes, 5METHYLTHIORIBOSE ISOMERASE 1 (MTI1) and DEHYDRATASE-ENOLASEPHOSPATASE-COMPLEX 1 (DEP1), were analyzed.
Mutant lines with reduced or abolished MTI1 or DEP1 gene expression were established and
their growth was analyzed on MTA containing medium. Plants without a functional MTI1 or
DEP1 gene were unable to utilize MTA as sulfur source, which proved the contribution of these
genes to the Yang Cycle in Arabidopsis. To analyze the response of mit1 and dep1 mutant
plants to different sulfur concentrations, hydroponic growth experiments were performed.
Whereas growth of mutant plants was indifferent from WT plants on sulfur sufficient conditions,
mti1 and dep1 plants showed increased sensitivity towards sulfur deficiency, displaying
reduced inflorescence growth, strong stress symptoms and reproductive defects resulting in
sterility.
Compared to WT plants, methionine metabolism was reduced in Yang Cycle mutant plants
during sulfur deficiency. Most notably, concentrations of S-adenosylmethionine and the
phloem-localized metabolite S-methylmethionine were strongly reduced in mutant plants.
Promoter-reporter lines were used to analyze MTI1 and DEP1 gene expression in all adult plant
tissues. In addition to the previously reported expression in the vascular bundles of rosette
leaves, expression was found in the vasculature of roots, flowers and siliques. Expression was
also found in tissues with high cell division rate e.g. root meristems, anthers and embryos.
Expression analyzes of genes coding for enzymes involved in nicotianamine or polyamine
biosynthesis also revealed expression in the vasculature, the root meristems and the
reproductive tissues. SUCROSE TRANSPORTER2 (SUC2) promoter driven phloem-specific
expression of MTI1 or DEP1 in the mti1 or dep1 background, could complement the mutant
and restore the WT phenotype. These results indicated, that the sulfur deficiency induced
defects of mti1 and dep1 plants were caused by a phloem-located metabolite.
Analyzes of the sulfur-dependent regulation of nicotianamine and polyamine biosynthesis
showed that both pathways were influenced by the sulfur status. During sulfur deficiency, both
expression of NICOTIANAMIN SYNTHASE (NAS) genes and nicotianamine concentrations
were reduced. However, low nicotianamine concentrations did not influence the iron, zinc and
- 124 -
SUMMARY
copper concentrations and externally applied nicotianamine could not rescue the sulfurdeficiency induced growth defects of Yang Cycle mutants. Expression of SPERMIDIN
SYNTHASE1 (SPDS1) was largely unaffected by the sulfur status but the concentrations of the
polyamines putrescine and spermidine were reduced in the mutant inflorescences during sulfur
deficiency. According to spermine measurements the steady state level in mutant
inflorescences was not significantly different compared to WT plants. However, chemical
complementation experiments revealed spermine deficiency of mti1 and dep1 mutant plants.
In contrast to the external application of putrescine or spermidine, only the application of the
polyamine spermine was able to improve the growth of mti1 and dep1 plants during sulfur
deficiency. Spermine application largely increased inflorescence growth and alleviated stress
symptoms but had little influence on mutant fertility.
Taken together, these results indicate that the Yang Cycle sustains polyamine synthesis in the
phloem of adult Arabidopsis plants. This function becomes increasingly important during
periods of sulfur deficiency, since the recycling of sulfur-containing MTA into methionine/Sadenosylmethionine in the phloem via the Yang Cycle prevents further reduction of
methionine/S-adenosylmethionine pools through polyamine synthesis. Therefore, the Yang
Cycle plays an important role for the growth and development of Arabidopsis during sulfurdeficiency.
8.2
Search for Yang Cycle transaminases in A. thaliana
So far, almost all enzymes of the Yang Cycle are known in Arabidopsis. Only the last step, the
transamination of 4-ketomethylthiobutyrat (KMTB) to methionine, remains elusive. The second
part of this work shows results concerning the identification or Yang Cycle transaminases in
Arabidopsis thaliana. Amino acid sequence comparisons between known Yang Cycle
transaminases from other organisms and Arabidopsis proteins revealed several candidates for
KMTB transaminases. The expression pattern of genes coding for those candidate proteins
was analyzed with promoter-reporter lines and compared with the expression pattern of the
Yang Cycle genes MTI1 and DEP1. Candidate genes with a similar expression pattern to MTI1
and DEP1 were analyzed further. To this end, T-DNA insertion lines were isolated and tested
for their growth on different sulfate sources. Candidate proteins were screened for KMTB
transaminase activity using enzymatic assays. During these analyzes the uncharacterized
gene At1g77670 could be identified as Yang Cycle Transaminase. At1g77670 displayed a
similar expression pattern compared to MTI1 and DEP1 and its protein was able to convert
KMTB to methionine. However, in contrast to mti1 and dep1 mutant plants, the At1g77670 TDNA insertion mutant was still able to utilize MTA as a sulfur source. This indicates that other
Yang Cycle transaminases remain to be discovered.
- 125 -
DANKSAGUNG
9
ANHANG
9.1
Aminosäurekonzentrationen in mti1- und dep1-Infloreszenzen in
Abhängigkeit von der Sulfatkonzentration
- 126 -
DANKSAGUNG
9.2
Hergestellte Gateway®-Zielvektoren
Pac I (14432)
attR1
chloramphenicol resistance
Ori
BAR
ccdB
attR2
T-DNA RB
LB
BAR
T-DNA RB
Kan R
NOS terminator
mgfp6
Kpn I (1402)
BAR
nos terminator
Ori
Sbf I (11645)
T-DNA LB
colE1
TET(R)
NOS terminator
XhoI (12481)
pSa
nos terminator
pBasta- GFP
pBas ta- GU S
15697 bp
14436 bp
RB
Kan(R)
HPT
pSUC2- dest+hpt
10002 bp
gusA
TET(R)
Kpn I (3000)
attR2
t35S
ccdB
attR2
chloramphenicol resistance
AtSUC2p
ccdB
attR1
Kan(R)
CaM
XhoI (8446)
AtSUC2 5' UTR
T-DNA LB
9.3
Arabidopsis-Genloci
Tabelle 24: Arabidopsis-Genloci
Abkürzung Genlokus
Name
AAT
ASPARTATE AMINOTRANSFERASE
At2g22250
ACL5
ACAULIS 5
At5g19530
ACS1
At3g61510
ACC SYNTHASE 1
ACS11
At4g08040
ACC SYNTHASE 11
ACS2
At1g01480
ACC SYNTHASE 2
ACS4
At2g22810
ACC SYNTHASE 4
ACS5
At5g65800
ACC SYNTHASE 5
ACS6
At4g11280
ACC SYNTHASE 6
ACS7
At4g26200
ACC SYNTHASE 7
ACS8
At4g37770
ACC SYNTHASE 8
ACS9
At3g49700
ACC SYNTHASE 9
ACT2
At3g18780
ACTIN 2
ADC1
At2g16500
ARGININE DECARBOXYLASE 1
AGD2
ABERRANT GROWTH AND DEATH 2
At4g33680
AIH
At5g08170
AGMATINE IMINOHYDROLASE
ALD1
AGD2-LIKE DEFENSE RESPONSE PROTEIN 1
At2g13810
APR3
APS REDUCTASE 3
At4g21990
ARD1
ACIDOREDUCTONE DIOXYGENASE 1
At4g14716
ARD2
ACIDOREDUCTONE DIOXYGENASE 2
At4g14710
ARD3
ACIDOREDUCTONE DIOXYGENASE 3
At2g26400
ARD4
ACIDOREDUCTONE DIOXYGENASE 4
At5g43850
ASP1
ASPARTATE AMINOTRANSFERASE 1
At2g30970
ASP2
ASPARTATE AMINOTRANSFERASE 2
At5g19550
ASP3
ASPARTATE AMINOTRANSFERASE 3
At5g11520
ASP4
ASPARTATE AMINOTRANSFERASE 4
At1g62800
ASP5
ASPARTATE AMINOTRANSFERASE 5
At4g31990
BCAT1
BRANCHED-CHAIN AMINO ACID TRANSFERASE 1
At1g10060
BCAT2
BRANCHED-CHAIN AMINO ACID TRANSFERASE 2
At1g10070
BCAT3
BRANCHED-CHAIN AMINO ACID TRANSFERASE 3
At3g49680
BCAT4
BRANCHED-CHAIN AMINO ACID TRANSFERASE 4
At3g19710
BCAT5
BRANCHED-CHAIN AMINO ACID TRANSFERASE 5
At5g65780
BCAT6
BRANCHED-CHAIN AMINO ACID TRANSFERASE 6
At1g50110
- 127 -
attR1
DANKSAGUNG
BCAT7
BUD2
CAM2
CPA
DEP1
MAT1
MAT2
MAT3
MAT4
MTI1
MTK
MTN1
MTN2
NAS1
NAS2
NAS3
NAS4
UBQ10
SAMDC1
SAMDC2
SAMDC3
SAMDC4
SPDS1
SPDS2
SPMS
SUC2
SULTR1;1
SULTR1;2
SULTR1;3
SULTR2;1
SULTR3;1
SULTR3;5
SULTR4;1
SULTR4;2
TAT7
TOM7-2
VAS1
---------
At1g50090
At5g18930
At2g41110
At2g27450
At5g53850
At1g02500
At4g01850
At2g36880
At3g17390
At2g05830
At1g49820
At4g38800
At4g34840
At5g04950
At5g56080
At1g09240
At1g56430
At4g05320
At3g02470
At5g15950
At3g25570
At5g18930
At1g23820
At1g70310
At5g53120
At1g22710
At4g08620
At1g78000
At1g22150
At5g10180
At3g51895
At5g19600
At5g13550
At3g12520
At5g53970
At1g64220
At1g80360
At1g77670
At3g05190
At5g27410
At5g36160
BRANCHED-CHAIN AMINO ACID TRANSFERASE 7
BUSHY AND DWARF 2
CALMODULIN 2
CARBAMOYLPUTRESCINE AMINOHYDROLASE
DEHYDRATASE-ENOLASE-PHOSPHATASE-COMPLEX 1
S-ADENOSYLMETHIONINE SYNTHETASE 1
S-ADENOSYLMETHIONINE SYNTHETASE 2
S-ADENOSYLMETHIONINE SYNTHETASE 3
S-ADENOSYLMETHIONINE SYNTHETASE 4
5-METHYLTHIORIBOSE ISOMERASE 1
5-METHYLTHIORIBOSE KINASE
5-METHYLTHIOADENOSINE NUCLEOSIDASE 1
5-METHYLTHIOADENOSINE NUCLEOSIDASE 1
NICOTIANAMINE SYNTHASE 1
NICOTIANAMINE SYNTHASE 2
NICOTIANAMINE SYNTHASE 3
NICOTIANAMINE SYNTHASE 4
POLYUBIQUITIN 10
S-ADENOSYLMETHIONINE DECARBOXYLASE 1
S-ADENOSYLMETHIONINE DECARBOXYLASE 2
S-ADENOSYLMETHIONINE DECARBOXYLASE 3
S-ADENOSYLMETHIONINE DECARBOXYLASE 4
SPERMIDINE SYNTHASE 1
SPERMIDINE SYNTHASE 2
SPERMINE SYNTHASE
SUCROSE TRANSPORTER 2
SULFATE TRANSPORTER 1;1
SULFATE TRANSPORTER 1;2
SULFATE TRANSPORTER 1;3
SULFATE TRANSPORTER 2;1
SULFATE TRANSPORTER 3;1
SULFATE TRANSPORTER 3;5
SULFATE TRANSPORTER 4;1
SULFATE TRANSPORTER 4;2
TYROSINE AMINOTRANSFERASE 7
TRANSLOCASE OF OUTER MEMBRANE 7 KDA SUBUNIT 2
REVERSAL OF SAV3 PHENOTYPE 1
Pyridoxal phosphate-dependent superfamily protein
D-aminoacid aminotransferase-like PLP-dependent enzyme
D-aminoacid aminotransferase-like PLP-dependent enzyme
L-tyrosine aminotransferase
- 128 -

1:1 Zuordnungsaufgaben

ABB Kaufel Neuer Gebietsverkaufsleiter

Wurzeln

Stellung gehalten

PDF downloaden

ABB Selfie-Wettbewerb Teilnahmebedingungen

WLAN-Verbindung einschalten und zwischen WLAN

Pressemitteilung

5.2 Eindampfung und Verdampfung