Abstract

DISS. ETH NO. 22501
Total Synthesis and SAR Investigations of Natural Products Inhibiting
Bacterial RNA Polymerase:
Ripostatin B and Tiacumicin B
A thesis submitted to attain the degree of
DOCTOR OF SCIENCES of ETH ZURICH
(Dr. sc. ETH Zurich)
Presented by
Florian David Glaus
MSc ETH Zurich
Born on January 3rd, 1985
Bitizen of Benken SG, Switzerland
Accepted on the recommendation of
Prof. Dr. Karl-Heinz Altmann, examiner
Prof. Dr. Erick M. Carreira, co-examiner
2015
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Abstract
Bacterial RNA polymerase (RNAP) is an attractive target for broad-spectrum
antibacterial drug discovery because it is an essential enzyme which is highly
conserved among bacteria, but, at the same time, differs significantly from RNA
polymerases of eukaryotic origin. The relevance of bacterial RNAP for antibacterial
therapy was established in the 1960s by the market introduction of the rifamycin
antibiotics. These have proven to be particularly important for the treatment of
tuberculosis, a disease which an estimated nine million people developed in 2013
alone. However, the number of rifamycin-resistant bacterial strains has increased
during the last ten years, thus threatening the clinical utility of this class of antibiotics
and creating an urgent need for the search and development of new inhibitors of
RNAP that do not exhibit cross-resistance with rifamycin antibiotics. In 2011, at the
outset of this PhD project, the rifamycins were still the only approved class of RNAP
inhibitors.
Ripostatins A (I) and B (II) (Figure A1) are 14-membered macrolides that were
first isolated in 1995 from the myxobacterium Sorangium cellulosum. Ripostatins
inhibit bacterial RNA polymerase by a different mode of action than rifamycin-type
inhibitors. As a result, the degree of cross-resistance between these two classes of
antitiotics is very limited. At the outset of this PhD project, no total synthesis of either
ripostatin had been reported in the literature. Furthermore, no inhibitory data against
Mycobacterium tuberculosis (Mtb) was available and no detailed structure-activity
relationship (SAR) studies had been carried out. Hence, with the goal to provide a
basis for SAR studies with a focus on Mtb, we embarked on the total synthesis of
ripostatin B (II), the chemically more stable variant among the two natural products.
Figure A1: Structures of ripostatins A(I) and B (II).
The advanced stages of the total synthesis of ripostatin B (II) are outlined in
Scheme A1. A Paterson aldol reaction between aldehyde III, which was synthesized
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in eleven steps from
D-aspartic
acid, and ketone IV, available in three steps from
phenylacetaldehyde, gave β-hydroxy ketone V (62% yield, >10:1 dr). The C15
stereocenter was then set in high yield (93%) and selectivity (>20:1 dr) by an EvansTishchenko reduction. After protection and reduction, the resulting alcohol VI was
esterified with acid VII employing a low-temperature Yamaguchi protocol. This
reaction failed to produce synthetically useful yields under a variety of other
conditions. Macrocyclization was effected by treatment of VIII with Grubbs-I
catalyst, affording IX in 78% yield as a single isomer. The elaboration of the RCM
product into II involved selective removal of the primary TBS group, one-pot
oxidation of the ensuing hydroxyl group to the corresponding acid functionality and
global deprotection. Ripostatin B (II) was synthesized in 21 steps for the longest
linear sequence from D-aspartic acid.
Scheme A1: Fragment assembly toward ripostatin B (II).
Using the same overall strategy, a total of seven ripostatin B analogs were
synthesized (Figure A2). Unfortunately, neither the natural product itself nor any of
these analogs exhibited significant activity against Mtb (MIC ≥ 50 μg/mL in all cases).
The activity of II against Mtb was not improved in presence of efflux inhibitors;
furthermore, a permeability impaired strain of Mtb (H37RvΔphoP) was also not
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susceptible toward II. Similar to Mtb, a range of other investigated bacteria were not
sensitive to II, with the exception of the efflux-impaired E. coli ΔtolC strain JW5503-1.
SAR studies in this latter strain revealed that modifications of the C3 side chain, i.e.
reduction of the carboxyl group to the alcohol stage (X), one-carbon homologation
(XI) as well as the introduction of a terminal methyl carbamate moiety (XII) are
tolerated well. Likewise, the C2–C3 double bond is not required for activity ((3R)XIII and (3S)-XIII). The phenyl ring, on the other hand, was found to be crucial for
activity, as truncation of the C15 side chain (analogs XIVa and XIVb) led to
considerably higher MIC values. The most active analog was X, which was about
eight-fold more potent than the parent natural product.
Figure A2: Structures of synthesized ripostatin B derivatives and of ripostatin B (II) as well as
MIC values against E. coli ΔtolC (strain JW5503-1).
In light of the unsatisfactory biological results obtained with ripostatin B-type
structures, we turned our attention toward another inhibitor of bacterial RNA
polymerase, namely tiacumicin B (XV) (Figure A3). This natural product, first
isolated in 1975 from Actinoplanes deccanensis, is highly potent against a range of
Gram-positive bacteria and also against Mtb, without being susceptible to crossresistance with rifamycin antibiotics. However, XV is only minimally absorbed from
the gastrointestinal tract, which strongly limits its utility for the treatment of
tuberculosis and of other systemic infections. Thus, to provide a basis for SAR
studies with tiacumicin B-type structures, we embarked on the synthesis of the
tiacumicin B aglycone (XVI).
At the outset of this PhD project, no total synthesis of XV or its aglycone XVI had
been reported in the literature. Furthermore, the isolation of XVI from fermentation
broths or a protocol enabling the semisynthesis of XVI from the parent natural
product had not been described.
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Figure A3: Structures of tiacumicin B and of the aglycone thereof.
The synthesis of XVI is outlined in Scheme A2. The sequence started from known
allylic alcohol XVII, which was elaborated into aldehyde XIX. The latter was then
transformed into enal XXI by a newly developed variant of the Corey-Peterson
olefination reaction, which employed thiophenol rather than the commonly used
trifluoroacetic acid for the (Z) to (E) isomerization of the mixture of aldimines
obtained upon addition of XX to XIX. Notably, these conditions allowed the one-pot
conversion of XIX into XXI in 81% yield. After installation of the C7 stereocenter
using Leighton’s strained silacycle XXII and protection of the ensuing hydroxyl
group, olefin XXIII was coupled with diene XXIV by means of a cross metathesis
reaction. After saponification of the methyl ester in the metathesis product, the
ensuing carboxylic acid XXV was esterified with alcohol XXVI employing a
Yamaguchi protocol. The macrocycle was closed by means of a TlOEt-promoted
Suzuki reaction, which was usually complete in less than 30 minutes and afforded
the product in 73% yield. Depending on the exact reaction conditions, final
deprotection with NEt3·3HF as the reagent afforded then either fully deprotected
aglycone XVI or partially protected versions thereof, which allow the synthesis of
tiacumicin analogs. Aglycone XVI was obtained in 13 linear steps from alcohol XVII.
Interestingly, XVI was (almost) inactive against RNAP from different sources,
indicating that the sugar moieties are crucial for activity.
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Scheme A2: Total Synthesis of the tiacumicin B aglycone (XVI).
Zusammenfassung
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Zusammenfassung
Die bakterielle RNA-Polymerase (RNAP) ist ein attraktives Zielprotein für die
Entwicklung
neuer
Breitbandantibiotika,
da
sie
einerseits
bei
Bakterien
hochkonserviert ist, sich jedoch andererseits deutlich von eukaryotischen Varianten
unterscheidet. Die Relevanz der bakteriellen RNAP für die antibakterielle Therapie
wurde in den 1960er-Jahren mit der Markteinführung der Rifamycin-Antibiotika
demonstriert. Es zeigte sich, dass die Rifamycine besonders zur Bekämpfung der
Tuberkulose geeignet sind, an welcher allein im Jahr 2013 ungefähr neun Millionen
Menschen erkrankten. Da die Zahl der Rifamycin-resistenten Bakterienstämme in
den letzten zehn Jahren jedoch stark zugenommen hat, ist die klinische Relevanz
dieser Antibiotikaklasse stark gefährdet. Dies macht die Erforschung und
Entwicklung neuer RNAP-Hemmer, welche keine Kreuzresistenzen mit den
Rifamycinen aufweisen, dringend nötig. Zum Zeitpunkt des Beginns dieser
Doktorarbeit im Jahr 2011 stellten die Rifamycine noch immer die einzige für
klinische Anwendungen zugelassene Klasse von RNAP-Hemmern dar.
Die Ripostatine A (I) und B (II) (Abbildung Z1) sind 14-gliedrige Makrolide,
welche erstmals im Jahr 1995 aus dem Myxobakterium Sorangium cellulosum isoliert
wurden.
Die
Ripostatine
hemmen
die
bakterielle
RNAP
über
einen
Wirkmechanismus, welcher sich fundamental von demjenigen der Antibiotika vom
Rifamycin-Typ unterscheidet. Es bestehen deshalb kaum Kreuzresistenzen zwischen
diesen beiden Antibiotikaklassen. Am Beginn dieser Dissertation waren weder
Totalsynthesen der Ripostatine in der Literatur beschrieben, noch waren Daten zur
Hemmung von Mycobacterium tuberulosis (Mtb) durch die Ripostatine oder
detaillierte SAR-Studien mit den Ripostatinen bekannt. Mit dem Ziel eine Grundlage
für SAR-Studien, mit einem Fokus auf Mtb, zu schaffen, haben wir deshalb die
Totalsynthese von Ripostatin B (II), welches sich gegenüber Ripostatin A (I) durch
eine höhere chemische Stabilität auszeichnet, in Angriff genommen.
Abbildung Z1: Strukturen der Ripostatine A (I) und B (II).
Zusammenfassung
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Die fortgeschrittenen Phasen der Totalsynthese von II sind in Schema Z1
dargelegt. Der Aldehyd III, welcher in elf Stufen ausgehend von D-Asparaginsäure
synthetisiert wurde, und Keton IV, zugänglich in drei Stufen ausgehend von
Phenylacetaldehyd, wurden mittels einer Paterson Aldolreaktion verknüpft. Die
Reaktion lieferte β-Hydroxyketon V in moderater Ausbeute (62%), aber hoher
Diastereoselektivität (>10:1 dr). Die Reduktion von V unter Evans-Tishchenko
Bedingungen ermöglichte dann den Aufbau des C15-Stereozentrums mit hoher
Ausbeute (93%) und ausgezeichneter Selektivität (>20:1 dr). Mittels eines Reduktionsund eines Schützungsschrittes wurde dann der Alkohol VI erhalten, welcher unter
Anwendung einer Tieftemperaturvariante der Yamaguchi-Reaktion mit Säure VII
verestert
wurde.
Hierbei
gilt
es
zu
erwähnen,
dass
diverse
andere
Veresterungsmethoden nicht das gewünschte Produkt lieferten.
Schema Z1: Totalsynthese von Ripostatin B (II);Verknüpfung der Fragmente.
Der Makrozyklus wurde ausgehend von VIII mittels einer Ringschlussmetathese
geschlossen (Schema Z1). Dazu wurde der Grubbs-I Katalysator verwendet,
wodurch IX als ein einziges Isomer in 78% Ausbeute erhalten wurde. Die
Überführung des RCM-Produktes IX in Ripostatin B (II) erfolgte dann über die
selektive Entfernung der primären TBS-Gruppe, die Eintopf-Oxidation der daraus
hervorgegangenen Hydroxylgruppe zur entsprechenden Carbonsäurefunktionalität
Zusammenfassung
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und der Entschützung der beiden verbliebenen Hydroxylgruppen. Ripostatin B (II)
konnte somit ausgehend von
D-Asparaginsäure
in einer längsten linearen Sequenz
von 21 Stufen synthetisiert werden.
Unter Verwendung derselben Gesamtstrategie wurden insgesamt sieben
Ripostatin B-Derivate synthetisiert (Abbildung Z2). Es stellte sich jedoch heraus, dass
weder der Naturstoff selbst noch eines der Analoga eine signifikante Aktivität gegen
Mtb aufweist (MIC >50 μg/mL für alle Verbindungen). Die Gegenwart von EffluxHemmern hatte dabei keinen Einfluss auf die MIC-Werte von II gegen Mtb und auch
ein hyperpermeabler Mtb-Stamm (H37RvΔphoP) erwies sich II gegenüber als
unempfindlich. Des Weiteren konnte auch gegen eine Reihe von anderen Bakterien
keine nennenswerte Aktivität von II festgestellt werden. Eine Ausnahme bildete
hierbei der in seinem Efflux-Verhalten beeinträchtigte E. coli-Stamm ΔtolC JW5503-1.
SAR-Studien mit diesem Stamm zeigten, dass Modifikationen der C3-Seitenkette,
d.h. die Reduktion der Carbonsäurefunktionalität zur Hydroxylgruppe (X), die
Verlängerung der Seitenkette um eine Methylengruppe (XI) sowie die Einführung
einer Methylcarbamatgruppierung (XII), gut toleriert werden (Abbildung Z2).
Ebenfalls konnte demonstriert werden, dass die C2–C3 Doppelbindung für die
Aktivität nicht Relevant ist ((3R)-XIII und (3S)-XIII). Im Gegensatz dazu lieferte die
Verkürzung der C15-Seitenkette Derivate (XIVa und XIVb), welche massiv höhere
MIC-Werte aufwiesen als der Naturstoff, d.h. der Phenylring scheint von grosser
Wichtigkeit für die Aktivität der Ripostatine zu sein. Die potenteste Verbindung, X,
wies einen rund achtfach tieferen MIC-Wert auf als Ripostatin B (II).
Abbildung Z2: Strukturen der synthetisierten Ripostatin B-Derivate und von Ripostatin B (II),
sowie MIC-Werte gegen E. coli ΔtolC (strain JW5503-1).
Angesichts der unbefriedigenden biologischen Resultate, welche mit den
Ripostatinen erhalten wurden, haben wir uns in einem zweiten Teil dieser
Doktorarbeit einem anderen Hemmer der bakteriellen RNAP, nämlich Tiacumicin B
Zusammenfassung
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(XV), zugewandt. Dieser Naturstoff, der erstmals im Jahr 1975 aus Actinoplanes
deccanensis isoliert wurde, ist wirksam gegen verschiedene Gram-positive Bakterien
sowie gegen Mtb, ohne dabei Kreuzresistenzen mit Rifamycin-Antibiotika
aufzuweisen. Infolge seiner geringen oralen Bioverfügbarkeit ist XV jedoch nicht zur
Behandlung der Tuberkulose und anderen systemischen Infektionen geeignet. Mit
dem Ziel eine Grundlage für nachfolgende SAR-Studien zu schaffen, haben wir
deshalb die Synthese des Tiacumicin B-Aglykons (XVI; Abbildung Z3) in Angriff
genommen.
Abbildung Z3: Strukturen von Tiacumicin B (XV) und des Tiacumicin B-Aglykons (XVI).
Bei Beginn dieser Dissertation waren weder eine Totalsynthese von XV noch des
Aglykons XVI publiziert. Zudem war keine Methode für die semisynthetische
Überführung des Naturstoffs XV in das Aglykon XVI bekannt und auch die Isolation
von XVI aus Fermentationsbrühen war nicht beschrieben.
Unsere Synthese ist in Schema Z2 dargelegt. Die Sequenz startete mit der
Herstellung des Aldehyden XIX ausgehend vom allylischen Alkohol XVII. Der
Aldehyd XIX wurde anschliessend mittels einer neuentwickelten Variante der CoreyPeterson Olefinierung in Enal XXI überführt. Diese Variante beinhaltete die
Verwendung von Thiophenol anstatt der gemeinhin verwendeten Trifluoressigsäure
für die (Z) zu (E) Isomerisierung des durch Addition von XX an XIX und
anschliessende Eliminierung entstandenen Aldimin-Gemisches. Die Reaktion konnte
im Eintopfverfahren durchgeführt werden, was XXI in einer guten Ausbeute von
81% lieferte.
Zusammenfassung
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Schema Z2: Totalsynthese des Tiacumicin B-Aglykons (XVI).
Nach der Einführung des C7-Stereozentrums mittels einer Leighton-Allylierung
und anschliessender Schützung der dabei entstandenen Hydroxylgruppe wurde
Olefin XXIII mittels einer Kreuzmetathese mit Dien XXIV verknüpft (Schema Z2).
Anschliessend wurde die Estergruppe im Metatheseprodukt verseift und die so
erhaltene Carbonsäure XXV wurde unter Anwendung eines Yamaguchi-Protokolls
mit Alkohol XXVI verestert. Der Ringschluss zum Makrozyklus wurde mittels einer
TlOEt-vermittelten Suzuki-Kreuzkupplung herbeigeführt, welche in weniger als 30
Minuten vollständig ablief und das gewünschte Produkt in 73% Ausbeute lieferte. In
Abhängigkeit von den exakten Reaktionsbedingungen lieferte die Entschützung mit
NEt3·3HF entweder das vollständig entschützte Aglykon XVI, oder teilweise
entschützte Varianten. Letztere erlauben die Synthese von Tiacumicin B-Derivaten.
Das Aglykon XVI wurde, ausgehend von XVII, in 13 linearen Schritten synthetisiert.
Das Aglykon XVI war (praktisch) inaktiv gegen die RNAP verschiedener
Bakterien. Dies beweist, dass die Zucker entscheidend für die biologische Aktivität
sind.

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