Elektrooptische on line Bestimmung der Zellvitalität in Biogasprozessen Erich Kielhorn; 1. Hammer Bioenergietage; Hamm; 21.Juli 2015 © TU Berlin, FG Bioverfahrenstechnik - vertraulich Motivation o Während die prozesstechnischen Schritte innerhalb der industriellen Biogasproduktion vergleichsweise gut untersucht sind, ist wenig über den physiologischen Zustand der Mikroorganismen unter Produktionsbedingungen bekannt. o Veränderungen/Störungen im Prozess finden aber zuerst in der Zelle statt, bevor Auswirkungen in den Prozessparametern sichtbar werden. o Dies ist umso bedeutender, wenn die Fahrweise einer Anlage flexibel hinsichtlich der Substratzusammensetzung und –menge sein soll. Eine Bewertung des physiologischen Zustands der Zellen kann wertvolle Hinweise zur Identifizierung geeigneter, stabiler Betriebspunkte liefern. 2 Erich Kielhorn; 1. Hammer Bioenergietage; Hamm; 21.Juli 2015 © TU Berlin, FG Bioverfahrenstechnik - vertraulich Motivation Es ist bisher keine Methode verfügbar, die on line die Vitalität von Zellen bewerten kann. Ist die Methode der elektrooptischen Messung der induzierbaren Polarisierbarkeit von Zellen dazu geeignet? Quantifizierung des Transmembranpotentials länglicher Zellen bei unterschiedlichen Frequenzen Bestimmung ohne Färbemethoden, damit die Probe schnell und automatisiert untersucht werden kann Die Methode liefert einen Durchschnittswert aller betrachtbaren Zellen 3 Erich Kielhorn; 1. Hammer Bioenergietage; Hamm; 21.Juli 2015 © TU Berlin, FG Bioverfahrenstechnik - vertraulich Messmethoden Zellphysiologie Flusszytometrie 3-D HolographieMikroskopie Elektrooptische Messung 4 Erich Kielhorn; 1. Hammer Bioenergietage; Hamm; 21.Juli 2015 © TU Berlin, FG Bioverfahrenstechnik - vertraulich Messmethoden Zellphysiologie Flusszytometrie 3-D HolographieMikroskopie Elektrooptische Messung 5 Erich Kielhorn; 1. Hammer Bioenergietage; Hamm; 21.Juli 2015 © TU Berlin, FG Bioverfahrenstechnik - vertraulich Flusszytometrie - Probenvorbehandlung Probenaufarbeitung für die Durchflusszytometrie von Biogasproben Fixation Detergenzien Konz. Homogenisierung Zentrifugation Formaldehyd 3,7% /EtOH 50% BaCl2 5 mM Ultraschall Leistung Dauer Impulse/s G-Zahl Dauer Phase Paraformaldehyd 2% Bromhexinhydrochlorid 0,2 % 40-65W 60s 5 3200g 10min Pellet Natrium Azid 10% 15-35W 30s 5 8000g 20min Pellet Natrium Hexametaphosphat 0,2-0,5 % Vortex 10s 650g 2minÜberst. Natrium Pyrophosphat 0,2% NiCl2 5-15 mM Triton X-100 10-20 µg/L Tween 5-25 µg/L Tween 20 0,41 mM Tween 21 4,1 mM Tween+Flokkulationsreagenz 25 µg/L Zitronensäure 0,11 M Referenz: Nettmann (ATB); Günther, Koch (UFZ) Vorteil: Im Bereich der mikrobiellen Reinkultur bereits etablierte Methode. Nachteil: Großer Anteil händischer Probenvorbereitung - können da Einflüsse der Probenbehandlung noch quantifiziert werden? 6 Erich Kielhorn; 1. Hammer Bioenergietage; Hamm; 21.Juli 2015 © TU Berlin, FG Bioverfahrenstechnik - vertraulich Messmethoden Zellphysiologie Flusszytometrie 3-D HolographieMikroskopie Elektrooptische Messung 7 Erich Kielhorn; 1. Hammer Bioenergietage; Hamm; 21.Juli 2015 © TU Berlin, FG Bioverfahrenstechnik - vertraulich Polarisierbarkeit – Hintergrund Membran = dielektrische Schicht Cytoplasma = Leitfähiger Kern Membran = dielektrische Schicht Spannungsabhängige Ionenkanäle Anwendungen: Elektroporation, Dekontamination, Biofouling-Vorbeugung 8 Erich Kielhorn; 1. Hammer Bioenergietage; Hamm; 21.Juli 2015 © TU Berlin, FG Bioverfahrenstechnik - vertraulich Polarisierbarkeit – Einfluss elektrischer Felder auf mikrobielle Membranen Werden Mikroorganismen einem elektrischen Feld ausgesetzt, ändert sich das Transmembranpotential Wenn Mikroorganismen elektrischen Impulsen im Bereich kleiner Wellenlängen ausgesetzt sind, wird dadurch die Spannung an der äußeren Seite der Ionenkanäle beeinflusst. Elektrisches Ungleichgewicht an der Zellaußenseite Metabolische Aktivität hängt u.A. von den Transportprozessen durch die Membran ab Quelle: http://courses.cm.utexas.edu 9 Erich Kielhorn; 1. Hammer Bioenergietage; Hamm; 21.Juli 2015 © TU Berlin, FG Bioverfahrenstechnik - vertraulich Polarisierbarkeit – Hintergrund 10 Erich Kielhorn; 1. Hammer Bioenergietage; Hamm; 21.Juli 2015 © TU Berlin, FG Bioverfahrenstechnik - vertraulich Polarisierbarkeit – Hintergrund 11 Erich Kielhorn; 1. Hammer Bioenergietage; Hamm; 21.Juli 2015 © TU Berlin, FG Bioverfahrenstechnik - vertraulich Elektrooptische Messung – EloTrace 12 Erich Kielhorn; 1. Hammer Bioenergietage; Hamm; 21.Juli 2015 © TU Berlin, FG Bioverfahrenstechnik - vertraulich Elektrooptische Messung – EloTrace 13 Erich Kielhorn; 1. Hammer Bioenergietage; Hamm; 21.Juli 2015 © TU Berlin, FG Bioverfahrenstechnik - vertraulich Elektrooptische Messung – Clostridium acetobutylicum Lösemittel Polarisierbarkeit [Fm²] Säuren Lösemittelkonz. [mmol/gTM] Säurekonz. [mmol/gTM] AcetonButanolEthanol Batch Fermentation Syntheseraten von Säuren können mit der Methodik abgeleitet werden Maß für die Stoffwechselaktivität 14 Junne et al, Biotechnology and Bioengineering, 2008 Erich Kielhorn; 1. Hammer Bioenergietage; Hamm; 21.Juli 2015 © TU Berlin, FG Bioverfahrenstechnik - vertraulich Messung der Polarisierbarkeit – Herausforderungen bei der Messung in Biogasprobenmatrizes: • Fasern und grobe Partikel müssen aussortiert werden • Repräsentation der mikrobiellen Zusammensetzung dann noch gegeben? • Wie hoch ist die Reproduzierbarkeit der Messungen bei der halbautomatischen Probenvorbehandlung? • Nur ein Teil der Mikroorganismen werden gemessen – sind aufgrund dieser Daten relevante Rückschlüsse auf den Prozess möglich? 15 Erich Kielhorn; 1. Hammer Bioenergietage; Hamm; 21.Juli 2015 © TU Berlin, FG Bioverfahrenstechnik - vertraulich Probenvorbereitung – Messung der Partikelgröße zur Optimierung absolute Anzahl Ziel: Separation von lebenden Zellen und restlichem biogenen Material Partikelgröße in Biogasproben gemessen mit Laserlicht-Rückreflexion (BioCell Analyzer, S+E Sequip GmbH) Partikelgröße [µm] Filtrat nach Filtrierung mit 45 µm-Membranfilter 16 Erich Kielhorn; 1. Hammer Bioenergietage; Hamm; 21.Juli 2015 © TU Berlin, FG Bioverfahrenstechnik - vertraulich Probenvorbereitung – für elektrooptische Messungen Zentrifugation 500xg entfernt Partikel >10 µm absolute Anzahl Zentrifugat Relevante Partikelgröße für die Messung von Bakterienzellen Herausforderung: Integration in die halbautomatische Probenvorbereitung. absolute Anzahl Partikelgröße [µm] Pellet Partikelgröße [µm] 17 Erich Kielhorn; 1. Hammer Bioenergietage; Hamm; 21.Juli 2015 © TU Berlin, FG Bioverfahrenstechnik - vertraulich Zellstatus-Monitoring o Batch-Vergärung über 30 Tage nach VDI-Richtlinie: VDI 4630 Vergärung organischer Stoffe o 300g Inokulum + 2g Maisstärke • Batch 1: Inokulum: Klärschlamm • Batch 2: Inokulum: NaWaRo-Anlage Versuchsapparatur nach DIN 38414-8, Quelle VDI Richtlinie VDI 4639 18 Erich Kielhorn; 1. Hammer Bioenergietage; Hamm; 21.Juli 2015 © TU Berlin, FG Bioverfahrenstechnik - vertraulich Zellstatus-Monitoring – Batch-Versuche Inokulum: Klärschlamm 0.5 FOS/TAC Methanproduktion 300 0.4 200 0.3 100 0.2 0 0.1 FOS/TAC Methanproduktion [ml/d] 400 0.0 0 5 10 15 20 25 30 35 Zeit [d] Versuchsdauer [Tag] 19 Erich Kielhorn; 1. Hammer Bioenergietage; Hamm; 21.Juli 2015 © TU Berlin, FG Bioverfahrenstechnik - vertraulich Zellstatus-Monitoring – Batch-Versuche Inokulum: NaWaRo-Anlage 350 0.5 FOS/TAC Methane production 0.4 250 200 0.3 150 0.2 100 50 FOS/TAC Methanproduction [ml/d] 300 0.1 0 0.0 0 5 10 15 20 25 30 35 Versuchsdauer Zeit [d] [Tag] 20 Erich Kielhorn; 1. Hammer Bioenergietage; Hamm; 21.Juli 2015 © TU Berlin, FG Bioverfahrenstechnik - vertraulich Zellstatus-Monitoring – Zusammenhang Methanbildungsrate und Polarisierbarkeit Inokulum: Klärschlamm 21 Erich Kielhorn; 1. Hammer Bioenergietage; Hamm; 21.Juli 2015 © TU Berlin, FG Bioverfahrenstechnik - vertraulich Zellstatus-Monitoring – Zusammenhang Methanbildungsrate und Polarisierbarkeit Inokulum: NaWaRo-Anlage 22 Erich Kielhorn; 1. Hammer Bioenergietage; Hamm; 21.Juli 2015 © TU Berlin, FG Bioverfahrenstechnik - vertraulich Gasproduktion [NmL*h-1] Zellstatus-Monitoring – Parallele Batch-Gärtests Versuchsdauer [d] 23 Erich Kielhorn; 1. Hammer Bioenergietage; Hamm; 21.Juli 2015 © TU Berlin, FG Bioverfahrenstechnik - vertraulich Essigsäure [g/L] Zellstatus-Monitoring – Parallele Batch-Gärtests Versuchsdauer [d] 24 Erich Kielhorn; 1. Hammer Bioenergietage; Hamm; 21.Juli 2015 © TU Berlin, FG Bioverfahrenstechnik - vertraulich Zusammenfassung & Ausblick Die elektrooptische Messung mit Proben aus einem Laborbioreaktor ist für Substrate mit einem hohen Anteil an nachwachsenden Rohstoffen durchgeführt worden. Die Anwendung konnte in Biogasprozessen im Labormaßstab erfolgreich angewendet werden, eine multivariate Datenanalyse wird derzeit durchgeführt Die elektrooptische Messmethode liefert eine Aussage über die Stoffwechselaktivität von Zellen in Biogasproben Die Probenaufbereitung zur elektrooptischen Messung wird weiter optimiert und automatisiert. Eine Anwendung in industriellen Prozessen wird vorbereitet. Wie viel früher kann eine Veränderung des Zellzustandes detektiert werden? 25 Erich Kielhorn; 1. Hammer Bioenergietage; Hamm; 21.Juli 2015 © TU Berlin, FG Bioverfahrenstechnik - vertraulich GEFÖRDERT VON: Johanna Koserske Peter Neubauer Stefan Junne Boris Habermann Alexander Angersbach Emma Ritzi Jörn Beheim-Schwarzbach KOORDINIERT DURCH: Torsten Unmack Vincent Pelenc © TU Berlin, FG Bioverfahrenstechnik - vertraulich noch FRAGEN ? 27 © TU Berlin, FG Bioverfahrenstechnik - vertraulich Zellgrößenbestimmung mit dem BIO Cell Analyser „IPAS“ (BCA) Laser light beam reflection-based method for analyzing the single-cell particle size distribution in situ Autofocus area with an adjustable length of 125 µm Light transmission via a glasfiber for wavelengths between 660 and 780 nm Erfahrung in der Anwendung in Reinkulturen Methode zur Bewertung der Probenvorbereitung Page 28 © TU Berlin, FG Bioverfahrenstechnik - vertraulich
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