Reaktive Sauerstoffspezies und deren Metabolit als Targets für neue analgetische Substanzen (D-4F Peptid und E06 mAb) im Entzündungsschmerz B. Oehler1,2, J. Kloka1,2, M. Mohammadi1, N. Roewer1, R. Blum2, A. Brack1 und H. Rittner1 1 Klinik und Poliklinik für 2 Anästhesiologie, Institut für Neurobiologie, Universitätsklinikum Würzburg Fragestellung: D-4F, ein ApoA-I mimetisches Peptid, sowie E06 mAb, ein monoklonaler Antikörper aus ApoE-defizienten Mäusen, wirken bei Ratten mit Entzündungsschmerzen nach lokaler Injektion von komplettem Freund’schen Adjuvans (CFA) sowie bei Kollagen-induzierter Arthritis (CIA) über eine Verminderung von oxidierten Phospholipiden antinozizeptiv. Oxidierte Phospholipide werden durch Reaktion von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) wie Wasserstoffperoxid (H2O2) aus Lipidmembranen freigesetzt und führen zur Bildung von 4-Hydroxynonenal (4-HNE), einem Endprodukt der Lipidperoxidation [1,2]. OxPAPC-induzierte Hyperalgesie erfolgt durch Aktivierung des „Transient Receptor Potential“ Kanals vom Ankyrin-Typ (TRPA1) über Oxidierung von Cysteinresten [3]. In dieser Studie wird die Wirkung von D-4F Peptid und E06 mAb auf endogene ROSMetabolite wie 4-HNE oder H2O2 an TRPA1 und TRPV(vanilloid)1-Kanälen im Vergleich zu den jeweiligen prototypischen exogenen Agonisten Senföl bzw. Capsaicin analysiert. Methodik: Einzelzellkalziummessungen an mit hTRPA1 oder rTRPV1 transfizierten HEK-293-Zellen sowie spinalen Hinterwurzelganglien (DRG) von Mäusen wurden in Fura-2-basierten Assays durchgeführt. Mechanische Schmerzschwellen wurden nach lokaler Injektion der Substanzen in Hinterpfoten männlicher Wistar-Ratten mittels Randall-Selitto-Test gemessen (Tierversuchsvorhaben REG 61/11). Als statistischer Test wurde eine One- oder Two-Way ANOVA post hoc Holm-Šídák mit OriginPro durchgeführt. Ergebnisse: D-4F Peptid und E06 mAb hemmen die 4-HNE-induzierte TRPA1Aktivierung in stabil transfizierten HEK-293-Zellen und murinen DRG (siehe Abb. 1). Ebenso wird eine durch intraplantare Gabe von 4-HNE ausgelöste mechanische Hyperalgesie signifikant durch D-4F Peptid und E06 mAb blockiert. Die TRPA1Aktivierung durch H2O2 wird durch E06 mAb nicht inhibiert. D-4F Peptid hingegen verhindert die H2O2-bedingte Aktivierung von TRPA1 und hebt die H2O2-induzierte mechanische Hyperalgesie auf. Calcium-Influx hervorgerufen durch den exogenen TRPA1-Agonist Senföl sowie den exogenen TRPV1-Agonist Capsaicin werden durch D-4F Peptid und E06 mAb in vitro nicht blockiert. Auch die durch Senföl ausgelöste mechanische Hyperalgesie wird durch den E06 mAb nicht-signifikant reduziert (in vitro: n ≥ 4 mit jeweils 50-100 Zellen, One-Way ANOVA; in vivo: n = 5 pro Gruppe, Two-Way ANOVA repeated measurements, post hoch Holm-Šídák, p<0.05). A B Abb. 1: A, B In Fura-2-beladenen 4‐HNE HEK-293TRPA1-Zellen erhöhen 4-HNE (10 µM; A) und H2O2 (10 µM, B) die intrazelluläre Kalziumkonzentration, HV D C abgebildet als Ratio (340/380 nm). C, D H2O2+D‐4F 4‐HNE+D‐4F Co-Inkubation von 4-HNE (C) bzw. H2O2 (D) mit D-4F Peptid (100 µg/ml) verringert die Anzahl der reagierenden HV E F HEK-293TRPA1-Zellen H2O2+ IgM 4‐HNE+ IgM sowie die durchschnittliche Amplitude. E, F Der Isotypen-gleiche Antikörper IgM (1/300) hat wenig bzw. keinen Einfluss auf die 4-HNE (E) bzw. H2O2 (F) bedingte HV H G H2O2+E06 4‐HNE+E06 TRPA1-Aktivierung. G, H Das Gemisch aus 4-HNE (G) und E06 mAb (1/300) verzögert die TRPA1-Aktivierung und HV HV reduziert die Anzahl der reagierenden Zellen, wohingegen das Gemisch aus H2O2 (H) und E06 mAb (1/300) die H2O2induzierte TRPA1-Aktiverung nicht moduliert. Schwarze Linie: Mittelwert der ca. 100 Einzelzellen (graue Linien). Interpretation: D-4F Peptid und E06 mAb blockieren nur endogene ROS-abhängige TRPA1-Aktivatoren des Entzündungsschmerzes und nicht exogenes Senföl oder Capsaicin. D-4F Peptid und E06 mAb sind zwei vielversprechende, neue Therapeutika in der Behandlung von Entzündungsschmerzen, wobei E06 selektiver für ROS Metabolite wie OxPAPC und HNE wirksam ist. Gefördert durch das IZKF Würzburg (N-261). Referenzen: 1. Trevisan G, et al. Arthritis Rheum 2013; 65: 2984-2995; 2. Keeble JE, et al. Pain 2009; 141: 135-142, 3. Hinman A, et al. Proc Natl Acad Sci U S A 2006; 103: 19564-19568
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