Master Biotechnologie 1. Seminar

1. Seminar Biotechnologie
Ausarbeitung
Master Biotechnologie
1. Seminar
Patrick Pilak
Biosynthesis of Sandalwood Oil
Santalum album CYP76F Cytochromes P450 Produce Santalols and Bergamotol
Bohlmann et al. 2013
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Zielsetzung
Die Zielsetzung dieser Arbeit bestand darin Sandelholzöl biotechnologisch durch Metabolic
Engineering in S. cerevisae herzustellen.
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Einleitung
2.1
Sandelholzöl
Sandelholzöl wird aus den Wurzeln und Holz des Sandelholzbaumes santalus album gewonnen. Es
wird von der Duft- und Perfumindustrie benötigt und hat daher eine große wirtschaftliche Bedeutung
für die entsprechenden Produktionsländer. Der Sandelholzbaum wächst in den tropischen und
gemäßigten Zonen Indiens, Indonesiens und Australiens. Diese Baumart weist ein langsames
Wachstum auf und ist für seine kleinen roten Blüten bekannt.
2.2
Gründe für eine biotechnologische Produktion von Sandelholzöl
Durch Krankheiten, Abholzung und Ausbeutung sind die natürlichen Populationen dieser Baumart
stark dezimiert worden. Gleichzeitig steigt die Nachfrage von der verarbeitenden Industrie.
Alternativmöglichkeiten sind Plantagen und chemische Produktionsanlagen. Da ein Baum 30 Jahre
benötigt bis er verarbeitet werden kann sind Plantagen aber unrentabel. Im Falle von chemischen
Herangehensweisen sind diverse Aufarbeitungsschritte mit umweltschädlichen Chemikalien
notwendig. Aus diesen ökologischen und
ökonomischen Gesichtspunkten ist eine alternative
biotechnologische Produktionsmethode von Interesse.
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2.3
Ausarbeitung
Cytochrome P450
Cytochrome P450 bilden eine Superfamilie von Hämproteinen und kommen in allen bekannten
Lebensformen vor. Sie zeichnen sich durch ihr spezifisches Absorptionsspektrum und ihre Vielfalt an
katalytischen Reaktionen aus.
Um die große Anzahl der heute bekannten Cytochrome P450 einordnen zu können werden diese nicht
nach ihrer Funktion, sondern anhand der Sequenzähnlichkeit ihrer Gene klassifiziert. Enzyme deren
Gene eine 40 %ige Übereinstimmung aufweisen werden in eine Familie eingeordnet; bei
Sequenzähnlichkeiten von 55 % in eine Subfamilie. Dementsprechend gehört das Cytochrom 76F39 in
die Familie 11 und die Subfamilie A. Die letzte Zahl steht für das individuelle Gen dieses Enzyms
(Abb. 1).
CYP76F39
Cytochrom P450
Familie
Subfamilie
Individuelles Gen
Abbildung 1: Nomenklatur CYP76F39
Das aktive Zentrum dieser Enzyme besteht aus einem Protoporphyrin IX, dessen Zentrum ein Eisen 3+Ion bildet. Dieses Ion ist äquatorial an die 4 Stickstoffatome des Protoporphyrinringes gebunden. Im
Gegensatz zu den meisten Hämproteinen handelt es sich beim fünften Liganden nicht um ein Histidin,
sondern um ein Thiolat-Anion eines Cysteins (Abb.2). Diese charakteristische Eigenschaft führt dazu,
dass Cytochrome P450 ein spezifisches Absorptionssmaximum bei 450 nm im reduzierten COgebundenen Zustand aufweisen. Die Abkürzung P450 resultiert aus dieser Eigenschaft und steht für
Pigment 450.
Abbildung 2: Prosthetische Gruppe von Cytochromen P450. Ein zentral angeordnetes Eisen3+-Ion ist an vier
Stickstoffatome des Protoporphyrinringes gebunden. Proximal als fünfter Ligand ist ein Thiolat-Rest eines
Cystein an das Eisenion gebunden.
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Cytochrome P450 gehören zu den Oxidoreduktasen bzw. in der weiteren Einteilung zu den externen
Monooxygenasen. Bei dieser Reaktion wird ein externer Elektronendonor in Form von NAD(P)H
genutzt um zwei Sauerstoffatome zu spalten. Dabei wird ein Sauerstoffmolekül auf das entsprechende
Substrat übertragen und das andere zur Bildung eines Wassermoleküls genutzt.
Vereinfacht dargestellt wird die folgende Reaktion katalysiert:
R-H + O2 + NAD(P)H + H+
R-OH + H2O + NAD(P)+
Um diesen Reaktionsschritt durchführen zu können, wird neben NAD(P)H als Elektronendonor auch
eine Elektronentransportkette benötigt. Abhängig von der genauen Zusammensetzung der
Komponenten und dem Organismus werden 10 verschiedene Klassen unterschieden. Im Falle des
mikrosomalen Systems besteht die Transportkette aus einer Cytochrom-P-Reduktase (CPR).
Abbildung 3: Mikrosomales Elektronentransportsystem. Durch die Oxidation von NADPH+H+ werden 2
Elektronen auf die Cytochrom P Redukase (CPR) übertragen. Durch das Eisen-Schwefel-Protein CPR werden
diese dann auf das entsprechende Cytochrom P450 übertragen, um die Übertragung eines Sauerstoffatoms auf
das enzymspezifische Substrat unter Wasserfreisetzung zu ermöglichen.
Durch die Oxidation von NAD(P)H zu NADP+ werden 2 Elektronen auf die CPR übertragen. Die
Aufgabe des CPR besteht im Anschluss darin die Elektronen auf das Cytochrom P450 zu übertragen.
Das breite Spektrum an katalysierten Reaktionen dieser Enzyme umfasst unter anderem die
Biosynthese von Steroiden, die Biotransformation von Xenobiotika und die Aktivierung von
Karzinogenen. Aber auch eine weitreichende, nicht weniger wichtige, Fülle an chemischen
Reaktionen, wie beispielsweise Hydroxylierungen, Deaminierungen und N-, O-, S-Dealkylierungen.
Einer der größten Vorteile besteht allerdings darin, dass CYP450 in der Lage sind inaktiven Sauerstoff
zu nutzen um Substrate stereo- und regioselektiv umzusetzen, was durch chemische Verfahren nur
sehr schwierig und unter Bildung von racemischen Gemischen durchzuführen ist. Allein durch diese
Fähigkeit und der Vielfalt an möglichen Reaktionen und Substraten bergen Cytochrome P450 ein
immenses biotechnologisches Potential.
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2.4
Ausarbeitung
Synthese von Sandelholzöl
Die Synthese von Sandelholzöl in s. album beginnt mit der Synthese von Farnesylpyrophosphat (FPP)
aus
Dimethylallylpyrophosphat
(DMAPP)
und
Isopentylpyrophosphat
(IPP)
durch
die
Farnesylpyrophosphatsynthase (FPPS). Im Anschluss wird FPP durch ein Enzym (Santalensynthase
SSy) zu den vier Ausgangssubstraten von Sandelholzöl umgesetzt.
Diese Substanzen sind die
Sesquiterpene a-Santalen, a-exo-bergamoten, epi-ß-santalen und ß-santalen. Ausgehend davon
entstehen die Grundsubstanzen von Sandelholzöl: a-Santalol, a-exo-bergamotol, epi-ß-santalol und ßsantalol durch eine Hydroxylierung. Diese können als Z oder E Isomere vorliegen.
Abbildung 4: Biosynthese von Sandelholzöl in s. album
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Ergebnisse
3.1
Identifizierung der Gene
Es wurde eine cDNA Bibliothek des Genoms von s. album durch eine Transkriptionsassemblierung
erstellt. Zunächst wurden CPR’s aus Arabidopsis thaliana als Suchsequenzen eingesetzt und dadurch
2 SaCPR’s mit 70%- und 82%iger Identität identifziert.
Des Weiteren wurden diverse pflanzliche Cytochrome P450, die an der Terpen Biosynthese beteiligt
sind,
als
Suchsequenzen
eingesetzt.
Als
Suchmotive
wurde
die
Hämbindestelle
und
Sauerstoffbindestelle verwendet. Dadurch wurden 10 Cytochrome der Familie 76 identifiziert (Abb.
5).
Abbildung 5: Phylogenetische Analyse der entdeckten Cytochrome.
3.2
In vitro Synthese von Sandelholzöl
Neun der identifizierten Cytochrome wurden in Plasmide integriert und mit einem Plasmid, dass die
SaCPR enthält in S. cerevisae kotransformiert. Im Anschluss wurden die Mikrosome isoliert und in in
vitro Experimenten eingesetzt. Als Substrate wurden die Substanzen sind die Sesquiterpene aSantalen, a-exo-bergamoten, epi-ß-santalen und ß-santalen verwendet.
In einer GC-MS Analyse wurden das natürliche Sandelholzöl und die Proben der neun
transformierten Cytochrome (Abb.6) vermessen. Dabei wies das Cytochrom CYP76F39v1 die größte
Übereinstimmung mit dem natürlichen Sandelholzöl auf, da die Substanzen a-Santalol, a-exobergamotol, epi-ß-santalol und ß-santalol synthetisiert werden konnten. Allerdings stimmen die
Verhältnisse der E/Z-Stereoisomere nicht überein. Im natürlichen Sandelholzöl überwiegen die ZStereoisomere, wohingegen im biotechnologisch hergestellten Sandelholzöl die E-Stereoisomere
überwiegen. Die übrigen acht Cytochrome synthetisierten nicht alle acht Substanzen und sind daher
von weniger Interesse.
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Abbildung 6: GC-MS Analyse der in vitro Umsätze der identifizierten CYP76F. (E)- α -santalol (7) and (Z)α -santalol (5), (E)-ß-santalol (12),(Z)-ß-santalol (10), (E)-α-exo-bergamotol (8), (Z)-α-exo-bergamotol (6), (E)epi-ß-santanol (11), (Z)-epi-ß-santanol (9)
3.3
In vivo Synthese von Sandelholzöl
Neun der identifizierten Cytochrome wurden in Plasmide integriert und mit einem Plasmid, dass die
SaCPR und SaSSy enthält in S. cerevisae kotransformiert. Die FPPS in s. cerevisae ist ausreichend um
genug FPP herzustellen. Somit mussten keine Substrate zugegeben werden. Im Anschluss erfolgte eine
GC-MS Analyse wie in 3.2.
Abbildung 7: GC-MS Analyse der in vitro Umsätze der identifizierten CYP76F. (E)- α -santalol (7) and (Z)α -santalol (5), (E)-ß-santalol (12),(Z)-ß-santalol (10), (E)-α-exo-bergamotol (8), (Z)-α-exo-bergamotol (6), (E)epi-ß-santanol (11), (Z)-epi-ß-santanol (9)
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Abbildung 7 verdeutlicht, dass wie in Abbildung 6 alle Santalole und Bergamotole synthetisiert
wurden, aber wiederum in einer Mischung der Stereoisomere, die nicht dem natürlichen Sandelholzöl
entspricht.
Zudem wurden Farnesol und andere unbekannte Nebenprodukte synthetisiert. Diese könnten bei einer
späteren Aufarbeitung des Öles behindern.
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Diskussion
4.1
Kritikpunkte
Die in dieser Arbeit beschriebene Methode zur Herstellung von Sandelholzöl ist in zwei Punkten zu
kritisieren. Erstens, wurden in vivo Nebenprodukte identifiziert, die die Aufarbeitung des Öles
behindern könnten. Zweitens, konnten nicht die natürlichen Verhältnisse der E- und Z-Stereoisomere
gebildet werden. Im natürlichen Öl überwiegen die Z-Stereoisomere, wohingegen in dem in dieser
Arbeit hergestellte Öl die E-Stereoisomere überwiegen. Daher ist das derzeitige Öl als nicht
verkaufsfähig einzustufen.
4.2
Erklärungen
Für die in 4.1 angesprochenen Probleme gibt es verschiedene mögliche Erklärungen. Zum Einen wäre
es denkbar, dass eine Isomerase in a. album existiert die die E-Stereoisomere zu Z-Isomeren umsetzt.
Da im Sandelholzbaum das Öl über Jahre verbleibt und in dieser Arbeit das Öl in Minuten oder
Stunden synthetisiert worden ist, wäre diese Erklärung plausibel.
Außerdem unterscheiden sich die physiologischen Bedingungen in Hefe und Pflanzen, sodass es zu
leichten Veränderungen im aktiven Zentrum der Cytochrome kommen könnte, wodurch nur Z-Isomere
gebildet werden würden.
4.3
Lösungen
Zum Einen wäre es möglich die in 4.2 beschriebene Isomerase zu identifizieren und zusätzlich in Hefe
heterolog zu exprimieren. Zum Anderen wäre es denkbar dass noch andere Cytochrome existieren die
nur Z-Stereoisomere bilden können. Auch diese gilt es zu finden.
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Zusammenfassung
Die in dieser Arbeit postulierte Methode beschreibt den ersten biotechnologischen Prozess zur
Herstellung von Sandelholzöl. Dies würde eine Alternative zur bisherigen Gewinnung von
Sandelholöl aus dem Sandelholzbaum s. album darstellen. Aufgrund von wirtschaftlichen Interessen
ist dies ein Forschungsfeld, das es weiter zu untersuchen gilt.
Zwar konnten die Grundsubstanzen des Sandelholzöls hergestellt werden, aber diese stimmen nicht
mit dem nativen Öl überein, weshalb dieses Öl noch nicht verkaufsfähig ist.
Zudem konnten neue Informationen über die Cytochrome der Familie F76 gewonnen werden.
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Literatur
•
Biosynthesis of Sandalwood Oil: Santalum album CYP76F Cytochromes P450 Produce
Santalols and Bergamotol (Bohlmann et al. 2013)
•
“Cytochromes P450 as versatile biocatalysts” (Rita Bernhardt 2006)
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