Besondere Lernleistung Vergleichende Identifizierung von Bakterienstämmen mittels analytischem Profilindex (VITEK 2 Compact) und Massenspektrometrie (MALDITOF) Bearbeiter: Theresa Mühle Betreuer: Frau Gostomski und Frau Dr. med. Fichtner Gliederung • • • • • • Einführung Materialien und Methoden Ergebnisse Diskussion Zusammenfassung Ausblick 1. Einführung 1. Einführung Zielstellung • Bakterien = ubiquitär • Unter bestimmten Bedingungen Entstehung von Infektionen • Korrekte Erregeridentifizierung für erfolgreiche Therapie notwendig • Für Identifizierung Bau der Bakterienzelle entscheidend 1. Einführung Bakterienzellen (1) (3) (1) http://www.lifeline.de/img/diabetes/origs115033/ 1986954703-w830-h830/kokken.jpg (2) http://deutsche-wirtschafts-nachrichten.de/wpcontent/uploads/2013/11/130916171253-drug-resistanttuberculosis-horizontal-gallery-e1385415806274.jpg https://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb (2) (3) /3/3b/Leptospira_scanning_micrograph.jpg/300pxLeptospira_scanning_micrograph.jpg 1. Einführung Zellaufbau http://file1.npage.de/006694/21/bilder/3279b4525dbbf34d100c4c0380e2bf85_1_orig.jpg 1. Einführung Erregeridentifizierung • Verschiedene Methoden: - Mikroskopie - Biochemische Verfahren - Massenspektrometrie 1. Einführung Erregeridentifizierung • Massenspektrometrie: neues Verfahren im Labor - Verifizierung notwendig (Überprüfung der Leistungsfähigkeit, Überprüfung der richtigen Arbeitsweise) - gefordert: Überprüfung an 100 Bakterienstämmen 1. Einführung Erregeridentifizierung Aufgabe: Untersuchung von 100 Stämmen mittels VITEK 2 Compact (biochemische Identifizierung) und MALDITOF (Massenspektrometrie) 2. Materialien und Methoden 2. Materialien und Methoden Identifizierung mittels VITEK 2 Compact • Verschiedene Karten für unterschiedliche Bakteriengruppen (z.B. grampositive Kokken, gramnegative Stäbchen) • Untersuchung 63 verschiedener Reaktionen pro Karte • Erstellung eines biochemischen Profils 2. Materialien und Methoden Identifizierung mittels VITEK 2 Compact 2. Materialien und Methoden Identifizierung mittels VITEK 2 Compact • Herstellung Bakteriensuspension • Glasstäbchen Bakterienprobe von Agarplatte in Reagenzglas Trübung • Röhrchen der Karte in Keimsuspension • Carriernummer in Computer; Barcodenummern scannen; Probennummer eingeben 2. Materialien und Methoden Identifizierung mittels VITEK 2 Compact • 2 Fächer = Fülleinheiten • Vakuum-Pumpe saugt Luft aus Kammer • Proben über Transferröhrchen in Testkarten gepresst • 3 – 4 min Signalton; Carrier in Belade- und Entladeeinheit umsetzen 2. Materialien und Methoden Identifizierung mittels VITEK 2 Compact • Gerät liest Barcodes; sendet Daten + Carriernummer an Computer; Vergleich zu manuell eingegebenen Daten • Transferröhrchen von Testkarten abgetrennt und versiegelt • Identifizierungskarten in Halterungen der Leseeinheit eingesetzt • Alle 15 min: Transmissionsoptik misst Stoffwechselaktivität der Bakterien mit sichtbarem Licht 2. Materialien und Methoden Identifizierung mittels VITEK 2 Compact 2. Materialien und Methoden Identifizierung mittels MALDITOF • MALDI-TOF: Matrix-assistierte-Laser-Desorption/Ionisation Time-of-Flight • Massenspektrometrie 2. Materialien und Methoden Identifizierung mittels MALDITOF • Proben mit UV-Laser bestrahlt positiv geladene Proteine werden freigesetzt • Ionen elektrostatisch beschleunigt; gelangen in Flugrohr • Unterschiedliche Massen Ionen treffen nicht zum selben Zeitpunkt auf Detektor • Messung der Flugzeit in molare Masse umgerechnet • Summe der Proteinmassen ergibt typische Massenverteilung der Proteine 2. Materialien und Methoden Identifizierung mittels MALDITOF http://www.biomerieux.de/upload/Jan%2011-1.pdf 2. Materialien und Methoden Identifizierung mittels MALDITOF 2. Materialien und Methoden Identifizierung mittels MALDITOF 2. Materialien und Methoden Identifizierung mittels MALDITOF Sehr wahrscheinliche Speziesidentifikation ; Sichere Gattungsidentifikatio n, wahrscheinliche Speziesidentifikation Wahrscheinliche Gattungsidentifikati on Unzuverlässige Identifikation 2. Materialien und Methoden Identifizierung mittels MALDITOF • Belegungsplan beschriften zeigt alle Positionen auf Targetplatte • Holzspießer kleine Menge der Kolonie auf Targetposition • Lufttrocknung Pipette 1 µl einer Matrix auf Target Lufttrocknung Matrix kristallisiert • Computer: Durchgang benennen; virtuelle Targetplatte Positionen der Präparate kennzeichnen 3. Ergebnisse 3. Ergebnisse Streptococcus Name Anzahl der Stämme Identifizierun g durch VITEK 2 Compact Identifizierun g durch MALDI-TOF Streptococcus agalactiae 5 ✔ ✔ Streptococcus pyogenes 3 ✔ ✔ Streptococcus dysgalactiae ssp equismilis 6 ✔ ✔ Streptococcus anginosus 1 ✔ ✔ Streptococcus constellatus ssp pharyngis 1 ✔ ✔ Streptococcus mitis 2 ✔ x Streptococcus parasanguinis 1 ✔ ✔ 3. Ergebnisse Enterococcus Name Anzahl der Stämme Identifizierung durch VITEK 2 Compact Identifizierung durch MALDITOF Enterococcus faecium 4 ✔ ✔ Enterococcus gallinarum 1 ✔ ✔ Enterococcus faecalis 1 ✔ ✔ 3. Ergebnisse Staphylococcus Name Anzahl der Stämme Identifizierung durch VITEK 2 Compact Identifizierung durch MALDI-TOF Staphylococcus aureus 7 ✔ ✔ Staphylococcus auricularis 1 ✔ ✔ Staphylococcus epidermidis 9 ✔ ✔ Staphylococcus haemolyticus 1 x ✔ Staphylococcus hominis 1 x ✔ Staphylococcus lugdunensis 1 ✔ ✔ Staphylococcus saprophyticus 1 ✔ ✔ 3. Ergebnisse Micrococcus Name Anzahl der Stämme Identifizierung durch VITEK 2 Compact Identifizierung durch MALDITOF Micrococcus luteus 1 ✔ ✔ 3. Ergebnisse Coryneforme grampositive Stäbchen Name Anzahl der Stämme Identifizierung durch VITEK 2 Compact Identifizierung durch MALDITOF Arthrobacter cumminsii 1 ✔ ✔ Corynebacterium amycolatum 5 ✔ ✔ Corynebacterium aurimucosum 2 x ✔ Corynebacterium striatum 1 x ✔ Rothia mucilaginosa 1 x ✔ Fakultativ bis obligat anaerobe, grampositive, sporenlose Stäbchenbakterien 3. Ergebnisse Name Anzahl der Stämme Identifizierung durch VITEK 2 Compact Identifizierung durch MALDITOF Actinobaculum schaalii 1 x ✔ Actinomyces neuii ssp neuii 1 x ✔ Actinomyces turicensis 1 x ✔ Actinomyces urogenitalis 1 x ✔ 3. Ergebnisse Bacillaceae Name Anzahl der Stämme Identifizierung durch VITEK 2 Compact Identifizierung durch MALDITOF Bacillus cereus 1 x ✔ 3. Ergebnisse Haemophilus Name Anzahl der Stämme Identifizierung durch VITEK 2 Compact Identifizierung durch MALDITOF Haemophilus influenzae 3 ✔ ✔ Haemophilus parainfluenzae 1 ✔ ✔ 3. Ergebnisse Enterobacteriaceae Name Anzahl der Stämme Identifizierung durch VITEK 2 Compact Identifizierung durch MALDI-TOF Citrobacter freundii 1 ✔ ✔ Enterobacter cloacae 1 ✔ ✔ Escherichia coli 10 ✔ ✔ Escherichia vulneris 1 ✔ ✔ Klebsiella oxytoca 1 ✔ ✔ Morganella morganii ssp morganii 1 ✔ ✔ Pantoea agglomerans 1 ✔ ✔ Providencia rettgeri 1 ✔ ✔ Serratia marcescens 2 ✔ ✔ Pseudomonas und andere anspruchslose nichtfermentierende gramnegative Stäbchen 3. Ergebnisse Name Anzahl der Stämme Identifizierung durch VITEK 2 Compact Identifizierung durch MALDI-TOF Acinetobacter baumannii 1 ✔ x Acinetobacter ursingii 1 ✔ ✔ Aeromonas hydrophila ssp anaerogenes 1 x ✔ Pseudomonas stutzeri 1 ✔ ✔ Pseudomonas aeruginosa 6 ✔ ✔ 4. Diskussion 4. Diskussion Identifizierung mittels VITEK 2 Compact • VITEK 2 Compact erkennt Bakterien anhand von biochemischen Prozessen häufige Überschneidung von Merkmalen 4. Diskussion Identifizierung mittels VITEK 2 Compact • VITEK 2 Compact nicht identifiziert: - 2 Staphylococcus: ähnliche Stoffwechselprofile - 5 Corynebakterien: sehr langsames Wachstum - 5 grampositive Stäbchen: sehr langsames Wachstum - 1 Aeromonas: zu wenig Stoffwechselleistung 4. Diskussion Identifizierung mittels MALDI-TOF • MALDI-TOF erkennt Bakterien anhand ihrer Massenspektren ähnliche Spektren bei nah verwandten Bakterien 4. Diskussion Identifizierung mittels MALDI-TOF MALDI- TOF nicht identifiziert: - 3 Streptococcus: Massenspektren zu ähnlich 4. Diskussion Identifizierung mittels MALDI-TOF MALDI- TOF nicht identifiziert: -1 Acinetobacter: Massenspektren zu ähnlich 4. Diskussion Vergleich zusätzlicher Faktoren • MALDI-TOF: hohe Anschaffungskosten; arbeitet kostengünstiger und schneller • VITEK 2 Compact: geringere Anschaffungskosten, höhere Verbrauchskosten; längere Analysendauer Moderne Technik + persönliche Erfahrungen + aktueller Wissensstand = Erfolg der Keimidentifizierung 5. Zusammenfassung 5. Zusammenfassung • Beide nicht 100% fehlerfrei • MALDI-TOF: 4 Fehler; geringer Zeitaufwand • VITEK 2 Compact: 13 Fehler; lange Analysedauer • Fazit: Verifizierung des MALDI-TOF erfolgreich 6. Ausblick 6. Ausblick • Erweiterung der Datenbank beider Systeme Verbesserung der Identifizierungsmöglichkeiten • Massenspektrometrie: sinnvolle Ergänzung zur biochemischen Identifizierung, aber momentan noch hohe Anschaffungskosten Vielen Dank für Ihre Aufmerksamkeit!
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