VAAM-Nachrichten 210 Neues aus den VAAM-Fachgruppen: Fachgruppe Mikrobiologische Qualitätssicherung Mikrobiologische g mit Hilfe der FTIR-Spektroskopie Eine der zentralen Aufgaben in der mikrobiologischen Qualitätssicherung ist die Identifizierung von Mikroorganismen. Um die Qualität und die Sicherheit von Produkten zu gewährleisten, müssen sie frei von Verderbnis-erregenden und pathogenen Mikroorganismen sein. Durch eine zuverlässige Identifizierung der Mikroorganismen können Produktionsprozesse optimiert und die Ursache von Kontaminationen festgestellt werden. Die Fourier-Transform-Infrarot(FTIR)Spektroskopie wird bereits in vielen Berei- auf Agarplatten kultiviert. Etwas Zellmaterial wird aus dem konfluenten Zellrasen der Agarplatte entnommen und in destilliertem Wasser suspendiert. Diese Suspension wird auf spezielle, wiederverwendbare Mikrotiterplatten (96-iger oder 384-iger Format) aufgetragen und nach Trocknen der Proben (15 min) mit dem Lesegerät HTS-XT (Bruker Optik GmbH, Ettlingen) auf der Mikrotiterplatte gemessen und identifiziert (Abb. 2). Eine weitere zeitaufwändige Kultivierung, wie sie beispielsweise für die Typisierung anhand von biochemischen Reaktionen not- Abb. 1: Probenpräparation: Zellmaterial wird geerntet und in etwas destilliertem Wasser suspendiert. Diese Suspension wird auf die Mikrotiterplatte aufgetragen und getrocknet. chen der Qualitätssicherung als schnelle und kostengünstige Untersuchungsmethode genutzt. Sie kann dabei für die Identitäts- und Reinheitsprüfung von Stoffen aber auch für die quantitative Bestimmung von Inhaltsstoffen verschiedener Proben eingesetzt werden. Die unterschiedlichen Biomoleküle der Mikroorganismen (Proteine, Lipide, DNA/RNA, Kohlenhydrate, Speicherstoffe usw.) zeigen ein charakteristisches InfrarotSpektrum. Dieser spektrale „Fingerabdruck“ spiegelt die biochemische Zusammensetzung der Zellen wider. Unter standardisierten Kultivierungs- und Präparationsbedingungen können Mikroorganismen aufgrund der hohen Messgenauigkeit und der Spezifität ihrer Spektren sogar bis auf Stammebene identifiziert werden. Die Methode ist universell für die Identifizierung von Bakterien, Hefen und Schimmelpilzen einsetzbar. Die Probenpräparation zeichnet sich durch eine einfache Handhabung und einen geringen Zeitbedarf (etwa eine Minute pro Probe) aus (Abb. 1). Reinkulturen von Mikroorganismen werden unter standardisierten Bedingungen typischerweise für 24 Stunden wendig ist, entfällt. Für die Messung und Auswertung sind weder Reagenzien noch andere Verbrauchsmaterialien erforderlich. Das Mikrotiterplatten-Lesegerät HTS-XT wird von einer bedienerfreundlichen Software gesteuert, das die Messung, Auswertung, Dokumentation und Archivierung der Messdaten automatisch durchführt. Die Messzeit pro Probe beträgt typischerweise 30 Sekunden. Anschließend werden die Mikrotiterplatten gereinigt, um für die nächste Auftragung verwendet zu werden. Die Identifizierungsergebnisse werden in einer Tabelle aufgeführt, wobei der identifizierte Stamm oder die Spezies angezeigt wird. Aufgrund des geringen Zeitbedarfs für die Präparation und Messung und den sehr niedrigen laufenden Kosten ist diese Schnellmethode besonders bei hohem Probenaufkommen interessant. Um unbekannte Mikroorganismen zu identifizieren, werden deren FTIR-Spektren mit den Referenzspektren der Datenbanken verglichen. Die Qualität dieser Datenbanken ist für eine zuverlässige Identifizierung von entscheidender Bedeutung. Eine gute Bibliothek muss nicht nur alle relevanten Spezies, sondern auch die spektrale Variabilität der verschiedenen Stämme einer Spezies enthalten. In den beste- Abb. 2: Messung und Auswertung: Die Messung mit dem Mikrotiterplattenlesegerät HTS-XT dauert etwa 30 Sekunden. Es können verschiedene wieder verwendbare Mikrotiterplatten eingesetzt werden. Die Identifizierungsergebnisse werden in einer Tabelle dargestellt. Die Ähnlichkeiten der Mikroorganismenspektren können auch grafisch in Form von Dendrogrammen dargestellt werden. BIOspektrum · 2/05 · 11. Jahrgang VAAM-Nachrichten henden Datenbanken sind daher die Spektren von Stämmen verschiedener Stammsammlungen sowie Spektren von Isolaten unterschiedlicher Produktionsstätten aufgenommen. Die Datenbanken decken dabei ein breites Spektrum von Verderbnis-erregenden und pathogenen Bakterien und Hefen ab. Alle Stämme, die in den SpektrenBibliotheken enthalten sind, wurden mit zuverlässigen Methoden identifiziert. Die bestehenden Datenbanken wurden am Zentralinstitut für Ernährungs- und Lebensmittelforschung Weihenstephan (ZIEL), Institut für Mikrobiologie, TUMünchen bei Siegfried Scherer und Herbert Seiler erstellt und validiert. Die Analyse und Charakterisierung von mikrobiellen Populationen ist ein weiterer wichtiger Bestandteil des Qualitätsmanagements. Die Vorteile der FTIR-Spektroskopie bei der Identifizierung von Mikroorganismen sind die einfache Durchführung, eine hohe Kosteneffizienz sowie die schnellen und zuverlässigen Messergebisse. Da mit dieser Methode eine Differenzierung bis auf Stammebene möglich ist, eignet sie sich auch für die Überwachung der betriebseigenen „Hausflora“ und für die Analyse von Kontaminationsrouten. Eine Bibliothek mit den Spektren der Hausflora-Mikroorganismen ermöglicht die: – Spezifische Kontrolle der Kulturen – Frühzeitige Erkennung von Florenveränderungen – Erleichterte der Fehlersuche bei Problemfällen (Finden der Ursache der Verunreinigung und Klärung von Verantwortlichkeiten) – Verbesserte Hygieneüberwachung Alexander Piry, Bruker Optik GmbH, Ettlingen BIOspektrum · 2/05 · 11. Jahrgang VAAM-Symposium