Biofilm - Swissatest Testmaterialien AG

Biofilm –
Industrienahe Testmethoden
Caroline Amberg
Swissatest testmaterials ag, St. Gallen, Schweiz
Zürich, 11. November, 2015
Kolb Kolloquium
Swissatest Testmaterialien AG, Mövenstrasse 12, CH-9015 St. Gallen, swissatest.ch
1
Inhalt
• Biofilme in Haushaltgeräten
• Normen zu Biofilmuntersuchungen
• Swissatest Testmethoden
• Biofilm Screening Test (Lab-scale Test)
• Erfassung der Biofilmreduktion in der
Waschmaschine
• Biofilm-Wachstum in der Waschmaschine
• Relevanz und Grenzen der Tests
• Zusammenfassung und Fazit
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November 2015
Biofilmbildung in Waschmaschinen
• Wasser / Feuchtigkeit
• Ablauf, Pumpe, Schläuche, Bottich, Trommel,
Waschmittelschublade
• Temperaturen zwischen 4°C und 60°C
• Niedrigtemperatur-Waschverfahren: 20°C bis 40°C
• Organische / Anorganische Nährstoffe
• Schmutzbeladung der Wäsche
• Kunststoffe / Gummiteile und Schläuche
• Metalle / Legierungen (Drehkreuz)
• Ungenügende Keimreduktion
• Waschmittel ohne Bleiche
• Kurze Waschzyklen
• Geringer Wasserverbrauch
 Biofilmbildung in Waschmaschinen muss erwartet werden und lässt
sich nicht vollständig verhindern
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Biofilmwachstum im Geschirrspüler
• Wasser / Feuchtigkeit
• Sumpf, Filter, Ablauf, Ionenaustauscher, Pumpe,
Schläuche, Gummidichtung,
• Temperaturen zwischen 4°C und 60°C
• Höhere Temperaturen zwischen 50 und 75°C (Klarspülen)
• Organische / Anorganische Nährstoffe
• Hoher Schmutzgehalt im Sumpf, Ablauf und Filter
• Gummi / Schläuche
• Keimreduktion
• Trends zu tieferen Temperaturen
• Kürzere Spülzyklen
• Wasserverbrauch
Wegen der feuchten Umgebung und der hohen
Schmutzladung muss auch im Geschirrspüler mit
Biofilmbildung gerechnet werden
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November 2015
Ist Biofilmbildung in Haushaltsgeräten ein Problem?
Ja, weil…
• Geruchsproblem
• Biokorrosion / Biofouling
• Potentielles Gesundheitsrisiko:
• Infektionen
• Unsichtbare Verbreitung von Antibiotika-Resistenzen
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Geruchsbildung in Haushaltgeräten
•
•
•
Biofilmbildung ist die Geruchsquelle
Dimethyl disulphide, 3-methyl-1-butanol, Isovaleriansäure
und Isobutyric acid werden am häufigsten detektiert
Involvierte Mikroorganismen:
•
•
•
•
•
•
•
Pseudomonas Stämme (P. aeruginosa, P. fluorescens, P. oleovorans,
P. pseudoalcaligenes)
Staphylococcus Stämme (S. epidermidis, S. haemolyticus)
Micrococcus Stämme,
Shewanella putrefaciens
Brevundimonas sp.
Sphingobacterium sp.
Microbacterium sp.
 Geruchsstoffe aus Waschmaschinen tragen zum
Schlechtgeruch von Textilien bei
 Beanstandungen durch Kunden
 Im Geschirrspüler scheint das Geruchsthema weniger
prominent
Source: Stapleton K et al. (2013). The potential impact of washing machines on laundry malodour generation. Letters in Applied Microbiology 56, 299-306.
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Pathogene Keime in der Waschmaschine
Häufig nachgewiesene Mikroorganismen:
•
•
•
•
•
•
•
•
Pseudomonas aeruginosa
Pseudomonas aeruginosa
Staphylococcus sp. (S. epidermidis, S.
haemolyticus)
Micrococcus sp.
Shewanella putrefaciens
Brevundimonas sp.
Sphingobacterium sp.
Microbacterium sp.
Fungi: Rhodotorula, Candida, Fusarium etc.
 Resultate repräsentieren nicht zwingend die
Realität im Biofilm!
 ca. 30% der isolierten Keime sind potentiell
pathogen (Risikogruppe 2)
 Keimtransfer von Gerät auf Wäsche oder Geschirr
 Infektionsrisiko, stille Verbreitung von Antibiotika
Resistenzen
Sources: Stapleton K et al. (2013). The potential impact of washing machines on laundry malodour generation. Letters in Applied Microbiology 56, 299-306.
Gattlen J et al. (2010). Biofilms isolated from washing machines from three continents and their tolerance to a standard detergent. Biofouling, 26(8), 873-882.
IFH report (2011).The infection risks associated with clothing and household linens in home and everyday life settings, and the role of laundry
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Pathogene Keime im Geschirrspüler
•
•
•
Keine Studien über das Keimspektrum im
Geschirrspüler vorhanden
Hitzeresistente Bakterien, Sporenbildner und Pilze
Isolierte Pilze (ca. 60% der beprobten Geschirrspüler
enthalten Pilze):
•
•
•
•
•
•




Exophiala dermatitidis
Aspergillus sp.
Candida sp.
Fusarium sp.
Penicillium sp.
Rhodotorula sp.
Black Yeast Exophiala (in 50% der Proben mit
Pilzen)
Exophiala sp. (thermo-, pH- und salz tolerant
Systemische Infektionen / Lungen
Infektionsrisiko ist unklar
Haushaltgeräte können Nischen für spezialisierte
Mikroorganismen darstellen
Sources: Zalar et al. (2011). Dishwasher – A man-made ecological niche acoommodating human opportunistic fungal pathogens.Fungal Biology 115, 997-1007.
Babic et al. (2015). Candida and Fusarium species known as opportunistic human pathogens from customer-accessible parts of reisdential washing machines.
Fungal Biology 119, 95-113.
Gostincar, Grube, Gunde-Cimerman (2015). Evolution of Fungal Pathogens in Domestic Environments? Fungal Biology 115, 1108-1018.
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Inhalt
• Biofilme in Haushaltgeräten
• Normen zu Biofilmuntersuchungen
• Swissatest Testmethoden
• Biofilm Screening Test (Lab-scale Test)
• Erfassung der Biofilmreduktion in der
Waschmaschine
• Biofilm-Wachstum in der Waschmaschine
• Relevanz und Grenzen der Tests
• Zusammenfassung und Fazit
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Biofilm Probenahme und Analytik
Probenahme:
Tupfer, Materialplättchen
Direkte Untersuchungsmöglichkeiten:
e.g. Microskopie, FTIR-Spectrometrie
Analytik:
• Zellzahlen
• Art der Species
• Verteilung der Species im Biofilm
• Biofilmstruktur
• Biofilmmenge (Biomasse)
• EPS-Menge
• Viabilität
• Vorkommen spezifischer Keime
 Methode hängt vom Ziel der Untersuchung ab
 Einzelne Parameter alleine sind oft ungenügend und sagen wenig aus
 Ein natürlicher Biofilm ist eine hoch-komplexe Struktur. Die Wahl der richtigen
Analysemethode und die Interpretation der Ergebnisse muss vorher gut durchdacht werden
und zum Untersuchungsziel passen
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Biofilm Standards
ASTM E2562_12: Standard Test Method for Quantification of Pseudomonas
aeruginosa Biofilm Grown with High Shear and Continuous Flow using CDC Biofilm
Reactor
 Kultur und Probenahme eines standardisierten P. aeruginosa biofilm für verschiedenste
Anwendungen. Massnahme zur Biofilm Entfernung kann im Reaktor oder nach Entnahme der
Biofilm-Plättchen durchgeführt werden.
 Hohe Scherkräfte, stark haftender Biofilm
 Bestimmung der Keimzahlen
ASTM_E2871_13: Standard Test Method for Evaluating Disinfectant Efficacy Against
Pseudomonas aeruginosa Biofilm Grown in CDC Biofilm Reactor Using Single Tube
Method
Kultur eines P. aeruginosa Biofilms nach dem Standard E2562_12. Desinfektionsmittelprüfung in
50 ml Röhrchen
 Bestimmung der Keimzahlen
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Biofilm Standards
ASTM E2647_13: Standard Test Method for Quantification of
Pseudomonas aeruginosa Biofilm Grown Using Drip Flow Biofilm
Reactor with Low Shear and Continuous Flow
 Kultur und Probenahme eines standardisierten P. aeruginosa Biofilms für
verschiedene Anwendungen. Massnahmen zur Biofilm-Entfernung können im
Reaktor oder extern nach Entnahme der Biofilm-Plättchen durchgeführt
werden
 Umgebung mit geringen Scherkräften, Biofilm haftet lose
 Bestimmung der Keimzahlen
ASTM E 2196_12: Standard Test Method for Quantification of
Pseudomonas aeruginosa Biofilm Grown with Medium Shear and
Continuous Flow Using Rotating Disk Reactor
 Kultur und Probenahme eines standardisierten P. aeruginosa Biofilms für
unterschiedliche Anwendungen. Massnahmen zur Biofilmentfernung können
im Reaktor oder extern nach Entnahme der Biofilm-Plättchen durchgeführt
werden
 Mittlere Scherkräfte, Biofilm haftet ‘mittel’
 Bestimmung der Keimzahlen
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Biofilm Standards
ASTM E2799_12: Standard Test Method for Testing Disinfectant Efficacy against Pseudomonas aeruginosa
Biofilm using the MBEC Assay
 Desinfektionsmittelprüfung mit P. aeruginosa biofilm
 Nur Screening test
 Bestimmung der Keimzahl (quantitativ) oder der Optischen Dichte (qualitativ)
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Inhalt
• Biofilme in Haushaltgeräte
• Normen zu Biofilmuntersuchungen
• Swissatest Testmethoden
• Biofilm Screening Test (Lab-scale Test)
• Erfassung der Biofilmreduktion in der
Waschmaschine
• Biofilm-Wachstum in der Waschmaschine
• Relevanz und Grenzen der Tests
• Zusammenfassung und Fazit
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Biofilm Screening test
Lab scale Methode zur Erfassung der Biofilmentfernung
oder Biofilmabnahme:
•
•
•
Wachstum eines jungen Biofilm (24 h)
Chemische Behandlung oder simulierter Wasch- / Reinigungsprozess
Erfassung der Biofilmmenge mit dem Kristallviolett-Assay (O’Toole,
2011) alternativ Keimzahlbestimmungen
Anwendungen:
•
•
•
•
•
•
Beschichtungen von Oberflächen
Gerätereinigungsmittel
Desinfektionsmittel
Bestimmen der wirksamsten Konzentrationen
Bestimmen der wirksamsten Waschbedingungen
Synergistische oder antagonistische Effekte
Verschiedene Prüfvarianten stehen zur Verfügung
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Biofilm Screening Test
1) Growth of a
young biofilm
Mixed biofilm
24 h incubation
at 30°C in
growth medium
E. coli
Staphylococcus
aureus
Microbial growth in
the solution OD595
2) Simulated
washing test(s)
3) Biofilm
quantification
Pseudomonas
aeruginosa
Simulated washing
machine cleaning test
Quantification of
growth in the
suspension
Quantification of
biofilm amount
Microbial growth in
the solution OD595
4 h Incubation at
30°C in medium
Rinsing to
remove
planctonic cells
Crystal violet
assay
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Prüfung von verschiedenen Waschmaschinen-Reinigern
Prüfansätze / Wasserkontrolle
Negativkontrolle (ohne Biofilm)
Aktive Inhaltsstoffe:
A: Citric acid, Limonene,
B: citric acid
C: organische Säuren, Bitrex
Chlorbleiche zum Vergleich
WM
Reiniger A
Wasserkontrolle
WM
Reiniger B
Chlorbleiche
(50g/L)
WM
Reiniger C
Prüfbedingungen:
-Hauptwaschen: 60°C 30 min bei 100U/min
-2 Spülgänge à 10 min, RT
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Prüfung von Waschmaschinen-Reinigern
Ein simulierte Waschversuch (Biofilm-Quantifizierung mit dem Kristallviolett-assay)
Single washing test:
• Good efficiency to lower biofilm
amount
• No total removal of biofilm
• Chlorine was more effective
• No difference between the Cleaners
Biofilm formation CV-assay at 550 nm
4,000
3,500
3,000
2,500
2,000
1,500
1,000
0,500
0,000
-0,500
mixed biofilm, WM cleaner A
water control
mixed biofilm, WM cleaner B
chlorine (50g/L)
mixed biofilm, WM cleaner C
Biofilm formation CV-assay at 550 nm
‘Langzeit-Wirkung’ (Biofilm-Quantifizierung mit dem Kristallviolett-Assay)
4,000
Biofilm prevention:
• Good efficiency to lower biofilm amount
• No total removal of biofilm (Chemistry and/or
temperature are not sufficient)
• Chlorine was more effective
• Cleaner B was more effective in the long-term
approach
3,500
3,000
2,500
2,000
1,500
1,000
0,500
0,000
-0,500
mixed biofilm, WM cleaner A
water control
mixed biofilm, WM cleaner B
chlorine (50g/L)
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mixed biofilm, WM cleaner C
Prüfung von Waschmitteln / Maschinenreinigern
Prüfansätze / Wasserkontrolle
Negativkontrolle (ohne Biofilm)
Aktive Inhaltsstoffe:
1: ?
A: Citric acid, D-Limonene
B: citric acid
IEC-A*: Bleichkomplex TAED
- Perborat
Wasserkontrolle
IEC-A*
FlüssigWMWaschmittel
reiniger 1
WM
Reiniger A
WM
Reiniger B
Prüfbedingungen:
-Hauptwaschen: 60°C 30 min bei 100U/min
-2 Spülgänge à 10 min, RT
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Prüfung von Waschmittel-Reinigern /
Ein simulierter Waschversuch (Keimzahlbestimmung)
arith mean of microbial counts per 5 ul
1000000
503000
100000
Microbial counts (Biofilm) in lab scale test
126000
65000
10000
14900
977
1000
154
100
10
1
H2O control
liquid color detergent
IEC-A*
washing machine
cleaner 1
detergent / washing machine cleaner
washing machine
cleaner A
washing machine
cleaner B
 Bessere Differenzierung zwischen den Produkten mit der Keimzahlbestimmung
 Reiniger B entfernt am meisten Biofilm (Inaktivierung von Keimen) und ist sogar effizienter
als IEC-A*
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Biofilm Entfernung in der Waschmaschine
Biofilm Entfernung in der Waschmaschine:
•
•
Biofilm mit drei Bakterienspecies (E. coli, Staphylococcus aureus,
Pseudomonas aeruginosa) auf Polypropylen-Plättchen
Bestimmung der Biofilm-Entfernung durch Erfassung der Keimzahlen
auf den Plättchen vor / nach der Wäsche
Anwendungen:
•
•
•
Erfassung der Biofilm Entfernung in einem einzelnen Waschprozess
Vergleichende Prüfung (Prozess ohne WM / Flüssigwaschmittel)
Synergistischer Effekt der Mechanik, Wasser, Chemie und Temperatur
 Biofilmentfernung in einem Gerätereinigungszyklus
 Wirksamkeit von Waschmitteln / Bleiche / Additive
 Übertragung von Biofilmkeimen auf die gewaschene
Wäsche
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Biofilm Entfernung in der Waschmaschine
24 h incubation at
30°C in growth
medium
E. coli
Staphylococcus
aureus
Microbial
counts of
mixed biofilms
before
washing cycle
Microbial counts of
mixed biofilms on
carrier after washing
cycle
Pseudomonas
aeruginosa
Suspension
wird weiter
analysiert
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Koch-/Buntwäsche
60°C, kurz
No detergent, liquid
detergent, IEC-A*,
verschiedene
WaschmaschinenReiniger
Biofilm wird vom
Plättchen abgelöst
(Ultraschall, Vortex)
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Biofilm Ports zum Einsetzen der Biofilme in die Waschmaschine
Port 2: Bottich, unten beim Sumpf
Port 1: Bottich, mittlere Höhe
Port 3: Bottich hinten oben
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arithm. mean microbial counts KBE/coupon
Biofilmentfernung in der Waschmaschine (60°C)
10000,0
1000,0
Microbial counts (biofilm) in washing machine
1945,33
86,92
100,0
10,0
1,0
H2O control
liquid color detergent
9,92
9,00
IEC-A*
washing machine
cleaner 1
detergent / Washing machine cleaner
18,50
washing machine
cleaner A
9,00
washing machine
cleaner B
 Unterschiede zwischen den Produkten sind in der Waschmaschine kleiner als im lab-scale test
(tiefe Keimzahlen und grössere Standardabweichungen)
 Bleiche haltiges Pulverwaschmittel ist bei 60°C bereits sehr effektiv gegenüber Biofilm
 Gewisse Gerätereiniger sind weniger effektiv gegenüber Biofilm als IEC-A* (im lab-scale test und in
der Waschmaschine)
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Transferrate von Biofilmkeimen auf die Wäsche
Transfer rates from washing machine biofilm bacteria to Cotton
 kleine Transferraten
(ca. 200 Keime /
Textilträger) ohne
Waschmittel
 Unterschiede zwischen
Baumwolle und
Polyester
 Unterschiede zwischen
den Keimen
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Biofilm Wachstum Test
Biofilm Wachstum Test:
•
•
•
•
Testdauer > 12 Wochen
2 Waschzyklen pro Woche
Zugabe von Prüfkeimen / Erdsuspension / ohne Zugabe von Keimen
‘Schlechte’ Consumer-Gewohnheiten werden simuliert: Schmutzbeladung,
Niedrigtemperaturwaschverfahren, etc.
Anwendungen:
•
•
Regelmässige Anwendung eines Produktes oder Gerätereinigungszyklus wird
simuliert im Vergleich zu einem Geräte ohne Anwendung des Produktes /
Reinigungszyklus
Nach dem Versuch werden Waschmaschinen auseinander-genommen und der
Biofilm an verschiedenen Probenahme-stellen charakterisiert
•
Visuell: sauber / Ablagerungen
•
Biofilm Menge: Protein-, Polysaccharide Menge, Keimzahlen und
Keimspektrum
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Probenahmeorte
6
1
1
11
15
2
4
7b
7a
6
5b
5a
3
12a/b
10
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Probenahmeorte
Waschmaschine A
Waschbedingungen:
- 30°C Koch / Buntwäsche
- 400 U/min
- Flüssigwaschmittel mit tiefer
Dosierung
- 50% Beladung (Baumwolle)
- Schmutzbeladung: 10 g/kg
Kapazität
- Maschine bleibt nach dem
Waschprozess 24 h
geschlossen
Waschmaschine B
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Sampling Locations
Waschmaschine A
Waschmaschine B
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PROBENAHMEORTE
BESCHREIBUNG
BIOFILM-BILDUNG
BIOFILM-BILDUNG
BIOFILM-BILDUNG
1
Trommel aussen
6
8
9
3
Bottich, unten bei Ablauf
6
Bottich, Rückwand
9
2
Trommel aussen, Rückseite, unter Drehkreuz
4
Bottich, unten, bei Heizung
5A
6
8A
8C
9
11
12A
12B
14
15
16
17
18
19
20
Trommel, Aussenseite vorne
Faltenbalg bei Ablauf
7
5
7
5
10
Faltenbalg Kugelventil
7
Bottich Schweissnaht
Schlauch Pumpe zur Türdichtung
Entlüftung Trommel / Schaumsensor
12
10
13
7
5
Faltenbalg (Einschubkasten – Trommel)
8
5
Einspülkasten
Wasserabfluss-rohr
10
14
9
6
Einschubkasten, Ablauf Weichspüler
WM 2
10
Türdichtung, seitlich auf Höhe der Wasserlinie
Waschmittelschublade, Hauptwaschgangfach
8B
13
7
Türdichtung, unten
7B
6
7
Drehkreuz
7A
13
WM 1
7
5
12
3
6
Türglas
6
11
MITTELWERT PRO PROBENAHMEORT
6.7
Pumpe
7
11
8
10
6
4
4
7
6
7
13
8
11
Wasserzulaufschlauch
Wasser aus dem Flusensieb
14
8
6
7
5
8
9
Steg
Flusensieb
WM 3
9
10
10
8
9
10
14
6
5
9
Qualitative
Beurteilung pro
Probeort beinhaltet:
- Gesamtkeimzahl
- Schimmelpilze
- Pseudomonas
aeruginosa
- Proteinmenge
- Polysaccharidmenge
- visuelle Beurteilung
12
8
10
9
7
8.7
 Interessant: Obwohl Wasserqualität, Schmutzbeladung und Waschbedingungen ähnlich waren, haben sich
unterschiedliche Keimspektren in den Waschmaschinen etabliert (Materialien, Geräteprüfung)
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Inhalt
• Biofilme in Haushaltgeräten
• Normen zu Biofilmuntersuchungen
• Swissatest Testmethoden
• Biofilm Screening Test (Lab-scale Test)
• Erfassung der Biofilmreduktion in der
Waschmaschine
• Biofilm-Wachstum in der Waschmaschine
• Relevanz und Grenzen der Tests
• Zusammenfassung und Fazit
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Relevanz und Grenzen der Tests
Relevanz / Vorteile
Biofilm Screening test ist flexible nutzbar:
• Testkeime (single strains oder mixed-species biofilm)
• Einzelne oder mehrere Waschzyklen können simuliert werden
• Wiederaufwachsen von Biofilm nach einer Reinigung /
Waschzyklus kann simuliert werden
• Pseudomonas aeruginosa ist ein Problemkeim in wasserführenden
Systemen und deshalb nicht nur für Haushaltgeräte relevant
• Viele verschiedene Bedingungen können parallel geprüft werden
Biofilm Entfernung in der Waschmaschine:
• In situ test
• Alle Einflussfaktoren werden berücksichtigt
• Entspricht fast der realen Situation
Biofilm Wachstumstest:
• Gerätebeurteilung und vergleich
• Materialbeurteilung
• Worst-case szenario wird simuliert
Grenzen
Modell-system
Analytik begrenzt die Untersuchung
Je nach Anwendung kommen sehr
spezifische Keime zur Anwendung
Mechanik kann nicht richtig
simuliert werden
Weniger gut reproduzierbar
Sehr spezifische Untersuchung
Vergleichende Prüfung
Biofilm-Anzucht beeinflusst
Resultat
Analytik begrenzt Resultat
Konstruktionsunterschiede
Datenmenge  Beurteilung ist eine
Herausforderung
Analytik begrenzt Resultat
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Zusammenfassung und Fazit
• Biofilme in Haushaltgeräte stellen hauptsächlich ein Geruchsproblem
dar. Das Gesundheitsrisiko ist noch unklar.
• Verschiedene Biofilmnormen bestehen, die hauptsächlich die
Produktion von reproduzierbaren Biofilmen beschreiben.
Pseudomonas aeruginosa als einziger Biofilmkeim.
• Eine Norm (ASTM E2799_12: ) beschreibt eine Testmethode für die
Prüfung von Desinfektionsmittel gegenüber Pseudomonas aeruginosa
Biofilmen
• Verschiedene Testmethoden für Biofilm-Untersuchungen wurden von
Swissatest entwickelt.
• Biofilm Screening test für Auswahl und Optimierung von aktiven
Inhaltsstoffen und Formulierungen, sowie systematische
Untersuchungen
• Biofilm Entfernung in der Waschmaschine für die Beurteilung von
Produkten und / oder Gerätereinigungszyklen
• Biofilm Wachstum Test für die Beurteilung von Geräten und
Materialien
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Vielen Dank für Ihre Aufmerksamkeit
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